RU2802789C1

RU2802789C1 - Группа антигенов и тест-система для диагностики инфекции М.tuberculosis complex

Info

Publication number: RU2802789C1
Application number: RU2022126558A
Authority: RU
Inventors: Николай Львович Максимов; Станислав Викторович Петровский; Антон Михайлович Наумов
Original assignee: Николай Львович Максимов; Станислав Викторович Петровский; Антон Михайлович Наумов
Filing date: 2022-10-12
Publication date: 2023-09-04

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описана тест-система для диагностики инфекции М.tuberculosis complex, включающая белок, содержащий комбинацию аминокислотных последовательностей, кодируемых генами EsxA, EsxB, EspK, EspJ, tb7.7 (Rv2654c). Также описан способ диагностики инфекции М.tuberculosis complex с помощью тест-системы. Он включает введение образца цельной крови в контакт с антигеном с последующей инкубацией и количественным иммунохимическим измерением изменения концентрации интерферона гамма в результате специфической реакции циркулирующих антиген-специфических эффекторных Т-лимфоцитов на препарат туберкулезного антигена у сенсибилизированных М.tuberculosis complex пациентов. Техническим результатом использования изобретения является группа антигенов и тест-система для скрининговой диагностики туберкулезной инфекции, в том числе не имеющей ярких клинических проявлений. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 6 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к генной инженерии и диагностике ин-витро и может быть использовано для иммунологической диагностики инфекции M. tuberculosis complex.

Уровень техники

Туберкулез - инфекционное заболевание, которое вносит значительные вклад в структуру смертности населения многих стран, опережая ВИЧ-инфекцию [WHO, Global tuberculosis report, 2021]. Возбудителем туберкулеза является бактерия Mycobacterium tuberculosis, относящаяся к группе генетически близких видов рода Mycobacterium - Mycobacterium tuberculosis complex, которые вызывают заболевания различных видов животных. Это хемоорганотрофные, медленно растущие, неспорообразующие, неподвижные, аэробные микроорганизмы, относящиеся к классу Актинобактерии [Gordon and Parish, Microbiology 2018;164:437-439]. Патогенные микобактерии обладают рядом специфических биологических особенностей, к которым относится способность длительное время пребывать в неразмножающейся покоящейся форме. Это позволяет возбудителю сохраняться на протяжении десятилетий после первичной инфекции, ничем себя не проявляя на клиническом уровне. Вместе со способностью уклонятся от иммунного ответа и манипулировать клетками первичного иммунитета, эта способность обуславливает высокую общественную опасность M. tuberculosis и, в значительной степени, определяет характер эпидемиологического процесса [WHO, Early detection of tuberculosis, 2011].

Туберкулез получил наибольшее распространение в развивающихся странах, особенно, в среде материально неблагополучных слоев общества, для которых характерен низкий уровень жизни и ограниченный доступ к медицинской инфраструктуре. Ситуация осложняется тем, что эпидемиологическим резервуаром инфекции становятся маргинализированные слои общества и пенитенциарные учреждения. Однако эпидемиология туберкулеза не ограничивается указанными популяциями. В целом, распространение этого заболевания очень неравномерно и не всегда объяснимо. Многолетние исследования показали, что восприимчивость к туберкулезу имеет комплексную природу, так, только около у 10% инфицированных впоследствии развивается активный туберкулез. Данные геномки и исследования генетических маркеров восприимчивости к туберкулезу выявили ряд генетических детерминант, главным образом, связанных с генами человеческих лейкоцитарных антигенов, генов системы комплимента, генов цитокинов и циокиновых рецепторов. При этом не удается выявить набор наследуемых факторов восприимчивости, который мог бы иметь значимый прогностический потенциал. [Richard Bellamy et al., Genetic susceptibility to tuberculosis in Africans: A genome-wide scan, Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97(14): 8005-8009]. В то же время данные указывают на большее значение приобретенных качеств иммунной системы, чем генетические маркеры возбудителя или пациента. Наиболее вероятно, что условия окружающей среды и образ жизни оказывают существенно большее влияние на восприимчивость, чем врожденные факторы иммунитета человека и генетические особенности отдельных штаммов микобактерий. Однако не стоит исключать появление высокопатогенных штаммов микобактерий, которые могут существенно повлиять на эпидемиологическую обстановку в будущем [Small PM. Tuberculosis in the 21st century: DOTS and SPOTS. Int J Tuberc Lung Dis 1999;3:949-55].

Факторы, которые напрямую или косвенно нарушают функционирование иммунной системы играют ведущую роль в повышении восприимчивости к туберкулезной инфекции. Ряд из них имеют социокультурные предпосылки: низкое качество питания, курение, алкоголизм, наркомания, плохие бытовые условия. Также туберкулез вносит существенный вклад в коморбидность при ВИЧ-инфекции [P Davies and J Grange, Thorax. 2001 Sep; 56(Suppl 2): ii23-ii29]. Пандемия новой коронавирусной инфекции, потенциально, может создать новые риски, связанные как с организационными проблемами здравоохранения, так и с массовым использованием стероидной противовоспалительной терапией [Gao Y, Liu M at al, Association between tuberculosis and COVID-19 severity and mortality: A rapid systematic review and meta-analysis, J Med Virol. 2021 Jan;93(1):194-196]. Важным фактором риска так же является воздействие длительного психоэмоционального стресса [Denise L. Bellinger, Brooke A. Millar et al., Cell Immunol. 2008 Mar-Apr; 252(1-2): 27-56] и связанного с ним иммуносупрессорного действия кортизола [Glucocorticoid-Induced Exacerbation of Mycobacterial Infection Is Associated With a Reduced Phagocytic Capacity of Macrophages Front Immunol 2021].

Консолидированные усилия мирового научного и медицинского сообщества обеспечили существенное снижение заболеваемости и смертности от туберкулеза. Глобальная положительная тенденция сохранялась более 5 лет. Так, по данным ВОЗ, в 2019 году туберкулез поразил около 10 миллионов и привел, по меньшей мере, к 1,2 миллионам летальных исходов во всем мире. При этом своевременная диагностика и лечение позволило предотвратить, начиная с 2000 года, более 60 миллионов смертей [World Health Organization. Global tuberculosis report 2020].

Как указывалось выше, источником препятствий в борьбе с глобальной эпидемии является ряд биологических адаптаций возбудителя: способность впадать в «спящее» состояние; способность существовать как внутриклеточный патоген; уклонятся от действия иммунной системы и т.д. Это объясняет то, что туберкулез характеризуется продолжительным и скрытным развитием инфекционного процесса и плохо поддается диагностике и лечению. Согласно документам ВОЗ по глобальной программе противодействия распространению туберкулеза [End TB Strategy by WHO], отдельная актуальная проблема, это рост случаев заражения антибиотикорезистентными, трудно попадающимся лечению, штаммами. Так Российская Федерация входит в тройку лидеров по частоте выявления антибиотикорезистентных форм туберкулезной инфекции.

Фактором, требующим особого внимания к профилактике и ранней диагностики, является высокая вероятность реактивации скрытной латентной формы туберкулеза (LTBI), которая ведет к регулярному появлению в популяции не выявленных лиц с интенсивным бактериовыделением. При этом до 25% бактериовыделителей не имеют каких-либо выраженных симптомов и могут быть выявлены только в результате широкомасштабного скрининга населения [World Health Organization. Early detection of tuberculosis. An overview of approaches, guidelines and tools. 2011. WHO, Geneva, Switzerland]. Так, по оценкам ВОЗ [World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2015. WHO, Geneva, Switzerland], не выявленными остаются до 30% всех случаев активного туберкулеза. Это делает важнейшей задачей раннее прерывание цепочек передачи инфекции.

Таким образом, на ряду с очевидной необходимостью усилий по разработки более эффективных инструментов иммунопрофилактики, вопрос о ранней массовой скрининговой диагностики представляется наиболее актуальным. Однако характерные для туберкулеза, локальные очаги инфекции при начальных или этапах активного туберкулеза или LTBI зачастую никак не проявляют себя, а возбудитель не может быть обнаружен в биообразцах с приемлемой диагностической чувствительностью.

LTBI представляет отдельную специфическую проблему в связи со своими уникальными иммунологическими особенностями. При этом по некоторым расчетам, риск развития активного туберкулеза (AT) у LTBI-пациентов может достигать 10%, что требует своевременного выявления и, как минимум, наблюдения таких пациентов. Однако на настоящий момент не существует общепринятого золотого стандарта для диагностики латентного туберкулеза [Noton K. Duttaa and Petros C. Karakousis, Latent Tuberculosis Infection: Myths, Models, and Molecular Mechanisms, Microbiol Mol Biol Rev 2014].

Широко применяемое в Российской Федерации лучевое обследование легких (флюорография) способно выявить только заболевание в его активной фазе. Лица с AT и бактериовыделением длительное время продолжают обычную общественно-бытовую деятельность, представляя для окружающих существенную опасность. Кроме того, флюорография - это метод с весьма ограниченной диагностической специфичностью, что приводит к значительной гипердиагностики и направлению лиц с нетуберкулезными пульмонологическими патологиями в туберкулезные диспансеры для дополнительного обследования. Еще одной проблемой может стать недоступность в ряде регионов рентгенологического оборудования.

Бактериологическое исследование мокроты является обязательным общепринятым методом подтверждения наличия активного туберкулеза и определения чувствительности к антибиотикам. Так, клинические рекомендации [РОФ, Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению туберкулеза органов дыхания, 2014] указывает врачам общей практики от необходимости заподозрить туберкулез даже у лиц с наличием лишь некоторых симптомов АТ: длительный кашель не ясной этиологии, ночная потливость и т.д. В таких случаях врач обязан направить пациента на бактериологическое исследование мокроты. Эти безусловно оправданные указания, однако, накладывают особенную ответственность на первичное звено здравоохранения. А именно, для корректного сбора биообразцов мокроты необходимо тщательно проинструктировать пациента о способе отхаркивания, а пациент должен быть достаточно мотивирован и информирован о важности правильного выполнения требований медперсонала, в противном случае, собираются образцы не пригодные для проведения анализа и получения достоверного заключения. Таким образом, вместе с проблемами доступности специализированной бактериологической лаборатории и прочих нюансов, кающихся организации здравоохранения в конкретных регионах, остро стоит проблема человеческого фактора, налагая исключительно высокие требования к профессионализму медперсонала на всех уровнях. Однако даже при идеальном соблюдении всех условий, бактериоскопия имеет ограниченную чувствительность и прогностический потенциал [WHO, Toman’s tuberculosis case detection, treatment, and monitoring: questions and answers, F.Luelmo 2006]. В частности, для реализации бактериоскопического анализа требуются значительные организационные ресурсы, которые обеспечат наличие бактериологических лабораторий, имеющих необходимые условия и лицензированные для работы с патогенными организмами, в культивировании которых заключается суть метода определения микробной нагрузки. Кроме вышеперечисленных недостатков, метод занимает длительное время, вплоть до нескольких недель. Таким образом, бактериоскопический анализ не может быть рассмотрен как скрининговый метод даже для выявления лиц с АТ не имеющих характерных симптомов, а возможность выявления LTBI совершенно исключена.

Более оперативным способом выявления лиц, являющихся активными микробовыделителями, является микроскопия мокроты. Несмотря на введение этапов по концентрированию центрифугированием и широкого внедрения флюоресцентной-LED микроскопии, позволяющей значительно повысить чувствительность метода, на практике диагностическая чувствительность колеблется от 20-80% [World Health Organization. 2011. Fluorescent lightemitting diode (LED) microscopy for diagnosis of tuberculosis: policy statement. WHO, Geneva, Switzerland].

К методам, основным на выявлении самого возбудителя относятся методы амплификации ДНК M. tuberculesis. К ним относится Xpert MTB/RIF, основанный на технологии полимеразной цепной реакции в реальном времени, направленной на амплификацию региона rpoB гена, с которым связана антибиотикорезистентность по отношению к рифомицину. Благодаря этому, метод позволяет выявить не только наличие самого возбудителя, но и помочь выбрать оптимальную антибиотикотерапию. Данный метод сохраняет многие недостатки бактериоскапического метода: мокрота в качестве биообразца и способность выявлять только легочный туберкулез в активной фазе. Xpert MTB/RIF предусматривает использование специализированного и дорогостоящего оборудования, однако, позволяет существенно сократить время анализа и может рассматриваться в качестве альтернативы традиционной бактериоскопии. Последние модификации метода позволили добиться чувствительности сопоставимой с культивированием на жидких средах, вследствиt чего следует рассматривать Xpert MTB/RIF как возможную альтернативу «золотому стандарту» диагностики туберкулеза. На настоящий момент ВОЗ рекомендует метод для первичной диагностики лиц с подозрением на активный туберкулез [World Health Organization. 2013. Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampin resistance: Xpert MTB/RIF system for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. Policy update. WHO, Geneva, Switzerland].

