WO2022114803A1 - Primer set for personal identification and respiratory viral infection diagnosis, and use thereof - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
Definitions
- the present invention relates to a primer set for personal identification and diagnosis of respiratory viral infections and uses thereof.
- Viruses that cause respiratory diseases not only have very high infectivity, but also show various clinical features. Clinical symptoms caused by each virus vary from the common cold to pneumonia and usually recover within a few days, but cough and fatigue can last for more than 2 weeks, and may cause abdominal pain, vomiting, and convulsions. Pneumonia is the most common complication due to these respiratory diseases, and in the elderly or chronically ill, it leads to death due to worsening of underlying diseases and complications.
- influenza virus As viruses that cause respiratory diseases, influenza virus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus (RSV), adenovirus, etc. are known.
- RSV respiratory syncytial virus
- avian influenza viruses As viruses that cause respiratory diseases, influenza virus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus (RSV), adenovirus, etc. are known.
- SARS-CoV and avian influenza viruses are prevalent, infectious diseases caused by these viruses are becoming more prevalent.
- Respiratory disease viruses generally occur more frequently in winter, but show a continuous infection pattern throughout the year. Among them, adenovirus shows a high incidence from late winter to early summer, and is known to occur sporadically regardless of the season. Respiratory diseases caused by these viruses have not yet been developed with an effective vaccine or therapeutic agent, so they rely on popular therapies such as adequate hydration, stability, antipyretics, and antibiotics to prevent secondary infection. Therefore, a more rapid and accurate diagnosis of viruses that cause respiratory diseases is important for early prevention and effective treatment of disease spread. However, it is difficult to diagnose a viral respiratory infection because it is not only difficult to identify the causative virus clinically, but also to distinguish it from a bacterial respiratory infection, except when it shows relatively characteristic clinical symptoms.
- virus isolation which confirms the cytopathic effect of virus proliferation by inoculating cells sensitive to the virus, is known as the most reliable diagnostic method, but it takes a long time and requires the effort of an experienced researcher.
- basic antibacterial ELISA and IFA, genetic diagnostic methods, etc. have been used to detect virus antigens.
- Korean Patent Registration No. 10-0824414 discloses a single-tube-multiplex RT-PCR method for rapidly and accurately diagnosing viruses related to respiratory infectious diseases and a single-tube-multiplex RT-PCR primer using the same, have.
- the present invention relates to a primer set for personal identification and diagnosis of respiratory viral infections and uses thereof.
- the present invention provides any one or more primer pairs selected from the group consisting of the following first to fifteenth primer pairs for detecting a genetic locus for personal identification: and the following first to fifteenth primer pairs for detecting a respiratory virus It provides a primer set for personal identification and respiratory virus infection diagnosis comprising any one or more primer pairs selected from the group consisting of the 23rd primer pair:
- a first primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2,
- a second primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4,
- a third primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6,
- a fourth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 8;
- a fifth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10;
- a sixth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12;
- a seventh primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 14;
- An eighth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16;
- a ninth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 18;
- a tenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20;
- a twelfth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 23 or 24;
- a thirteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 or 26;
- a 14th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 27 or 28;
- 15th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 30;
- 16th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32;
- 17th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34;
- 18th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 or 36;
- a 19th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38;
- a twentieth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39 or 40;
- 21st primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 41 or 42;
- a 22nd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 43 or 44, and
- a 23rd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46.
- the present invention provides a composition and kit for personal identification and respiratory virus infection diagnosis including the primer set.
- the present invention comprises the steps of amplifying a locus for individual identification and a target sequence for detecting a respiratory virus, respectively, using the primer set and the sample; mixing the amplified personal identification locus amplification product and virus detection amplification product; and analyzing the mixture by capillary electrophoresis.
- the primer set according to the present invention is universalized by simultaneously detecting a locus capable of identifying an individual using a STR (stort tandem repeat) analysis and a PCR amplification method with a target virus gene by a DNA analyzer-based capillary electrophoresis method. Compared to the real-time PCR method, multiple types of respiratory viruses can be detected, and it can be usefully used to confirm which individual is infected with which virus at once.
- STR storage tandem repeat
- 1 is a view showing the results of confirming cDNA synthesized from the RNA gene of the virus in an embodiment of the present invention by an agarose gel electrophoresis method (1: influenza A virus, 2: influenza B virus, 3: rhinovirus, 4: Metapneumovirus, 5-10: novel coronavirus).
- FIG. 2 is a view showing the result of confirming the detection effect by the primer for detecting respiratory disease virus in an embodiment of the present invention by an agarose gel electrophoresis method (1: influenza A virus, 2: adenovirus, 3: rhinovirus, 4: metapneumovirus, 5: novel coronavirus (RdRp), 6: novel coronavirus (E gene), 7: novel coronavirus (N gene), 8: influenza B virus).
- RdRp novel coronavirus
- E gene novel coronavirus
- N gene novel coronavirus
- 8 influenza B virus
- FIG. 3 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing the product amplified with the gene locus for individual identification and the product amplified using the primer for influenza A virus in an embodiment of the present invention.
- FIG. 4 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing the product amplified with the gene locus for individual identification and the product amplified using the primer for influenza B virus in an embodiment of the present invention.
- FIG. 5 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing a product amplified with a locus for individual identification and a product amplified using a primer for adenovirus in an embodiment of the present invention.
- FIG. 6 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing the product amplified with a locus for individual identification and the product amplified using a primer for rhinovirus in an embodiment of the present invention.
- FIG. 7 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing a product amplified with a gene locus for individual identification and a product amplified using a primer for metapneumovirus in an embodiment of the present invention.
- FIG. 8 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing the product amplified with the gene locus for individual identification and the product amplified using the primer for novel coronavirus in an embodiment of the present invention.
- FIG. 9 is a schematic diagram showing a genetic locus for individual identification and a respiratory virus detection position amplified using the primer set according to the present invention.
- the present invention provides any one or more primer pairs selected from the group consisting of the following first to fifteenth primer pairs for detecting a locus for personal identification: and a group consisting of the following sixteenth to twenty-third primer pairs for detecting respiratory viruses It provides a primer set for individual identification and respiratory virus infection diagnosis comprising any one or more primer pairs selected from:
- a first primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2,
- a second primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4,
- a third primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6,
- a fourth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 8;
- a fifth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10;
- a sixth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12;
- a seventh primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 14;
- An eighth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16;
- a ninth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 18;
- a tenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20;
- a twelfth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 23 or 24;
- a thirteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 or 26;
- a 14th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 27 or 28;
- 15th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 30;
- 16th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32;
- 17th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34;
- 18th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 or 36;
- a 19th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38;
- a twentieth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39 or 40;
- 21st primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 41 or 42;
- 22nd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 43 or 44, and
- a 23rd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46.
- the primer set is selected from the group consisting of the following first to fifteenth primer pairs for detecting the genetic locus for personal identification, and the following sixteenth to twenty-third primer pairs for detecting respiratory viruses Any one or more primer pairs may be included. That is, the primer set according to the present invention may include the first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for individual identification, and the sixteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32. In addition, the primer set may include a pair of first to fifteenth primers for detecting the locus for individual identification, and a pair of seventeenth primers comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34.
- the primer set may include first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for individual identification, and an eighteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 or 36.
- the primer set may include a first to fifteenth primer pair for detecting the locus for individual identification, and a nineteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38.
- the primer set includes the first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for personal identification, and the twentieth primer pair consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 39 or 40, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 41 or 42 It may include any one or more primer pairs selected from the group consisting of the 21st primer pair consisting of, and the 22nd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 43 or 44. Furthermore, the primer set may include a first to fifteenth primer pair for detecting the locus for personal identification, and a twenty-third primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46.
- the primer set includes all of the following first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for personal identification, and the following sixteenth to twenty-third primer pairs for detecting respiratory viruses.
