WO2022049340A1 - Procédé de nourrissage d'un plathelminthe et extrait de plathelminthe dépourvu de microorganismes pathogènes pour l'homme - Google Patents

Procédé de nourrissage d'un plathelminthe et extrait de plathelminthe dépourvu de microorganismes pathogènes pour l'homme Download PDF

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WO2022049340A1
WO2022049340A1 PCT/FR2021/051497 FR2021051497W WO2022049340A1 WO 2022049340 A1 WO2022049340 A1 WO 2022049340A1 FR 2021051497 W FR2021051497 W FR 2021051497W WO 2022049340 A1 WO2022049340 A1 WO 2022049340A1
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extract
flatworms
flatworm
yeast
human
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PCT/FR2021/051497
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Didier Raoult
Pierre Edouard FOURNIER
Eric GHIGO
Original Assignee
Fondation Mediterranee Infection
Aix-Marseille Universite
Eric GHIGO
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Definitions

  • the present invention relates to a method of feeding a flatworm and a flatworm extract free of pathogenic microorganisms for humans, useful in the fields of pharmacy, cosmetics and nutraceuticals.
  • plaquehelminthes designates a phylum of flatworms which comprises four classes: rhabditophora (formerly “turbellarians”) such as planaria, monogeneans which are parasites of aquatic organisms, trematodes (flukes, digeneans) which are parasites like the liver fluke, and cestodes like the tapeworm or tapeworm.
  • Planarians are aquatic flatworms belonging to several species in the class Rhabditophora. They can be swimmers or crawlers, and live at sea, in fresh water, or in very humid soils (in tropical forests). Planarians are known for their regenerative abilities. They are able to perpetually regenerate themselves, and any part of their body, due to the presence of a large amount of stem cells (20-30%) in their tissues compared to other living organisms for which the amount of stem cells is of the order of Ippm. Planarian stem cells multiply and regenerate continuously, unlike the stem cells of more evolved organisms, which multiply little or not at all. The biochemical factors allowing the multiplication of stem cells in a planarian remain unidentified.
  • Patent application WO2019016346 describes an aqueous extract of planaria, non-parasitic and non-pathogenic in humans, in particular of the species Schmidtea mediterranea, capable of activating the multiplication of human stem cells and which therefore presents, an activity cell regeneration useful in many cosmetic, pharmaceutical or nutraceutical applications.
  • a first object of the present invention relates to a method of feeding flatworms, in which the flatworms are fed exclusively with malted yeast.
  • a second object of the present invention relates to a process for the preparation of a flatworm extract, comprising the steps of:
  • a third object of the present invention relates to an extract of flatworms fed exclusively with malted yeast which can be obtained by implementing the method according to the second object of the invention, said flatworms being devoid of pathogenic microorganisms for the man.
  • a fourth object of the present invention relates to a composition
  • a composition comprising one or more flatworms fed exclusively with malted yeast, said flatworm or flatworms being free of pathogenic microorganisms for humans.
  • a fifth object of the present invention relates to a composition comprising an extract according to the invention.
  • a sixth object of the present invention relates to a process for eliminating pathogenic microorganisms present in one or more flatworms, said process comprising a step which consists in feeding one or more flatworms, preferably exclusively, with malted yeast for sufficient time to eliminate said pathogenic microorganisms.
  • a seventh object of the present invention relates to a process for the preparation of a flatworm extract according to the invention, comprising the steps of:
  • step (b) preparing a flatworm extract from the flatworms obtained in step (a).
  • An eighth object of the present invention relates to the use of an aqueous extract according to the invention or of a composition comprising an extract according to the invention, to cultivate human or animal cells in vitro or ex vivo.
  • a ninth object of the present invention relates to an extract according to the invention or a composition comprising an extract according to the invention, for its use as a medicament, for example to be used to promote the healing of a skin wound. or a skin burn.
  • the term “platyhelminth” designates a flatworm of the phylum of the same name.
  • the flatworm can be of the class of rhabditophora, preferably it is a planarian.
  • the flatworm according to the invention is non-parasitic and/or non-pathogenic in humans.
  • the flatworm according to the invention is a flatworm belonging to one of the following species Schmidtea mediterranea, Dugesia japonica, Dendricoelum lacteum, Polycelis nigra, Polycelys tenuis and Planaria torva, preferably to the species Schmidtea mediterranea.
