WO2022131408A1 - 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 제조방법 - Google Patents

고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 제조방법 Download PDF

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WO2022131408A1
WO2022131408A1 PCT/KR2020/018685 KR2020018685W WO2022131408A1 WO 2022131408 A1 WO2022131408 A1 WO 2022131408A1 KR 2020018685 W KR2020018685 W KR 2020018685W WO 2022131408 A1 WO2022131408 A1 WO 2022131408A1
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WO
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test
oligonucleotide
solution
cap
purity
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PCT/KR2020/018685
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김태훈
박전의
남경완
박창희
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오토텔릭바이오 주식회사
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing high-purity antisense oligonucleotides.
  • oligonucleotides The synthesis of oligonucleotides is usually synthesized by an automatic synthesizer by condensing each monomer in a solid resin, and the oligonucleotides are chemically synthesized by using nucleoside phosphoramidite.
  • the oligonucleotide synthesis process is divided into 1) detritylation, 2) coupling, 3) capping, and 4) oxidation, and one nucleotide binds during one cycle. Therefore, oligomers can be synthesized by participating in each reaction in order of dA, dG, dT, and dC in the order of the base sequence to be synthesized.
  • ammonium hydroxide is added to separate the oligomer from the support.
  • Oligonucleotides are synthesized by binding to a solid support to prevent movement of the nucleoside at the 3' end and then reacting in a column. Therefore, the synthesis is carried out from 3' to 5'.
  • a solid support As the support, controlled pore glass (CPG) or polystyrene is used, and polystyrene is a support with strong hydrophobicity and has better synthesis efficiency than CPG.
  • CPG controlled pore glass
  • polystyrene is a support with strong hydrophobicity and has better synthesis efficiency than CPG.
  • DMT dimethoxytrityl group
  • the present invention provides 1) 3 to 15% dichloroacetic acid dissolved in toluene to remove 5'-dimethoxytrityl (DMT), a protecting group of a nucleoside ( Detritylation step of treating dichloroacetic acid; DCA); 2) a coupling step of mixing and reacting a phosphoramidite solution and a 4,5-dicyanoimidazole (DCI) solution; 3) a thiolation step of treating 0.1 to 1.0 M phenylacetyl disulfide (PADS) dissolved in 2,6-lutidine; 4) N-methyl imidazole (N-Methyl imidazole; NMI), pyridine (Pyridine; PYD) and acetonitrile (Acetonitrile; ACN) mixed with Cap A solution, acetic anhydride (Ac O) and ACN are mixed Capping (Capping) step of processing the Cap B solution; 5) synthesizing an a phosphoramidite solution
  • the present invention relates to a method for producing a high-purity antisense oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide to be synthesized by the present inventors is a nucleic acid therapeutic agent having a PS backbone as an 18-mer single DNA sequence, and the synthesis process development is an AKTA OligoPilot 100 (OP100) synthesizer was used, and it relates to a method for preparing antisense oligonucleotides to improve yield and purity by optimizing step-by-step parameters. According to the present invention, antisense oligonucleotides with minimized related substances can be prepared.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an oligonucleotide synthesis reaction according to the present invention.
  • FIG. 4 shows a flow chart of oligonucleotide synthesis according to the present invention.
  • FIG. 5 shows a flow chart of embodiments for optimizing oligonucleotide synthesis according to the present invention.
  • 0.1 to 1.0 M phosphoramidite solution and 0.5 to 1.5 M DCI solution may be mixed in a 4: 6 or 1:1 weight ratio, but , but is not limited thereto.
  • the capping step of step 4) is a Cap A solution in which 20% NMI (v/v), 30% PYD (v/v) and 50% ACN (v/v) are mixed, 20 % Ac O (v / v) and 80% ACN (v / v) can be treated with a mixed Cap B solution, but is not limited thereto.
  • elution may be performed with a buffer containing 25 mM NaOH and 3 M NaCl, and washing may be performed with a buffer containing 0.5 to 0.55 M NaCl, but is limited thereto. it's not going to be
  • the antisense oligonucleotide may be an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • Antisense oligonucleotides are manufactured through 1) synthesis, 2) purification, 3) ultrafiltration, and 4) freeze drying.
  • the antisense oligonucleotide to be synthesized in the present invention is a nucleic acid therapeutic agent having a PS backbone as an 18-mer single DNA sequence, and the sequence is 5'-CGG-CAT-GTC-TAT-TTT-GTA-3' (SEQ ID NO: 1) .
  • an AKTA OligoPilot 100 (OP100) synthesizer was used, and it is a manufacturing method that improves yield and purity by optimizing step-by-step parameters.
  • Oligonucleotide synthesis represented by SEQ ID NO: 1 is synthesized using atechnikrom synthesizer. Amidite solution and other reagents are prepared, respectively, and the synthesis is carried out by the synthesis method developed through process development. Pack Uny PS300 (100mmol scale) in the column, and when packing is completed, connect to the synthesizer and start synthesis. The iterative synthesis process is summarized below.
  • Step 4 above is repeated 18 times in sequence. In each step, washing with ACN or toluene is performed before proceeding to the next step. A representative synthesis cycle is shown in FIG. 1 .
  • step 4 of the synthesis After the reaction in step 4 of the synthesis is completed, the oligonucleotide is attached to the Uny PS330 solid phase, and the ⁇ -cyanoethyl protecting group attached to the backbone of the oligonucleotide is removed using a 50% TEA in ACN solution. do (FIG. 2).
  • the oligonucleotide was treated with aqueous ammonium hydroxide to remove the remaining base protecting group and separated from the solid phase.
  • the column is separated from the synthesizer and nitrogen is added to the column inlet to dry the solid phase.
  • the dried solid phase is put in a cleavage tank and 80ml/mmol of 28-30% ammonium hydroxide is added. Put the sealed cutting tank in a shaking oven and let it react at 55°C for 15 hours. After 15 hours, the solid phase after cleavage and deprotection is completed is filtered through a filter to remove the solid phase and washed with 80 ml/mmol of purified water.
  • the filtered solution is analyzed by IEX (MF/QTM/100) analysis (FIG. 3).
  • the overall oligonucleotide synthesis flow chart of the present invention is shown in FIG. 4 .
  • a shortmer is an impurity generated when the amidite coupling reaction does not work well. If this does not proceed well, 2) it occurs when the coupling does not go well due to lack of coupling recycle time.
  • N+1 impurity is highly likely to be generated when 1) the coupling reaction time is long, and 2) when the activator is acidic.
  • Post peak impurity is an impurity that is highly likely to be generated when 1) the coupling reaction time is long, and 2) when the activator is acidic.