- the primers constituting the primer set according to the present invention are 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more or It may have 99% or more homology or include all mutated variants.
- the variant may include all of which one or more bases constituting the primer are substituted, deleted, inserted, or removed.
- the respiratory virus may include all types of respiratory viruses known in the art.
- the respiratory virus is influenza A virus (influenza A virus), influenza B virus (influenza B virus), adenovirus (adenovirus), rhinovirus (rhinovirus), novel coronavirus (SARS-CoV-2) and metapneumo It may be any one or more selected from the group consisting of viruses (metapneumovirus).
- 'molecular detection' refers to a method of detecting various molecular level changes occurring in cells through numerical values or images.
- the molecular diagnosis generally refers to analysis of nucleic acids such as DNA or RNA, but may include protein analysis and intracellular metabolome analysis in a wide range.
- the composition according to the present invention can identify individuals and diagnose respiratory viral infections through DNA analysis.
- the individual identification and diagnosis of respiratory virus infection may be performed by amplifying a genetic locus or a target location present in a respiratory virus gene.
- the amplification of the gene may be performed by any method known in the art.
- the gene amplification may include a polymerase chain reaction, a real time PCR, a multiplex PCR, and the like.
- the primer constituting the primer set may be a conjugate labeled with a detector such as a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope, or a colloid.
- a detector such as a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope, or a colloid.
- the chromogenic enzyme may be peroxidase, alkaline phosphatase or acid phosphatase
- the fluorescent material is thiourea (FTH), 7-acetoxycoumarin-3-yl, fluorescein-5-yl, fluorescein-6-yl , 2',7'-dichlorofluoresin-5-yl, 2',7'-dichlorofluoresin-6-yl, dihydrotetramethylrosamine-4-yl, tetramethylrhodamine-5-yl , tetramethylrhodamine-6-yl, 4,4-difluoro-5,7
- the present invention provides a composition and kit for personal identification and respiratory virus infection diagnosis including the primer set.
- a primer set included in the composition according to the present invention or a respiratory virus that can be diagnosed using the primer set may have the characteristics described above.
- the composition may include a ligand capable of specifically binding to a primer constituting the primer set according to the present invention.
- the ligand may be a conjugate labeled with a detector such as a chromogenic enzyme, a fluorescent material, a radioactive isotope or colloid, and a ligand treated with streptavidin or avidin.
- the composition for detection of the present invention may further include distilled water or a buffer for stably maintaining their structures in addition to the reagents described above.
- the kit may be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing of the primers included therein or separation of the complex.
- a solid substrate synthetic resin, nitrocellulose, glass substrate, metal substrate, glass fiber, microspheres or microbeads may be used.
- synthetic resin polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF or nylon may be used.
- the kit may be prepared by a conventional manufacturing method known to those skilled in the art, and may further include a buffer, a stabilizer, an inactive protein, and the like.
- the kit is a high-throughput screening (high throughput) through a fluorescence method performed by detecting the fluorescence of a fluorescent substance attached as a detector or a radiation method performed by detecting radiation of a radioisotope attached as a detector to detect the amount of a reagent.
- a screening, HTS) system, an SPR (surface plasmon resonance) method that measures changes in surface plasmon resonance in real time without labeling a detector, or an SPRI (surface plasmon resonance imaging) method that confirms the SPR system by imaging can be used.
- the kit may further include a reagent for amplifying a target site, such as a polymerase or dNTP.
- a reagent for amplifying a target site such as a polymerase or dNTP.
- the present invention comprises the steps of amplifying a locus for individual identification and a target sequence for detecting a respiratory virus, respectively, using the primer set and the sample; mixing the amplified personal identification locus amplification product and virus detection amplification product; and analyzing the mixture by capillary electrophoresis.
- the primer set used for the method for providing information necessary for individual identification and diagnosis of respiratory virus infection according to the present invention or a respiratory virus that can be diagnosed using the primer set may have the characteristics as described above.
- the amplification may be performed according to methods known in the art, and may be appropriately modified by those skilled in the art if necessary.
- the sample may include all samples as long as it is a sample for confirming personal identification and virus infection.
- the sample may be a sample derived from a mammal, specifically, a human.
- the sample before being used in the method for providing information necessary for individual identification and respiratory virus infection diagnosis according to the present invention, is subjected to anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, continuous extraction, centrifugation or It may be pre-treated using a method such as gel electrophoresis.
- a locus for use in STR analysis was selected, and a primer set capable of specifically amplifying it was prepared.
- the selected loci are shown in FIG. 1, and the sequences of the prepared primers are shown in Table 1 below.
- primers for TH01, D21S11 and Penta E loci were 6-FAM (fluorescein), D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO and primers for Penta D loci were VIC (ABI, USA), VWA, Primers for the D8S1179, TPOX and FGA loci were labeled NED (ABI, USA), and primers for the Amelogenin and D2S1338 loci were labeled with PET (ABI, USA).
- influenza A virus Specific to influenza A virus, influenza B virus, adenovirus, rhinovirus, novel coronavirus (SARS-CoV-2) and metapneumovirus to prepare a primer that can be detected, and the prepared sequences are shown in Table 2 below.
- SARS-CoV-2 novel coronavirus
- influenza virus primer Sequence 5' ⁇ 3') SEQ ID NO: influenza A virus M protein_F CATCCTGTTGTATATGAGGCCCAT SEQ ID NO: 31 M protein_R GGACTGCAGCGTAGACGCT SEQ ID NO: 32 influenza B virus hrmagglutinin_F GAATCTGCACTGGGATAACATC SEQ ID NO: 33 hrmagglutinin_R TTTTGTTCTGTCRATGCATTATAGG SEQ ID NO: 34 adenovirus hexon_F GCCGAGAAGGGCGTGCGCAGGTA SEQ ID NO: 35 hexon_R TACGCCAACTCCGCCCACGCGCT SEQ ID NO: 36 rhinovirus rhino RNA_F GAAACACGGACACCCAAAGTA SEQ ID NO: 37 rhino RNA_R TCCTCCGGCCCCTGAATG SEQ ID NO: 38 novel coronavirus RdRp_F GCTCGCAAACATACAACGTG SEQ ID NO: 39 RdRp_R CATTAACATTG
- a virus gene to be used as a template for detecting a target virus was prepared using the prepared primer.
- RNA viruses such as influenza A virus, influenza B virus, rhinovirus, novel coronavirus, and metapneumovirus, which are RNA viruses, were synthesized from RNA as cDNA. Specifically, 1 ⁇ g of RNA and 1 ⁇ l of oligo dT were mixed and heated at 42° C. for 4 minutes, which was then cooled on ice.
- Virus detection ability was confirmed by PCR analysis using the primers prepared in Example 2-1.
- PCR reaction 1 ⁇ l of viral template DNA, 5 ⁇ l of 10 ⁇ PCR buffer, 4 ⁇ l of 2.5 mM dNTP, 1 ⁇ l of 25 ⁇ M forward primer, 1 ⁇ l of 25 ⁇ M reverse primer, 0.25 ⁇ l of ExTaq polymerase (Takara , Japan) and 37.75 ⁇ l of distilled water were mixed to prepare a PCR reaction.
- the primers shown in Table 2 were used as the forward and reverse primers, and PCR was performed under the conditions described in Table 3 below. After the PCR reaction was completed, the PCR product was confirmed through agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIG. 2 .
- influenza A virus, influenza B virus, adenovirus, rhinovirus, novel coronavirus and metapneumovirus were specifically amplified by the prepared primers.
- Human genomic DNA was isolated from epithelial cells.
- a cotton swab was rubbed into the oral cavity to collect epithelial cells.
- the surface of the cotton swab from which epithelial cells were collected was separated with tweezers and placed in a new tube.