  • Malted yeast or “beer yeast” is well described in the literature, it is the result of the culture of Saccharomyces cerevisiae with malt, generally barley malt. It usually comes in the form of flakes and is widely used in vegetarian diets.
  • the malted yeast according to the present invention can be in any form suitable for feeding flatworms, for example in the form of powder, flakes, granules or in liquid form, for example obtained by mixing flakes with water.
  • the yeasts present in the malted yeast are said to be “active”, that is to say that they are alive.
  • platyhelminth devoid of pathogenic microorganisms for humans designates a platyhelminthe whose digestive tract is devoid of microorganisms pathogenic for humans, that is to say a platyhelminthe whose microbiota is devoid of pathogenic microorganisms for humans.
  • the pathogenic microorganisms for humans are Aeromonas veronii, Staphylococcus capitis, Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter guillouiae, Aeromonas hydrophila, Delftia acidovorans, Comamonas testosteroni, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus and Staphylococcus haemolyticus.
  • the microbiota of the flatworm of the invention is therefore devoid of the set of pathogenic microorganisms mentioned above.
  • extract refers to the product resulting from the extraction of cell contents.
  • extract of one or more flatworms designates the product resulting from the extraction of the contents of the cells of said flatworm or flatworms.
  • composition means a composition comprising a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic agent is administered.
  • These vehicles can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, etc.
  • Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid vehicles, especially for injection solutions.
  • Pharmaceutically acceptable excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skimmed milk powder, glycerol, propylene glycol, l water, ethanol and the like.
  • tablets or capsules may be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable excipients such as binding agents (e.g.
  • pregelatinized cornstarch polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose
  • fillers eg lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate
  • lubricants eg, magnesium stearate, talc or silica
  • disintegrants eg potato starch or sodium starch glycolate
  • wetting agents eg, sodium lauryl sulfate.
  • the tablets can be coated by methods well known in the state of the art.
  • Liquid preparations for oral administration may take the form of, for example, solutions, syrups or suspensions, or may be presented as a dry product to be reconstituted with water or another suitable vehicle before use.
  • Such liquid preparations can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable vehicles such as suspending agents (eg sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifying agents (for example, lecithin or acacia); non-aqueous vehicles (eg almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils); and preservatives (eg methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid).
  • suspending agents eg sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats
  • emulsifying agents for example, lecithin or acacia
  • non-aqueous vehicles eg almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils
  • preservatives eg methyl or propyl p-hydroxybenzoates or sorbic acid.
  • the pharmaceutical compositions may also contain buffering salts, flavorings, colorings and sweeteners, as appropriate.
  • treat or “treatment” encompasses any beneficial or desirable effect on a disease or disease state, and may even include a minimal reduction in one or more measurable markers of the disease or disease state.
  • the treatment may, for example, involve either reducing or ameliorating the symptoms of the disease or disease state, or delaying the progression of the disease or disease state.
  • treatment does not necessarily mean the complete eradication or cure of the pathology, nor of the associated symptoms.
  • the present invention does not require the use of antibiotics to obtain flatworms free of pathogenic microorganisms for humans.
  • the flatworms of the present description are therefore not only devoid of pathogenic microorganisms for humans, but also devoid of antibiotics.
  • Flatworms can be alive or dead. It can for example be frozen, freeze-dried and/or dried.
  • the flatworm is advantageously devoid of the following pathogenic microorganisms for humans: Aeromonas veronii, Staphylococcus capitis, Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter guillouiae, Aeromonas hydrophila, Delftia acidovorans, Comamonas testosteroni, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus and Staphylococcus haemolyticus.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising one or more flatworms fed exclusively with malted yeast, said flatworm(s) being free of pathogenic microorganisms for humans.
  • compositions comprising the flatworm(s) in their environment, for example a composition comprising water, at least one flatworm according to the invention and optionally malted yeast. It may for example be a composition comprising one or more flatworms according to the present description and exclusively malted yeast as food for the flatworm(s).
  • composition can be in different forms, for example in liquid form or in freeze-dried form. In freeze-dried form, the composition may additionally comprise a lyoprotectant, such as an unnatural lyoprotectant.
