WO2022119043A1 - 공액 고분자 기반 바이러스 검출용 복합체 - Google Patents

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complex
virus detection
glycol
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함승주
임종우
박근선
박채원
송대섭
염민주
김현욱
안유림
박지연
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Korea University Research and Business Foundation
University Industry Foundation UIF of Yonsei University
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Korea University Research and Business Foundation
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    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the present invention relates to a conjugated polymer-based virus detection complex, and specifically, a virus detection complex using a change in the optical signal of a conjugated polymer supported in the complex when the virus detection complex and the virus are combined.
  • influenza influenza
  • 'flu' an acute respiratory disease caused by influenza virus. Influenza causes large and small epidemics worldwide, and is very contagious enough to infect 10-20% of the general population within 2-3 weeks after the outbreak begins.
  • influenza virus When infected with influenza virus, a healthy person shows symptoms such as chills, fever, headache, and cough for several days and then recovers. Every year, 5-10% of the adult population and 20-30% of the pediatric population are infected with influenza virus, reaching the level of 1 billion people, of which 150,000 to 500,000 die.
  • Korean Patent Registration No. 10-2050213 discloses a bimolecular fluorescent probe system for in-situ detection of influenza virus having neuraminidase, and the bimolecular fluorescent probe system is sial by neuraminidase in the presence of influenza virus.
  • the bimolecular fluorescent probe system is sial by neuraminidase in the presence of influenza virus.
  • the presence of influenza virus can be detected quickly and with high sensitivity in the field.
  • a gene amplification test such as polymerase chain reaction must be additionally performed to quantify the virus.
  • the present inventors have completed a method for detecting and quantifying a virus using the fact that when the nanocarrier and the virus-derived peptide bind, an optical change occurs due to the non-covalent interaction of the conjugated polymer supported inside the nanocarrier.
  • An object of the present invention is to provide a nanocarrier comprising a first block copolymer polymer and a second block copolymer polymer including a carboxyl group, a conjugated polymer supported inside the nanocarrier; And to provide a complex for virus detection comprising a virus-specific peptide linked by a peptide bond with the carboxyl group of the second block copolymer polymer and its use.
  • a nanocarrier comprising a first block copolymer polymer and a second block copolymer polymer containing a carboxyl group
  • (c) provides a virus detection complex comprising a virus-specific peptide linked to the carboxyl group of the second block copolymer polymer by a peptide bond.
  • block copolymer refers to a copolymer made repeatedly in such a way that one type of monomer is polymerized to form a block, and then another monomer is polymerized to form a block, and such a block copolymer is Materials that can be made are called block copolymer polymers.
  • the first block copolymer polymer is methoxypolyethylene glycol-block-polyamino acid (methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(amino acid)) or methoxypolyethylene glycol-block -lactic acid (methoxy-poly(ethylene glycol)-block-lactic acid, mPEG-b-PLA).
  • the methoxypolyethylene glycol-block-polyamino acid is methoxypolyethylene glycol-block-polyphenylalanine (mPEG-b-pPhe), methoxypolyethylene glycol-block-polyleucine (mPEG-b-pLeu), methoxypolyethylene It is selected from the group consisting of glycol-block-polytryptophan (mPEG-b-pTrp) and methoxypolyethylene glycol-block-polylysine (mPEG-b-pLys), preferably methoxypolyethylene glycol-block-polyphenylalanine ( mPEG-b-pPhe).
  • mPEG-b-pPhe methoxypolyethylene glycol-block-polyphenylalanine
  • mPEG-b-pPhe methoxypolyethylene glycol-block-polyphenylalanine
  • the second block copolymer polymer includes a carboxyl group so that the virus-specific peptide can be linked to the nanocarrier by a peptide bond.
  • carboxymethyl polyethylene glycol-block-polyamino acid carboxymethyl-poly(ethylene glycol)-block-poly(amino acid)
  • carboxymethyl polyethylene glycol-block-lactic acid carboxymethyl-poly(ethylene glycol) )-block-lactic acid
  • CM-PEG-b-PLA carboxymethyl polyethylene glycol-block-polyamino acid
  • the carboxymethyl polyethylene glycol-block-polyamino acid is carboxymethyl polyethylene glycol-block-polyphenylalanine (CM-PEG-b-pPhe), carboxymethyl polyethylene glycol-block-polyleucine (CM-PEG-b-pLeu), carboxy It is selected from the group consisting of methyl polyethylene glycol-block-polytryptophan (CM-PEG-b-pTrp) and carboxymethyl polyethylene glycol-block-polylysine (CM-PEG-b-pLys), preferably carboxymethyl polyethylene glycol -block-polyphenylalanine (CM-PEG-b-pPhe).
  • CM-PEG-b-pPhe carboxymethyl polyethylene glycol-block-polyphenylalanine
  • CM-PEG-b-pPhe carboxymethyl polyethylene glycol-block-polyphenylalanine
  • the first and second block copolymer polymers exhibit self-assembly characteristics due to repulsion and attractive force between polymer chains, and the first and second block copolymer polymers are mixed with each other to form a structure such as micelles.