- 200 ⁇ l of 5% chelex and 4 ⁇ l of proteinase K were put into the tube, and reacted at 63° C. for 10 minutes.
- the tube was reacted at 95° C. for 10 minutes, centrifuged, and only the supernatant was transferred to a new tube to obtain genomic DNA.
- Gene amplification was performed in a conventional manner using the genomic DNA obtained in Experimental Example 1-1 and the viral gene template prepared in Example 2. Thereafter, the PCR product obtained using genomic DNA as a template and the PCR product obtained using each viral gene as a template were mixed in a volume ratio of 1:1. The mixture was analyzed using a 3130XL genotype analyzer (genetic analyzer, 16 capillary, ABI, USA) according to the manufacturer's protocol, and the results are shown in FIGS. 3 to 7 .
Abstract
The present invention relates to a primer set for personal identification and respiratory viral infection diagnosis, and a use thereof. Particularly, a primer set according to the present invention enables a locus, which can identify an individual, and a target viral gene to be simultaneously detected together by using short tandem repeat (STR) analysis and PCR amplification, and thus can be effectively used in determining, all at once, which individual is infected with which virus.
Description
본 발명은 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for personal identification and diagnosis of respiratory viral infections and uses thereof.
호흡기 질환을 야기하는 바이러스는 매우 높은 전염력을 가지고 있을 뿐만 아니라, 다양한 임상양상을 나타낸다. 각각의 바이러스에 의한 임상증상은 일반적인 감기부터 폐렴에 이르기까지 다양하며 보통 수일 내에 회복되나, 기침, 피로감 등은 2주 이상 지속될 수 있으며 복통, 구토, 경련 등을 유발하기도 한다. 이들 호흡기 질환에 의한 합병증으로는 폐렴이 가장 흔하고, 노년층이나 만성 질환자에서는 기저질환 악화 및 합병증으로 인해 사망에 이르기도 한다.Viruses that cause respiratory diseases not only have very high infectivity, but also show various clinical features. Clinical symptoms caused by each virus vary from the common cold to pneumonia and usually recover within a few days, but cough and fatigue can last for more than 2 weeks, and may cause abdominal pain, vomiting, and convulsions. Pneumonia is the most common complication due to these respiratory diseases, and in the elderly or chronically ill, it leads to death due to worsening of underlying diseases and complications.
호흡기 질환을 유발하는 바이러스로 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV), 아데노바이러스(adenovirus) 등이 알려져 있다. 또한 최근에는 사스 코로나 바이러스(SARS-CoV)나 조류 인플루엔자 바이러스 등이 유행하면서 이들 바이러스에 의한 감염병이 유행되고 있다.As viruses that cause respiratory diseases, influenza virus, parainfluenza virus, respiratory syncytial virus (RSV), adenovirus, etc. are known. In addition, recently, as SARS-CoV and avian influenza viruses are prevalent, infectious diseases caused by these viruses are becoming more prevalent.
호흡기 질환 바이러스는 일반적으로 겨울철에 발생빈도가 높으나, 연중 지속적인 감염 양상을 나타낸다. 이중, 아데노바이러스는 늦겨울에서 초여름에 걸쳐 높은 발생빈도를 나타내며, 계절에 관계없이 산발적으로 발생한다고 알려져 있다. 이들 바이러스에 의해 발생하는 호흡기 질환은 효과적인 백신이나 치료제가 아직 개발되지 않아, 감염시 적절한 수분공급, 안정, 해열제 복용, 2차 감염 방지를 위한 항생제 투여 등의 대중적인 요법에 의존하고 있다. 따라서, 호흡기 질환을 유발하는 바이러스의 보다 신속하고 정확한 진단이 질환 확산의 조기 예방과 효과적인 치료에 중요하다. 그러나, 바이러스성 호흡기 감염 질환은 비교적 특징적인 임상 증상을 나타내는 경우를 제외하고는 임상적으로 원인 바이러스의 규명이 어려울뿐만 아니라 세균성 호흡기 감염과 구분이 어렵기 때문에 정확한 진단에 어려움이 있는 실정이다.Respiratory disease viruses generally occur more frequently in winter, but show a continuous infection pattern throughout the year. Among them, adenovirus shows a high incidence from late winter to early summer, and is known to occur sporadically regardless of the season. Respiratory diseases caused by these viruses have not yet been developed with an effective vaccine or therapeutic agent, so they rely on popular therapies such as adequate hydration, stability, antipyretics, and antibiotics to prevent secondary infection. Therefore, a more rapid and accurate diagnosis of viruses that cause respiratory diseases is important for early prevention and effective treatment of disease spread. However, it is difficult to diagnose a viral respiratory infection because it is not only difficult to identify the causative virus clinically, but also to distinguish it from a bacterial respiratory infection, except when it shows relatively characteristic clinical symptoms.
현재 호흡기 질환 바이러스의 검출에는 다양한 방법이 이용되고 있다. 그중에서 해당 바이러스에 대해 감수성이 있는 세포에 접종하여 바이러스 증식에 의한 세포병변 효과를 확인하는 바이러스 분리는 진단법중 가장 확실한 방법으로 알려져 있으나, 시간이 오래걸리고 숙련된 연구자의 노력이 필요하다. 이외에도 바이러스의 항원 검출에 기초항 ELISA 및 IFA 등이나 유전자 진단법 등이 사용되고 있다.Currently, various methods are used to detect respiratory disease viruses. Among them, virus isolation, which confirms the cytopathic effect of virus proliferation by inoculating cells sensitive to the virus, is known as the most reliable diagnostic method, but it takes a long time and requires the effort of an experienced researcher. In addition, basic antibacterial ELISA and IFA, genetic diagnostic methods, etc. have been used to detect virus antigens.
이와 관련하여, 대한민국 특허등록 제10-0824414호는 호흡기 감염 질환과 관련된 바이러스를 신속, 정확하게 진단하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 방법 및 이를 이용한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 프라이머를 개시하고 있다.In this regard, Korean Patent Registration No. 10-0824414 discloses a single-tube-multiplex RT-PCR method for rapidly and accurately diagnosing viruses related to respiratory infectious diseases and a single-tube-multiplex RT-PCR primer using the same, have.