  • Step parameter Example One PD #2
  • Example 3 PD #1
  • Example 4 PD #4 Detritylation Reagent 3% DCA in Toluene 10% DCA in Toluene 10% DCA in Toluene 10% DCA in Toluene 1 st Cycle CV UV dependent 5.0 CV 5.0 CV 7.0 CV 2 nd ⁇ 16 th Cycle CV 5.0 CV 17 th , 18 th Cycle CV 5.6 CV flow rate 400 cm/hr 400 cm/hr 400 cm/hr 450 cm/hr Coupling Eq.
  • Example 5 PD #5
  • Example 6 PD #10
  • Example 7 PD #12
  • Example 8 PD #13 Detritylation Reagent 10% DCAA in Toluene 10% DCA in Toluene 10% DCA in Toluene 10% DCA in Toluene 1 st Cycle CV 5.0 CV 5.0 CV 5.0 CV 5.0 CV 2 nd ⁇ 16 th Cycle CV 17 th , 18 th Cycle CV flow rate 400 cm/hr 400 cm/hr 400 cm/hr 400 cm/hr 400 cm/hr Coupling Eq. & Conc.
  • Example 2 There was no change in the shortmer in Example 2 compared to Example 1, and the yield fell by 6.4%.
  • Example 3 In Example 3 compared to Example 1, the impurity pattern was improved (Early peak (shortmer) became small, FLP peak increased).
  • Examples 1 and 2 are shown in FIG. 6
  • the IEX-HPLC analysis chromatograms of Examples 1 and 3 are shown in FIG. 7
  • Examples 1 and 3 The LCMS (UV) analysis chromatogram of 3 is shown in FIG. 8 .
  • QSFF is a resin that does not have a high operating pressure, and it is damaged when it exceeds a certain pressure, so caution is required when using it.
  • DMT-on crude of the oligonucleotide of the present invention was purified through an ion exchange method.
  • the DMT-off oligo was obtained by adsorbing the DMT-on oligo to the resin during purification and then performing the Trityl removal reaction under acidic conditions (80% AcOH) (DTR step).
  • Test #2 25 mM NaOH, 3 M NaCl buffer was substituted for the buffer of 25 mM NaOH, 2 M NaCl (MP B) to control the number of tanks during actual production. Even after sanitization and elution steps were performed with one type of buffer of 25 mM NaOH and 3 M NaCl, the same results as Test #1 were obtained, providing the basis for changing the tank.
  • Test #3 changed the concentration of the DMT-on wash section from 0.5 M NaCl to 0.55 M NaCl. As a result, even if the DMT-on wash waste increased by 17%, FLP was not eluted, so it was judged that it was effective for the removal of shortmers during GMP production, and the DMT-on wash buffer was changed to 0.55M NaCl.
  • the %B was increased by adding 2 CV each of the CVs of the DMT-on wash and Elution sections (DMT-on wash CV 3 ⁇ 5, Elution CV 15 ⁇ 17), and purified water flush for method simplification Except for the step, it was immediately changed to 85 cm/hr except for the section where flow 300 cm/hr 1 CV was given at the beginning of the detritylation step. As a result, the number of fractions recovered increased, the mockpool selection range was increased, and the yield was increased by 3%.
  • Test #5 it was changed to DTR 5 CV and the contact time was shortened to 45 min, which is half.
  • the DMT-on Impurity result exceeded 1.00% (Spec: NMT 0.5%), and the DTR contact time should be fixed to 90 min or more.
  • Test #6 the pH adjustment section was increased from 5 CV to 10 CV to minimize the pH change before the elution step. It was confirmed that the pH was kept constant from the start of the Elution step during 10 CV.
  • Test #7 changed the loading capacity from 1050 OD/mL to 1150 OD/mL. There was no significant difference in the purification pattern or analysis results, confirming that there was no effect on the purification results.
  • Test #8 Crude worst case was used as a refined test (Crude #5) and the same method as Test #7 was conducted. As confirmed from the RP-HPLC results, N+1 and Unk-1.04 were not removed in the late eluting impurity, so the FLP purity was measured to be 89.6%. It was confirmed that the above-mentioned impurities were not well separated.
  • Test #9 is a field optimization experiment, and the linear velocity of the DTR Step was changed from 85 cm/hr to 150 cm/hr in the existing parameters. However, by maintaining the same CV, other parameters except for the linear velocity were the same, and a comparative experiment was conducted. The purification pattern was similar, but a new impurity, Unk-0.99, was generated in the RP-HPLC analysis result.
  • Test#10 changed the DTR CV to DTR CV 10 ⁇ 16 (DTR CT: 95 min), and Test#11 changed the DTR CV to DTR CV 16 ⁇ 14 (DTR CT: 85 min). It was confirmed that the impurities identified in Test #9 were removed in both experiments.
  • Test #12 was conducted with Crude with reduced late impurity. As a result of RP HPLC, Unk-1.04, N+1 were Spec in,
  • Test#13 is the final test, and in order to have sufficient DTR contact time, the DTR Step in Test#12 was changed to 16CV. The yield was higher in Test #12, and finally it was confirmed as the DTR 16 CV parameter at 150 cm/hr.
  • Ultrafiltration proceeds through the process of concentrating, desalting, and recovering the final concentrate of the pool solution.
  • TMP, loss to permeate, conductivity, etc. were confirmed as major parameters of the concentration and desalination process.
  • the OD was checked every time the permeate reached 75 mL, and concentrated until the retentate reached 100 mL.
  • TMP Retentate valve locking degree 2.82 / Press (PIRC 2500) 2.35 .

Abstract

본 발명은 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 대한 것으로서, 본 발명자들이 합성하고자 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18 mer의 single DNA 서열로써 PS backbone을 가지는 핵산 치료제로서, 합성공정 개발은 AKTA OligoPilot 100 (OP100) 합성기를 사용하였으며, 단계별 파라미터(parameter)를 최적화하여 수율과 순도를 향샹시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법에 대한 것이다. 본 발명에 따르면, 유연물질이 최소화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.

Description

고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 제조방법
본 발명은 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 관한 것이다.
