WO2022092595A1 - 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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tuberculosis
rubicon
protein
phosphorylated
amino acid
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양철수
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한양대학교 에리카산학협력단
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium infection and latent tuberculosis, and its use, and more particularly, the differential of Rubicon protein that appears when tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium infectious disease, or latent tuberculosis strain infection
  • the present invention relates to a diagnostic technology for tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium-infectious diseases and latent tuberculosis based on phosphorylation patterns.
  • Tuberculosis is a disease caused by bacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex. 10,000 people (20 per 100,000 population) died. Korea's tuberculosis incidence rate was 66 per 100,000 people, 85th out of 202 countries (1st among 36 OECD member countries), and the death rate was 4.8 people per 100,000 people, ranking 99th in the world (2nd among OECD member countries). recorded.
  • Mycobacterium tuberculosis mainly invades the lungs and causes pulmonary tuberculosis, but it can also invade the kidneys, brain, spine, lymph nodes, and genitourinary system in addition to the lungs, causing extrapulmonary infections with various symptoms.
  • Pulmonary tuberculosis is often asymptomatic in the early stages, but over time, systemic symptoms such as cough, fever, weight loss, night sweats, and anorexia may accompany systemic symptoms. ) can spread through the air and into the respiratory tract of others.
  • tuberculosis is classified into two types, active tuberculosis and latent tuberculosis, as not all tuberculosis symptoms or contagious diseases are caused by infection with Mycobacterium tuberculosis.
  • Active tuberculosis refers to a condition in which Mycobacterium tuberculosis is active in the body, showing symptoms of tuberculosis, and is contagious, requiring isolation and treatment.
  • latent tuberculosis refers to a state in which the tuberculosis bacillus does not actually act in the body, does not show any special symptoms, and is not contagious.
  • Nontuberculous mycobacterium (NTM) infection frequency is gradually increasing, and depending on the type, it can be classified into lung disease, lymphadenitis, skin/soft tissue/bone infection, and disseminated disease, but more than 90% of it appears as lung disease .
  • NTM Nontuberculous mycobacterium
  • MAC Mycobacterium avium complex
  • MAB fast-growing bacterium Mycobacterium abscessus
  • Most NTMs are widely distributed in natural environments such as natural water and soil and have low pathogenicity, so the risk of human-to-human infection is low. Progress, but difficult to complete.
  • Most patients with non-tuberculous mycobacterium lung disease come to the hospital with clinical symptoms and imaging findings similar to tuberculosis, so early differentiation and diagnosis from contagious tuberculosis is very important in terms of treatment, isolation, and transmission management.
  • each differential phosphorylation pattern appears in the S-R region of the Rubicon protein upon infection with tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infection disease, and latent tuberculosis strain, tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium-infectious disease and a biomarker capable of efficiently simultaneously discriminating and diagnosing latent tuberculosis, thereby completing the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infectious disease and latent tuberculosis.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium infection and latent tuberculosis, and a diagnostic kit comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infection disease and latent tuberculosis.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing an antibody for detecting phosphorylated residues of rubicon protein and an antibody prepared by the method.
  • another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing tuberculosis, comprising an agent for measuring the level of mRNA or protein encoded by the gene of Rubicon, and a kit for diagnosing tuberculosis comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing tuberculosis, which includes measuring the level of mRNA or protein encoded by the Rubicon gene in a biological sample derived from a subject.
  • the present invention is a tuberculosis, non-tuberculous anti-acid acid in the 557, 581, 583, and 585th serine residues of the Rubicon protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is provided as a biomarker for differential diagnosis of fungal infections and latent tuberculosis.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infection, and latent tuberculosis, comprising at least one phosphorylated residue in the amino acid region 567 to 625 of the rubicon protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. to provide.
  • the phosphorylated residue may be selected from the group consisting of S577, S581, S583 and S585.
  • the present invention is for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium infection disease, and latent tuberculosis, comprising an agent capable of detecting phosphorylated residues in amino acid regions 567 to 625 of the rubicon protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a composition is provided.
  • the present invention provides a kit for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infection, and latent tuberculosis comprising the composition.
  • the agent may be an antibody that specifically binds to a peptide fragment including a phosphorylated residue in the amino acid region.
  • the antibody may specifically bind to a peptide fragment comprising any one serine residue selected from the group consisting of phosphorylated S577, S581, S583 and S585.
  • the present invention relates to tuberculosis, a non-tuberculous mycobacterium infection disease, and a latent disease comprising the step of detecting a phosphorylated residue in the amino acid region 567 to 625 of the rubicon protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 from a biological sample derived from a subject
  • Information provision methods for diagnosing tuberculosis that is, methods for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium-infected diseases, and latent tuberculosis are provided.
  • the detection result of the phosphorylated residue is a phosphorylated residue
  • the detection of the phosphorylated residue is performed by western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation ( 1 selected from the group consisting of immunoprecipitation, flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony immunodiffusion, complement fixation assay, and protein chip It can be carried out through more than one method.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • immunoprecipitation 1 selected from the group consisting of immunoprecipitation, flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony immunodiffusion, complement fixation assay, and protein chip It can be carried out through more than one method.
  • the present invention comprises the steps of obtaining antisera after injecting a peptide comprising a phosphorylated residue in amino acid regions 567 to 625 of the rubicon protein into mammals other than humans; And it provides a method for producing an antibody for detecting phosphorylated residues in the amino acid region 567 to 625 of the rubicon protein, comprising the step of purifying the obtained antiserum.
  • the peptide may include any one serine residue selected from the group consisting of phosphorylated S577, S581, S583 and S585.
  • the present invention provides an antibody, prepared by the above production method.
  • the present invention provides a composition for diagnosing tuberculosis, comprising an agent for measuring the level of the rubicon gene mRNA or protein encoded by the gene, and a tuberculosis diagnostic kit comprising the composition.
  • the agent capable of measuring the mRNA level may be sense and antisense primers or probes complementary to the gene.
  • the agent capable of measuring the protein level may be an antibody or aptamer that specifically binds to the protein.
  • the present invention comprises the steps of measuring the mRNA level of the rubicon gene or the protein encoded by the gene in a biological sample derived from the subject; And it provides an information providing method for diagnosing tuberculosis, comprising the step of diagnosing tuberculosis when the rubicon mRNA or protein level of the subject is increased compared to the normal control group.