본 발명은 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for personal identification and diagnosis of respiratory viral infections and uses thereof.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 하기 제1 내지 제15 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍: 및 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 하기 제16 내지 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트를 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides any one or more primer pairs selected from the group consisting of the following first to fifteenth primer pairs for detecting a genetic locus for personal identification: and the following first to fifteenth primer pairs for detecting a respiratory virus It provides a primer set for personal identification and respiratory virus infection diagnosis comprising any one or more primer pairs selected from the group consisting of the 23rd primer pair:
서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍,A first primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2,
서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍,A second primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4,
서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍,A third primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6,
서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍,A fourth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 8;
서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍,A fifth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10;
서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍,A sixth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12;
서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍,A seventh primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 14;
서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍,An eighth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16;
서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍,A ninth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 18;
서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍,A tenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20;
서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍,11th primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 or 22;
서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍,A twelfth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 23 or 24;
서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍,A thirteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 or 26;
서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍,A 14th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 27 or 28;
서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍,15th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 30;
서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍,16th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32;
서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍,17th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34;
서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍,18th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 or 36;
서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍,A 19th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38;
서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍,A twentieth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39 or 40;
서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍,21st primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 41 or 42;
서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 및A 22nd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 43 or 44, and
서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍.A 23rd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a composition and kit for personal identification and respiratory virus infection diagnosis including the primer set.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 개인식별용 유전자 좌위 및 호흡기 바이러스를 검출용 표적 서열을 각각 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 개인식별용 유전자 좌위 증폭 산물 및 바이러스 검출용 증폭 산물을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 모세관 전기영동 방법으로 분석하는 단계를 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단에 필요한 정보제공 방법을 제공한다.Further, the present invention comprises the steps of amplifying a locus for individual identification and a target sequence for detecting a respiratory virus, respectively, using the primer set and the sample; mixing the amplified personal identification locus amplification product and virus detection amplification product; and analyzing the mixture by capillary electrophoresis.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 STR(stort tandem repeat) 분석과 PCR 증폭 방법을 사용하여 개개인을 식별할 수 있는 유전자 좌위를 DNA 분석기 기반의 모세관 전기영동 방법으로 표적 바이러스 유전자와 함께 동시에 검출함으로써, 보편화된 실시간 PCR 방법과 비교하여 다종의 호흡기 바이러스를 검출할 수 있고, 어떤 개체가 어떤 바이러스에 감염되었는지를 한번에 확인하는데 유용하게 사용될 수 있다.The primer set according to the present invention is universalized by simultaneously detecting a locus capable of identifying an individual using a STR (stort tandem repeat) analysis and a PCR amplification method with a target virus gene by a DNA analyzer-based capillary electrophoresis method. Compared to the real-time PCR method, multiple types of respiratory viruses can be detected, and it can be usefully used to confirm which individual is infected with which virus at once.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 바이러스의 RNA 유전자로부터 합성된 cDNA를 아가로스 겔 전기영동 방법으로 확인한 결과 도면이다(1: 인플루엔자 A 바이러스, 2: 인플루엔자 B 바이러스, 3: 라이노바이러스, 4: 메타뉴모바이러스, 5~10: 신종 코로나바이러스).1 is a view showing the results of confirming cDNA synthesized from the RNA gene of the virus in an embodiment of the present invention by an agarose gel electrophoresis method (1: influenza A virus, 2: influenza B virus, 3: rhinovirus, 4: Metapneumovirus, 5-10: novel coronavirus).
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 호흡기질환 바이러스 검출을 위한 프라이머에 의한 검출 효과를 아가로스 겔 전기영동 방법으로 확인한 결과 도면이다(1: 인플루엔자 A 바이러스, 2: 아데노바이러스, 3: 라이노바이러스, 4: 메타뉴모바이러스, 5: 신종 코로나바이러스(RdRp), 6: 신종 코로나바이러스(E gene), 7: 신종 코로나바이러스(N gene), 8: 인플루엔자 B 바이러스).2 is a view showing the result of confirming the detection effect by the primer for detecting respiratory disease virus in an embodiment of the present invention by an agarose gel electrophoresis method (1: influenza A virus, 2: adenovirus, 3: rhinovirus, 4: metapneumovirus, 5: novel coronavirus (RdRp), 6: novel coronavirus (E gene), 7: novel coronavirus (N gene), 8: influenza B virus).
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 개인식별을 위한 유전자 좌위를 증폭한 산물과 인플루엔자 A 바이러스에 대한 프라이머를 사용하여 증폭한 산물을 혼합하여 모세관 전기영동을 수행한 결과 도면이다.3 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing the product amplified with the gene locus for individual identification and the product amplified using the primer for influenza A virus in an embodiment of the present invention.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 개인식별을 위한 유전자 좌위를 증폭한 산물과 인플루엔자 B 바이러스에 대한 프라이머를 사용하여 증폭한 산물을 혼합하여 모세관 전기영동을 수행한 결과 도면이다.4 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing the product amplified with the gene locus for individual identification and the product amplified using the primer for influenza B virus in an embodiment of the present invention.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 개인식별을 위한 유전자 좌위를 증폭한 산물과 아데노바이러스에 대한 프라이머를 사용하여 증폭한 산물을 혼합하여 모세관 전기영동을 수행한 결과 도면이다.5 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing a product amplified with a locus for individual identification and a product amplified using a primer for adenovirus in an embodiment of the present invention.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 개인식별을 위한 유전자 좌위를 증폭한 산물과 라이노바이러스에 대한 프라이머를 사용하여 증폭한 산물을 혼합하여 모세관 전기영동을 수행한 결과 도면이다.6 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing the product amplified with a locus for individual identification and the product amplified using a primer for rhinovirus in an embodiment of the present invention.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 개인식별을 위한 유전자 좌위를 증폭한 산물과 메타뉴모바이러스에 대한 프라이머를 사용하여 증폭한 산물을 혼합하여 모세관 전기영동을 수행한 결과 도면이다.7 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing a product amplified with a gene locus for individual identification and a product amplified using a primer for metapneumovirus in an embodiment of the present invention.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 개인식별을 위한 유전자 좌위를 증폭한 산물과 신종 코로나바이러스에 대한 프라이머를 사용하여 증폭한 산물을 혼합하여 모세관 전기영동을 수행한 결과 도면이다.8 is a diagram showing the results of capillary electrophoresis by mixing the product amplified with the gene locus for individual identification and the product amplified using the primer for novel coronavirus in an embodiment of the present invention.
도 9는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭되는 개인식별용 유전자 좌위 및 호흡기 바이러스 검출 위치를 나타낸 모식도이다.9 is a schematic diagram showing a genetic locus for individual identification and a respiratory virus detection position amplified using the primer set according to the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 하기 제1 내지 제15 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍: 및 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 하기 제16 내지 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트를 제공한다:The present invention provides any one or more primer pairs selected from the group consisting of the following first to fifteenth primer pairs for detecting a locus for personal identification: and a group consisting of the following sixteenth to twenty-third primer pairs for detecting respiratory viruses It provides a primer set for individual identification and respiratory virus infection diagnosis comprising any one or more primer pairs selected from:
서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍,A first primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2,
서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍,A second primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4,
서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍,A third primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6,
서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍,A fourth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 8;
서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍,A fifth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10;
서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍,A sixth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12;
서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍,A seventh primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 14;
서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍,An eighth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16;
서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍,A ninth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 18;
서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍,A tenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20;
서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍,11th primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 or 22;
서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍,A twelfth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 23 or 24;
서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍,A thirteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 or 26;
서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍,A 14th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 27 or 28;
서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍,15th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 30;
서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍,16th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32;
서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍,17th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34;
서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍,18th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 or 36;
서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍,A 19th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38;
서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍,A twentieth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39 or 40;
서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍,21st primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 41 or 42;
서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 및22nd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 43 or 44, and
서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍.A 23rd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46.
본 발명의 일 측면에서, 상기 프라이머 세트는 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 하기 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 하기 제16 내지 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및 서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및 서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍, 및 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 나아가, 상기 프라이머 세트는 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및 서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.In one aspect of the present invention, the primer set is selected from the group consisting of the following first to fifteenth primer pairs for detecting the genetic locus for personal identification, and the following sixteenth to twenty-third primer pairs for detecting respiratory viruses Any one or more primer pairs may be included. That is, the primer set according to the present invention may include the first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for individual identification, and the sixteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32. In addition, the primer set may include a pair of first to fifteenth primers for detecting the locus for individual identification, and a pair of seventeenth primers comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34. In addition, the primer set may include first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for individual identification, and an eighteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 or 36. In addition, the primer set may include a first to fifteenth primer pair for detecting the locus for individual identification, and a nineteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38. In addition, the primer set includes the first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for personal identification, and the twentieth primer pair consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 39 or 40, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 41 or 42 It may include any one or more primer pairs selected from the group consisting of the 21st primer pair consisting of, and the 22nd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 43 or 44. Furthermore, the primer set may include a first to fifteenth primer pair for detecting the locus for personal identification, and a twenty-third primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46.
또한, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 프라이머 세트는 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 하기 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 하기 제16 내지 제23 프라이머 쌍을 모두 포함할 수 있다.In addition, in another aspect of the present invention, the primer set includes all of the following first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for personal identification, and the following sixteenth to twenty-third primer pairs for detecting respiratory viruses. can
본 발명에 따른 프라이머 세트를 구성하는 프라이머는 표적 위치에 특이적으로 결합을 유지하는 한, 서열번호 1 내지 46으로 각각 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖거나, 변이된 변이체를 모두 포함할 수 있다. 상기 변이체는 프라이머를 구성하는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 제거된 것을 모두 포함할 수 있다.The primers constituting the primer set according to the present invention are 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more or It may have 99% or more homology or include all mutated variants. The variant may include all of which one or more bases constituting the primer are substituted, deleted, inserted, or removed.
