WO2022113778A1 - てんかん治療剤 - Google Patents
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Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/18—Sulfonamides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
Definitions
- the present invention has an N-[(1S) -2,2,5,7-tetrafluoro-2,3-dihydro-1H-inden-, which has a GABA transporter 1 (hereinafter referred to as GAT-1) inhibitory action.
- GAT-1 GABA transporter 1
- Therapeutic agents for various epilepsy including intractable epilepsy, containing sulfamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
- Epilepsy is one of the most common central nervous system diseases, and there are more than 50 million patients worldwide. According to the definition of the World Health Organization, "a chronic brain disease caused by various causes, with recurrent seizures (epileptic seizures) resulting from excessive discharge of cerebral neurons as the main symptom, and a variety of clinical and laboratory tests. It is accompanied by the expression of findings. "
- epilepsy is classified into three different levels: seizure type, epilepsy disease type, and epilepsy syndrome.
- Seizures type include focal seizures, generalized seizures, and unknown seizures.
- Epilepsy types include focal epilepsy, generalized epilepsy, generalized focal epilepsy, and epilepsy of unknown type.
- Typical examples of epilepsy syndrome include West syndrome, Lennox-Gastaut syndrome, Dravet syndrome, fragile X syndrome, tuberous sclerosis, and medial temporal lobe epilepsy with hippocampal sclerosis.
- Treatment of epilepsy is centered on drug therapy with antiepileptic drugs (AEDs).
- AEDs antiepileptic drugs
- epilepsy treatment is to eliminate the disappearance of epileptic seizures and to prevent the side effects associated with the treatment.
- treatment with antiepileptic drugs can be started with a single agent.
- Single-agent treatment is usually given sequentially with 2-3 different drugs, and if that does not work, multidrug therapy is given.
- Approximately 70% of newly developed epilepsy patients can be expected to be in remission with antiepileptic drug treatment.
- epileptic seizures are difficult to be suppressed by multidrug therapy with existing drugs for the remaining about 30% of patients.
- Drugs on the market for the treatment of epilepsy include, for example, carbamazepine, etosuccimid, phenobarbital, phenytoin, primidone, sodium valproate, zonisamide, ferbamate, gabapentin, lamotrigine, topiramate, thiagabin, levetyracetam, oxcarbazepine, eslicarba.
- Non-Patent Document 1 There are zepine, pregabalin, lamotrigine, rufinamide, trimetadione, sultium, acetazolamide, bigabatrin, benzodiazepine drugs (chronazepam, clovasam, nitrazepam, diazepam), peranpanel, retigabin and the like.
- These existing antiepileptic drugs exert their effects by suppressing hyperexcitability of nerve cells.
- hyperexcitability there are an approach to suppress excitatory function and an approach to enhance inhibitory function. Examples of approaches to suppress excitatory function include suppression of sodium channels, calcium channels, and AMPA receptors.
- GABA A receptor activation is an example of an approach that enhances inhibitory function. Furthermore, as a method for activating the GABA A receptor, a method for directly activating the GABA A receptor and a method for indirectly activating the GABA A receptor by increasing GABA, which is a ligand for the GABA A receptor. There is. GAT-1 is mainly expressed in nerve cells and has a function of incorporating GABA in the synaptic cleft. Therefore, by inhibiting GAT-1, GABA in the synaptic cleft can be increased, and it can be expected that an antiepileptic effect will be exhibited.
- N-[(1S) -2,2,5,7-tetrafluoro-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl] sulfamide represented by the formula (I) (hereinafter, "compound”).
- (I) ” is a therapeutic coefficient (TD 50 / ED 50 ) comparing the seizure-suppressing effect (ED 50 ) in the mouse kindling model, which is a model of epilepsy, with the neurotoxic effect (TD 50 ) in the rotarod test. ) Is higher than that of the control compound, and it has been reported that it can be used as a safer therapeutic agent for epilepsy (Patent Document 1).
- Patent Document 2 it has been reported that compound (I) exhibits an analgesic effect in various animal models and has a possibility of being used as a pain therapeutic and / or preventive agent. Furthermore, it has been reported that the combined use of compound (I) and an AMPA-type glutamate receptor antagonist can be expected to lead to the provision of safe and effective drug therapy for all cases of epilepsy (Patent Documents). 3).
- Perampanel a novel, orally active, noncompetitive AMPA-receptor antagonist that reduces seizure activity in rodent models of epilepsy
- Epilepsy Vol. 52, No. 7, pp. 1331-1340, 2011
- An object of the present invention is to provide a safe and effective epilepsy therapeutic agent having a wide margin of efficacy and side effects and having applicability not only for cases resistant to drug treatment but also for epilepsy cases in general. ..
- compound (I) has an uncompetitive inhibitory effect on GAT-1 on various spasmodic animal models, thereby affecting physiological synapses.
- the present invention has been completed by finding that it exerts an anti-convulsant effect by selectively acting synapses in an hyperexcited state.
- the present invention relates to ⁇ 1> to ⁇ 31> below.
- ⁇ 3> The epilepsy therapeutic agent according to ⁇ 2>, wherein the epilepsy having focal epilepsy is medial temporal lobe epilepsy (MTLE), focal cortical dysplasia (FCD), or epilepsy having intractable focal epilepsy.
- MTLE medial temporal lobe epilepsy
- FCD focal cortical dysplasia
- ⁇ 3-1> N-[(1S) -2,2,5,7-tetrafluoro-2,3-dihydro-1H-indene-1-yl] sulfamide represented by the formula (I) or a drug thereof.
- GABA transporter 1 GABA transporter 1
- ⁇ 4> N-[(1S) -2,2,5,7-tetrafluoro-2,3-dihydro-1H-indene-1-yl] sulfamide represented by the formula (I): Or a method of treating epilepsy in which the pharmaceutically acceptable salt is administered to a patient in need of it.
- the epilepsy is epilepsy having focal epilepsy.
- the epilepsy having focal epilepsy is MTLE, FCD, or epilepsy having intractable focal epilepsy.
- ⁇ 7> N-[(1S) -2,2,5,7-tetrafluoro-2,3-dihydro-1H-indene-1-yl] sulfamide represented by the formula (I): Or a pharmaceutical composition for the treatment of epilepsy, comprising pharmaceutically acceptable salts and excipients thereof.
- the epilepsy is epilepsy having focal epilepsy.
- the epilepsy having focal epilepsy is MTLE, FCD, or epilepsy having intractable focal epilepsy.
- the epilepsy having focal epilepsy is MTLE, FCD, or epilepsy having refractory focal epilepsy.
- ⁇ 20> A method for treating epilepsy, wherein the GAT-1 inhibitor according to ⁇ 16> is administered to a patient in need thereof.
- the epilepsy is epilepsy having focal epilepsy.
- the epilepsy having focal epilepsy is MTLE, FCD, or epilepsy having intractable focal epilepsy.
- a pharmaceutical composition for treating epilepsy which comprises the GAT-1 inhibitor and excipient according to ⁇ 16>.
- the epilepsy is epilepsy having focal epilepsy.
- ⁇ 25> The pharmaceutical composition according to ⁇ 24>, wherein the epilepsy having focal epilepsy is MTLE, FCD, or epilepsy having intractable focal epilepsy.
- ⁇ 26> Use of the GAT-1 inhibitor according to ⁇ 16> for the production of a therapeutic agent for epilepsy.
- ⁇ 27> The use according to ⁇ 26>, wherein the epilepsy is epilepsy with focal epilepsy.
- ⁇ 28> The use according to ⁇ 27>, wherein the epilepsy having focal epilepsy is MTLE, FCD, or epilepsy having refractory focal epilepsy.
- ⁇ 29> The GAT-1 inhibitor according to ⁇ 16> for use in the treatment of epilepsy.
- the epilepsy having focal epilepsy is MTLE, FCD, or epilepsy having refractory focal epilepsy.
- the present invention relates to N-[(1S) -2,2,5,7-tetrafluoro-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl] sulfamide, which has an uncompetitive inhibitory effect on GAT-1.
- agents containing pharmaceutically acceptable salts Such an agent exhibits remarkable antiepileptic action, has a wide margin of efficacy and side effects, and has potential as a safe and effective therapeutic agent for epilepsy.
- 3 is a graph showing the effect of compound (B) and compound (I) on GABA concentration under excitatory conditions of mouse hippocampus stimulated with high-concentration potassium in Test Example 5. From 60 minutes to 160 minutes after administration, a significant increase in GABA concentration was observed in the compound (I) 100 mg / kg administration group and the compound (B) administration group 10 and 30 mg / kg administration group with respect to the vehicle administration group.
- FIG. 10 is a powder X-ray diffraction pattern of the A-type crystal of the compound (I) obtained in Reference Example 1.
- the horizontal axis shows the diffraction angle (2 ⁇ ), and the vertical axis shows the peak intensity.
- FIG. 11 is a powder X-ray diffraction pattern of the B-type crystal of the compound (I) obtained in Reference Example 2.
- the horizontal axis shows the diffraction angle (2 ⁇ ), and the vertical axis shows the peak intensity.
- FIG. 10 is a powder X-ray diffraction pattern of the A-type crystal of the compound (I) obtained in Reference Example 1.
- the horizontal axis shows the diffraction angle (2 ⁇ )
- the vertical axis shows the peak intensity.
- FIG. 12 is a TG-DTA chart of the A-type crystal of the compound (I) obtained in Reference Example 1.
- the horizontal axis shows the temperature
- the left vertical axis shows the weight change of TG
- the right vertical axis shows the heat flow rate of DTA.
- FIG. 13 is a TG-DTA chart of the B-type crystal of the compound (I) obtained in Reference Example 2.
- the horizontal axis shows the temperature
- the left vertical axis shows the weight change of TG
- the right vertical axis shows the heat flow rate of DTA.
- Compound (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be produced, for example, by the method described in Patent Document 1.
- the "pharmaceutically acceptable salt” is not particularly limited as long as it forms a salt with the compound according to the present invention, and specifically, for example, an inorganic acid salt, an organic acid salt or an acidic amino acid salt. Such as acid addition salts.