  • tuberculosis by increasing the expression of Rubicon protein, and by detecting differential phosphorylation of the Rubicon protein, it is experimentally verified that tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium infection as well as latent tuberculosis can be distinguished and accurate diagnosis is possible.
  • FIG. 1 shows the structure of a Rubicon protein and a serine (S) residue in the S-R region (aa567-625) that is phosphorylated upon interaction with p22phox.
  • Figure 2 is the result of confirming the differential phosphorylation of the Rubicon S-R region for each tuberculosis patient sample and mycobacterial strain.
  • pS581, pS583, pS585), and the results of immunoblotting and ELISA (HC: uninfected tuberculosis patient, E-TB: active tuberculosis patient-initial treatment, C-TB: active tuberculosis patient-completed treatment, CR-TB : Chronic refractory tuberculosis patient - treatment failure), FIG.
  • FIG. 3 is a view illustrating a mycobacterial strain capable of diagnosing infection through phosphorylation of each serine residue in the S-R region of FIG. 1 .
  • the present invention relates to a use for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium infection and latent tuberculosis based on differential phosphorylation in the S-R region of Rubicon protein, and to a use of Rubicon for diagnosing tuberculosis.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infection, and latent tuberculosis, comprising at least one phosphorylated residue in the amino acid region 567 to 625 of the Rubicon protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Rubicon (Run/cysteine-rich-domain-containing-Beclin1-interacting autophagy protein; Rubicon)" of the present invention is an autophagy-related protein, and ROS is generated by stimulation of TLR2 (Toll-like receptor 2). It binds to p22phox protein, one of the components of the NOX complex (NADPH oxidase complex) involved in It is known to play an important role in inhibiting the proliferation of bacteria introduced into the phagosome by promoting the inflammatory response.
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • Rubicon may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and at this time, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, most Preferably, it may include an amino acid sequence having more than 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sequence homology.
  • the amino acid region 567 to 625 of the Rubicon protein may include an S-R (Serine-Rich) region in which a serine amino acid residue is abundantly present.
  • the phosphorylated residue may be preferably selected from the group consisting of S577, S581, S583 and S585.
  • the present invention is a tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium infection disease, and A composition for diagnosing latent tuberculosis is provided.
  • the present invention provides a kit for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infection, and latent tuberculosis comprising the composition.
  • the tuberculosis is preferably active tuberculosis, more preferably active pulmonary tuberculosis, and may include all intractable pulmonary tuberculosis requiring treatment or poor treatment.
  • the tuberculosis may be preferably caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB), more preferably MTB H37Rv or MTB H37Ra infection, but is not limited thereto.
  • MTB Mycobacterium tuberculosis
  • the non-tuberculous mycobacterium-infectious disease may include all diseases that can be caused by infection with non-tuberculous mycobacterium, preferably lung disease, lymphadenitis, skin/soft tissue/bone infection or disseminated disease. It may be, and more preferably may be a non-tuberculous mycobacterium lung disease, most preferably Mycobacteroides abscessus or Mycobacterium avium subsp. avium infection, but is not limited thereto.
  • the latent tuberculosis is infected with Mycobacterium tuberculosis, but does not actually act in the body, does not show special symptoms, and includes all non-contagious states, preferably Mycobacterium bovis BCG or Mycobacterium smegmatis . , but is not limited thereto.
  • Diagnosis in a broad sense means judging the actual condition of a patient's disease in all aspects. The content of the judgment is the disease name, etiology, disease type, severity, detailed mode of the disease, and the presence or absence of complications. Diagnosis in the present invention is to determine whether or not tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium-infectious disease or latent tuberculosis has occurred and the level of progression.
  • the agent capable of detecting the phosphorylated residue may be an antibody that specifically binds to a peptide fragment including a phosphorylated amino acid residue in the amino acid region.
  • antibody includes immunoglobulin molecules having immunological reactivity with a specific antigen, and includes both monoclonal and polyclonal antibodies.
  • the antibody includes forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterologous antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • the present invention comprises the steps of: obtaining antisera after injecting a peptide comprising a phosphorylated residue in amino acid regions 567 to 625 of Rubicon protein into mammals other than humans; And it provides a method for producing an antibody for detecting phosphorylated residues in the amino acid region 567 to 625 of the rubicon protein, comprising the step of purifying the obtained antiserum.
  • the present invention provides an antibody for detecting phosphorylated residues in amino acid regions 567 to 625 of the rubicon protein, prepared by the above production method.
  • the peptide may preferably contain any one serine residue selected from the group consisting of phosphorylated S577, S581, S583 and S585. Accordingly, the detection antibody of the present invention may specifically bind to a peptide fragment containing any one of the phosphorylated serine residues, preferably to any one of the phosphorylated serine residues.
  • the mammal other than humans is not particularly limited as long as it can produce the antibody according to the present invention, but preferably a rabbit.
  • the purification may use a column affinity purification method, but is not particularly limited as long as it is available as a method for purifying a desired antibody from antisera in the art, and those skilled in the art may appropriately select and use it.
  • the kit for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infection, and latent tuberculosis of the present invention is composed of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method.
  • the kit is not particularly limited as long as it is an analysis method capable of detecting phosphorylated residues in the Rubicon protein, and preferably a method capable of detecting and confirming phosphorylated residues using an antibody can be used, and further Preferably, it may include an antibody for detection according to the present invention.
  • Rubicon (S581) and Rubicon (S585) phosphorylation were detected in active tuberculosis patient-primary treatment serum samples, It was confirmed that Rubicon (S581) phosphorylation was detected in serum samples from chronic intractable tuberculosis patients who failed drug treatment. In contrast, phosphorylation was not detected in non-TB patients and patients treated with active tuberculosis (see Example 2-1).
  • the differential phosphorylation pattern in the Rubicon S-R region for each mycobacterial strain in peripheral blood mononuclear cells of healthy people was comparatively analyzed. Specifically, as a result of infecting Mycobacterium tuberculosis MTB, non-tuberculous mycobacterium (NTM), tuberculosis vaccine strain BCG, and non-pathogenic tuberculosis strain, respectively, it was confirmed that phosphorylation patterns of serine residues in the S-R region were different (Example 2) -2).