  • amino acids are located inside the nanocarrier, and methoxypolyethylene glycol in the first block copolymer and carboxymethyl polyethylene glycol in the second block copolymer are positioned outside the nanocarrier.
  • mPEG-b-pPhe and CM-PEG-b-pPhe were dispersed in chloroform, the solution was added to demineralized water to react, and then chloroform was evaporated to obtain a nanocarrier composed of a block copolymer polymer. Thereafter, a conjugated polymer was supported on the inside of the nanocarrier.
  • conjugated polymer is a polymer having a ⁇ -conjugated structure formed due to the repetition of single bonds and double bonds, and shows a lower band gap energy than conventional polymers, resulting from this Electrical conductivity is the main characteristic. In addition, it shows a unique optical signal change in the visible light region due to oxidation-reduction reactions, changes in the ubiquity of electrons in polymers, and non-covalent interactions between polymers.
  • the conjugated polymer is a ⁇ -conjugated structural monomer polymerized
  • the ⁇ -conjugated structural monomer is an aniline derivative, a thiophene derivative, a pyrrole derivative, 3, 4-ethylenedioxythiophene derivatives, azepine derivatives, indole derivatives, carbazole derivatives, fluorine derivatives, phenylene derivatives, pi It may be at least one selected from the group consisting of pyrene derivatives and azulene derivatives.
  • polyaniline in which aniline is polymerized and polypyrrole in which pyrrole is polymerized may be used, and aniline and pyrrole may be supported on the nanocarrier in a molar ratio of 20:1 to 5:1. More preferably, aniline and pyrrole may be supported on the nanocarrier in a molar ratio of 15:1 to 7:1, most preferably 9:1.
  • the stability of the conjugated polymer is lowered when the conjugated polymer is polymerized inside the nanocarrier.
  • the distance between the virus detection complexes becomes close, and a non-covalent interaction occurs between the conjugated polymers supported inside the complex, resulting in an optical signal (absorption wavelength change). ) occurs.
  • This change in absorption wavelength is measured in the visible light region, and for example, when polyaniline and polypyrrole are used as conjugated polymers, the change in absorption wavelength of 430 nm and 630 nm is large.
  • the virus detection peptide is influenza A virus, influenza B virus, dengue virus, human respiratory syncytial virus (RSV), noro Viruses (norovirus), Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV) and SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2, COVID-) 19) may be derived from a virus selected from the group consisting of.
  • Influenza A virus is a virus causing influenza and its subtype is determined by hemagglutanin (HA) antigen and neuramidase (NA) antigen, which are surface antigens. HA antigens are known up to H1-H18, and NA antigens are N1-N9 is known until The subtypes that cause human-to-human infection include H1N1, H2N2, and H3N2, and the subtypes that cause avian influenza include H5N1, H7N9, H5N8, and H5N6.
  • HA antigens are known up to H1-H18
  • NA antigens are N1-N9 is known until The subtypes that cause human-to-human infection include H1N1, H2N2, and H3N2, and the subtypes that cause avian influenza include H5N1, H7N9, H5N8, and H5N6.
  • the peptide for virus detection is preferably a sequence specific to each virus for the sake of accuracy of detection, and for the specific peptide sequence, for example, a sequence known in a public database such as NCBI may be used.
  • the peptide for virus detection derived from influenza A virus may use the sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present inventors have studied a method for simultaneously detecting and quantifying a virus.
  • the target virus binds to the virus-specific peptide on the surface of the complex and the complex aggregates, It was confirmed that the presence or absence of a virus can be detected because the change in the absorption wavelength occurs due to the non-covalent interaction of the conjugated polymer.
  • the virus can be quantified by quantifying the change in the absorption wavelength for each concentration of the virus.
  • another aspect of the present invention provides a composition for confirming virus infection comprising the complex for virus detection as an active ingredient.
  • step (b) measuring the absorbance in the resultant of step (a); provides a method of providing information for diagnosing a virus infection, including.
  • step (a) may be carried out for a certain time so that the virus detection complex can bind to the virus, for example, 5 to 40 minutes, more specifically, 10 minutes to This can be done for 30 minutes.
  • step of measuring the absorbance of step (b) may be performed at an absorption wavelength in the range of 400 nm to 800 nm.
  • the presence or absence of a virus can be confirmed through the change in the absorption wavelength shown by the binding of the complex to the target virus, and the change in the absorption wavelength can be quantified to quantify the virus.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a virus detection principle using a polymer nanocarrier-peptide complex (CPNP-PEP) supported with a conjugated polymer.
  • CPNP-PEP polymer nanocarrier-peptide complex
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a method for synthesizing a polymer nanocarrier-peptide complex (CPNP-PEP) supported with a conjugated polymer according to an example of the present invention.
  • CPNP-PEP polymer nanocarrier-peptide complex
  • Figure 4 is a result of confirming the size distribution of nanoparticles in the CPNP sample and the CPNP-Linker sample with a dynamic light scattering particle size analyzer (dynamic light scattering, DLS).
  • 5 is a graph showing the absorption reaction values according to the content of carboxymethyl polyethylene glycol-block-polyphenylalanine in the CPNP sample and the CPNP-Linker sample.