  • a lyoprotectant such as an unnatural lyoprotectant.
  • An object of the present invention relates to a method of feeding flatworms, in which the flatworms are fed exclusively with malted yeast.
  • the inventors have tested the following foods: baker's yeast, spirulina, soy protein, soy milk, tofu, oatmeal, malt and none of these foods have been accepted as perennial foods by flatworms. Consequently, these foods do not make it possible to obtain one or more flatworms devoid of an element of animal origin.
  • the feeding method according to the invention comprises a step which consists in feeding the flatworms for a sufficient period of time to eliminate the microorganisms pathogenic for F Man and/or eliminate the elements of animal origin.
  • the flatworms are fed at least once a week, preferably at least twice a week, with an amount of malted yeast ranging from 0.10 mg yeast/400 flatworms to 0. 20 mg yeast/400 flatworms, preferably an amount of 0.15 mg yeast/400 flatworms.
  • Flatworms are fed for the time necessary to be free of pathogenic microorganisms for humans.
  • the flatworms are fed for at least one week, preferably for at least 2 weeks, for example for 4 weeks.
  • flatworms are deprived of all food for at least a week before being fed the malted yeast.
  • Another object of the present invention relates to a process for the preparation of an extract of flatworms, comprising the steps of:
  • step (ii) preparing a flatworm extract from the flatworms obtained in step (i).
  • Step (ii) of preparing the extract is described in more detail in the “Platworm extract” section below.
  • Another object of the invention relates to an extract of flatworms fed exclusively with malted yeast capable of being obtained by implementing the process for preparing a flatworm extract according to the invention, said flatworms being devoid of pathogenic microorganisms for humans.
  • the extract according to the invention can for example be an aqueous extract.
  • the extract according to the invention is antibiotic-free.
  • the absence of antibiotic within the extract according to the invention makes it particularly suitable for use in humans or animals.
  • the extract according to the invention is devoid of elements of animal origin other than those relating to the flatworm itself. This advantageously makes it possible to have an extract that is particularly suitable for use in vegan products, that is to say products that do not include any ingredient of animal origin, such as vegan cosmetic products.
  • Step (i) can be implemented with any crushing method allowing the flatworm cells to burst and their contents to be released, for example by shaking flatworms with glass beads.
  • Step (ii) can be implemented by centrifuging and/or filtering the ground material.
  • the extract according to the invention is cleared of any insoluble solid debris, in particular cleared of membrane debris resulting from the bursting of flatworm cells.
  • the preparation process may comprise at least one solid/liquid separation step, for example one or more membrane filtration steps having an appropriate cut-off threshold, for example a cut-off threshold of 1.20 ⁇ m , for example 0.80 ⁇ m, 0.45 ⁇ m, 0.2 ⁇ m.
  • Filtration makes it possible to obtain an extract which contains particles of a size less than the cut-off threshold of the filter used, for example particles of a size of less than 1.20 ⁇ m, for example less than 0.80 ⁇ m, less than 0.45, less than pm 0.2 pm.
  • Step (iii) can be carried out by evaporation or by adding a suitable solvent, for example water.
  • Example 3 describes a process for the preparation of a flatworm extract according to the invention.
  • the extraction conditions will be chosen so that the extract obtained has the desired concentration in the intended application.
  • the protein concentration of the crude extract can vary in particular depending on the quantity of flatworm used (for example, during an aqueous extraction, when the ratio flatworm/water is increased, the protein concentration of the extract increases also), the extraction time (for example, an increase in the extraction time during an aqueous extraction generally makes it possible to increase the protein concentration of the extract) and/or the extraction temperature (for example , an increase in the extraction temperature during an aqueous extraction generally makes it possible to increase the protein concentration of the extract).
  • the crude extract contains 1 mg to 50 mg of protein per mL of extract (mg/mL).
  • the absorbance at the characteristic wavelength of 280 nm i.e. A280nm is commonly used to estimate the total protein concentration in the extract.
  • the extract obtained can be more or less concentrated in proteins depending on the intended use.
  • the extract may in particular comprise between 15 mg of proteins per mL of extract (mg/mL) and 20 mg/mL.
  • the crude extract can be diluted or even concentrated depending on the intended use.