  • the present invention includes the step of detecting a phosphorylated residue in the amino acid region 567 to 625 of the Rubicon protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 from the subject-derived biological sample, tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium infection It provides an information provision method for diagnosing diseases and latent tuberculosis.
  • the term “information providing method for diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium-infectious disease and latent tuberculosis” is a preliminary step for diagnosis and is an objective objective necessary for the diagnosis of tuberculosis, non-tuberculous mycobacterium-infectious disease and latent tuberculosis. It provides basic information and excludes the clinical judgment or opinion of a doctor.
  • the subject-derived biological sample may include tissue, cells, whole blood, blood, serum, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, urine, etc., and preferably may be cells, whole blood, blood or serum, but the subject If it is a sample capable of detecting phosphorylation in the S-R region of the Rubicon protein, the present invention is not limited thereto.
  • Detection of the phosphorylated residue is performed by western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, flow cytometry. ), immunofluorescence, ouchterlony immunodiffusion, complement fixation assay, and protein chip can be performed through one or more methods selected from the group consisting of there is.
  • the present inventors analyzed the expression level of Rubicon protein in each tuberculosis patient-derived serum sample through Western blot and ELISA through Examples.
  • the expression of Rubicon protein was increased in the serum of patients with active tuberculosis - initial treatment (E-TB) and patients with chronic intractable tuberculosis (CR-TB) who had failed drug treatment, whereas non-tuberculosis patients (HC) and treated tuberculosis patients It was confirmed that the expression of the protein was not increased in the serum of the patient (C-TB) (see Example 2-1 and FIG. 2a ).
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing tuberculosis, comprising a Rubicon gene or a protein encoded by the gene.
  • the present invention provides a composition for diagnosing tuberculosis, comprising an agent for measuring the mRNA level of the Rubicon gene or the protein encoded by the gene.
  • the present invention provides a kit for diagnosing tuberculosis, comprising the composition.
  • the agent capable of measuring the mRNA level may be sense and antisense primers or probes complementary to the gene.
  • primer refers to an oligonucleotide synthesized for use in diagnosis, DNA sequencing, etc. as a short gene sequence serving as a starting point of DNA synthesis.
  • the primers may be synthesized and used with a length of typically 15 to 30 base pairs, but may vary depending on the purpose of use, and may be modified by methylation, capping, etc. by a known method.
  • probe refers to a nucleic acid capable of specifically binding to mRNA having a length of several bases to several hundreds of bases produced through enzymatic, chemical separation, purification or synthesis.
  • the presence or absence of mRNA can be checked by labeling radioactive isotopes or enzymes, and it can be designed and modified by a known method.
  • the agent capable of measuring the protein level may be an antibody or aptamer that specifically binds to the protein.
  • the kit for diagnosing tuberculosis of the present invention consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method.
  • the present invention comprises the steps of measuring the level of mRNA or the protein encoded by the Rubicon gene in a biological sample derived from a subject;
  • It provides an information providing method for diagnosing tuberculosis, including the step of diagnosing tuberculosis when the rubicon mRNA or protein level of the subject is increased compared to a normal control group.
  • the term “information providing method for tuberculosis diagnosis” used in the present invention provides objective basic information necessary for the diagnosis of tuberculosis as a preliminary step for diagnosis, and the clinical judgment or opinion of the doctor is excluded.
  • the subject-derived biological sample may include, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, blood, serum, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, and urine.
  • the mRNA level is determined by polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay by a conventional method known in the art. ; RPA), microarray (microarray) and Northern blotting (northern blotting) can be measured through one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the protein level is determined by a conventional method known in the art, such as western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, At least one method selected from the group consisting of flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony immunodiffusion, complement fixation assay, and protein chip It may be measured through, but is not limited thereto.
  • peripheral blood of healthy people was purchased from the Gyeonggi Blood Center (Suwon) of the Korean Red Cross for research.
  • the prepared blood was mixed with phosphate buffered saline (PBS) in the same amount, then superimposed on Ficoll Histopaque (MP Biomedicals, catalog number: 091692254), and centrifuged at 1500 rpm for 30 minutes to separate the leukocyte layer and peripheral blood Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the present inventors tried to prepare an antibody for specifically detecting phosphorylation in the S-R (Serine-Rich) region (aa567-625) of the Rubicon protein as shown in FIG. peptides from Antagene Inc. (USA) through Rubicon phosphorylated antibody was produced and purified.
  • each peptide with a modified phosphorylation site was combined with keyhole Limpets Hemocyanin (KLH), and then injected into two rabbits.
  • KLH keyhole Limpets Hemocyanin
  • antiserum was obtained from two rabbits after 70 days using a standard antibody production immunization protocol.
  • affinity purification using 100 ml or more of the obtained antisera, 5-10 mg of two rabbits were obtained to obtain a purified phosphorylation-specific antibody, and the purified antibody was transferred to a non-phosphorylated site through ELISA. It was confirmed that there was no cross-reactivity with respect to (data not shown).
  • Each peptide sequence used to construct the Rubicon phosphorylation-specific antibody is shown below:
  • a non-compatible antibody using a mouse-derived phosphorylation-specific-peptide was prepared and secured by identifying the mechanism of interaction with phosphorylation-mediated p22phox in the Rubicon S-R region, only among related research groups.
  • the present inventors received blood from each tuberculosis patient according to Example 1-1, prepared a serum sample, and then prepared the Rubicon antibody and the Rubicon Serine (S) residue prepared in Example 1-3. Immunoblotting and ELISA were performed using a phosphorylation detection antibody.
  • Immunoblotting was performed according to the following procedure. Specifically, each sample was denatured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to a PVDF membrane (Bio-Rad). Next, the PVDF membrane is reacted with a specific primary antibody, preferably a Rubicon antibody or an antibody specific for phosphorylation of a Rubicon serine residue, and then reacted with a secondary antibody that specifically binds to the primary antibody, and then antibody binding is performed by chemiluminescence (ECL). ; Millipore), and the signal was detected with a Vilber chemiluminescence analyzer (Fusion SL 3; Vilber Lourmat). ELISA was performed using the Human Rubicon (RUBCN) ELISA Kit (Abbexa) according to the manufacturer's recommended protocol to measure the level of Rubicon protein in cell culture supernatants and serum from normal and tuberculosis patients.
