WO2022103027A1 - 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2022103027A1 PCT/KR2021/015250 KR2021015250W WO2022103027A1 WO 2022103027 A1 WO2022103027 A1 WO 2022103027A1 KR 2021015250 W KR2021015250 W KR 2021015250W WO 2022103027 A1 WO2022103027 A1 WO 2022103027A1
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hsa
mrna
cervical cancer
micro rna
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조오연
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아주대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for diagnosing an acute tumor response of cervical cancer and a use thereof.
  • Cervical cancer is a malignant tumor that occurs frequently in women, and more than 350,000 patients worldwide die every year from cervical cancer. Cervical cancer is divided into stages 0 to 4, stage 0 cancer is also called intraepithelial cancer, and stage 1 to 4 cancer is called invasive cervical cancer. It is known that intraepithelial cancer develops 10 years earlier than invasive cervical cancer at the age of 35-40 years, and invasive cervical cancer begins to increase after the age of 30, peaks at the age of 50, and then decreases rapidly. In Korea, the prevalence of cervical cancer is about 31 per 100,000 and the mortality rate is 6.8 per 100,000, showing no significant change over the past 10 years. When looking at the frequency of incidence and prevalence by age, they are in the order of 50s, 60s, and 40s.
  • the incidence rate is three times that of the United States, 2.5 times that of Japan, and one-third that of Brazil. This is 6%, which is higher than the 2% in the US, Japan, and Switzerland.
  • the sexually transmitted disease model is the most widely accepted for the development of cervical cancer, and early onset sexual activity, multiple sexual partners, male factors, human papillomavirus (HPV) infection, and human immunodeficiency virus (HIV) Infection is known to be a risk factor for cervical cancer.
  • the recurrence rate after treatment for cervical cancer is 50% within 1 year, 25% within 2 years, and 15% within 3 years, with about 85% of patients having recurrence within 3 years.
  • the recurrence rate after radiation therapy for cervical cancer is over 55%.
  • Treatment of recurrent cervical cancer is determined differently depending on the type of treatment received and the patient's condition. If both treatments are not possible, chemotherapy is performed. However, there is no standard treatment, and appropriate treatment is carried out depending on the site of relapse. In general, treatment aimed at alleviating symptoms rather than curing the disease.
  • exosomes are 40-150 nm extracellular vesicles that are secreted to cancer cells or other normal cells, and perform various physiological functions through cell-to-cell signal transduction. It is known to be involved in the regulation of immunity, inflammation and stress response. They contain specific non-coding/coding RNAs, and miRNAs that regulate several coding RNAs play a key role in regulating these functions. Therefore, exosome miRNA can be considered as a high-level regulator that can be considered at the present time. In particular, because exosomes originating from normal cells as well as cancer cells are abundant in the blood, it is easy to know the relationship between the physical response of cancer patients and cancer cells, and at the same time, it is possible to examine the relationship between miRNA and coding gene.
  • the present invention relates to a biomarker for diagnosing an acute tumor response of cervical cancer and a use thereof, and the present inventors collect blood samples before and after treatment among cervical cancer patients receiving chemotherapy and radiation, and plasma exosomes therefrom. After isolating RNA, microRNAs related to acute tumor response (AR) of cervical cancer are detected through NGS analysis, and these are provided as biomarkers for diagnosing acute tumor response of cervical cancer.
  • AR acute tumor response
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing an acute tumor response of cervical cancer comprising at least one selected from the group consisting of mRNA of microRNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p) and DIABLO (Diablo homolog) provides
  • the present invention comprises an agent for measuring the expression level of one or more RNAs selected from the group consisting of mRNA of micro RNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p), and DIABLO (Diablo homolog).
  • RNAs selected from the group consisting of mRNA of micro RNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p), and DIABLO (Diablo homolog).
  • RNAs selected from the group consisting of mRNA of micro RNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p), and DIABLO (Diablo homolog).
  • the present invention provides a kit for diagnosing an acute tumor response of cervical cancer comprising the composition for diagnosing an acute tumor response.
  • the present invention relates to cervical cancer comprising measuring the mRNA expression level of microRNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p) or DIABLO (Diablo homolog) in a biological sample derived from a subject.
  • hsa-miR-92a-1-5p hsa-miR-92a-1-5p
  • DIABLO Diablo homolog
  • microRNA related to acute tumor response (AR) of cervical cancer RNAs micro RNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p), micro RNA 3960 (hsa-miR-3960), micro RNA 202-5p (hsa-miR-202-5p), micro RNA 3928-5p (hsa-miR-3928-5p), and microRNA 574-3p (hsa-miR-574-3p) were discovered, DIABLO (Diablo homolog) mRNA, UBC (Ubiquitin C) mRNA, and SIN3A As it was confirmed that it is related to the mRNA of (SIN3 transcription regulator family member A), the microRNAs and mRNA can be used as a means of diagnosing an acute tumor response (AR) of cervical cancer, and treatment and surgery It is expected to be effectively used
  • FIG. 1 is a diagram showing the mechanisms of microRNAs and mRNA involved in the acute tumor response (AR) of cervical cancer.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a treatment process, a blood collection time, an MRI scan time, and a follow-up procedure for cervical cancer patients who have undergone chemotherapy and radiation therapy.
  • FIG. 3 is an MRI photograph of a primary site for measuring a radiation treatment response to a tumor.
  • 5 is a result of analyzing the correlation between the miRNAs selected in FIG. 4 .
  • 6 is a result of network analysis of selected miRNA groups and their associated miRNAs.
  • IPA Ingenuity Pathway Analysis
  • FIG. 10 is a result of drawing a Venn diagram of four function categories related to an acute tumor response (AR) of cervical cancer.
  • FIG. 11 is a result of network analysis of the mRNA and miRNA reselected in FIG. 10 .
  • FIG. 12 is a result of analyzing the categories showing statistically significant differences according to whether or not the acute tumor response (AR) of cervical cancer by analyzing the log2FC values of the RNAs included in FIG. 11 using the IPA database.
  • AR acute tumor response
  • FIG. 13 is a graph showing the relative ratio of categories selected for the main miRNA related to the acute tumor response (AR) of cervical cancer.
  • FIG. 14 is a graph showing the significantly changed mRNA and miRNA according to the change of the main miRNA related to the acute tumor response (AR) of cervical cancer.
  • FIG. 15 is a result of subgroup analysis for the acute tumor response (AR) of cervical cancer targeting the mRNA of FIG. 11 .
  • 16 is a result of analyzing the correlation between the miRNAs selected in FIG. 15 .
  • liver plasma exosome miRNAs were analyzed and miRNAs showing clinical variables were detected through fold change.
  • biomarker composition for diagnosing acute tumor response of cervical cancer comprising at least one selected from the group consisting of this microRNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p) and DIABLO (Diablo homolog) mRNA do.
  • the acute tumor response (AR) of cervical cancer is to the extent that the tumor rapidly decreases according to radiation therapy, and the higher the value, the lower the bad treatment response, meaning a good treatment response. If the treatment response can be predicted, it will be possible to increase the treatment efficiency to control the tumor while minimizing the damage to normal tissues caused by radiation treatment by adjusting the radiation dose to be irradiated for each patient. It may provide a clue for the development of therapeutic agents to improve it.
