WO2022051824A1 - Formulação farmacêutica, processo de produção de uma formulação farmacêutica, medicamento, método de tratamento, e, uso de uma formulação farmacêutica - Google Patents

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WO2022051824A1
WO2022051824A1 PCT/BR2021/050233 BR2021050233W WO2022051824A1 WO 2022051824 A1 WO2022051824 A1 WO 2022051824A1 BR 2021050233 W BR2021050233 W BR 2021050233W WO 2022051824 A1 WO2022051824 A1 WO 2022051824A1
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WO
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pharmaceutical formulation
dmag
leishmaniasis
treatment
agents
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PCT/BR2021/050233
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English (en)
French (fr)
Inventor
Patrícia Sampaio Tavares VERAS
Helvécio Vinícius Antunes ROCHA
Beatriz Ferreira de Carvalho PATRICIO
Fabio Rocha FORMIGA
Kercia Pinheiro CRUZ
Diana Angélica dos Santos DANTAS
Marina Faillace de AMORIM
Juliana Perrone Bezerra de Menezes FULLAM
Cláudia Ida BRODSKYN
Antonio Luis de Oliveira Almeida PETERSEN
Luana Carneiro Palma GONÇALVES
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Fundação Oswaldo Cruz
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutical formulations comprising the compound 17-Dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG). More specifically, the present invention relates to topical or systemic pharmaceutical formulations comprising 17-DMAG and the use thereof as an antiparasitic agent, preferably for the treatment of leishmaniasis. The present invention further provides a process for producing said formulation, medicine, method of treating leishmaniasis and use of the formulation.
  • Leishmaniasis forms a complex of diseases transmitted by vectors called sandflies of the genus Lutzomyia in the New World and by the genus Phlebotomus in the Old World (MITROPOULOS, 2010).
  • VL visceral leishmaniasis
  • CML mucocutaneous
  • LC cutaneous
  • the recommended first choice treatment for most forms of leishmaniasis is the systemic use of pentavalent antimonials (Sb+5) such as N-methylglucamine antimoniate or meglumine antimoniate (Glucantime®) and sodium stibogluconate (Pentostam). ®).
  • pentavalent antimonials such as N-methylglucamine antimoniate or meglumine antimoniate (Glucantime®) and sodium stibogluconate (Pentostam).
  • these compounds can be administered intravenously or intramuscularly, and are also used intralesionally for CL.
  • Sodium stibogluconate and N-methylglucantime exhibit similar pharmacodynamics and pharmacokinetics. Pharmacokinetics indicate that more than 80% of the administered dose is excreted unchanged within 6 hours in urine. Different dosage regimens have been proposed and tested over the years in an attempt to discover the minimum effective therapeutic dose with the least toxic side effects (WHO, 1995; MITROPOULOS, 2010).
  • Amphotericin preparations have typically been used in the treatment of VL and mucosal leishmaniasis (LM). In some regions of world (for example, United States of America and Europe) is the drug of first choice (MITROPOULOS, 2010, GOTO, 2010).
  • AmB is available in four drug formulations: amphotericin deoxycholate (d-AmB), liposomal amphotericin (L-AmB; Ambisome®), lipid complex amphotericin B (ABLC; Abelcet®); amphotericin B colloidal dispersion (ABCD; Amphotec® or Amphocil®) (GOTO, 2010).
  • d-AmB amphotericin deoxycholate
  • L-AmB liposomal amphotericin
  • ABLC lipid complex amphotericin B
  • ABCD amphotericin B colloidal dispersion
  • Amphotec® or Amphocil® GOTO, 2010
  • d-AmB In addition to the high toxicity, d-AmB must be administered by slow intravenous infusion that lasts for hours, which suggests the need for medical care during the application of the treatment in a hospital environment (MCGWIRE, 2014).
  • Amphotericin B lipid formulations were developed as a strategy to prolong the half-life of the drug and reduce toxicity.
  • L-AmB has been showing good results for (VL) but the high cost of this drug is still a limiting factor for access to treatment.
  • the use of this drug for (CL) in humans still lacks more conclusive clinical trials (COPELAND, 2015).
  • Pentamidine a synthetic derivative of amidine, is mainly used as an option to pentavalent antimonials in individuals intolerant or resistant to antimony treatment. This drug also has activity against protozoa (certain strains of Trypanosoma and Babesia) and fungi (Candida albicans). The precise mode of your action antiprotozoal is still not fully understood (MITROPOULOS, 2010; MCGWIRE, 2014).
  • Pentamidine therapy has the advantage of having a short duration. Despite this, frequent adverse reactions with moderate morbidity have been associated with its use, including an unusually high rate (50%) of hyperglycemia, likely as a result of pancreatic damage and hypotension, tachycardia, and cardiologic changes. Patients using this medication require careful observation (MITROPOULOS, 2010; MCGWIRE, 2014).
  • Miltefosine was the first oral drug approved for the treatment of leishmaniasis.
  • the drug has shown very promising results in VL in the Indian population (95% cure rates) and in CL in Pakistan (cure rates comparable to pentavalent antimony) and is undergoing clinical trials for use in several other countries.
  • the main adverse effects reported associated with treatment are non-specific nausea and vomiting.
  • the drug is teratogenic and contraindicated in pregnancy. (MITROPOULOS, 2010).
  • HSP90 heat shock protein 90
  • HSP90 acts as a molecular chaperone helping the correct folding of nascent proteins, thus preventing the formation of proteins with incorrect tertiary structure and formation of protein aggregates. HSP90 assists the structural maturation of newly synthesized proteins under conditions of cellular homeostasis and stabilizes proteins when cells are under stress conditions, such as those caused by temperature increases, pH changes and nutritional deprivation (PRATT, 2003).
  • HSP90 client proteins are involved in different oncogenic pathways. Thus, HSP90 came to be recognized as a potential molecular target against different types of cancer.
  • G was one of the first natural compounds identified as being able to inhibit the activity of HSP90.
  • O GA is a natural antibiotic derived from the fungus Streptomyces hygroscopicus, which has antiproliferative activity against cancer cells and belongs to the benzoquinone ansamycin family. GA has low solubility, limited in vivo stability and is hepatotoxic, making it a compound with low chances of becoming marketable (SCHULTE, 1998; ISAACS, 2003).
  • 17-Dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, alvespimycin), another derivative of geldanamycin, has improved formulation and pharmacokinetics over 17-AAG.
  • 17-DMAG can cause hepatotoxicity, with a lower maximum tolerated dose than that tolerated by 17-AAG (HOLLINGSHEAD, 2005).
  • HSP90 inhibitor molecules still encompasses some questions and challenges, such as, for example, difficulty in defining the maximum tolerated dose of drugs and better anticancer results with approaches that explore other targets such as HSP40, HSP70 or CDC37 for certain types of cancer. tumors (DEN, 2012).
  • HSP90 In protozoan parasites, HSP90 is involved in processes related to the development of specific stages and the pathogenesis of the disease (SHONHAI, 2011).
  • the parasite undergoes stress due to sudden changes in temperature, pH, reactive oxygen species and the attack of hydrolytic enzymes when it infects host cells.
  • the increased expression of chaperones by the parasite in response to stress is related to adaptation to new environmental conditions, which activates the process of cell differentiation.
  • Evidence indicates that chaperones directly influence the virulence of the parasite and its survival within macrophages of the vertebrate host (SHONHAI, 2011).
  • HSP90 is an abundant protein in Leishmania, representing about 2.8% of the total cytoplasmic proteins of this parasite. Some Leishmania spp. HSP90 client proteins. have a role in the cell cycle of the parasite (SHONHAI, 2011).
  • braziliensis parasites in the initial site of infection and in the lymph node of these animals shows that there is a difficulty for 17-AAG to reach peripheral tissues, such as the dermis and epidermis.
  • the use of dermal dressings or ointments containing the drug may be a strategy to increase the efficiency of the treatment of CL.
  • the drug could reach higher concentrations at the site of infection, however, there is a difficulty in the technique in identifying the tolerated dose.
  • the present invention is built with the use of the compound 17-DMAG that proved to be effective against Leishmania amazonensis and Leishmania braziliensis in LC models in vitro and in vivo.
  • 17-DMAG the compound 17-DMAG molecule with other inputs and under specific technical parameters in a pharmaceutical formulation active against leishmaniasis.
  • the invention described herein aims to provide a pharmaceutical formulation comprising 17-DMAG that: (1) enables the administration of the drug that is released more adequately and, therefore, resulting in a more effective formulation than the free compound; (2) defines the in vivo active concentration range of 17-DMAG in the formulation; (3) shows a significant reduction in lesion size compared to in vitro and in vivo assays in cutaneous leishmaniasis models on the species L. amazonensis and L. braziliensis.
  • the invention is therefore to obtain alternatives for the treatment of parasitic diseases.
  • the present investigation is based on formulations comprising 17-DMAG and its leishmanicidal activity superior to the state of the art with reduction of side and adverse effects.
  • the invention provides a pharmaceutical formulation which comprises, as an active ingredient, an amount therapeutically effective compound of 17-DM AG and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • a medicament which comprises said pharmaceutical formulation.
  • the invention provides a method of treating leishmaniasis using the formulation described above.
  • the invention provides the use of the formulation described above for the manufacture of a medicament for treating leishmaniasis.
  • Figure 1 refers to the chemical structure of the 17-DMAG molecule.
  • Figure 2 refers to the in vitro cell viability assay with axenic promastigotes of L. amazonensis and differentiated THP-1 cells treated with 17-DMAG in a 12-step serial dilution assay (initial concentration: 2 ⁇ M and 50 ⁇ M, respectively).
  • Figure 3 refers to the cytotoxicity assay in human lung fibroblasts, MRC-5 cells, treated with 17-DMAG (initial concentration: 50 ⁇ M) in a 12-step serial dilution assay, performed in triplicate.
  • the graph represents values of cell viability percentages.
  • Figure 4 refers to the intracellular viability assay in THP-1 cells infected by L. amazonensis and treated with 17-DMAG at different concentrations. The graph represents the number of viable cells.
  • Figure 5 refers to the effect of different treatment regimens with 17-DMAG on the lesion size of BALB/c mice infected by L. braziliensis.
  • the graphs express the difference in the thickness of the lesion in the infected ear (left ear - LE) in relation to the contralateral ear (right ear - OD) of treated and untreated animals.
  • A all groups of animals, treated and untreated;
  • B area under the curve (AUC) of lesion thickness shown in “A”.