올리고뉴클레오타이드의 합성은 통상적으로 고체 수지에서 각 모노머를 축합하여 자동합성기로 합성되는데, 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 포스포아미다이트(nucleoside phosphoramidite)를 사용함으로써 화학적으로 합성된다. 올리고뉴클레오타이드 합성 과정은 1) 디트리틸레이션(detritylation), 2) 커플링(coupling), 3) 캡핑(capping), 4) 산화(oxidation)로 나뉘며, 한 주기 동안 1개의 뉴클레오티드가 결합한다. 그러므로 합성하고자 하는 염기서열 순서대로 dA, dG, dT, dC를 순서에 맞게 각 반응에 참여시킴으로 올리고머(oligomer)를 합성할 수 있다. 합성이 완료되면 수산화 암모늄(ammonium hydroxide)를 넣어 지지체로부터 올리고머를 분리한다. 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단의 뉴클레오사이드(nucleoside)를 움직이지 못하도록 고형 지지체 (solid support)에 결합한 후 컬럼에서 반응시킴으로 합성이 이루어진다. 그러므로 합성은 3'에서 5'으로 실시된다. 지지체는 controlled pore glass (CPG)나 폴리스틸렌(polystylene)을 사용하는데, 폴리스틸렌은 소수성이 강한 지지체로 CPG 보다 더 좋은 합성효율을 갖는다. 합성하려는 올리고뉴클레오타이드의 염기서열에 따라 상기 4단계별 반응을 반복하여 합성이 완결되면 5' 말단에는 여전히 디메톡시트리틸기(dimethoxytrityl group; DMT)가 남아있는 상태가 되는데, 합성된 올리고뉴클레오타이드의 정제방법에 따라 트리틸기(trityl)가 부탁된 상태 또는 제거된 상태로 합성을 종결한다.
다만, 상기와 같은 올리고뉴클레오타이드 합성 과정에서 불순물이 포함되거나 합성 효율이 저하되는 등의 문제점이 발생할 수 있어, 올리고뉴클레오타이드 합성 수율 및 순도를 향상시키기 위한 기술 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 올리고뉴클레오타이드의 합성 단계별 파라미터(parameter)를 최적화하여 수율과 순도를 향샹시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 뉴클레오사이드(nucleoside)의 보호기인 5'-디메톡시트리틸(5'-dimethoxytrityl; DMT)을 제거하기 위해 톨루엔에 녹인 3 내지 15 % 디클로로아세트산(dichloroacetic acid; DCA)를 처리하는 디트리틸레이션(Detritylation) 단계; 2) 포스포아미다이트(phosphoramidite) 용액 및 4,5-디시아노이미다졸(4,5-Dicyanoimidazole; DCI) 용액을 혼합하여 반응시키는 커플링(Coupling) 단계; 3) 2,6-루티딘(2,6-Lutidine)에 녹인 0.1 내지 1.0 M 페닐아세틸 디설파이드(Phenylacetyl disulfide; PADS)를 처리하는 티올화(Thiolation) 단계; 4) N-메틸 이미다졸(N-Methyl imidazole; NMI), 피리딘(Pyridine; PYD) 및 아세토니트릴(Acetonitrile; ACN)이 혼합된 Cap A 용액과, 무수 아세트산(Acetic anhydride; Ac2O) 및 ACN이 혼합된 Cap B 용액을 처리하는 캡핑(Capping) 단계; 5) 상기 제1단계 내지 제4단계를 목적 올리고뉴클레오타이드의 염기서열 수에 따라 반복하여 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계; 6) 상기 합성된 올리고뉴클레오타이드를 정제하는 단계; 7) 상기 정제된 올리고뉴클레오타이드를 한외여과(Ultrafiltration)하는 단계; 및 8) 상기 한외여과된 올리고뉴클레오타이드를 동결건조하는 단계를 포함하는 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법을 제공한다.
본 발명은 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 대한 것으로서, 본 발명자들이 합성하고자 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18 mer의 single DNA 서열로써 PS backbone을 가지는 핵산 치료제로서, 합성공정 개발은 AKTA OligoPilot 100 (OP100) 합성기를 사용하였으며, 단계별 파라미터(parameter)를 최적화하여 수율과 순도를 향샹시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법에 대한 것이다. 본 발명에 따르면, 유연물질이 최소화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 합성 반응 모식도를 나타낸다.
도 2는 올리고뉴클레오타이드 합성 후 세척 과정을 나타낸다.
도 3은 미변성 올리고뉴클레오타이드의 절단 및 탈보호 과정을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 합성 플로우 차트를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 합성 최적화를 위한 실시예들의 플로우 차트를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예 1과 실시예 2의 IEX-HPLC 분석 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시예 1과 실시예 3의 IEX-HPLC 분석 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 실시예 1과 실시예 3의 LCMS (UV) 분석 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 9는 Test#1, 2, 3의 정제 prep-chromatogram 결과를 나타낸다.
도 10은 Test#4, 5, 6의 정제 prep-chromatogram 결과를 나타낸다.
도 11은 Test#7, 8의 정제 prep-chromatogram 결과를 나타낸다.
도 12는 Test#9, 10, 11의 정제 prep-chromatogram 결과를 나타낸다.
도 13은 Test#12의 Loading step prep-chromatogram 결과를 나타낸다.
도 14는 Test#12의 Elution step prep-chromatogram 결과를 나타낸다.
도 15는 Test#13의 정제 prep-chromatogram 결과를 나타낸다.
도 16은 Purification Test#8의 분석 크로마토그램 (IEX-HPLC) 결과를 나타낸다.
도 17은 Purification Test#8 RP-HPLC 크로마토그램 분석 결과를 나타낸다.
도 18은 Synthesis #13의 분석 크로마토그램 (IEX-HPLC) 결과를 나타낸다.
도 19는 한외여과(Ultrafiltration) 분석 크로마토그램 (IEX-HPLC) 결과를 나타낸다.
도 20은 한외여과(Ultrafiltration) 분석 크로마토그램 (RP-HPLC) 결과를 나타낸다.
도 21은 Lyophilization Test#2의 분석 크로마토그램 (IEX-HPLC ) 결과를 나타낸다.
도 22는 Lyophilization Test#2의 분석 크로마토그램 (RP-HPLC) 결과를 나타낸다.