- the salt with an inorganic acid for example, a salt with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like can be mentioned.
- a salt with an organic acid for example, acetic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, tartrate acid, citric acid, lactic acid, stearic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like. And salt can be mentioned.
- salt with an acidic amino acid for example, a salt with aspartic acid, glutamic acid, etc. can be mentioned.
- the therapeutic agent for epilepsy of the present invention can be produced by mixing a pharmaceutically acceptable additive with compound (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
- the therapeutic agent for epilepsy of the present invention can be produced according to a known method such as the method described in the 17th revised Japanese Pharmacopoeia general rules for preparation.
- the epilepsy therapeutic agent of the present invention can be appropriately administered to a patient according to its dosage form.
- the dose of the compound (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is the degree of symptoms, the age of the patient, the sex, the body weight, the sensitivity difference, the administration method, the administration time, and the pharmaceutical preparation.
- 100 ⁇ g to 5 g per day, 300 ⁇ g to 3 g in one embodiment, and 1 mg to 1 g in another embodiment are usually injected.
- 30 ⁇ g to 1 g per day, 30 ⁇ g to 500 mg in one embodiment, and 50 ⁇ g to 300 mg in another embodiment are administered once or in several divided doses.
- [Pharmaological test example] The present inventors conducted a study using 6 Hz psychomotor seizure model mice to confirm the inhibitory effect on convulsions.
- a binding test using a tritium label of compound (I) and GAT-1, GABA transporter 2 (GAT-2), GABA transporter 3 (GAT-3) , Betaine / GABA transporter (BGT-1) was used for GABA uptake inhibition test using each forced expression cell.
- the group composition is as shown in Table 1. 60 minutes after the sample administration, electrical stimulation was performed via the cornea to induce convulsions. The presence or absence of convulsions was evaluated by observing each individual for 30 seconds after the end of electrical stimulation. Out of 10 animals in each administration group, the number of individuals showing convulsions was counted (Fig. 1). Based on the number of convulsive individuals, 50% effective doses of compound (I) and compound (A) (compound (I) ED 50 and compound (A) ED 50 , respectively) were calculated by probit analogysis. ⁇ Result> Table 2 shows the ED 50 of each administration group in 6 Hz psychomotor seizure model mice.
- Compound (I) shows a dose-dependent anticonvulsant effect and 100% inhibitory effect at 50 mg / kg
- compound (A) which is an existing antiepileptic drug
- each group was analyzed by Dunnett's test. The significance level was 5% on both sides.
- the binding activity of compound (I) to each group was confirmed by a radioisotope binding experiment using a tritium label of compound (I).
- TB total binding
- each brain synaptosome membrane fraction (protein amount 0.4 mg / tube) and tritium label compound (final concentration 200 nmol / L) of compound (I) were added to each assay tube at 4 ° C. Incubated for 2 hours.
- each assay tube was filled with each brain synaptosome membrane fraction (protein content 0.4 mg / tube) and a tritium label of compound (I) (final concentration 200 nmol / L), compound (I) ( The final concentration (1 mmol / L) was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 2 hours.
- the reaction solutions for TB measurement and NSB measurement were passed through a glass filter and washed 3 times with 50 mmol / L Tris-HCl buffer. The glass filter was transferred to a vial for measuring liquid scintillation, and the liquid scintillator was added and incubated for 3 hours or more.
- the GAT-1 protein expression levels in the brain synaptosome membrane fractions of homozygous GAT-1 knockout mice, heterozygous GAT-1 knockout mice, and wild-type litermate mice are shown in FIG.
- the specific binding of the tritium label of compound (I) in each group is shown in FIG.
- compound (I) (0.0128-1000 ⁇ mol / L) or tiagabine hydrochloride (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., Catalog number T3165, hereinafter referred to as compound (B) (0.256 nmol / L-100 ⁇ mol / L)) and [ 3H ] GABA (0.01-500 ⁇ mol / L) were added, and 37 ° C., 5% CO 2 Incubated for 5 minutes. The cells were washed with cold assay buffer, a liquid scintillator was added, and the cells were incubated at room temperature for 1 hour or longer.
- Vehicle was prepared with a composition of 0.4275 (w / v)% methylcellulose /4.5 (v / v)% cremofol / 10 (v / v)% dimethyl sulfoxide solution.
- Compound (I) was dissolved in dimethylsulfoxide to 100 mg / mL, which was diluted with 0.475 (w / v)% methylcellulose / 5 (v / v)% cremofol solution to 10 mg / mL of compound (I).
- a mL solution was prepared. This was further diluted with Vehicle to prepare 1 mg / mL and 3 mg / mL solutions of compound (I).
- GABA was dissolved in a 50% methanol solution to give a 1 mg / mL GABA standard solution.
- This solution is continuously diluted with Ringer's solution (147.0 mmol / L NaCl, 4.7 mmol / L KCl, 0.6 mmol / L regsvr 4 , 2.5 mmol / L CaCl 2 , 5.0 mmol / L HEPES, pH 7.4). Then, 0.5, 1, 2, 10, 50, 250, 500 and 1000 ng / mL GABA solutions were obtained.
- These solutions were used as GABA standard solutions S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 and S8, respectively.
- GABA-d6 was dissolved in a 50% methanol solution to give a 1 mg / mL internal standard (IS) solution. This solution was diluted with acetonitrile to make a 100 ng / mL IS solution.
- GABA standard solution S3 or S8 was diluted with Ringer's solution and 1.5, 100 and 800 ng / mL (respectively).
- a QC sample solution of n 2) was prepared.
- midazolam Astellas Pharma Co., Ltd.
- medetomidine hydrochloride Nippon Zenyaku Kogyo
- butorphanol tartrate Meiji Seika Pharma
- a guide cannula was implanted in the left hippocampus (2.7 mm posterior to the bregma, 3.3 mm to the left, 1.8 mm below) using a brain localization device (Narishige Scientific Instrument Laboratory, SR-5). The guide cannula was secured to the skull with dental cement. Mice were subcutaneously administered 65 mg / kg of ampicillin sodium (Meiji Seika Pharma) for good recovery. Mice were intraperitoneally administered with 1 mg / kg of atipamezole hydrochloride (Nippon Zenyaku Kogyo) to recover from anesthesia and returned to the cage.
- a microdialysis probe (Acom, AI-4-03) was inserted into the left hippocampus through a guide cannula. The tip of the microdialysis probe reached 4.8 mm below the bregma. The next day, a probe was connected to the perfusion tube and Ringer's solution was perfused with a syringe pump (CMA400400 and CMA800202, CMA) at a flow rate of 1.5 ⁇ L / min. After perfusion for 160 minutes or more, the perfusate (30 ⁇ L / 20 minutes / fraction) was sequentially collected in a tube set at 6 ° C. using a fraction collector (CMA8002770, CMA).
- a syringe pump CMA400400 and CMA800202, CMA
- the perfusate sample No. 1 to 4 (80 to 0 minutes before administration) reflected the GABA concentration under physiological conditions before administration of Vehicle or compound (I)
- the perfusate sample No. 5 to 7 (0 to 60 minutes after administration) and perfusate sample No. 8-12 (60-160 minutes post-dose) reflect the effect of compound (I) on GABA concentration under physiological conditions and under excitatory conditions with high potassium stimulation, respectively.
- the GABA concentration was measured by the following LC-MS / MS method.
- 60 ⁇ L of IS solution was added to 20 ⁇ L of GABA standard solution, QC sample and perfusion sample solution to prepare a sample for analysis.
- 60 ⁇ L of acetonitrile and IS solution were added to 20 ⁇ L of Ringer's solution, respectively to prepare blanks and 0 ng / mL (with IS) samples.
- the samples were set on the autosampler and 20 ⁇ L of each sample was injected into LC-MS / MS.
- the equipment and conditions used are as follows.
- the peak areas of GABA and GABA-d6 (IS) on the SRM chromatogram were integrated, and the peak area ratio of GABA / IS was calculated using the integration software Thermo Xcalibur TM 4.0 (Thermo Fisher Scientific).
- the GABA concentration of each sample was calculated from the regression equation of the standard curve and rounded to three decimal places in ng / mL display.
- the GABA concentration of each sample of each animal was set to the perfusate sample No. It was converted into a ratio of 1 to 4 to the average concentration (assumed to be 100%) and expressed as a ratio (%) to the pre-GABA concentration. For each sample, the average value of the ratio to the pre-GABA concentration and the standard error were calculated, and the change over time of the GABA concentration was examined.
- the GABA concentration under physiological conditions (0 to 60 minutes after administration) and the GABA concentration under excitatory conditions due to high-concentration potassium stimulation (60 to 160 minutes after administration) of the Percentage-administered group and the compound (I) -administered group were examined.
- FIG. 6 shows the mouse hippocampal perfusate sample No. The effect of compound (I) on the extracellular GABA concentration under physiological conditions from 1 to 7 (80 minutes before administration to 60 minutes after administration) is shown.
- FIG. 7 shows the mouse hippocampal perfusate sample No. The effect of compound (I) on the extracellular GABA concentration under physiological conditions from 1 to 12 (80 minutes before administration to 160 minutes after administration) and under excitatory conditions by high-concentration potassium stimulation is shown.
- the GABA concentration increased 75 times the pre-GABA concentration in the first 20-minute sample of the Vehicle-administered group, and an increase in GABA was observed throughout the perfusion of the high-potassium-containing Ringer's solution. rice field.
- Compound (I) promoted an increase in GABA by stimulation with high-concentration potassium.
- the effects of compound (I) in the 30 and 100 mg / kg dose groups were statistically significant compared to the Vehicle dose group.
- Oral administration of compound (I) at doses of 10, 30 or 100 mg / kg did not increase extracellular GABA concentrations in mouse hippocampus under physiological conditions, but high potassium concentrations at doses of 30 and 100 mg / kg.
- the extracellular GABA concentration in the mouse hippocampus was statistically significantly increased under the excitement condition of the stimulus.
- Compound (I) was found to selectively increase the extracellular concentration of GABA in the mouse hippocampus under excitatory conditions.