상기 호흡기 바이러스는 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 호흡기 바이러스를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus), 인플루엔자 B 바이러스(influenza B virus), 아데노바이러스(adenovirus), 라이노바이러스(rhinovirus), 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 및 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The respiratory virus may include all types of respiratory viruses known in the art. In one example, the respiratory virus is influenza A virus (influenza A virus), influenza B virus (influenza B virus), adenovirus (adenovirus), rhinovirus (rhinovirus), novel coronavirus (SARS-CoV-2) and metapneumo It may be any one or more selected from the group consisting of viruses (metapneumovirus).
본 발명의 일 측면에서, a) 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍은 인플루엔자 A 바이러스를 검출하고; b) 서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍은 인플루엔자 B 바이러스를 검출하며; c) 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍은 아데노바이러스를 검출하고; d) 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍은 라이노바이러스를 검출하며; e) 서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍, 및 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 신종 코로나바이러스를 검출하고; 및 f) 서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍은 메타뉴모바이러스를 검출할 수 있다.In one aspect of the present invention, a) the 16th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32 detects influenza A virus; b) the 17th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34 detects influenza B virus; c) the 18th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 or 36 detects adenovirus; d) the 19th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38 detects rhinovirus; e) a 20th primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39 or 40, a 21st primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 or 42, and a first consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 43 or 44 any one or more primer pairs selected from the group consisting of 22 primer pairs detect novel coronavirus; And f) the 23rd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46 can detect metapneumovirus.
상기 프라이머 세트를 이용한 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단은 분자진단 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 용어, '분자진단(molecular detection)'은 세포 내에서 일어나는 다양한 분자 수준의 변화를 수치나 영상을 통해 검출해내는 방법을 의미한다. 상기 분자진단은 일반적으로 DNA나 RNA 등의 핵산 분석을 말하나, 넓은 범위에서 단백질 분석 및 세포 내 대사체(metabolome) 분석을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 DNA 분석을 통해 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염을 진단할 수 있다.Individual identification and respiratory virus infection diagnosis using the primer set may be performed using a molecular diagnostic method. The term, 'molecular detection' refers to a method of detecting various molecular level changes occurring in cells through numerical values or images. The molecular diagnosis generally refers to analysis of nucleic acids such as DNA or RNA, but may include protein analysis and intracellular metabolome analysis in a wide range. Specifically, the composition according to the present invention can identify individuals and diagnose respiratory viral infections through DNA analysis.
상기 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염을 진단은 유전자 좌위나 호흡기 바이러스 유전자 내에 존재하는 표적 위치를 증폭하여 수행될 수 있다. 이때, 유전자의 증폭은 통상의 기술분야에 알려진 모든 방법으로 수행될 수 있다. 일례로, 상기 유전자 증폭은 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR), 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 등을 포함할 수 있다.The individual identification and diagnosis of respiratory virus infection may be performed by amplifying a genetic locus or a target location present in a respiratory virus gene. At this time, the amplification of the gene may be performed by any method known in the art. For example, the gene amplification may include a polymerase chain reaction, a real time PCR, a multiplex PCR, and the like.
상기 프라이머 세트를 구성하는 프라이머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.The primer constituting the primer set may be a conjugate labeled with a detector such as a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope, or a colloid. The chromogenic enzyme may be peroxidase, alkaline phosphatase or acid phosphatase, and the fluorescent material is thiourea (FTH), 7-acetoxycoumarin-3-yl, fluorescein-5-yl, fluorescein-6-yl , 2',7'-dichlorofluoresin-5-yl, 2',7'-dichlorofluoresin-6-yl, dihydrotetramethylrosamine-4-yl, tetramethylrhodamine-5-yl , tetramethylrhodamine-6-yl, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-ethyl or 4,4-difluoro Rho-5,7-diphenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-ethyl, Cy3, Cy5, poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC), Rhoda Min-B-isothiocyanate (RITC), PE (Phycoerythrin) or rhodamine.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a composition and kit for personal identification and respiratory virus infection diagnosis including the primer set.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 프라이머 세트나 이를 이용하여 진단할 수 있는 호흡기 바이러스는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.A primer set included in the composition according to the present invention or a respiratory virus that can be diagnosed using the primer set may have the characteristics described above.
또한, 상기 조성물은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 구성하는 프라이머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체가 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.In addition, the composition may include a ligand capable of specifically binding to a primer constituting the primer set according to the present invention. The ligand may be a conjugate labeled with a detector such as a chromogenic enzyme, a fluorescent material, a radioactive isotope or colloid, and a ligand treated with streptavidin or avidin. The composition for detection of the present invention may further include distilled water or a buffer for stably maintaining their structures in addition to the reagents described above.
상기 키트는 이에 포함되는 프라이머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.The kit may be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing of the primers included therein or separation of the complex. In this case, as the solid substrate, synthetic resin, nitrocellulose, glass substrate, metal substrate, glass fiber, microspheres or microbeads may be used. In addition, as the synthetic resin, polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF or nylon may be used.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.In addition, the kit may be prepared by a conventional manufacturing method known to those skilled in the art, and may further include a buffer, a stabilizer, an inactive protein, and the like. The kit is a high-throughput screening (high throughput) through a fluorescence method performed by detecting the fluorescence of a fluorescent substance attached as a detector or a radiation method performed by detecting radiation of a radioisotope attached as a detector to detect the amount of a reagent. A screening, HTS) system, an SPR (surface plasmon resonance) method that measures changes in surface plasmon resonance in real time without labeling a detector, or an SPRI (surface plasmon resonance imaging) method that confirms the SPR system by imaging can be used.
또한, 상기 키트는 중합효소, dNTP 등과 같이 표적 부위를 증폭하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.In addition, the kit may further include a reagent for amplifying a target site, such as a polymerase or dNTP.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 개인식별용 유전자 좌위 및 호흡기 바이러스를 검출용 표적 서열을 각각 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 개인식별용 유전자 좌위 증폭 산물 및 바이러스 검출용 증폭 산물을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 모세관 전기영동 방법으로 분석하는 단계를 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단에 필요한 정보제공 방법을 제공한다.Further, the present invention comprises the steps of amplifying a locus for individual identification and a target sequence for detecting a respiratory virus, respectively, using the primer set and the sample; mixing the amplified personal identification locus amplification product and virus detection amplification product; and analyzing the mixture by capillary electrophoresis.
본 발명에 따른 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단에 필요한 정보제공 방법에 사용되는 프라이머 세트나 이를 이용하여 진단할 수 있는 호흡기 바이러스는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.The primer set used for the method for providing information necessary for individual identification and diagnosis of respiratory virus infection according to the present invention or a respiratory virus that can be diagnosed using the primer set may have the characteristics as described above.
상기 증폭은 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 필요에 의해 통상의 기술자에 의해 적절히 변형될 수 있다.The amplification may be performed according to methods known in the art, and may be appropriately modified by those skilled in the art if necessary.
상기 시료는 개인식별 및 바이러스 감염 여부를 확인하기 위한 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물, 구체적으로 인간 유래의 시료일 수 있다.The sample may include all samples as long as it is a sample for confirming personal identification and virus infection. For example, the sample may be a sample derived from a mammal, specifically, a human.