  • micro RNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p) consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the mRNA of DIABLO (Diablo homolog) is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is done
  • the biomarker composition includes micro RNA 3960 (hsa-miR-3960), micro RNA 202-5p (hsa-miR-202-5p), micro RNA 3928-5p (hsa-miR-3928-5p), micro RNA 574- It may further include one or more selected from the group consisting of 3p (hsa-miR-574-3p), UBC (Ubiquitin C) mRNA, and SIN3A (SIN3 transcription regulator family member A) mRNA.
  • the micro RNA 3960 (hsa-miR-3960) consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the micro RNA 202-5p (hsa-miR-202-5p) consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the microRNA 3928-5p (hsa-miR-3928-5p) is composed of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the micro RNA 574-3p (hsa-miR-574-3p) is shown in SEQ ID NO: 6 consists of the nucleotide sequence shown, the UBC (Ubiquitin C) mRNA consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, and the SIN3A (SIN3 transcription regulator family member A) mRNA is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 is made of
  • the present invention comprises an agent for measuring the expression level of one or more RNAs selected from the group consisting of mRNA of micro RNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p), and DIABLO (Diablo homolog).
  • RNAs selected from the group consisting of mRNA of micro RNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p), and DIABLO (Diablo homolog).
  • RNAs selected from the group consisting of mRNA of micro RNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p), and DIABLO (Diablo homolog).
  • the agent for measuring the expression level may be sense and antisense primers or probes that complementarily bind to the microRNA.
  • the primer is a short gene sequence serving as a starting point of DNA synthesis, and refers to an oligonucleotide synthesized for use in diagnosis, DNA sequencing, and the like.
  • the primers may be synthesized and used with a length of typically 15 to 30 base pairs, but may vary depending on the purpose of use, and may be modified by methylation, capping, etc. by a known method.
  • the probe refers to a nucleic acid capable of specifically binding to mRNA having a length of several bases to several hundred bases produced through enzymatic chemical separation or purification or synthesis.
  • the presence or absence of mRNA can be checked by labeling radioactive isotopes or enzymes, and it can be designed and modified by a known method.
  • the diagnostic composition includes micro RNA 3960 (hsa-miR-3960), micro RNA 202-5p (hsa-miR-202-5p), micro RNA 3928-5p (hsa-miR-3928-5p), and micro RNA 574-3p (hsa-miR-574-3p), UBC (Ubiquitin C) mRNA, and SIN3A (SIN3 transcription regulator family member A) mRNA of one or more RNA selected from the group consisting of mRNA to further include an agent for measuring the level of expression can
  • the present invention provides a kit for diagnosing an acute tumor response of cervical cancer comprising the composition for diagnosing an acute tumor response.
  • the kit consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the kit includes a genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of a DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer, and water in order to perform PCR. It may be a kit.
  • the PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl2.
  • components necessary for performing electrophoresis that can confirm whether or not the PCR product is amplified may be additionally included in the kit.
  • the kit may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC -Water (DEPC-water), sterile water, etc. may be included. It can also include a pair of primers specific for a gene used as a quantitative control.
  • the present invention relates to cervical cancer comprising measuring the mRNA expression level of microRNA 92a-1-5p (hsa-miR-92a-1-5p) or DIABLO (Diablo homolog) in a biological sample derived from a subject.
  • hsa-miR-92a-1-5p hsa-miR-92a-1-5p
  • DIABLO Diablo homolog
  • the biological sample is exosomes derived from blood or plasma.
  • the expression level is determined by next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase protection assay; RPA), microarray, and northern blotting (northern blotting) can be measured by at least one method selected from the group consisting of.
  • NGS next generation sequencing
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RPA RNase protection assay
  • microarray and northern blotting (northern blotting) can be measured by at least one method selected from the group consisting of.
  • the providing method includes micro RNA 3960 (hsa-miR-3960), micro RNA 202-5p (hsa-miR-202-5p), and micro RNA 3928-5p (hsa-miR-3928-5p) in a biological sample derived from a subject.
  • Micro RNA 574-3p hsa-miR-574-3p
  • UBC Ubiquitin C
  • SIN3A SIN3 transcription regulator family member A
  • the subject may be a patient receiving radiation therapy for treating cervical cancer.
  • the diagnosis in a broad sense, means judging the actual condition of a patient's disease in all aspects.
  • the content of the judgment is the disease name, etiology, disease type, severity, detailed mode of the disease, and the presence or absence of complications.
  • the prognosis refers to prediction of disease progression and recovery, and refers to a prospect or a preliminary evaluation.
  • the method of providing information for diagnosis provides objective basic information necessary as a preliminary step for diagnosis or prognosis prediction, and a doctor's clinical judgment or opinion is excluded.
  • the Institutional Review Board of Ajou University Hospital obtained informed consent from the donor and approved this study.
  • Acute treatment response was defined as the value obtained by dividing the tumor size on the imaging test taken at the time of cancer diagnosis by the tumor size on the imaging test taken at the 4th week of the start of radiotherapy. This was used as a clinical end point.
  • the scope of evaluation of tumor size was limited to the pelvis and abdominal lymph nodes.
  • the size of the cervical tumor was measured using a radiotherapy treatment planning system (eclipse) on a T2 weighted MRI image or a diffusion weighted MRI image. Lymph node size was measured by CT or T2 weighted MRI image. All measurements were made using images before treatment and at the 4th week of starting chemotherapy, and the types of images used before and during treatment were the same.
  • the treatment process, blood collection time, MRI imaging time, and follow-up procedure were performed for 28 cervical cancer patients who had undergone chemotherapy.
  • the volume of the tumor in the primary site was measured using MRI, and the lymph node metastasis lesion was measured by CT or MRI.
  • the scope for measuring tumor volume was limited to the pelvis and abdominal lymph nodes. The clinical results of the patients are shown in Table 1 below.
  • Exosomal RNA of plasma-derived exosomes was extracted using miRNeasy Serum / Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA) according to the manufacturer's instructions. The concentration of extracted RNA was calculated by Quant-IT RiboGreen (Invitrogen). The size of RNA was confirmed using the Agilent RNA 6000 Pico Kit and Small RNA Kit in an Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Boblingen, Germany).
  • RNA isolated from each sample was used to construct a sequencing library with the SMARTer smRNA-Seq kit for Illumina according to the manufacturer's protocol.
  • the input RNA was first polyadenylated to provide priming sequences for the oligo (dT) primers.
  • cDNA synthesis was primed by a 3'smRNA dT Primer incorporating an adapter sequence at the 5' end of each RNA template, followed by addition of non-template nucleotides bound by SMRT smRNA Oligo enhanced with locked nucleic acid (LNA) technology.
  • LNA locked nucleic acid
  • PrimeScript RT used SMART smRNA Oligo as a template to add a second adapter sequence to the 3' end of each first strand cDNA molecule. Afterwards, a full-length Illumina adapter containing an index sequence for sample multiplexing during PCR amplification was added. Forward PCR Primer bound to sequences added by SMART smRNA Oligo, whereas Reverse PCR Primer bound to sequences added by 3'smRNA dT Primer.