- FIG. 8 shows the perfusate sample No. of the mouse hippocampus. The effects of compound (B) and compound (I) on extracellular GABA concentration under physiological conditions from 1 to 7 (80 minutes before administration to 60 minutes after administration) are shown. Perfusate sample No.
- the average GABA concentration before administration of Vehicle, compound (B) or compound (I) in 1 to 4 was 1.734 ⁇ 0.176 ng / mL in the Vehicle administration group, and the compound ( B) In the 3, 10 or 30 mg / kg administration group, 1.918 ⁇ 0.121 ng / mL and 1.504 ⁇ 0.148 ng / mL, 1.913 ⁇ 0.236 ng / mL, respectively, and the compound (I) In the 100 mg / kg administration group, it was 1.507 ⁇ 0.152 ng / mL.
- Compound (B) was used in the perfusate sample No. 1 at all doses.
- FIG. 9 shows the mouse hippocampal perfusate sample No. The effects of compound (B) and compound (I) on extracellular GABA concentration under physiological conditions from 1 to 12 (80 to 160 minutes before administration) and under excitatory conditions with high-concentration potassium stimulation are shown.
- the GABA concentration increased 63 times the pre-GABA concentration in the first 20-minute sample of the Vehicle-administered group, and an increase in GABA was observed throughout the perfusion of the high-potassium-containing Ringer's solution. rice field.
- the effects of the 10 and 30 mg / kg compound (B) -administered group and the 100 mg / kg compound (I) -administered group were statistically significant as compared with the Vehicle-administered group.
- Oral administration of compound (I) at a dose of 100 mg / kg statistically significantly enhanced the increase in GABA concentration only under excitatory conditions with high potassium stimulation.
- the pharmacological properties of compound (I) were different from those of compound (B).
- N- (2,2,5,7-tetrafluoro-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl) sulfamide and N-[(1S) -2,2,5,7-tetra used in the production Fluoro-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl] sulfamide can be obtained by a known method, for example, the method described in Example 1 of WO2013 / 191144.
- the obtained powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
- A-type crystals are identified by one or more diffraction peaks selected from the group consisting of diffraction angles (2 ⁇ ⁇ 0.2 °) 6.1 °, 9.6 °, 12.7 ° and 21.7 °. Can be done.
- the obtained powder X-ray diffraction pattern is shown in FIG.
- the B-type crystal has one or more diffractions selected from the group consisting of a diffraction angle (2 ⁇ ⁇ 0.2 °) of 5.2 °, 10.5 °, 11.1 °, 13.9 ° and 15.6 °. It can be identified by the peak.
- the measurement result of the A-type crystal is shown in FIG. 12, and the measurement result of the B-type crystal is shown in FIG.
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Abstract
N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドまたはその薬剤学的に許容される塩を含有する、てんかん治療剤を開示する。
Description
本発明は、GABAトランスポーター1(以下、GAT-1と称す)阻害作用を有する、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドまたはその薬剤学的に許容される塩を含有する、難治てんかんを含む種々てんかんの治療剤に関する。
てんかんは最も頻度の高い中枢神経疾患の1つであり、全世界で約5,000万人以上の患者が存在している。世界保健機関の定義では「種々の病因によってもたらされる慢性の脳疾患であり、大脳ニューロンの過剰な放電から由来する反復性の発作(てんかん発作)を主徴とし、それに変異に富んだ臨床ならびに検査所見の表出が伴う」とされる。
国際抗てんかん連盟(ILAE)により2017年に改訂された新たなてんかん分類では、てんかんは発作型、てんかん病型、てんかん症候群の3つの異なるレベルで分類される。発作型には焦点起始発作、全般起始発作、起始不明発作がある。てんかん病型には焦点てんかん、全般てんかん、全般焦点合併てんかん、病型不明てんかんがある。てんかん症候群の代表例として、West症候群、Lennox-Gastaut症候群、Dravet症候群、脆弱X症候群、結節性硬化症、海馬硬化を伴う内側側頭葉てんかんなどがある。てんかんの治療は、抗てんかん薬(AED)による薬物療法が中心である。てんかん治療の目標はてんかん発作の消失と治療に伴う副作用を発現させないことである。抗てんかん薬物を用いた治療は原則として単剤より始められる。単剤治療は通常2-3種類の異なる薬剤で順次行い、それでも奏功しない場合には、多剤併用治療を行う。新たに発病したてんかん患者の約70%は抗てんかん薬治療で発作の寛解が期待できる。しかしながら、残りの約30%の患者については既存薬剤による多剤併用療法によっても、てんかん発作は抑制され難いことが知られている。
てんかんの治療用に上市されている薬物として、例えばカルバマゼピン、エトサクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド、フェルバメート、ガバペンチン、ラモトリギン、トピラマート、チアガビン、レベチラセタム、オクスカルバゼピン、エスリカルバゼピン、プレガバリン、ラコサミド、ルフィナミド、トリメタジオン、スルチアム、アセタゾラミド、ビガバトリン、ベンゾジアゼピン系薬物(クロナゼパム、クロバザム、ニトラゼパム、ジアゼパム)、ペランパネル、レチガビンなどがある(非特許文献1)。これら既存の抗てんかん薬は、神経細胞の過剰興奮を抑制することにより効果を発現するものである。過剰興奮を抑制するアプローチとして、興奮性機能を抑えるアプローチと抑制性機能を増強させるアプローチがある。興奮性機能を抑えるアプローチの例として、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、AMPA受容体の抑制がある。抑制性機能を増強させるアプローチの例としてGABAA受容体の活性化がある。さらに、GABAA受容体を活性化させる手法として、GABAA受容体を直接活性化させる手法と、GABAA受容体のリガンドであるGABAを増やすことによって間接的にGABAA受容体を活性化させる手法がある。GAT-1は主に神経細胞に発現しており、シナプス間隙のGABAを取り込む機能を有している。したがって、GAT-1を阻害することで、シナプス間隙のGABAを増やすことができ、抗てんかん効果を発現することが期待できる。
抗てんかん薬による薬物療法の重大な課題の1つに、神経機能抑制による毒性症状(めまい、眼振、複視、眠気、嘔吐、運動失調、精神症状、倦怠感、意欲の消失などの症状)がある。これらは、ほとんどの従来の抗てんかん薬において用量依存的に出現する副作用であり、治療薬選択・用量の制限につながる重大な課題である。また、これらは長期服用を必要とするてんかん患者の生活の質を大きく低下させる。よって、有効用量と神経毒性用量との乖離が大きい薬剤が見出せれば、前述の薬剤治療に抵抗性の症例のみならず、てんかんの症例全般に対して安全で効果的な薬物療法の提供につながることが期待できる。
ここで、式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド(以下、「化合物(I)」ともいう。)は、てんかんのモデルであるマウスキンドリングモデルにおける発作抑制作用(ED50)とロータロッド試験での神経毒性作用(TD50)を比較した治療係数(TD50/ED50)が対照化合物に比して高く、より安全性が高いてんかん治療剤としての利用可能性を有することが報告されている(特許文献1)。また、化合物(I)は各種動物モデルでの鎮痛作用を示し、疼痛治療および/または予防剤としての利用可能性を有することが報告されている(特許文献2)。さらに、化合物(I)とAMPA型グルタミン酸受容体拮抗剤とを併用することでてんかんの症例全般に対して安全で効果的な薬物療法の提供につながることが期待できることも報告されている(特許文献3)。
Shrivastavaら, "An overview on antiepileptic drugs", Drug Discoveries & Therapeutics., 6巻, 4号, 178-193頁, 2012年
Bartonら, "Pharmacological characterization of the 6 Hz psychomotor seizure model of partial epilepsy", Epilepsy Research, 47巻, 3号, 217-227頁, 2001年
Fuksら, "Localization and photoaffinity labelling of the levetiracetam binding site in rat brain and certain cell lines", European Journal of Pharmacology, 478巻, 1号, 11-19頁, 2003年
