WO2022050431A1 - 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents

골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 Download PDF

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delphinidin
hydrogen peroxide
cells
treated
chondrocytes
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PCT/KR2020/011701
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김동희
이동영
김덕룡
자다사이브
박영진
송명근
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경상국립대학교병원
경상국립대학교산학협력단
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    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoarthritis and a health functional food.
  • Degenerative arthritis is a disease caused by inflammation and pain in the joints, and includes osteoarthritis, rheumatoid arthritis, gout, and sciatica, and 95% of arthritis patients suffer from degenerative arthritis.
  • Degenerative arthritis is a disease in which local degenerative changes appear as joint cartilage is worn away, also called osteoarthritis.
  • Degenerative arthritis is a representative degenerative disease closely related to aging, and about 10 to 15% of the entire population suffers, and in particular, about 60 to 80% of the elderly population over 65 suffer from degenerative arthritis.
  • the cause of degenerative arthritis is closely related to the aging phenomenon or excessive weight, and it is more common in women as they get older.
  • the initial symptom is one or two joints with stiffness and aching pain accompanied by pain, and if it is prolonged, over-formation of bone around the joint and deformation of the joint will result.
  • the mechanism of degenerative arthritis is an increase in the production of pro-inflammatory cytokines and an increase in the secretion of MMPs such as collagenase and stromelysin to damage the articular cartilage matrix. cause.
  • drugs such as analgesics, steroids, and nonsteroidal anti-inflammatory drugs or chondroprotectors such as hyaluronic acid, glucosamine, and chondroitin are used
  • chondroprotectors such as hyaluronic acid, glucosamine, and chondroitin
  • arthroscopic surgery proximal tibial osteotomy
  • joint Surgical treatment such as partial knee arthroplasty or total knee arthroplasty is used.
  • chondroprotectors only serve to protect joints by supplying nutrients to chondrocytes or alleviating shock.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis.
  • An object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or improving arthritis.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis comprising delphinidin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Health functional food for preventing or improving osteoarthritis including delphinidin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition and health functional food of the present invention have excellent preventive, therapeutic or ameliorating effects on osteoarthritis.
  • 1 is a result confirming the C28/I2 chondrocyte protective effect of delphinidin under hydrogen peroxide cytotoxicity.
  • 1A shows that cell viability when C28/I2 chondrocytes were treated with hydrogen peroxide in the presence of NAC was higher than that treated with hydrogen peroxide in the absence of NAC.
  • FIG. 1B shows cell images analyzed using bright-field microscopy when C28/I2 chondrocytes were treated with hydrogen peroxide in the presence or absence of NAC.
  • 1C shows no cytotoxicity when C28/I2 cells were treated with 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M, 50 ⁇ M delphinidin for 2, 4, and 24 h.
  • FIG. 1D shows that cell viability when C28/I2 chondrocytes were treated with hydrogen peroxide in the presence of delphinidin was higher than that of hydrogen peroxide in the absence of delphinidin.
  • FIG. 1E shows cell images analyzed using bright-field microscopy when C28/I2 chondrocytes were treated with hydrogen peroxide in the presence or absence of delphinidin.
  • 1F shows that the relative ROS levels in cells treated with hydrogen peroxide in the presence of NAC or delphinidin were significantly reduced compared to ROS levels in cells treated with hydrogen peroxide alone.
  • 2 is a result confirming the protective effect of C28/I2 chondrocytes under oxidative stress of delphinidin through the activation of Nrf2 and NF- ⁇ B.
  • 2A is a result of Western blot analysis on proteins involved in apoptosis and cell protection.
  • 2B and 2C show that when treated with hydrogen peroxide in the presence of delphinidin, the expression levels of the pro-apoptotic proteins c-caspase-3 and c-PARP are significantly reduced.
  • 2D, 2E, and 2F show that when hydrogen peroxide was treated in the presence of delphinidin, the expression levels of the anti-apoptotic protein Bcl-XL and the antioxidant proteins Nrf2 and NF- ⁇ B were significantly increased.
  • 2G and 2H show that the apoptosis rate of cells treated with hydrogen peroxide in the presence of delphinidin is significantly reduced compared to that of cells treated with hydrogen peroxide alone.
  • 3 is a result confirming that delphinidin induces autophagy and protects C28/I2 chondrocytes from apoptosis due to oxidative stress induced by hydrogen peroxide.
  • 3A and 3B show that the expression level of LC3-II, an autophagy marker, is increased when delphinidin is treated.
  • 3C and 3D confirm this through LC3 punctate analysis.
  • 3E, 3F show monodansylcadaverine (MDC) analysis showing the formation of autophagosomes or autolysosomes upon induction of autophagy.
  • Figures 3G, 3H confirms the formation of autophagosomes or autologous lysosomes through acridine orange (AO) staining analysis.
  • MDC monodansylcadaverine
  • FIG. 4 is a result confirming that when autophagy induced by delphinidin is inhibited, apoptosis induced by hydrogen peroxide is increased in C28/I2 chondrocytes.
  • Figure 4A shows that when hydrogen peroxide is treated in the presence of chloroquine, an autophagy inhibitor, cell viability is reduced despite the presence of NAC or delphinidin.
  • Fig. 4B is an analysis of this using a microscope.
  • Figures 4C, 4D show that regardless of NAC or delphinidin, the apoptosis rate in cells treated with hydrogen peroxide in the presence of chloroquine is significantly increased compared to cells treated with hydrogen peroxide alone.
  • 5 is also a result confirming through western blot analysis that when autophagy induced by delphinidin is inhibited, apoptosis induced by hydrogen peroxide is increased in C28/I2 chondrocytes.
  • 5B and 5C show that when autophagy is inhibited by CQ, apoptosis is significantly increased in the hydrogen peroxide-only group or in the hydrogen peroxide-treated group in the presence of NAC or delphinidin.