  • FIG. 6 is a graph showing the change in absorption wavelength after reacting the conjugated polymer-supported polymer nanocarrier (A) and the conjugated polymer-supported polymer nanocarrier-peptide complex (B) with influenza A virus subtype CA04. .
  • CPNP conjugated polymer-supported polymer nanocarrier
  • CPNP-PEP conjugated polymer-supported polymer nanocarrier-peptide complex
  • FIG. 8 is a graph showing the absorption reaction values after reacting the conjugated polymer-supported polymer nanocarrier-peptide complex with influenza A virus subtypes CA04 (A) and H3N2 (B), respectively.
  • FIG. 9 is a graph showing the absorbance response values after the conjugated polymer-supported polymer nanocarrier-peptide complex (CPNP-PEP) was reacted with influenza A virus subtypes CA04 (A) and H3N2 (B), respectively.
  • CPNP-PEP conjugated polymer-supported polymer nanocarrier-peptide complex
  • mPEG-b-pPhe poly(ethylene glycol)-block-poly(phenylalanine)
  • CM-PEG-b-pPhe a block copolymer polymer of carboxymethyl-poly(ethylene glycol) and phenylalanine
  • CPNP conjugated polymer encapsulated nanoparticle
  • EDC Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride
  • Sulfo-NHS N-hydroxysulfosuccinimide
  • the CA04(H1N1) specific peptide (Fmoc-ARLSPTMVHPNGAQP-NH 2 ) was purchased from Peptron Co., Ltd. (Daejeon, Korea).
  • CPNP-PEP polymer nanocarrier having a virus detection peptide bound to the surface and a conjugated polymer supported therein.
  • Figure 2 schematically shows the synthesis method of CPNP-PEP.
  • the change in absorbance according to dilution was compared between the CPNP sample in which CPNP is present as a single particle and the sample in which CPNP is combined as a linker (CPNP-Linker).
  • linker hexamethylenediamine containing amine groups on both sides was used, and the CPNP was artificially aggregated by linking the carboxymethyl functional groups exposed on the surface of the CPNP containing CM-PEG-b-pPhe.
  • CPNP and linker were linked to each other by the EDC/Sulfo-NHS method used to prepare CPNP-PEP.
  • the CPNP sample and the CPNP-Linker sample were analyzed with a dynamic light scattering (DLS).
  • DLS dynamic light scattering
  • Spectral changes according to the concentrations of the CPNP sample and the CPNP-Linker sample were quantified according to Equation 1 and displayed as a graph.
  • a result of confirming the spectral change according to the percentage of CM-PEGb-pPhe contained in CPNP it was found that the spectral difference was most clearly revealed when 80% of CM-PEG-b-pPhe was contained (Fig. 5C; A to D, respectively, the percentage of CM-PEGb-pPhe is 20%, 50%, 80% and 100%).
  • the particle concentration that shows the greatest difference in reactivity depending on the presence or absence of CPNP binding by the linker is It was confirmed that it was 0.3125 mg/ml (FIG. 5C).
  • the above concentration is a suitable concentration for maximizing reactivity.
  • Influenza A virus samples (subtype CA04(H1N1): HA titer 2 ⁇ 10) diluted with CPNP-PEP (0.625 mg/ml) or CPNP (0.625 mg/ml) at various concentrations were 1:1 at room temperature for 20 minutes. The reaction was carried out, and the absorbance was measured to quantify the optical response according to Equation 1.
  • the CPNP-PEP of the present invention can specifically detect influenza A virus.
  • CPNP-PEP (0.0625 mg/ml) was reacted with influenza A virus samples diluted to various concentrations 1:1 at room temperature for 20 minutes, and the absorbance was measured and quantified according to Equation 1.
  • subtype CA04 H1N1
  • subtype H3N2 which have a lot of nucleotide sequence difference from each other, were used.
  • the CPNP-PEP of the present invention can bind to a specific virus according to the specificity of the peptide, and selective and quantitative virus detection is possible by quantifying the change in the absorption wavelength caused by the binding.

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Abstract

본 발명은 공액 고분자 기반 바이러스 검출용 복합체에 관한 것으로, 상기 바이러스 검출용 복합체는 바이러스와 결합하면 흡광 파장이 변하는 특성을 가지며, 이러한 흡광 파장의 변화를 통해 바이러스의 존재 유무를 확인할 수 있고, 흡광 파장의 변화를 수치화하면 바이러스를 정량할 수 있다.

Description

공액 고분자 기반 바이러스 검출용 복합체
본 발명은 공액 고분자 기반 바이러스 검출용 복합체에 관한 것으로 구체적으로 바이러스 검출용 복합체와 바이러스가 결합하면 복합체 내에 담지된 공액 고분자의 광학적 신호가 변하는 것을 이용한 바이러스 검출용 복합체이다.
코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 비롯해 최근 바이러스 감염에 의한 질환이 늘어나고 있다. 바이러스에 의한 질환 중에서 인플루엔자(influenza)는 흔히 '독감'으로 알려져 있고, 인플루엔자 바이러스 (influenza virus)에 의해서 발병되는 급성 호흡기 질환이다. 인플루엔자는 전세계적으로 크고 작은 유행을 일으키며, 유행이 시작되면 2~3주 내에 통상 인구의 10~20%가 감염될 정도로 전염성이 대단히 큰 질병이다.