  • a specific primary antibody preferably a Rubicon antibody or
  • Rubicon (S581) phosphorylation was commonly observed in serum samples from patients with active tuberculosis - first treatment (E-TB) and patients with chronic intractable tuberculosis - treatment failure (CR-TB). .
  • Rubicon (S585) phosphorylation was also observed in the active tuberculosis patient-primary treatment.
  • the present inventors compared and analyzed the phosphorylation pattern of serine residues in the Rubicon S-R region after infecting the healthy human-derived peripheral blood mononuclear cells obtained in Example 1-1 with various mycobacterial strains cultured in Example 1-2.
  • the present invention provides a biomarker capable of accurately and rapidly discriminating and diagnosing tuberculosis, non-tuberculous mycobacterial infectious disease, and latent tuberculosis, and can be used for clinical diagnosis in a field requiring rapid diagnosis of tuberculosis causative bacteria.

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Abstract

본 발명은 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 또는 잠복결핵 균주 감염 시 나타나는 루비콘 (Rubicon) 단백질의 차등적 인산화 양상에 기반한 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵의 진단기술에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 Rubicon 단백질의 발현 증가를 통해 결핵 진단이 가능하고, Rubicon 단백질의 차등적 인산화 검출을 통해 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 뿐만 아니라 잠복결핵을 구별하여 정확한 진단이 가능함을 실험적으로 규명하였는바, 본 발명에 따른 신규한 진단용 바이오마커는 결핵 의심환자 또는 유사 증상을 나타내는 환자의 혈액 시료로부터 조기에 활동성 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 여부를 정확하게 진단함으로써 격리 및 치료, 관리 측면 등에서 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 및 이의 용도
본 발명은 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 또는 잠복결핵 균주 감염 시 나타나는 루비콘 (Rubicon) 단백질의 차등적 인산화 양상에 기반한 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵의 진단기술에 관한 것이다.
결핵 (tuberculosis)은 결핵균 복합체 (Mycobacterium tuberculosis complex)에 속하는 세균에 의해 발생하는 질환으로, 결핵으로 인해 2018년 기준 전 세계 약 1,000만 명 (인구 10만 명당 130명)의 환자가 발생하였고, 약 150만명 (인구 10만 명당 20명)이 사망하였다. 우리나라의 결핵 발생률은 인구 10만 명당 66명으로 전 세계 202개국 중 85위 (OECD 36개 회원국 중 1위), 사망률은 인구 10만 명당 4.8명으로 전 세계 99위 (OECD 회원국 중 2위)를 기록하였다. 결핵균은 주로 폐를 침범하여 폐결핵을 일으키지만, 폐 이외에 신장, 뇌, 척추, 림프절, 비뇨생식계 등을 침범하여 다양한 증상을 나타내는 폐 외 감염을 일으킬 수도 있다. 폐결핵은 초기에 무증상인 경우도 많으나 시간이 지나면서 기침, 발열, 체중감소, 야간발한, 식욕부진 등과 같은 전신 증상이 동반될 수 있고, 결핵균은 전염성 폐결핵 환자의 비말핵 (결핵균이 포함된 미세한 침방울)이 공기를 통해 다른 사람의 호흡기로 전파되어 전염될 수 있다.
그러나 결핵균에 감염되어도 모두 결핵 증상을 보이거나 전염성을 갖는 것은 아니므로 결핵은 활동성 결핵 (active tuberculosis)과 잠복결핵 (latent tuberculosis) 두 유형으로 분류된다. 활동성 결핵이란 결핵균이 몸속에서 활동하여 결핵 증상을 나타내고 전염성이 있어 격리 및 치료가 필요한 상태를 말한다. 이에 반해, 잠복결핵이란 결핵균이 실제 몸속에서 활동하지 않으며 특별한 증상을 보이지 않고 전염성이 없는 상태를 말한다. 그러나 전염성 결핵환자와 접촉한 사람뿐만 아니라 인간 면역결핍 바이러스 (Human Immunodeficiency Virus; HIV) 감염자, 면역억제제 복용자, 종양괴사인자 (Tumor Necrosis Factor; TNF) 길항제 사용자 및 최근 2년 이내에 결핵 감염이 확인된 경우 등의 결핵 발병 고위험 군은 잠복결핵 진단을 받을 경우 활동성 결핵으로 진행될 가능성이 있어 잠복결핵 치료가 필요하다.
비결핵 항산균 (nontuberculous mycobacterium; NTM)은 감염 빈도가 점차 증가하고 있고, 유형에 따라 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증, 파종성 질환으로 분류될 수 있지만 90% 이상은 폐질환으로 나타난다. 우리나라의 경우 비결핵 항산균에 의한 폐질환은 절반 이상이 마이코박테리움 아비움 복합체 (Mycobacterium avium complex; MAC) 감염에 의해 유발되며, 신속 성장균인 마이코박테리움 압세수스 (Mycobacterium abscessus; MAB)가 20-30%를 차지하여 두 번째로 흔한 원인균으로 보고되고 있다. 대부분의 NTM은 자연수와 토양 등 자연환경에 널리 분포하고 병원성이 낮아 사람 간의 감염 위험이 적지만, 손상된 면역 체계를 가진 사람들에게 상기 폐질환은 만연한 질환으로 발생률과 중요성이 급격히 증가하고 있으며, 대게 서서히 진행되지만 완치시키기는 어렵다. 대부분의 비결핵 항산균 폐질환 환자는 결핵과 유사한 임상 증상 및 영상 소견으로 내원하므로 전염성이 있는 결핵과 초기에 감별 및 진단하는 것이 치료 및 격리 여부, 전파 관리 측면에서 매우 중요하다.
기존 비결핵 항산균 폐질환의 진단은 객담검사에서 균이 동정되면 확진이지만 배양검사에 약 2달이라는 오랜 시간이 걸리고 격리가 필요한 결핵과 영상의학적으로 감별이 되지 않는 문제가 있다. 이에 결핵 및 비결핵 항산균 폐질환을 감별 진단할 수 있는 방법으로 상기 결핵균 및 비결핵균 균주들을 동시 검출하는 분자진단 기법이 많이 연구되어 왔다. 그러나 아직까지 보다 간편하고 효율적으로 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵까지 진단할 수 있는 바이오마커의 개발은 미미한 실정이다.