Hanadaら, "Perampanel: a novel, orally active, noncompetitive AMPA-receptor antagonist that reduces seizure activity in rodent models of epilepsy", Epilepsia, 52巻, 7号, 1331-1340頁, 2011年
本発明の課題は、薬効と副作用のマージンが広く、薬剤治療に抵抗性の症例のみならず、てんかんの症例全般に対する利用可能性を有する、安全で効果的なてんかん治療剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討して種々けいれん動物モデルに対して、化合物(I)がGAT-1の不競合阻害作用を示すことで、生理的なシナプスには影響が少なく、過剰興奮状態のシナプス選択的に作用することで抗けいれん効果を発揮することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下<1>から<31>に関する。
<1>式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
またはその薬剤学的に許容される塩を含有する、てんかん治療剤。
<2>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<1>に記載のてんかん治療剤。
<3>焦点発作を有するてんかんが内側側頭葉てんかん(MTLE)、限局性皮質異形成症(FCD)、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<2>に記載のてんかん治療剤。
<3-1>式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドまたはその薬剤学的に許容される塩が、GABAトランスポーター1(GAT-1)を阻害する、<1>~<3>のいずれかに記載のてんかん治療剤。
<4>式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
またはその薬剤学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与する、てんかんの治療方法。
<5>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<4>に記載の治療方法。
<6>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<5>に記載の治療方法。
<7>式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
またはその薬剤学的に許容される塩および賦形剤を含む、てんかん治療のための医薬組成物。
<8>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<7>に記載の医薬組成物。
<9>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<8>に記載の医薬組成物。
<10>てんかん治療剤製造のための式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
またはその薬剤学的に許容される塩の使用。
<11>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<10>に記載の使用。
<12>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<11>に記載の使用。
<13>てんかん治療における使用のための、式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
またはその薬剤学的に許容される塩。
<14>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<13>に記載の使用のための化合物またはその薬剤学的に許容される塩。
<15>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<14>に記載の使用のための化合物またはその薬剤学的に許容される塩。
<16> 式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
またはその薬剤学的に許容される塩を含有するGAT-1阻害剤。
<17>てんかんの治療に用いるための、<16>に記載のGAT-1阻害剤。
<18>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<17>に記載のGAT-1阻害剤。
<19>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<18>に記載のGAT-1阻害剤。
<20><16>に記載のGAT-1阻害剤を、それを必要とする患者に投与する、てんかんの治療方法。
<21>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<20>に記載の治療方法。
<22>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<21>に記載の治療方法。
<23><16>に記載のGAT-1阻害剤および賦形剤を含む、てんかん治療のための医薬組成物。
<24>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<23>に記載の医薬組成物。
<25>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<24>に記載の医薬組成物。
<26>てんかん治療剤製造のための<16>に記載のGAT-1阻害剤の使用。
<27>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<26>に記載の使用。
<28>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<27>に記載の使用。
<29>てんかん治療における使用のための、<16>に記載のGAT-1阻害剤。
<30>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<29>に記載の使用のためのGAT-1阻害剤。
<31>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<30>に記載の使用のためのGAT-1阻害剤。
<1>式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
<2>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<1>に記載のてんかん治療剤。
<3>焦点発作を有するてんかんが内側側頭葉てんかん(MTLE)、限局性皮質異形成症(FCD)、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<2>に記載のてんかん治療剤。
<3-1>式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドまたはその薬剤学的に許容される塩が、GABAトランスポーター1(GAT-1)を阻害する、<1>~<3>のいずれかに記載のてんかん治療剤。
<4>式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
<5>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<4>に記載の治療方法。
<6>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<5>に記載の治療方法。
<7>式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
<8>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<7>に記載の医薬組成物。
<9>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<8>に記載の医薬組成物。
<10>てんかん治療剤製造のための式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
<11>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<10>に記載の使用。
<12>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<11>に記載の使用。
<13>てんかん治療における使用のための、式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
<14>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<13>に記載の使用のための化合物またはその薬剤学的に許容される塩。
<15>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<14>に記載の使用のための化合物またはその薬剤学的に許容される塩。
<16> 式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド:
<17>てんかんの治療に用いるための、<16>に記載のGAT-1阻害剤。
<18>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<17>に記載のGAT-1阻害剤。
<19>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<18>に記載のGAT-1阻害剤。
<20><16>に記載のGAT-1阻害剤を、それを必要とする患者に投与する、てんかんの治療方法。
<21>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<20>に記載の治療方法。
<22>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<21>に記載の治療方法。
<23><16>に記載のGAT-1阻害剤および賦形剤を含む、てんかん治療のための医薬組成物。
<24>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<23>に記載の医薬組成物。
<25>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<24>に記載の医薬組成物。
<26>てんかん治療剤製造のための<16>に記載のGAT-1阻害剤の使用。
<27>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<26>に記載の使用。
<28>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<27>に記載の使用。
<29>てんかん治療における使用のための、<16>に記載のGAT-1阻害剤。
<30>てんかんが焦点発作を有するてんかんである、<29>に記載の使用のためのGAT-1阻害剤。
<31>焦点発作を有するてんかんがMTLE、FCD、または難治性焦点発作を有するてんかんである、<30>に記載の使用のためのGAT-1阻害剤。
本発明は、GAT-1の不競合阻害作用を有する、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドまたはその薬剤学的に許容される塩を含有する薬剤を提供する。かかる薬剤は、顕著な抗てんかん作用を示し、薬効と副作用のマージンが広く、安全で効果的なてんかんの治療剤としての利用可能性を有している。
以下、本発明の内容について詳細に説明する。
化合物(I)またはその薬剤学的に許容される塩は、例えば、特許文献1に記載された方法により製造することができる。
「薬剤学的に許容される塩」とは、本発明に係る化合物と塩を形成されるものであれば特に限定されず、具体的には例えば、無機酸塩、有機酸塩または酸性アミノ酸塩等の酸付加塩が挙げられる。
無機酸との塩の一態様としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の一態様としては、例えば酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、ステアリン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