Все вышеперечисленные методы по своим аналитическим и техническим характеристикам не подходят для скрининговой диагностики туберкулеза на ранних стадиях активного туберкулеза и LTBI, однако незаменимы для подтверждения диагноза и контроля эффективности терапии. Главными проблемами в использовании бактериологических и молекулярно-биологических диагностических платформ становятся отсутствие достаточного количества возбудителя за пределами очага инфекции и отсутствие характерных изменений в легких, которые могли бы быть выявлены в ходе рутинного рентгенологического обследования на ранних этапах развития заболевания [Shajo Kunnath-Velayudhan and Maria Laura Gennaro, Immunodiagnosis of Tuberculosis: a Dynamic Viewof Biomarker Discovery, CMR, Oct. 2011, p. 792-805].

Отдельной проблемой остается диагностика внелегочного туберкулеза. Необходимость инвазивных методов получения биопсийного материала для бактериологических и молекулярных методов исследования затрудняет не только скрининг, но и подтверждения этого диагноза.

На настоящий момент наиболее перспективным подходом к массовой скрининговой диагностики туберкулеза, в том числе и его скрытой формы - LTBI, рассматривается выявление иммунного ответа на возбудитель в той или иной форме. Иммунодиагностика лишена недостатков, связанных с выявлением самого возбудителя или его компонентов. После проникновения в организм, микобактерии неизбежно сталкиваются с первичным звеном неспецифического иммунитета, а затем, формируется специфический иммунный ответ, который может быть выявлен различными методами в зависимости от его типа. Маркеры иммунного ответа могут быть выявлены за пределами очага инфекции, что значительно упрощает процесс получения биообразцов, в частности, в качестве биообразца может быть использована цельная венозная кровь, в которой определяется гуморальный или клеточный иммунный ответ. Несмотря на то что иммунная система является одной из мишеней туберкулеза, а возбудитель способен нарушить или замедлять формирование иммунного ответа, не позволив ему развиться до проективного уровня, в большинстве случаев, количественные и качественные характеристики иммунного ответа оказываются достаточными для диагностических целей даже на фоне иммунодефицитных состояний [J.A.Santosab, R. Duartecd, C.Nunesa, Host factors associated to false negative and indeterminate results in an interferon-γ release assay in patients with active tuberculosis, Pulmonolog., 2020].

В связи с тем, что наиболее распространенным подходом в иммунодиагностики инфекционных заболеваний является выявление гуморального иммунного ответа, а именно, патоген-специфичных антител, были предприняты усилия по разработки соответствующих тест-систем. Учитывая распространение методов серодиагностики и развития инфраструктуры, в которую этот метод мог бы быть интегрирован, этот подход представляется весьма целесообразным. Исследование иммунопротеома M. tuberculosi, показало, что около 10% всех белков туберкулезных микобактерий вызывают гуморальный иммунный ответ. Большинство этих антигенов являются секретируемыми и мембранными белками. Причем, можно выделить группу антигенов, представляющих около 1% протеома, которые проявляют наибольшую имммуногенность у пациентов с активным туберкулезом [Kunnath-Velayudhan, S., et al. 2010. Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.107:14703-14708]. Это наблюдение обосновало разработку серодиагностических наборов, в связи с их потенциалом различать туберкулез на его различных стадиях и контролировать эффективность терапии [Abebe, F., C. Holm-Hansen, H. G. Wiker, and G. Bjune. 2007. Progress inserodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scand. J. Immunol 66:176-191]. Однако существенной проблемой в разработке методов серодиагностики туберкулеза, стала значительная вариация профиля иммунодоминантности в популяции. К причинам такой гетерогенности относят: вариация среди носителей различных аллелей HLA; различны профиль экспрессии среди разных штаммов M. tuberculosi и различие в метаболическом статусе микобактерий. Такую вариабельность можно объяснить и тем, что гуморальный ответ не является протективным против туберкулеза и, таким образом, в процессе эволюции противотуберкулезного иммунитета, он не находился под прессом естественного отбора. Таким образом, в человеческих популяциях не сформировалось более или менее единообразного или стереотипного профиля гуморального иммунного ответа и оказалось затруднительным подобрать набор биомаркеров для серодиагностики, которые могли бы охватить весь диапазон изменчивости популяции по характеру противотуберкулезного гуморального иммунного ответа. Так, при расширении репертуара антигенов, для обеспечения приемлемой диагностической чувствительности, неизбежно растет число ложноположительных результатов [Steingart, K. R., et al. 2007. Commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: a systematic review. PloS Med. 4:e202.].

Диагностическая стратегия основанная на выявлении гуморального ответа, по наличию специфических антител, является наиболее распространенной для выявления широкого спектра инфекционных заболеваний, однако, для диагностики ряда инфекций, в том числе и микобактеральных, детектирование патоген-специфичных антител не целесообразно, так как гуморальный ответ, не является физиологичным и, в связи с отсутствием протективности, не является приоритетной реакцией иммунной системы человека. В частности, при развитии туберкулезной инфекции, интенсивный гуморальный иммунный ответ возникает на поздних стадиях и при высокой микробной нагрузке, при этом, данные эпитопного картирования микобактеральных протеомов не позволяют выделить достаточно характеристичный паттерн B-клеточных эпитопов, который обеспечил бы репрезентативную картину гуморального ответа всей популяции [Steingart, K. R., et al. 2009. Performance of purified antigens for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis: a meta-analysis. Clin. Vaccine Immunol. 16:260-276]. Вероятно, это связано, с отсутствием действия естественного отбора в направлении по оптимизации гуморального ответа, что привело к высокой гетерогенности по этому показателю внутри человеческой популяции. Таким образом, крайне затруднительно выделить набор B-клеточных антигенов и ответствующих эпитопов, который мог бы перекрыть все популяционную изменчивость гуморального ответа на туберкулезную инфекцию. В итоге, несмотря на все технологические, логистические и технические преимущества, ВОЗ не рекомендует серодиагностику для скрининга туберкулезной инфекции [World Health Organization. 2011. Commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis. Policy statement. WHO, Geneva, Switzerland].

Попытки детектировать антигены и ДНК микобактерий в крови так же нецелесообразны для скрининговой диагностики в связи с локальным характером инфекционного процесса и отсутствием циркулирующего патогена и его компонентов на ранних стадиях забеливания в достаточным для детектировании количестве. Широко применяемые методы радиологической диагностики и микробиологии не позволяют распознать инфекцию на ранних стадиях, а также часто сопряжены с логистическими и техническими сложностями.

К иммунодиагностике туберкулеза так же можно отнести и туберкулиновый кожный тест или реакцию Манту, история применения которого насчитывает уже более века. Метод основан на выявлении реакции гиперчувствительности замедленного типа, которая возникает у лиц, иммунная система которых контактировала с возбудителем. Данный тип иммунного ответа является физиологичным, стереотипным и, вероятно, наиболее протективным ответом на туберкулезную инфекцию. Реакция гиперчувствительности замедленного типа основана на формировании пула туберкулез-специфичных Т-клеток, циркулирующих по всему организму. В случае появления в ткани антигенов туберкулезных микобактерий, презентированных клетками неспецифического звена иммунитета (моноциты, макрофаги и дендритные клетки), Т-лимфоциты активируются и выделяют широкий спектр провоспалительных цитокинов. Результатом становится мобилизация и дифференциация моноцитов, активация фагоцитоза, автофагоцитоза и усиление процессов лизосомальной деградации содержимого фагосом и автофагосом. Этими эффектами и обуславливается протективный эффект. [Jonathan Kevin Sia and Jyothi Rengarajan, Immunology of Mycobacterium tuberculosis infections, Microbiol Spectr. 2019] Кроме того, реакция вовлекает множество других типов клеток и инициирует комплексную тканевую реакцию.

Выявление лиц с предформированной гиперчувствительностью к туберкулезным аллергенам осуществляется внутрикожным введением препарата, содержащего продукты жизнедеятельности микобактерий или белки, выделенные из самих микобактерий. В том случае, если иммунная система пациента сенсибилизирована по отношению к антигенам, содержащимся в препарате, т.е. имела контакт с возбудителем, развивающаяся реакция гиперчувствительности проявляет себя в течение нескольких дней в виде небольшого отека и гиперемии, образовании пустулы, которую можно оценить невооруженным глазом, а ее размер используется как критерий позитивности.

Традиционно, препарат, используемый для кожного туберкулезного теста, называется туберкулезным аллергеном или туберкулином. Его состав прошел эволюцию от так намываемого «старого туберкулина Коха» до очищенного белкового дериватива (PPD). Данный метод исключительно прост в применении и обладает низкой себестоимостью, а его диагностическая чувствительность превышает 90%. Однако в связи с тем, что препарат имеет сложный и не вполне известный состав, включающий значительный спектр антигенов, неизбежно возникают проблемы с низкой специфичностью, особенно, на фоне масштабной и систематической противотуберкулезной иммунопрофилактики. Так, вакцинация БЦЖ-вакциной ведет к сенсибилизации иммунной системы, антигенами, содержащимися в туберкулине, и, следовательно, к возникновению ложноположительных результатов. Кроме того, кросс-реактивность метода может возникнуть в ответ на сенсибилизацию некоторыми нетуберкулезными видами микобактерий. Все это ведет к 40-50% доле ложноположительных результатов, что накладывает избыточную нагрузку на систему здравоохранения. Другим фактором, делающим смутными перспективы дальнейшего широкого использования туберкулинового кожного теста, это все возрастающие регуляторные требования к качеству инъекционных биопрепаратов. Плохо идентифицированный состав препарата и сложный производственный процесс, взывает вопросы относительно воспроизводимости качественных характеристик препарата, безопасности и надежности его использования [Alessandra Regatieri, Yehia Abdelwahed, et al., Testing for Tuberculosis: The Roles of Tuberculin Skin Tests and Interferon Gamma Release Assays, Laboratory Medicine, 2011].

Для разработки более специфичных методов диагностики были использованы данные сравнительной геномики, биоинформатики и эпитопного картирования, которые позволили достичь существенного прогресса в поиске специфических иммунобиомаркеров. Так, были выявлены регионы в геномах болезнетворных туберкулезных микобактерий, которые оказались дилетированными в вакцинных и непатогенных штаммах, а гены, содержащиеся в этих регионах, кодировали белки напрямую участвующие в патогенезе и, таким образом, являющиеся факторами патогенности. Технологии генной инженерии позволили экспрессировать эти факторы в гетерологических системах, выделить в очищенном виде и охарактеризовать. Это сделало возможным получить очищенные препараты, содержащие иммунодоминантные антигены-маркеры патогенных микобактерий. Впоследствии, в качестве антигенов, начали широко использовать и аминокислотные последовательности белков-маркеров, полученных путем химического синтеза. Эти технологии поддаются масштабированию до промышленного уровня, что способствовало появлению диагностикумов нового поколения. Так, появляются методы диагностики в формате кожного туберкулезного аллерго-теста, в которых в качестве аллергена используются рекомбинантные химерные белки, содержащие последовательности специфических белков биомаркеров, описанных в Государственной фармакопее РФ и получивших общее наименование - туберкулезный рекомбинантный аллерген. К таким препаратам относится Диаскин-тест, производства компании Генериум [Tatiana Ivanovna Morozova, Olga Otpuschennykova, Recombinant Tuberculosis Allergen in Detecting Latent Tuberculosis Infection in Adults, European Respiratory Journal 2018].