  • the amplified library was purified on a 6% Novex TBE-PAGE gel (Thermo Fisher, MA) to excise fractions greater than 138 bp (cDNA 18 bp or more + adapter 120 bp or more).
  • the resulting library cDNA molecules contained the sequences required for clustering in the Illumina flow cell.
  • Libraries were gel purified and validated by checking size, purity and concentration on an Agilent Bioanalyzer. Libraries were quantified using qPCR according to the qPCR Quantification Protocol Guide (KAPA Library Quantificatoin Kit for Illumina Sequecing Platform) and validated using a TapeStation D1000 ScreenTape (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Libraries were pooled in equimolar amounts and sequenced on an Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, USA) instrument to generate 51 base reads. Image decomposition and quality value calculations were performed using modules in the Illumina pipeline.
  • the raw sequence reads of small RNAs obtained from different experimental samples were pretreated with miRDeep2 and analyzed.
  • Adapter trimming was removed if there was an adapter sequence to which miRNA was attached during the smRNA library construction process using the cutadapt program.
  • the first 3nts of all reads were trimmed to remove additional bases inserted during the SMART template-switching activity process.
  • the adapter sequence and all 3' of the adapter were also removed. If the read matched the first 5 bp or more of the 3' adapter sequence, the sequence was considered to be in fact the adapter sequence and then trimmed from the read. For analysis, only trimmed reads of at least 18 bp were considered reliable.
  • the remaining adapter sequences were classified as non-adapter reads. In this analysis, trimmed and non-adapter reads were combined and considered processed reads for downstream analysis.
  • clusters contained reads with 100% matching sequence ID and read length, and a temporary cluster ID and number of retained reads were provided.
  • RNA constructs are known as rRNA. To eliminate the effect of large amounts of rRNA, reads were aligned and matched to 45S pre-rRNA and mitochondrial rRNA of Homo sapiens .
  • Sequence alignment and detection of microRNAs was performed using the miRDeep2 software algorithm. Prior to sequence alignment, the Homo sapiens reference genome release hg19 was searched in the UCSC genome browser and indexed using Bowtie (1.1.2) to align sequencing reads to the reference sequence. The precursor miRNA obtained from miRBase v21 was aligned with the reference sequence. The miRDeep2 algorithm, based on the miRNA biogenesis model, aligned reads to potential hairpin structures in a manner consistent with Dicer processing and assigned a score indicating the likelihood that the hairpin was a true miRNA precursor.
  • Clustered reads were sequentially aligned to the reference genome, miRBase v21, and the non-coding RNA database RNAcentral release 10.0 to identify known miRNAs and other types of RNA.
  • the NGS data included small RNA, non-mRNA, and mRNA, of which miRNA and mRNA were used for analysis. Among these, 14 or more cases with a read count of 0 were excluded from the analysis. 586 cases of miRNA and 15324 cases of mRNA were used for the analysis. For all transcript data values, the log2 fold change (log2FC) value of the read count values 2 weeks after the start of radiotherapy compared to the read count values of plasma exosomes before treatment was used.
  • log2FC log2 fold change
  • the read count value before radiotherapy was used as a control, and the change in the read count value 2 weeks after radiotherapy was calculated as a log2 fold change (log2FC) value.
  • TMM normalization was performed using edgeR and log2FC values were obtained.
  • MiRNAs capable of predicting a clinical end point were selected, and their correlation was analyzed ( FIGS. 4 and 4 ). Correlation analysis was performed in the following three steps.
  • Step 1 Hmisc package - rcorr function - pearson's correlation
  • Step 2 Leaps package - regsubsets function - exhaustive algorithm (set max variable 10 or 7)
  • Step 3 Mean comparison (Wincoxon rank sum test or Kruskal-Wallis test) and boxplots
  • miRNAs were selected through subgroup analysis of miRNAs (log2FC) having a significant association (
  • each miRNA (log2FC) value was simply calculated by miR-3928-3p+miR-92a-1-5p+miR-574-3p+miR The value was obtained by adding and subtracting in the order of -3960-miR-202-5p. It was found that the higher the value, the higher the correlation with the acute tumor response.
  • the main miRNA group and their associated miRNAs were divided into network subgroups and network analysis was performed. The influence of major miRNA groups and subgroups according to clinical end points was described.
  • Igraph package - prim algorithm was used, and in all networks, the red edge was visualized in the positive direction and the blue edge in the negative direction.
  • group A means the main miRNA group
  • group B means the miRNA group associated with several major miRNA groups.
  • miRNAs related to acute tumor response were divided into subgroups and analyzed as a network.
  • good AR ⁇ 0.2
  • pool AR ⁇ 0.2
  • a level was significantly increased or decreased in the same direction as in FIG. 5 , and it was found that level A miRNAs each independently contributed to AR. It can be seen that miR-574-3p had relatively little influence.
  • B level miRNAs included in the current network have little relevance to A level.
  • step II Through network analysis, the structure of the entire miRNA-mRNA, including the main miRNA group, associated mRNAs, and miRNA included in step II, was identified. The shortest pathway linking major miRNAs was described, and the locations of clinically relevant subgroup miRNAs were identified on the network of stage II. Network analysis was visualized under the same conditions as in step II.
  • a network was constructed by combining (
  • mRNAs A
  • miRNAs and mRNAs B
  • RNA damage and repair As shown in FIG. 9 , 30 significant function categories were selected by IPA (Ingenuity Pathway Analysis) analysis with miRNAs and mRNAs related to acute tumor response (AR). Among the 30 research hypothetical areas, RNA damage and repair, cancer, cell death and survival, and DNA Replication, Recombination , and Repair) was selected. As specific subcategories of the above items, DNA metabolism (Metabolism of DNA), DNA degradation (Degradation of DNA), DNA repair (DNA replication), DNA fragmentation (Fragmentation of DNA), apoptosis of tumor cell line (Apoptosis of tumor) cell lines), and Repair of DNA.
  • IPA Information Pathway Analysis
  • a disease/function category with a degree of significance and a possibility of association with a clinical end point was selected, and a Venn diagram using mRNA and miRNA corresponding to each group was shown (FIG. 10). ). Through the Venn diagram shown, mRNAs and miRNAs commonly associated with cancer and specific functions were reselected.
  • FIG. 10 a Venn diagram of four function categories selected in relation to acute tumor response (AR) was drawn, and mRNA and miRNA of items overlapping with the cancer region were selected.
  • AR acute tumor response
  • Reselected mRNA and miRNAs were formed into a network using the short pathway of the main miRNA of FIG. 7 .
  • Network analysis was visualized under the same conditions as in step II.
  • a network was formed using the miRNAs and mRNAs selected in FIG. 10 and main miRNAs.
  • the figure above is a network in which the case where the correlation between edges does not become 0.4 is removed, and the figure below is a network in which the case where the correlation does not become 0.6 is removed.
  • all mRNAs were significantly changed according to changes in miR-202-5p and miR-3960.