상기와 같은 배경 하에 본 발명자들은 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 균주에 감염 시 루비콘 (Rubicon) 단백질의 S-R 영역에서 각각 차등적인 인산화 양상이 나타나는 것을 확인함으로써 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 여부를 효율적으로 동시에 감별하여 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 진단용 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 루비콘 단백질의 인산화된 잔기 검출용 항체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 항체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 루비콘 (Rubicon) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 결핵 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 결핵 진단용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 루비콘 (Rubicon) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는 결핵 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 (Rubicon) 단백질의 557, 581, 583, 및 585 번째의 세린(Serine) 잔기를 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 감별 진단을 위한 바이오마커로 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 하나 이상의 인산화된 잔기를 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 인산화된 잔기는 S577, S581, S583 및 S585로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 인산화된 잔기를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 제제는 상기 아미노산 영역 내 인산화된 잔기를 포함하는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 항체는 인산화된 S577, S581, S583 및 S585로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세린 잔기를 포함하는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 피검자 유래 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 인산화된 잔기를 검출하는 단계를 포함하는 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 진단을 위한 정보제공방법, 즉 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 인산화된 잔기의 검출 결과,
i) S581 및 S585 잔기 중 어느 하나 이상의 인산화가 검출되는 경우, 결핵으로 진단하고; ii) S577 잔기의 인산화가 검출되는 경우, 비결핵 항산균 감염질환으로 진단하며; 및 iii) S583 잔기의 인산화가 검출되는 경우, 잠복결핵으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 인산화된 잔기의 검출은 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 방사선면역분석법 (radioimmunoassay; RIA), 방사면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 효소면역분석법 (ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법 (flow cytometry), 면역형광염색법 (immunofluorescence), 오우크테로니 면역확산법 (ouchterlony immunodiffusion), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay) 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 인산화된 잔기를 포함하는 펩타이드를 인간을 제외한 포유동물에 주입한 후 항혈청을 얻는 단계; 및 상기 수득된 항혈청을 정제하는 단계를 포함하는, 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역 내 인산화된 잔기 검출용 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 펩타이드는 인산화된 S577, S581, S583 및 S585로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세린 잔기를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 루비콘 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 결핵 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 결핵 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머일 수 있다.
또한, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 루비콘 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 정상대조군과 비교하여 상기 피검자의 루비콘 mRNA 또는 단백질 수준이 증가되어 있는 경우 결핵으로 진단하는 단계를 포함하는, 결핵 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 Rubicon 단백질의 발현 증가를 통해 결핵 진단이 가능하고, Rubicon 단백질의 차등적 인산화 검출을 통해 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 뿐만 아니라 잠복결핵을 구별하여 정확한 진단이 가능함을 실험적으로 규명하였는바, 본 발명에 따른 신규한 진단용 바이오마커를 이용하여 결핵 의심환자 또는 유사 증상을 나타내는 환자의 혈액 시료로부터 조기에 활동성 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 여부를 정확하게 진단함으로써 격리 및 치료, 관리 측면 등에서 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 루비콘 (Rubicon) 단백질의 구조, 및 p22phox와의 상호작용 시 인산화 되는 S-R 영역 (aa567-625) 내 세린 (S) 잔기를 도시한 것이다.
도 2는 결핵 환자 검체 및 마이코박테리아 균주별 Rubicon S-R 영역의 차등적 인산화를 확인한 결과로서, 도 2a는 다양한 유형의 결핵 환자 유래 혈청 시료에서 Rubicon 단백질 수준 및 Rubicon S-R 영역 내 세린 잔기의 인산화 (pS577, pS581, pS583, pS585) 여부를 비교분석한 면역 블롯팅 및 ELISA 결과이고 (HC: 결핵 비감염자, E-TB: 활동성 결핵 환자-초치료, C-TB: 활동성 결핵 환자-치료 완료, CR-TB: 만성 난치성 결핵 환자-치료 실패), 도 2b는 건강한 사람 유래 말초혈액단핵구에 다양한 마이코박테리아 균주를 감염시킨 후 Rubicon S-R 영역 내 세린 잔기의 인산화 양상을 비교 분석한 면역 블롯팅 결과, 및 Rubicon 단백질 수준을 측정한 ELISA 결과를 나타낸 것이다 (결핵균: MTB Rv 및 MTB Ra, 백신 결핵균: BCG, 비병원성 결핵균: M. Smeg, 비결핵 항산균: M. abs 및 M. avium).
도 3은 상기 도 1의 S-R 영역 내 각 세린 잔기의 인산화를 통해 감염 여부를 진단할 수 있는 마이코박테리아 균주를 기재하여 나타낸 것이다.
본 발명은 루비콘 (Rubicon) 단백질의 S-R 영역 내 차등적 인산화에 기반한 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용도, 및 Rubicon의 결핵 진단용도에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 하나 이상의 인산화된 잔기를 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 “루비콘 (Run/cysteine-rich-domain-containing-Beclin1-interacting autophagy protein; Rubicon)”은 자가소화작용 (autophagy) 관련 단백질로, TLR2 (Toll-like receptor 2)의 자극에 의해 ROS 생성에 관여하는 NOX 복합체 (NADPH oxidase complex)의 구성성분 중 하나인 p22phox 단백질에 결합하여 NOX의 효소활성을 증가시켜 ROS의 생성을 촉진시키고, NF-κB 신호를 활성화시켜 염증성 사이토카인의 분비를 촉진시킴으로써 염증반응을 촉진하여 파고솜 (phagosome) 내로 유입된 세균 (bacteria)의 증식을 억제시키는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 루비콘 (Rubicon)은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 이때 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역은 세린 (Serine) 아미노산 잔기가 풍부하게 존재하는 S-R (Serine-Rich) 영역을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인산화된 잔기는 바람직하게 S577, S581, S583 및 S585로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 인산화된 잔기를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 결핵은 바람직하게는 활동성 결핵, 더욱 바람직하게는 활동성 폐결핵일 수 있고, 치료가 필요하거나 치료가 잘 되지 않는 난치성 폐결핵을 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 결핵은 바람직하게 Mycobacterium tuberculosis (MTB), 더욱 바람직하게 MTB H37Rv 또는 MTB H37Ra 감염에 의해 유발된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 비결핵 항산균 감염질환은 비결핵 항산균의 감염으로 유발될 수 있는 질환을 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 비결핵 항산균 폐질환일 수 있으며, 가장 바람직하게는 Mycobacteroides abscessus 또는 Mycobacterium avium subsp. avium 감염에 의해 유발된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 잠복결핵은 결핵균에 감염이 되어 있으나 실제 몸속에서 활동하지 않으며 특별한 증상을 보이지 않고 전염성이 없는 상태를 모두 포함하며, 바람직하게는 Mycobacterium bovis BCG 또는 Mycobacterium smegmatis에 감염된 상태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “진단 (diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 또는 잠복결핵의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명에서, 상기 인산화된 잔기를 검출할 수 있는 제제는 상기 아미노산 영역 내 인산화된 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론 (monoclonal) 항체 및 다클론 (polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체 (예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명자들은 자체적으로 Rubicon 단백질의 S-R 영역 (aa567-625) 내 인산화를 특이적으로 검출할 수 있는 항체를 제작하기 위해 차등적으로 인산화된 잔기를 포함하는 특정 펩타이드 단편을 이용하여 토끼에서 이에 대한 항체를 최초로 생산 및 정제하였다 (실시예 1-3 참조).