또한, 본 발명에 따른 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단에 필요한 정보제공 방법에 사용되기 전에 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.In addition, before being used in the method for providing information necessary for individual identification and respiratory virus infection diagnosis according to the present invention, the sample is subjected to anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, continuous extraction, centrifugation or It may be pre-treated using a method such as gel electrophoresis.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples, provided that the following examples are only for illustrating the present invention, and the present invention is not limited thereto. Anything that has substantially the same configuration as the technical idea described in the claims of the present invention and achieves the same operation and effect is included in the technical scope of the present invention.
실시예 1. STR 분석을 위한 프라이머의 제작Example 1. Preparation of primers for STR analysis
STR 분석에 사용하기 위한 유전자 좌위를 선별하고, 이를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 선별된 유전자 좌위를 도 1에, 제작된 프라이머의 서열을 하기 표 1에 나타내었다. 이때, TH01, D21S11 및 Penta E 유전자 좌위에 대한 프라이머는 6-FAM(fluorescein)을, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO 및 Penta D 유전자 좌위에 대한 프라이머는 VIC(ABI, 미국)을, VWA, D8S1179, TPOX 및 FGA 유전자 좌위에 대한 프라이머는 NED(ABI, 미국)를 Amelogenin 및 D2S1338 유전자 좌위에 대한 프라이머는 PET(ABI, 미국)를 표지하였다.A locus for use in STR analysis was selected, and a primer set capable of specifically amplifying it was prepared. The selected loci are shown in FIG. 1, and the sequences of the prepared primers are shown in Table 1 below. At this time, primers for TH01, D21S11 and Penta E loci were 6-FAM (fluorescein), D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO and primers for Penta D loci were VIC (ABI, USA), VWA, Primers for the D8S1179, TPOX and FGA loci were labeled NED (ABI, USA), and primers for the Amelogenin and D2S1338 loci were labeled with PET (ABI, USA).
| 좌위seat | 프라이머primer | 서열(5'→3')Sequence (5'→3') | 서열번호SEQ ID NO: |
| TH01TH01 | TH01FTH01F | GTGATTCCCATTGGCCTGTTCGTGATTCCCATTGGCCTGTTC | 서열번호 1SEQ ID NO: 1 |
| TH01RTH01R | ATTCCTGTGGGCTGAAAAGCTCATTCCTGTGGGCTGAAAAGCTC | 서열번호 2SEQ ID NO: 2 | |
| D21S11D21S11 | D21S11FD21S11F | ATATGTGAGTCAATTCCCCAAGATATGTGAGTCAATTCCCCAAG | 서열번호 3SEQ ID NO: 3 |
| D21S11RD21S11R | TGTATTAGTCAATGTTCTCCAGAGACTGTATTAGTCAATGTTCTCCAGAGAC | 서열번호 4SEQ ID NO: 4 | |
| Penta EPenta E | Penta E-FPenta E-F | ATTACCAACATGAAAGGGTACCAATAATTACCAACATGAAAGGGTACCAATA | 서열번호 5SEQ ID NO: 5 |
| Penta E-RPenta E-R | TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACAATTTTGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACAATTT | 서열번호 6SEQ ID NO: 6 | |
| D5S818D5S818 | D5S818-FD5S818-F | GGTGATTTTCCTCTTTGGTATCCGGTGATTTTCCTCTTTGGTATCC | 서열번호 7SEQ ID NO: 7 |
| D5S818-RD5S818-R | AGCCACAGTTTACAACATTTGTATCTAGCCACAGTTTACAACATTTGTATCT | 서열번호 8SEQ ID NO: 8 | |
| D13S317D13S317 | D13S317FD13S317F | ATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGAATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA | 서열번호 9SEQ ID NO: 9 |
| D13S317RD13S317R | GGCAGCCCAAAAAGACAGAGGCAGCCCAAAAAGACAGA | 서열번호 10SEQ ID NO: 10 | |
| D7S820D7S820 | D7S820FD7S820F | ATGTTGGTCAGGCTGACTATGATTGTTGGTCAGGCTGACTATG | 서열번호 11SEQ ID NO: 11 |
| D7S820RD7S820R | GATTCCACATTTATCCTCATTGACGATTCCACATTTATCCTCATTGAC | 서열번호 12SEQ ID NO: 12 | |
| D16S539D16S539 | D16S539FD16S539F | GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAGGGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG | 서열번호 13SEQ ID NO: 13 |
| D16S539RD16S539R | GTTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATCGTTTGTTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATC | 서열번호 14SEQ ID NO: 14 | |
| CSF1POCSF1PO | CSF1POFCSF1POF | CCGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAGTCCGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAGT | 서열번호 15SEQ ID NO: 15 |
| CSF1PORCSF1POR | ATTTCCTGTGTCAGACCCTGTTATTTCCTGTGTCAGACCCTGTT | 서열번호 16SEQ ID NO: 16 | |
| Penta DPenta D | Penta D-FPenta D-F | GAAGGTCGAAGCTGAAGTGGAAGGTCGAAGCTGAAGTG | 서열번호 17SEQ ID NO: 17 |
| Penta D-RPenta D-R | ATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAGATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAG | 서열번호 18SEQ ID NO: 18 | |
| VWAVWA | VWA-FVWA-F | GCCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATGTGGCCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATTGTG | 서열번호 19SEQ ID NO: 19 |
| VWA-RVWA-R | GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGGGGACAGATGGATAAATACATAGGATGGATGG | 서열번호 20SEQ ID NO: 20 | |
| D8S1179D8S1179 | D8S1179-FD8S1179-F | ATTGCAACTTATATGTATTTTTGTATTTCATGATTGCAACTTATATGTATTTTTGTATTTCATG | 서열번호 21SEQ ID NO: 21 |
| D8S1179-RD8S1179-R | ACCAAATTGTGTTCATGAGTATAGTTTCACCAAATTGTGTTCATGAGTATAGTTTC | 서열번호 22SEQ ID NO: 22 | |
| TPOXTPOX | TPOX-FTPOX-F | GCACAGAACAGGCACTTAGGGCACAGAACAGGCACTTAGG | 서열번호 23SEQ ID NO: 23 |
| TPOX-RTPOX-R | CGCTCAAACGTGAGGTTGCGCTCAAACGTGAGGTTG | 서열번호 24SEQ ID NO: 24 | |
| FGAFGA | FGA-FFGA-F | GGCTGCAGGGCATAACATTAGGCTGCAGGGCATAACATTA | 서열번호 25SEQ ID NO: 25 |
| FGA-RFGA-R | ATTCTATGACTTTGCGCTTCAGGAATTCTATGACTTTGCGCTTCAGGA | 서열번호 26SEQ ID NO: 26 | |
| AmelogeninAmelogenin | Amelogenin-FAmelogenin-F | CCCTTTGAAGTGGTACCAGAGCACCCTTTGAAGTGGTACCAGAGCA | 서열번호 27SEQ ID NO: 27 |
| Amelogenin-RAmelogenin-R | GCATGCCTAATATTTTCAGGGAATAGCATGCCTAATATTTTCAGGGAATA | 서열번호 28SEQ ID NO: 28 | |
| D2S1338D2S1338 | D2S1338-FD2S1338-F | GGATTTGGAAACAGAAATGGCTTGGGATTTGGAAACAGAAATGGCTTG | 서열번호 29SEQ ID NO: 29 |
| D2S1338-RD2S1338-R | CCTAGCACTTAGAACTGTTTCTTGCCTAGCACTTAGAACTGTTTCTTG | 서열번호 30SEQ ID NO: 30 |
실시예 2. 호흡기 바이러스 검출용 프라이머 세트의 제작Example 2. Preparation of primer sets for detection of respiratory viruses
2-1. 프라이머 세트의 제작2-1. Preparation of primer sets
인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus), 인플루엔자 B 바이러스(influenza B virus), 아데노바이러스(adenovirus), 라이노바이러스(rhinovirus), 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 및 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 제작하고, 제작된 서열을 하기 표 2에 나타내었다.Specific to influenza A virus, influenza B virus, adenovirus, rhinovirus, novel coronavirus (SARS-CoV-2) and metapneumovirus to prepare a primer that can be detected, and the prepared sequences are shown in Table 2 below.