  • ANOVA (*** p ⁇ 0.0001; * p ⁇ 0.05).
  • Figure 6 refers to images of the effect of different treatment regimens with 17-DMAG on the lesion size of BALB/c mice infected with L. braziliensis.
  • a - D lesions in the control group, applied intraperitoneally with a 5% glucose solution;
  • E - H lesions in the group treated with 20 mg/kg daily;
  • I - L lesions in the group treated with 30 mg/kg every other day;
  • M - P lesions in the group treated with 50 mg/kg every five days.
  • Figure 7 refers to the kinetics of 17-DMAG treatment (20 mg/kg concentration, daily dose for two, four or seven weeks) on the lesion size of BALB/c mice infected with L. braziliensis.
  • A lesion development in treated or control groups, monitored weekly
  • B Area under the curve (AUC) of lesion development shown in “A”. Student's t test, ***p ⁇ 0.0001.
  • Figure 8 refers to the parasite load of the ear and lymph node of mice infected with L. braziliensis treated with 17-DMAG intraperitoneally (concentration of 20 mg/kg, daily dose for two, four or seven weeks).
  • A lymph nodes after two weeks
  • B ear after two weeks
  • C lymph node after four weeks
  • D ear after four weeks
  • E lymph node after seven weeks
  • F ear after seven weeks.
  • Student's t test (*** p ⁇ 0.0001; ** p ⁇ 0.01; * p ⁇ 0.05).
  • Figure 9 refers to images of lesions in the ear and lymph nodes of BALB/c mice infected with L. braziliensis and treated with 17 -DM AG injected intraperitoneally (concentration of 20 mg/kg, daily dose for two, four or seven weeks).
  • (A - D) ear and lymph node of the animals in the control group which received a 5% glucose solution daily for two weeks intraperitoneally; (E - H) ear and lymph node of infected animals treated with 20 mg/kg daily for two weeks; (I - L) ear and lymph node of the animals in the control group, which received a 5% glucose solution daily for four weeks intraperitoneally; (M - P) ear and lymph node of infected animals treated with 20 mg/kg daily for four weeks.
  • Figure 10 refers to the toxicity image of topical application of free 17-DMAG, incorporated into a hydrogel in BALB/c mice. Healthy BALB/c mice were daily exposed to 17-DMAG incorporated in hydrogel, at concentrations of 0.15 mg/g; 0.20 mg/g; 0.25mg/g or 0.30mg/g for four weeks. As a control, animals were exposed to the white hydrogel without 17-DMAG. The results are expressed as the difference in the thickness of the exposed ear compared to the contralateral ear. (* p ⁇ 0.05, Kruskal-Wallis test).
  • Figure 11 refers to the electron microscopy image of the polymeric nanoparticles of 17-DMAG (A and B), of the polymeric nanoparticles contrasted with osmium (A' and B'), with the measurements of the nanoparticles.
  • the present invention in its most general aspect, provides a pharmaceutical formulation that comprises, as an active ingredient, a therapeutically effective amount of the 17-DMGA compound and at least one pharmaceutically acceptable excipient, such that this formulation improves the effectiveness of the drug. treatment of leishmaniasis, while reducing its toxicity.
  • active is used herein to refer to a material that induces a desired effect and includes derivatives and analogues of the specifically mentioned material that also induces the desired effect.
  • the term "therapeutically effective amount” means an amount sufficient to induce the desired effect, but low enough to avoid serious side effects.
  • the therapeutically effective dose can be estimated initially, either in cell culture assays or in animal models, usually mice, rabbits, dogs or pigs. The animal model can also be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Information of this type can then be used to determine useful doses and routes of administration in humans.
  • the drug 17-DM AG is comprised in said formulation in the range of 0.50 mg/g to 0.05 mg/g in relation to the total weight of the formulation.
  • the administration of said pharmaceutical formulations can be carried out by the routes of administration: oral, sublingual, nasal, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intra-articular, subcutaneous, cutaneous, transdermal, but not limited to these.
  • compositions of the present invention are selected depending on the final presentation of the formulation of the present invention, which can be in the form of capsules, tablets or suspension for oral administration, suspension for nasal administration, injectable suspension for intramuscular, intravenous, cutaneous or subcutaneous, semi-solid formulations for topical administration.
  • compositions do not show toxicity to the recipient organism at the dosages and concentrations employed and include buffers such as phosphates, citrates and other organic acids; antioxidants such as ascorbic acid and methionine; preservatives such as hexamethonium chloride, benzalkonium, benzethonium chloride, phenol, butyl alcohol, benzyl alcohol, alkyl parabens such as methyl and propyl paraben, catechol, resorcinol and m-cresol; polymeric excipients such as polyvinylpyrrolidones and polyethylene glycols; sweeteners and flavoring agents; stabilizing agents such as EDTA or EGTA; non-ionic surfactants such as polysorbates 20 and 80; diluents such as lactose, starch, mannitol or microcrystalline cellulose; lubricants such as stearic acid, stearates (magnesium, zinc), sodium steary
  • the term "pharmaceutically acceptable” means that the excipient is suitable for use in contact with tissues without toxicity, incompatibility, instability, irritation or undue allergic reaction, or the like.
  • Non-limiting examples of excipients suitable for the invention include surfactants such as tweens, spans and myrjs; gelling agents such as carboxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl celluloses, nonionic emulsifiers such as monoglycerides, fatty acid esters, monooleates, polysorbates; immobilizing agents such as cyclodextrins: alpha, beta, beta hydroxypropyl, alginates and gelatins; film-forming or film-forming agents such as polyvinyl alcohol and cetostearyl alcohol; epithelializing agents such as allantoin and cepalin; dispersing agents such as sorbitol, polyethylene glycols, stearates; and preserving and stabilizing agents, such as parabens and imidasolidinylureria, used alone or in combination with each other.
  • surfactants such as tweens, spans and myrjs
  • gelling agents such as carboxymethyl,
  • the excipient is selected from the group consisting of diluents, carriers, wetting agents, dispersants, disintegrants, flow promoters, coating agents, stabilizers, gelling agents, emulsifiers, sweeteners, flavors and preservatives.
  • the excipients are in the range of 50% to 95% in relation to the total weight of the formulations.
  • the excipients are in the range of 60% to 90%. More preferably, the excipients are in the range of 65% to 80%.
  • formulations described herein may optionally comprise additives in order to increase ease of administration, storage capacity, resistance to degradation, bioavailability, half-life, provide isotonic preparations, etc.
  • additives useful for the preparation of pharmaceutical formulations are well known in the art.
  • said formulations may comprise modified drug delivery systems.
  • Modified delivery systems are selected from the group comprising liposomes, osmotic pumps, enteric coatings, polymeric matrix systems, transdermal systems, implants, micro and nanoemulsions and others well known in the art.
  • compositions of the present invention can be oral, topical or systemic.
  • said formulations are topical formulations.
  • formulations for topical use are understood as any compositions for application directly to the skin, more specifically, to skin lesions and their surroundings.
  • formulations of the invention can be used to manufacture a wide variety of types of products that include, but are not limited to, ointments, creams, pastes, gels, hydrogels, lotions, solutions, suspensions, sprays, plasters, among others.
  • said formulations are in the form of a cream or hydrogel.
  • the cream formulation obtained from the agitation of the oil phase in the aqueous phase under high speed to obtain a homogeneous cream with smaller particles (droplets) and with better texture and stability.
  • the aqueous phase contains nipagin glycerin and distilled water.
  • the oil phase contains wax, petroleum jelly, cetyl alcohol or nizapol.
  • the cream formulation containing 17-DMAG in a concentration range of 0.05mg-0.30mg/g, diluted in water is a concentration range of 0.05mg-0.30mg/g, diluted in water.
  • the hydrogel formulation is obtained by solubilizing 17-DMAG in distilled water and adding carboxymethylcellulose (CMC) solution.
  • the pharmaceutical formulation is for the treatment of leishmaniasis.
  • the pharmaceutical formulation is for the treatment of Visceral Leishmaniasis and/or Cutaneous Leishmaniasis.
  • the leishmaniasis is American Cutaneous Leishmaniasis.
  • the American Cutaneous Leishmaniasis is caused by the species L. amazonensis and L. braziliensis, responsible for the disease in the diffuse cutaneous form.
  • a medicament which comprises the combination described above.
  • drug refers to a pharmaceutical product, technically obtained or elaborated, with prophylactic, curative, palliative or diagnostic purposes.
  • the invention provides a method of treating leishmaniasis using the formulation described above.
  • the precise effective amount for a human subject will depend on the severity of the disease state, the general health of the subject, the age, weight, and sex of the subject, the diet, the time and frequency of administration, the combination /drug combinations, reaction sensitivities, and tolerance/response to therapy. Thus, doses to be delivered depend on a number of factors that cannot be measured before clinical studies are done. The person skilled in the art, however, knows how to arrive at adequate doses for different treatments.
  • the invention provides for the use of combination described above for the manufacture of a medicament for treating leishmaniasis, preferably for the treatment of Visceral Leishmaniasis and/or Cutaneous Leishmaniasis, more preferably for the treatment of American Cutaneous Leishmaniasis.
  • optical density was read at wavelengths of 570 and 600 nm in a spectrophotometer (SPECTRA Max 340 PC) to determine cell viability, expressed in percentage terms, used to calculate the IC50 value. This value was determined by applying sigmoidal regression to the concentration-response curves using the GraphPad Prism (version 5.0) of at least three independent experiments performed in triplicates.
  • Human THP-1 cells were centrifuged at 300xg for 10 min at 4°C and resuspended (10 5 cells/100 ⁇ L) in complete RPMI medium containing phorbol-12-myristate-13-acetate (PM A) at 100 nM and distributed in 96-well plates. Cultures were incubated at 37°C for 72 h to induce macrophage differentiation. The wells were then washed twice with saline, the complete RPMI medium (without PMA) was replenished and the cells were re-incubated at 37°C for an additional 48 h. The cultures were then treated with 17-DMAG in 12-step serial dilutions (1:2) using an initial concentration of 50 ⁇ M.
  • PM A phorbol-12-myristate-13-acetate
  • IC50 and CC50 values (Leishmania and THP-1 cell, respectively) were calculated, observed in Figure 2.
  • the results in Figure 2 demonstrate that 17-DMAG has greater toxicity against L. amazonensis compared to the host cell.