Более современным способом реализации возможностей, появившихся после открытия высокоспецифичных антигенов-биомаркеров, стало направление по разработки диагностикумов с общим наименованием IGRA (Interferon-Gamma Release Assay). Оно представляет из себя альтернативу кожному аллерготесту, которое предусматривает выявление антиген-специфичных Т-лимфоцитов в in vitro формате. Другими словами, процесс распознавания антигена-биомаркера осуществляется вне человеческого организма, а в реакции с антигеном участвуют периферические мононулеарные клетки из венозной крови, в состав которых входит как Т-лимфоциты, так и антигенпрезентирующие клетки. В одном варианте, используются цельная венозная кровь, которую инкубируют в присутствии антигенов маркеров (Quantiferon tb test, Qiagen, Valencia, CA), в другом варианте периферические мононуклеарные клеки выделяют из крови, и реакция осуществляется во временной культуре клеток (T-Spot TB. Oxford Immunotec, Abingdon, United Kingdom). Наличие туберкулез-специфичных Т-клеток и, следовательно, туберкулезной инфекции в обоих вариантах определяют по выделению γ-интерферона - наиболее характерному маркеру активации Т-лимфоцитов при противотуберкулезном иммунном ответе. Индикатором антиген-специфической активации Т-клеток был выбран провоспалительный лимфокин - γ-интерферон. Этот иммунорегуляторный белок выделяется Т-лимфоцитами первого типа в ответ на распознавание туберкулезного антигена, и играет ключевую роль в развитии реакции гиперчувствительности замедленного типа. Важно отметить, что с активностью гамма интерферона связана не только протективность, но и иммунопатогенез. [Andrea M. Cooper. Cell mediated immune responses in Tuberculosis/ Annu Rev Immunol. 2009].

В тестах IGRA, использующих цельную кровь, антиген-специфическая активация Т-лимфоцитов оценивается по приросту концентрации γ-интерферона в плазме после стимуляции гепаринизированной крови антигеном, которая осуществляется в течение 16-24 часов, как правило, непосредственно в вакуумных контейнерах для забора крови. Для измерения суммарной концентрации γ-интерферона используется иммунохимический анализ (ИФА или ИХЛА), при этом оценка амплитуды Т-клеточной реакции проводится путем сравнения с концентрацией γ-интерферона в плазме нестимулированной антигеном крови.

В формате иммуноспота культивирование проводится непосредственно в иммунологическом планшете с сорбированными антителами против человеческого γ-интерферона, в результате чего, после удаления клеток и внесения в лунки пероксидазных конъюгатов и хромогена, на месте осевшей активированной антиген-специфичной клетки появляется темное пятно (spot). Таким образом, выделение периферических мононуклеаров позволяет оценить количество индивидуальных антиген-специфичных Т-лимфоцитов, что по некоторым данным повышает чувствительность. Однако, выделение и культивирование клеток из крови требует от персонала особых навыков и специального оборудования.

Методы на базе принципа IGRA имеют значительное преимущество перед кожными тестами в логистике и безопасности, так как требуют единственного визита пациента и не предусматривают введения в организм какой-либо субстанции.

В 2011 году ВОЗ выпустил рекомендации для использования ряда коммерческих тест-систем для выявления туберкулезной инфекции: Qiagen QuantiFERON®-Gold (QFT-G); QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT) и Oxford Immunotec T-SPOT®.TB (T-Spot).

Самая ранняя версия IGRA-теста фирмы Qiagen - QFT использовала в качестве индуктора PPD, то есть препарат, используемый для кожного теста, который вносился в цельную кровь. В следующей версии QFT-G, PPD был заменен на специфические антигены туберкулезных микобактерий - ESAT-6 и CFP-10. В 2008 году, был представлен набор QFT-GIT, в котором был усовершенствован преаналитический этап, а репертуар антигенов расширен за счет антигена TB7.7.

Набор T-Spot, как отмечалось выше, предусматривает выделение и кратковременное культивирование периферических мононуклеарных клеток в специальных планшетах, что существенно осложняет преаналитический этап. Однако этап выделения клеток предусматривает их подсчет и нормирование. Это позволяет повысить чувствительность метода у детей и пациентов с иммунодефицитом.

Вышеперечисленных наборах Qiagen и Oxford Immunotec предусмотрены отрицательный вариант, позволяющие определить фоновый уровень интерферона и положительные контроль, в котором митоген осуществляет не специфическую активацию лимфоцитов, подтверждая функциональную активность лимфоцитов. При этом в T-spot специфическая активация лимфоцитов осуществляется для каждого антигена по отдельности, а в указанных наборах Qiagen антиген представлен суммарным пулом перекрывающихся синтетических пептидов содержащих аминокислотные последовательности всех используемых антигенов.

В последнее десятилетие на рынке появились доработанные варианты IGRA-теста от вышеперечисленных производителей, а также от компаний, дебютировавших в этой сфере:

• Beijing Wantai’s TB-IGRA (Wantai) китайского производства, который основан на активации цельной крови рекомбинантным полипептидом, содержащим последовательности ESAT-6 и CFP-10. Так же, как и QFT-GIT, использует формат трех пробирок с положительным и отрицательным контролем помимо пробирки с антигеном.

• QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus, производства Qiagen Австралия), достаточно близок к QFT-GIT и отличается дополнительной пробиркой с антигеном, в которой содержится альтернативный пул синтетических пептидов, призванный активировать специфические цитотоксические лимфоциты.

• QIAreach QuantiFERON-TB (QIAreach производства Qiagen Австралия) использует тот же набор антигенов что и QFT-GIT, но реализуется без контрольных пробирок, а определение концентрации интерферона проводится методом иммунофлуоресценции на наночастицах в латеральном потоке.

• Standard E TB-Feron ELISA (TBF, SD Biosensor, Республика Корея), так же очень близок с QFT-GIT по формату теста, но антигены представлены отдельными полноразмерными рекомбинантными белками ESAT-6, CFP-10 и TB7.7.

• T-SPOT.TB 8 with T-Cell Select (T-Cell Select, Oxford Immunotec, Великобритания) представляет из себя вариант иммуноспот-теста с усовершенствованной процедурой выделения периферических мононуклеаров.

Патент РФ 2636490 (Аллерген, содержащий комбинацию последовательностей белков, кодируемых генами EsxA, EsxB, EspJ, EspK M.tuberculosis complex, и способ его применения для диагностики инфекции M.tuberculosis complex) описывает искусственную беловую конструкцию, содержащую набор последовательностей специфических антигенов: EsxA, EsxB, EspJ и EspK. Изобретение также описывает способ применения конструкции, в качестве активного компонента для кожного аллерго-теста, который, благодаря расширенному репертуару специфических антигенов позволит с большей чувствительностью и специфичность выявлять сенсибилизированых лиц.

Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является искусственная белковая конструкция и способ ее применения для диагностики инфекции M. tuberculosis complex, описанная в патенте РФ 2636490, где в качестве аллергена, способного вызывать специфическую аллергическую реакцию замедленного типа у сенсибилизированных, используется препарат белка, содержащий комбинацию аминокислотных последовательностей, кодируемых генами M. tuberculosis complex из ряда EsxA, EsxB, EspK, EspJ, который вводится внутрикожно.

Изобретение отличается от указанного прототипа структурой белковой конструкции и способом применения. Так, помимо аминокислотных последовательностей, кодируемых генами EsxA, EsxB, EspJ и EspK в составе белковой конструкции содержится аминокислотная последовательность белка Rv2654c, так же известный как TB7.7, который позволяет вовлечь в иммуноспецифическую реакцию дополнительные пул сенсибилизированный лимфоцитов, повысив, тем самым амплитуду реакции. Вторым отличием, связанным со способом применения, является использование усовершенствованной полиэпитопной белковой конструкции в качестве препарата-индуктора ex vivo активации антиген специфических Т-лимфоцитов в IGRA формате. А именно, препарат антигена вносится в вакуумную пробирку для забора венозной крови, в которой затем происходит инкубация цельной крови и антигена. Результат оценивается путем сравнения фонового уровня γ-интерферона в пробирке отрицательного контроля, в которой не содержится антиген. Кроме пробирки с антигеном и пробирки отрицательного контроля, метод применения предусматривает пробирку, содержащую митоген - неспецифический активатор лимфоцитов. Пробирка с митогеном, используется в качестве положительного контроля, подтверждающего функциональную активность лимфоцитов в крови.

Заключение о наличии туберкулезной инфекции делается на основании оценки относительной и абсолютной разницы в концентрации γ-интерферона в плазме образца крови из пробирки с препаратом антигена и контрольной пробирки. Таким образом, разница концентраций является критерием позитивности.

Отличие, относящееся к расширению эпитопного репертуара за счет добавления в конструкцию антигена аминокислотной последовательности белка ТВ7.7, позволит повысить число лимфоцитов, участвующих в реакции распознавания антигена, что в свою очередь повысит амплитуду γ-интерферонового ответа и в конечном итоге приведет к повышению чувствительности диагностического метода. Данное преимущество реализуется, главным образом, в снижении числа сомнительных результатов среди пациентов с иммунодефицитом различной природы, детей и лиц пожилого возраста.

Отличие, относящееся к способу применения, позволяют преодолеть недостатки In vivo диагностики, которые заключаются в рисках непредвиденных побочных эффектов, вызванных компонентами препарата и логистическими сложностями массового применения кожного аллерготеста.

В частности, полипептиды входящие в состав белковой конструкции, как доказано, играют ключевую роль в патогенезе туберкулезных микобактерий, что обязывает заподозрить возможные нежелательные последствия их введения в организм человека. Так же невозможно полностью исключить риски реакции индивидуальной непереносимости. Сама же схема применения кожного аллерготеста, предусматривает необходимость двух визитов в медицинское учреждение (при инъекции и для фиксирования результата). При этом невыполнение пациентом требований медперсонала о бережном отношении к месту инъекции и неявка на повторный прием, может привести к искажению результатов или срыву диагностического мероприятия.

Настоящее изобретение позволит улучшить логистику и преодолеть методологические и организационные сложности при проведении массового скрининга туберкулезной инфекции, обеспечит высокие аналитические характеристики клинико-лабораторной диагностики и расширит арсенал инструментов для скрининга туберкулезной инфекции.

Задачей, решаемой с помощью заявляемого изобретения, является разработка тест-системы и способа диагностики инфекции М.tuberculosis complex ин витро на ранних стадиях по образцу цельной крови с целью скрининга, в том числе для BCG-вакцинированных лиц и лиц, имеющих противопоказания к кожному аллерго-тесту.

Для решения этой задачи мы предлагаем тест-систему для диагностики инфекции М.tuberculosis complex отличающуюся тем, что в качестве антигена используется смесь полипептидов или химерный полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, кодируемых генами М.tuberculosis complex из ряда EsxA (кодирует белок ESAT-6, последовательность SEQ ID NO 1), EsxB (кодирует белок CFP-10, последовательность SEQ ID NO 2), EspJ (кодирует одноименный белок, последовательность SEQ ID NO 3), EspK (кодирует одноименный белок, последовательность SEQ ID NO 4), Rv2654c (кодирует белок tb7.7, .последовательность SEQ ID NO 5),

при этом антиген представляет собой мозаичный полипептид или смесь полипептидов, полученный методами генной инженерии в трансгенной культуре клеток;

при этом антиген содержит белки, очищенные методом металл-хелатной хроматографии;

Также предлагается способ диагностики инфекции М.tuberculosis complex с помощью тест-системы по п.1, включающий введение образца цельной крови в контакт с антигеном по п.1 с последующей инкубацией и количественным иммунохимическим измерением изменения концентрации интерферона гамма в результате специфической реакции циркулирующих антиген-специфических эффекторных Т-лимфоцитов на препарат туберкулезного антигена у сенсибилизированных М.tuberculosis complex пациентов.

Технический результат заявляемого изобретения достигается благодаря использованию увеличенного репертуара антигенных биомаркеров, который позволяет выявлять большее количество клональных линий лимфоцитов, специфичных к различным эпитопам. В связи с тем, что каждая клональная линия Т-лимфоцитов специфична строго к одному эпитопу, а при туберкулезной инфекции происходит формирование пула лимфоцитов, специфичных к разным эпитопам, использование увеличенного набора антигенов, позволяет активировать большее количество специфичных Т1-лимфоцитов и вследствие этого увеличивать амплитуду индуцибельного γ-интерферонового ответа. Кроме того, в связи с гетерогенностью иммунного ответа на туберкулезную инфекцию, которая выражается в том что, у индивидов с различными аллелями HLA иммунодоминантность различных специфических туберкулезных антигенов проявляется в разной степени, таким образом, расширение спектра антигенов обеспечивает иммунодиагностическую диверсификацию, и снижает вероятность ложно отрицательных результатов у лиц с нестандартным патерном иммунодоминантности к антигенам микобактерий. Данный факт подтвержден исследованиями суммарной иммунореактивности к наборам синтетических пептидов - антигенов, в которых показано повышение амплитуды γ-интерферонового ответа в ответ на расширение ассортимента антигенов. Этот фактор может оказать существенное влияние на эффективность активации антиген-специфичных лимфоцитов, так как лимфоциты способны распознать только те антигены, которые презентованы антигенпрезентирующими клетками.