  • 5D, 5E, and 5F show that after hydrogen peroxide treatment in the presence of NAC, delphinidin or rapamycin, the levels of the anti-apoptotic protein Bcl-XL and the antioxidant response proteins Nrf2 and p-NF- ⁇ B of the group treated with hydrogen peroxide alone indicates a significantly increased And when autophagy is suppressed by CQ, it indicates that the levels of Bcl-XL, Nrf2, and p-NF- ⁇ B are significantly reduced.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis comprising delphinidin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can protect chondrocytes by inhibiting apoptosis caused by oxidative stress, thereby having an excellent effect in preventing or treating osteoarthritis.
  • delphinidin activates the antiapoptotic protein Bcl-XL and the antioxidant response proteins Nrf2 and NF- ⁇ B in chondrocytes, and the proapoptotic proteins casepase-3 and c It is thought that this is because it inhibits -PARP.
  • delphinidin activates autophagy, which removes damaged mitochondria or misfolded proteins that cause the generation of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • pharmaceutically acceptable means exhibiting properties that do not cause serious irritation to the subject, cell, tissue, etc. to which the compound or composition is administered and do not impair the biological activity and physical properties of the compound.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt prepared using a specific compound according to the present invention and a relatively non-toxic acid or base.
  • the pharmaceutically acceptable salt may be, for example, an acid addition salt or a metal salt.
  • Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes. It can be formed from non-toxic organic acids such as dioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • These pharmaceutically non-toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate, chloride, bromide, ioda.
  • an acid addition salt of a compound represented by formula (1) can be obtained by dissolving the compound in an excess aqueous acid solution, and precipitating the salt using a hydrating organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. .
  • the metal salt may be a sodium, potassium or calcium salt.
  • Metal salts can be prepared using a base, for example an alkali metal or alkaline earth metal salt by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt and evaporating the filtrate and/or Or it can be obtained by drying.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays contrast agent-induced nephrotoxicity.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of the subject suspected of nephrotoxicity induced by the contrast agent and the symptoms of the subject are improved or changed to a beneficial effect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. can, but is not limited thereto.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, dextrin, maltodextrin, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • it is prepared using usually used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants, but is not limited thereto.
  • Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., but these solid preparations include at least one or more excipients in the compound, for example, starch, calcium carbonate , sucrose or lactose, gelatin, etc. are mixed and prepared.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate , sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, activity of the drug, and the type of disease in the patient; Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitant drugs and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and generally 1 to 6000 mg per kg of body weight, preferably 60 to 600 mg per kg of body weight, may be administered once or in three divided doses. there is. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, disease severity, sex, weight, age, etc., the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving osteoarthritis comprising delphinidin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • food acceptable means exhibiting properties that do not cause serious irritation to the subject, cell, tissue, etc. to which the compound or composition is administered and do not impair the biological activity and physical properties of the compound.
  • food acceptable salt refers to a salt prepared using a specific compound according to the present invention and a relatively non-toxic acid or base, and may be within the range described above for "salt”.
  • the health functional food of the present invention may be manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. for the purpose of preventing or improving osteoarthritis.
  • the health functional food of the present invention refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients useful for the human body according to Act No. 6727 of the Health Functional Food Act, and contains nutrients for the structure and function of the human body. It refers to ingestion for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as regulation or physiological action.
  • the health functional food of the present invention may contain normal food additives, and unless otherwise specified, whether it is suitable as a food additive is related to the item according to the general rules and general test method of food additives approved by the Food and Drug Administration. It is judged according to the standards and standards.
  • Examples of the items listed in the Food Additives Code include chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, high pigment, and guar gum; Mixed preparations such as sodium L-glutamate preparation, noodles added alkali agent, preservative agent, tar color agent, etc. are not limited thereto.
  • a health functional food in the form of a tablet is granulated in a conventional manner by mixing the composition with an excipient, a binder, a disintegrant and other additives, followed by compression molding by adding a lubricant, or the mixture directly. Compression molding is possible.
  • the health functional food in the form of tablets may contain a corrosive agent and the like, if necessary.
  • hard capsules can be prepared by filling a mixture of the composition and additives such as excipients in conventional hard capsules, and soft capsules are gelatin obtained by mixing the composition with additives such as excipients. It can be prepared by filling in a capsule base such as The soft capsules may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, a preservative, and the like, if necessary.
  • a health functional food in the form of a ring can be prepared by molding a mixture of the composition and an excipient, a binder, a disintegrant, etc. by a known method, and if necessary, it can be coated with sucrose or other skinning agent, or starch , it is also possible to coat the surface with a material such as talc.
  • a health functional food in the form of granules can be prepared in granular form by a conventionally known method by mixing the composition with an excipient, a binder, a disintegrant, etc., and may contain a flavoring agent, a corrosive agent, etc. as necessary.
  • Health functional foods include beverages, meat, chocolate, foods, and sweets. It may be pizza, ramen, other noodles, gums, candies, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes, health supplements, and the like.
  • Health functional foods may be orally applied for the purpose of nutritional supplements, and the application form is not particularly limited.
  • the daily intake is preferably 5000 mg or less, more preferably 2000 mg or less, and most preferably 500 to 1500 mg or 650 mg daily.
  • 1 tablet may be administered with water once a day.
  • C28/I2 human chondrocytes (SCC043) were obtained from Merck and cultured in 5% CO 2 humidified atmosphere in DMEM medium supplemented with 5% (v/v) FBS, 100 units/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin. Cell viability of C28/I2 human chondrocytes was measured using the CCK-8 kit. Cells ( ⁇ 5 ⁇ 10 4 cells/well) in a 96-well plate were combined with other compounds such as NAC, delphinidin chloride, chloroquine or rapamycin and treated with hydrogen peroxide solution.