  • Groups centered on miR-202-5p and miR-3960 and DIABLO are positively linked with EGF via miR-574-3p. Only changes in miR-92a-1-5p significantly changed DIABLO.
  • RNAs constituting the network of stage VI were uploaded to the IPA database for each 28 patients, and z-scores of significant disease/function categories were obtained. Only items for which a significant z-score was obtained in all patients were selected, and items with statistically significant differences according to clinical end points were analyzed.
  • the network in Figure 11 was apoptosis associated with DNA fragmentation in about 10%, and in 60-65% of RNA damage / repair (RNA damage / repair) and It was associated with DNA metabolism, the other 25-30% were cell death and survival of other types.
  • Their composition was the same as the proportion of mRNAs that moved according to the changes in miR-202-5p and miR-3690, and DIABLO associated with miR-92a-1-5p was the key to DNA fragmentation and apoptosis. seems to play a role.
  • mRNAs and miRNAs that were significantly changed according to changes in the main miRNA were analyzed.
  • mRNA changes according to changes in miR-202-5p and miR-3690 were significantly changed by both miRNAs, UBC (miR-202-5p), and SIN3A (miR-3960).
  • Changes in the same direction are indicated in red color, changes in the opposite direction are indicated in blue color, and changes exceeding 1.5 log2FC are indicated by shades.
  • Each label indicates that DRR stands for DNA Replication, Recombination, and Repair, RDR stands for RNA damage and repair, DNA(r) stands for DNA replication, DNA (d) is DNA degradation, DRR(o) is DNA Replication, Recombination, and Repair-others, and Apop(f) is apoptosis-DNA fragmentation. DNA fragmentation), Apop(o) stands for Apoptosis - others, and non-Apop stands for Non-apoptosis.
  • mRNAs capable of predicting a clinical end point were extracted, and the clinical significance between them and the main miRNAs was analyzed. Correlation analysis was performed in the same step as step I above.
  • FIG. 15 a subgroup analysis was performed on the mRNA constituting FIG. 11 for acute tumor response (AR). When all possible combinations of cases were calculated based on the Adjusted R value, mRNAs that were continuously included were selected. DIABLO, SIN3A, UBC, and RPL41 were screened.

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Abstract

본 발명은 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들로부터 치료 전/후의 혈액에서 분리한 엑소좀 내에 포함된 microRNA를 분석한 결과, 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)과 관련된 마이크로 RNA들로 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960), 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p), 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p), 및 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p)를 발굴하고, DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA, UBC(Ubiquitin C)의 mRNA, 및 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA와 관련됨을 확인하였는 바, 상기 마이크로 RNA들 및 mRNA를 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 조성물, 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물, 자궁경부암 급성 종양 반응 진단용 키트, 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

Description

자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 및 이의 용도
본 발명은 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
자궁경부암(cervical cancer)은 여성에게 빈번하게 발생되는 악성 종양으로, 매년 전세계적으로 35만 명 이상의 환자가 자궁경부암으로 사망하고 있다. 자궁경부암은 0기에서 4기까지 나뉘고 0기 암을 상피내암이라고도 하며, 1기부터 4기 암을 침윤성 자궁경부 암이라고 한다. 상피내암은 침윤성 자궁경부암보다 10년 정도 빠르게 35~40세 정도에서 발병하며 침윤성 자궁경부암은 30세 이후부터 증가하기 시작하여 50대에 정점에 달한 후 급격히 감소하는 경향을 보이는 것으로 알려져 있다. 국내의 경우 자궁경부암의 유병률 수준은 10만 명당 31명 정도이고 사망률은 10만 명당 6.8명 수준으로 지난 10년간 큰 변화를 보이지 않았다. 발생률과 유병률의 빈도를 연령별로 보면 50대, 60대, 40대의 순이며, 발생률은 미국의 3배, 일본의 2.5배, 브라질의 1/3 수준이며 자궁경부암으로 인한 사망률이 암 사망률에서 차지하는 비율이 6%로 미국, 일본, 스위스 등의 2% 내외에 비하여 높은 실정이다. 현재 자궁경부암 발생에 관해서는 성적 접촉성 감염질환 모델이 가장 널리 인정되고 있으며 조기에 시작된 성적 활동, 다수의 성교 상대자, 남성 요인, 인유두종 바이러스(human papillomavirus, HPV) 감염, 에이즈 바이러스(human immunodeficiency virus) 감염 등이 자궁경부암 발생의 위험 요인으로 알려져 있다.
자궁경부암의 치료 후 재발률은 1년 내 50%, 2년 내 25%, 3년 내 15% 정도로서, 약 85%의 환자가 3년내 재발을 한다. 특히 자궁경부암의 방사선 치료 후의 재발율 또한 55%가 넘는다. 재발한 자궁경부암의 치료는 기존에 받았던 치료의 종류와 환자의 상태에 따라 다르게 결정되는데, 일반적으로 1차 치료로 수술을 했다면 재발시에는 방사선 치료를, 1차 치료로 방사선 치료를 했다면 수술을 고려하며, 두 가지 치료가 모두 불가능할 경우 항암화학요법을 시행하게 된다. 그러나 표준적인 치료법은 없으며 재발부위에 따라 각각에 대한 적절한 치료를 실시하는데, 일반적으로 병을 고치는 것보다 증상을 경감시기는 것을 목적으로 하는 치료법이다.
현재 자궁경부암에서 급성 치료 반응의 평가를 영상도구에 많이 의존하고 있으며 보조적으로 SCC ag, Cyfra21-1 과 같은 종양표지자를 사용하고 있지만 방사선 치료 반응을 예측하기에는 부족하다. 이를 보완할 수 있다면 추가적인 방사선 선량의 증가 및 감소 등의 효과적인 치료전략의 수립에 기여할 수 있을 것이다. 이러한 임상적 문제를 해결하기 위해서는 방사선 치료 반응 예측을 위한 정확한 도구가 필요하다. 임상결과들은 단순하지만 그 이면에는 복잡한 생물학적인 의미를 내포하고 있으므로 좀 더 유의미한 상위레벨의 접근방법이 필요하다.
한편, 엑소좀(Exosome)은 암세포 혹은 다른 정상세포에 분비되는 40-150 nm의 세포외 소포(extracellular vesicles)로써, 세포와 세포간의 신호전달을 통한 여러 생리적 기능을 수행하며 암의 발생, 전이, 면역력, 염증 그리고 스트레스 반응의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들은 특이 non coding/coding RNA들을 포함하고 있으며 여러 coding RNA를 조절하는 miRNA가 이러한 기능들을 조절하는 핵심역할을 한다. 따라서 exosome miRNA는 현 시점에서 생각해 볼 수 있는 상위 레벨의 조절인자로서 고려될 수 있다. 특히 혈액 안에는 암세포뿐만 아니라 정상세포에서 기원한 exosome들도 풍부하기 때문에 암환자들의 신체적 반응과 암세포 간의 관련성을 알기 용이하며 동시에 miRNA와 coding gene 사이의 연관성을 살펴보는 것도 가능하다.