Технический результат заявляемого изобретения достигается благодаря использованию высокопродуктивного и низкозатратного способа синтеза химерного (мозаичного) рекомбинантного полипептида-антигена в трансгенной линии клеток. Полипептиды, входящие в состав белковой конструкции, как доказано, играют ключевую роль в патогенезе и иммунологическом ответе организма на туберкулезную инфекцию. Ограничения технологии биосинтеза, связанные с возможностью контаминации антигена примесями компонентов бактерии, которые имеют митогенные свойства и могут повлиять на специфичность метода, преодолены благодаря использованию специальной схемы очистки продукта методом аффинной хроматографии. Высокая продуктивность технологии, позволяет снизить себестоимость ключевого компонента диагностической системы и повышает технологичность производства благодаря объединению пяти антигенов в один полипептид.

Другой технический результат заявляемого изобретения достигается благодаря увеличенного ассортимента иммунодоминантных антигенов, за счет объединение антигенов и фрагментов антигенов в одну искусственную белковую конструкцию, благодаря повышению общей молекулярной массы химерного полипептида по сравнению с отдельными, относительно низкомолекулярными пептидами и белками-антигенами микобактерии, предсказуемо улучшается взаимодействие антигена с антигенпрезетирующими клетками, которые с большей вероятностью распознают и процессируют более крупную молекулу. Этот фактор может оказать существенное влияние на эффективность активации антиген-специфичных лимфоцитов, так как лимфоциты способны распознать только те антигены, которые презентованы антигенпрезентирующими клетками.

Дополнительный технический результат заявляемого изобретения достигается так же за счет формата заявляемой тест-системы в качестве ин витро диагностикума в формате высокопроизводительного и общедоступного в современных лабораториях ИФА или ИХЛА с количественной оценкой концентрации измеряемого аналита, вместо устаревшей реакции Манту, метода, который предполагает органолептическую оценку результатов анализа, требует неоднократного посещения пациентом процедурного кабинета и предусматривает введение субстанции в организм человека.

Изобретение расширит арсенал имеющихся средств для ранней иммунодиагностики туберкулеза и повысит доступность для широких масс населения, в том числе для BCG-вакцинированных лиц и лиц имеющих противопоказания к кожному аллерго-тесту.

Раскрытие сущности изобретения

Предлагается группа антигенов и тест-система, содержащая в качестве антигена смесь полученных отдельно полипептидов или мозаичный (химерный) полипептид, содержащий комбинацию аминокислотных последовательностей, кодируемых генами esxА, esxB, espJ, espK (Rv3879c) и Rv2654c М. tuberculosis complex. Выбор комбинации последовательностей в белковой конструкции осуществлялся на принципах постгеномного дизайна с использованием общедоступных данных сравнительной геномики, биоинформатики, и эпитопного картирования.

Как вариант исполнения изобретения, последовательности объединены в один мозаичный (химерный) полипептид методами генной инженерии, который также содержит аффинную метку для металл-хелатной хроматографии и последовательности-линкеры, обеспечивающие структурную обособленность регионов полипептида, соответствующих продуктам указанных генов. Аффинная метка представляет из себя последовательность из шести гистидиновых аминокислотных остатков, расположенную на С-конце полипептида, которая имеет свойство образовывать координационные связи (хелатировать) с атомами таких металлов как никель и медь. Это свойство позволяет использовать металл-хелатную хроматографию для выделения и очистки полипептида после биосинтеза.

Аминокислотные последовательности предлагаемого мозаичного антигена кодируются генами, входящими в локальные регионы RD-1 (region difference-1) и RD-11 генома M. tuberculosis. RD-1 один из 16 регионов, которые не обнаруживаются в непатогенных штаммах M. tuberculosis и содержат более 100 открытых рамок считывания. Показано, что RD-1 делетируется на самых первых этапах аттенуации M. tuberculosis [[Behr MA, et al.(1999) Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 284(5419):1520-1523]. Таким образом, отсутствие данного региона в штаммах, использованных в аттенуированной противотуберкулезной живой вакцине BCG [PJ Sabo, GG Mahairas et al. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovisournal of Bacteriology 1996], дает основание рассматривать RD-1 в качестве элемента, содержащего основные факторы патогенности. Компоненты могут быть использованы в качестве биомаркеров туберкулезной инфекции, в том числе ее латентной формы (LTBI).

Входящие в состав предлагаемого мозаичного антигена белки ESAT-6 (Rv3875) и CFP-10 (Rv3874), кодируемые генами RD-1, как показано [van Pinxteren LA, RavnP, AggerEM, PollockJ, AndersenP. Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP10, Clin Diagn Lab Immunol, 2000, vol. 7 (pg. 155-60)] появляются в культуральной жидкости при культивировании патогенных штаммов M. tuberculosis. Впоследствии нашлись подтверждения в роли ESAT-6 и CFP-10 в патогенезе [Nicole van der Wel, David Hava, Diane HoubenM et al., M. tuberculosis and M. leprae Translocate from the Phagolysosome to the Cytosol in Myeloid Cells]. Так, данные белки участвуют в нарушении работы первичного неспецифического звена иммунитета и, как следствие, торможении формирования специфического иммунного ответа.

Входящий в состав предлагаемого мозаичного антигена белок кодируемый, расположенным в регионе RD-1, геном espJ - Esp-J (Rv7838, TB27.4) так же является субстратом для секреторной системы Esx-1. Белок богат аланином и влияет на жизнеспособность микроорганизма в ходе инфекционного процесса, хотя его функции не вполне ясны [Pramod K Singh, Richa Saxena at al, RD-1 encoded EspJ protein gets phosphorylated prior to affect the growth and intracellular survival of mycobacteria, Nature scientific reports 2015]. В ходе эпитопного картирования, установлено, что Esp-J обладает высокой иммунодоминантностью и содержит 12 Т-клеточных эпитопов, большая часть которых расположена вблизи С-терминали. Низкая иммунореактивность этого антигена в когортах BCG-вакцинированных здоровых добровольцев, делает Esp-J привлекательным кандидатом в ряд биомаркеров латентных и активных форм туберкулеза [Human T-cell responses to the RD1-encoded protein TB27.4 (Rv3878) from Mycobacterium tuberculosis].

Еще один белок, входящий в состав предлагаемого химерного антигена, является биомаркером из группы SPX-1-субстратных белков - Esp-K. Он так же является сильным Т-клеточным антигеном и содержит 12 предсказанных T-клеточных эпитопов. Кодируется геном espK (Rv3879c), принадлежащем RD-1 региону [Xiao-Qing Liu, Davinder Dosanjh et al., Evaluation of T-Cell Responses to Novel RD1- and RD2-Encoded Mycobacterium tuberculosis Gene Products for Specific Detection of Human Tuberculosis Infection Infection and Immunity 2004]. В отличии от вышеперечисленных биомаркеров, Esp-K не обнаруживается в культуральной жидкости, а его функции связаны с ESAT-6/CFP-10 системой, так как его делеция приводит к резкому снижению секреции CFP-10 и потере цитолитической активности микроорганизма [Lian-Yong Gao, Su GuoA et al., A mycobacterial virulence gene cluster extending RD1 is required for cytolysis, bacterial spreading and ESAT-6 secretion, Molecular Microbiology 2004]. Ряд фактов указывают на то, что Esp-K является компонентом ESX-1 машинерии и/или играет роль специализированного шаперона [Bryant McLaughlin, Janet S ChonA at al, Mycobacterium ESX-1-Secreted Virulence Factor with Unique Requirements for Export, PLOS 2007].

В предлагаемом мозаичном антигене включен еще один из наиболее специфичных биомаркеров туберкулезной инфекции, который не обнаруживается в других видах патогенных микобактерий - TB7.7 (Antitoxin Rv2654c). Ген Rv2654c, кодирующий TB7.7 расположен в регионе фагового происхождения - RD-11(phiRv2) [Cole ST, Brosch R, Parkhill J, et al. Deciphering the biology of Mycobacteriumtuberculosis from the complete genome sequence. Nature1998], который присутствует только в геномах патогенных штаммов [Inger Brock, Karin Weldingh at al, Specific T-Cell Epitopes for Immunoassay-Based Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis InfectionJournal of Clinical Microbiology 2004]. Методами биоинформатики установлено, что ген Rv2654c входит в состав оперона, организованного сходным образом с опероном, регулирующим продукцию ESAT-6 и CFP-10, что указывает на высокую вероятность участия данного гена в патогенезе. Продукт этого гена представляет из себя 81-аминокислотный, богатый аланином белок, обладающий высокой иммуногенностью. Так, в Южной Африки Rv2654c оказался самым иммунодоминантным пептидом, среди сенсибилизированных индивидов [Claus Aagaard, Inger, Brock, Mapping Immune Reactivity toward Rv2653 and Rv2654: Two Novel Low-Molecular-Mass Antigens Found Specifically in the Mycobacterium tuberculosis Complex, The Journal of Infectious Diseases 2004].

Диагностический принцип, используемый в изобретении, основывается на выявлении антиген-специфических Т-лимфоцитов в цельной крови пациентов по выделению γ-интерферона в ответ на экспозицию с крови со антигенами-биомаркерами. Фокусировка на Т-клеточном иммунном ответе и использование его диагностических целях определяется тем фактом, что именно T-клеточный иммунный ответ является наиболее стереотипной, протективной и характеристичной реакцией в ответ на инфекционный процесс, вызванный патогенными микобактериями. Формирование антиген-специфичных лимфоцитов, как правило, происходит в течение 2-3 недель после контакта возбудителей с первичным неспецифическим звеном иммунной системы. Наиболее характерной реакцией является появление антиген-специфичных Т-лимфоцитов, синтезирующих провоспалительные цитокины γ-интерферон, IL-2 и TNF-α. Т-лимфоциты синтезирующий данный спектр цитокинов обозначаются как T1-лимфоциты, которые относятся к так называемым эффекторным T-клеткам, направляющих иммунный ответ по воспалительному пути, привлекая миелоидные клетки первичного звена иммунитета и инициируя комплексные тканевые защитные реакции, к которым относится и гиперчувствительность замедленного типа. После функционального контакта с антигенпрезентирующей дендритной клеткой во вторичных лимфоидных органах, происходит дифференциация CD4 и CD8 клетки в соответствующие Т-лимфоциты 1 типа. Дифференциация в лимфоциты 1 типа детерминируется паттерном паракринных стимулов исходящих от антигенпрезентирующей клетки, которая, благодаря комплексному распознаванию характерных патоген-ассоциированных молекулярных паттернов, идентифицирует микобактерию как мишень для иммунного ответа типа 1. Кроме того, ряд факторов сигнализируют о типе тканей в которых произошел контакт антигенпрезентирующей клетки с патогеном, под совокупным действием этих факторов дифференцированный антиген-специфичный T1-лимфоцит начинает гистоспецифическую миграцию в сайт первичного контакта иммунной системы с возбудителем. Затем, если на месте инфекции T1-лимфоцит распознает через T-клеточный рецептор тот же T-клеточный эпитоп, презентированный на клетках через MHCI или MHCII, он активируется, претерпевает клональную экспансию и секретирует IP-10, цитокин, который индуцирует дифференциацию моноцитов в макрофаги и стимулируют их миграцию в область инфекционного процесса. Далее, секреция лимфоцитом IL-2, TNF-α и γ-интерферона активизируют фагоцитарную активность моноцитов и макрофагов, повышая эффективность созревания фагосом, лизосомальную деградации их содержимого и запуск автофагоцитоза. Эти процессы является одними из главных протективных эффектов активации T-лимфоцитов при туберкулезной инфекции, так как ключевым фактором патогенности микобактерий является способность персистировать и размножаться в фагоцитах, а Т1-DTH ответ позволяет преодолеть эту адаптацию микобактерий. Повышение эффективности деградации микобактерий в фагосомах и автофагосомах, повышает эффективность презентации T-клеточных эпитопов антиген-специфичным T-клеткам, усиливая реакцию по принципу положительной обратной связи. Ключевую регуляторную роль в Т1-клеточных реакциях играет γ-интерферон, являясь необходимым и достаточным цитокиновым фактором для запуска процессов, обеспечивающих протективность иммунитета по отношению к микобактериальной инфекции. Таким образом, можно рассматривать γ-интерфероновый ответ как наиболее характеристичный маркер специфического противотуберкулезного иммунного ответа. На всех этапах туберкулезной инфекции антиген-специфические Т-лимфоциты мигрируют из очага инфекции в кровяное русло, что позволяет их детектировать в образцах цельной венозной крови. При экспозиции туберкулезных антигенов в вакутейнере или пробирке или пробирке ex vivo с венозной кровью инфицированного пациента, антиген поглощается антигенпрезентирующими клетками крови (макрофагами, моноцитами и дендритными клетками), после протеолитического процессинга антигена, пептиды презентируются антиген-специфичным Т-клеткам через MHCI и MHCII комплексы, в результате чего, лимфоциты активируются и начинают интенсивно синтезировать γ-интерферон. Сравнивая антиген-специфический индуцибельный γ-интерфероновый ответ с фоновым уровнем интерферона, определяется амплитуда реакции, по величине которой, делается вывод о сенсибилизации иммунной системы патогенными микобактериями, и, соответственно, наличии туберкулезной инфекции.