  • C28/I2 human chondrocytes ( ⁇ 5 ⁇ 10 4 cells/well) were inoculated in a 96-well plate in DMEM medium (200 ⁇ L) supplemented with 5% FBS for 24 hours. After incubation, cells were treated with 500 ⁇ M hydrogen peroxide in the presence or absence of 40 ⁇ M delphinidin and 5 mM NAC, and incubated at 37° C. for 2 hours and 4 hours. Intracellular ROS levels were measured with the DCFDA Cellular ROS Detection Assay Kit (cat. No. ab113851; Abcam, Burlingame, CA, USA).
  • TUNEL terminal uridine nick-end labeling
  • TUNEL analysis was performed to measure apoptosis according to the manufacturer's instructions of the Promega DeadEnd Fluorometric TUNEL assay system for 1 hour. After washing with PBS, a glass cover slip was mounted on a glass slide using a mounting medium containing DAPI. Slides were analyzed under a fluorescence microscope (BX51-DSU; Olympus, Tokyo, Japan). More than 1500 nuclei per field were counted. The experiment was repeated 3 times.
  • C28/I2 human chondrocytes were collected and washed twice with very cold 1x PBS.
  • Total protein was extracted with cell lysis buffer supplemented with protease and phosphatase inhibitor cocktail (Halt's Protease), and protein concentration was determined using the Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) method. did After concentration determination, equal amounts (30 ⁇ g) of total protein were separated by 12% or 10% SDS-PAGE. Target proteins were specifically detected by western blotting using the indicated antibodies. Proteins were visualized with enhanced chemiluminescence detection reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). All protein levels were normalized to ⁇ -actin levels.
  • C28/I2 human chondrocytes were cultured on polylysine-coated coverslips for 24 hours. After incubation, cells were treated with 500 ⁇ M hydrogen peroxide in the presence or absence of 40 ⁇ M delphinidin chloride for 2 hours. After treatment, the cells were washed twice with 1 x PBS, and then fixed with 4% (w/v) paraformaldehyde for 30 minutes. After incubation, cells were washed with 1xPBS and permeabilized with PBS containing 0.1% Trito X-100 for 20 min at room temperature. Cells were blocked with 5% horse serum diluted with PBS for 1 hour, and then incubated with primary antibody overnight at 4C.
  • C28/I2 cells were cultured on coverslips for 24 h and then treated with 500 ⁇ M hydrogen peroxide for 2 h in the presence or absence of delphinidin. After treatment, the cells were washed 3 times with PBS, fixed with 4% formaldehyde, and permeabilized with 100% methanol. For confirmation of autophagy, acridine orange (AO) assay was performed according to the given instructions. Acridine orange (AO) dye was added to the cells at a final concentration of 1 ⁇ g/mL, protected from direct sunlight and incubated at room temperature for 15 min.
  • AO acridine orange
  • Red (acidic vacuole) and green (cytoplasmic) fluorescence images were captured with a confocal microscope (RV-1000; Olympus, Tokyo) using color filters for tetramethylrhodamine (TRITC) and fluorescein isothiocyanate (FITC), respectively.
  • TRITC tetramethylrhodamine
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • C28/I2 cells were inoculated into 6-well plates with sterile coverslips for 24 hours and then treated with 500 ⁇ M hydrogen peroxide in the presence or absence of delphinidin chloride, rapamycin or chloroquine for 2 hours. After treatment, cells were washed 3 times with 1 ⁇ PBS. After washing, autophagic vacuoles were labeled with MDC by incubating cells grown on coverslips with 0.05 mM MDC diluted in PBS at 37 C for 15 min in the dark (protect from direct light exposure). After incubation, the cells were washed 4 times with PBS, and subjected to an inverted fluorescent microscope (Leica).
  • TUNEL assay was performed to confirm apoptosis.
  • the apoptosis rate of cells treated with hydrogen peroxide in the presence of delphinidin was significantly reduced compared to that of cells treated with hydrogen peroxide alone (Fig. 2G,H).
  • LC3-I conjugation of LC3 (LC3-I, unconjugated LC3) and PE (phosphatidylethanolamine) lipids, called LC3-II
  • LC3-II conjugation of LC3 and PE (phosphatidylethanolamine) lipids
  • Autophagy is a well-known stress response and cytoprotective mechanism used by cells under various stresses.
  • this mechanism in chondrocytes treated with hydrogen peroxide in the absence or presence of 5 mM NAC, 40 ⁇ M delphinidin, the autophagy activator rapamycin (100 nM Rapa) or the autophagy inhibitor chloroquine (20 ⁇ M CQ). It was confirmed that autophagy plays a functional role in the anti-apoptotic effect of delphinidin.
  • the viability of cells treated with hydrogen peroxide in the presence of 5 mM NAC, 40 ⁇ M delphinidin and 100 nM rapamycin was significantly increased compared to the viability of cells treated with hydrogen peroxide alone.
  • the autophagy marker LC3 the apoptosis markers c-caspase-3 and c-PARP, and the anti-apoptosis marker Bcl- Western blot analysis was performed for XL and antioxidant response proteins (Nrf2 and p-NF- ⁇ B) ( Figure 5A-F).
  • the levels of apoptosis markers such as c-capse-3 and c-PARP after treatment with hydrogen peroxide in the presence of NAC, delphinidin or rapamycin were significantly reduced compared to those of the group treated with hydrogen peroxide alone.

Abstract

본 발명의 약학 조성물 및 건강기능식품은 산화 스트레스에 의해 유발되는 세포 사멸을 저해하고 자가 포식을 활성화하여 연골 세포를 보호할 수 있어, 골관절염에 대한 우수한 예방, 치료 또는 개선 효과를 갖는다.