본 발명은 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명자들은 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들 중에서 치료 전/후로 혈액 샘플을 채취하고, 이로부터 혈장 엑소좀(exosome) RNA를 분리한 후, NGS 분석을 통해 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)과 관련된 마이크로 RNA들을 검출하고, 이들을 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커로 제공하는 것이다.
본 발명은 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 및 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 및 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 급성 종양 반응 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 급성 종양 반응 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 또는 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들로부터 치료 전/후의 혈액에서 분리한 엑소좀 내에 포함된 microRNA를 분석한 결과, 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)과 관련된 마이크로 RNA들로 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960), 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p), 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p), 및 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p)를 발굴하고, DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA, UBC(Ubiquitin C)의 mRNA, 및 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA와 관련됨을 확인하였는 바, 상기 마이크로 RNA들 및 mRNA를 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)을 진단하는 수단으로 활용될 수 있으며, 치료 및 수술 후의 예후를 예측하는데 유용한 바이오 마커로써 임상에서 효율적으로 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)에 관련된 마이크로 RNA들 및 mRNA의 메커니즘을 나타내는 그림이다.
도 2은 항암 방사선 치료를 시행한 자궁경부암 환자들에 대한 치료과정, 혈액의 채취 시점, MRI 촬영 시점, 및 추적 관찰 과정을 설명한 모식도이다.
도 3는 종양에 대한 방사선 치료 반응을 측정하기 위한 원발 부위 MRI 촬영 사진이다.
도 4은 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)과 유의한 연관성을 가진 miRNA(log2FC)들의 서브그룹(Subgroup) 분석을 통한 miRNA의 선별 결과이다.
도 5는 상기 도 4에서 선별된 miRNA의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 6는 선별된 miRNA 군 및 그들과 연관된 miRNA들을 네트워크(network)로 분석한 결과이다.
도 7은 선별된 miRNA 군과 연관 mRNA들 간의 구조를 파악한 network 분석한 결과이다.
도 8은 각 임상 요소와 높은 관련성이 있는 mRNA (A) 및 네트워크(network) 분석을 통해 얻어진 miRNA 및 mRNA(B)를 포함하여 관련 유전자들을 선별한 결과다.
도 9은 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)에 관련된 miRNA와 mRNA들을 IPA(Ingenuity pathway analysis) 분석한 결과이다.
도 10는 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)과 관련된 4개의 함수 범주(function category)들의 벤다이어그램을 그린 결과이다.
도 11은 상기 도 10에서 재선별된 mRNA 및 miRNA들을 네트워크(network)로 분석한 결과이다.
도 12은 상기 도 11에 포함된 RNA들의 log2FC 값들을 IPA database로 분석하여 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR) 여부에 따라 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 범주들을 분석한 결과이다.
도 13는 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)과 관련된 주 miRNA에 대하여 선별된 범주들의 상대적 비율을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 14은 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)과 관련된 주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화된 mRNA 및 miRNA들을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 15는 도 11의 mRNA들을 대상으로 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)에 대한 서브그룹을 분석한 결과이다.
도 16는 상기 도 15에서 선별된 miRNA의 상관관계를 분석한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 혈장 엑소좀 miRNA가 항암방사선 치료를 시행한 환자들에게서 나타나는 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)을 예측할 수 있는 바이오 마커인지 확인하기 위해, 방사선 치료 전/후(2주)간의 혈장 엑소좀 miRNA를 분석하여 fold change를 통해 임상 변수가 나타나는 miRNA를 검출하였다.
본 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 및 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
상기 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)은 방사선 치료에 따라 종양이 빠르게 감소하는 정도로 그 값이 높을 수록 나쁜 치료 반응을 낮을 수로 좋은 치료 반응을 의미한다. 치료반응 여부를 예측할 수 있다면 환자별로 조사하고자 하는 방사선량을 조절하여 방사선 치료로 인한 정상조직의 손상을 최소화하면서 종양을 조절할 수 있는 치료 효율을 높일 수 있을 것이며, 방사선 저항성을 가지는 종양의 치료 반응을 향상시키기 위한 치료제의 개발을 위한 실마리를 제공할 수 있다.
상기 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA는 서열번호 2으로 표시되는 염기서열로 이루어진다.
상기 바이오 마커 조성물은 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960), 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p), 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p), 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p), UBC(Ubiquitin C)의 mRNA, 및 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960)는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p)는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p)는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p)는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 UBC(Ubiquitin C)의 mRNA는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진다.
또한, 본 발명은 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 및 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물을 제공한다.
상기 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마이크로 RNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
상기 프라이머는 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
상기 프로브는 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
상기 진단용 조성물은 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960), 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p), 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p), 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p), UBC(Ubiquitin C)의 mRNA, 및 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 급성 종양 반응 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 급성 종양 반응 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예컨대, 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다
또한, 본 발명은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 또는 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장 유래 엑소좀이다.
상기 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
상기 제공 방법은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960), 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p), 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p), 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p), UBC(Ubiquitin C)의 mRNA, 및 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
상기 대상체는 자궁경부암을 치료하기 위한 방사선 치료를 받는 환자일 수 있다.
상기 진단은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 상기 예후는 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다.
상기 진단을 위한 정보 제공 방법은 진단 또는 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
1. 환자 및 검체
자궁경부암으로 진단된 후 항암 방사선 치료를 받은 환자들을 대상으로 하였다. 아주 대학교 병원 연구위원회 (Institutional Review Board)는 기증자로부터 정보제공에 대한 동의를 받고, 이 연구를 승인하였다.
급성 치료 반응은 암 진단시에 촬영한 영상검사상 종양의 크기를 방사선 치료 시작 4주차에 촬영한 영상검사상 종양의 크기로 나눈 값으로 정의하였다. 이를 임상 종료점으로 (Clinical end point) 하였다.종양의 크기를 평가하는 범위는 골반과 복부림프절에 한정하였다. 자궁경부의 종양의 크기는 T2 weighted MRI image 또는 Diffusion weighted MRI image를 대상으로 radiotherapy treatment planning system (eclipse)를 사용하여 그 부피를 측정하였다. 림프절의 크기는 CT 혹은 T2 weighted MRI image를 통하여 측정되었다. 모든 측정은 치료 전과 항암방사선 치료 시작 4주차의 image를 이용하여 이루어졌으며 치료 전과 치료 중에 사용된 image의 종류는 같았다.
도 2에 나타난 바와 같이, 항암 방사선 치료를 시행한 28명의 자궁경부암 환자들에 대한 치료과정, 혈액의 채취 시점, MRI 촬영 시점, 및 추적 관찰 과정을 실시하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 종양에 대한 방사선 치료 반응을 측정하기 위해 MRI를 이용하여 원발 부위의 종양의 부피를 측정하였고, 림프절 전이 병변은 CT 혹은 MRI로 측정하였다. 종양의 부피를 측정하는 범위는 골반과 복부림프절에 국한되었다. 환자들의 임상 결과는 하기 표 1과 같다.