В связи с тем что ex vivo реакция требует жизнеспособных и функционально активных клеток, как вариант исполнения метода, может быть необходим положительный контроль, который подтверждает функциональную активность и отсутствие иммунодефицитного состояния пациента, для чего используются вещества-митогены, способные вызвать неспецифическую активацию лимфоцитов, которая так же сопровождается секрецией γ-интерферона и, таким образом, может быть использована в общей аналитической схеме в качестве положительного контроля.

Изобретение описывает способ диагностики инфекции М.tuberculosis complex с помощью заявленной тест-системы, представленной в виде комплекта, состоящего из трех пробирок для забора венозной крови и материалов для количественного определения γ-интерферона. В данном способе диагностики смесь антигенов или полиэпитопный антиген (мозаичный белок), содержащий комбинацию аминокислотных последовательностей белков, кодируемых генами esxА, esxB, espJ, espK и Rv2654 содержится в высушенном виде в одной из пробирок для забора цельной крови. Оставшиеся две пробирки служат отрицательным контролем и положительным контролем. Пробирка положительного контроля содержит митоген (например, фито-гемагглютинин), вызывающий неспецифическую активацию лимфоцитов и выработку ими γ-интерферона, подтверждая функциональную активность лимфоцитов в образце. Пробирка отрицательного контроля предназначен для определения фонового уровня γ-интерферона. Также все три контейнера могут содержат гепаринат лития в качестве антикоагулянта, в том случае, если забор крови осуществляется непосредственно в них. В другом варианте исполнения изобретения, забор крови может осуществляться в стандартные вакутейнеры с антикоагулянтом, например с гепаринатом лития, после чего кровь может быть перененесена в другие пробирки с антигеном, митогеном и отрицательным контролем для проведения тестирования.

Полиэпитопный антиген может быть заменен на смесь отдельных рекомбинантных белков, содержащих последовательности, кодируемые генами esxА, esxB, espJ, espK и Rv2654, при этом суть изобретения не меняется.

В вакутейнеры или пробирки проводится забор и/или перенос, предпочтительно, по два миллилитра венозной крови пациента, затем вакутейнеры или пробирки инкубируются при 37°C в течение 16-24 часов, после чего центрифугированием отделяются форменные элементы крови, и в полученной плазме определяется содержание γ-интерферона во всех трех образцах.

Определение концентрации γ-интерферона проводится иммунохимически методом иммуноферментного анализа (ИФА) или иммунохемилюминисцентного анализа (ИХЛА).

В ходе проведения ИФА лунки 96-луночного иммунологического микропланшета, на поверхность которого сорбированы моноклональные антитела против γ-интерферона человека вносится по 5-100 мкл плазмы крови из каждого варианта пробирок, также в лунки вносится в дублях 4-6 калибровочных растворов с известной концентрацией γ-интерферона, покрывающих диапазон концентрации от 0 до 5 ME/мл. Во все используемые лунки вносится по 50-100 мкл буферного раствора биотинилированных моноклональных антител против γ-интерферона человека с концентрацией 50-200 нг/мл. Проводится инкубация на планшетном шейкере при 37°C и при частоте перемешивания 10-20 герц продолжительностью 60-120 минут. Проводится помывка промывочным буфером, содержащим неионный детергент, путем полного заполнения используемых лунок 3-5 раз с паузами между заполнением и аспирацией 10-30 секунд. Во все используемые лунки вносится по 100 мкл буферного раствора, содержащего конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена. Проводится инкубация на планшетном шейкере при 37°C при частоте перемешивания 10-20 герц продолжительностью 20-60 минут. Проводится помывка фосфатным буфером, содержащим не ионный детергент, путем полного заполнения используемых лунок 3-7 раз с паузами между заполнением и аспирацией 10-30 секунд. Во все используемые лунки вносится раствор содержащий смесь субстрата, которым является перекись водорода, и хромогена на основе тетраметилбензидина. Планшет инкубируется при комнатной температуре без встряхивания 20-30 минут в защищенном от света месте. Для остановки реакции во все используемые лунки вносится разбавленный раствор серной кислоты. Аналитический сигнал измеряется спектрофотометрически на стандартном планшетном оптическом ридере.

Анализ методом ИХЛА осуществляется с использованием специальных автоматических анализаторов (например, Diatron, Stratec, Германия). В одном из вариантов анализа методом ИХЛА 5-20 мкл суспензии суперпарамагнитных микросфер, конъюгированных с моноклональными антителами против γ-интерферона человека, диаметром от 0,5 до 2 микрон, с концентрацией 0,05-0,5 мг/мл, помещается в отдельную реакционную кювету и смешивается с образцом плазмы из трех типов пробирок, при этом каждый образец вносится в отдельную кювету в количестве 50-200 мкл. Таким же образом к суспензии микросфер добавляют от 4 до 6 калибровочных растворов с известной концентрацией γ-интерферона, покрывающих диапазон концентрации от 0 до 5 ME/мл. Образцы плазмы и калибровочные образцы далее инкубируются с суспензией микросфер при температуре от +37 до +42°С в течение 10-60 минут. Суспензия микросфер отмывается буферным промывочным раствором, содержащим неионный детергент, при этом микросферы седиментируются на дно или стенку кюветы наведением на нее постоянного магнитного поля. Цикл седиментации микросфер магнитным полем и ресуспендирование промывочным буфером повторяется 3-5 раз. После завершения цикла промывки, в кювету вносится раствор с моноклональными антителами против γ-интерферона человека, меченными хемилюминесцентными производными изолюминола или акридина. Кювета далее инкубируется при температуре от +37 до +42С в течение 10-30 минут, после чего микросферы отмывается буферным промывочным раствором, содержащим неионный детергент, в процессе отмывки микросферы седиментируются на дно или стенку кюветы наведением на нее постоянного магнитного поля. Цикл седиментации микросфер магнитным полем и ресуспендирование промывочным буфером повторяется 3-5 раз. На следующем этапе осуществляется инициация хемилюминесцентной реакции окисления акридина, путем последовательного добавления триггер-раствора №1, состоящего из 0,5% раствора перекиси водорода в 0,1Н азотной кислоте, и триггер-раствора №2, состоящего из раствора 5-15 мМ катионного детергента цетилтриметиламмония хлорида в 0,25М растворе гидрооксида натрия. Измерение электромагнитного излучения, образующегося в результате хемилюминесцентной реакции, в виде света в видимом диапазоне длин волн осуществляется при помощи фотоэлектронного умножителя или лавинных фотодиодов в составе измерительного оборудования анализатора, время измерения составляет от 3 до 6 секунд. Измерение аналитического сигнала выражается в относительных единицах количества излучения RLU.

В другом варианте метода ИХЛА, 5-20 мкл суспензии суперпарамагнитных микросфер, конъюгированных со стрептавидином или его аналогами, диаметром от 0,5 до 2 микрон, с концентрацией 0,05-0,5 мг/мл, помещается в отдельную реакционную кювету и смешивается с буферным раствором содержащим моноклональными антитела против γ-интерферона человека меченные биотином и хемилюминесцентным производным акридина или изолюминола, после чего к суспензии микросфер добавляется образец плазмы из трех типов пробирок, каждый образец плазмы вносится в отдельную кювету в количестве 50-200 мкл. Таким же образом к суспензии микросфер добавляют от 4 до 6 калибровочных растворов с известной концентрацией γ-интерферона, покрывающих диапазон концентрации от 0 до 5 ME/мл. Образцы плазмы и калибровочные образцы далее инкубируются с суспензией микросфер при температуре от +37 до +42°С в течение 10-60 минут. Суспензия микросфер отмывается буферным промывочным раствором, содержащим неионный детергент, при этом микросферы седиментируются на дно или стенку кюветы наведением на нее постоянного магнитного поля. Цикл седиментации микросфер магнитным полем и ресуспендирование промывочным буфером повторяется 3-5 раз. На следующем этапе осуществляется инициация реакции окисления хемилюминесцентной метки, сопровождающаяся излучением света. Измерение электромагнитного излучения, образующегося в результате хемилюминесцентной реакции, в виде света в видимом диапазоне длин волн осуществляется при помощи фотоэлектронного умножителя или лавинных фотодиодов в составе измерительного оборудования анализатора, время измерения составляет от 3 до 6 секунд. Измерение аналитического сигнала выражается в относительных единицах RLU.

Расчет концентрации производится с использованием кривой регрессии аналитического сигнала калибровочных растворов в ИФА или ИХЛА. Заключение о наличии туберкулезной инфекции может быть сделано при соблюдении следующих условий: концентрация γ-интерферона в плазме крови пробирки «Контроль» не превышает 8-10 IU/мл; разница между концентрацией γ-интерферона в плазме крови пробирки «Митоген» и пробирки "Контроль" не менее 0,5-1 IU/мл. Заключение о наличии туберкулезной инфекции делается в случае, если концентрация γ-интерферона в вакутейнере или пробирке с полиэпитопным антигеном - превышает концентрацию в отрицательном контроле на 20-35%, а разница этих концентраций больше, чем 0,2-0,4 IU/мл.

Техническим результатом использования изобретения является группа антигенов и тест-система для скрининговой диагностика туберкулезной инфекции, в том числе не имеющей ярких клинических проявлений. Специфичность диагностики не ниже 90-100%, в том числе среди BCG-вакцинированных лиц, а чувствительность - 70-90%, в обоих случаях с доверительная вероятность не ниже 90%.

Краткое описание поясняющих материалов

Фиг.1 Структура мозаичного антигена в виде выравнивания последовательностей соответствующих фрагментов белков.

Фиг.2 - Генетическая карта плазмидного вектора pET28a+MT5 (где МТ-5 - условное обозначение гена и кодируемого им белка предлагаемого в качестве примера химерного антигена)

Осуществление изобретения

Пример 1. Сборка последовательностей химерного гена и конструирование экспрессирующей плазмиды.

Источником последовательностей, используемых для сборки белковой конструкции и соответствующего гена является открытая база данных Genbank и содержащаяся в базе аннотированная последовательность генома M.tuberculosis H37Rv (genbank accession number NC_000962).

В состав белковой конструкции входят следующие элементы:

1) полноразмерные аминокислотные последовательности белков, кодируемых EsxA (последовательность SEQ ID NO 1),

2) и EsxB (последовательность SEQ ID NO 2)

3) участки аминокислотной последовательности белка, кодируемого геном EspJ содержащие предсказанные и подтвержденные Т-клеточные эпитопы GQPSQATQLLSTPVSQVTTQ и AEKPATEQAEPVHEVTNDDQGDQGDVQPAEVV AAARDEGAGASPGQQPGGGVPAQAMDTGAGARPAASPLAAPVDPSTPA (фрагмент последовательности SEQ ID NO 3)

4) Затем следуют эпитопы белка, кодируемого геном EspK LWFELMKPMTSTATGREAAHLRAFRAYAAHSQEI. (фрагмент последовательности SEQ ID NO 4).

5) Затем следуют участки белка, кодируемого геном TB7.7 (Antitoxin Rv2654c) ARALVRAVAESHGVAAVLFAATAAAAAAVDRGDPP (фрагмент последовательности SEQ ID NO 5).