Description

골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품
본 발명은 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
관절염은 관절에 염증 및 통증이 발생되어 생기는 질환으로서, 퇴행성 관절염(osteoarthristis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 통풍, 건성 관절염이 있으며, 관절염 환자의 95%가 퇴행성 관절염을 앓고 있다. 퇴행성 관절염(degenerative arthritis)은 관절 연골이 닳아 없어지면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로서, 골관절염(osteoarthritis)이라고도 한다. 퇴행성 관절염은 노령화와 밀접한 연관을 갖는 대표적인 퇴행성 질환으로, 전 인구의 10~15% 정도가 앓고 있으며, 특히 65세 이상의 고령인구 중 60~80% 정도가 퇴행성 관절염을 앓고 있다.
퇴행성 관절염의 원인은 노화 현상이나 과다한 체중과 관계가 깊으며, 나이가 많아질수록 여성에서 많이 발병되고 있다. 초기 증상은 한 개 또는 두 개의 관절이 강직과 함께 쑤시는 듯한 동반 통증이 나타나며, 장기화되면 관절 주변에 골의 과잉형성 및 관절의 변형 등을 초래하게 된다. 퇴행성 관절염이 유발되는 기전으로는 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 생성이 증가하고 콜라게네이즈(collagenase), 스트로멜라이신(stromelysin) 등과 같은 MMPs의 분비가 증가되어 관절연골 기질의 손상을 유발한다.
현재 임상적으로 사용되고 있는 퇴행성 관절염의 치료로는, 진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염증제 등과 같은 약물 치료제나 히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등의 연골보호제를 이용하거나, 관절경 수술, 경골 근위부 절골술, 관절부분 치환술, 슬관절 전치환술 등의 외과적 치료에 의한다. 그러나 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지고 있으며, 연골 보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이다.
본 발명은 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 델피니딘 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 델피니딘 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품.
본 발명의 약학적 조성물 및 건강기능식품은 골관절염에 대한 우수한 예방, 치료 또는 개선 효과를 갖는다.
도 1은 과산화수소 세포 독성 하에서 델피니딘의 C28/I2 연골 세포 보호 효과를 확인한 결과이다. 도 1A은 C28/I2 연골 세포를 NAC의 존재 하에 과산화수소로 처리하였을 때의 세포 생존력이 NAC의 부재 하에 과산화수소로 처리한 것에 비해 높다는 것을 나타낸다. 도 1B는 C28/I2 연골 세포를 NAC의 존재 또는 부재 하에 과산화수소로 처리하였을 때 세포 이미지를 bright-field microscopy를 사용하여 분석한 것이다. 도 1C는 2, 4, 24 시간 동안 C28/I2 세포를 10 μM, 20 μM , 30 μM , 40 μM , 50 μM 델피니딘으로 처리하였을 때 세포 독성이 없다는 것을 나타낸다. 도 1D는 C28/I2 연골 세포를 델피니딘의 존재 하에 과산화수소로 처리하였을 때의 세포 생존력이 델피니딘의 부재 하에 과산화수소로 처리한 것에 비해 높다는 것을 나타낸다. 도 1E는 C28/I2 연골 세포를 델피니딘의 존재 또는 부재 하에 과산화수소로 처리하였을 때 세포 이미지를 bright-field microscopy를 사용하여 분석한 것이다. 도 1F는 NAC 또는 델피니딘의 존재 하에 과산화수소로 처리된 세포에서 상대적인 ROS 수준은 과산화수소만으로 처리된 세포에서 ROS 수준에 비해 상당히 감소한 것을 나타낸다.
도 2는 Nrf2와 NF-ΚB의 활성화를 통한 델피니딘의 산화 스트레스 하의 C28/I2 연골 세포 보호 효과를 확인한 결과이다. 도 2A는 세포 사멸 및 세포 보호에 관여하는 단백질에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이다. 도 2B, 2C는 델피니딘의 존재 하에 과산화수소로 처리한 경우, 전-세포사멸 단백질인 c-caspase-3, c-PARP의 발현 수준이 유의하게 감소함을 나타낸다. 도 2D, 2E, 2F는 델피니딘의 존재 하에 과산화수소로 처리한 경우, 항-세포사멸적 단백질인 Bcl-XL 및 항산화 단백질인 Nrf2와 NF-ΚB의 발현 수준이 유의하게 증가함을 나타낸다. 도 2G, 2H는 델피니딘의 존재 하에서 과산화수소 처리된 세포의 사멸율이 과산화수소만 처리된 세포의 사멸율에 비해 현저히 감소함을 나타낸다.
도 3은 델피니딘이 자가 포식을 유도하고 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스로 인한 세포 사멸로부터 C28/I2 연골 세포를 보호하는 것을 확인한 결과이다. 도 3A, 3B 델피니딘이 처리된 경우, 자가 포식 마커인 LC3-II의 발현 수준이 증가함을 나타낸다. 도 3C, 3D은 이를 LC3 punctate 분석을 통해 확인한 것이다. 도 3E, 3F는 자가 포식 유도 시 자가 포식 소체 또는 자가 리소좀의 형성을 나타내는 MDC(monodansylcadaverine) 분석을 나타낸 것이다. 도 3G, 3H는 자가 포식 소체 또는 자가 리소좀의 형성을 AO(acridine orange) 염색 분석을 통해 확인한 것이다.