이에, 본 발명은 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 인산화된 잔기를 포함하는 펩타이드를 인간을 제외한 포유동물에 주입한 후 항혈청을 얻는 단계; 및 상기 수득된 항혈청을 정제하는 단계를 포함하는, 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역 내 인산화된 잔기 검출용 항체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된, 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역 내 인산화된 잔기의 검출용 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 바람직하게 인산화된 S577, S581, S583 및 S585로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세린 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 검출용 항체는 상기 인산화된 세린 잔기 중 어느 하나를 포함하는 펩타이드 단편, 바람직하게는 상기 인산화된 세린 잔기 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 인간을 제외한 포유동물은 본 발명에 따른 상기 항체를 생산할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 토끼일 수 있다.
상기 정제는 컬럼 친화성 정제방법을 이용할 수 있으나, 해당 기술분야에서 항혈청으로부터 원하는 항체를 정제하는 방법으로 이용 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 당업자가 적절히 선택하여 이용 가능하다.
본 발명의 결핵, 비결핵 항산균 감염질환, 및 잠복결핵 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예컨대, 상기 키트는 Rubicon 단백질 내 인산화된 잔기를 검출할 수 있는 분석 방법이라면 그 방법이 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 항체를 이용하여 인산화된 잔기의 검출 및 확인이 가능한 방법을 이용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 검출용 항체를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 실시예를 통해 루비콘 (Rubicon) S-R 영역 내 차등적 인산화를 통해 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵을 구별하여 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 각 결핵 환자의 검체에서 채취한 혈청 시료에 대하여 면역 블롯팅을 실시한 결과, 활동성 결핵 환자-초치료 혈청 시료에서는 Rubicon (S581) 및 Rubicon (S585) 인산화가 검출되었고, 약물 치료에 실패한 만성 난치성 결핵 환자 유래 혈청 시료에서는 Rubicon (S581) 인산화가 검출된 것을 확인하였다. 이에 반해, 결핵 비감염자 및 활동성 결핵이 치료된 환자에서는 인산화가 검출되지 않았다 (실시예 2-1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 건강한 사람의 말초혈액단핵구에 마이코박테리아 균주별 Rubicon S-R 영역 내 차등적 인산화 양상을 비교분석하였다. 구체적으로, 결핵균인 MTB, 비결핵 항산균 (NTM), 결핵 백신균주 BCG 및 비병원성 결핵 균주를 각각 감염시킨 결과, 상기 S-R 영역 내 세린 잔기의 인산화 양상이 각각 상이하게 나타나는 것을 확인하였다 (실시예 2-2 참조).
따라서 상기 본 발명의 실시예 결과를 통해 Rubicon S-R 영역 내 차등적 인산화 양상을 확인함으로써 MTB 감염에 따른 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 여부를 감별하여 진단하는 것이 가능함을 입증할 수 있다.
이에, 본 발명은 피검자 유래 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 인산화된 잔기를 검출하는 단계를 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단을 위한 정보제공방법”은 진단을 위한 예비적 단계로써 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명에 있어서, 상기 인산화된 아미노산 잔기의 검출 결과,
i) S581 및 S585 잔기 중 어느 하나 이상의 인산화가 검출되는 경우, 결핵으로 진단하고; ii) S577 잔기의 인산화가 검출되는 경우, 비결핵 항산균 감염질환으로 진단하며; 및 iii) S583 잔기의 인산화가 검출되는 경우, 잠복결핵으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피검자 유래 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 세포, 전혈, 혈액 또는 혈청일 수 있으나, 피검자의 Rubicon 단백질의 S-R 영역 내 인산화를 검출할 수 있는 시료라면 이것으로 제한되지 않는다.
상기 인산화된 잔기의 검출은 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 방사선면역분석법 (radioimmunoassay; RIA), 방사면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 효소면역분석법 (ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법 (flow cytometry), 면역형광염색법 (immunofluorescence), 오우크테로니 면역확산법 (ouchterlony immunodiffusion), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay) 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 수행될 수 있다.
한편, 본 발명자들은 실시예를 통해 각 결핵 환자유래 혈청 시료에서 Rubicon 단백질의 발현수준을 웨스턴 블롯 및 ELISA를 통해 분석하였다. 그 결과, 활동성 결핵 환자-초치료 (E-TB) 및 약물 치료에 실패한 만성 난치성 결핵 환자 (CR-TB)의 혈청에서는 Rubicon 단백질의 발현이 증가된 반면, 결핵 비감염자 (HC) 및 치료된 결핵 환자 (C-TB)의 혈청에서는 상기 단백질의 발현이 증가하지 않은 것을 확인하였다 (실시예 2-1 및 도 2a 참조).
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 루비콘 (Rubicon) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 결핵 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 루비콘 (Rubicon) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 결핵 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 결핵 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머 (Primer)”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로서, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브 (Probe)”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기 길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머일 수 있다.