인플루엔자 바이러스에 감염되면 건강한 사람은 수 일 동안 오한, 발열, 두통, 기침 등의 증상을 보인 후 회복되나 만성 폐질환자, 심장 질환자 및 면역저하자 등은 폐렴과 같은 합병증이 발생하여 사망할 수 있다. 매년 성인 인구의 5~10%, 소아 인구의 20~30%가 인플루엔자 바이러스에 감염되어 최대 10억 명 수준에 이르며, 그 중 15만~50만 명이 사망에 이른다.
이에 바이러스를 검출할 수 있는 다양한 기술이 개발되고 있다. 예를 들어, 국내 등록특허 제10-2050213호에는 뉴라미니데이즈(neuraminidase)를 갖는 인플루엔자 바이러스 현장 검출용 이분자 형광 프로브 시스템이 개시되며, 상기 이분자 형광 프로브 시스템은 인플루엔자 바이러스 존재 시 뉴라미니데이즈에 의해 시알릭산과 갈락토오스가 결합된 구조체로부터 갈락토오스가 분리되어 이분자 형광단백질 프로브 구조체에 결합함으로써 생성되는 형광의 변화를 측정하여 현장에서 인플루엔자 바이러스 존재 여부를 신속하고 높은 감도로 검출할 수 있다. 그러나 상기 방법은 인플루엔자 바이러스의 존재 여부만 확인할 수 있어 바이러스를 정량하려면 중합효소연쇄반응과 같은 유전자증폭검사를 추가로 수행해야 한다.
또한, 금나노입자 및 크로마토그래피를 이용한 가시적 바이러스 감염 진단법은 신속한 검출이 가능하나, 타겟 바이러스에 대한 정량적 검출이 어렵고 금 나노입자의 비특이적 반응을 해결할 필요가 있다.
이러한 상황에서 본 발명자들은 나노 전달체와 바이러스 유래 펩타이드가 결합하면 나노 전달체 내부에 담지된 공액 고분자의 비공유적 상호작용에 의해 광학 변화가 일어나는 것을 이용하여 바이러스를 검출 및 정량하는 방법을 완성하였다.
본 발명의 목적은 제1 블록 공중합체 고분자 및 카르복시기를 포함하는 제2 블록 공중합체 고분자로 이루어진 나노 전달체, 상기 나노 전달체의 내부에 담지된 공액 고분자; 및 제2 블록 공중합체 고분자의 카르복시기과 펩타이드 결합으로 연결되는 바이러스 특이적 펩타이드를 포함하는 바이러스 검출용 복합체와 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은
(a) 제1 블록 공중합체 고분자 및 카르복시기를 포함하는 제2 블록 공중합체 고분자로 이루어진 나노 전달체;
(b) 상기 나노 전달체의 내부에 담지된 공액 고분자; 및
(c) 제2 블록 공중합체 고분자의 카르복시기과 펩타이드 결합으로 연결되는 바이러스 특이적 펩타이드를 포함하는 바이러스 검출용 복합체를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "블록 공중합체(block polymer)"는 한 종의 단량체가 중합되어 블록을 형성하고 이어서 다른 단량체가 중합되어 블록을 형성하는 식으로 반복되어 만들어진 공중합체이며, 이러한 블록 공중합체를 만들 수 있는 물질을 블록 공중합체 고분자라고 한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제1 블록 공중합체 고분자는 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리아미노산 (methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(amino acid)) 또는 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-락틱산 (methoxy-poly(ethylene glycol)-block-lactic acid, mPEG-b-PLA)일 수 있다. 또한, 상기 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리아미노산은 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리페닐알라닌 (mPEG-b-pPhe), 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리류신 (mPEG-b-pLeu), 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리트립토판 (mPEG-b-pTrp) 및 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리라이신 (mPEG-b-pLys)으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리페닐알라닌 (mPEG-b-pPhe)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제2 블록 공중합체 고분자는 나노 전달체에 바이러스 특이적 펩타이드가 펩타이드 결합으로 연결될 수 있도록 카르복시기를 포함한다. 이러한 제2 블록 공중합체에는 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리아미노산 (carboxymethyl-poly(ethylene glycol)-block-poly(amino acid)) 또는 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-락틱산 (carboxymethyl-poly(ethylene glycol)-block-lactic acid, CM-PEG-b-PLA)이 있다. 상기 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리아미노산은 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리페닐알라닌 (CM-PEG-b-pPhe), 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리류신 (CM-PEG-b-pLeu), 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리트립토판 (CM-PEG-b-pTrp) 및 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리라이신 (CM-PEG-b-pLys)으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리페닐알라닌 (CM-PEG-b-pPhe)이다.