| 바이러스virus | 프라이머primer | 서열(5'→3')Sequence (5'→3') | 서열번호SEQ ID NO: |
| 인플루엔자 A 바이러스influenza A virus | M protein_FM protein_F | CATCCTGTTGTATATGAGGCCCATCATCCTGTTGTATATGAGGCCCAT | 서열번호 31SEQ ID NO: 31 |
| M protein_RM protein_R | GGACTGCAGCGTAGACGCTTGGACTGCAGCGTAGACGCT | 서열번호 32SEQ ID NO: 32 | |
| 인플루엔자 B 바이러스influenza B virus | hrmagglutinin_Fhrmagglutinin_F | GAATCTGCACTGGGATAACATCGAATCTGCACTGGGATAACATC | 서열번호 33SEQ ID NO: 33 |
| hrmagglutinin_Rhrmagglutinin_R | TTTGTTCTGTCRATGCATTATAGGTTTTGTTCTGTCRATGCATTATAGG | 서열번호 34SEQ ID NO: 34 | |
| 아데노바이러스adenovirus | hexon_Fhexon_F | GCCGAGAAGGGCGTGCGCAGGTAGCCGAGAAGGGCGTGCGCAGGTA | 서열번호 35SEQ ID NO: 35 |
| hexon_Rhexon_R | TACGCCAACTCCGCCCACGCGCTTACGCCAACTCCGCCCACGCGCT | 서열번호 36SEQ ID NO: 36 | |
| 라이노바이러스rhinovirus | rhino RNA_Frhino RNA_F | GAAACACGGACACCCAAAGTAGAAACACGGACACCCAAAGTA | 서열번호 37SEQ ID NO: 37 |
| rhino RNA_Rrhino RNA_R | TCCTCCGGCCCCTGAATGTCCTCCGGCCCCTGAATG | 서열번호 38SEQ ID NO: 38 | |
| 신종 코로나바이러스novel coronavirus | RdRp_FRdRp_F | GCTCGCAAACATACAACGTGGCTCGCAAACATACAACGTG | 서열번호 39SEQ ID NO: 39 |
| RdRp_RRdRp_R | CATTAACATTGGCCGTGACACATTAACATTGGCCGTGACA | 서열번호 40SEQ ID NO: 40 | |
| E gene_FE gene_F | TTCGGAAGAGACAGGTACGTTATTCGGAAGAGACAGGTACGTTA | 서열번호 41SEQ ID NO: 41 | |
| E gene_RE gene_R | AGCAGTACGCACACAATCGAGCAGTACGCACACACAATCG | 서열번호 42SEQ ID NO: 42 | |
| N gene_FN gene_F | AAGGAAATTTTGGGGACCAGAAGGAAATTTTGGGGACCAG | 서열번호 43SEQ ID NO: 43 | |
| N gene_RN gene_R | GAGTCAGCACTGCTCATGGAGAGTCAGCACTGCTCATGGA | 서열번호 44SEQ ID NO: 44 | |
| 메타뉴모바이러스metapneumovirus | meta RNA_Fmeta RNA_F | GTGATGCACTCAAGAGATACCCGTGATGCACTCAAGAGATACCC | 서열번호 45SEQ ID NO: 45 |
| meta RNA_Rmeta RNA_R | CATTGTTTGACCGGCCCCATAACATTGTTTGACCGGCCCCATAA | 서열번호 46SEQ ID NO: 46 |
2-2. 바이러스 주형의 준비2-2. Preparation of virus template
상기 제작한 프라이머를 사용하여 표적 바이러스를 검출하는데 주형으로 사용될 바이러스 유전자를 준비하였다.A virus gene to be used as a template for detecting a target virus was prepared using the prepared primer.
먼저, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 신종 코로나바이러스 및 메타뉴모바이러스 각각의 유전자를 병원성 바이러스 은행(KBPV)으로부터 분양받았다. 이중에서 RNA 바이러스인 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 라이노바이러스, 신종 코로나바이러스 및 메타뉴모바이러스와 같이 RNA를 유전자로 갖는 바이러스는 RNA를 cDNA로 합성하였다. 구체적으로, 1 ㎍의 RNA 및 1 ㎕의 올리고 dT를 혼합하여 42℃에서 4분 동안 가열하고, 이를 얼음에 냉각시켰다. 이후, 여기에 10 ㎕의 10× 역전사 완충용액, 2 ㎕의 dNTP, 0.5 ㎕의 RNase 억제제, 1 ㎕의 역전사효소 및 4.5 ㎕의 증류수를 첨가하였다. 상기 혼합물을 42℃에서 1시간 동안 반응시키고, 95℃에서 5분 동안 끓여 역전사효소를 비활성화시키고, 합성된 cDNA를 수득하였다. 합성된 cDNA는 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.First, each gene of influenza A virus, influenza B virus, adenovirus, rhinovirus, novel coronavirus and metapneumovirus was distributed from the Pathogenic Virus Bank (KBPV). Among them, RNA viruses such as influenza A virus, influenza B virus, rhinovirus, novel coronavirus, and metapneumovirus, which are RNA viruses, were synthesized from RNA as cDNA. Specifically, 1 μg of RNA and 1 μl of oligo dT were mixed and heated at 42° C. for 4 minutes, which was then cooled on ice. Then, 10 μl of 10× reverse transcription buffer, 2 μl of dNTP, 0.5 μl of RNase inhibitor, 1 μl of reverse transcriptase and 4.5 μl of distilled water were added thereto. The mixture was reacted at 42° C. for 1 hour, boiled at 95° C. for 5 minutes to inactivate reverse transcriptase, and synthesized cDNA was obtained. The synthesized cDNA was confirmed through agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIG. 1 .
도 1에 나타난 바와 같이, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 라이노바이러스, 신종 코로나바이러스 및 메타뉴모바이러스의 cDNA가 합성된 것을 확인하였다.As shown in FIG. 1 , it was confirmed that cDNAs of influenza A virus, influenza B virus, rhinovirus, novel coronavirus and metapneumovirus were synthesized.
2-3. 프라이머의 바이러스 검출능 확인2-3. Confirmation of virus detection ability of primers
상기 실시예 2-1에서 제작한 프라이머를 이용하여 바이러스의 검출능을 PCR 분석 방법으로 확인하였다.Virus detection ability was confirmed by PCR analysis using the primers prepared in Example 2-1.
구체적으로, 1 ㎕의 바이러스 주형 DNA, 5 ㎕의 10× PCR 완충용액, 4 ㎕의 2.5 mM dNTP, 1 ㎕의 25 μM 정방향 프라이머, 1 ㎕의 25 μM 역방향 프라이머, 0.25 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본) 및 37.75 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 이때, 정방향 및 역방향 프라이머는 상기 표 2에 기재된 프라이머를 사용하였으며, PCR은 하기 표 3에 기재된 조건으로 수행되었다. PCR 반응이 끝난 후, PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.Specifically, 1 μl of viral template DNA, 5 μl of 10× PCR buffer, 4 μl of 2.5 mM dNTP, 1 μl of 25 μM forward primer, 1 μl of 25 μM reverse primer, 0.25 μl of ExTaq polymerase (Takara , Japan) and 37.75 μl of distilled water were mixed to prepare a PCR reaction. In this case, the primers shown in Table 2 were used as the forward and reverse primers, and PCR was performed under the conditions described in Table 3 below. After the PCR reaction was completed, the PCR product was confirmed through agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIG. 2 .
| 초기 변성 단계early metamorphic stage |
95℃, 5분95°C, 5 |
1회1 time |
| 변성 단계metamorphic stage | 95℃, 30초95℃, 30 seconds | 35회Episode 35 |
| 어닐링(anneling)annealing | 60℃, 40초60℃, 40 seconds | |
| 연신(elongation)elongation | 72℃, 1분72℃, 1 min | |
| 후기 연신 단계Late Stretching Stage |
72℃, 10분72°C, 10 |
1회1 time |
도 2에 나타난 바와 같이, 제작한 프라이머에 의해 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 신종 코로나바이러스 및 메타뉴모바이러스가 특이적으로 증폭됨을 확인하였다.As shown in FIG. 2 , it was confirmed that influenza A virus, influenza B virus, adenovirus, rhinovirus, novel coronavirus and metapneumovirus were specifically amplified by the prepared primers.