  • EXAMPLE 2 In vitro cytotoxicity assay of MRC-5 cells to 17-DMAG
  • the cytotoxicity assay was performed with human lung fibroblasts (MRC-5 cells) treated with 17-DMAG.
  • MRC-5 cells were centrifuged at 300xg for 10 min at 4°C and resuspended in complete RPMI medium and plated at a concentration of 2.5 x 10 4 per well, then incubated at 37°C for 24 h. .
  • the cells were treated with 17-DMAG (initial concentration: 50 ⁇ M) following the same protocol used for THP-1 cells.
  • Alamar Blue® was added and the plates were read in a spectrophotometer. The CC50 value was determined in the same way as for the THP-1 cells.
  • THP-1 cells 5x10 5 per well
  • PM A 100 nM
  • the cells were washed with saline and the medium (without PMA) was replenished.
  • the cells were washed again and infected by L. amazonensis promastigotes in stationary phase (10:1) for 6 h at 35° C.
  • the cells were washed twice with saline, the RPMI medium was replenished and concentrations of 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 300 nM and 400 nM (five replicates for each concentration) of 17-DMAG were added and the cells were incubated for a period of 72 h. Then the cells were washed with saline and complete Schneider medium was added. After four days, viable parasites were counted in a Neubauer chamber and the IC50 value was calculated for 17-DMAG.
  • Figure 4 demonstrates that, as in promastigotes, 17-DMAG also showed toxicity against the amastigote forms in a dose-dependent manner. It is observed that at concentrations above 100 nM of 17-DMAG, viable parasites were no longer observed. Interestingly, the IC 50 value obtained against the intracellular form of amastigote was 13.4 nM, showing that 17-DMAG is about 7 times more effective against the amastigote than against the flagellated promastigote form of L. amazonensis. , whose IC 50 was 90 nM.
  • EXAMPLE 4 In vivo assay with mice infected by L. braziliensis with 17-DMAG intraperitoneally at doses of 20, 30 or 50 mg/kg.
  • mice were infected in the dermis of the left ear with 10 5 L. braziliensis parasites in a total volume of 10 pL of sterile saline and treated with intraperitoneal injections of 17-DMAG at doses of 20 mg/kg daily, 30 mg/kg every other day and 50 mg/kg every five days.
  • mice were divided into four groups: (i) untreated control animals, which received 5% glucose application daily; (ii) animals treated with 20mg/kg of 17-DMAG intraperitoneal daily; (iii) animals treated with 30mg/kg of 17-DMAG intraperitoneally every other day; (iv) animals treated with 50mg/kg of 17-DMAG intraperitoneally every five days. [00102] Before each treatment application, the animals were weighed to determine the drug volume. The thickness of the infected and contralateral ears was measured weekly, comparatively.
  • Figure 5B shows the result of the area under the curve (AUC) of the lesion size of the different experimental groups. Despite the difference between the AUC of the treated animal in relation to that of the untreated animal, being higher at the dose of 20 mg/kg of 17-DMAG applied daily, at all concentrations tested the differences between the AUCs in relation to that of the untreated animals was statistically significant.
  • EXAMPLE 5 In vivo assay with mice infected by L. braziliensis with 17-DMAG intraperitoneally for 2, 4 or 7 weeks.
  • mice treated daily with a dose of 20 mg/kg of 17-DMAG did not show symptoms of toxicity and still showed an effective response that promoted a decrease in the thickness of the lesion as well as the appearance of the infected ear, it was decided to to carry out a kinetics study following the lesion and the parasite load at different times after treatment and for longer periods: two, four and seven weeks of treatment.
  • BALB/c mice were infected in the dermis of the left ear with 10 5 L. braziliensis parasites in a total volume of 10 pL of sterile saline and, after two weeks, treated with intraperitoneal injections of 17-DMAG at a concentration of 20 mg/kg daily for two, four or seven weeks.
  • mice were divided into six groups: (i) untreated control animals that received 5% glucose application daily for two weeks; (ii) animals treated for two weeks with application of 20 mg/kg of 17-DMAG daily; (iii) control animals untreated for four weeks that received 5% glucose application daily; (iv) animals treated for four weeks with applications of 20 mg/kg of 17-DMAG daily; (v) control animals untreated for seven weeks that received 5% glucose applications daily; (vi) animals treated for seven weeks with applications of 20 mg/kg of 17-DMAG daily.
  • mice were weighed to determine the drug volume. Ear lesion thickness was measured weekly. After two, four or seven weeks of treatment, the animals were euthanized and the infected ear and draining lymph node were removed to quantify the parasite load by limiting dilution.
  • Figure 7 shows the variation in lesion size of mice infected with L. braziliensis and treated with 17-DMAG for two, four or seven weeks of treatment.
  • Mice treated for two weeks showed little lesion development during the first week and decreased thickness in the second week, when compared to the control.
  • the mice treated for four weeks showed a significant decrease in the size of the lesion in relation to the previous weeks, unlike the control group, which showed an increase in the lesion (Figure 7B).
  • the lesion showed a significant decrease in relation to the control, reaching zero between the infected and uninfected ear between the fifth and sixth weeks of treatment.
  • Figure 8 demonstrates evaluation of the parasite load by limiting dilution. After two weeks of treatment, there was a marked reduction, both in the ear and in the lymph node of the treated mice in relation to the control ( Figure 8 A - B). With four weeks of treatment, the reduction in the parasite load is even more expressive in the treated group compared to the control. Five animals in the group treated for four weeks did not show ear load and six did not show lymph node load, while all mice in the control group showed load ( Figure 8C - D).
  • Figure 9 shows images acquired from the ear and draining lymph node of mice that show the difference between the treated and control groups. In animals followed for two weeks, the control showed a well-developed lesion and an enlarged lymph node (Figure 9A - D), while the animals that received treatment for two weeks showed no lesion or a small lesion and the lymph node was reduced 1 , 6 times compared to the control ( Figure 9E - H).
  • EXAMPLE 6 In vivo toxicity assay in uninfected mice treated with 17-DMAG topically in hydrogel formulations.
  • the different therapeutic regimens were applied daily to uninfected animals at doses of 0.15, 0.20, 0.25, 0.30 mg/g of hydrogel.
  • 30 mice were divided into five groups, a control group of mice treated with hydrogel without the drug or white hydrogel (i); and another four groups were treated with hydrogel containing 17-DMAG at concentrations of 0.15 mg/g (ii); 0.20 mg/g (iii); 0.25 mg/g (iv); 0.30 mg/g (v) to evaluate the toxicity of 17-DMAG in hydrogel in vivo, exposing the formulation on the skin of the ear of mice for 4 weeks.
  • the 30 mice were treated daily and ear thickness was measured weekly.
  • EXAMPLE 7 Production of polymeric nanoparticles containing 17-DMAG.
  • 17-DMAG polymeric nanoparticles 2-5 mg of the drug are dissolved in 1.5 to 5 ml of an aqueous solution containing 0-5% PEG 300. Then this sample is poured into 2 to 8 ml of dichloromethane containing 100 to 400 mg of PLGA and processed per ultrasonication at 20-40% amplitude in 30 second cycles. This emulsion is poured into 10 mL of an aqueous solution containing 0.5-2% PVA and taken to the ultrasonicator again.
  • the final emulsion formed is poured into 30 ml of an aqueous solution containing 0.5-2% PVA and left for up to 10 min under magnetic stirring.
  • an aqueous solution containing 0.5-2% PVA containing 0.5-2% PVA and left for up to 10 min under magnetic stirring.
  • the following proportions were used: 3mg of 17-DMAG; 2.5% PEG in a volume of 1.5 mL; 100 mg of PLGA in 2 ml of dichloromethane; 1% PVA; 40% sonication amplitude in 30 second cycles.
  • the solvent is evaporated in a rotary evaporator at 40 °C and 200 mBar for 1 hour and the solution is ultracentrifuged at 166,713.1 m/s 2 (17,000 xg) three times and resuspended in type II water. After the last ultracentrifugation, the sample is resuspended in 5 mL of water and the samples are frozen at -80 °C and lyophilized for 24 h at -30 °C.
  • the nanoparticles achieved an encapsulation efficiency of 40% of 17-DMAG. This measurement was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). The size of the nanoparticles, obtained by dynamic light scattering, showed an average value equal to 282 nm and a polydispersion index of 0.1. The Zeta potential was acquired by electrophoretic potential, having a value equal to -33 mV. Figure 11 shows the image obtained by transmission electron microscopy (TEM) where it is observed that the nanoparticles are spherical and with sizes ranging from 70 to 400 nm. Cell viability was evaluated and the IC50 obtained was 14.9 nM.
  • TEM transmission electron microscopy
  • PALMA L.C. et al. A docking-based structural analysis of geldanamycin-derived inhibitor binding to human or Leishmania. no. June 2018, p. 1-9, 2019.

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Abstract

A presente invenção refere-se, de forma geral, a formulações farmacêuticas que compreendem, como ingrediente ativo, o composto 17- Dimetilaminoetilamino- 17 -demetoxigeldanamicina (17-DMAG) e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. A invenção ainda provê processo de produção da referida formulação, medicamento, método de tratamento de leishmaniose e uso da formulação. As formulações da invenção constituem uma inovadora alternativa terapêutica no controle da leishmaniose.

Description

FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, MEDICAMENTO, MÉTODO DE TRATAMENTO, E, USO DE UMA FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a formulações farmacêuticas compreendendo o composto 17-Dimetilaminoetilamino-17- demetoxigeldanamicina (17-DMAG). Mais especificamente, a presente invenção refere-se a formulações farmacêuticas tópicas ou sistêmicas compreendendo 17-DMAG e uso das mesmas como agente antiparasitário, preferencialmente, para tratamento da leishmaniose. A presente invenção ainda provê processo de produção da referida formulação, medicamento, método de tratamento de leishmaniose e uso da formulação.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] As leishmanioses formam um complexo de doenças transmitidas por vetores chamados flebotomínios do gênero Lutzomyia no novo mundo e pelo gênero Phlebotomus no velho mundo (MITROPOULOS, 2010).
[003] Este complexo de doenças afeta 12 milhões de pessoas no planeta (AKHOUNDI, 2017). Segundo a WHO (2019), em 2017, 94% dos novos casos de leishmaniose reportados a Organização Mundial de Saúde (World Health Organization - WHO) ocorreram em sete países: Brasil, Etiópia, índia, Quênia, Sudão do Sul e Sudão.