酸性アミノ酸との塩の一態様としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本発明のてんかん治療剤は、薬剤学的に許容される添加物を、化合物(I)またはその薬剤学的に許容される塩と混和することにより製造することができる。本発明のてんかん治療剤は例えば第十七改正日本薬局方の製剤総則に記載の方法など既知の方法に従って製造することができる。
本発明のてんかん治療剤は、その剤形に応じて適切に患者に投与することができる。
本発明のてんかん治療剤において、化合物(I)またはその薬剤学的に許容される塩の投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、医薬製剤の種類等に応じて異なるが、通常、成人(体重60kg)に対して経口投与する場合、1日あたり100μg~5g、一態様としては300μg~3g、別の態様としては1mg~1gを、注射投与する場合、1日あたり30μg~1g、一態様としては30μg~500mg、別の態様としては50μg~300mgを1回または数回に分けて投与する。
〔薬理試験例〕
本発明者らは、けいれんに対する抑制効果を確認するために6Hz精神運動発作モデルマウスを用いて研究を行った。また、化合物(I)の作用機序を確認するために化合物(I)のトリチウムラベル体を用いた結合試験およびGAT-1,GABA transporter 2(GAT-2),GABA transporter 3(GAT-3),Betaine/GABA transporter(BGT-1)の各強制発現細胞を用いたGABA取込み阻害試験を行った。
本発明者らは、けいれんに対する抑制効果を確認するために6Hz精神運動発作モデルマウスを用いて研究を行った。また、化合物(I)の作用機序を確認するために化合物(I)のトリチウムラベル体を用いた結合試験およびGAT-1,GABA transporter 2(GAT-2),GABA transporter 3(GAT-3),Betaine/GABA transporter(BGT-1)の各強制発現細胞を用いたGABA取込み阻害試験を行った。
[試験例1]6Hz精神運動発作モデルマウスを用いたけいれんに対する抑制効果確認試験
けいれんに対する抑制効果を確認するため、6Hz精神運動発作モデルマウスを用いた試験を実施した。このモデルは、薬剤抵抗性の焦点発作モデルとして知られている(非特許文献2)。
<方法>
5週齢の雄性Scl:ddYマウス(日本エスエルシー(株))を試験に供した(各処置でn=10)。角膜を介する電気刺激(44mA,6Hz,0.2ms rectangular pulse width,3s duration)によって誘発されるけいれんの有無を評価の指標とした。次の4つの内、1つ以上の行動を示す個体をけいれん有りと判定した(stun,forelimb clonus,twitching of the vibrissae,Straub-tail;非特許文献2)。
化合物(I)またはレベチラセタム(東京化成工業(株)、カタログ番号L0234、以下、化合物(A)という)を、それぞれ10mL/kgの投与容量になるように0.45%メチルセルロース/4.5%クレモフォール/10%ジメチルスルホキシド溶液に溶解して検体を調製し、経口投与した。ネガティブコントロールとして、化合物を含まない上記混合溶液(Vehicle)を使用した。群構成は表1の通りである。検体投与60分後に角膜を介する電気刺激を行い、けいれんを誘発させた。電気刺激終了後30秒間、各個体を観察することでけいれんの有無を評価した。各投与群10匹中、けいれんを示した個体数をカウントした(図1)。
上記けいれん個体数を基に、化合物(I)および化合物(A)の50%有効用量(それぞれ化合物(I) ED50,化合物(A) ED50)をprobit analysisにより算出した。
<結果>
6Hz精神運動発作モデルマウスにおける各投与群のED50を表2に示す。化合物(I)は用量依存的に抗けいれん効果を示し、50mg/kgでは100%の阻害効果を示すのに対し、既存の抗てんかん薬である化合物(A)は100mg/kgおよび200mg/kgで部分的な阻害効果しか示さないことが明らかとなった。この結果は、本発明に係る薬剤のけいれんに対する顕著な抑制効果を示すものである。
けいれんに対する抑制効果を確認するため、6Hz精神運動発作モデルマウスを用いた試験を実施した。このモデルは、薬剤抵抗性の焦点発作モデルとして知られている(非特許文献2)。
<方法>
5週齢の雄性Scl:ddYマウス(日本エスエルシー(株))を試験に供した(各処置でn=10)。角膜を介する電気刺激(44mA,6Hz,0.2ms rectangular pulse width,3s duration)によって誘発されるけいれんの有無を評価の指標とした。次の4つの内、1つ以上の行動を示す個体をけいれん有りと判定した(stun,forelimb clonus,twitching of the vibrissae,Straub-tail;非特許文献2)。
化合物(I)またはレベチラセタム(東京化成工業(株)、カタログ番号L0234、以下、化合物(A)という)を、それぞれ10mL/kgの投与容量になるように0.45%メチルセルロース/4.5%クレモフォール/10%ジメチルスルホキシド溶液に溶解して検体を調製し、経口投与した。ネガティブコントロールとして、化合物を含まない上記混合溶液(Vehicle)を使用した。群構成は表1の通りである。検体投与60分後に角膜を介する電気刺激を行い、けいれんを誘発させた。電気刺激終了後30秒間、各個体を観察することでけいれんの有無を評価した。各投与群10匹中、けいれんを示した個体数をカウントした(図1)。
上記けいれん個体数を基に、化合物(I)および化合物(A)の50%有効用量(それぞれ化合物(I) ED50,化合物(A) ED50)をprobit analysisにより算出した。
<結果>
6Hz精神運動発作モデルマウスにおける各投与群のED50を表2に示す。化合物(I)は用量依存的に抗けいれん効果を示し、50mg/kgでは100%の阻害効果を示すのに対し、既存の抗てんかん薬である化合物(A)は100mg/kgおよび200mg/kgで部分的な阻害効果しか示さないことが明らかとなった。この結果は、本発明に係る薬剤のけいれんに対する顕著な抑制効果を示すものである。
[試験例2]GAT-1ノックアウトマウス全脳サンプルを用いた結合試験
GAT-1ノックアウトマウス全脳サンプルにおける化合物(I)の結合活性を確認するため、本試験を実施した。
<方法>
10週齢の雄性ホモ接合型GAT-1ノックアウトマウス、ヘテロ接合型GAT-1ノックアウトマウス、野生型リッターメイトマウス(Deltagen社)から既報(非特許文献3および4)に基づいて調製した脳シナプトソーム膜画分を試験に供した(n=3)。
各群におけるGAT-1タンパク質発現はウェスタンブロッティングにより確認した。1次抗体としてrabbit anti-GAT1 monoclonal antibody(Abcam社)あるいはrabbit anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)monoclonal antibody(Cell Signaling Technology社)を使用した。2次抗体としてhorseradish peroxidase(HRP)-linked anti-rabbit IgG(GE Healthcare社)を使用した。HRP基質の添加により生じた化学発光強度を定量し、サンプルごとにGAT-1タンパク質発現レベル(=GAT-1特異的な化学発光強度/GAPDH特異的な化学発光強度)を算出した。野生型リッターメイト群におけるGAT-1タンパク質発現レベルの平均値を100%としたときの、各群におけるGAT-1タンパク質発現レベルの平均値を算出した。野生型リッターメイト群に対する各群の統計学的有意性について、Dunnett検定により解析した。有意水準は両側5%とした。
各群に対する化合物(I)の結合活性は、化合物(I)のトリチウムラベル体を用いたラジオアイソトープ結合実験により確認した。Total Binding(TB)測定用に、各アッセイチューブに各脳シナプトソーム膜画分(タンパク質量0.4mg/チューブ)と化合物(I)のトリチウムラベル体(最終濃度200nmol/L)を加え、4℃で2時間インキュベートした。Nonspecific Binding(NSB)測定用に、各アッセイチューブに各脳シナプトソーム膜画分(タンパク質量0.4mg/チューブ)と化合物(I)のトリチウムラベル体(最終濃度200nmol/L)、化合物(I)(最終濃度1mmol/L)を加え、4℃で2時間インキュベーションした。TB測定用およびNSB測定用の反応溶液をガラスフィルターに通し、50mmol/L Tris-HCl bufferで3回洗浄した。ガラスフィルターを液体シンチレーション測定用バイアルに移し、液体シンチレーターを添加後3時間以上インキュベーションした。液体シンチレーションカウンターで放射能を測定し、サンプルごとに化合物(I)のトリチウムラベル体の特異的結合(Specific Binding(SB)=TB-NSB)を算出した。野生型リッターメイト群における化合物(I)のトリチウムラベル体のSBの平均値を100%としたときの、各群における化合物(I)のトリチウムラベル体のSBの平均値を算出した。野生型リッターメイト群に対する各群の統計学的有意性について、Dunnett検定により解析した。有意水準は両側5%とした。
<結果>
ホモ接合型GAT-1ノックアウトマウス、ヘテロ接合型GAT-1ノックアウトマウス、野生型リッターメイトマウスの脳シナプトソーム膜画分におけるGAT-1タンパク質発現レベルを図2に示す。野生型リッターメイト群におけるGAT-1タンパク質発現レベルの平均値を100%としたときの、ヘテロ接合型GAT-1ノックアウト群およびホモ接合型GAT-1ノックアウト群におけるGAT-1タンパク質発現レベルの平均値はそれぞれ45.2%および0.0%であった。また、各群における化合物(I)のトリチウムラベル体の特異的結合を図3に示す。GAT-1タンパク質発現レベルの低下とともに、化合物(I)のトリチウムラベル体の特異的結合も低下した(野生型リッターメイト群における特異的結合の平均値を100%としたときの、ヘテロ接合型GAT-1ノックアウト群およびホモ接合型GAT-1ノックアウト群における特異的結合の平均値はそれぞれ54.0%および8.0%)。これらの結果は、化合物(I)が、GAT-1に特異的に結合することを示すものである。
GAT-1ノックアウトマウス全脳サンプルにおける化合物(I)の結合活性を確認するため、本試験を実施した。
<方法>
10週齢の雄性ホモ接合型GAT-1ノックアウトマウス、ヘテロ接合型GAT-1ノックアウトマウス、野生型リッターメイトマウス(Deltagen社)から既報(非特許文献3および4)に基づいて調製した脳シナプトソーム膜画分を試験に供した(n=3)。
各群におけるGAT-1タンパク質発現はウェスタンブロッティングにより確認した。1次抗体としてrabbit anti-GAT1 monoclonal antibody(Abcam社)あるいはrabbit anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)monoclonal antibody(Cell Signaling Technology社)を使用した。2次抗体としてhorseradish peroxidase(HRP)-linked anti-rabbit IgG(GE Healthcare社)を使用した。HRP基質の添加により生じた化学発光強度を定量し、サンプルごとにGAT-1タンパク質発現レベル(=GAT-1特異的な化学発光強度/GAPDH特異的な化学発光強度)を算出した。野生型リッターメイト群におけるGAT-1タンパク質発現レベルの平均値を100%としたときの、各群におけるGAT-1タンパク質発現レベルの平均値を算出した。野生型リッターメイト群に対する各群の統計学的有意性について、Dunnett検定により解析した。有意水準は両側5%とした。