본 발명은 1) 뉴클레오사이드(nucleoside)의 보호기인 5'-디메톡시트리틸(5'-dimethoxytrityl; DMT)을 제거하기 위해 톨루엔에 녹인 3 내지 15 % 디클로로아세트산(dichloroacetic acid; DCA)를 처리하는 디트리틸레이션(Detritylation) 단계; 2) 포스포아미다이트(phosphoramidite) 용액 및 4,5-디시아노이미다졸(4,5-Dicyanoimidazole; DCI) 용액을 혼합하여 반응시키는 커플링(Coupling) 단계; 3) 2,6-루티딘(2,6-Lutidine)에 녹인 0.1 내지 1.0 M 페닐아세틸 디설파이드(Phenylacetyl disulfide; PADS)를 처리하는 티올화(Thiolation) 단계; 4) N-메틸 이미다졸(N-Methyl imidazole; NMI), 피리딘(Pyridine; PYD) 및 아세토니트릴(Acetonitrile; ACN)이 혼합된 Cap A 용액과, 무수 아세트산(Acetic anhydride; Ac2O) 및 ACN이 혼합된 Cap B 용액을 처리하는 캡핑(Capping) 단계; 5) 상기 제1단계 내지 제4단계를 목적 올리고뉴클레오타이드의 염기서열 수에 따라 반복하여 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계; 6) 상기 합성된 올리고뉴클레오타이드를 정제하는 단계; 7) 상기 정제된 올리고뉴클레오타이드를 한외여과(Ultrafiltration)하는 단계; 및 8) 상기 한외여과된 올리고뉴클레오타이드를 동결건조하는 단계를 포함하는 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 2) 단계의 커플링(Coupling) 단계는 0.1 내지 1.0 M 포스포아미다이트(phosphoramidite) 용액 및 0.5 내지 1.5 M DCI 용액을 4 : 6 또는 1 : 1 중량비로 혼합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 4) 단계의 캡핑(Capping) 단계는 20% NMI(v/v), 30% PYD(v/v) 및 50% ACN(v/v)이 혼합된 Cap A 용액과, 20% Ac2O(v/v) 및 80% ACN(v/v)이 혼합된 Cap B 용액을 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 6) 단계의 정제 단계는 25 mM NaOH 및 3 M NaCl이 포함된 완충액으로 용출(elution)하고, 0.5 내지 0.55M NaCl을 포함하는 완충액으로 세척(wash)할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 >
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1) 합성(Synthesis), 2) 정제(Purification), 3) 한외여과(Ultrafiltration), 4) 동결건조(Freeze Drying) 공정을 거쳐 제조된다.
본 발명에서 합성하고자 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18 mer의 single DNA 서열로써 PS backbone을 가지는 핵산 치료제이며, 서열은 5'-CGG-CAT-GTC-TAT-TTT-GTA-3' (서열번호 1)이다.
합성공정 개발은 AKTA OligoPilot 100 (OP100) 합성기를 사용하였으며, 단계별 파라미터(parameter)를 최적화하여 수율과 순도를 향샹시키는 제조방법이다.
1. 합성(Synthesis)
서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오타이드 합성은 Technikrom 합성기를 사용하여 합성을 한다. 아미다이트(Amidite) 용액 및 다른 시약 등은 각각 준비하며, 공정 개발을 통해 개발된 합성법으로 합성을 진행한다. 컬럼에 Uny PS300(100mmol scale)을 packing 하고 packing이 완료되면 합성기에 연결 후 합성을 시작한다. 반복적인 합성 공정은 아래와 같이 요약된다.
1) 디트리틸레이션(Detritylation): 뉴클레오사이드(nucleoside)의 보호기인 5'-디메톡시트리틸(5'-dimethoxytrityl; DMT)을 제거하기 위해 톨루엔에 녹인 10% 디클로로아세트산(dichloroacetic acid; DCA)을 사용한다.
2) 커플링(Coupling): 커플링 반응은 0.7 M DCI 용액과 0.2 M 포스포아미다이트(phosphoramidite) 용액을 각각 in-line mixing을 하였을 때 시작된다. 이 반응에서는 1.75 당량의 포스포아미다이트(phosphoramidite), 6.13 당량 0.7 M DCI 용액을 사용하였다.
3) 티올화(산화)[Thiolation(oxidation)]: 0.2M PADS solution in 2,6-Lutidine 8 당량을 사용하여 Phosphite (Ⅲ) triester linkage를 phosphorothioate(Ⅴ) ester linkage로 변환시킨다.
4) 캡핑(Capping): 커플링(Coupling) 반응이 진행되지 않은 5'-hydroxyl groups을 보호기로 치환시켜 n-1 sequences의 형성을 최소화하기 위해 진행되는 반응이다.
위 4단계는 서열대로 18번 반복적으로 실행된다. 각 단계마다 다음 단계로 진행하기 전 ACN 또는 톨루엔(Toluene)으로 세척을 진행한다. 대표적인 합성 사이클(cycle)은 도 1 에 명시하였다.
2. 합성 후 세척
합성이 4단계의 반응이 끝난 뒤 올리고뉴클레오타이드는 Uny PS330 고체상에 부착되어 있으며, 50%의 TEA in ACN 용액을 사용하여 올리고뉴클레오타이드의 backbone에 붙어있는 β-시아노에틸(β-cyanoethyl) 보호기를 제거한다(도 2).
3. 미변성 올리고뉴클레오타이드의 절단 및 탈보호
올리고뉴클레오타이드는 수상 수산화 암모늄(aqueous ammonium hydroxide)으로 처리함으로써 남아있는 염기 보호기(base protecting group)가 제거되고 고체상으로부터 분리된다.
합성이 종료되면 컬럼을 합성기에서 분리한 후 컬럼 인렛에 질소를 가하여 고체상을 건조한다. 건조된 고체상은 절단 탱크(cleavage tank)에 담아 80ml/mmol의 28~30% 수산화 암모늄을 투입한다. 밀봉된 절단 탱크를 shaking oven에 넣은 후 55℃, 15시간 반응을 시켜준다. 15시간 경과 후, 절단(cleavage), 탈보호(deprotection)가 완료된 고체 상을 필터로 여과해주어 고체상을 제거하고 80ml/mmol의 정제수를 사용해 세척해 준다. 필터된 용액은 IEX(MF/QTM/100) 분석법으로 분석을 진행한다(도 3).
본 발명의 전체적인 올리고뉴클레오타이드 합성 플로우 차트는 도 4에 나타냈다.
일반적인 올리고뉴클레오타이드 합성에 있어서, 쇼트머(shortmer)는 아미다이트(amidite) 커플링 반응이 잘되지 않을 때 생기는 불순물(impurity)로, 1) 디트리틸레이션(detritylation) 반응이 잘되지 않아 커플링이 잘 진행되지 않았을 경우, 2) 커플링 리사이클 시간(coupling recycle time) 부족으로 인해 커플링이 잘 되지 않았을 경우에 생긴다. 또한, N+1 impurity은 1) 커플링 반응시간이 길었을 경우, 2) 활성제(Activator)가 산성(acidic)일 경우 생성될 가능성이 높다.