[004] As leishmanioses se manifestam em duas formas clínicas principais: leishmaniose visceral (LV), que pode ser fatal se deixada sem tratamento, e leishmaniose tegumentar, cujas formas mucocutânea (LMC) e cutânea (LC) causam lesões que geralmente se curam espontaneamente, mas podem deixar cicatrizes ou deformidades, o que leva essa doença infecciosa a ser classificada como uma das seis mais importantes do planeta dada a sua gravidade e prevalência (GOTO, 2010, AKHOUNDI, 2017).
[005] O tratamento de primeira escolha para leishmaniose visceral são os antimoniais pentavalentes. Em casos mais graves, ou em pacientes que não respondem adequadamente ao tratamento com os antimoniais, a Anfotericina B é a segunda escolha. Em último caso, o fármaco de escolha é a Pentamidina (MCGWIRE, 2014).
[006] O US Food and Drug Administration (FDA) aprovou em 2014 a miltefosina (Impávido, Paladin Therapeutics), um análogo de alquilfosfocolina oral, para tratamento de LV, LC e LMC. É o primeiro medicamento oral a ser aprovado para tratamento de LV (SUNYOTO, 2018).
[007] Os tratamentos atuais para as leishmanioses apresentam diversas limitações, como alta toxicidade, baixa eficácia, alto custo, desenvolvimento de resistência do parasita e baixa aderência do paciente, podendo levar à falha terapêutica. Assim, o mais recente interesse na classe de drogas antiparasitárias está focado no aumento da eficácia, diminuição dos efeitos colaterais e nos baixos custos (MONGE-MAILLO, 2013; COPELAND, 2015).
Antimoniais Pentavalentes
[008] O tratamento de primeira escolha recomendado para a maioria das formas de leishmanioses é o uso sistêmico dos antimoniais pentavalentes (Sb+5) como o antimoniato de N-metilglucamina ou antimoniato de meglumina (Glucantime®) e o estibogluconato de sódio (Pentostam®). Para uso sistêmico, esses compostos podem ser administrados por via intravenosa ou intramuscularmente, e também são usados intralesionalmente para LC (MCGWIRE, 2014; MONGE-MAILLO, 2013).
[009] O estibogluconato de sódio e N-metilglucantime apresentam farmacodinâmica e farmacocinética semelhantes. A farmacocinética indica que mais do que 80% da dose administrada é excretada dentro de 6 horas na urina na forma inalterada. Diferentes regimes posológicos foram propostos e testados ao longo dos anos, na tentativa de descobrir a dose terapêutica eficaz mínima com o mínimo efeitos colaterais tóxicos (WHO, 1995; MITROPOULOS, 2010).
[0010] A Organização Mundial de Saúde preconiza que as doses de antimoniais não devem ultrapassar 20 mg/kg/dia, não se ultrapassando o limite de 850 mg de antimônio, devido à sua elevada toxicidade. (WHO, 1995)
[0011] Apesar de muito utilizados, os antimoniais pentavalentes causam severos efeitos colaterais e a quimioterapia com esses fármacos é necessária por uma duração prolongada. Os efeitos colaterais, tais como arritmias cardíacas, nefrotoxidade, pancreotoxidade e hepatotoxicidade já foram descritos em diversos estudos (MCGWIRE, 2014; MONGE-MAILLO, 2013; HALDAR, 2011, GOTO, 2010).
[0012] Outro desafio para clínica é a necessidade do aumento progressivo da dose diária de antimônio e a duração da terapia para combater a falta de resposta e resistência dos organismos à terapia. Na índia, 65% dos pacientes não tratados anteriormente com antimoniais não respondem prontamente ou apresentam recaída após terapia. No Brasil, as taxas de cura após a terapia com Sb+5 estão se tomando cada vez mais baixas e variam de 50% a 90%. (HALDAR, 2011, MACHADO, 2010)
[0013] O desenvolvimento da resistência do parasita a um fármaco usado por décadas e a adesão irregular dos pacientes ao tratamento, devido à dose diária por via parenteral durante 20 dias, podem ser os principais fatores na determinação da taxa de insucesso crescente dos antimoniais. Outros fármacos alternativos, como pentamidina e anfotericina B, também são de uso parenteral (MITROPOULOS, 2010).
Anfotericina B (AmB)
[0014] As preparações de anfotericina têm sido tipicamente usadas no tratamento de LV e leishmaniose mucosa (LM). Em algumas regiões do mundo (por exemplo, Estados Unidos da América e Europa) é o fármaco de primeira escolha (MITROPOULOS, 2010, GOTO, 2010).
[0015] A AmB está disponível em quatro formulações de medicamentos: anfotericina desoxicolato (d-AmB), anfotericina lipossomal (L-AmB; Ambisome®), anfotericina B de complexo lipídico (ABLC; Abelcet®); anfotericina B de dispersão coloidal (ABCD; Amphotec® ou Amphocil®) (GOTO, 2010).
[0016] Em geral, essas formulações compartilham eficácia semelhante, porém apresentam diferenças em relação aos efeitos colaterais. Os efeitos colaterais comuns da anfotericina B são insuficiência renal e anormalidades eletrolíticas, observados de maneira mais intensa associados a d-AmB ..(MCGWIRE, 2014; MITROPOULOS, 2010; COPELAND, 2015).
[0017] Além da alta toxicidade, a d-AmB deve ser administrada por infusão intravenosa lenta que dura horas, o que sugere a necessidade de cuidados médicos durante a aplicação do tratamento em ambiente hospitalar (MCGWIRE, 2014).
[0018] As formulações lipídicas da Anfotericina B foram desenvolvidas como estratégia para prolongar a meia-vida do fármaco e reduzir a toxicidade. A L-AmB vem apresentando bons resultados para (LV) mas o alto custo desse medicamento ainda é um limitante para o acesso ao tratamento. Além disso, o uso deste medicamento para (LC) em seres humanos ainda carece de ensaios clínicos mais conclusivos (COPELAND, 2015).
Pentamidina
[0019] A pentamidina, um derivado sintético da amidina, é utilizada principalmente como opção aos antimoniais pentavalentes em indivíduos intolerantes ou resistentes ao tratamento antimonial. Esse fármaco também apresenta atividade contra protozoários (certas cepas de Trypanosoma e Babesia) e fungos (Candida albicans). O modo preciso de sua ação antiprotozoária ainda não é totalmente compreendida (MITROPOULOS, 2010; MCGWIRE, 2014).
[0020] A terapia com a pentamidina tem a vantagem de possuir um curto período de duração. Apesar disso, reações adversas frequentes com morbidade moderada têm sido associadas ao seu uso, incluindo uma taxa incomumente alta (50%) de hiperglicemia, provavelmente como resultado de dano pancreático e hipotensão, taquicardia e alterações cardiológicas. Pacientes em uso deste medicamento requerem observação cuidadosa (MITROPOULOS, 2010; MCGWIRE, 2014).
Miltefosina
[0021] A miltefosina foi o primeiro medicamento oral aprovado para o tratamento de leishmaniose. O fármaco demonstrou resultados muito promissores em LV na população indiana (taxas de cura de 95%) e em LC no Paquistão (taxas de cura comparáveis às do antimônio pentavalente) e está passando por testes clínicos para uso em vários outros países. Os principais efeitos adversos relatados associados ao tratamento são náusea inespecífica e vômito. O medicamento é teratogênico e contraindicado na gravidez. (MITROPOULOS, 2010).
[0022] No entanto, um estudo feito do uso da miltefosina na terapia de LC na Colômbia e na Guatemala revelaram resultados terapêuticos que variavam de acordo com as espécies causadoras. Nas regiões da Colômbia onde L. panamensis é comum, os pesquisadores relataram taxas de cura de 91% para o grupo tratado com miltefosina oral versus 38% no grupo placebo. A taxa de cura da miltefosina foi comparável ao tratamento com antimônio pentavalente padrão. Por outro lado, nas regiões da Guatemala onde L. braziliensis e L. mexicana são predominantes, a taxa de cura para o grupo tratado com miltefosina foi de 53% versus 21% no grupo placebo (MITROPOULOS, 2010).
[0023] Um outro estudo avaliou a eficácia e segurança da miltefosina versus o antimônio pentavalente no tratamento de LC, causada por L. braziliensis e L. guyanensis. O resultado demonstrou taxa de cura acima de 75% com miltefosina e 60% com Sb+5. Porém, a dose utilizada de 150 mg/kg/dia durante 28 dias apresentou custo elevado e efeitos colaterais como náuseas e vômitos em metade dos pacientes (MACHADO, 2010).
Inibidores da Proteína de choque térmico 90 (HSP90)
[0024] Os fármacos atualmente utilizados no tratamento da leishmaniose foram descobertos há décadas e/ou apresentam graves efeitos adversos e limitações de acesso ao medicamento devido ao alto custo. Vários centros de pesquisa ao redor do mundo vêm dando suporte de ciência básica no entendimento da biologia dos parasitos compondo um importante conhecimento que facilita a escolha de alvos terapêuticos. Dentre os alvos moleculares com potencial de serem explorados farmacologicamente, a proteína de choque térmico 90 (HSP90) pode ser uma alternativa para novas drogas antiparasitárias mais eficazes, com menos efeitos colaterais e de baixo custo.
[0025] HSP90 atua como uma chaperona molecular ajudando o dobramento correto de proteínas nascentes, evitando, desta forma, a formação de proteínas com estrutura terciária incorreta e formação de agregados proteicos. A HSP90 auxilia a maturação estrutural de proteínas recém- sintetizadas em condições de homeostasia celular e estabiliza proteínas quando as células estão em condições de estresse, como as causadas por aumento de temperatura, mudanças de pH e privação nutricional (PRATT, 2003).
[0026] Muitas proteínas cliente da HSP90 estão envolvidas em diferentes vias oncogênicas. Assim, a HSP90 passou a ser reconhecida como potencial alvo molecular contra diferentes tipos de câncer.
[0027] A geldanamicina (GA) foi um dos primeiros compostos naturais identificados como sendo capazes de inibir a atividade da HSP90. O GA é um antibiótico natural derivado do fungo Streptomyces hygroscopicus, que apresenta atividade antiproliferativa contra células cancerígenas e pertence à família das ansamicinas benzoquinonas. GA tem baixa solubilidade, estabilidade in vivo limitada e é hepatotóxico, tornando-o um composto com baixas chances de se tomar comerciável (SCHULTE, 1998; ISAACS, 2003).