  • the extract according to the invention comprises from 15 pg of protein per mL of extract (pg/mL) to 50 mg of protein per mL of extract (mg/mL), for example from 15 pg/mL to 20 mg/L, for example from 15 pg/mL to 1 mg/L, for example from 15 pg/mL to 0.3 mg/L.
  • the extract according to the invention comprises less than 0.5 mg of protein per mL of extract (mg/mL), for example less than 0.3 mg/mL, for example between 15 pg/mL and 0.3 mg/mL, preferably from 15 pg mg/mL to 75 pg/mL. Complete dehydration of this extract makes it possible to obtain an extract in powder form.
  • the extract according to the invention has a MALDI TOF spectrum corresponding to the data presented in Table 1.
  • M/z ratios (mass in Dalton/charge) on the abscissa of the various characteristic peaks of the spectrum; S/N: ratios (peak intensity/background noise intensity) of the different characteristic peaks of the spectrum.
  • composition comprising an extract of flatworms
  • the invention also relates to a composition comprising an extract according to the invention.
  • the composition is a cosmetic and/or dermatological composition and may comprise one or more carriers and/or excipients suitable for the targeted use.
  • the composition can be in the form of a gel, lotion, cream, ointment, paste or soap.
  • the composition according to the invention may comprise various usual excipients suitable for external topical administration, in particular excipients that are dermatologically and/or cosmetologically acceptable.
  • compositions according to the invention are well known to those skilled in the art and include, for example, agents promoting penetration at the level of the skin, moisturizing agents, thickening agents, stabilizing agents, emollient agents and surfactants, emulsifying agents, preservatives, pH adjusting agents, etc.
  • the composition according to the invention is formulated in the form of a cream comprising the extract of the invention and at least the following excipients: an emulsifying agent, an emollient agent, a thickening agent, a moisturizing agent and optionally a preservative. .
  • the composition according to the invention is formulated in the form of comprising the extract of the invention and at least the following additional excipients: a gelling agent, a thickening agent, a moisturizing agent and optionally a preservative.
  • the composition according to the invention may also comprise other compounds suitable for cosmetic and/or dermatological use, such as radical scavengers, antioxidant vitamins such as vitamin E, vitamin C, antioxidant agents such as natural polyphenols, enzymes, plant active ingredients, natural anti-inflammatory substances, alcohols, polyols, esters, electrolytes, oils polar and non-polar, polymers, copolymers, phospholipids, colorants, perfumes and/or skin peeling agents.
  • the composition is a nutraceutical composition (or dietary supplement) and may comprise one or more carriers and/or excipients suitable for the targeted use.
  • the composition must therefore be able to be ingested. It can come in different galenic forms, such as a dispersion, a capsule, a cachet, a powder, a tablet, etc.
  • the nutraceutical composition can also be in the form of a food, such as a yogurt, a cereal bar, a gel, a candy, a chewing gum, etc.
  • the composition is a pharmaceutical composition and may comprise a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • Acceptable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene glycol, water, ethanol and the like.
  • the tablets or capsules may be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable excipients such as binding agents (e.g.
  • pregelatinized corn starch polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose
  • bulking agents eg, lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate
  • lubricants eg, magnesium stearate, talc or silica
  • disintegrants eg, potato starch or sodium starch glycolate
  • wetting agents eg, sodium lauryl sulfate
  • Tablets can be coated by methods well known in the art.
  • Liquid preparations for oral administration may take, for example, the form of solutions, syrups or suspensions, or they may be presented as a dry product to be reconstituted with water or another suitable vehicle before use.
  • liquid preparations can be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable additives such as suspending agents (eg, sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifying agents (for example, lecithin or acacia); non-aqueous vehicles (eg, almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils); and preservatives (eg, methyl or propyl-p-hydroxybenzoates or sorbic acid).
  • suspending agents eg, sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats
  • emulsifying agents for example, lecithin or acacia
  • non-aqueous vehicles eg, almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils
  • preservatives eg, methyl or propyl-p-hydroxybenzoates or sorbic acid.
  • the preparations may also contain buffering salts, flavoring, coloring and sweetening agents, as appropriate.
  • composition according to the invention may also comprise a cell culture medium, preferably a culture medium capable of cultivating human or animal cells.
  • a cell culture medium preferably a culture medium capable of cultivating human or animal cells.