도 4는 델피니딘에 의해 유도된 자가 포식을 억제하는 경우, C28/I2 연골 세포에서 과산화수소에 의해 유도된 세포 사멸이 증가됨을 확인한 결과이다. 도 4A는 자가 포식 억제제인 클로로퀸의 존재 하에 과산화수소를 처리하였을 때는 NAC나 델피니딘의 존재에도 불구하고 세포 생존력이 감소됨을 나타낸다. 도 4B는 이를 현미경을 사용하여 분석한 것이다. 도 4C, 4D는 NAC 또는 델피니딘에 관계없이, 클로로퀸의 존재 하에 과산화수소로 처리된 세포에서 세포 사멸 비율은 과산화수소만으로 처리된 세포에 비해 유의하게 증가함을 나타낸다.
도 5 또한 델피니딘에 의해 유도된 자가 포식을 억제하는 경우, C28/I2 연골 세포에서 과산화수소에 의해 유도된 세포 사멸이 증가됨을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 5B, 5C는 CQ에 의해 자가 포식이 억제되는 경우, 과산화수소만 처리된 그룹 또는 NAC나 델피니딘의 존재 하에 과산화수소 처리된 그룹에서 세포 사멸이 유의하게 증가됨을 나타낸다. 도 5D, 5E, 5F는 NAC, 델피니딘 또는 라파마이신의 존재 하에서 과산화수소 처리한 후 항-세포사멸 단백질인 Bcl-XL 및 항산화 반응 단백질인 Nrf2, p-NF-ΚB의 수준이 과산화수소만으로 처리된 그룹의 것보다 유의하게 증가됨을 나타낸다. 그리고 CQ에 의해 자가 포식이 억제되는 경우에는 Bcl-XL, Nrf2, p-NF-ΚB의 수준이 유의하게 감소됨을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 델피니딘(Delphinidin) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 산화 스트레스에 의해 유발되는 세포 사멸을 저해하여 연골 세포를 보호할 수 있어, 골관절염을 예방 또는 치료하는 데 우수한 효과가 있다. 이는 델피니딘이 연골 세포 내의 항-세포사멸 단백질(antiapoptotic protein) Bcl-XL과 항산화 반응 단백질(antioxidant response protein) Nrf2 및 NF-ΚB를 활성화시키고, 전-세포사멸 단백질(proapoptotic protein) casepase-3 및 c-PARP를 저해시키기 때문인 것으로 판단된다. 또한, 활성산소(ROS)의 생성을 유발하는 손상된 미토콘드리아 또는 misfolded proteins 등을 제거하는 자가 포식(autophagy)을 델피니딘이 활성화시키기 때문인 것으로도 판단된다.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 화합물 또는 조성물이 투여되는 개체, 세포, 조직 등에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은, 본 발명에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 예를 들어 산 부가염 또는 금속염일 수 있다.
산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 형성될 수 있다. 이러한 약학적으로 무독한 염은 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피을레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴- 1,4-디오에이트, 핵산-1，6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 를투엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β_하이드톡시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학식 1로 표시되는 화합물의 산 부가염은 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 염을 수화성 유기 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜 수득할 수 있다.
금속염은 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염일 수 있다. 금속염은 염기를 사용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고 여액을 증발 및/또는 건조시켜 수득할 수 있다.
용어 "예방"은 조영제 유발 신독성을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
용어 "치료"는 조영제 유발 신독성 의심 및 발병 개체의 증상이 호전 되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏당 1 내지 6000 mg, 바람직하게는 60 내지 600 mg을 1회 또는 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 델피니딘 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
용어 "식품학적으로 허용 가능한"은 화합물 또는 조성물이 투여되는 개체, 세포, 조직 등에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "식품학적으로 허용 가능한 염"은, 본 발명에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미하며, "염"에 관한 전술한 범위 내일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 골관절염 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품이라 함은, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 상기 조성물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 상기 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 상기 조성물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 상기 조성물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류. 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복함제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
건강기능식품은 영양제의 용도로 경구 적용될 수 있으며, 적용 형태는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 경구 투여되는 경우, 하루 섭취량은 5000mg 이하인 것이 바람직하고, 하루 섭취량이 2000mg 이하인 것이 보다 바람직하며, 하루 섭취량이 500 내지 1500mg, 또는 650mg인 것이 가장 바람직하다. 캡슐제 또는 정제로 제제화하는 경우, 1일 1회 1정을 물과 함께 투여할 수 있다.
상기 델피니딘 및 골관절염 등에 관련된 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 세포 생존력 측정
C28/I2 인간 연골 세포(SCC043)는 Merck로부터 입수하여 5%(v/v) FBS, 100units/mL 페니실린 및 100 μg/mL streptomycin이 보충된 DMEM 배지에서 5% CO 2 가습 대기에서 배양되었다. C28/I2 인간 연골 세포의 세포 생존율을 CCK-8 키트를 사용하여 측정하였다. 96-well plate 내의 세포(~5Х10 4 cells/well)를 NAC, delphinidin chloride, chloroquine 또는 rapamycin과 같은 다른 화합물과 조합하여 과산화수소 용액으로 처리하였다. 100 μL의 배지 및 CCK-8 시약(10 μL)을 함유하는 각 웰을 각 웰에 첨가하고, 세포를 5 % CO 2 가습 대기에서 37 C에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. 세포 생존력은 microplate reader(Hides 1 FN/Chameleon; Turku, Finland)를 사용하여 485 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정되었다.
2. 세포 내 ROS의 결정
C28/I2인간 연골 세포(~5Х10 4 cells/well)를 5% FBS가 보충된 DMEM 배지(200 μL)에서 24시간 동안 96-well plate에 접종하였다. 배양 후, 세포를 40 μM의 델피니딘 및 5 mM NAC의 존재 또는 부재 하에 500 μM 과산화수소로 처리하고, 2시간 및 4시간 동안 37℃ 에서 배양하였다. 세포 내 ROS 수준을 DCFDA 세포성 ROS 검출 분석 키트 (cat. No. ab113851; Abcam, Burlingame, CA, USA)로 측정하였다. DMSO/ phosphate-buffered saline(PBS, 인산완충생리식염수)에 용해된 30 μM DCFDA를 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 37 ℃에서 30분 동안 암 조건에서 배양시킨다. 이어서 플레이트는485/535 nm에서 GloMax® detection system (Model #E 8032; Promega, Sunnyvale,CA, USA)로 판독하였다.