Между последовательностями, относящимися к домену ESAT-6 и CFP-10, а также между CFP-10 и доменами, относящимися к белкам EspJ, EspK и TB7.7, вводится линкерная последовательность, SGASSGSGGS, которая служит молекулярным шарниром и обеспечивает структурную обособленность элементов. Кроме того, на С-конце полученной конструкции, дополнительно вносится полигистидиновая последовательность, содержащая 4-6 гистидиновых аминокислотных остатков. Конструкция может быть модифицирована путем изменения порядка элементов и/или исключения и/или добавления отдельных элементов последовательностей, приведенных в перечне SEQ ID NO 1-5 без изменения технического результата изобретения. Пример структуры полиэпитопной мозаичной конструкции антигена в виде выравнивания последовательностей приведена на Фиг 1. Полученную последовательность аминокислот подвергают обратной трансляции in silico. Вырожденность генетического кода используется для формирования массива расчетных взаимно перекрывающихся антипараллельных комплементарных олигонуклеотидов, способных к самосборке и достройке в двуцепочечную ДНК заданной последовательности в полимеразной цепной реакции при использовании олигонуклеотидов в качестве ДНК-матрицы. Процесс сборки полиэпитопной белковой конструкции in silico проводился в следующей последовательности: 1) EsxA; 2) EsxB; 3) EspJ/EspK/TB7.7. Линкерные последовательности включаются в состав соответствующих частей 1 и 2. Для работы используются коммерчески синтезированные олигонуклеотиды для сборки и амплификации фрагментов гена, кодирующего заявленный мозаичный полипептид (условное обозначение - МТ5)

Часть 1 (EsxA) амплифицируется с прямым праймером, содержащим сайт рестрикции Nde I, и обратным праймером, содержащим сайты рестрикции BamH I и Xho I. Часть 2 (EsxB) амплифицируются прямым праймером, содержащим сайт рестрикции Bgl II, и обратным праймером, содержащим сайты рестрикции BamH I и Xho I. Часть 3 (EspJ/EspK/TB7.7) амплифицируются с прямым праймером, содержащими сайт рестрикции Bgl II, и обратным праймером, содержащим сайты рестрикции Xho I. Условия проведения полимеразной цепной реакции стандартные, применяются коммерческие наборы реагентов, содержащие Taq-полимеразу и стандартный буфер для проведения реакции (Производства ООО "Сибэнзим", Россия). В качестве матрицы для проведения амплификации используют смесь заранее синтезированных соответствующих олигонуклеотидов в концентрации от 0,1 до 1 микромоль на литр каждого. Олигонуклеотиды для сборки гена приведены в таблице 1 в качестве примера. Последовательности олигонуклеотидов могут быть изменены и не характеризуют технический результат изобретения.

Для клонирования частей гена используют плазмидный вектор pET28a+. На первом этапе, плазмидная ДНК гидролизуется эндонуклеазами рестрикции Nde I и Xho I. Для клонирования первой части гена (EsxA), ПЦР-продукт гидролизуется эндонуклеазами рестрикции Nde I и Xho I и лигируется в плазмидный вектор по соответствующим липким концам сайтов рестрикции. Структура плазмиды подтверждается секвенированием, после чего вектор гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamH I и Xho I для следующего этапа работы. Для клонирования второй части гена (EsxB), соответствующий ПЦР-продукт гидролизуется эндонуклеазами рестрикции Bgl II и Xho I и лигируется в плазмидный вектор по соответствующим сайтам, при этом палиндромная последовательность сайтов BamH I и Bgl II взаимно уничтожается при лигировании комплементарных липких концов. Структура плазмиды подтверждается секвенированием, после чего вектор вновь гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamH I и Xho I для следующего этапа работы.

Для клонирования третьей части гена (EspJ/K), соответствующий ПЦР-продукт гидролизуется эндонуклеазами рестрикции Bgl II и Xho I и лигируется в плазмидный вектор по соответствующим сайтам, при этом палиндромная последовательность сайтов BamH I и Bgl II взаимно уничтожается при лигировании комплементарных липких концов. Структура плазмиды подтверждается секвенированием. Условия реакции рестрикции и лигирования стандартные, согласно инструкции к применению коммерчески доступных ферментов реакции (Производства ООО "Сибэнзим", Россия).

Полученный плазмидный вектор pET28(a+)-MT5 имеет генетическую карту, показанную на Фиг. 2. Вектор pET28(a+)-MT5 трансформируется в компетентные клетки E.coli, приготовленные стандартным способом. Для трансформации используется штамм BL21(DE3), содержащий копию гена ДНК-полимеразы фага Т7 в хромосомной ДНК. Отбор клонов после трансформации ведется рассеванием на твердую агаризованную среду, содержащую канамицин в концентрации 100 мкг/мл, по признаку антибиотикорезистентности к канамицину, ген резистентности к которому находится в составе плазмиды. Отобранные клоны пересевают, культивируют в жидкой среде LB до оптической плотности 0,6 ОЕ на длине волны 600 нм, после чего индуцируют экспрессию гена полиэпитопного мозаичного белка-аллергена добавлением в среду изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) до концентрации 1 mM, что обеспечивает разблокировку лактозного оператора и активирует транскрипцию полимеразы Т7 и целевого мозаичного гена. Наличие индукции определяют по наличию характерных полос в электрофорезе суммарного клеточного лизата клонов в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Клоны, показавшие индукцию и продукцию целевого белка с массой, совпадающей с расчетной, отбираются и пересеваются на агаризованную среду. Плазмидная ДНК клонов выделяется стандартными методами и подвергается секвенированию для проверки последовательности ДНК на предмет появления ошибок. Клоны, содержащие векторную плазмидную ДНК с целевым геном, обладающие индукцией и не содержащие ошибок в структуре целевого гена пересеваются и депонируются в криохранилище при -80°С.

Пример 2. Получение очищенного заявленного мозаичного полипептида (сокращенное название антигена МТ5).

Ампула с криоконсервированным продуцентом размораживается при комнатной температуре и переcеивается в стерильную жидкую LB среду, содержащую канамицин в концентрации 25 мкг/мл. Проводится культивирование в емкости, превышающей объем культуры в 5-10 раз, при температуре 37°C и шейкировании со скоростью 200-250 оборотов в минуту в течение 12-18 часов. Затем, культура пересевается в LB среду содержащую канамицин в концентрации 25 мкг/мл в соотношении культура/среда 1 к 10. Проводится культивирование в емкости, превышающей объем культуры в 5 -10 раз, при температуре 37°C и шейкировании со скоростью 200-250 оборотов в минуту, в течение 2-3 часов до момента достижения оптической плотности OD600 0,4-0,6 при оптическом пути 1 см. Индукция экспрессии белка проводится внесением IPTG в культуру до концентрации 1 мМ. После индукции культивирование проводится при прежних условиях еще 6-8 часов. Микробная масса осаждается центрифугированием на RCF 4000-6000g в течение 20 мин. Затем микробная масса ресуспендируется в 10-20 объемах буфера для лизиса, в состав которого входит: 0,5М NaCl; 0,1М Na-фосфатный буфер; 1%(^v/_v) Triton X-100; pH7,5. Полученная суспензия обрабатывается на ультразвуковом дезинтеграторе по 20 секунд 5 раз при непрерывном охлаждении на ледяной бане. После чего суспензия центрифугируется при 6000 g, лизирующий раствор заменяется на свежий и обработка ультразвуком повторяется. Повторяя указанную операцию 4-6 раз, получают очищенный агрегированный рекомбинантный белок в виде осадка (так называемые «тельца включения»). Полученный осадок растворяют в растворе «А», который имеет состав:1М NaCl; 0,1М Na-фосфатный буфер; 1%(^v/_v) Triton X-100; 8М мочевина; 0,015М имидазол. Нерастворимая фракция удаляется центрифугированием на RCF 11000-15000g 60 мин. Надосадочная жидкость фильтруется через полиэфирсульфонный фильтр с рейтингом фильтрации 0,22-0,45 мкм. Дальнейшее выделение мозаичного полипептида МТ5 проводится методом металл-хелатной хроматографии на Ni-NTI агарозном сорбенте. Фильтрат вносится на колонку, затем колонка промывается не менее 10 объемами раствора «А» в течение не менее 10 часов. После чего колонка промывается 5 объемами раствора «B», имеющим следующий состав: 0,3 М NaCl; 0,1М Na-фосфатный буфер; 8М мочевина pH6,8. Элюция связанного белка проводится раствором «B», pH которого выведен на значения 4.0-4.3 добавлением HCL. Сбор целевой фракции проводится по поглощению света с длиной волны 280 нм. В целевой фракции, измеряется концентрация белка методом Бредфорда. Подлинность и чистота препарата подтверждается ДСН-электрофорезом в полиакриламидном геле. Концентрация мозаичного полипептида МТ5 в конечном препарате должна находиться в диапазоне 30-40 мг/мл. В случае необходимости, следует сконцентрировать раствор методом тангенциальной ультрафильтрации. Готовый препарат проверяют на наличие контаминации бактериальными эндотоксинами, которая не должна превышать 1 МЕ на мг.

Пример 3. Подготовка тест-системы с использованием заявленного антигена.

1. Подготовка вакуумного контейнера для забора венозной крови «Контроль».

Готовится водный раствор гепарината лития с концентрацией 960000-2400000 ME/л.

Через сопло, обеспечивавшее тонкодисперсное распыление жидкости, на стенку контейнера из прозрачного пластика размером 13 на 75 мм впрыскивается 25±5 мкл водного раствора, содержащих 24-60 ME гепарината лития. Содержимое пробирки высушивается потоком очищенного воздуха, азота или инертного газа в течение 10-60 секунд при температуре от 20°C до 55°C или в вентилируемом сушильном шкафу при температуре от 20°C до 55°C в течение 1-24 часов. Пробирки укупориваются при пониженном давлении, которое, при заборе крови, обеспечит наполнение пробирки 2 (±10%) миллилитрами венозной крови. После укупорки пробирки подвергаются электронно-лучевой стерилизации электронами с энергией 5-10 МэВ.

2. Подготовка вакуумного контейнера для забора венозной крови «Митоген».

Непосредственно перед использованием готовится водный раствор митогена, имеющий состав: гепаринат лития 960000-2400000 ME/л; 0,1М натрий/калий-фосфатный буфер; 0,3М NaCl; 0,002М CaCl; 1%(^v/_m) фикол и 0,1-0,5 г/л L-фракция фитогемагглютинина Phaseolus vulgaris.

В контейнер из прозрачного пластика размером 13 на 75 мм вносят 0,5-1,5 мл разделительного геля. Затем через сопло, обеспечивавшее тонкодиссперсное распыление жидкости, на стенку контейнера впрыскивается 25 ± 5мкл водного раствора митогена фито гемагглютинина. Содержимое пробирки высушивается потоком очищенного воздуха, азота или инертного газа в течение 10-60 секунд при температуре от 20°C до 55°C или в вентилируемом сушильном шкафу при температуре от 20°C до 55°C в течение 1-24 часов. Пробирки укупориваются при пониженном давлении, которое, при заборе крови, обеспечит наполнение пробирки 2 (±10%) миллилитрами венозной крови. После укупорки пробирки подвергаются электронно-лучевой стерилизации электронами с энергией 5-10 МэВ.

3. Подготовка вакуумного контейнера для забора венозной крови «МТ», содержащий заявленный антиген.

Непосредственно перед использованием готовится водный раствор химерного антигена (условное обозначение МТ5), имеющий состав: гепаринат лития 960000-2400000 ME/л; 0,1М натрий/калий-фосфатный буфер; 0,3М NaCl; 0,01М CaCl; 1%(^v/_m) фиколл и 1-3 г/л антиген МТ5. Для приготовления раствора используется концентрат очищенного антигена МТ5.

В контейнер из прозрачного пластика размером 13 на 75 мм через сопло, обеспечивавшее тонкодисперсное распыление жидкости, впрыскивается 25 ± 5мкл водного раствора антигена. Содержимое пробирки высушивается потоком очищенного воздуха, азота или инертного газа в течение 10-60 секунд при температуре от 20°C до 55°C или в вентилируемом сушильном шкафу при температуре от 20°C до 55°C в течение 1-24 часов. Пробирки укупориваются при пониженном давлении, которое, при заборе крови, обеспечит наполнение пробирки 2 (±10%) миллилитрами венозной крови. После укупорки пробирки подвергаются электронно-лучевой стерилизации электронами с энергией 5-10 МэВ.