상기 제1 및 제2 블록 공중합체 고분자는 고분자 사슬 간의 반발력과 인력으로 인해 자가 조립 특성을 나타내며, 제1 및 제2 블록 공중합체 고분자는 서로 혼합되어 미셀(micelle)과 같은 구조를 형성할 수 있다. 이때 제1 및 제2 블록 공중합체 모두 나노전달체의 내부로는 아미노산이 위치하고, 나노전달체의 외부로는 제1 블록 공중합체는 메톡시폴리에틸렌글리콜, 제2 블록 공중합체는 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜이 위치할 수 있다.
본 발명에서는 클로로포름에 mPEG-b-pPhe 및 CM-PEG-b-pPhe를 분산시키고, 이 용액을 탈염수에 추가하여 반응시킨 후 클로로포름을 증발시켜 블록 공중합체 고분자로 이루어진 나노 전달체를 얻었다. 이후 나노 전달체의 내부에 공액 고분자를 담지시켰다.
본 명세서에서, 용어 "공액 고분자(conjugated polymer)"는 단일결합과 이중결합의 반복으로 인해 형성된 π-공액 구조를 갖는 고분자로 기존의 고분자에 비해 낮은 밴드갭 에너지를 보이고, 이것에 기인한 반도체적 전기 전도성이 주요한 특징이다. 또한, 산화-환원 반응, 고분자 내 전자의 편재성 변화 및 고분자 사이의 비공유적 상호작용에 의해 가시광선 영역에서 고유한 광학적 신호 변화를 보인다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 공액 고분자는 π-공액 구조 단량체가 중합된 것이며, π-공액 구조 단량체는 아닐린(aniline) 유도체, 티오펜(thiophene) 유도체, 피롤(pyrrole) 유도체, 3,4-에틸렌다이옥시티오펜(3,4-ethylenedioxythiophene) 유도체, 아제핀(azepine) 유도체, 인돌(indole) 유도체, 카바졸(carbazole) 유도체, 플루오렌(fluorine) 유도체, 페닐렌(phenylene) 유도체, 파이렌(pyrene) 유도체 및 아줄렌(Azulene) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 종 이상일 수 있다.
바람직하게는 상기 공액 고분자로 아닐린이 중합된 폴리아닐린과 피롤이 중합된 폴리피롤을 사용할 수 있으며, 아닐린과 피롤은 20:1 내지 5:1몰 비로 나노 전달체에 담지될 수 있다. 더욱 바람직하게는 아닐린과 피롤은 15:1 내지 7:1, 가장 바람직하게는 9:1의 몰 비로 나노전달체에 담지될 수 있다. 상기 비율에서 피롤의 함량이 적어지면 나노 전달체 내부에서 공액 고분자를 중합했을 때 공액 고분자의 안정성이 저하되고, 반대로 피롤의 함량을 증가시키면 광학적 신호의 변화율이 감소하여 검출 신호 분석이 어렵게 된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 바이러스 검출용 복합체가 바이러스와 결합하면 바이러스 검출용 복합체끼리의 거리가 가까워지고, 복합체 내부에 담지된 공액 고분자끼리 비공유적 상호작용이 발생하여 광학 신호(흡광 파장 변화)를 발생한다. 이러한 흡광 파장 변화는 가시광선 영역에서 측정되며, 예를 들어 공액 고분자로 폴리아닐린 및 폴리피롤을 사용하면 430 ㎚ 및 630 ㎚의 흡광 파장에서 변화 폭이 크게 나타난다.
본 발명에서, 상기 바이러스 검출용 펩타이드는 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A virus), 인플루엔자 B 바이러스 (influenza B virus), 뎅기 바이러스 (Dengue virus), 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (human respiratory syncytial virus, RSV), 노로바이러스 (norovirus), 메르스 코로나바이러스 (Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV), 사스 코로나바이러스 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV) 및 사스 코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2, COVID-19)로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것일 수 있다.
인플루엔자 A 바이러스는 독감 원인 바이러스로 표면항원인 헤마글루타닌 (HA) 항원과 뉴라미다아제 (NA) 항원에 의해 아형이 결정되며, HA 항원은 H1-H18까지 알려져 있고, NA 항원은 N1-N9까지 알려져 있다. 사람 대 사람 감염을 일으키는 아형에는 H1N1, H2N2 및 H3N2가 있고, 조류 인플루엔자를 유발하는 아형에는 H5N1, H7N9, H5N8, H5N6가 있다.
상기 바이러스 검출용 펩타이드는 검출의 정확성을 위해 각 바이러스에 특이적인 서열인 것이 바람직하며, 구체적인 펩타이드 서열은 예를 들어, NCBI와 같은 공공 데이터베이스에 공지된 서열을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 인플루엔자 A 바이러스에서 유래한 바이러스 검출용 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 서열을 사용할 수 있다.