3. TUNEL 분석
세포 사멸을 측정하기 위해 Promega DeadEnd쪠 Fluorometric TUNEL 분석 시스템을 사용하여 TUNEL(terminal uridine nick-end labeling) 분석을 수행하였다. 세포를 커버 슬립(coverslips)에서 24시간 동안 배양한 후 NAC, delphinidin chloride, chloroquine 및 rapamycin의 존재 또는 부재 하에 과산화수소 용액 처리하였다. 세포를 4 %(w/v) paraformaldehyde로 30분 동안 고정시키고, 0.1 % Triton X-100을 함유하는 PBS로 20분 동안 실온에서 투과시켰다. 세포를 PBS로 희석된 5 % horse serum으로 1시간 동안 차단한 후, 1시간 동안 Promega DeadEnd쪠 Fluorometric TUNEL assay system의 제조사의 지시에 따라 세포 사멸을 측정하기 위해 TUNEL 분석을 수행하였다. PBS로 세척한 후, DAPI를 함유하는 봉입제(mounting medium)를 사용하여 유리 커버 슬립을 유리 슬라이드 상에 장착하였다. 슬라이드는 형광 현미경 (BX51-DSU; Olympus, Tokyo, Japan)으로 분석되었다. 필드 당 1500 개 이상의 핵이 계수되었다. 실험은 3 번 반복되었다.
4. 웨스턴 블롯 분석
NAC(N-acetylcysteine), delphinidin chloride, chloroquine 및 rapamycin의 존재 또는 부재 하에 과산화수소 용액으로 처리한 후, C28/I2 인간 연골 세포를 수집하고 아주 차가운 1 x PBS로 2 회 세척하였다. 총 단백질을 protease 및 phosphatase inhibitor cocktail (Halt쪠 Protease)이 보충된 세포 용해 완충액으로 추출하고, Pierce bicinchoninic acid (BCA) 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 농도 결정 후 동일한 양 (30 μg)의 총 단백질을 12 % 또는 10 % SDS-PAGE로 분리했다. 지시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 표적 단백질을 특이적으로 검출하였다. 단백질은 강화된 화학 발광 검출 시약 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 가시화되었다. 모든 단백질 수준을 β - 액틴 수준으로 표준화시켰다.
5. Immunofluorescence staining
C28/I2 인간 연골 세포를 24시간 동안 polylysine이 코팅된 커버 슬립에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 40 μM delphinidin chloride의 존재 또는 부재 하에 2시간 동안 500 μM 과산화수소로 처리하였다. 처리 후, 세포를 1 x PBS로 2회 세척한 다음, 4 %(w/v) paraformaldehyde로 30분 동안 고정시켰다. 배양 후, 세포를 1xPBS로 세척하고, 실온에서 20분 동안 0.1 % Trito X-100을 함유하는 PBS로 투과시켰다. 세포를 1시간 동안 PBS로 희석된 5 % horse serum으로 차단한 다음 4C에서 밤새 1차 항체와 함께 배양하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 실온에서 90분 동안 FITC-접합된 2차 항체(PBS로 1:50 희석)와 함께 배양하였다. 슬라이드를 각각 5분 동안 PBS로 2 회 세척하고, confocal microscope(FV-1000; Olympus, Tokyo)로 이미지를 캡쳐했다.
6. Acridine Orange dye staining
C28/I2 세포를 커버 슬립 상에서 24시간 동안 배양한 다음, 델피니딘의 존재 또는 부재 하에 2시간 동안 500 μM 과산화수소로 처리하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 3 회 세척하고, 4 % formaldehyde로 고정시키고, 100 % 메탄올로 투과하였다. 자가 포식의 확인을 위해, 주어진 지시에 따라 acridine orange(AO) 분석을 수행하였다. Acridine orange(AO) 염료를 1 μg/mL의 최종 농도로 세포에 첨가하고, 직사광선으로부터 보호하여 15분 동안 실온에서 배양하였다. 적색(산성 액포) 및 녹색(세포질) 형광 이미지는 각각 TRITC(Tetramethylrhodamine) 및 FITC(Fluorescein isothiocyanate)에 대한 컬러 필터를 사용하여 confocal microscope (RV-1000; Olympus, Tokyo) 으로 캡쳐했다. 그런 다음, 겹친 이미지를 NIH Image J 소프트웨어를 사용하여 처리하고 정량화했다.
7. Autophagic Vacuoles에 대한 Monodansylcadaverine(MDC) 염색
C28/I2 세포를 24시간 동안 멸균 커버 슬립이 있는 6-well plates에 접종한 다음, delphinidin chloride, rapamycin 또는 chloroquine의 존재 또는 부재 하에 2시간 동안 500 μM 과산화수소로 처리하였다. 처리 후, 세포를 1 x PBS로 3 회 세척하였다. 세척 후, 자가 포식 액포를 어두운 곳에서 15분 동안 37 C에서 PBS로 희석한 0.05 mM MDC를 갖는 커버 슬립 상에서 성장된 세포를 배양함으로써 MDC로 표지하였다(빛에 직접 노출되는 것을 보호). 배양 후, 세포를 PBS로 4 회 세척하고, inverted fluorescent microscope (Leica).