All
(N=28)
Age (years) [IQR] 50.0 [42.5;56.0]
FIGO stage 2018
- IB 4 (14.3%)
- IIB-IIIC1 14 (50.0%)
- IIIC2-IVA 7 (25.0%)
- IVB 3 (10.7%)
Pathology
- Adenocarcinoma 4 (14.3%)
- Adenosquamous cell carcinoma 1 (3.6%)
- Unclassified carcinoma 1 (3.6%)
- Squamous cell carcinoma 22 (78.6%)
Radiotherapy field
Pelvis 19 (67.9%)
Pelvic with paraaortic region 9 (32.1%)
Total dose (EQD2) [IQR] 76.2 [72.2;84.2]
Intracavitary brachytherapy
- Do not 2 (7.1%)
- 24 Gy in 4 fractions 10 (35.7%)
- 24 Gy in 6 fractions 5 (17.9%)
- 25 Gy in 5 fractions 1 (3.6%)
- 30 Gy in 6 fractions 10 (35.7%)
Acute tumor response [IQR] 0.14 [0.09;0.28]
Acute tumor response
≥ 0.2 (poor response) 9 (32.1%)
< 0.2 (good response) 19 (67.9%)
IQR; interquartile range, FIGO; International Federation of Gynecology and Obstetrics, EQD2; equivalent dose in 2 Gy fractions
2. 엑소좀 miRNA 및 mRNA에 대한 dataset 구성
방사선 치료 전과 방사선 치료 2주차일 때, 환자들로부터 혈액을 5-10cc 채집하였다. 채집된 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 추가적으로 인체 유래물 보관소에 보관되어 있던 29명의 혈장 샘플 3-5cc를 분양 받아 실험에 사용하였다. 혈장 샘플들로부터 엑소좀(exosome)을 분리하고, NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 시행하였다. 혈장으로부터 발현량이 낮은 샘플은 분석에서 제외하였다.
2-1. Small RNA 라이브러리 구축 및 시퀀싱
혈장을 Exo2D RNA 용액(Exosomeplus)과 혼합하여 엑소좀을 분리하였다. 제조사의 지침에 따라 miRNeasy Serum / Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 혈장 유래 엑소좀의 엑소좀 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 농도는 Quant-IT RiboGreen (Invitrogen)에 의해 계산되었다. RNA의 크기는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Boblingen, Germany)에서 Agilent RNA 6000 Pico Kit 및 Small RNA Kit를 사용하여 확인하였다.
각 샘플에서 분리된 10ng의 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina 용 SMARTer smRNA-Seq 키트로 시퀀싱 라이브러리를 구성하는 데 사용되었다. 입력 RNA는 올리고 (dT) 프라이머에 대한 프라이밍 서열을 제공하기 위해 먼저 폴리아데닐화되었다. cDNA 합성은 각 RNA 주형의 5 '끝에 어댑터 서열을 통합하는 3'smRNA dT Primer에 의해 프라이밍되며, LNA(locked nucleic acid) 기술로 강화된 SMRT smRNA Oligo에 의해 결합된 비주형 뉴클레오티드를 추가되었다. 템플릿 전환 단계에서 PrimeScript RT는 SMART smRNA Oligo를 각 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3 '말단에 두 번째 어댑터 시퀀스를 추가하기위한 템플릿으로 사용하였다. 이 후, PCR 증폭 중에 샘플 멀티플렉싱용 인덱스 시퀀스를 포함하는 전체 길이 Illumina 어댑터를 추가하였다. Forward PCR Primer는 SMART smRNA Oligo에 의해 추가된 서열에 결합하는 반면 Reverse PCR Primer는 3’smRNA dT Primer에 의해 추가된 서열에 결합하였다.
증폭된 라이브러리를 6% Novex TBE-PAGE 겔(Thermo Fisher, MA)에서 정제하여 138bp(cDNA 18bp 이상 + 어댑터 120bp 이상) 이상의 분획을 절제하였다. 결과 라이브러리 cDNA 분자에는 Illumina 플로우 셀의 클러스터링에 필요한 시퀀스를 포함시켰다.
라이브러리는 겔 정제되었으며 Agilent Bioanalyzer에서 크기, 순도 및 농도를 확인하여 검증되었다. 라이브러리는 qPCR Quantification Protocol Guide (Illumina Sequecing 플랫폼 용 KAPA Library Quantificatoin 키트)에 따라 qPCR을 사용하여 정량화되었고, TapeStation D1000 ScreenTape (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)를 사용하여 검증되었다. 라이브러리를 등 몰량으로 풀링하고 Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, USA) 기기에서 시퀀싱하여 51 개의 염기 읽기를 생성하였다. 이미지 분해 및 품질 값 계산은 Illumina 파이프 라인의 모듈을 사용하여 수행되었다.
2-2. 어댑터 트리밍(Adapter trimming)
서로 다른 실험 샘플에서 얻은 small RNA의 raw 서열 read은 miRDeep2로 전처리하고 분석되었다. 어댑터 트리밍은 cutadapt 프로그램을 사용하여 smRNA 라이브러리 구축 과정에서 miRNA이 부착된 어댑터 서열이 존재하면 제거하였다. 모든 read의 첫 번째 3nt는 SMART template-switching 활동 프로세스 중에 삽입된 추가 염기를 제거하기 위해 트리밍되었다. 어댑터 서열과 어댑터의 모든 3’도 제거되었다. 읽기가 3’어댑터 서열의 처음 5 bp 이상 일치하는 경우, 서열이 실제로 어댑터 서열인 것으로 간주한 후, read에서 트리밍되었다. 분석을 위해, 트리밍된 read이 최소 18bp 이상인 경우만 신뢰하는 것으로 간주하였다. 나머지는 어댑터 서열은 비 어댑터 읽기로 분류하였다. 이 분석에서 트리밍 및 비 어댑터 읽기가 결합되고 다운 스트림 분석을 위해 처리된 read으로 간주되었다.
2-3. 클러스터링(Clustering)
서열 특이성(sequence uniqueness) 및 계산 강도를 최소화하기 위해 어댑터 서열로 처리된 read을 수집하여 클러스터를 형성하였다. 이 클러스터에는 서열 ID 및 read 길이와 100% 일치하는 read을 포함하며, 임시 클러스터 ID 및 보유 read 수가 제공되었다.
2-4. 리보솜 RNA 필터링
대부분의 RNA 구성은 rRNA로 알려져 있다. 다량의 rRNA의 효과를 제거하기 위해 읽기를 Homo sapiens의 45S pre-rRNA 및 미토콘드리아 rRNA에 정렬하고 일치시켰다.
2-5. miRNA read
miRDeep2 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 microRNA의 서열 정렬 및 검출을 수행하였다. 서열 정렬을 수행하기 전에 Homo sapiens reference genome release hg19를 UCSC 게놈 브라우저에서 검색하고 시퀀싱 read을 참조 서열에 정렬하기 위한 Bowtie (1.1.2)를 사용하여 인덱싱하였다. miRBase v21에서 얻은 전구체 miRNA을 참조 서열과 정렬하였다. miRDeep2 알고리즘은 miRNA biogenesis 모델을 기반으로 하며, Dicer 처리와 일치하는 방식으로 잠재적인 헤어핀 구조에 읽기를 정렬하고 헤어핀이 진정한 miRNA 전구체일 가능성을 나타내는 점수를 할당하였다.