본 발명자들은 바이러스의 검출과 정량을 동시에 수행할 수 있는 방법을 연구한 결과, 상기 복합체와 검출하고자 하는 표적 바이러스를 접촉시키면 복합체 표면의 바이러스 특이적 펩타이드에 표적 바이러스가 결합하여 복합체가 응집하고, 이에 의한 공액 고분자의 비공유적 상호작용에 의해 흡광 파장의 변화가 발생하므로 바이러스의 존재 유무를 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 바이러스의 농도별 흡광 파장의 변화를 수치화하면 바이러스를 정량할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양상은 상기 바이러스 검출용 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 확인용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양상은
(a) 바이러스의 유무를 확인하고자 하는 시료와 바이러스 감염 확인용 조성물을 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계 (a)의 결과물에서 흡광도를 측정하는 단계;를 포함하는 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단계 (a)는 바이러스 검출용 복합체가 바이러스와 결합할 수 있도록 일정 시간 동안 수행될 수 있으며, 예를 들어 5분 내지 40분, 보다 구체적으로는 10분 내지 30분 동안 수행될 수 있다.
또한, 상기 단계 (b)의 흡광도를 측정하는 단계는 400 ㎚ 내지 800 ㎚ 범위의 흡광 파장에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 바이러스 검출용 복합체를 사용하면, 복합체와 표적 바이러스의 결합에 의해 나타나는 흡광 파장의 변화를 통해 바이러스의 존재 유무를 확인할 수 있고, 흡광 파장의 변화를 수치화하면 바이러스를 정량할 수 있다.
도 1은 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체-펩타이드 복합체(CPNP-PEP)를 이용한 바이러스 검출 원리를 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따라 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체-펩타이드 복합체(CPNP-PEP)를 합성하는 방법을 도식화한 것이다.
도 3은 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체(CPNP)가 단일 입자로 존재하는 CPNP 샘플(A)과 CPNP를 링커로 결합한 CPNP-Linker 샘플(B)에서 농도 희석에 따른 흡광도 변화를 비교한 결과이다.
도 4는 CPNP 샘플과 CPNP-Linker 샘플에서 나노입자의 크기 분포를 동적 광산란 입도분석기(dynamic light scattering, DLS)로 확인한 결과이다.
도 5는 CPNP 샘플과 CPNP-Linker 샘플에서 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리페닐알라닌의 함량에 따른 흡광 반응 수치를 그래프로 표시한 결과이다.
도 6은 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체(A) 및 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체-펩타이드 복합체(B)를 인플루엔자 A 바이러스 아형 CA04와 반응시킨 후 흡광 파장의 변화를 그래프로 표시한 결과이다.
도 7은 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체(CPNP) 및 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체-펩타이드 복합체(CPNP-PEP)를 인플루엔자 A 바이러스 아형 CA04와 반응시킨 후 흡광 반응 수치를 그래프로 표시한 결과이다.
도 8은 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체-펩타이드 복합체를 인플루엔자 A 바이러스 아형 CA04(A) 및 H3N2(B)와 각각 반응시킨 후 흡광 반응 수치를 그래프로 표시한 결과이다.
도 9는 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체-펩타이드 복합체(CPNP-PEP)를 인플루엔자 A 바이러스 아형 CA04(A) 및 H3N2(B)와 각각 반응시킨 후 흡광 반응 수치를 그래프로 표시한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: CPNP-PEP 합성
1-1. 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체 합성
메톡시폴리에틸렌글리콜(methoxy-poly(ethylene glycol), mPEG)과 페닐알라닌 (phenylalanine)의 블록 공중합체 고분자인 mPEG-b-pPhe (poly(ethylene glycol)-block-poly(phenylalanine))를 당 업계에 알려진 방법에 따라 합성하였다. 동일한 방법으로 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜 (carboxymethyl-poly(ethylene glycol), CM-PEG)과 페닐알라닌의 블록 공중합체 고분자인 CM-PEG-b-pPhe를 합성하였다.
합성한 mPEG-b-pPhe와 CM-PEG-b-pPhe의 혼합물 5 ㎎을 클로로포름 1 ㎖에 분산시키고, 탈염수(deionized water, DIW) 10 ㎖이 들어 있는 바이알에 블록 공중합체 고분자가 분산된 상기 클로로포름 용액 1 ㎖를 추가하였다. 오픈한 상태로 바이알을 24시간 동안 600 rpm에서 교반하여, 클로로포름을 증발시켰다 (DIW-chloroform 2-phase system → DIW 1-phase system).
이후 클로로포름이 증발된 결과물에 아닐린(aniline) 20.25 ㎕ (0.225 mmol) 및 피롤(pyrrole) 1.75 ㎕ (0.025 mmol)를 몰비(Molar ratio) 9:1로 추가하여 2시간 동안 교반하였다. 이 과정에서 용액이 전체적으로 투명한 노란색을 띄게 된다. 교반하면서 1M의 APS(ammonium persulfate) 용액 0.5 ㎖를 추가하였다. APS를 첨가하면 용액의 색이 투명한 노란색에서 불투명한 갈색으로 즉각적으로 변한다. 결과물을 냉장고에서 48시간 동안 보관한 후 원심분리(8000 RPM, 10분)로 3회 세척하였다.
이하에서는 상기 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체를 "CPNP (Conjugated polymer encapsulated nanoparticle)"로 기재한다.