본 발명의 결핵 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
또한, 본 발명은 피검자 유래의 생물학적 시료에서 루비콘 (Rubicon) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
정상대조군과 비교하여 상기 피검자의 루비콘 mRNA 또는 단백질 수준이 증가되어 있는 경우 결핵으로 진단하는 단계를 포함하는, 결핵 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “결핵 진단을 위한 정보제공방법”은 진단을 위한 예비적 단계로써 결핵의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
상기 피검자 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 혈청, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA 수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이 (microarray) 및 노던 블롯팅 (northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 방사선면역분석법 (radioimmunoassay; RIA), 방사 면역확산법 (radioimmunodiffusion), 효소면역분석법 (ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법 (flow cytometry), 면역형광염색법 (immunofluorescence), 오우크테로니 면역확산법 (ouchterlony immunodiffusion), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay) 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 실험 대상자 및 시료 준비
본 발명에서는 분당서울대병원 호흡기내과에서 결핵 비감염자, 초치료 중인 활동성 결핵 환자, 치료가 완료된 활동성 결핵 환자 및 치료에 실패한 난치성 결핵 환자의 혈액을 공여 받은 후 혈청을 분리하여 실험을 진행하였다.
또한, 건강한 사람의 말초혈액은 대한적십자사 경기도 혈액원 (수원)으로부터 연구용 혈액을 구매하여 진행하였다. 준비된 혈액을 인산 완충액 (phosphate buffered saline; PBS)과 동량으로 섞어준 다음, Ficoll Histopaque (MP Biomedicals, catalog number: 091692254) 위에 중첩시키고, 1500 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 백혈구층을 분리 및 말초혈액단핵구 (peripheral blood mononuclear cell; PBMC)를 분리하였다.
1-2. 다양한 마이코박테리아 균의 배양
본 발명의 실시예에서 이용한 마이코박테리아 균주인 Mycobacterium tuberculosis (MTB) 사람형 H37Rv (ATCC 27294), Mycobacterium tuberculosis 사람형 H37Ra (ATCC 25177), Mycobacterium bovis BCG (ATCC 35737), Mycobacterium smegmatis (ATCC 700084), Mycobacteroides abscessus (ATCC 19977) 및 Mycobacterium avium subsp. avium (ATCC 25291)을 확보하고 서턴 배지에서 37℃ 조건하에 4~6주 동안 표면 배양하여 준비하였다.
1-3. 루비콘 (Rubicon) S-R 영역 내 인산화 검출용 항체 제작
본 발명자들은 도 1에 도시된 바와 같은 Rubicon 단백질의 S-R (Serine-Rich) 영역 (aa567-625) 내 인산화를 특이적으로 검출하기 위한 항체를 제작하고자 하였으며, 이를 위해 상기 영역 내 인산화 되는 부위를 포함하는 펩타이드를 이용하여 Antagene Inc. (미국)을 통해 루비콘 인산화 항체를 생산 및 정제하였다.
간단하게, 인산화 부위가 변형된 10mg의 각 펩타이드를 keyhole Limpets Hemocyanin (KLH)와 결합시킨 후, 토끼 2마리에 주입하였다. 다음으로 항체 제작 면역 표준 프로토콜을 이용하여 70일 이후, 토끼 2마리에서 항혈청을 수득하였다. 이어서 100ml 이상의 수득된 항혈청을 이용하여 두 컬럼 친화성 정제를 진행함으로써 2 마리의 토끼에서 5-10mg을 얻어 정제된 인산화 특이적 항체를 수득하였으며, 이때 정제된 항체는 ELISA를 통해 인산화 되지 않은 부위에 대하여 교차반응을 나타내지 않음을 확인하였다 (데이터는 제시하지 않음). 상기 Rubicon 인산화 특이적 항체 제작에 이용된 각 펩타이드 서열은 하기에 나타낸 바와 같다:
1) Cys-FSSRD(p)SAQLSDSGSA (S577)
2) Cys-RDSAQL(p)SDSGSADEV (S581)
3) Cys-FSSRDSAQLSD(p)SGSA (S583)
4) Cys-RDSAQLSDSG(p)SADEV (S585)
상기 과정을 통해 본 발명에서는 관련 연구 그룹 중 유일하게 Rubicon S-R 영역 내 인산화 매개 p22phox와의 상호작용 기전 규명을 통한 마우스 유래 인산화 특이적-펩타이드를 이용한 비상용화 항체를 제작 및 확보하였다.
실시예 2. 결핵 환자 검체 및 마이코박테리아 균주별 Rubicon S-R 영역의 차등적 인산화 확인
2-1. 결핵 환자 검체별 Rubicon S-R 영역 내 세린 잔기의 차등적 인산화 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1-1에 따라 각 결핵 환자로부터 혈액을 공여 받아 혈청 (serum) 시료를 준비한 다음, 각각 Rubicon 항체 및 상기 실시예 1-3에서 제작한 Rubicon 세린 (Serine; S) 잔기의 인산화 검출 항체를 사용하여 면역 블롯팅 및 ELISA를 실시하였다.
면역 블롯팅은 하기 과정에 따라 진행하였다. 구체적으로 각 샘플을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)으로 변성시키고, PVDF 막 (Bio-Rad)으로 이동시켰다. 다음으로 상기 PVDF 막을 특정 1차 항체, 바람직하게 Rubicon 항체 또는 Rubicon 세린 잔기의 인산화 특이적 항체와 반응시킨 후 1차 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체와 반응시킨 다음 항체 결합을 화학 발광 (ECL; Millipore)에 의해 시각화하고, Vilber chemiluminescence analyzer (Fusion SL 3; Vilber Lourmat)로 신호를 검출하였다. ELISA는 제조업체가 권장한 프로토콜에 따라 인간 Rubicon (RUBCN) ELISA Kit (Abbexa)로 세포배양 상청액과 정상인 및 결핵 환자유래 혈청에서 Rubicon 단백질의 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 활동성 결핵 환자-초치료 (early pulmonary TB patients; E-TB) 및 약물 치료에 실패한 만성 난치성 결핵 환자 (chronic refractory pulmonary TB patients; CR-TB)의 혈청에서는 면역 블롯팅 및 ELISA를 통해 Rubicon 단백질의 발현이 증가된 것을 확인하였다.