各群に対する化合物(I)の結合活性は、化合物(I)のトリチウムラベル体を用いたラジオアイソトープ結合実験により確認した。Total Binding(TB)測定用に、各アッセイチューブに各脳シナプトソーム膜画分(タンパク質量0.4mg/チューブ)と化合物(I)のトリチウムラベル体(最終濃度200nmol/L)を加え、4℃で2時間インキュベートした。Nonspecific Binding(NSB)測定用に、各アッセイチューブに各脳シナプトソーム膜画分(タンパク質量0.4mg/チューブ)と化合物(I)のトリチウムラベル体(最終濃度200nmol/L)、化合物(I)(最終濃度1mmol/L)を加え、4℃で2時間インキュベーションした。TB測定用およびNSB測定用の反応溶液をガラスフィルターに通し、50mmol/L Tris-HCl bufferで3回洗浄した。ガラスフィルターを液体シンチレーション測定用バイアルに移し、液体シンチレーターを添加後3時間以上インキュベーションした。液体シンチレーションカウンターで放射能を測定し、サンプルごとに化合物(I)のトリチウムラベル体の特異的結合(Specific Binding(SB)=TB-NSB)を算出した。野生型リッターメイト群における化合物(I)のトリチウムラベル体のSBの平均値を100%としたときの、各群における化合物(I)のトリチウムラベル体のSBの平均値を算出した。野生型リッターメイト群に対する各群の統計学的有意性について、Dunnett検定により解析した。有意水準は両側5%とした。
<結果>
ホモ接合型GAT-1ノックアウトマウス、ヘテロ接合型GAT-1ノックアウトマウス、野生型リッターメイトマウスの脳シナプトソーム膜画分におけるGAT-1タンパク質発現レベルを図2に示す。野生型リッターメイト群におけるGAT-1タンパク質発現レベルの平均値を100%としたときの、ヘテロ接合型GAT-1ノックアウト群およびホモ接合型GAT-1ノックアウト群におけるGAT-1タンパク質発現レベルの平均値はそれぞれ45.2%および0.0%であった。また、各群における化合物(I)のトリチウムラベル体の特異的結合を図3に示す。GAT-1タンパク質発現レベルの低下とともに、化合物(I)のトリチウムラベル体の特異的結合も低下した(野生型リッターメイト群における特異的結合の平均値を100%としたときの、ヘテロ接合型GAT-1ノックアウト群およびホモ接合型GAT-1ノックアウト群における特異的結合の平均値はそれぞれ54.0%および8.0%)。これらの結果は、化合物(I)が、GAT-1に特異的に結合することを示すものである。
[試験例3]GAT-1,GAT-2,GAT-3,BGT-1の各強制発現細胞を用いたGABA取込み阻害試験
化合物(I)のGAT-1に対する機能的な作用を確認するため、GAT-1,GAT-2,GAT-3,BGT-1の各強制発現細胞を用いたGABA取込み阻害試験を実施した。
<方法>
ヒトGAT-1,ヒトGAT-2,ヒトGAT-3,ヒトBGT-1の各強制発現細胞をそれぞれ96-well microtiter plateに4.0×104cells/200μL/wellの密度で播き、37℃、5%CO2で1日培養した。細胞をassay bufferで洗浄後、化合物(I)(0.0128-1000μmol/L)と[3H]GABA(50μmol/L)を加え、37℃、5%CO2で5分間インキュベーションした。この時、ヒトGAT-1強制発現細胞を用いた試験においては、細胞をassay bufferで洗浄後、化合物(I)(0.0128-1000μmol/L)あるいはチアガビン塩酸塩(東京化成工業(株)、カタログ番号T3165、以下、化合物(B)という、(0.256nmol/L-100μmol/L))と、[3H]GABA(0.01-500μmol/L)を加え、37℃、5%CO2で5分間インキュベーションした。細胞をcold assay bufferで洗浄後、液体シンチレーターを加え、室温で1時間以上インキュベーションした。液体シンチレーションカウンターで放射能を測定し、化合物を添加していないcontrol wellの放射能を100%としたときの、各wellの放射能を算出した。これらの値を基に、化合物(I)のヒトGAT-1,ヒトGAT-2,ヒトGAT-3,ヒトBGT-1に対する50%GABA取込み阻害濃度(IC50)を算出した。
<結果>
[3H]GABA(50μmol/L)条件下の化合物(I)のヒトGAT-1,ヒトGAT-2,ヒトGAT-3,ヒトBGT-1に対する阻害曲線を図4に、50%GABA取込み阻害濃度を表3に示す。化合物(I)はヒトGAT-1選択的に阻害効果を示すことが明らかとなった。また、[3H]GABA濃度を0.01-500μmol/Lの範囲で変化させたときの、化合物(I)および化合物(B)のヒトGAT-1に対する阻害曲線を図5に示す。GAT-1を選択的に阻害することが知られている既存の抗てんかん薬である化合物(B)(日本では未承認)は、GABA濃度によらずGAT-1に対する阻害強度が一定であるのに対し、化合物(I)はGABA濃度の上昇とともにGAT-1に対する阻害強度も上昇することが明らかとなった。これらの結果は、化合物(I)がGAT-1の選択的な不競合阻害剤であることを示すものである。
化合物(I)のGAT-1に対する機能的な作用を確認するため、GAT-1,GAT-2,GAT-3,BGT-1の各強制発現細胞を用いたGABA取込み阻害試験を実施した。
<方法>
ヒトGAT-1,ヒトGAT-2,ヒトGAT-3,ヒトBGT-1の各強制発現細胞をそれぞれ96-well microtiter plateに4.0×104cells/200μL/wellの密度で播き、37℃、5%CO2で1日培養した。細胞をassay bufferで洗浄後、化合物(I)(0.0128-1000μmol/L)と[3H]GABA(50μmol/L)を加え、37℃、5%CO2で5分間インキュベーションした。この時、ヒトGAT-1強制発現細胞を用いた試験においては、細胞をassay bufferで洗浄後、化合物(I)(0.0128-1000μmol/L)あるいはチアガビン塩酸塩(東京化成工業(株)、カタログ番号T3165、以下、化合物(B)という、(0.256nmol/L-100μmol/L))と、[3H]GABA(0.01-500μmol/L)を加え、37℃、5%CO2で5分間インキュベーションした。細胞をcold assay bufferで洗浄後、液体シンチレーターを加え、室温で1時間以上インキュベーションした。液体シンチレーションカウンターで放射能を測定し、化合物を添加していないcontrol wellの放射能を100%としたときの、各wellの放射能を算出した。これらの値を基に、化合物(I)のヒトGAT-1,ヒトGAT-2,ヒトGAT-3,ヒトBGT-1に対する50%GABA取込み阻害濃度(IC50)を算出した。
<結果>
[3H]GABA(50μmol/L)条件下の化合物(I)のヒトGAT-1,ヒトGAT-2,ヒトGAT-3,ヒトBGT-1に対する阻害曲線を図4に、50%GABA取込み阻害濃度を表3に示す。化合物(I)はヒトGAT-1選択的に阻害効果を示すことが明らかとなった。また、[3H]GABA濃度を0.01-500μmol/Lの範囲で変化させたときの、化合物(I)および化合物(B)のヒトGAT-1に対する阻害曲線を図5に示す。GAT-1を選択的に阻害することが知られている既存の抗てんかん薬である化合物(B)(日本では未承認)は、GABA濃度によらずGAT-1に対する阻害強度が一定であるのに対し、化合物(I)はGABA濃度の上昇とともにGAT-1に対する阻害強度も上昇することが明らかとなった。これらの結果は、化合物(I)がGAT-1の選択的な不競合阻害剤であることを示すものである。
[試験例4]マウス海馬における、生理的条件下における細胞外GABA濃度および高濃度カリウム刺激による興奮条件下における細胞外GABA濃度の増大に対する効果
生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下における、マウス海馬細胞外GABA濃度に及ぼす化合物(I)の影響を検討するため、以下の実験を行った。
生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下における、マウス海馬細胞外GABA濃度に及ぼす化合物(I)の影響を検討するため、以下の実験を行った。
<方法>
Vehicleを0.4275(w/v)%メチルセルロース/4.5(v/v)%クレモフォール/10(v/v)%ジメチルスルホキシド溶液の組成で調製した。化合物(I)をジメチルスルホキシドに溶解し100mg/mLとし、これを0.475(w/v)%メチルセルロース/5(v/v)%クレモフォール溶液で希釈して、化合物(I)の10mg/mL溶液を調製した。これをさらにVehicleで希釈して、化合物(I)の1mg/mLおよび3mg/mLの溶液を調製した。
GABAを50%メタノール溶液に溶解し、1mg/mLのGABA標準溶液を得た。この溶液をリンゲル液(147.0mmol/L NaCl、4.7mmol/L KCl、0.6mmol/L MgSO4、2.5mmol/L CaCl2、5.0mmol/L HEPES、pH7.4)で連続希釈して、0.5、1、2、10、50、250、500および1000ng/mLのGABA溶液を得た。これらの溶液を、それぞれGABA標準溶液S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7およびS8として用いた。
GABA-d6を50%メタノール溶液に溶解し、1mg/mLの内部標準(IS)溶液を得た。この溶液をアセトニトリルで希釈して、100ng/mLのIS溶液を作成した。
QC-X-L、QC-X-MおよびQC-X-H(X=1または2)について、GABA標準溶液S3またはS8をリンゲル液で希釈し、それぞれ1.5、100および800ng/mL(それぞれn=2)のQC試料溶液を調製した。
Vehicleを0.4275(w/v)%メチルセルロース/4.5(v/v)%クレモフォール/10(v/v)%ジメチルスルホキシド溶液の組成で調製した。化合物(I)をジメチルスルホキシドに溶解し100mg/mLとし、これを0.475(w/v)%メチルセルロース/5(v/v)%クレモフォール溶液で希釈して、化合物(I)の10mg/mL溶液を調製した。これをさらにVehicleで希釈して、化合物(I)の1mg/mLおよび3mg/mLの溶液を調製した。
GABAを50%メタノール溶液に溶解し、1mg/mLのGABA標準溶液を得た。この溶液をリンゲル液(147.0mmol/L NaCl、4.7mmol/L KCl、0.6mmol/L MgSO4、2.5mmol/L CaCl2、5.0mmol/L HEPES、pH7.4)で連続希釈して、0.5、1、2、10、50、250、500および1000ng/mLのGABA溶液を得た。これらの溶液を、それぞれGABA標準溶液S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7およびS8として用いた。
GABA-d6を50%メタノール溶液に溶解し、1mg/mLの内部標準(IS)溶液を得た。この溶液をアセトニトリルで希釈して、100ng/mLのIS溶液を作成した。
QC-X-L、QC-X-MおよびQC-X-H(X=1または2)について、GABA標準溶液S3またはS8をリンゲル液で希釈し、それぞれ1.5、100および800ng/mL(それぞれn=2)のQC試料溶液を調製した。
5週齢の雄性Scl:ddYマウス(日本エスエルシー(株))を試験に供した(各処置でn=7または8)。マウスにミダゾラム(アステラス製薬)、塩酸メデトミジン(日本全薬工業)および酒石酸ブトルファノール(Meiji Seikaファルマ)の混合液をそれぞれ4、0.3及び5mg/kgの用量で皮下麻酔した。脳定位固定装置(成茂科学器械研究所、SR-5)を用いて、ガイドカニューレを左海馬(ブレグマの後方2.7mm、左3.3mm、下方1.8mm)に埋め込んだ。ガイドカニューレを歯科用セメントで頭蓋に固定した。良好な回復を得るために、マウスに65mg/kgのアンピシリンナトリウム(Meiji Seikaファルマ)を皮下投与した。マウスに1mg/kgの塩酸アチパメゾール(日本全薬工業)を腹腔内投与して麻酔から回復させ,ケージに戻した。
手術の5日後、ガイドカニューレを通してマイクロダイアリシスプローブ(エイコム、A-I-4-03)を左海馬に挿入した。マイクロダイアリシスプローブの先端はブレグマから4.8mm下まで達した。
翌日、灌流チューブにプローブを接続し、シリンジポンプ(CMA400400およびCMA8002020、CMA)を用いて1.5μL/分の流量でリンゲル液を灌流した。160分以上灌流後、フラクションコレクター(CMA8002770、CMA)を用いて6℃に設定したチューブに潅流液(30μL/20分/フラクション)を順次採取した。240分間、マウス1例あたり計12検体を採取した。採取開始72分後に、Vehicleまたは10、30もしくは100mg/kgの化合物(I)を経口投与した。投与前の体重から、投与容量(10mL/kg体重)を算出した。採取開始127分後に、潅流液をリンゲル液から高濃度カリウム含有リンゲル液(51.7mmol/L NaCl、100.0mmol/L KCl、0.6mmol/L MgSO4、2.5mmol/L CaCl2、5.0mmol/L HEPES、pH7.4)に切り替えた。マイクロダイアリシスプローブを接続するチューブ中の透析液容量を考慮すると、潅流液サンプルNo.1~4(投与前80分~0分)はVehicleまたは化合物(I)投与前の生理的条件下におけるGABA濃度を反映し、潅流液サンプルNo.5~7(投与後0分~60分)および潅流液サンプルNo.8~12(投与後60分~160分)は、それぞれ、生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下におけるGABA濃度に対する化合物(I)の影響を反映する。