1-2. 공액 고분자가 담지된 고분자 나노 전달체와 펩타이드의 결합
EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 및 Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) 용액을 각각 5 ㎎/1.3 ㎖ 및 10 ㎎/1.3 ㎖ 농도로 제조하였다. CPNP 4 ㎖을 400 rpm으로 교반하고, 여기에 상기 EDC 용액 (5 ㎎/1.3 ㎖) 및 Sulfo-NHS (10 ㎎/1.3 ㎖) 용액을 1시간 간격으로 400 ㎕씩 총 2회 첨가하였다. 이후. 인플루엔자 A 바이러스 아형 CA04(H1N1) 특이적 펩타이드(2 ㎎/1 ㎖ in 20% DMSO)를 800 ㎕ 첨가하여 하룻밤 동안 교반하고, 원심분리(8000 RPM, 10분)로 3회 세척하였다. 상기 CA04(H1N1) 특이적 펩타이드 (Fmoc-ARLSPTMVHPNGAQP-NH 2)는 ㈜펩트론(대전, 대한민국)에서 구입하였다.
이하에서는 바이러스 탐지용 펩타이드가 표면에 결합되어 있고, 공액 고분자가 내부에 담지된 고분자 나노 전달체를 "CPNP-PEP"로 기재한다. 도 2에 CPNP-PEP의 합성 방법을 개략적으로 도시하였다.
실험예 1: 단일 CPNP 샘플과 CPNP-Linker 샘플의 차이 확인
나노입자 사이의 거리에 의한 흡광 변화를 확인하기 위해 CPNP가 단일 입자로 존재하는 CPNP 샘플과 CPNP를 링커로 결합시킨 샘플(CPNP-Linker)에 대하여 희석에 따른 흡광도 변화를 비교하였다. 링커는 양쪽에 아민기를 포함하는 헥사메틸렌다이아민 (hexamethylenediamine)을 사용하였으며, CM-PEG-b-pPhe를 포함하는 CPNP의 표면에 드러난 카르복시메틸 작용기들을 연결함으로써 인위적으로 CPNP를 응집시킨다. CPNP와 링커는 CPNP-PEP 제조에 사용한 EDC/Sulfo-NHS 방법으로 서로 연결시켰다.
각 샘플을 0.25 ㎎/㎖부터 0.00782 ㎎/㎖ 농도까지 1/2로 희석하며 흡광 파장을 분석한 결과, CPNP 샘플에서 흡광 파장(430 ㎚ 및 630 ㎚)의 변화가 큰 것을 알 수 있었다 (도 3의 A). 반면, CPNP-Linker 샘플에서는 희석에 의한 입자 사이의 거리 변화가 제한되어 흡광 파장의 변화폭이 적게 나타났다 (도 3의 B). 이 결과를 통해 나노입자 사이의 거리와 흡광 파장 변화의 관계를 확인하였다.
또한, CPNP의 응집 정도를 확인하기 위해 CPNP 샘플과 CPNP-Linker 샘플을 동적 광산란 입도분석기(dynamic light scattering, DLS)로 분석하였다. 분석 결과, CPNP-Linker 샘플에서 더 넓은 입자 분포가 나타나는 것을 확인하여 CPNP-Linker 샘플에서는 입자들이 응집되나, CPNP 샘플에서는 단일 입자 형태로 존재하는 것을 알 수 있었다 (도 4).
CPNP 샘플 및 CPNP-Linker 샘플의 농도에 따른 스펙트럼 변화를 수학식 1에 따라 정량화하여 그래프로 표시하였다. 먼저 CPNP에 포함된 CM-PEGb―pPhe의 백분율에 따른 스펙트럼 변화를 확인한 결과, CM-PEG-b-pPhe가 80% 포함된 경우 스펙트럼 차이가 가장 극명하게 드러나는 것을 알 수 있었다 (도 5의 C; A 내지 D 각각 CM-PEGb―pPhe의 백분율이 20%, 50%, 80% 및 100%). 또한, CPNP-Linker 샘플과 비교하여 단일 입자로 존재하는 CPNP 샘플에서 스펙트럼의 변화폭이 큰 것을 수치화하여 플랏팅(plotting)한 결과, 링커에 의한 CPNP 결합 유무에 따라 반응성 차이가 가장 크게 드러나는 입자 농도는 0.3125 ㎎/㎖인 것을 확인하였다 (도 5의 C). 상기 농도가 반응성 최대화를 위한 적정 농도이다.
[수학식 1]
Optical Response (OR) = (I 430-I * 430) + (I 430-I * 430) (I *=initial value)
실험예 2: CPNP-PEP과 바이러스의 결합 여부 확인
CPNP-PEP (0.625 ㎎/㎖) 또는 CPNP (0.625 ㎎/㎖)를 다양한 농도로 희석한 인플루엔자 A 바이러스 샘플 (아형 CA04(H1N1): HA titer 2^10)과 1:1로 20분 동안 상온에서 반응시키고, 흡광도를 측정하여 수학식 1에 따라 광학 반응(optical response)을 수치화하였다.
확인 결과, CPNP와 인플루엔자 A 바이러스 샘플을 반응시킨 경우 흡광 파장의 변화가 발생하지 않아 CPNP와 인플루엔자 A 바이러스가 결합하지 않는 것을 알 수 있었다. 그러나 CPNP-PEP과 인플루엔자 A 바이러스 샘플을 반응시키면 바이러스 타이터와 비례하여 흡광 변화가 발생했으며, 이는 CPNP-PEP과 인플루엔자 A 바이러스가 결합하였음을 의미한다 (도 6의 A 및 B).