8. 통계 분석
각 실험은 적어도 세 번 수행되었다. 대표 데이터는 평균 ± 표준편차(±SD)로 표현하였다. 두 그룹 간의 차이는 two-tailed Student's t-test를 사용하여 평가되었다. One-way analysis of variance (ANOVA)를 사용하여 세 그룹 이상의 평균을 비교한 다음 Tukey's multiple comparison tests를 수행하였다. p-value of < 0.05 및 p-value of < 0.01은 유의한 것으로 간주하였다. 모든 통계적 분석은 SPSS 18.0 for Windows (SPSS, Chicago, IL, USA)로 수행되었다.
결과
1. 산화적 스트레스(Oxidative stress) 하의 연골 세포(Chondrocytes)의 세포 보호 효과
먼저, 인간 연골 세포에 대한 과산화수소의 세포 독성 효과를 시험하기 위해, 세포를 5 mM NAC의 존재 또는 부재 하에 2시간 및 4시간 동안 250 μM 또는 500 μM 과산화수소로 처리하였다. 과산화수소를 처리한 후 세포 생존율이 시간 및 용량에 의존적으로 현저히 감소하였다. 그러나, NAC의 존재 하에 과산화수소로 처리된 세포는 세포 생존력이 현저히 증가하였다(도 1A,B). 세포 형태 및 손상의 현미경 분석은 과산화수소 처리가 이들 세포에 세포 독성이 있는 반면, 도 1B에서 보이는 바와 같이, NAC는 과산화수소 처리된 세포에 대해 세포 보호 효과를 가짐을 밝혀냈다. 이들 세포에서 과산화수소의 독성 효과는 ROS(oxidative stress)의 축적에 의해 야기되는데, 잘 알려진 항산화제인 NAC가 과산화수소 처리된 세포의 생존력을 상당히 증가시켰다.
델피니딘의 세포 보호 역할을 추가로 조사하기 위해, 다른 농도(10-75 μM)의 델피니딘으로 세포를 처리하여 세포 독성 효과를 확인하였다. 흥미롭게도, 2, 4, 24시간 동안 50 μM의 농도가 될 때까지 델피니딘의 세포 독성은 관찰되지 않았으며, 75 μM에서 약간 감소했다(도 1C). 이후 모든 실험에서 40 μM 델피니딘을 사용했다. 델피니딘의 세포보호 역할을 시험하기 위해, C28/I2 연골 세포를 2시간 및 4시간 동안 40 μM 델피니딘의 존재 또는 부재 하에 500 μM 과산화수소로 처리하였다. 예상한 바와 같이, 델피니딘 존재 하에서 과산화수소 처리된 세포의 생존력은 델피니딘 부재 하에서 과산화수소 처리된 세포에 비해 현저히 증가하였다. 세포 형태의 현미경 분석 또한 델피니딘의 세포 보호 역할을 시사한다(도 1D,E). 종합해보면, 이러한 결과들은 델피니딘이 산화적 스트레스 하의 C28/I2 연골세포에서 세포 보호 역할을 가진다는 것을 시사한다.
연골 세포에서 델피니딘의 세포 보호 역할이 항산화 활성에 의한 것인지 여부를 추가로 조사하기 위해, 세포를 5 mM NAC(잘 알려진 항산화제) 및 40 μM 델피니딘의 부재 또는 존재 하에 500 μM 과산화수소로 처리하였다. 흥미롭게도, NAC 또는 델피니딘의 존재 하에 과산화수소로 처리된 세포에서 상대적인 ROS 수준은 과산화수소만으로 처리된 세포에서 ROS 수준에 비해 상당히 감소하였다(도 1F). 이 결과는 연골 세포에서 델피니딘의 세포 보호 효과가 항산화 활성에 의한 것임을 분명히 시사한다.
2. 산화적 스트레스 하의 연골 세포에서 세포 사멸(apoptotic cell death) 억제효과
과산화수소에 의해 유도된 연골 세포의 세포 사멸에 대한 델피니딘의 효과를 조사하기 위해, 세포 사멸 및 세포 보호(항산화 반응)에 관여하는 단백질에 대해 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 수행하였다. 결과는 과산화수소로 처리한 후 전-세포사멸적 단백질(proapoptotic proteins) (c-caspase-3 및 c-PARP)의 발현 수준이 유의하게 증가함을 보여주었다. 그러나, 델피니딘의 존재 하에서, 이들 단백질의 발현 수준은 상당히 감소되었다(도 2A-C). 또한, 과산화수소 처리 후 항-세포사멸적 단백질(antiapoptotic protein)인 Bcl-XL 및 항산화 단백질(Nrf2 및 p-NF-ΚB)의 수준이 유의하게 감소하였다. 그러나, 델피니딘의 존재 하에서 이들 단백질의 수준은 유의하게 증가하였다(도 2A,D-F). 이러한 결과는 델피니딘이 Nrf2 및 p-NF-ΚB의 활성화를 통해 연골 세포에서 항-세포사멸적 역할을 한다는 것을 분명히 시사한다.
연골 세포에서 델피니딘의 항-세포사멸적 역할을 추가적으로 조사하기 위해, 세포사멸 확인을 위한 TUNEL 분석을 수행하였다. 흥미롭게도, 델피니딘의 존재 하에서 과산화수소 처리된 세포의 사멸율은 과산화수소만 처리된 세포의 사멸율에 비해 현저히 감소하였다(도 2G,H). 이러한 결과는 연골 세포에서 델피니딘의 항-세포사멸적 역할을 더욱 명확하게 한다.