Post peak impurity인 N+1 impurity는 1) 커플링 반응시간이 길었을 경우, 2) 활성제(Activator)가 산성(acidic)일 경우 생성될 가능성이 높은 불순물이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 합성 최적화를 위한 실시예들의 파라미터는 표 1 및 표 2에 나타냈고, 플로우차트는 도 5에 나타냈다.
Step parameter 실시예 1
PD #2 		실시예 2
PD #3 		실시예 3
PD #1 		실시예 4
PD #4
Detritylation Reagent 3% DCA
in Toluene		 10% DCA
in Toluene		 10% DCA
in Toluene		 10% DCA
in Toluene
1st Cycle CV UV dependent 5.0 CV 5.0 CV 7.0 CV
2nd~16th Cycle CV 5.0 CV
17th, 18th Cycle CV 5.6 CV
Flow rate 400 cm/hr 400 cm/hr 400 cm/hr 450 cm/hr
Coupling Eq. & Conc.Amidite 1.75 eq, 0.2M 1.75 eq, 0.2M 1.90 eq, 0.2M 1.75 eq, 0.2M
Recycle 5 min 5 min 5 min 5 min
Recycle Flow Rate 300 cm/hr 300 cm/hr 300 cm/hr 300 cm/hr
Activator composition 1.0 M DCI 1.0 M DCI 1.0 M DCI 1.0 M DCI
Amidite, Activator ratio 4 : 6 4 : 6 4 : 6 4 : 6
First coupling Single Single Single Single
Thiolation Reagent 0.2 M XH 0.2 M XH 0.2M PADS 0.2M PADS
Volume 1.0 CV 1.0 CV 1.5 CV 1.5 CV
Flow Rate 234 cm/hr 234 cm/hr 130 cm /hr 130 cm/hr
Recycle time & Recycle Flow rate 382 cm/hr,5 min 382 cm/hr,
5 min		 N/A N/A
Capping Reagent Composition Cap A 20% NMI, 30% PYD, 50% ACN
Cap B 20%,Ac2O, 80% ACN (v/v)		 Cap A 20% NMI, 30% PYD, 50% ACN
Cap B 20%,Ac2O, 80% ACN (v/v)		 Cap A 20% NMI, 30% PYD, 50% ACN
Cap B 20%, Ac2O, 80% ACN (v/v)		 Cap A 20% NMI, 30% PYD, 50% ACN
Cap B 20%,Ac2O, 80% ACN (v/v)
Volume 0.2 CV Cap A pre
0.75 CV Cap A&B		 0.2 CV Cap A pre
0.75 CV Cap A&B		 0.5 CV Cap A&B 0.5 CV Cap A&B
Flow rate 125 cm/hr 125 cm/hr 385 cm/hr 385 cm/hr
Cleavage & Deprotection 55℃, 9hr 55℃, 9hr
Result Purity (%) 75.6 77.0 83.1 81.9
Yield (%) 83.2 76.8 74.2 84.8
Step Parameter 실시예 5
PD #5 		실시예 6
PD #10 		실시예 7
PD #12 		실시예 8
PD #13
Detritylation Reagent 10% DCAA in Toluene 10% DCA in Toluene 10% DCA in Toluene 10% DCA in Toluene
1st Cycle CV 5.0 CV 5.0 CV 5.0 CV 5.0 CV
2nd~16th Cycle CV
17th, 18th Cycle CV
Flow rate 400 cm/hr 400 cm/hr 400 cm/hr 400 cm/hr
Coupling Eq. & Conc. Amidite 1.75 eq, 0.2M 1.90 eq, 0.2M 1.75 eq, 0.2M 1.75 eq, 0.2M
Recycle 5 min 5 min 5 min 5 min
Recycle Flow Rate 300 cm/hr 300 cm/hr 300 cm/hr 300 cm/hr
Activator composition 1.0 M DCI 1.0 M DCI 0.7 M DCI 0.7 M DCI
Amidite, Activator ratio 4 : 6 4 : 6 1 : 1 1 : 1
First coupling Double Single Single Single
Thiolation Reagent 0.2M PADS 0.2M PADS 0.2M PADS 0.2M PADS
Volume 1.5 CV 1.5 CV 1.5 CV 1.5 CV
Flow Rate 130 cm/hr 130 cm/hr 130 cm/hr 130 cm/hr
Recycle time & Recycle Flow rate N/A N/A N/A N/A
Capping Reagent Composition Cap A 20% NMI, 30% PYD, 50% ACN
Cap B 20%, Ac2O, 80% ACN (v/v)		 Cap A 20% NMI, 30% PYD, 50% ACN
Cap B 20%,Ac2O, 80% ACN (v/v)		 Cap A 20% NMI, 30% PYD, 50% ACN
Cap B 20%,Ac2O, 80% ACN (v/v)		 Cap A 20% NMI, 30% PYD, 50% ACN
Cap B 20%,Ac2O, 80% ACN (v/v)
Volume 0.5 CV Cap A&B 0.5 CV Cap A&B 0.5 CV Cap A&B 0.5 CV Cap A&B
Flow rate 385 cm/hr 385 cm/hr 385 cm/hr 385 cm/hr
Cleavage & Deprotection 55℃, 9hr 55℃, 9hr
Result Purity (%) 80.1 83.6 83.6 83.5
Yield (%) 82.3 74.6 72.5 72.6
- 실시예 1 대비 실시예 2 에서 쇼트머(shortmer) 변화 없고, 수율 6.4% 떨어졌다.
- 실시예 1 대비 실시예 3에서는 불순물(impurity) 패턴 개선되었다(Early peak (shortmer)이 작아지고, FLP peak이 커짐).
- 실시예 4: detritylation CV 변경
- 실시예 5: Coupling 단계에서 single coupling 대신 double coupling으로 변경
- 실시예 6: 실시예 3의 재현 실험
- 실시예 7: post peak impurity (N+1 impurity) 최소화
- 실시예 8: scale up batch
한편, 실시예 1과 실시예 2의 IEX-HPLC 분석 크로마토그램은 도 6에 나타냈고, 실시예 1과 실시예 3의 IEX-HPLC 분석 크로마토그램은 도 7에 나타냈으며, 실시예 1과 실시예 3의 LCMS (UV) 분석 크로마토그램은 도 8에 나타냈다.
4. 정제
QSFF(Q Sepharose Fast Flow) Resin을 이용한 컬럼 패킹
QSFF (GE Healthcare, Cat No.: 17-0510-01 Lot No.: 10269817) 에 대해 3회 Packing test를 진행하였으며 사용한 컬럼 바디는 XK Column 16/40 (GE Healthcare, Cat No.28988938) 을 사용하였고, 이때의 Target bed height 14.0~16.0 cm로써 AKTA Avant FPLC (GE Healthcare) 장비를 이용하여 패킹 및 CIT를 진행하였다. 3번째 패킹 시험이 가장 좋은 결과를 보였으므로 이후 정제를 진행하였다(표 3).