Пример 4. Проведение количественного ИФА-анализа содержания γ-интерферона в плазме крови.

Подготовка иммуносорбента.

Раствор, содержащий моноклональные антитела против γ-интерферона человека в концентрации 2-5 мкг/мл и 0,05М бикарбонатный буфер (pH9,0), вносят в стандартный 96-луночный планшет по 100 мкл на лунку. Планшет инкубируется при температуре 15-28°C в течение 16-24 часов. Затем раствор антител удаляется из планшета и вносится по 200 мкл блокирующего раствора, содержащего 0,1%(^v/_m) казеината натрия и 1%(^v/_m) сахарозы. Планшет инкубируется при температуре 15-28°C в течение 2-3 часов. После завершения блокировки, блокирующий раствор тщательно удаляется из планшета и планшет высушивается при комнатной температуре в течение 12-16 часов.

Подготовка рабочих растворов. Готовится раствор для разведения, в состав которого входит: 0,1М трис-гидроксиметил-аминометан, 0,3M NaCl; 0,5%(^v/_m) казеинат натрия; 0,1% Proclin300; 0,1%(^v/_v) Triton X-100. Готовится раствор для промывки планшета, в состав которого входит: 0,01 М фосфат натрия однозамещенный, 0,15 М NaCl, 0,05%(^v/_v) Твин 20, доводят pH раствора до 7,0-7,5. Готовится раствор конъюгата №1. В раствор для разведения конъюгатов вносятся биотинилированные моноклональные антитела против γ-интерферона человека до концентрации 100 нг/мл. Готовится раствор конъюгата №2. В раствор для разведения конъюгата вносится конъюгат стрептавидин-пероксидазы (производства ООО "Передовые Диагностические Платформы", Россия) в концентрации 20 мкг/мл. Готовятся четыре калибровочных раствора γ-интерферона человека: в буфер для разведения вносят лейкоцитарный γ-интерферон человека до концентраций соответствующих 0,5 ME; 1ME; 2ME; 4ME; 6ME. Готовится раствор субстрата, в состав которого входит: 0,05 М фосфат-цитратный буфер (pH5,0-6,0) и 0,02%(^v/_m) гидроперит. Готовится раствор 0,5%(^v/_m) хромогена 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в диметилсульфоксиде (ДМСО). Готовят рабочий раствор хромогена, для чего вносят 400 мкл раствора концентрата 0,5% хромогена в 12 мл раствора субстрата. Готовят стоп-раствор, для чего растворяют 50 мл концентрированной серной кислоты в одном литре деионизованной воды.

Проведение анализа

Экспозиция венозной крови с антигеном и митогеном

У пациента проводится забор венозной крови по 2 мл в три вакуумных контейнера тест-системы в следующем порядке: «Контроль»; «МТ»; «Митоген». После окончания забора и без промедления, кровь перемешивается осторожным переворачиванием не менее 10 раз, затем, инкубируется в вертикальном положении 16-24 часа при 37°C. Подготовка образцов и проведение ИФА-анализа. После окончании экспозиции вакуумные контейнеры с кровью центрифугируют на RCF 2000-3000 g 10-15 минут, затем при помощи автоматического микродозатора переносят плазму в три микропробирки. Все три образца плазмы крови пациента, калибровочные растворы γ-интерферона и буфер для разведения, не содержащий γ-интерферон, вносят в дублях по 50-100 мкл в лунки планшета, затем во все используемые лунки вносят по 50-100 мкл раствора конъюгата №1. Планшет инкубируют в планшетном шейкере 60-120 минут при скорости шейкировании 700 оборотов в минуту и температуре 37°C. После окончания инкубации удаляют содержимое лунок планшета, промывают лунки планшета от не связавшихся с твердой фазой реагентов промывочным раствором не менее 5 раз, полностью наполняя и опорожняя лунки планшета. Затем, без промедления, во все используемые лунки вносят конъюгат №2 по 100 мкл. Планшет инкубируют в планшетном шейкере 30 минут при скорости шейкировании 700 оборотов в минуту и температуре 37°C. После окончания инкубации удаляют содержимое лунок планшета, промывают лунки планшета от не связавшихся с твердой фазой реагентов промывочным раствором не менее 5 раз, полностью наполняя и опорожняя лунки планшета.

В лунки вносят по 100 микролитров раствора хромогена с субстратом и выдерживают 23 (±3) минуты в защищенном от света месте при комнатной температуре. Затем, в лунки вносят стоп-раствор. Далее переходят к обработке и интерпретация результатов. Планшет сканируют на стандартном планшетном ридере, укомплектованном оптическими фильтрами 450нм и 610нм. Аналитическим сигналом является разность между поглощением света с длиной волны 450 нм и 610 нм. Используя аналитические сигналы лунок, соответствующих калибровочным растворам, строится логарифмическая регрессия сигнала по концентрации, при этом лунки, соответствующие раствору для разведения, принимаются за нулевую точку. Полученную кривую используют для определения концентрации γ-интерферона во всех трех образцах плазмы пациента. Заключения о наличии туберкулезной инфекции делается на основании критериев указанных в Табл.2.

Пример 5. Проведение количественного ИФА-анализа содержания γ-интерферона в плазме крови.

Подготовка иммуносорбента

Раствор, содержащий рекомбинантный стрептавидин и 0,05М бикарбонатный буфер (pH9,0), вносят в стандартный 96-луночный планшет по 100 мкл на лунку. Планшет инкубируется при температуре 15-28°C в течение 16-24 часов. Готовится раствор для промывки планшета, в состав которого входит: 0,01 М фосфат натрия однозамещенный, 0,15 М NaCl, 0,05%(v/v) Твин 20, доводят pH раствора до 7,0-7,5. Лунки планшета промываются однократным заполнением и аспирацией раствора для промывки планшета. Затем, в лунки планшета вносится по 100 мкл второго сорбционного раствора, содержащего 0,1%(v/m) казеинат натрия, 1%(v/m) сахарозы и моноклональные антитела против γ-интерферона человека в концентрации 50 нг/мл. Планшет инкубируется при температуре 15-28°C в течение 16-24 часов. После завершения блокировки, второй сорбционный раствор тщательно удаляется из планшета. Планшет промывается промывочным раствором однократным заполнением лунок и аспирацией. Далее, в планшет вносится по 150 мкл блокирующего раствора содержащего 0,1%(v/m) казеинат натрия, 1%(v/m) сахарозы и 0,1 поливинилпирролидона молекулярной массы 60-70 кДа, планшет инкубируется не менее 4 секунд, после чего содержимое лунок аспирируется и планшет высушивается при комнатной температуре в течение 12-16 часов или в сушильном шкафу при температуре +30°С не менее 30 минут.

Подготовка рабочих растворов. Готовится раствор для разведения реагентов, в состав которого входит: 0,1М трис-гидроксиметил-аминометан, 0,3M NaCl; 0,5%(v/m) казеинат натрия; 0,1% Proclin300; 0,1%(v/v) Triton X-100. Готовится раствор конъюгата. В раствор для разведения конъюгата вносятся моноклональные антитела против γ-интерферона конъюгированные с пероксидазой хрена (производства ООО "Передовые Диагностические Платформы", Россия) в концентрации 20 мкг/мл. Готовятся четыре калибровочных раствора γ-интерферона человека: в буфер для разведения вносят лейкоцитарный γ-интерферон человека до концентраций соответствующих 0,5 ME; 1ME; 2ME; 4ME; 6ME. Готовится раствор субстрата, в состав которого входит: 0,05 М фосфат-цитратный буфер (pH5,0-6,0) и 0,02%(v/m) гидроперит. Готовится раствор 0,5%(v/m) хромогена 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в диметилсульфоксиде (ДМСО). Готовят рабочий раствор хромогена, для чего вносят 400 мкл раствора концентрата 0,5% хромогена в 12 мл раствора субстрата. Готовят стоп реагент, для чего растворяют 50 мл концентрированной серной кислоты в одном литре деионизованной воды.

Проведение анализа

Экспозиция венозной крови с антигеном и митогеном. У пациента проводится забор венозной крови по 2 мл в три вакуумных контейнера тест-системы в следующем порядке: «Контроль»; «МТ»; «Митоген». После окончания забора и без промедления, кровь перемешивается осторожным переворачиванием не менее 10 раз, затем, инкубируется в вертикальном положении 16-24 часа при 37°C. Подготовка образцов и проведение ИФА-анализа. После окончании экспозиции вакуумные контейнеры с кровью центрифугируют на RCF 2000-3000 g 10-15 минут, затем, при помощи автоматического микродозатора переносят плазму в три микропробирки. Во все используемые лунки планшета вносят по 50 мкл раствора конъюгата. Затем, все три образца плазмы крови пациента, калибровочные растворы γ-интерферона и буфер для разведения, не содержащий γ-интерферон, вносят в дублях по 100 мкл в лунки планшета. Планшет инкубируют в планшетном шейкере 120 минут при скорости шейкировании 700 оборотов в минуту и температуре 37°C. После окончания инкубации удаляют содержимое лунок планшета, промывают лунки планшета от не связавшихся с твердой фазой реагентов промывочным раствором не менее 5 раз, полностью наполняя и опорожняя лунки планшета. В лунки вносят по 100 микролитров раствора хромогена с субстратом и выдерживают 30 (±3) минуты в защищенном от света месте при комнатной температуре. Затем, в лунки вносят по 50 мкл стоп-раствора. Далее переходят к обработке и интерпретация результатов. Планшет сканируют на стандартном планшетном ридере, укомплектованном оптическими фильтрами 450нм и 610нм. Аналитическим сигналом является разность между поглощением света с диной волны 450 нм и 610нм. Используя аналитические сигналы лунок, соответствующих калибровочным растворам, строится логарифмическая регрессия сигнала по концентрации, при этом лунки, соответствующие раствору для разведения, принимаются за нулевую точку. Полученную кривую используют для определения концентрации γ-интерферона во всех трех образцах плазмы пациента. Заключения о наличии туберкулезной инфекции делается на основании критериев указанных в Табл.2.

Пример 6. Проведение количественного иммунохемилюминесцентного ИХЛА-анализа содержания γ-интерферона в плазме крови.

Подготовка рабочих растворов. Готовится раствор для разведения реагентов, в состав которого входит: 50М HEPES, 0,3M NaCl; 0,5%(v/m) казеинат натрия; 0,1% азид натрия; 0,1%(v/v) Triton X-100. Готовится раствор для промывки, в состав которого входит: 0,05 М трис-гидроксиметил-аминометан, 0,150M NaCl; 0,1% азид натрия; 0,1%(v/v) тергитол доводят pH раствора до 7,0-7,5. Готовится раствор реагента №1. В раствор для разведения реагентов вносятся биотинилированные моноклональные антитела против γ-интерферона человека до концентрации 500 нг/мл и моноклональные антитела против γ-интерферона человека конъюгированные с акридином в концентрации 100 нг/мл. (производство ООО "Передовые Диагностические Платформы", Россия). Готовится раствор суперпарамагнитных микросфер диаметром 1 микрон, конъюгированных с рекомбинантным стрептавидином. Суспензия микросфер встряхивается на вортексе, после чего растворяется в буфере для разведения реагентов в концентрации 0,25 мг/мл (производство ООО "Передовые Диагностические Платформы", Россия). Готовятся четыре калибровочных раствора γ-интерферона человека: в буфер для разведения вносят лейкоцитарный γ-интерферон человека до концентраций соответствующих 0,5 ME; 1ME; 2ME; 4ME; 6ME. Готовится раствор субстрата, в состав которого входит: 0,05 М фосфат-цитратный буфер (pH5,0-6,0) и 0,02%(v/m) гидроперит. Готовится раствор триггера №1 состоящего из 0,5% раствора перекиси водорода в 0,1Н азотной кислоте, и рабочий раствор триггера №2, состоящего из раствора 10 мМ катионного детергента цетилтриметиламмония хлорида в 0,25М растворе гидрооксида натрия.