[0028] Compostos semis sintéticos foram produzidos a partir da GA. O primeiro inibidor da HSP90 a entrar em ensaios clínicos para câncer foi um derivado da GA, o 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-AAG, tanespimicina). O 17-AAG apresentou um maior número de resultados positivos contra câncer de mama e mieloma múltiplo em comparação ao GA, porém também problemas de solubilidade, baixas propriedades farmacêuticas e o perfil tóxico relacionado principalmente à porção benzoquinona (NECKERS, 2012; HOLLINGSHEAD, 2005).
[0029] O 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina (17- DMAG, alvespimicina), outro derivado da geldanamicina, apresenta formulação e farmacocinética melhorados em relação ao 17-AAG. No entanto, estudos pré-clínicos indicaram que, em tratamento de cânceres, o 17- DMAG pode causar hepatotoxicidade, tendo apresentado uma máxima dose tolerada menor do que a tolerada pelo 17-AAG (HOLLINGSHEAD, 2005).
[0030] A pesquisa por moléculas inibidoras de HSP90 ainda engloba algumas questões e desafios como, por exemplo, dificuldade na definição da dose máxima tolerada das drogas e melhores resultados antineoplásicos com abordagens que exploram outros alvos como HSP40, HSP70 ou CDC37 para certos tipos de tumores (DEN, 2012).
HSP90 de parasitos protozoários
[0031] Em parasitos protozoários, a HSP90 está envolvida em processos relacionados ao desenvolvimento de estágios específicos e à patogênese da doença (SHONHAI, 2011). [0032] O parasita sofre um estresse devido a mudanças súbitas de temperatura, pH, espécies reativas de oxigênio e o ataque de enzimas hidrolíticas quando infecta células hospedeiras. O aumento da expressão de chaperonas pelo parasito em resposta ao estresse está relacionado à adaptação às novas condições ambientais, o que ativa o processo de diferenciação celular. Evidências indicam que as chaperonas influenciam diretamente na virulência do parasito e a sua sobrevivência no interior de macrófagos do hospedeiro vertebrado (SHONHAI, 2011).
[0033] HSP90 é uma proteína abundante em Leishmania, representando cerca de 2,8% do total das proteínas citoplasmáticas desse parasito. Algumas proteínas cliente da HSP90 de Leishmania spp. têm um papel no ciclo celular do parasito (SHONHAI, 2011).
[0034] O estudo de SANTOS (2014) avaliou a capacidade do inibidor de HSP90, 17-AAG, em reduzir a infecção in vitro e in vivo de Leishmania braziliensis. O tratamento com 17-AAG de camundongos infectados resultou em uma redução do tamanho da lesão cutânea e da carga parasitária no local da infecção (de 107 nos animais controle para 106 nos animais tratados), no entanto, não foi capaz de reduzir a carga parasitaria no linfonodo drenante dos animais tratados, evidenciando que os resultados observados não foram tão robustos quanto os descritos para outros parasites protozoários. É possível que a persistência dos parasites de L. braziliensis no local inicial da infecção e no linfonodo desses animais mostram que há uma dificuldade do 17-AAG em atingir os tecidos periféricos, a exemplo da derme e epiderme. O uso de curativos dérmicos ou pomadas contendo a droga pode ser uma estratégia para aumentar a eficiência do tratamento de LC. Assim, o fármaco poderia atingir concentrações maiores no local da infecção, no entanto, há uma dificuldade na técnica em identificar a dose tolerada.
[0035] O estudo de Palma e colaboradores (2019) demonstra a diferente afinidade de inibidores de Hsp90 - geldaminicina e seus análogos 17-AAG e 17-DMAG - em espécie de parasita de leishmaniose. A partir de um estudo in silico foi possível identificar que os inibidores possuem maior tendência de se ligar ao domínio do terminal N da proteína Hsp83 de Leishmania amazonensis em comparação com a proteína humana Hsp90. É divulgado que as diferenças intermoleculares existentes permitem o uso em terapias anti-Leishmania (PALMA, 2019).
[0036] A presente invenção se constrói com a utilização do composto 17-DMAG que se mostrou eficaz contra Leishmania amazonensis e Leishmania braziliensis em modelos de LC in vitro e in vivo. Além das contribuições da técnica, combinando a molécula 17-DMAG a outros insumos e sob parâmetros técnicos específicos em uma formulação farmacêutica ativa contra leishmaniose.
[0037] Em suma, a invenção ora descrita visa proporcionar uma formulação farmacêutica compreendendo 17-DMAG que: (1) viabiliza a administração do fármaco que é liberado de forma mais adequada e, portanto, resultando numa formulação mais eficaz que o composto livre; (2) define a faixa de concentração ativa in vivo de 17-DMAG na formulação; (3) apresenta redução significativa do tamanho da lesão em comparação aos ensaios in vitro e in vivo em modelos de leishmaniose cutânea sobre as espécies L. amazonensis e L. braziliensis.
[0038] A invenção constitui-se, portanto, na obtenção de alternativas para os tratamentos de doenças parasitárias. Neste sentido, a presente investigação baseia-se em formulações compreendendo 17-DMAG e sua atividade leishmanicida superior ao estado de técnica com redução de efeitos colaterais e adversos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0039] Em um aspecto mais geral, a invenção provê uma formulação farmacêutica que compreende, como ingrediente ativo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto 17 -DM AG e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0040] Em outro aspecto, é fornecido o processo de produção de uma formulação farmacêutica, compreendendo as etapas de:
(a) solubilização do princípio ativo em excipientes adequados;
(b) formação das nanopartículas a partir da diluição em meio previamente selecionado e processamento por emulsificação;
(c) recuperação das nanopartículas pela eliminação dos solventes empregados no processo e extração física.
[0041] Em um outro aspecto, é provido um medicamento, que compreende a referida formulação farmacêutica.
[0042] Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um método de tratamento de leishmaniose que utiliza a formulação descrita acima.
[0043] Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso da formulação descrita acima para manufatura de um medicamento para tratar leishmaniose.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0044] A Figura 1 refere à estrutura química da molécula de 17- DMAG.
[0045] A Figura 2 se refere ao ensaio de viabilidade celular in vitro com promastigotas axênicas de L. amazonensis e células THP- 1 diferenciadas tratadas com 17-DMAG em um ensaio de diluição seriada de 12 passos (concentração inicial: 2 μM e 50 μM, respectivamente). O gráfico representa valores de IC50 (L. amazonensis) e CC50 (células THP-1) para o 17-DMAG. Teste de Mann Whitney *** p = 0,001.
[0046] A Figura 3 se refere ao ensaio de citotoxidade em fibroblastos pulmonares humanos, células MRC-5, tratadas com 17-DMAG (concentração inicial: 50 μM) em um ensaio de diluição seriada de 12 passos, realizado em triplicata. O gráfico representa valores dos percentuais de viabilidade celular. [0047] A Figura 4 se refere ao ensaio de viabilidade intracelular em células THP-1 infectadas por L. amazonensis e tratadas com 17-DMAG em diferentes concentrações. O gráfico representa o número de células viáveis. [0048] A Figura 5 se refere ao efeito do tratamento de diferentes esquemas terapêuticos com 17-DMAG sobre o tamanho da lesão de camundongos BALB/c infectados por L. braziliensis. Os gráficos expressam a diferença da espessura da lesão da orelha infectada (orelha esquerda - OE) em relação a orelha contralateral (orelha direita - OD) dos animais tratados e não tratados. Onde, (A) todos os grupos de animais, tratados e não tratados; (B) área sob a curva (AUC) da espessura da lesão mostrada em “A”. ANOVA, (*** p < 0,0001; * p < 0,05).
[0049] A Figura 6 se refere a imagens do efeito do tratamento de diferentes esquemas terapêuticos com 17-DMAG sobre o tamanho da lesão de camundongos BALB/c infectados por L. braziliensis. (A - D) lesões do grupo controle, aplicada solução de glicose 5% via intraperitoneal; (E - H) lesões do grupo tratado com 20 mg/kg diariamente; (I - L) lesões do grupo tratado com 30 mg/kg em dias alternados; (M - P) lesões do grupo tratado com 50 mg/kg a cada cinco dias.
[0050] A Figura 7 se refere a cinética do tratamento de 17-DMAG (concentração de 20 mg/kg, dose diária durante duas, quatro ou sete semanas) sobre o tamanho da lesão de camundongos BALB/c infectados por L. braziliensis. Onde, (A) desenvolvimento da lesão nos grupos tratado ou controle, monitorado semanalmente (B) Área sob a curva (AUC) do desenvolvimento da lesão mostrado em “A”. Teste t de Student, ***p< 0,0001.
[0051] A Figura 8 se refere à carga parasitária da orelha e linfonodo de camundongos infectados por L. braziliensis tratados com 17-DMAG via intraperitoneal (concentração de 20 mg/kg, dose diária durante duas, quatro ou sete semanas). Onde, (A) linfonodos após duas semanas, (B) orelha após duas semanas, (C) linfonodo após quatro semanas, (D) orelha após quatro semanas; (E) linfonodo após sete semanas; (F) orelha após sete semanas. Teste t de student, (*** p< 0,0001; ** p< 0,01; * p< 0,05).
[0052] A Figura 9 se refere a imagens das lesões na orelha e linfonodos de camundongos BALB/c infectados com L. braziliensis e tratados com 17 -DM AG injetável via intraperitoneal (concentração de 20 mg/kg, dose diária durante duas, quatro ou sete semanas). Onde, (A - D) orelha e linfonodo dos animais do grupo controle, que receberam solução de glicose 5% diariamente durante duas semanas via intraperitoneal; (E - H) orelha e linfonodo dos animais infectados e tratados com 20 mg/kg diariamente durante duas semanas; (I - L) orelha e linfonodo dos animais do grupo controle, que receberam solução de glicose 5% diariamente durante quatro semanas via intraperitoneal; (M - P) orelha e linfonodo dos animais infectados e tratados com 20 mg/kg diariamente durante quatro semanas.
[0053] A Figura 10 se refere a imagem de toxicidade da aplicação tópica do 17-DMAG livre, incorporado em hidrogel em camundongos BALB/c. Camundongos BALB/c saudáveis foram diariamente expostos ao 17-DMAG incorporado em hidrogel, nas concentrações de 0,15 mg/g; 0,20 mg/g; 0,25mg/g ou 0,30 mg/g durante quatro semanas. Como controle, animais foram expostos ao hidrogel branco, sem 17-DMAG. Os resultados são expressos como a diferença da espessura da orelha exposta em relação à contralateral. (* p < 0,05, teste de Kruskal-Wallis).