3. 자가 포식(Autophagy) 유도를 통한 산화적 스트레스 하의 연골 세포 보호 효과
델피니딘의 세포 보호 활성을 추가로 시험하기 위해, 델피니딘의 존재 및 부재 하에서 과산화수소 처리에 의해 유도된 자가 포식을 4시간 동안 측정하였다. 먼저, LC3-II라고 불리는, LC3(LC3-I, unconjugated LC3)과 PE(포스파티딜 에탄올아민, phosphatidylethanolamine) 지질의 접합(conjugation)을 평가했다. 흥미롭게도, 잘 알려진 자가 포식 마커인 LC3-II의 발현 수준은 델피니딘만 처리된 그룹과 델피니딘의 존재 또는 부재 하에서 과산화수소로 처리된 그룹에서 유의하게 증가하였다(도 3A,B). 이들 데이터는 LC3 punctate 분석뿐만 아니라, 자가 포식 유도 시 자가 포식 소체(autophagosomes) 또는 자가 리소좀(autolysosomes)의 형성을 나타내는 MDC(monodansylcadaverine) 및 아크리딘 오렌지(AO, acridine orange) 염색 분석에 의해 추가로 확인되었다. 일단 LC3와 PE가 접합되면, 이들은 자가 포식 소체로 불리는 세포 내 이중 막 구조로 합쳐지고, 이어서 리소좀과 융합된 자가 리소좀으로 합쳐진다. 상기에 나타낸 바와 같이, 델피니딘 자체는 LC3 puncta를 유의하게 증가시키고, 연골 세포가 40 μM 델피니딘 및 500 μM 과산화수소와 함께 배양될 때 이들 punctate 수를 추가로 촉진시켰다(도 3C,D). 또한, MDC 또는 AO 염료 염색 분석은 델피니딘 및 과산화수소의 처리를 통한 자가 리소좀의 유사한 형성을 보여주었다(도 3E-H). 이들 결과는 델피니딘에 의해 유도된 자가 포식이 산화적 스트레스 조건 하의 연골 세포에서 세포 보호 기전과 관련 될 수 있음을 나타낸다.
4. 자가 포식 활성화에 의해 조절되는 델피니딘의 세포 보호 역할
자가 포식은 다양한 스트레스 하에서 세포가 사용하는 잘 알려진 스트레스 반응 및 세포 보호 기전이다. 이러한 기전에서, 5 mM NAC, 40 μM 델피니딘, 자가 포식 활성제인 라파마이신(rapamycin, 100 nM Rapa) 또는 자가 포식 억제제 클로로퀸(chloroquine, 20 μM CQ)의 부재 또는 존재 하에 과산화수소로 처리된 연골 세포에서의 델피니딘의 항세포사멸 효과에서 자가 포식이 기능적 역할을 수행함을 확인했다. 흥미롭게도, 5 mM NAC, 40 μM 델피니딘 및 100 nM 라파마이신의 존재 하에 과산화수소로 처리된 세포의 생존력은 과산화수소만 처리된 세포의 생존력과 비교하여 유의하게 증가되었다. 그러나, 세포가 과산화수소 및 20 μM 클로로퀸(CQ)으로 처리 되었을 때, 5 mM NAC, 40 μM 델피니딘의 존재에도 불구하고, 세포의 생존력은 클로로퀸으로 처리되지 않은 세포의 생존력과 비교하여 현저하게 감소되었다(도 4A). 세포의 현미경 형태 검사에서 동일한 결과가 관찰되었다(도 4B). 이러한 결과는 자가 포식이 세포 보호에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 또한 TUNEL 분석을 사용하여 세포 보호에서 자가 포식의 효과를 조사했다. 예상한 바와 같이, NAC의 존재 하에 과산화수소로 처리된 TUNEL-양성 세포의 세포 사멸율은 유의하게 감소되었다. 또한, 델피니딘 및 자가 포식 활성제인 라파마이신은 과산화수소만을 처리한 것에 비해 세포 사멸 비율을 유의하게 감소시켰다. 그러나, NAC 또는 델피니딘에 관계없이, 자가 포식 억제제인 클로로퀸의 존재 하에 과산화수소로 처리된 세포에서 세포 사멸 비율은 과산화수소만으로 처리된 세포에 비해 유의하게 증가하였다. 이 결과들은 자가 포식의 세포 보호 역할을 추가적으로 시사한다(도 4C,D).
산화적 스트레스에 대한 델피니딘의 효과에 관련된 자가 포식 활성화의 세포 보호 역할을 조사하기 위해, 자가 포식 마커인 LC3, 세포 사멸 마커인 c-caspase-3와 c-PARP, 항-세포사멸 마커인 Bcl-XL 및 항산화 반응 단백질(Nrf2 및 p-NF-ΚB)에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(그림 5A-F). 흥미롭게도, NAC, 델피니딘 또는 라파마이신의 존재 하에 과산화수소로 처리한 후의 c-capse-3 및 c-PARP와 같은 세포 사멸 마커의 수준이 과산화수소만으로 처리된 그룹의 것보다 현저하게 감소하였다. 한편, NAC, 델피니딘 또는 라파마이신의 존재 하에서 과산화수소 처리한 후 항세포사멸 단백질(Bcl-XL) 및 항산화 반응 단백질(Nrf2 및 p-NF-ΚB)의 수준이 과산화수소만으로 처리된 그룹의 것보다 유의하게 증가하였다(도 5A,D-F). 그러나, CQ에 의한 자가 포식의 억제는 과산화수소만 처리된 그룹에서 또는 NAC나 델피니딘의 존재 하에 과산화수소 처리된 그룹에서 이들 세포의 사멸을 유의하게 증가시켰지만(도5A-C), 항-세포사멸 단백질 Bcl-XL 및 항산화 반응 단백질(Nrf2 및 p-NF-ΚB)의 수준을 유의하게 감소시켰다(도 5A,D-F). 이러한 결과는 델피니딘이 자가 포식을 활성화시킬 수 있으며, 이는 산화적 스트레스로부터 인간 연골 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 명백히 입증한다.

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  1. 델피니딘(Delphinidin) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 델피니딘(Delphinidin) 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 골관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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