Проведение анализа

Экспозиция венозной крови с антигеном и митогеном. У пациента проводится забор венозной крови по 2 мл в три вакуумных контейнера тест-системы в следующем порядке: «Контроль»; «МТ»; «Митоген». После окончания забора и без промедления, кровь перемешивается осторожным переворачиванием не менее 10 раз, затем, инкубируется в вертикальном положении 16-24 часа при 37°C. Подготовка образцов и проведение ИХЛА-анализа. После окончании экспозиции вакуумные контейнеры с кровью центрифугируют на RCF 2000-3000 g 10-15 минут, затем, при помощи автоматического микродозатора переносят плазму в три микропробирки. Готовятся пустые реакционные пластиковые кюветы для ИХЛА анализа объемом 2 мл. Раствор суперпарамагнитных микросфер вносится во все реакционные кюветы в количестве 20 мкл, затем вносится раствор реагента №1, содержащий смесь моноклональных антител, вносится во все используемые кюветы в количестве 50 мкл. На следующем этапе вносятся образцы плазмы крови пациента из каждой пробирки, калибровочные растворы γ-интерферона вносят в дублях по 200 мкл во все соответствующие реакционные кюветы. Кюветы инкубируют 60 минут при температуре 37°C, после чего микросферы отмываются буферным промывочным раствором. В процессе отмывки микросферы седиментируются на стенку кюветы наведением на нее постоянного магнитного поля. Цикл седиментации микросфер магнитным полем и ресуспендирование подачей 800 мкл промывочного буфера повторяется 5 раз для каждой кюветы. На последнем этапе отмывки промывочный буфер последовательно аспирируется из кюветы и осуществляется инициация хемилюминесцентной реакции окисления акридина, путем последовательного добавления 250 мкл триггер-раствора №1, и 50 мкл триггер-раствора №2 в каждую реакционную кювету последовательно. Измерение электромагнитного излучения, образующегося в результате хемилюминесцентной реакции, в виде света в видимом диапазоне длин волн, осуществляется при помощи фотоэлектронного умножителя в составе измерительного оборудования анализатора, время измерения после добавления тригера №2 составляет 3 секунды. Измерение аналитического сигнала выражается в относительных единицах количества излучения RLU.

Используя аналитические сигналы от каждой кюветы с образцами соответствующих калибровочных растворов, строится логарифмическая регрессия сигнала по концентрации. Полученную кривую используют для определения концентрации γ-интерферона во всех трех образцах плазмы пациента. Заключения о наличии туберкулезной инфекции делается на основании критериев указанных в Табл.2.

Перечень последовательностей

SEQ ID NO 1 ген EsxA, кодирует белок ESAT-6,

mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfa

SEQ ID NO 2 ген EsxB, кодирует белок CFP-10,

MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF

SEQ ID NO 3 ген EspJ, кодирует одноименный белок

MAEPLAVDPTGLSAAAAKLAGLVFPQPPAPIAVSGTDSVVAAINETMPSIESLVSDGLPGVKAALTRTASNMNAAADVYAKTDQSLGTSLSQYAFGSSGEGLAGVASVGGQPSQATQLLSTPVSQVTTQLGETAAELAPRVVATVPQLVQLAPHAVQMSQNASPIAQTISQTAQQAAQSAQGGSGPMPAQLASAEKPATEQAEPVHEVTNDDQGDQGDVQPAEVVAAARDEGAGASPGQQPGGGVPAQAMDTGAGARPAASPLAAPVDPSTPAPSTTTTL

SEQ ID NO 4 EspK ген кодирует одноименный белок

MSITRPTGSYARQMLDPGGWVEADEDTFYDRAQEYSQVLQRVTDVLDTCRQQKGHVFEGGLWSGGAANAANGALGANINQLMTLQDYLATVITWHRHIAGLIEQAKSDIGNNVDGAQREIDILENDPSLDADERHTAINSLVTATHGANVSLVAETAERVLESKNWKPPKNALEDLLQQKSPPPPDVPTLVVPSPGTPGTPGTPITPGTPITPGTPITPIPGAPVTPITPTPGTPVTPVTPGKPVTPVTPVKPGTPGEPTPITPVTPPVAPATPATPATPVTPAPAPHPQPAPAPAPSPGPQPVTPATPGPSGPATPGTPGGEPAPHVKPAALAEQPGVPGQHAGGGTQSGPAHADESAASVTPAAASGVPGARAAAAAPSGTAVGAGARSSVGTAAASGAGSHAATGRAPVATSDKAAAPSTRAASARTAPPARPPSTDHIDKPDRSESADDGTPVSMIPVSAARAARDAATAAASARQRGRGDALRLARRIAAALNASDNNAGDYGFFWITAVTTDGSIVVANSYGLAYIPDGMELPNKVYLASADHAIPVDEIARCATYPVLAVQAWAAFHDMTLRAVIGTAEQLASSDPGVAKIVLEPDDIPESGKMTGRSRLEVVDPSAAAQLADTTDQRLLDLLPPAPVDVNPPGDERHMLWFELMKPMTSTATGREAAHLRAFRAYAAHSQEIALHQAHTATDAAVQRVAVADWLYWQYVTGLLDRALAAAC

SEQ ID NO 5 tb7.7 ген кодирует одноименный белок

MSGHALAARTLLAAADELVGGPPVEASAAALAGDAAGAWRTAAVELARALVRAVAESHGVAAVLFAATAAAAAAVDRGDPP

Таблица 1
Домен (ген)	Олигонуклеотиды для сборки и амплификации фрагментов гена МТ5
EsxA (ESAT-6)	D1 5'- CTGTTGGATGAAGGCAAACAGAGCCTGACCAAACTTGCAGCAGCCTGGGGTGGCAGTGGCTCAGAAGCGT D2 5'- CATTGAAGCTGCAGCGTCTGCGATTCAAGGCAACGTGACCAGCATTCACAGCCTGTTGGATGAAGGCAAAC D3 5'- GCGTGAAGACGACAGAACCATATGACAGAACAACAGTGGAACTTTGCAGGCATTGAAGCTGCAGCGTC R1 5'- GCATTGTTCAGTTCGGTCGCAGTCGCATCCCACTTCTGCTGAACACCCTGATACGCTTCTGAGCCACTGC R2 5'- CTCGCCATCGCTTGACCTGCTTCACTGATGGTGCGTGCAAGGTTCTGCAGTGCATTGTTCAGTTCGGTCG R3 5'- GCAGCGAACTCAGTACAACAGCTAGCGAACATGCCAGTCACATTACCCTCGGTGCTCGCCATCGCTTGACCT NDE 5'- GAACCATATGACAGAACAAC BamHI/XhoI 5'- AACACTCGAGTGGTTCGGATCCACTAGAGGCTCCGCTAGCGAACATGCCAGT
EsxB (CFP-10)	D1 5'- GAAGCATGGCAGAGATGAAGACCGATGCAGCGACCCTTGCTCAAGAAGCAGGCAACTTTGAACGCATCAG D2 5'- CAACTTTGAACGCATCAGTGGTGATCTGAAGACCCAGATTGATCAGGTGGAGAGCACTGCAGGCAGCTTG D3 5'- AGCACTGCAGGCAGCTTGCAGGGTCAGTGGCGTGGTGCGGCGGGCACTGCAGCTCAAGCTGCTGTGGTTC R1 5'- GTGCTGATTTCGTCCAGTTCCTGTTTCTGTTTGTTCGCTGCTTCCTGAAAGCGAACCACAGCAGCTTGAG R2 5'- CTTGCTGTTGTTCCTCATCCGCACGACTGTACTGAACACCCGCTTGACGAATGTTGGTGCTGATTTCGTCCAGT R3 5'- GCAGCGAACTCAGTACAACAGAAGCCCATCTGGCTGGACAACGCTTGCTGTTGTTCCTCATC Bgl 5'- AGACAGATCTGGTGGAAGCATGGCAGAGATGA BamHI/XhoI 5'- AACACTCGAGTGGTTCGGATCCACTAGAGGCTCCGCTGAAGCCCATCTGGCTGGA
EspJ/EspK	F-Bgl 5’- AGACAGATCTGGTGGTTCTGGCCAGCCGAGTCAAGCCACCCAGCTGCTGAGCACTCC 2F 5’- AGGCGGAGAAACCGGCGACCGAACAGGCGGAACCGGTGCATGAAGTGACCAACGATG 3F 5’- TGCAGCCGGCGGAAGTGGTTGCAGCTGCGCGTGATGAAGGTGCGGGCGCGTCTCCA 4F 5’- CGTTCCGGCGCAGGCGATGGACACTGGCGCAGGTGCACGTCCAGCAGCGTCACCGT 5F 5’- AGCACCCCAGCGAGCGGAGCCTCTAGTGGTTCAGGTGGAAGCCTGTGGTTTGAACT 6F 5’- CCGCGACTGGTCGTGAAGCAGCGCATCTTCGTGCGTTTCGTGCGTATGCTGCGCACA 1R 5’- CGCCGGTTTCTCCGCCTGGGTGGTCACCTGGCTCACCGGAGTGCTCAGCAGCTGG 2R 5’- CCACTTCCGCCGGCTGCACATCGCCCTGATCGCCCTGATCATCGTTGGTCACTTCATG 3F 5’- CCATCGCCTGCGCCGGAACGCCACCGCCTGGCTGCTGGCCTGGAGACGCGCCCGCACCTT 4R 5’- TCCGCTCGCTGGGGTGCTCGGATCAACCGGCGCAGCTAACGGTGACGCTGCTGGACGTG 5R 5’- CTTCACGACCAGTCGCGGTGCTGGTCATCGGTTTCATCAGTTCAAACCACAGGCTTC 6R ACTAACGCACGTGCACTGCCACCTGAGCCACTGGACGCACCACTAATCTCCTGACTGTGCGCAGCATACGCA 7F AGTGCACGTGCGTTAGTTCGTGCGGTTGCGGAAAGCCATGGCGTTGCTGCAGTGCTGTT 8R GGTGGATCACCACGATCCACGGCTGCAGCTGCTGCAGCAGTCGCTGCAAACAGCACTGCAGCAAC 9R Xho CAACCTCGAGGGTGGATCACCACGATCCA

Таблица 2
Содержание γ-интерферона в плазме из контейнера «Контроль», ME	Содержание γ-интерферона в плазме из контейнера «Митоген» минус «Контроль», ME	Содержание γ-интерферона в плазме из контейнера «МТ»минус «Контроль», ME	Заключение
≥4	< 0.2	≥ 0.5	Результат отрицательный
	≥ 0.2 and < 25% от концентрации в «Контроль»	≥ 0.5	Результат отрицательный
	≥ 0.2 and ≥ 25% от концентрации в «Контроль»	Любое значение	Результат положительный
	< 0.2	< 0.5	Результат не ясен
	≥ 0.2 and < 25% от концентрации в «Контроль»	< 0.5	Результат не ясен
≤4	Любое значение	Любое значение	Результат не ясен

Claims

1. Тест-система для диагностики инфекции М.tuberculosis complex, включающая белок, содержащий комбинацию аминокислотных последовательностей, кодируемых генами EsxA, EsxB, EspK, EspJ, tb7.7 (Rv2654c).

2. Тест-система по п.1, где EsxA имеет SEQ ID NO 1, EsxB имеет SEQ ID NO 2, EspK имеет SEQ ID NO 3, EspJ имеет SEQ ID NO 4, tb7.7 имеет SEQ ID NO 5.

3. Тест-система по п.1, где в эпитопы и/или блоки последовательностей антигена, где EsxA имеет SEQ ID NO 1, EsxB имеет SEQ ID NO 2, EspK имеет SEQ ID NO 3, EspJ имеет SEQ ID NO 4, tb7.7 имеет SEQ ID NO 5, введены замены и/или модификации аминокислотной последовательности, не приводящие к потере способности антигена вызывать специфическую реакцию индукции синтеза интерферона гамма у антиген-специфических Т-лимфоцитов у сенсибилизированных М.tuberculosis complex пациентов.

4. Способ диагностики инфекции М.tuberculosis complex с помощью тест-системы по п.1, включающий введение образца цельной крови в контакт с антигеном с последующей инкубацией и количественным иммунохимическим измерением изменения концентрации интерферона гамма в результате специфической реакции циркулирующих антиген-специфических эффекторных Т-лимфоцитов на препарат туберкулезного антигена у сенсибилизированных М.tuberculosis complex пациентов, а заключение о наличии туберкулезной инфекции делается в случае, если концентрация гамма-интерферона в вакутейнере или пробирке с полиэпитопным антигеном - превышает концентрацию в отрицательном контроле на 20-35%, а разница этих концентраций больше чем 0,2-0,4 IU/мл.