[0054] A Figura 11 se refere a imagem de microscopia eletrônica das nanopartículas poliméricas de 17-DMAG (A e B), das nanopartículas poliméricas contrastadas com ósmio (A’ e B’), com as medidas das nanopartículas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0055] Acredita-se que um técnico no assunto possa, com base na descrição contida na presente invenção, usar a mesma em sua mais completa extensão. As concretizações específicas, a seguir, devem ser interpretadas como meramente ilustrativas, e não como limitantes, em qualquer aspecto, do restante da descrição.
[0056] A não ser que seja definido de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a presente invenção pertence. O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A terminologia utilizada na descrição da invenção tem finalidade de descrever concretizações preferenciais somente, e não tem a intenção de limitar o escopo de seus ensinamentos.
[0057] A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos utilizados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar dependendo das propriedades a serem obtidas.
[0058] Todas as referências bibliográficas patentárias ou não patentárias citadas no presente pedido, são aqui incorporados por referência em sua integralidade.
[0059] A presente invenção, em seu aspecto mais geral, provê uma formulação farmacêutica que compreende, como ingrediente ativo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto 17-DMGA e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, de forma que esta formulação melhora a eficácia do tratamento de leishmaniose, ao mesmo tempo que diminui a toxicidade do mesmo. [0060] O termo “ativo” é usado aqui para se referir a um material que induz um efeito desejado e inclui os derivados e análogos do material especificamente mencionado que também induz o efeito desejado.
[0061] Como usado aqui, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade suficiente para induzir o efeito desejado, mas baixa o suficiente para evitar efeitos colaterais sérios. Para qualquer composto, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente, quer em ensaios de cultura de células, quer em modelos animais, usualmente camundongos, coelhos, cães ou porcos. O modelo animal também pode ser usado para se determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Informação desse tipo pode então ser usada para se determinar doses úteis e vias para administração em humanos.
[0062] Em uma concretização, o fármaco 17 -DM AG é compreendido na referida formulação na faixa de 0,50 mg/g até 0,05 mg/g em relação ao peso total da formulação. Conforme a presente invenção, a administração das ditas formulações farmacêuticas pode ser realizada pelas vias de administração: oral, sublingual, nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra-articular, subcutânea, cutânea, transdérmica, não sendo limitada a estas.
[0063] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados em função da apresentação final da formulação da presente invenção que pode ser na forma de cápsulas, comprimidos ou suspensão para a administração oral, suspensão para administração nasal, suspensão injetável para administração intramuscular, intravenosa, cutânea ou sub-cutânea, formulações semissólidas para administração tópica. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis não apresentam toxicidade ao organismo receptor nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões como fosfatos, citratos e outros ácidos orgânicos; antioxidantes como ácido ascórbico e metionina; conservantes como cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico, álcool benzílico, alquil parabenos como metil- e propilparabeno, catecol, resorcinol e m-cresol; excipientes poliméricos como polivinilpirrolidonas e polietileno glicóis; edulcorantes e flarorizantes; agentes estabilizantes como EDTA ou EGTA; surfactantes não-iônicos como polissorbatos 20 e 80; diluentes como lactose, amido, manitol ou celulose microcristalina; lubrificantes como ácido esteárico, estearatos (magnésio, zinco), estearil fumarato de sódio; promotores de fluxo como talco e dióxido de silício coloidal; agentes granulantes como derivados de celulose (HPC, HPMC), amido pré-gelatinizado, PVP k-30; desintegrantes como amido glicolato de sódio, croscarmelose sódica ou crospovidona; agentes molhantes como lauril sulfato de sódio, docusato sódico, polissorbatos 20, 60, 80 (Tween®); agentes de revestimento como derivados de celulose (metilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, acetato de celulose). Referências conhecidas do técnico no assunto sobre excipientes farmaceuticamente aceitáveis são a publicação "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18- edição, (1990), Mack Publishing Co., USA., e a publicação "Handbook of Pharmaceutical Additives" de Michael e Irene Ash, 1995, Gower (Inglaterra).
[0064] Para fins desta invenção, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa que o excipiente é adequado para uso em contato com tecidos sem toxicidade, incompatibilidade, instabilidade, irritação ou reação alérgica indevida, ou similares.
[0065] Exemplos não limitantes de excipientes adequados à invenção incluem agentes tensoativos, tais como tweens, spans e myrjs; agentes gelificantes, tais como carboximetil, hidroxietil, hidroxipropil-celuloses, emulsificantes não iônicos, tais como monoglicerídeos, ésteres de ácidos graxos, monoleatos, polissorbatos; agentes imobilizantes, tais como ciclodextrinas: alfa, beta, hidroxipropil beta, alginatos e gelatinas; agentes formadores de película ou filmantes, tais como polivinil álcool e cetoestearílico álcool; agentes epitelizantes, tais como alantoína e cepalin; agentes dispersantes, tais como sorbitol, polietino glicóis, estearatos; e agentes conservantes e estabilizantes, tais como parabenos e imidasolinidil- uréria, utilizados só ou em combinações entre si.
[0066] Em uma concretização, o excipiente é selecionado do grupo consistindo de diluentes, carreadores, molhantes, dispersantes, desintegrantes, promotores de fluxo, agentes de revestimento, estabilizantes, gelificantes, emulsificantes, edulcorantes, flavorizantes e conservantes.
[0067] Em uma concretização, os excipientes estão na faixa de 50% a 95% em relação ao peso total das formulações. Preferencialmente, os excipientes estão na faixa de 60% a 90%. Mais preferencialmente, os excipientes estão na faixa de 65% a 80%.
[0068] Além disto, as formulações aqui descritas podem, opcionalmente, compreender aditivos com o objetivo de aumentar a facilidade de administração, a capacidade de serem estocadas, a resistência à degradação, a biodisponibilidade, a meia vida, prover preparações isotônicas, etc. Aditivos usais para a preparação de formulações farmacêuticas são bem conhecidos na arte.
[0069] Ainda, as referidas formulações podem compreender sistemas de liberação modificada de drogas. Os sistemas de liberação modificada são selecionados do grupo que compreende lipossomas, bombas osmóticas, revestimentos entéricos, sistemas matriciais poliméricos, sistemas transdérmicos, implantes, micro e nanoemulsões e outros bem conhecidos na arte.
[0070] As formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser orais, tópicas ou sistêmicas.
[0071] Em uma concretização, as ditas formulações são formulações tópicas.
[0072] Para os fins desta invenção, formulações para uso tópico são entendidas como quaisquer composições para aplicação diretamente sobre a pele, mais especificamente, sobre lesões cutâneas e suas imediações.
[0073] As formulações da invenção podem ser usadas para fabricar uma ampla variedade de tipos de produtos que incluem, porém sem caráter limitativo, pomadas, cremes, pastas, géis, hidrogéis, loções, soluções, suspensões, sprays, emplastros, entre outros.
[0074] Em uma concretização preferencial, as ditas formulações estão na forma de creme ou hidrogel.
[0075] Para os fins desta invenção, a formulação de creme obtida da agitação de fase oleosa em fase aquosa sob alta velocidade para obtenção de um creme homogêneo com partículas menores (gotículas) e com melhor textura e estabilidade.
[0076] Em uma concretização preferencial, a fase aquosa contém glicerina nipagin e água destilada. Em uma concretização preferencial, a fase oleosa contem cera, vaselina, álcool cetílico ou nizapol.
[0077] Em uma concretização preferencial, a formulação de creme contendo 17-DMAG em uma faixa de concentração de 0,05 mg-0,30 mg/g, diluído em água.
[0078] Para os fins desta invenção, a formulação de hidrogel obtida pela solubilização de 17-DMAG em água destilada e adição de solução de carboximetilcelulose (CMC).
[0079] Em uma concretização preferencial, a formulação de hidrogel contendo 17-DMAG em uma faixa de concentração de 0,05 mg-0,30 mg/g, diluído em água destilada, adicionado a uma solução de 2% de CMC.
[0080] Em uma forma de concretização, a formulação farmacêutica é para o tratamento das leishmanioses.
[0081] Em uma forma de concretização preferida, a formulação farmacêutica é para o tratamento da Leishmaniose Visceral e/ou Leishmaniose Tegumentar. [0082] Em uma forma de concretização mais preferida, a leishmaniose é a Leishmaniose Tegumentar Americana.
[0083] Particularmente, a Leishmaniose Tegumentar Americana é causada pela espécie L. amazonensis e L. braziliensis , responsável pela doença na forma cutânea difusa.
[0084] Em outro aspecto, é fornecido o processo de produção de uma formulação farmacêutica, compreendendo as etapas de:
(a) solubilização do princípio ativo em excipientes adequados;
(b) formação das nanopartículas a partir da diluição em meio previamente selecionado e processamento por emulsificação;
(c) recuperação das nanopartículas pela eliminação dos solventes empregados no processo e extração física.
[0085] Em um outro aspecto, é provido um medicamento, que compreende a combinação descrita acima.
[0086] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “medicamento” se refere a um produto farmacêutico, tecnicamente obtido ou elaborado, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico.
[0087] Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um método de tratamento de leishmaniose que utiliza a formulação descrita acima.
[0088] A quantidade efetiva precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado de doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, do peso, e do sexo do sujeito, da dieta, do tempo e da frequência de administração, da combinação/combinações de drogas, das sensibilidades de reação, e da tolerância/resposta à terapia. Assim, doses a serem fornecidas dependem de um número de fatores que não podem ser mensuradas antes que os estudos clínicos sejam feitos. O técnico no assunto, no entanto, sabe como chegar a doses adequadas para diferentes tratamentos.
[0089] Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso da combinação descrita acima para manufatura de um medicamento para tratar leishmaniose, preferencialmente para o tratamento da Leishmaniose Visceral e/ou Leishmaniose Tegumentar, mais preferencialmente para o tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana.
[0090] Embora várias formas de realização que incorporam os ensinamentos da presente invenção tenham sido aqui mostradas e descritas em detalhes, àqueles versados na técnica será possível vislumbrar prontamente muitas outras formas de realização variadas que possam ainda incorporar esses ensinamentos. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexa.