또한, 흡광 반응 수치를 그래프로 표시한 결과 CPNP-PEP과 인플루엔자 A 바이러스 샘플을 반응시킨 경우 바이러스 타이터에 비례하여 광학 반응이 증가하는 것을 알 수 있었다 (도 7). 이 결과는 바이러스-펩타이드 결합에 기인한 입자 응집이 흡광 신호로 나타나는 것을 의미한다.
본 실험예의 결과를 통해 본 발명의 CPNP-PEP이 인플루엔자 A 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 3: CPNP-PEP를 이용한 바이러스 검출 여부 확인
CPNP-PEP (0.0625 ㎎/㎖)를 다양한 농도로 희석한 인플루엔자 A 바이러스 샘플과 1:1로 20분 동안 상온에서 반응시키고, 흡광도를 측정하여 수학식 1에 따라 수치화하였다. 인플루엔자 A 바이러스 샘플은 염기서열이 서로 차이가 많이 나는 아형 CA04(H1N1) 및 아형 H3N2를 사용하였다.
확인 결과, CPNP-PEP과 CPNP와 인플루엔자 A 바이러스 아형 H3N2 샘플을 반응시킨 경우 흡광 파장의 변화가 발생하지 않으나, CPNP-PEP과 인플루엔자 A 바이러스 아형 CA04(H1N1) 샘플을 반응시키면 바이러스 타이터와 비례하여 흡광 변화가 발생하는 것을 알 수 있었다 (도 8의 A 및 B).
또한, 흡광 반응 수치를 그래프로 표시한 결과 CPNP-PEP과 인플루엔자 A 바이러스 아형 CA04(H1N1) 샘플을 반응시킨 경우 바이러스 타이터에 비례하여 광학 반응이 증가하는 것을 알 수 있었다 (도 9).
본 실험예의 결과를 통해 본 발명의 CPNP-PEP이 펩타이드의 특이성에 따라 특정 바이러스와 결합할 수 있고, 결합에 의해 나타나는 흡광 파장의 변화를 수치화하면 선택적이고 정량적인 바이러스 검출이 가능함을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. (a) 제1 블록 공중합체 고분자 및 카르복시기를 포함하는 제2 블록 공중합체 고분자로 이루어진 나노 전달체;
    (b) 상기 나노 전달체의 내부에 담지된 공액 고분자; 및
    (c) 제2 블록 공중합체 고분자의 카르복시기와 펩타이드 결합으로 연결되는 바이러스 특이적 펩타이드를 포함하는 바이러스 검출용 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 블록 공중합체는 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리아미노산 (methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(amino acid)) 또는 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-락틱산 (methoxy-poly(ethylene glycol)-block-lactic acid, mPEG-b-PLA)인, 바이러스 검출용 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리아미노산은 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리페닐알라닌 (mPEG-b-pPhe), 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리류신 (mPEG-b-pLeu), 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리트립토판 (mPEG-b-pTrp) 및 메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-폴리라이신 (mPEG-b-pLys)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 바이러스 검출용 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 블록 공중합체는 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리아미노산 (carboxymethyl-poly(ethylene glycol)-block-poly(amino acid)) 또는 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-락틱산 (carboxymethyl-poly(ethylene glycol)-block-lactic acid, CM-PEG-b-PLA)인, 바이러스 검출용 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리아미노산은 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리페닐알라닌 (CM-PEG-b-pPhe), 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리류신 (CM-PEG-b-pLeu), 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리트립토판 (CM-PEG-b-pTrp) 및 카르복시메틸폴리에틸렌글리콜-블록-폴리라이신 (CM-PEG-b-pLys)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 바이러스 검출용 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 공액 고분자는 π-공액 구조 단량체가 중합된 것인, 바이러스 검출용 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 π-공액 구조 단량체는 아닐린(aniline) 유도체, 티오펜(thiophene) 유도체, 피롤(pyrrole) 유도체, 3,4-에틸렌다이옥시티오펜(3,4-ethylenedioxythiophene) 유도체, 아제핀(azepine) 유도체, 인돌(indole) 유도체, 카바졸(carbazole) 유도체, 플루오렌(fluorine) 유도체, 페닐렌(phenylene) 유도체, 파이렌(pyrene) 유도체 및 아줄렌(Azulene) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 종 이상인 것인, 바이러스 검출용 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 검출용 펩타이드는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 뎅기 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 노로바이러스, 메르스 코로나바이러스, 사스 코로나바이러스및 사스 코로나바이러스-2로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것인, 바이러스 검출용 복합체.
  9. 제8항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스에서 유래한 바이러스 검출용 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 것인, 바이러스 검출용 복합체.
  10. 제1항의 바이러스 검출용 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 확인용 조성물.
  11. (a) 바이러스의 유무를 확인하고자 하는 시료와 제10항의 바이러스 감염 확인용 조성물을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)의 결과물에서 흡광도를 측정하는 단계;를 포함하는
    바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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