QSFF는 운용압력이 높지 않은 Resin이고 일정압력을 넘으면 망가지기 때문에 사용에 주의가 필요하다.
No.
(Lab Note #) 		B.H (cm) I.D (cm). CV (mL) Asymmetry
(0.8<As<1.8) 		HETP
(<0.02700)
QSFF packing 15.3 1.6 30.8 1.29 0.02204
본 발명 올리고뉴클레오타이드의 DMT-on Crude를 이온 교환 방법을 통해 정제하였다. DMT-off 중간체를 얻기 위해 정제 진행 중 DMT-on 올리고를 Resin에 흡착 후 산성 조건(80% AcOH)에서 Trityl 제거 반응을 통해(DTR step)을 DMT-off oligo를 얻었다.
본 발명의 실시예에 따른 정제 시험 결과는 표 4에 나타냈다.
Crude#* Test No.
(Lab Note #) 		Purpose Condition Mockpool
Purity ( % )
IEX /RP 		Yield
(%)
실시예 2
(PD#3)		 Test #1 Avecia method 재현 SAX-OCD 94.3/90.1 52.6
Test #2 Elution 버퍼 조성 변경 94.6/91.6 50.6
Test #3 DMT-on wash 조성변경 94.2/91.7 51.0
Test #4 Step 및 CV 변경 94.6/90.9 54.2
Test #5 DTR CV 변경 실험 94.9/92.4 63.6
Test #6 pH adjustment 변경 실험 94.2/90.4 54.7
실시예 3
(PD#1)		 Test #7 Loading capacity 변경 96.1/93.1 59.5
실시예 5
(PD#5)		 Test #8 다량의 Impurity가 포함된 Crude 정제 실험 94.9/89.6 55.3
실시예 3
(PD#1)		 Test #9 Flow rate 변경에 따른 CV 변경 실험 96.3/92.1 61.6

실시예 6
(PD#10)		 Test #10 96.0/93.0 64.1
Test #11 95.8/90.9 61.8
실시예 7
(PD#12)		 Test #12 Crude 변경 실험 96.2/94.4 59.1
Test #13 DTR CV 변경, Final 공정으로 선택 97.3/94.2 65.5
Test#1, 2, 3
Test#1은 DMT-on crude를 컬럼에 흡착시킨 후 이를 80% AcOH를 통해 컬럼 내에서 디트리틸레이션(Detritylation)을 진행하였다. 제공된 SAX-OCD 방법의 Resin packing, 정제 및 Fraction 회수까지 재현성을 확인하였다.
Test#2는 실제 생산 시 탱크 개수 조절을 위해 25 mM NaOH, 2 M NaCl(MP B)의 Buffer를 25 mM NaOH, 3 M NaCl buffer로 대체하였다. 25 mM NaOH, 3 M NaCl의 buffer 1종류로 Sanitization 및 Elution step을 진행하여도 Test#1과 동일한 결과를 얻어 탱크 변경의 근거를 마련하였다.
Test#3는 DMT-on wash 구간의 농도를 0.5 M NaCl 에서 0.55 M NaCl로 변경하였다. 결과적으로 DMT-on wash waste가 17%가 증가되더라도 FLP는 Eluting 되지 않아 GMP 생산 시 Shortmer의 제거에 효율적이라고 판단하여 DMT-on wash buffer를 0.55M NaCl로 변경하였다.
Test #4, 5, 6
Test#4는 DMT-on wash, Elution 구간의 CV를 각각 2 CV씩 추가하여 %B를 증가 시켰으며(DMT-on wash CV 3 → 5, Elution CV 15 → 17), Method 단순화를 위해 Purified water flush Step을 제외하고 Detritylation step 시작시 flow 300 cm/hr 1 CV를 주는 구간을 제외하고 바로 85 cm/hr로 변경하였다. 결과적으로 Fraction 회수 개수가 늘어 Mockpool 선택 범위가 증가되었고 수율이 3% 증가되었다.
Test#5에서는 DTR 5 CV로 변경하여 Contact time을 절반인 45 min으로 진행하였다. IEX HPLC 분석결과에서 DMT-on Impurity 결과가 1.00%(Spec: NMT 0.5%)가 넘어 DTR Contact time은 90 min 이상으로 고정해야 함을 확인하였다.
Test#6는 pH adjustment 구간을 5 CV에서 10 CV로 늘려 Elution step 전에 pH변화를 최소화 시키는 실험을 진행하였다. 10 CV 진행시 Elution step 시작부터 pH가 일정히 유지됨을 확인하였다.
Test #7, 8
Test#7은 Loading capacity를 1050 OD/mL에서 1150 OD/mL로 변경하였다. 정제 패턴이나 분석결과에서 큰 차이가 없어 정제 결과에 영향이 없음을 확인하였다.
Test#8 Crude worst case를 정제한 test로 (Crude #5) 사용하여 Test#7과 동일한 방법으로 진행하였다. RP-HPLC 결과에서 확인하기에 Late eluting impurity 내에 N+1 및 Unk-1.04가 제거되지 않아 FLP Purity가 89.6%로 측정되었다. 상기 언급된 불순물(Impurity)이 잘 분리되지 않음이 확인되었다.
Test #9, 10, 11
Test#9는 현장 최적화 실험으로 기존 파라미터(parameter)에서 DTR Step의 Linear velocity를 85 cm/hr에서 150 cm/hr로 변경하였다. 단, 동일한 CV를 유지하여 Linear velocity를 제외한 타 파라미터(parameter)는 동일하게 하여 비교 실험을 진행하였다. 정제 패턴은 유사하나 RP-HPLC 분석결과에서 새로운 불순물(Impurity)인 Unk-0.99가 발생하였다.
Test#10은 DTR CV 10 → 16 (DTR CT: 95 min), Test#11은 DTR CV 16 → 14 (DTR CT: 85 min)로 DTR CV를 변경하였고 CT의 동일화를 위한 Test이다. Test#9에서 확인된 불순물(Impurity)이 두 실험에서 제거되었음을 확인하였다.
Test #12, 13
Test#12는 Late impurity가 줄어든 Crude로 실험을 진행하였다. RP HPLC 결과 상, Unk-1.04, N+1은 Spec in 되었으나,
Test#13는 최종 실험으로 충분한 DTR contact time을 가지기 위해 Test#12에서 DTR Step을 16CV로 변경하였다. 수율이 Test#12에 보다 높게 나와 최종적으로 150 cm/hr에서 DTR 16 CV Parameter로 확정하였다.