手術の5日後、ガイドカニューレを通してマイクロダイアリシスプローブ(エイコム、A-I-4-03)を左海馬に挿入した。マイクロダイアリシスプローブの先端はブレグマから4.8mm下まで達した。
翌日、灌流チューブにプローブを接続し、シリンジポンプ(CMA400400およびCMA8002020、CMA)を用いて1.5μL/分の流量でリンゲル液を灌流した。160分以上灌流後、フラクションコレクター(CMA8002770、CMA)を用いて6℃に設定したチューブに潅流液(30μL/20分/フラクション)を順次採取した。240分間、マウス1例あたり計12検体を採取した。採取開始72分後に、Vehicleまたは10、30もしくは100mg/kgの化合物(I)を経口投与した。投与前の体重から、投与容量(10mL/kg体重)を算出した。採取開始127分後に、潅流液をリンゲル液から高濃度カリウム含有リンゲル液(51.7mmol/L NaCl、100.0mmol/L KCl、0.6mmol/L MgSO4、2.5mmol/L CaCl2、5.0mmol/L HEPES、pH7.4)に切り替えた。マイクロダイアリシスプローブを接続するチューブ中の透析液容量を考慮すると、潅流液サンプルNo.1~4(投与前80分~0分)はVehicleまたは化合物(I)投与前の生理的条件下におけるGABA濃度を反映し、潅流液サンプルNo.5~7(投与後0分~60分)および潅流液サンプルNo.8~12(投与後60分~160分)は、それぞれ、生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下におけるGABA濃度に対する化合物(I)の影響を反映する。
GABA濃度は以下のLC-MS/MS法によって測定した。
96ウェルプレート上で、60μLのIS溶液を、20μLのGABA標準溶液、QC試料および潅流試料溶液に加えて分析用試料を調製した。60μLのアセトニトリルおよびIS溶液を、20μLのリンゲル液にそれぞれ加えてブランク及び0ng/mL(ISあり)試料を調製した。
試料をオートサンプラーにセットし、各試料20μLをLC-MS/MSに注入した。使用した装置及び条件は以下のとおりである。
LC:Vanquish(シリアル番号8302241、サーモフィッシャー・サイエンティフィック)
MS/MS:TSQ Quantiva(シリアル番号TQH-Q1-0498、サーモフィッシャー・サイエンティフィック)
HPLC条件
カラム:Luna3μm NH2、150×2.0mm(フェノメネクス)
移動相
A:1mol/L炭酸アンモニウム(pH10.0)/ミリQ水/アセトニトリル=14.25/936/50(v/v/v)
B:アセトニトリル/ミリQ水=95/5(v/v)
グラジエント条件:
時間(分) 流速(mL/分) B%
0.00 0.4 100
5.00 0.4 30
8.50 0.4 30
8.51 0.6 100
10.50 0.6 100
Divert value:0-4分(廃棄)、4-5分(MS/MS)、5-10.5分(廃棄)
カラム温度:40℃
オートサンプラー温度:4℃
注入量:20μL
MS/MS条件
イオン源:H-ESI
スプレー電圧:静的
陽イオン:2100V
陰イオン:2500V
電流LC流量:0μL/分
シースガス:30Arb
補助ガス:5Arb
スイープガス:3Arb
イオントランスファーチューブ温度:342℃
気化器温度:358℃
スキャンタイプ:選択反応モニタリング(SRM)
RFレンズ:30V
Q1解像度(半値全幅;FWHM):0.7
Q3解像度(FWHM):0.7
CIDガス:1.5mTorr
ソース断片化:0V
クロムフィルター:6S
SRMテーブル:
96ウェルプレート上で、60μLのIS溶液を、20μLのGABA標準溶液、QC試料および潅流試料溶液に加えて分析用試料を調製した。60μLのアセトニトリルおよびIS溶液を、20μLのリンゲル液にそれぞれ加えてブランク及び0ng/mL(ISあり)試料を調製した。
試料をオートサンプラーにセットし、各試料20μLをLC-MS/MSに注入した。使用した装置及び条件は以下のとおりである。
LC:Vanquish(シリアル番号8302241、サーモフィッシャー・サイエンティフィック)
MS/MS:TSQ Quantiva(シリアル番号TQH-Q1-0498、サーモフィッシャー・サイエンティフィック)
HPLC条件
カラム:Luna3μm NH2、150×2.0mm(フェノメネクス)
移動相
A:1mol/L炭酸アンモニウム(pH10.0)/ミリQ水/アセトニトリル=14.25/936/50(v/v/v)
B:アセトニトリル/ミリQ水=95/5(v/v)
グラジエント条件:
時間(分) 流速(mL/分) B%
0.00 0.4 100
5.00 0.4 30
8.50 0.4 30
8.51 0.6 100
10.50 0.6 100
Divert value:0-4分(廃棄)、4-5分(MS/MS)、5-10.5分(廃棄)
カラム温度:40℃
オートサンプラー温度:4℃
注入量:20μL
MS/MS条件
イオン源:H-ESI
スプレー電圧:静的
陽イオン:2100V
陰イオン:2500V
電流LC流量:0μL/分
シースガス:30Arb
補助ガス:5Arb
スイープガス:3Arb
イオントランスファーチューブ温度:342℃
気化器温度:358℃
スキャンタイプ:選択反応モニタリング(SRM)
RFレンズ:30V
Q1解像度(半値全幅;FWHM):0.7
Q3解像度(FWHM):0.7
CIDガス:1.5mTorr
ソース断片化:0V
クロムフィルター:6S
SRMテーブル:
SRMクロマトグラム上のGABA及びGABA-d6(IS)のピーク面積を積分し、積分ソフトThermo XcaliburTM4.0(サーモフィッシャー・サイエンティフィック)を用いてGABA/ISのピーク面積比を算出した。検量線(Y=aX+b)は、GABA(X)の名目濃度に対するピーク面積比(Y)をプロットし、1/X2-加重最小二乗回帰を用いて傾き(a)および切片(b)を計算することによって作成した。各試料のGABA濃度は標準曲線の回帰式から算出し、ng/mL表示で小数点以下3桁に四捨五入した。
各動物の各試料のGABA濃度を潅流液サンプルNo.1~4の平均濃度(100%とする)に対する割合に換算し、プレGABA濃度に対する割合(%)で表した。各試料についてプレGABA濃度に対する割合の平均値と標準誤差を算出し、GABA濃度の経時変化を検討した。生理的条件下のGABA濃度(投与後0分~60分)および高濃度カリウム刺激による興奮条件下のGABA濃度(投与後60分~160分)に対する、Vehicle投与群と化合物(I)投与群の差を検討するため、プレGABA濃度のパーセンテージ値の対数変換後に、反復測定分散分析に続くDunnett多重比較検定を行った。P<0.05(両側)の値を統計的に有意であるとみなした。GraphPad Prismバージョン8.3.1(グラフパッドソフトウェア)を用いて統計解析を行った。
<結果>
図6は、マウス海馬の潅流液サンプルNo.1~7(投与前80分~投与後60分)における生理的条件下の細胞外GABA濃度に対する化合物(I)の効果を示す。潅流液サンプルNo.1~4(投与前80分~0分)におけるVehicleまたは化合物(I)投与前の平均GABA濃度は、Vehicle投与群で1.916±0.131ng/mLであり、化合物(I)10、30および100mg/kg群ではそれぞれ、1.825±0.069ng/mL、1.882±0.085ng/mLおよび1.915±0.118ng/mLであった。試験したすべての用量において化合物(I)は、潅流液サンプルNo.5~7(投与後0分~60分)中の生理的条件下のGABA濃度に影響を及ぼさなかった。
図7は、マウス海馬の潅流液サンプルNo.1~12(投与前80分~投与後160分)における生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下の細胞外GABA濃度に対する化合物(I)の効果を示す。高濃度カリウム含有リンゲル液に変更することにより、Vehicle投与群の最初の20分間の試料ではGABA濃度がプレGABA濃度の75倍に増大し、高濃度カリウム含有リンゲル液潅流の間ずっとGABAの増大が観察された。化合物(I)は高濃度カリウム刺激によるGABAの増大を促進した。化合物(I)の30および100mg/kg投与群の効果は、Vehicle投与群と比較して統計学的に有意であった。
化合物(I)を10、30または100mg/kgの用量で経口投与した場合、生理的条件下においてマウス海馬の細胞外GABA濃度は上昇しなかったが、30および100mg/kgの用量では高濃度カリウム刺激による興奮条件下においてマウス海馬細胞外GABA濃度を統計的に有意に亢進した。化合物(I)は興奮条件下選択的にマウス海馬におけるGABAの細胞外濃度を増加させることが明らかとなった。
図6は、マウス海馬の潅流液サンプルNo.1~7(投与前80分~投与後60分)における生理的条件下の細胞外GABA濃度に対する化合物(I)の効果を示す。潅流液サンプルNo.1~4(投与前80分~0分)におけるVehicleまたは化合物(I)投与前の平均GABA濃度は、Vehicle投与群で1.916±0.131ng/mLであり、化合物(I)10、30および100mg/kg群ではそれぞれ、1.825±0.069ng/mL、1.882±0.085ng/mLおよび1.915±0.118ng/mLであった。試験したすべての用量において化合物(I)は、潅流液サンプルNo.5~7(投与後0分~60分)中の生理的条件下のGABA濃度に影響を及ぼさなかった。
図7は、マウス海馬の潅流液サンプルNo.1~12(投与前80分~投与後160分)における生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下の細胞外GABA濃度に対する化合物(I)の効果を示す。高濃度カリウム含有リンゲル液に変更することにより、Vehicle投与群の最初の20分間の試料ではGABA濃度がプレGABA濃度の75倍に増大し、高濃度カリウム含有リンゲル液潅流の間ずっとGABAの増大が観察された。化合物(I)は高濃度カリウム刺激によるGABAの増大を促進した。化合物(I)の30および100mg/kg投与群の効果は、Vehicle投与群と比較して統計学的に有意であった。
化合物(I)を10、30または100mg/kgの用量で経口投与した場合、生理的条件下においてマウス海馬の細胞外GABA濃度は上昇しなかったが、30および100mg/kgの用量では高濃度カリウム刺激による興奮条件下においてマウス海馬細胞外GABA濃度を統計的に有意に亢進した。化合物(I)は興奮条件下選択的にマウス海馬におけるGABAの細胞外濃度を増加させることが明らかとなった。
[試験例5]マウス海馬における、生理的条件下における細胞外GABA濃度および高濃度カリウム刺激による興奮条件下における細胞外GABA濃度の増大に対する効果
生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下における、マウス海馬細胞外GABA濃度に及ぼす化合物(B)の影響を検討し、化合物(I)の影響と比較するため、以下の実験を行った。
生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下における、マウス海馬細胞外GABA濃度に及ぼす化合物(B)の影響を検討し、化合物(I)の影響と比較するため、以下の実験を行った。
<方法>
試験例4と同様の方法で実験を行った。ただし、本試験例においては、Vehicle、100mg/kgの化合物(I)または3、10もしくは30mg/kgの化合物(B)をマウスに経口投与した。
試験例4と同様の方法で実験を行った。ただし、本試験例においては、Vehicle、100mg/kgの化合物(I)または3、10もしくは30mg/kgの化合物(B)をマウスに経口投与した。
<結果>