  • the invention also relates to a process for eliminating pathogenic microorganisms present in one or more flatworms, said process comprising a step which consists in feeding one or more flatworms, preferably exclusively, with malted yeast for a sufficient period to eliminate said pathogenic microorganisms.
  • the method according to the invention does not require the use of antibiotics in order to have a platyhelminth devoid of pathogenic microorganisms for humans.
  • the flatworms are fed at least once a week, preferably at least twice a week, with an amount of malted yeast ranging from 0.10 mg yeast/400 flatworms to 0. 20 mg yeast/400 flatworms, preferably an amount of 0.15 mg yeast/400 flatworms.
  • Flatworms are fed for the time necessary to be free of pathogenic microorganisms for humans.
  • the flatworms are fed for at least one week, preferably for at least 2 weeks, for example for 4 weeks.
  • flatworms are deprived of all food for at least a week before being fed the malted yeast.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a flatworm extract according to the invention, comprising the steps of:
  • Step (b) of preparing the extract is described in more detail in the “Platworm extract” section above.
  • the invention also relates to the use of an extract according to the invention or of a composition comprising an extract according to the invention, for cultivating human cells or animals in vitro or ex vivo.
  • the invention relates to the use of an extract according to the invention or of a composition comprising an extract according to the invention, for cultivating human or animal cells in vitro or ex vivo, in which said human cells do not are not human embryonic stem cells requiring the destruction of a human embryo and having the capacity to develop into a human being.
  • the extract can for example be used to regenerate human or animal cells, for example by stimulating their differentiation, growth, multiplication and/or proliferation.
  • the extract is used to regenerate human dental stem cells.
  • Human or animal cells can be any type of cell, for example stem cells or differentiated cells.
  • stem cells considered are human stem cells, these are not human embryonic stem cells requiring the destruction of a human embryo and having the capacity to develop into a human being.
  • differentiated cells reference may in particular be made to epithelial cells, fibroblasts, keratinocytes, endothelial cells, neuronal cells or nerve cells.
  • Another object of the present invention relates to the use of an extract according to the invention or of a composition comprising an extract according to the invention as an anti-aging agent, healing agent and/or agent for regenerating human cells. or animal, wherein said extract or said composition is applied topically.
  • topical route refers to an application to the skin, the mucous membranes, the superficial body growths such as the nails, body hair and hair, preferably the skin, for example an application to healthy skin.
  • a person skilled in the art will be able to determine the quantity and frequency of application depending on the anti-ageing, healing and/or regenerating effect sought and the type of cells targeted.
  • the anti-aging, healing and/or regenerating effects can be measured by analyzing the expression of one or more genes whose role in cell aging, healing or cell proliferation is known.
  • a cosmetic process for treating the skin for example healthy skin, to fight against the signs of skin aging, and in particular the expression wrinkles caused by uncontrolled facial muscle contractions, consisting in apply to the areas of the skin requiring such treatment, a cosmetic composition according to the invention.
  • the invention also relates to an extract according to the invention or a composition comprising an extract according to the invention, for its use as a medicament.
  • the extract or composition may be formulated for parenteral administration, for example intravascular (intravenous or intra-arterial), intraperitoneal, intramuscular, enteral or topical administration.
  • parenteral administration for example intravascular (intravenous or intra-arterial), intraperitoneal, intramuscular, enteral or topical administration.
  • the administration or the application can be done in one go or, more generally, in several times.
  • the duration of treatment may vary depending on the pathology being treated and the subject being treated.
  • the extract or the composition can be used as monotherapy or in combination with drugs whose therapeutic interest is recognized in the pathology considered.
  • the invention relates to an extract according to the invention or a composition comprising an extract according to the invention, for its use to promote the healing of a skin wound or a skin burn.
  • Topical administration is preferred in this indication.
  • Example 1 Analysis of microorganisms contained in planarians fed with different diets
  • a first group of 400 flatworms (Schmidtea mediterranea) were fed twice a week, for 2 weeks, with 0.15 g of malted yeast (Markal - Levure Maltée de Bière - Paillettes 250g), i.e. 0.0375g/100 planarians/feeding.
  • a second group of 400 flatworms (Schmidtea mediterranea) were fed twice a week, for 2 weeks, with calf liver (SAPRIMEX company, Italy) at 0.40mg/400 flatworms/feeding.