본 발명의 Test에 따른 RP-HPLC 분석 정제 시험 결과는 표 5 및 표 6에 나타냈다.
RPHPLC Analysis Test#1 Test#2 Test#3 Test#4 Test#5 Test#6 Test#7
Species RRT Spec. ( % ) %Area
Unk-0.76 0.76-0.8 NMT 0.5 0.05 0.04 0.04 0.05 0.13 0.09 0.09
3'N-2 0.80-0.85 NMT 0.6 0.13 0.11 0.12 0.13 0.06 0.14 0.05
Unk-0.86 0.86-0.87 NMT 0.5 0.04 0.17 0.16 0.17 0.19 0.17 0.11
3'N-1 0.90-0.94 NMT 3.4 1.24 1.09 1.05 1.17 1.09 1.42 1.16
PO/5'N-1 0.95-0.98 NMT 7.6 2.41 3.00 2.99 3.20 3.16 4.35 2.19
FLP 1.00 NLT 85.0 90.71 91.61 91.73 91.51 90.94 90.42 93.06
Unk-1.04 1.04-1.06 NMT 2.6 2.04 1.92 1.92 1.81 2.02 1.71 0.94
N+1 1.07-1.10 NMT 1.2 1.76 0.84 0.84 0.83 0.87 0.85 1.42
CNET 1.11-1.14 NMT 5.2 0.19 0.90 0.72 0.80 0.85 0.76 0.57
Unk-1.15 1.15-1.18 NMT 0.5 0.18 N.D. 0.13 N.D. 0.18 N.D. 0.17
Unk-1.19 1.19-1.21 NMT 0.5 0.02 0.25 0.21 0.28 0.26 0.10 0.08
Unk-1.24 1.24-1.27 NMT 0.5 0.02 0.03 N.D. 0.04 0.03 N.D. N.D.
Unspecified
Impurities 		NMT 0.3 0.07 0.05 0.05 - 0.10 - 0.12
- - 0.04 - 0.03 - 0.01
- - 0.02 - 0.03 - 0.02
- - - - 0.02 - 0.02
- - - - 0.05 - -
Total unspecified NMT 2.2 0.07 0.05 0.11 0.00 0.21 0.00 0.17
Total Impurities NMT 15 8.09 8.39 8.27 8.49 9.06 9.58 6.94
RPHPLC Analysis Test#8 Test#9 Test#10 Test#11 Test#12 Test#13
Species RRT Spec. ( % ) %Area
Unk-0.76 0.76-0.8 NMT 0.5 0.13 0.07 0.05 0.05 N.D. N.D
3'N-2 0.80-0.85 NMT 0.6 0.04 0.11 0.11 0.15 0.13 0.05
Unk-0.86 0.86-0.87 NMT 0.5 0.19 0.19 0.21 0.13 0.12
3'N-1 0.90-0.94 NMT 3.4 1.82 1.43 0.71 1.46 0.91 0.77
PO/5'N-1 0.95-0.98 NMT 7.6 3.85 1.88 3.11 3.90 2.33 2.93
FLP 1.00 NLT 85.0 89.65 92.07 92.97 90.85 94.43 94.16
Unk-1.04 1.04-1.06 NMT 2.6 1.34 0.85 1.02 1.95 0.96 1.04
N+1 1.07-1.10 NMT 1.2 1.67 1.45 1.38 0.87 0.41 0.39
CNET 1.11-1.14 NMT 5.2 0.43 0.64 0.42 0.38 0.56 0.53
Unk-1.15 1.15-1.18 NMT 0.5 0.23 0.15 0.14 0.08 0.08 N.D
Unk-1.19 1.19-1.21 NMT 0.5 0.27 0.11 0.04 0.10 0.05 N.D
Unk-1.24 1.24-1.27 NMT 0.5 0.03 N.D. N.D. 0.05 N.D. N.D
Unspecified
Impurities 		NMT 0.3 0.01 0.83 - - - -
0.10 0.03 - - - -
0.03 0.02 - - - -
0.03 0.13 - - - -
0.04 0.02 - - - -
0.02 0.03 - - - -
0.02 0.01 - - - -
0.06 1.06 - - - -
0.05 0.83 - - - -
Total unspecified NMT 2.2 0.34 1.06 - - - -
Total Impurities NMT 15 10.35 7.93 7.03 9.15 5.57 5.84
본 발명의 Test에 따른 IEX-HPLC 분석 정제 시험 결과는 표 7 및 표 8에 나타냈다.
IEXHPLC Test#1 Test#2 Test#3 Test#4 Test#5 Test#6 Test#7
Species RRT Spec. ( % ) %Area
Unk-0.71 0.71-0.78 NMT 0.5 N.D. 0.02 0.02 0.04 N.D. 0.07 N.D.
Unk-0.79 0.79-0.81 NMT 0.6 0.16 0.16 0.15 0.18 0.06 0.21 N.D.
PO/3'N-2 0.87-0.90 NMT 4.8 2.23 1.09 1.20 1.38 0.15 2.99 N.D.
3'N-1/5'N-1 0.94-0.96 NMT 4.2 1.65 1.84 N.D. N.D. N.D. 1.56 2.86
FLP 1 NLT 93.0 95.23 94.63 94.15 94.61 94.91 94.18 96.10
Unk-1.07 1.07-1.10 NMT 1.9 0.73 1.60 1.92 1.19 0.24 0.89 0.95
Unk-1.11 1.11-1.16 NMT 0.6 N.D. 0.63 0.65 0.54 0.11 N.D. N.D.
DMT-on 1.16-1.23 NMT 0.5 N.D. 0.02 0.02 0.04 0.81 0.03 N.D.
Total unspecified NMT 1.0 - 0.04 1.91 2.05 3.71 0.08 0.09
Total Impurities NMT 7.0 4.77 5.37 5.85 5.39 5.09 5.82 3.90
IEXHPLC Test#8 Test#9 Test#10 Test#11 Test#12 Test#13
Species RRT Spec. ( % ) %Area
Unk-0.71 0.71-0.78 NMT 0.5 0.02 0.01 N.D. 0.02 0.03 0.14
Unk-0.79 0.79-0.81 NMT 0.6 N.D. 0.13 0.21 0.14 0.22 N.D.