図8は、マウス海馬の潅流液サンプルNo.1~7(投与前80分~投与後60分)における生理的条件下の細胞外GABA濃度に対する化合物(B)および化合物(I)の効果を示す。潅流液サンプルNo.1~4(投与前80分~0分)におけるVehicle、化合物(B)または化合物(I)投与前の平均GABA濃度は、Vehicle投与群で1.734±0.176ng/mLであり、化合物(B)3、10もしくは30mg/kg投与群ではそれぞれ、1.918±0.121ng/mL、1.504±0.148ng/mL、1.913±0.236ng/mLであり、化合物(I)100mg/kg投与群では1.507±0.152ng/mLであった。化合物(B)は全用量で潅流液サンプルNo.5~7(投与後0分~60分)中の生理的条件下のGABA濃度を有意に増加させたが、化合物(I)は生理的条件下のGABA濃度に影響を及ぼさなかった。
図9は、マウス海馬の潅流液サンプルNo.1~12(投与前80分~160分)における生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下の細胞外GABA濃度に対する化合物(B)および化合物(I)の効果を示す。高濃度カリウム含有リンゲル液に変更することにより、Vehicle投与群の最初の20分間の試料ではGABA濃度がプレGABA濃度の63倍に増大し,高濃度カリウム含有リンゲル液潅流の間ずっとGABAの増大が観察された。化合物(B)は化合物(I)と同様に高濃度カリウム刺激によるGABAの増大を促進した。10および30mg/kgの化合物(B)投与群ならびに100mg/kgの化合物(I)投与群の効果は、Vehicle投与群と比較して統計的に有意であった。
化合物(B)を経口投与すると、生理的条件下において3、10および30mg/kgの用量で、マウス海馬の細胞外GABA濃度は有意に増加し、10および30mg/kgの用量で、高濃度カリウム刺激による興奮条件下で有意に増加した。化合物(I)を100mg/kgの用量で経口投与すると、高濃度カリウム刺激による興奮条件下においてのみGABA濃度の増大が統計的に有意に亢進した。マイクロダイアリシスによる試験例4および5の実験では、化合物(I)の薬理学的特性は化合物(B)と異なっていた。
図8は、マウス海馬の潅流液サンプルNo.1~7(投与前80分~投与後60分)における生理的条件下の細胞外GABA濃度に対する化合物(B)および化合物(I)の効果を示す。潅流液サンプルNo.1~4(投与前80分~0分)におけるVehicle、化合物(B)または化合物(I)投与前の平均GABA濃度は、Vehicle投与群で1.734±0.176ng/mLであり、化合物(B)3、10もしくは30mg/kg投与群ではそれぞれ、1.918±0.121ng/mL、1.504±0.148ng/mL、1.913±0.236ng/mLであり、化合物(I)100mg/kg投与群では1.507±0.152ng/mLであった。化合物(B)は全用量で潅流液サンプルNo.5~7(投与後0分~60分)中の生理的条件下のGABA濃度を有意に増加させたが、化合物(I)は生理的条件下のGABA濃度に影響を及ぼさなかった。
図9は、マウス海馬の潅流液サンプルNo.1~12(投与前80分~160分)における生理的条件下および高濃度カリウム刺激による興奮条件下の細胞外GABA濃度に対する化合物(B)および化合物(I)の効果を示す。高濃度カリウム含有リンゲル液に変更することにより、Vehicle投与群の最初の20分間の試料ではGABA濃度がプレGABA濃度の63倍に増大し,高濃度カリウム含有リンゲル液潅流の間ずっとGABAの増大が観察された。化合物(B)は化合物(I)と同様に高濃度カリウム刺激によるGABAの増大を促進した。10および30mg/kgの化合物(B)投与群ならびに100mg/kgの化合物(I)投与群の効果は、Vehicle投与群と比較して統計的に有意であった。
化合物(B)を経口投与すると、生理的条件下において3、10および30mg/kgの用量で、マウス海馬の細胞外GABA濃度は有意に増加し、10および30mg/kgの用量で、高濃度カリウム刺激による興奮条件下で有意に増加した。化合物(I)を100mg/kgの用量で経口投与すると、高濃度カリウム刺激による興奮条件下においてのみGABA濃度の増大が統計的に有意に亢進した。マイクロダイアリシスによる試験例4および5の実験では、化合物(I)の薬理学的特性は化合物(B)と異なっていた。
[参考例] N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドの結晶
参考例1および2に従ってN-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドの結晶を製造した。製造に用いたN-(2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル)スルファミドおよびN-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドは、公知の方法、例えば、WO2013/191144の実施例1記載の方法で得ることができる。
参考例1および2に従ってN-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドの結晶を製造した。製造に用いたN-(2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル)スルファミドおよびN-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドは、公知の方法、例えば、WO2013/191144の実施例1記載の方法で得ることができる。
[参考例1] N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドのA型結晶の製造
N-(2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル)スルファミドを、超臨界流体クロマトグラフィーを用いて光学分割することで化合物(I)のA型結晶を得た。
N-(2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル)スルファミドを、超臨界流体クロマトグラフィーを用いて光学分割することで化合物(I)のA型結晶を得た。
[参考例2] N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドのB型結晶の製造
N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド(50g)と酢酸イソプロピル(500mL)の混合物を20-30℃で攪拌し、均一溶液を得た。得られた溶液を水で洗浄し、有機層をセライトろ過した。ろ液を重さが200gになるまで45-50℃にて濃縮した。残渣に酢酸イソプロピルを加え、重さが200gになるまで45-50℃にて再度濃縮した。残渣を65-70℃に加熱し、へプタン(425mL)を滴下した。得られた混合物を0―5℃にて1時間冷却したのち、ろ過した。ろ物をヘプタンで洗浄し、50℃にて16時間乾燥させることで化合物(I)のB型結晶(45g)を得た。
N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミド(50g)と酢酸イソプロピル(500mL)の混合物を20-30℃で攪拌し、均一溶液を得た。得られた溶液を水で洗浄し、有機層をセライトろ過した。ろ液を重さが200gになるまで45-50℃にて濃縮した。残渣に酢酸イソプロピルを加え、重さが200gになるまで45-50℃にて再度濃縮した。残渣を65-70℃に加熱し、へプタン(425mL)を滴下した。得られた混合物を0―5℃にて1時間冷却したのち、ろ過した。ろ物をヘプタンで洗浄し、50℃にて16時間乾燥させることで化合物(I)のB型結晶(45g)を得た。
[参考例3] 粉末X線回折
参考例1および2に従って得られた化合物(I)のA型結晶およびB型結晶の粉末X線回折を以下の条件で行った。
(測定条件)
サンプルホルダー:アルミニウム製ホルダー
ターゲット:銅
検出器:シンチレーションカウンター
管電圧:50kV
管電流:300mA
スリット:発散スリット0.5mm、散乱スリット開放、受光スリット開放
走査速度:5°/分
サンプリング間隔:0.02°
走査範囲:3~35°
参考例1および2に従って得られた化合物(I)のA型結晶およびB型結晶の粉末X線回折を以下の条件で行った。
(測定条件)
サンプルホルダー:アルミニウム製ホルダー
ターゲット:銅
検出器:シンチレーションカウンター
管電圧:50kV
管電流:300mA
スリット:発散スリット0.5mm、散乱スリット開放、受光スリット開放
走査速度:5°/分
サンプリング間隔:0.02°
走査範囲:3~35°
(1)A型結晶
粉末X線回折 回折角度(2θ±0.2°):6.1°、9.6°、12.4°、12.7°、19.0°、19.9°、21.7°、22.4°、23.7°、26.4°
得られた粉末X線回折パターンを図10に示す。
A型結晶は、回折角度(2θ±0.2°)6.1°、9.6°、12.7°および21.7°からなる群から選択される1以上の回折ピークにより識別することができる。
粉末X線回折 回折角度(2θ±0.2°):6.1°、9.6°、12.4°、12.7°、19.0°、19.9°、21.7°、22.4°、23.7°、26.4°
得られた粉末X線回折パターンを図10に示す。
A型結晶は、回折角度(2θ±0.2°)6.1°、9.6°、12.7°および21.7°からなる群から選択される1以上の回折ピークにより識別することができる。
(2)B型結晶
粉末X線回折 回折角度(2θ±0.2°):5.2°、10.5°、11.1°、13.9°、15.6°、20.6°、21.1°、23.7°、25.6°、26.4°
得られた粉末X線回折パターンを図11に示す。
B型結晶は、回折角度(2θ±0.2°)5.2°、10.5°、11.1°、13.9°および15.6°からなる群から選択される1以上の回折ピークにより識別することができる。
粉末X線回折 回折角度(2θ±0.2°):5.2°、10.5°、11.1°、13.9°、15.6°、20.6°、21.1°、23.7°、25.6°、26.4°
得られた粉末X線回折パターンを図11に示す。
B型結晶は、回折角度(2θ±0.2°)5.2°、10.5°、11.1°、13.9°および15.6°からなる群から選択される1以上の回折ピークにより識別することができる。
[参考例4] 熱重量・示差熱分析(TG-DTA)
参考例1および2に従って得られた化合物(I)のA型結晶およびB型結晶のTG-DTAの測定を以下の条件で行った。
(測定条件)
雰囲気:40mL/min窒素ガス気流下
対照:空のアルミニウム製試料パン
昇温速度:10℃/min
サンプリング間隔:0.1sec
測定温度範囲:30~160℃
参考例1および2に従って得られた化合物(I)のA型結晶およびB型結晶のTG-DTAの測定を以下の条件で行った。
(測定条件)
雰囲気:40mL/min窒素ガス気流下
対照:空のアルミニウム製試料パン
昇温速度:10℃/min
サンプリング間隔:0.1sec
測定温度範囲:30~160℃
A型結晶の測定結果を図12に、B型結晶の測定結果を図13に示す。
Claims (8)
- てんかんが焦点発作を有するてんかんである、請求項1に記載のてんかん治療剤。
- 焦点発作を有するてんかんが内側側頭葉てんかん、限局性皮質異形成症、または難治性焦点発作を有するてんかんである、請求項2に記載のてんかん治療剤。
- 式(I)で表される、N-[(1S)-2,2,5,7-テトラフルオロ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イル]スルファミドまたはその薬剤学的に許容される塩がGABAトランスポーター1(GAT-1)を阻害する、請求項1~3のいずれか1項に記載のてんかん治療剤。
- てんかんの治療に用いるための、請求項5に記載のGAT-1阻害剤。
- てんかんが焦点発作を有するてんかんである、請求項6に記載のGAT-1阻害剤。
- 焦点発作を有するてんかんが内側側頭葉てんかん、限局性皮質異形成症、または難治性焦点発作を有するてんかんである、請求項7に記載のGAT-1阻害剤。
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JP2020-195053 | 2020-11-25 | ||
JP2020195053A JP2024026905A (ja) | 2020-11-25 | 2020-11-25 | てんかん治療剤 |
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Citations (2)
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