  • Each of the inoculations is incubated under three different temperature conditions (19°C, 28°C and 37°C) and under two contions of incubation time (24 h and 48 h), namely 24 h at 19° C, 24 h at 28°C, 24h at 37°C, 48h at 19°C, 48h at 28°C or 48h at 37°C.
  • Each individual bacterial colony was harvested and identified by MALDI-TOF-MS (Microflex Spectrometer; Bruker Daltonics, Bremen, Germany). The spectra obtained were imported into the MALDI Biotyper 3.0 software (Bruker Daltonics) and analyzed against the reference spectra of the bacteria included in the database (Bruker database constantly updated with the Mediterranean-Infection database.
  • MALDI Biotyper RTC software was used to interpret the results based on the scores obtained: a colony was probably identified at the species level for a score >2.0, probably identified for a score between 1.99 and 1 .7, but not identified for a score ⁇ 1.7.
  • Planarians fed the malted yeast were free of bacteria that could be pathogenic to humans.
  • Planarians fed with malted yeast included a single bacterial species, non-pathogenic to humans: Pseudomonas brenneri.
  • Urmitella massiliensis Urmitella massiliensis, Paenibacillus polymyxa and Micrococcus luteus have been found in malted yeast given to planarians, but these bacteria were not found in planarians after feeding with malted yeast.
  • Dugesia japonica planarians exclusively with malted yeast eliminated pathogenic microorganisms for humans. These planarians devoid of pathogenic microorganisms for humans are particularly suitable for the preparation of an extract of planarians which does not present a risk for humans.
  • the malted yeast is inactivated by heat treatment at a temperature of 50°C for 1 hour.
  • Feeding planarians with inactivated malted yeast does not eliminate pathogenic microorganisms for humans present in Schmidtea mediterranea.
  • the equipment and method of this test is the same as that implemented in example 1 of the patent application but by feeding the planarians exclusively with Saccharomyces cerevisiae baker's yeast and not exclusively with Saccharomyces cerevisiae malted yeast + malt according to the invention).
  • Feeding planarians with baker's yeast does not eliminate pathogenic microorganisms for humans present in Schmidtea mediterranea.
  • Example 2 Trials of different diets without element of animal origin on planarians belonging to the species Schmidtea mediterranea.
  • Platyhelminths do not sustainably feed on any of these foods without an animal element. Surprisingly, platyhelminths do not accept feeding with malt unlike malted yeast. Feeding platyhelminthes with each of the foods devoid of elements of animal origin, except malted yeast, does not make it possible to eliminate the pathogenic microorganisms for F Man present in Schmidtea mediterranean
  • platyhelminths do not accept being fed on a perennial basis with baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) but accept being fed with malted yeast (Saccharomyces cerevisiae with malt), which differs baker's yeast only by the presence of malt.
  • planarians were washed twice with 200 ml of sterile water (ceramic: microfiltration (0.2 micron), interior of the antibacterial ceramic, compacted activated carbon). The washed planarians were transferred to a tube and the water was removed, then the planarians were frozen at -80°C.
  • Tube A was mixed using a mechanical stirrer for 5 minutes, at 2500 cycles/minute. The contents of tube A were passed through a syringe fitted with a 23 g needle and placed in a new tube (tube B).
  • Tube A containing the glass beads and the residues that remained stuck to the beads.
  • 20 ml of sterile water (temperature 4°C) was added.
  • Tube A was again mixed using a mechanical stirrer for 5 minutes at 2500 cycles/minute.
  • the contents of tube A were again passed through a syringe fitted with a 23 g needle and then transferred to tube B.
  • Tube B now contains 40 ml of crude planaria extract.
  • the Best tube was centrifuged for 5 min at 3220g at 4°C then the supernatant of tube B was filtered through a 1.20 m membrane (filtrate 1).
  • Filtrate 1 was then filtered through a 0.80 m membrane (filtrate 2).
  • Filtrate 2 was then filtered on a 0.45 ⁇ m membrane (filtrate 3).
  • Filtrate 3 was then filtered on a 0.2 ⁇ m membrane (filtrate 4).
  • Filtrate 4 only contained particles smaller than 0.2 ⁇ m.
  • the protein concentration of filtrate 4 was determined by absorbance at the wavelength of 280 nm.