실험예 1. 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 동시 확인Experimental Example 1. Simultaneous confirmation of individual identification and respiratory virus infection
1-1. 게놈 DNA의 분리1-1. Isolation of genomic DNA
인간 게놈 DNA를 상피세포로부터 분리하였다.Human genomic DNA was isolated from epithelial cells.
먼저, 면봉을 구강 내에 문질러 상피세포를 채취하였다. 상피세포를 채취한 면봉의 표면을 핀셋으로 분리하여 새 튜브에 넣었다. 상기 튜브에 200 ㎕의 5% 첼렉스(chelex) 및 4 ㎕의 프로테이나제 K(proteinase K)를 넣고, 63℃에서 10분 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 상기 튜브를 95℃에서 10분 동안 반응시키고, 원심분리하여 상층액만 새 튜브로 옮겨 게놈 DNA를 수득하였다.First, a cotton swab was rubbed into the oral cavity to collect epithelial cells. The surface of the cotton swab from which epithelial cells were collected was separated with tweezers and placed in a new tube. 200 μl of 5% chelex and 4 μl of proteinase K were put into the tube, and reacted at 63° C. for 10 minutes. After the reaction was completed, the tube was reacted at 95° C. for 10 minutes, centrifuged, and only the supernatant was transferred to a new tube to obtain genomic DNA.
1-2. 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염의 확인1-2. Personal identification and confirmation of respiratory viral infection
상기 실험예 1-1에서 수득한 게놈 DNA와 실시예 2에서 준비한 바이러스 유전자 주형을 사용하여 통상적인 방법으로 유전자 증폭을 수행하였다. 이후, 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 수득된 PCR 산물과, 각각의 바이러스 유전자를 주형으로 사용하여 수득된 PCR 산물을 1:1의 부피비로 혼합하였다. 상기 혼합물을 3130XL 유전형 분석기(genetic analyzer, 16 capillary, ABI, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석하고, 그 결과를 도 3 내지 7에 나타내었다.Gene amplification was performed in a conventional manner using the genomic DNA obtained in Experimental Example 1-1 and the viral gene template prepared in Example 2. Thereafter, the PCR product obtained using genomic DNA as a template and the PCR product obtained using each viral gene as a template were mixed in a volume ratio of 1:1. The mixture was analyzed using a 3130XL genotype analyzer (genetic analyzer, 16 capillary, ABI, USA) according to the manufacturer's protocol, and the results are shown in FIGS. 3 to 7 .
도 3 내지 7에 나타난 바와 같이, 개개인의 유전자 좌위에 따른 STR 분석 결과와 호흡기 바이러스의 검출을 확인할 수 있는 피크(peak)가 적절한 비율로 관찰되었다. 따라서, 상기 결과로부터 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염여부를 동시에 확인할 수 있음을 알 수 있었다.As shown in FIGS. 3 to 7 , peaks capable of confirming the detection of respiratory viruses and the results of STR analysis according to individual loci were observed at an appropriate ratio. Therefore, from the above results, it was confirmed that individual identification and respiratory virus infection could be confirmed at the same time.
Claims (7)
- 개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 하기 제1 내지 제15 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍: 및Any one or more primer pairs selected from the group consisting of the following first to fifteenth primer pairs for detecting a genetic locus for identification: and호흡기 바이러스를 검출하기 위한 하기 제16 내지 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트:A primer set for personal identification and respiratory virus infection diagnosis comprising any one or more primer pairs selected from the group consisting of the following 16th to 23rd primer pairs for detecting a respiratory virus:서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍,A first primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2,서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍,A second primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4,서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍,A third primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6,서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍,A fourth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 8;서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍,A fifth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 10;서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍,A sixth primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12;서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍,A seventh primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 14;서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍,An eighth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 16;서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍,A ninth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 18;서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍,A tenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20;서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍,11th primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21 or 22;서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍,A twelfth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 23 or 24;서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍,A thirteenth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 or 26;서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍,A 14th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 27 or 28;서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍,15th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 30;서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍,16th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32;서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍,17th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34;서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍,18th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 or 36;서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍,A 19th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38;서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍,A twentieth primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39 or 40;서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍,21st primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 41 or 42;서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 및22nd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 43 or 44, and서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍.A 23rd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는The method of claim 1, wherein the primer set개인식별용 유전자 좌위를 검출하기 위한 제1 내지 제15 프라이머 쌍, 및first to fifteenth primer pairs for detecting the locus for personal identification, and호흡기 바이러스를 검출하기 위한 제16 내지 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트.A primer set for personal identification and diagnosis of respiratory virus infection, comprising any one or more primer pairs selected from the group consisting of 16th to 23rd primer pairs for detecting respiratory viruses.
- 제1항에 있어서, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus), 인플루엔자 B 바이러스(influenza B virus), 아데노바이러스(adenovirus), 라이노바이러스(rhinovirus), 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 및 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트.According to claim 1, wherein the respiratory virus is influenza A virus (influenza A virus), influenza B virus (influenza B virus), adenovirus (adenovirus), rhinovirus (rhinovirus), novel coronavirus (SARS-CoV-2) And any one or more selected from the group consisting of metapneumovirus (metapneumovirus), personal identification and respiratory virus infection diagnosis primer set.
- 제1항에 있어서,The method of claim 1,a) 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍은 인플루엔자 A 바이러스를 검출하고;a) the 16th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 or 32 detects influenza A virus;b) 서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍은 인플루엔자 B 바이러스를 검출하며;b) the 17th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34 detects influenza B virus;c) 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍은 아데노바이러스를 검출하고;c) the 18th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 or 36 detects adenovirus;d) 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍은 라이노바이러스를 검출하며;d) the 19th primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 or 38 detects rhinovirus;e) 서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍, 및 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 신종 코로나바이러스를 검출하고; 및e) a 20th primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39 or 40, a 21st primer pair consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 or 42, and a first consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 43 or 44 any one or more primer pairs selected from the group consisting of 22 primer pairs detect novel coronavirus; andf) 서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍은 메타뉴모바이러스를 검출하는, 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트.f) The 23rd primer pair consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or 46 is a primer set for individual identification and respiratory virus infection diagnosis, which detects metapneumovirus.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 조성물.A composition for personal identification and respiratory virus infection diagnosis comprising the primer set of claim 1.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 키트.A kit for personal identification and respiratory virus infection diagnosis comprising the primer set of claim 1.
- 제1항의 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 개인식별용 유전자 좌위 및 호흡기 바이러스를 검출용 표적 서열을 각각 증폭시키는 단계;Amplifying a target sequence for detecting a locus for personal identification and a respiratory virus using the primer set and sample of claim 1, respectively;상기 증폭된 개인식별용 유전자 좌위 증폭 산물 및 바이러스 검출용 증폭 산물을 혼합하는 단계; 및mixing the amplified personal identification locus amplification product and virus detection amplification product; and상기 혼합물을 모세관 전기영동 방법으로 분석하는 단계를 포함하는 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단에 필요한 정보제공 방법.A method for providing information necessary for individual identification and respiratory virus infection diagnosis, comprising the step of analyzing the mixture by capillary electrophoresis.
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