또한, Rubicon 세린 잔기의 인산화 양상을 비교한 결과, 활동성 결핵 환자-초치료 (E-TB) 및 만성 난치성 결핵 환자-치료 실패 (CR-TB) 혈청 시료에서 Rubicon (S581) 인산화가 공통적으로 관찰되었다. 더욱이 활동성 결핵 환자-초치료에서는 Rubicon (S585) 인산화도 함께 관찰되었다. 이에 반해, 결핵 비감염자 (Healthy Control; HC) 및 활동성 결핵 환자-치료 완료 (cured pulmonary TB patients; C-TB)의 경우에는 상기 Rubicon S-R 영역 내 세린 잔기의 인산화가 일어나지 않은 것을 확인하였다.
2-2. 마이코박테리아 균주별 Rubicon S-R 영역 내 세린 잔기의 차등적 인산화 확인
나아가 본 발명자들은 상기 실시예 1-1에서 얻어진 건강한 사람 유래 말초혈액단핵구에 실시예 1-2에서 배양한 다양한 마이코박테리아 균주를 감염시킨 후 Rubicon S-R 영역 내 세린 잔기의 인산화 양상을 비교 분석하였다.
그 결과, 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 마이코박테리아를 감염시킨 경우에는 모두 Rubicon 단백질의 발현이 증가한 것으로 나타났다. 또한, 인산화 양상을 관찰한 결과 결핵균인 MTB H37Rv를 감염시킨 경우에는 Rubicon (S581) 및 Rubicon (S585) 인산화가 확인되었고, 2종의 비결핵 항산균 (NTM) 폐질환 유발 균주 (M. abscessus 및 M.avium)를 각각 감염시킨 경우에는 Rubicon (S577) 인산화가 검출되었으며, 백신 균주 BCG 및 비병원성 결핵균인 M. smegmatis를 각각 감염시킨 경우에는 Rubicon (S583) 인산화가 확인되었다.
따라서 상기 결과들은 Rubicon 단백질의 발현 증가를 통해 결핵 진단이 가능하며, Rubicon S-R 영역 내 차등적 인산화 양상을 확인함에 따라 MTB 감염에 따른 폐결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 여부를 진단하는 것이 가능함을 입증하는 것이다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 결핵, 비결핵 항상균 감염질환, 및 잠복결핵을 정확하고 신속하게 감별하여 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하여, 결핵 원인균의 빠른 진단이 필요한 현장에서 임상진단을 위해 이용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 하나 이상의 인산화된 잔기를 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인산화된 잔기는 S577, S581, S583 및 S585로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 1 이상의 인산화된 잔기를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제제는 상기 아미노산 영역 내 인산화된 잔기를 포함하는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항체는 인산화된 S577, S581, S583 및 S585로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세린 잔기를 포함하는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  6. 상기 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 키트.
  7. 피검자 유래 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 1 이상의 인산화된 잔기를 검출하는 단계를 포함하는, 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 인산화된 잔기의 검출 결과,
    i) S581 및 S585 잔기 중 어느 하나 이상의 인산화가 검출되는 경우, 결핵으로 진단하고;
    ii) S577 잔기의 인산화가 검출되는 경우, 비결핵 항산균 감염질환으로 진단하고; 및
    iii) S583 잔기의 인산화가 검출되는 경우, 잠복결핵으로 진단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 인산화된 잔기의 검출은 웨스턴 블롯팅 (western blotting), 방사선면역분석법 (radioimmunoassay; RIA), 방사면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 효소면역분석법 (ELISA), 면역침강법 (immunoprecipitation), 유세포분석법 (flow cytometry), 면역형광염색법 (immunofluorescence), 오우크테로니 면역확산법 (ouchterlony immunodiffusion), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay) 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  10. 루비콘 (Rubicon) 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역에서 인산화된 잔기를 포함하는 펩타이드를 인간을 제외한 포유동물에 주입한 후 항혈청을 얻는 단계; 및
    상기 수득된 항혈청을 정제하는 단계를 포함하는, 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역 내 인산화된 잔기 검출용 항체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 펩타이드는 인산화된 S577, S581, S583 및 S585로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세린 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  12. 제10항의 방법에 의해 제조된, 루비콘 단백질의 567번부터 625번 아미노산 영역 내 인산화된 잔기의 검출용 항체.
  13. 루비콘 (Rubicon) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 결핵 진단용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머인 것을 특징으로 하는, 결핵 진단용 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 결핵 진단용 키트.
  17. 피검자 유래의 생물학적 시료에서 루비콘 (Rubicon) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    정상대조군과 비교하여 상기 피검자의 루비콘 mRNA 또는 단백질 수준이 증가되어 있는 경우 결핵으로 진단하는 단계를 포함하는, 결핵 진단을 위한 정보제공방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100033868A (ko) * 2008-09-22 2010-03-31 충남대학교산학협력단 결핵의 단계 진단용 마커의 스크리닝 방법 및 발굴된 단백질 항원
KR20180023394A (ko) * 2016-08-25 2018-03-07 솔젠트 (주) 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 진단키트
WO2020180257A1 (en) * 2019-03-07 2020-09-10 Singapore Health Services Pte Ltd Threonine166 and serine189 of rubicon run domain as lrrk2 kinase inhibition target sites

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100033868A (ko) * 2008-09-22 2010-03-31 충남대학교산학협력단 결핵의 단계 진단용 마커의 스크리닝 방법 및 발굴된 단백질 항원
KR20180023394A (ko) * 2016-08-25 2018-03-07 솔젠트 (주) 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 진단키트
WO2020180257A1 (en) * 2019-03-07 2020-09-10 Singapore Health Services Pte Ltd Threonine166 and serine189 of rubicon run domain as lrrk2 kinase inhibition target sites

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUL-SU YANG; JONG-SOO LEE; MARY RODGERS; CHAN-KI MIN; JUNE-YONG LEE; HEEJIN KIM; KWANG-HOON LEE; CHUL-JOONG KIM; BYUNGHA OH; EBRA: "Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation", CELL HOST & MICROBE, vol. 11, no. 3, 30 January 2012 (2012-01-30), NL , pages 264 - 276, XP028468223, ISSN: 1931-3128, DOI: 10.1016/j.chom.2012.01.018 *
PAIK SEUNGWHA, KIM JIN KYUNG, CHUNG CHAEUK, JO EUN-KYEONG: "Autophagy: A new strategy for host-directed therapy of tuberculosis", VIRULENCE, vol. 10, no. 1, 1 January 2019 (2019-01-01), US , pages 448 - 459, XP055925951, ISSN: 2150-5594, DOI: 10.1080/21505594.2018.1536598 *

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