  • the protein concentration obtained was between 17.5 and 20 mg of protein/mL.
  • Filtrate 4 (corresponding to an aqueous extract stripped of all insoluble solid debris larger than 0.2 ⁇ m) was freeze-dried and stored at 4°C for later use.
  • Filtrate 4 was analyzed in triplicate by MALDI-TOF according to the protocol detailed below.
  • a 1 pL sample of aqueous extract from example 4A was diluted to 1/20th with a mixture of trichloroacetic acid, acetonitrile and water and was deposited on an HCCA matrix. Then, 1 ⁇ L of saturated matrix HCCA was added on top, then the whole thing was dried for 10 minutes. Extract analysis was performed with a Maldi-Tof Microflex LT10 mass spectrometer (Bruker). The results were collected with MALD1 Biotyper RTC software.
  • the spectra acquisition method included the following steps and features:
  • Electrode 151 20.00 kV
  • Electrode 152 18.05 kV
  • Focusing electrode 6 kVl
  • Laser frequency 60Hz
  • Detector gain 8 .8 X
  • Post Ion Extraction 120 ns
  • Mass range from 700 to 20000 Da.
  • BIOTYPER® software from the manufacturer BRUKER DALTONICS® which makes it possible to apply the automatic method described above to a series of samples taking into account the criteria mentioned above and a quality score. or validation score which represents the addition of 2 scores ni + n2 (ni being a function of the number of peaks and n2 a function of the signal/background noise ratio):
  • ni 0 for n::s: 8
  • ni 1 for 8 ⁇ n::s: 27,
  • ni 2 for 27 ⁇ n :s;
  • 43, ni 3 for 43 ⁇ n:s;
  • Rmax signal/noise ratio
  • a spectrum is taken into account if its validation score (nl+n2) is greater than 2.
  • Example 4 effect of the aqueous extract of planaria (filtrate 4 obtained in Example 3)
  • Example 4 The cytotoxicity of the aqueous extract obtained in Example 3 (filtrate 4) was tested on HL60 human lymphocyte cells (ATCC CCL-240). The cells were brought into contact with different dilutions of the extract. Briefly, 5x10 4 cells/well (24-well plate) were cultured in RPMI medium (GibCoBRL) supplemented with fetal calf serum (10%) and penicillin and streptomycin (5000U/ml, 5000pg/ml respectively), at 37°C, and under a 5% CO2 atmosphere. [141] At a 1:5 dilution (ie 0.3 mg protein/ml extract) the extract caused cell death.
  • RPMI medium GibCoBRL
  • penicillin and streptomycin 5000U/ml, 5000pg/ml respectively
  • the cells used were human stem cells (ATCC CLS-300702). The cells were brought into contact with different dilutions of the extract. Briefly, 5x10 3 cells/well, on a 48-well plate, were cultured in DMEM/E12 medium (GibCoBRL) supplemented with fetal calf serum (10%) and penicillin and streptomycin (5000U/ml , 5000 pg/ml respectively), at 37°C, and under a 5% CO2 atmosphere. The results are presented at Ligure 2A to D.
  • DMEM/E12 medium GibCoBRL
  • penicillin and streptomycin 5000U/ml , 5000 pg/ml respectively
  • Ligure 2B Only a dilution (1/20; Ligure 2B), which is between 1:5 (Ligure 2A) and 1:100 (Ligure 2C), allowed a significant induction (* p ⁇ 0.05) of human stem cell proliferation compared to untreated cells. The induction of multiplication was about 1.6 times.
  • the Ligure 2D shows the growth of human stem cells treated with the aqueous extract of planaria diluted to 1/20 th for 9 days and the control without treatment. Cells were stained with Giemsa.
  • the cells used were human epithelial cells (ATCC CCL-2). The cells were brought into contact with different dilutions of the extract. Briefly, 5x10 3 cells/well, on a 48-well plate, were cultured in DMEM medium (GibCoBRL) supplemented with fetal calf serum (10%) and penicillin and streptomycin (5000U/ml, 5000pg /ml respectively), at 37°C, and under a 5% CO2 atmosphere.