[0091] A presente invenção será agora descrita por meio de exemplos, os quais pretendem ser meramente ilustrativos da presente invenção, não sendo, de forma alguma, limitativos quanto ao escopo e à abrangência da presente invenção.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: Ensaio in vitro de viabilidade celular ao 17-DMAG
[0092] Inicialmente, foi avaliada a diferença de susceptibilidade do parasito e da célula hospedeira ao 17-DMAG. Para isso, foram realizados ensaios de viabilidade celular para avaliar a atividade leishmanicida e a citotoxicidade (em célula humana de linhagem THP-1) do 17-DMAG.
[0093] Promastigotas axênicas de L. amazonensis em fase logarítmica foram distribuídas em placas de 96 poços (4x105 parasitos/poço) em meio Schneider completo e tratadas com 17-DMAG (LC Laboratories, Wobum, MA, EUA) em diluições seriadas de 12 passos (1:2) em uma concentração inicial de 2 μM. Após 72 h de tratamento a 24° C, os parasitos foram incubados com 10% de Alamar Blue® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por 1h e 30 min. Em seguida, a densidade óptica (DO) foi lida nos comprimentos de onda de 570 e 600 nm em espectrofotômetro (SPECTRA Max 340 PC) para determinar a viabilidade celular, expressa em termos percentuais, usada para calcular o valor de IC50. Este valor foi determinado aplicando regressão sigmoidal às curvas de concentração-resposta utilizando o GraphPad Prism (versão 5.0) de pelo menos três experimentos independentes realizados em triplicatas.
[0094] Células humanas THP-1 foram centrifugadas a 300xg durante 10 min a 4o C e ressuspensas (105 células/100μL) em meio RPMI completo contendo forbol-12-miristato- 13 -acetato (PM A) a 100 nM e distribuídas em placas de 96 poços. As culturas foram incubadas a 37° C por 72 h para induzir a diferenciação em macrófagos. Os poços foram então lavados duas vezes com salina, o meio RPMI completo (sem PMA) foi reposto e as células foram re-incubadas a 37° C por um período adicional de 48 h. As culturas foram então tratadas com 17-DMAG em diluições seriadas de 12 passos (1:2) utilizando uma concentração inicial de 50 μM. Após 72 h de tratamento a 37° C, as células foram incubadas com Alamar Blue® a 10% por 22 h. Em seguida, as placas foram lidas em comprimentos de onda de 570 e 600 nm em espectrofotômetro (SPECTRA Max 340 PC). Os dados obtidos foram utilizados para calcular o percentual de viabilidade celular e, posteriormente, o valor de CC50 foi determinado a partir da regressão sigmoidal das curvas concentração-resposta usando GraphPad Prism (versão 5.0) de pelo menos três experimentos independentes realizados em triplicata.
[0095] A partir desses ensaios foram calculados os valores de IC50 e CC50 (Leishmania e célula THP-1, respectivamente) observados na Figura 2. O valor de IC50 para 17-DMAG foi de 0,09 μM em promastigotas de L. amazonensis, enquanto que em células THP-1 foi observado valor de CC50 de 10,6 μM (p = 0, 001), resultando em um índice de seletividade de 117,8. Os resultados da Figura 2 demonstram que o 17-DMAG apresenta maior toxicidade contra L. amazonensis em comparação à célula hospedeira.
EXEMPLO 2: Ensaio in vitro de citotoxidade de células MRC-5 ao 17- DMAG
[0096] Adicionalmente ao ensaio com THP-1 e com o objetivo de avaliar outro tipo celular, o ensaio de citotoxicidade foi realizado com fibroblastos pulmonares humanos (células MRC-5) tratados com 17-DMAG. Para este fim, as células MRC-5 foram centrifugadas a 300xg durante 10 min a 4o C e ressuspensas em meio RPMI completo e plaqueadas na concentração de 2,5 x 104 por poço, depois foram incubadas a 37° C durante 24 h. Posteriormente, as células foram tratadas com 17-DMAG (concentração inicial: 50 μM) seguindo o mesmo protocolo utilizado para as células THP-1. Após 72 h, o Alamar Blue® foi adicionado e as placas foram lidas em espectrofotômetro. O valor de CC50 foi determinado da mesma maneira que foi realizado para as células THP- 1.
[0097] O resultado do ensaio é mostrado na Figura 3. Observa-se que o 17-DMAG reduziu o percentual de viabilidade celular somente em concentrações acima de 6,25 μM. Assim como para as células THP-1, o valor de CC50 foi calculado e apresentou um valor de 13,24 μM.
EXEMPLO 3: Ensaio in vitro de viabilidade intracelular ao 17-DMAG
[0098] Para avaliar se a toxicidade observada em promastigotas também seria observada em amastigotas, foi realizado um ensaio de viabilidade intracelular em macrófagos infectados por L. amazonensis e tratados com 17-DMAG em diferentes concentrações. Células THP-1 (5x105 por poço) foram plaqueadas em meio RPMI completo com PM A (100 nM) para promover a diferenciação em macrófagos. Após 72 h, as células foram lavadas com salina e o meio (sem PMA) foi reposto. Após 48 h em meio sem PMA, as células foram novamente lavadas e infectadas por promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária (10:1) por 6 h a 35° C. Para remoção dos parasites não internalizados, as células foram lavadas duas vezes com salina, o meio RPMI foi reposto e concentrações de 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 300 nM e 400 nM (cinco réplicas para cada concentração) de 17-DMAG foram adicionados e as células foram incubadas por um período de 72 h. Em seguida, as células foram lavadas com salina e foi adicionado meio Schneider completo. Após quatro dias, os parasitos viáveis foram contados em câmara de Neubauer e o valor de IC50 foi calculado para o 17-DMAG.
[0099] A Figura 4 demonstra que, assim como em promastigotas, o 17-DMAG também apresentou toxicidade contra as formas amastigotas de modo dose-dependente. Observa-se que em concentrações acima de 100 nM de 17-DMAG, já não foram observados parasitos viáveis. Interessantemente, o valor de IC50 obtido contra a forma intracelular de amastigota foi de 13,4 nM, mostrando que o 17-DMAG é cerca de 7 vezes mais eficaz contra a forma amastigota, do que contra a forma promastigota flagelada de L. amazonensis, cujo IC50 foi de 90 nM.
EXEMPLO 4: Ensaio in vivo com camundongos infectados por L. braziliensis com 17-DMAG por via intraperitoneal nas doses de 20, 30 ou 50 mg/kg.
[00100] Os camundongos BALB/c foram infectados na derme da orelha esquerda com 105 parasitas L. braziliensis em um volume total de 10 pL de salina estéril e tratados com injeções intraperitoneais de 17-DMAG nas doses de 20 mg/kg diariamente, 30 mg/kg em dias alternados e 50 mg/kg a cada cinco dias.
[00101] O tratamento teve início após 15 dias da infecção por L. braziliensis. Para isto, 35 camundongos foram divididos em quatro grupos: (i) animais controle não tratados, que receberam aplicação de glicose 5% diariamente; (ii) animais tratados com 20mg/kg de 17-DMAG intraperitoneal diariamente; (iii) animais tratados com 30mg/kg de 17-DMAG intraperitoneal em dias alternados; (iv) animais tratados com 50mg/kg de 17-DMAG intraperitoneal a cada cinco dias. [00102] Antes de cada aplicação do tratamento, os animais eram pesados para determinar o volume do fármaco. Semanalmente, foi realizada a mensuração da espessura das orelhas infectada e contralateral, comparativamente.
[00103] O efeito do tratamento de diferentes esquemas terapêuticos com 17-DMAG na sua formulação injetável contra L. braziliensis em camundongos BALB/c pode ser observado na Figura 5.
[00104] O grupo de animais submetidos ao tratamento com 20 mg/kg mostrou uma redução significativa do tamanho da lesão em comparação com o grupo controle (Figura 5 A). Em relação ao grupo tratado com 30 mg/kg em dias alternados, também foi possível observar uma redução do tamanho da lesão em relação ao controle, porém menos expressiva do que no grupo tratado diariamente mesmo em concentração menor (Figura 5B). Os camundongos tratados com a concentração de 50 mg/mL a cada cinco dias apresentaram redução menos significativa do tamanho da lesão em relação ao controle (Figura 5C). Supomos que a menor eficácia da dose de 50 mg/kg em comparação aos animais tratados com 20 mg/kg se deu devido ao espaço de tempo entre as aplicações serem diárias no grupo tratado com 20 mg/kg, em comparação ao espaço de cinco dias no grupo tratado com 50 mg/kg.
[00105] A Figura 5B mostra o resultado da área sob a curva (AUC) do tamanho da lesão dos diferentes grupos experimentais. Apesar da diferença, entre a AUC do animal tratado em relação a do não tratado, ser maior na dose de 20 mg/kg de 17-DMAG aplicado diariamente, em todas as concentrações testadas as diferenças entre as AUCs em relação àquela dos animais não tratados foi estatisticamente significante.
[00106] Corroborando com os resultados das espessuras das lesões, imagens tiradas das orelhas de animais infectados mostram clara diferença entre o grupo controle e os grupos tratados (Figura 6). Os camundongos do grupo controle apresentaram uma lesão bem desenvolvida (Figura 6A-D). As orelhas dos animais tratados apresentaram lesão de menor tamanho (Figura 6E-P). A derme da orelha dos animais não tratado apresentou aspecto mais avermelhado, quando comparada com a pele dos camundongos tratados em qualquer concentração. Os animais tratados com 20 mg/kg (Figura 6E-H) e com 30 mg/kg (Figura 6I-L) apresentaram pouca ou nenhuma lesão. Os camundongos tratados com 50 mg/kg a cada cinco dias (Figura 5M-P), apresentaram lesões, no entanto, com aspecto menos inflamado que as lesões nos animais não tratados.
[00107] Os resultados obtidos com este ensaio mostram que o fármaco 17-DMAG, quando aplicado intraperitonealmente em doses de até 30 mg/kg, reduz de forma significativa o tamanho da lesão causada por L. braziliensis, independentemente do esquema terapêutico utilizado. No entanto, os achados evidenciam que, quando aplicado em intervalos longos entre as aplicações, o efeito terapêutico foi menos eficaz.
EXEMPLO 5 : Ensaio in vivo com camundongos infectados por L. braziliensis com 17-DMAG por via intraperitoneal por 2, 4 ou 7 semanas.