2-6. miRNA 및 기타 RNA 범주 비율
클러스터링 된 읽기는 알려진 miRNA 및 기타 유형의 RNA를 식별하기 위해, 참조 게놈, miRBase v21 및 비 코딩 RNA 데이터베이스 RNAcentral release 10.0에 순차적으로 정렬되었다.
모든 데이터 및 시각화는 R 4.0.2 version(www.r-project.org)을 이용하여 수행되었으며 모든 비교 분석은 비모수를 가정하였다. 상기 NGS data는 small RNA, non- mRNA, 및 mRNA을 포함하고 있었으며, 이 중 miRNA 및 mRNA을 분석에 이용하였다. 이 중 14명이상에서 read count가 0인 경우는 분석에서 제외되었다. 분석에 이용된 miRNA는 586건, mRNA은 15324 건으로 통계되었다. 모든 전사체 데이터의 값들은 치료 전의 혈장 엑소좀의 read count값들 대비 방사선 치료 시작 2주 후의 read count 값들의 log2 fold change (log2FC) 값을 사용하였다. 28명의 환자들에 각 각에 대해 방사선 치료 전의 read count 값을 control로 사용하였고, 방사선 치료 후 2주의 read count 값의 변화를 log2 fold change (log2FC) 값으로 계산하였다. edgeR을 사용하여 TMM normalization 하고 log2FC 값을 구하였다.
3. 분석과정 및 결과
바이오마커를 선별하기 위한 분석 과정 및 결과는 다음의 단계로 진행되었다.
I 단계
임상 종료점(Clinical end point)을 예측할 수 있는 miRNA들을 선별하고,이들의 상관관계를 분석하였다(도 4 및 4). 상관 관계(Correlation) 분석은 다음 3단계로 이루어졌다.
1 단계: Hmisc package - rcorr function - pearson’s correlation
2 단계: Leaps package - regsubsets function - exhaustive algorithm (최대 변수 설정 10 또는 7)
3 단계: Mean comparison (Wincoxon rank sum test or Kruskal-Wallis test) and boxplots
도 4에 나타난 바와 같이, 자궁경부암의 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)와 유의한 연관성(|R| >0.4)을 가진 miRNA(log2FC)들의 서브그룹(Subgroup) 분석을 통해 miRNA을 선별하였다. Adjusted R 값을 기준으로 가능한 모든 경우의 조합을 연산했을 때 지속적으로 포함되는 miRNA들을 선별하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 선별된 miRNA 변수들의 다중선형회귀 조합으로 방향성을 얻은 후 단순히 각 miRNA (log2FC) 값들을 miR-3928-3p+miR-92a-1-5p+miR-574-3p+miR-3960-miR-202-5p 순으로 더하고 빼서 값을 구했다. 그 값이 클 수록 급성 종양 반응(acute tumor response)과 관련이 높은 것으로 나타났다.
II 단계
주 miRNA 군 및 그들과 연관된 miRNA들을 네트워크 서브그룹(network subgroup)으로 나누어 네트워크(network) 분석하였다. 임상 종료점(Clinical end point)에 따라 주 miRNA 군의 및 서브그룹의 영향력을 기술하였다.
Network 분석은 Igraph package - prim algorithm을 사용하고, 모든 network에서 붉은 색 edge는 양의 방향, 푸른색 edge는 음의 방향을 의미하도록 시각화 하였다.
miRNA 그룹 층화는 A group은 주 miRNA 군을 의미하고, B group은 여러 주 miRNA 군과 연관된 miRNA 군을 의미한다.
도 6에 나타난 바와 같이, 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)에 관한 miRNA들을 서브그룹(network subgroup)으로 나누어 네트워크(network)로 분석하였다. 주 miRNA가 포함된 community 마다 good AR (<0.2) 및 pool AR (≥ 0.2)을 표시하고, 각 miRNA의 수준이 증가한 개수 및 감소한 갯수를 비교하였다 (증가: log2FC>1.5, 감소: log2FC <-1.5). miR-574-3p를 제외한 A level은 도 5와 같은 방향성으로 유의미하게 증가 혹은 감소하였으며 이는 level A의 miRNA들이 각각 독립적으로 AR에 기여하는 것으로 나타났다. miR-574-3p는 상대적으로 영향력이 적었다고 볼 수 있다. AR 그룹에 따른 B level miRNA들의 차이는 없었다. 따라서 현재의 network에 포함되는 B level miRNA들은 A level과의 관련성이 적다고 볼 수 있다.
III 단계
network 분석을 통해 주 miRNA 군, 연관 mRNA들 및 II 단계에 포함된 miRNA를 포함하여 전체적인 miRNA-mRNA 간의 구조를 파악하였다. 주 miRNA 간을 연결하는 가장 짧은 pathway를 기술하고, II 단계의 network 상에서 임상적 연관성이 있는 subgroup miRNA들의 위치를 확인하였다. Network 분석은 상기 II 단계와 동일한 조건으로 시각화하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, A level의 miRNA와 연관된 (|R| >0.6) mRNA들과 선별된 miRNA들을 합쳐 network를 구성하였으며, A level miRNA들 (화살표) 상이의 최단 거리는 붉은 선으로 표시되었다. 25개이상의 긴 거리를 가졌으며 직선으로 이어져 유기적인 연결 구조도 아니었으며 B level의 miRNA는 현 network에서 발견되지 않아 현재의 network는 level A를 연결하는 miRNA-mRNA 구조로 적절하지 않다.
IV 단계
임상 종료점(Clinical end point)과 관련성 있는 mRNA들과 III 단계의 network에 포함된 miRNA 및 mRNA들이 포함되도록 선별(도 8)하고, 기존 IPA (Ingenuity Pathway Analysis) database로부터 유의한 질환(disease)/ 함수 범주(function category) 및 하위 범주(subcategories) 들을 추출(도 9)하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 각의 임상 요소와 높은 관련성이 있는 mRNA들 (A)및 네트워크(network) 분석을 통해 얻어진 miRNA 및 mRNA(B)를 포함하여 관련 유전자들을 선별하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)에 관련된 miRNA와 mRNA들로 IPA(Ingenuity pathway analysis) 분석하여 유의한 함수 범주(function category) 30개를 선별하였다. 30개 중 연구의 가정과 관련된 영역들로 RNA 손상/복구(RNA damage and repair), 암(cancer), 세포 사멸/생존(cell death and survival), 및 DNA 복제/제조합/복구(DNA Replication, Recombination, and Repair)를 선택하였다. 상기 항목들의 구체적 하위 범주(subcategories)로써 DNA 대사(Metabolism of DNA), DNA 분해(Degradation of DNA), DNA 복구(DNA replication), DNA 단편화(Fragmentation of DNA), 종양 세포주의 세포사멸(Apoptosis of tumor cell lines), 및 DNA 복구(Repair of DNA)를 선택하였다.