PO/3'N-2 0.87-0.90 NMT 4.8 1.60 1.27 0.99 0.92 1.44 0.64
3'N-1/5'N-1 0.94-0.96 NMT 4.2 1.83 1.55 1.49 1.55 1.71 1.58
FLP 1 NLT 93.0 94.91 96.29 96.03 95.78 96.21 97.25
Unk-1.07 1.07-1.10 NMT 1.9 1.08 0.53 0.89 1.13 N.D. N.D.
Unk-1.11 1.11-1.16 NMT 0.6 0.09 N.D. 0.32 0.32 0.21 0.29
DMT-on 1.16-1.23 NMT 0.5 0.09 0.21 0.08 0.02 0.03 0.09
Total unspecified NMT 1.0 0.37 - - 0.13 0.19 -
Total Impurities NMT 7.0 5.09 3.71 3.97 4.22 3.79 2.75
5. 한외여과 (Ultrafiltration)
1) 농축 단계(Concentration step)
한외여과는 Pool solution의 농축, 탈염 및 최종 농축액의 회수 공정을 통해 진행된다. 농축 및 탈염 과정의 주요 파라미터(parameter)로 TMP, Permeate로의 손실 및 전도도 등을 확인하였다. 6회 내에 농축 완료 하기 위해 Permeate가 75 mL이 될 때마다 OD 확인하였고, Retentate가 100 mL이 될 때까지 농축하고 농축 시 TMP: Retentate valve 잠김정도 2.82 / Press (PIRC 2500) 2.35로 설정하여 진행하였다.
Permeate OD Vol. (mL) TOD TMP
P1 0.0568 75 4.26 1.50~2.00
P2 0.0542 75 4.07 1.50~2.00
P3 0.1237 75 9.28 1.55~1.90
P4 0.0983 75 7.37 1.55~1.90
P5 0.1135 75 8.51 1.55~1.90
P6 0.1817 85 15.44 1.55~1.90
2) 탈염 단계(Diafiltration step)
농축 진행한 Retentate (100 mL)에 DW (1DV~3DV)를 첨가하고 Permeate로 첨가해준 DW 양만큼 빠져나올 때까지 UF 진행하였으며 Permeate의 전도도를 측정하여 50 μS/cm 이하가 될 때까지 1~2 과정을 반복하였다. Retentate 잠김 정도 2.82 / Press (PIRC 2500) 2.35로 설정하였다. 1 DV 당 16.4회 진행 시 (Permeate 부피: 1635 mL/농축 시작 부피: 100 mL) 전도도가 목표값 만큼 떨어짐을 확인하였다.
Permeate OD Cond . Vol. (mL) TMP
P1 0.1507 62.5 mS/cm 100 1.55~1.90
P2 0.1137 37.4 mS/cm 100 1.55~1.90
P3 0.0504 21.4 mS/cm 100 1.55~1.90
P4 0.0622 12.1 mS/cm 100 1.55~1.90
P5 0.0338 3.5 mS/cm 300 1.55~1.90
P6 0.0449 1058 μs/cm 280 1.55~1.90
P7 0.0556 105 μs/cm 300 1.55~1.90
P8 0.0226 25.4 μs/cm 280 1.55~1.90
P9 0.0996 28.3 μs/cm 75 1.55~1.90
3) 회수 단계(Recovery step)
Skid volume (30 mL)이상 넣어서 세척 후 용액을 회수하였다. (Yield: 56890/58841 × 100 = 96.68%)
Permeate OD Dilution Vol. (mL) TOD
Mockpool 0.5551 200 530 58841
Retentate 0.7833 1000 65 50915
Wash #1 0.5773 200 50 5658
Wash #2 0.6345 20 25 317
6. 동결건조(Lyophilization)
한외여과가 끝난 샘플은 동결건조를 진행하였다. Deep freezer에서 용액을 얼린 후 RPM 1400, 진공 압력 0.001 bar에서 40시간 동안 상온에서 동결건조를 진행하였다 (SCANVAC 100). 각 수율은 표 12에 나타냈다.
Exp name Loading solution API Powder Yield
Test #1 0.60 g 0.59 g 98.3 %
Test #2 2.21 g 2.22 g 100.5%
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

Claims (5)

1) 뉴클레오사이드(nucleoside)의 보호기인 5'-디메톡시트리틸(5'-dimethoxytrityl; DMT)을 제거하기 위해 톨루엔에 녹인 3 내지 15 % 디클로로아세트산(dichloroacetic acid; DCA)를 처리하는 디트리틸레이션(Detritylation) 단계;
2) 포스포아미다이트(phosphoramidite) 용액 및 4,5-디시아노이미다졸(4,5-Dicyanoimidazole; DCI) 용액을 혼합하여 반응시키는 커플링(Coupling) 단계;
3) 2,6-루티딘(2,6-Lutidine)에 녹인 0.1 내지 1.0 M 페닐아세틸 디설파이드(Phenylacetyl disulfide; PADS)를 처리하는 티올화(Thiolation) 단계;
4) N-메틸 이미다졸(N-Methyl imidazole; NMI), 피리딘(Pyridine; PYD) 및 아세토니트릴(Acetonitrile; ACN)이 혼합된 Cap A 용액과, 무수 아세트산(Acetic anhydride; Ac2O) 및 ACN이 혼합된 Cap B 용액을 처리하는 캡핑(Capping) 단계;
5) 상기 제1단계 내지 제4단계를 목적 올리고뉴클레오타이드의 염기서열 수에 따라 반복하여 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계;
6) 상기 합성된 올리고뉴클레오타이드를 정제하는 단계;
7) 상기 정제된 올리고뉴클레오타이드를 한외여과(Ultrafiltration)하는 단계; 및
8) 상기 한외여과된 올리고뉴클레오타이드를 동결건조하는 단계를 포함하는 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 2) 단계의 커플링(Coupling) 단계는 0.1 내지 1.0 M 포스포아미다이트(phosphoramidite) 용액 및 0.5 내지 1.5 M DCI 용액을 4 : 6 또는 1 : 1 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 4) 단계의 캡핑(Capping) 단계는 20% NMI(v/v), 30% PYD(v/v) 및 50% ACN(v/v)이 혼합된 Cap A 용액과, 20% Ac2O(v/v) 및 80% ACN(v/v)이 혼합된 Cap B 용액을 처리하는 것을 특징으로 하는 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 6) 단계의 정제 단계는 25 mM NaOH 및 3 M NaCl이 포함된 완충액으로 용출(elution)하고, 0.5 내지 0.55M NaCl을 포함하는 완충액으로 세척(wash)하는 것을 특징으로 하는 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 고순도 안티센스 올리고뉴클레오타이드 제조방법.
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