[00108] Após demostrado que camundongos tratados diariamente com a dose de 20 mg/kg de 17-DMAG não apresentaram sintomas de toxicidade e ainda apresentaram uma resposta eficaz que promoveu diminuição da espessura da lesão bem como do aspecto da orelha infectada, decidiu-se realizar um estudo de cinética acompanhando a lesão e a carga parasitária em diferentes momentos após o tratamento e por tempos mais prolongados: duas, quatro e sete semanas de tratamento.
[00109] Os camundongos BALB/c foram infectados na derme da orelha esquerda com 105 parasitas L. braziliensis em um volume total de 10 pL de salina estéril e, após duas semanas, tratados com injeções intraperitoneais de 17-DMAG na concentração de 20 mg/kg diariamente durante duas, quatro ou sete semanas.
[00110] O tratamento com 17-DMAG foi iniciado 15 dias após a infecção por L. braziliensis. Para isso, 34 camundongos foram distribuídos em seis grupos: (i) animais controle não tratados que receberam aplicação de glicose 5% diariamente durante duas semanas; (ii) animais tratados durante duas semanas com aplicação 20 mg/kg de 17-DMAG diariamente; (iii) animais controle não tratados por quatro semanas que receberam aplicação de glicose 5% diariamente; (iv) animais tratados durante quatro semanas com aplicações de 20 mg/kg de 17-DMAG diariamente; (v) animais controle não tratados durante sete semanas que receberam aplicações glicose 5% diariamente; (vi) animais tratados durante sete semanas com aplicações de 20 mg/kg de 17-DMAG diariamente.
[00111] Antes de cada aplicação os camundongos foram pesados para determinar o volume do fármaco. A espessura da lesão na orelha foi medida semanalmente. Após duas, quatro ou sete semanas de tratamento os animais foram eutanasiados e tiveram a orelha infectada e linfonodo de drenagem retirados para quantificação de carga parasitária por diluição limitante.
[00112] A Figura 7 mostra a variação do tamanho da lesão de camundongos infectados por L. braziliensis e tratados com 17-DMAG por duas, quatro ou sete semanas de tratamento. Os camundongos tratados por duas semanas apresentaram pouco desenvolvimento da lesão durante a primeira semana e diminuição da espessura na segunda semana, quando comparado ao controle. Os camundongos tratados durante quatro semanas apresentaram diminuição importante do tamanho da lesão em relação às semanas anteriores, diferente do grupo controle, que apresentou aumento da lesão (Figura 7B). Nos camundongos tratados por sete semanas, a lesão mostrou uma queda expressiva em relação ao controle, chegando a zero a diferença entre orelha infectada e não infectada entre a quinta e sexta semana de tratamento.
[00113] A Figura 8 demonstra avaliação da carga parasitária por diluição limitante. Após duas semanas de tratamento, observou-se uma redução acentuada, tanto na orelha quanto no linfonodo dos camundongos tratados em relação ao controle (Figura 8 A - B). Com quatro semanas de tratamento, a redução da carga parasitária é ainda mais expressiva no grupo tratado em relação ao controle. Cinco animais do grupo tratado durante quatro semanas não apresentaram carga na orelha e seis não apresentaram carga no linfonodo, enquanto todos os camundongos do grupo controle apresentaram carga (Figura 8C - D). Após sete semanas de tratamento, nenhuma carga parasitária foi encontrada nem na orelha e nem no linfonodo dos camundongos tratados, enquanto que os animais controle apresentaram uma mediana de 55.000 parasites de carga no linfonodo e de 5.500 parasites na lesão (Figura 8E - F).
[00114] A Figura 9 apresenta imagens adquiridas a partir da orelha e do linfonodo drenante dos camundongos que evidenciam a diferença entre os grupos tratado e controle. Nos animais acompanhados por duas semanas, o controle apresenta uma lesão bem desenvolvida e linfonodo aumentado (Figura 9A - D), enquanto que os animais que receberam tratamento durante duas semanas apresentaram nenhuma lesão ou uma lesão pequena e o linfonodo mostrou-se reduzido 1 ,6 vezes em relação ao controle (Figura 9E - H). Observa-se aspectos similares nas lesões e linfonodos dos camundongos na quarta semana após o tratamento, quando o controle apresentou uma lesão bem desenvolvida, com aspecto mais inflamado do que os animais de duas semanas, além do linfonodo aumentado em três vezes (Figura 91 - L), enquanto que os camundongos tratados não apresentaram nenhuma lesão e o linfonodo mostrou uma redução de três vezes em relação ao controle (Figura 9M - P).
EXEMPLO 6: Ensaio de toxicidade in vivo em camundongos não infectados tratados com 17-DMAG por via tópica nas formulações em hidrogel.
[00115] Para avaliar a toxicidade do 17-DMAG em base semissólida, camundongos BALB/c não infectados foram expostos ao 17-DMAG incorporado em base tópica hidrogel em diferentes concentrações. Para isso, 12,0 mg, 10,0 mg, 8 mg e 6 mg de 17-DMAG foram individualmente diluídos em 40 mL de água destilada. Para gelificação, cada solução foi aquecida a 37 °C para adição de 1% de carboximetilcelulose sódica (CMC-Na), produzindo, respectivamente, as doses de hidrogel de 0,30, 0,25, 0,20 e 0,15 mg/g.
[00116] Os diferentes esquemas terapêuticos foram aplicados diariamente em animais não infectados nas doses de 0,15, 0,20, 0,25, 0,30 mg/g de hidrogel. Para isso, 30 camundongos foram divididos em cinco grupos, um grupo controle de camundongos tratados com hidrogel sem o fármaco ou hidrogel branco (i); e outros quatro grupos foram tratados com hidrogel contendo 17-DMAG nas concentrações de 0,15 mg/g (ii); 0,20 mg/g (iii); 0,25 mg/g (iv); 0,30 mg/g (v) para avaliar a toxicidade do 17-DMAG em hidrogel in vivo, expondo a formulação na pele da orelha de camundongos durante 4 semanas. Os 30 camundongos foram tratados diariamente e a espessura da orelha foi medida semanalmente.
[00117] Os resultados obtidos estão representados na Figura 6, onde observa-se que apenas o hidrogel de maior concentração, 0,30 mg/g, apresentou diferença significativa de espessura de orelha quando comparado ao branco. No entanto, apesar do composto em hidrogel não ter causado aumento da espessura na concentração de 0,25 mg/g, foi observado aumento da sensibilidade, rigidez e discreta vermelhidão na orelha tratada quando comparado ao controle (branco). Esses dados mostram que a dose a ser usada para teste da eficácia deve iniciar na concentração de 0,20 mg/g de hidrogel, concentração de 300 μM, 15.000 vezes superior àquela do IC50.
EXEMPLO 7: Produção de nanopartículas poliméricas contendo 17-DMAG. [00118] Para a produção das nanopartículas poliméricas de 17-DMAG. São dissolvidos 2-5 mg da droga em 1,5 a 5 mL de uma solução aquosa contendo 0-5% de PEG 300. Em seguida essa amostra é vertida em 2 a 8 mL de diclorometano contendo 100 a 400 mg de PLGA e processada por ultrassonicação a amplitude de 20-40% em ciclos de 30 segundos. Essa emulsão é vertida em 10 mL de uma solução aquosa contendo de 0,5-2% de PVA e levada ao ultrassonicador novamente. A emulsão final formada é vertida em 30 mL de uma solução aquosa contento de 0,5-2% de PVA e deixada por até 10 min sob agitação magnética. Em uma concretização preferencial, foram utilizadas as seguintes proporções: 3mg de 17-DMAG; 2,5% de PEG em um volume de 1,5 mL; 100 mg de PLGA em 2 mL de diclorometano; 1% de PVA; amplitude de 40% de sonicação em ciclos de 30 segundos.
[00119] Em seguida o solvente é evaporado em rotaevaporador a 40 °C e 200 mBar por 1 hora e a solução é ultracentrifugada a 166.713,1 m/s2 (17.000 x g) por três vezes e ressuspensa em água do tipo II. Após a última ultracentrifugação a amostra é ressuspensa em 5 mL de água e as amostras são congeladas a -80 °C e liofilizadas por 24h a -30 °C.
[00120] As nanopartículas obtiveram uma eficiência encapsulação de 40% de 17-DMAG. Essa medida foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O tamanho das nanopartículas, obtido por espalhamento de luz dinâmico, demonstrou um valor médio igual a 282 nm e índice de polidispersão de 0,1. O potencial Zeta foi adquirido por potencial eletroforético, tendo valor igual a -33 mV. A Figura 11 mostra a imagem obtida por microscopia eletrônica de transmissão (MET) onde observa-se que as nanopartículas são esféricas e com tamanho variando de 70 a 400 nm. Foi avaliado a viabilidade celular e o IC50 obtido foi de 14,9 nM.
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Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender, como ingrediente ativo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto 17-Dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-DMAG) e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
2. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de que a quantidade de 17-DMAG é de 0,50 m/g até 0,05 mg/g em relação ao peso total da formulação.
3. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o excipiente farmaceuticamente aceitável é selecionado do grupo consistindo de diluentes, carreadores, protetores, tensoativos, agentes dispersantes, agentes imobilizantes, agentes formadores de película ou filmantes, cicatrizantes, regeneradores de tecidos, agentes estabilizantes, agentes gelificantes, agentes epitelizantes, emulsificantes não iônicos, e agentes conservantes.
4. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o somatório do percentual de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está na faixa de 60% a 90%, mais preferencialmente, os excipientes estão na faixa de 65% a 80% em relação ao peso total da formulação.
5. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de ser uma formulação tópica ou sistêmica.
6. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de estar na forma de pomadas, cremes, pastas, géis, hidrogéis, loções, soluções, suspensões, sprays, emplastros, entre outros, preferencialmente na forma de um hidrogel.
7. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de ser para o tratamento das leishmanioses, preferencialmente para o tratamento da Leishmaniose Visceral e/ou Leishmaniose Tegumentar, mais preferencialmente para o tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana.
8. Processo de produção de uma formulação farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(a) solubilização do princípio ativo em excipientes adequados;
(b) formação das nanopartículas a partir da diluição em meio previamente selecionado e processamento por emulsificação;
(c) recuperação das nanopartículas pela eliminação dos solventes empregados no processo e extração física.
9. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende a formulação farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
10. Método de tratamento de leishmaniose, caracterizado pelo fato de que utiliza a formulação farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
11. Uso de uma formulação farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratar leishmaniose, preferencialmente.
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