V 단계
유의성 정도 및 임상 종료점(Clinical end point)과의 연관 가능성이 있는 질환(disease)/ 함수 범주(function category)를 선별하고, 각 그룹에 해당하는 mRNA 및 miRNA들을 이용 벤다어그램을 도시하였다(도 10). 도시된 벤다이어그램을 통해 암과 특정기능에 공통적으로 연관된 mRNA 및 miRNA들을 재선별 하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)과 관련되어 선별된 4개의 함수 범주(function category)들의 벤다이어그램을 그리고 cancer 영역과 중복된 항목들의 mRNA 및 miRNA를 선택하였다.
VI 단계
도 7의 주 miRNA의 short pathway를 이용하여 재선별된 mRNA 및 miRNA들을 network로 형성하였다. Network 분석은 상기 II 단계와 동일한 조건으로 시각화하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 도 10에서 선별된 miRNA 및 mRNA들과 주 miRNA들을 이용하여 network를 형성하였다. 위의 그림은 edge사이의 correlation이 0.4가 되지 않는 경우를 제거한 network이고 아래의 그림은 correlation이 0.6이 되지 않는 경우를 제거한 network이다. DIABLO를 중심으로 모여있는 miR-92a-1-5p, miR-3928-3p, miR-564-3p를 제외하고는 모두 miR-202-5p 및 miR-3960의 변화에 따라 유의미하게 변화하는 mRNA들이었다. miR-202-5p 및 miR-3960를 중심으로 한 그룹과 DIABLO는 miR-574-3p를 매개로 EGF와 양으로 연결되어 있다. miR-92a-1-5p의 변화 만이 DIABLO를 유의하게 변화시켰다.
VII 단계
VI 단계의 network를 구성하는 RNA들의 log2FC 값들을 28명 별로 IPA database에 올리고, 유의미한 질환(disease)/ 함수 범주(function category)의 z-score를 구하였다. 모든 환자들에서 유의미한 z score가 구해진 항목만을 선별하여 clinical end point에 따라 통계적으로 유의하게 차이가 있었던 항목들을 분석하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 도 11(윗쪽)의 network에 포함된 RNA들의 log2FC 값들을 모두 각 환자 별로 IPA database에서 분석하여 카테고리 별로 z score를 얻은 후 Acute tumor response 0.2를 기준으로 poor 및 good 반응으로 나누었을 때 통계적으로 유의한 차이를 보이는 항목들을 기술한 결과 DNA 단편화(DNA fragmentation)를 동반하는 세포사멸(apoptosis) 및 세포 성장에 따른 DNA 대사 증가가 good AR과 연관되었다.
VIII 단계
모든 network에서 유의미하게 변한 RNA 그룹에 대하여 주 miRNA에 대한 상기 선별된 하위 범주(subcategories)들에 대한 RNA들의 비율 변화를 분석하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 도 11(윗쪽)의 network는 약 10%에서 DNA 단편화(DNA fragmentation)와 연관된 세포사멸(apoptosis)였으며, 60-65%는 RNA 손상/복구(RNA damage/repair) 및 DNA 대사(DNA metabolism)와 연관되었으며, 그 외 25-30%는 다른 종류의 세포 사멸/생존(cell death and survival)이었다. 이들의 구성은 모두 miR-202-5p 및 miR-3690의 변화에 따라 움직이는 mRNA들의 비중과 같았으며 miR-92a-1-5p와 연관된 DIABLO는 DNA 단편화(DNA fragmentation)와 연관된 세포사멸(apoptosis)의 역할을 하는 것으로 보인다.
IX 단계
주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화된 mRNA 및 miRNA들을 분석하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, miR-202-5p 및 miR-3690의 변화에 따른 mRNA의 변화는 두 miRNA에 의해 모두 유의하게 변화한 mRNA와 UBC (miR-202-5p), SIN3A(miR-3960)를 포함시켰다. 같은 방향의 변화는 붉은 색으로 반대방향의 변화는 푸른 색으로 p 값의 변화를 표시하였으며1.5 log2FC를 넘어서는 변화는 음영으로 표시하였다. 각각의 라벨은 DRR은 DNA 복제, 재조합 및 복구(DNA Replication, Recombination, and Repair)를 의미하고, RDR은 RNA 손상 및 복구(RNA damage and repair), DNA(r)은 DNA 복제(DNA replication), DNA (d)는 DNA 분해(DNA degradation), DRR(o)는 DNA 복제, 재조합 및 수리-기타(DNA Replication, Recombination, and Repair-others), Apop(f)는 세포사멸-DNA 단편화(Apoptosis - DNA fragmentation), Apop(o)는 세포사멸-기타(Apoptosis - others), non-Apop는 비-세포사멸(Non-apoptosis)을 의미한다.
X 단계
도 11에서 얻어진 mRNAㄷ르을 이용하여 임상 종료점(Clinical end point)을 예측할 수 있는 mRNA들을 추출하고, 이들과 주 miRNA 들간의 임상적 유의성을 분석하였다. 상관 관계(Correlation) 분석은 상기 I 단계와 동일한 단계로 이루어졌다.
도 15에 나타난 바와 같이, 도 11을 구성하는 mRNA들을 대상으로 급성 종양 반응(acute tumor response, AR)에 대한 서브그룹(subgroup) 분석을 시행하였다. Adjusted R 값을 기준으로 가능한 모든 경우의 조합을 연산했을 때 지속적으로 포함되는 mRNA들을 선별하였다. DIABLO, SIN3A, UBC, 과 RPL41이 선별되었다.
도 16에 나타난 바와 같이, DIBLO+UBC+SIN3A-RPL41 (log2FC) 값이 증가할 수로 acute tumor response는 유의하게 향상되었다. RPL41의 방향성은 network 분석에서는 miR-3960과 일치하나 다중선형 회귀에서는 반대방향이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (15)

  1. 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 및 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 바이오 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA는 서열번호 2으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 바이오 마커 조성물은 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960), 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p), 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p), 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p), UBC(Ubiquitin C)의 mRNA, 및 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 마커 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960)는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p)는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p)는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p)는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 UBC(Ubiquitin C)의 mRNA는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오 마커 조성물.
  5. 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 및 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마이크로 RNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 진단용 조성물은 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960), 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p), 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p), 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p), UBC(Ubiquitin C)의 mRNA, 및 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA는 서열번호 2으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960)는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p)는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p)는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p)는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 UBC(Ubiquitin C)의 mRNA는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단용 조성물.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 급성 종양 반응 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 급성 종양 반응 진단용 키트.
  11. 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 92a-1-5p(hsa-miR-92a-1-5p), 또는 DIABLO(Diablo homolog)의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장 유래 엑소좀인 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 제공 방법은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 3960(hsa-miR-3960), 마이크로 RNA 202-5p(hsa-miR-202-5p), 마이크로 RNA 3928-5p(hsa-miR-3928-5p), 마이크로 RNA 574-3p(hsa-miR-574-3p), UBC(Ubiquitin C)의 mRNA, 및 SIN3A(SIN3 transcription regulator family member A)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 대상체는 자궁경부암을 치료하기 위한 방사선 치료를 받는 환자인 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 급성 종양 반응 진단을 위한 정보 제공 방법.
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