  • DMEM medium GibCoBRL
  • fetal calf serum fetal calf serum
  • penicillin and streptomycin 5000U/ml, 5000pg /ml respectively
  • the Ligure 3D shows the growth of human epithelial cells treated with the aqueous extract diluted to 1/20 th for 9 days and the control without treatment. Cells were stained with Giemsa.
  • the cells used were human endothelial cells (ATCC CRL-1730). The cells were brought into contact with different dilutions of the extract. Briefly, 5x10 3 cells/well, on a 48-well plate, were cultured in DMEM medium (GibCoBRL) supplemented with fetal calf serum (10%) and penicillin and streptomycin (5000U/ml, 5000pg /ml respectively), at 37°C, and under a 5% CO2 atmosphere. [149] A dilution (1/20; Figure 4B), ranging from 1:5 (Figure 4A) to 1:100 ( Figure 4C), allowed a significant induction (*p ⁇ 0.05) of the proliferation of human endothelial cells compared to untreated cells. The induction of multiplication was about 1.38 times.
  • Example 3 A 1/20 dilution of the aqueous extract of planaria obtained in Example 3 (filtrate 4) treated at 95°C for 10 minutes is added to the human cells of interest. Cell multiplication was measured after 9 days.
  • the aqueous extract of planaria induces genes for wound healing, immune genes, genes for cell renewal, genes for cell migration, genes for protection against photo-aging, anti cell death genes, and hyaluronic acid receptor activating genes.
  • Figure 1 illustrates the measurement of the cytotoxicity of the aqueous extract of planaria on human lymphocyte cells.
  • Figures 2A to 2D illustrate the measurement of planaria aqueous extract on human stem cell multiplication. Only a dilution comprised (1/20, B) between 1/5 (A) and 1/100 (C) allows a significant induction (*p ⁇ 0.05) of the proliferation of human stem cells compared to untreated cells.
  • Figure 2D shows the growth of human stem cells treated with the aqueous extract of planaria diluted at 1/20 for 9 days and the control without treatment. The cells are stained with Giemsa.
  • Figures 3A to 3D illustrate the measurement of the effect of the aqueous extract of planaria on the multiplication of human epithelial cells.
  • the cells used are human epithelial cells (ATCC CCL-2).
  • a dilution (1/20; B) and 1:5 (A) and 1:100 (C) allows a significant induction (*p ⁇ 0.05) of the proliferation of human epithelial cells compared to untreated cells.
  • Figure 3D shows the growth of human epithelial cells treated with the aqueous extract of planaria diluted at 1/20 for 9 days and the control without treatment. The cells are stained with Giemsa.
  • Figures 4A-4C illustrate the measurement of the effect of planarian aqueous extract on human endothelial cell proliferation.
  • the cells used are human endothelial cells (ATCC CRL-1730).
  • a dilution (1/20; B) and 1:5 (A) and 1:100 (C) allows a significant induction (*p ⁇ 0.05) of the proliferation of human endothelial cells compared to untreated cells.
  • Figures 5A-5C illustrate the measurement of the effect of aqueous extract of heat-treated planaria on the replication of human stem cells (ATCC CLS-300702), human endothelial (ATCC CRL-1730), epithelial human (ATCC CCL-2).
  • a 1/20 dilution of the aqueous extract of planaria is treated at 95°C for 10 minutes is added to the human cells of interest and cell multiplication is measured after 9 days.
  • the aqueous planaria extract inactivated by heat does not induce cell multiplication.
  • Figures 6A and 6B illustrate the measurement of the effect of the aqueous extract of planaria on the healing of a cell layer of human stem cells and human epithelial cells.
  • the human cells of interest are cultured to confluence until a cell layer is formed.
  • a 325 ⁇ m wide lesion of the cellular layer is made using a needle calibrated, then the aqueous extract of planaria diluted to 1/20 th is added or not to the cell culture.
  • Healing of the cell layer complete filling of the lesion with new cells is monitored over time.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de nourrissage d'un plathelminthe et un extrait de plathelminthe dépourvu de microorganismes pathogènes pour l'Homme, utile dans les domaines de la pharmacie, de la cosmétique et de la neutraceutique.

Description

Description
Titre de l’invention : Procédé de nourrissage d’un plathelminthe et extrait de plathelminthe dépourvu de microorganismes pathogènes pour l’Homme
Domaine technique
[1] La présente invention concerne un procédé de nourrissage d’un plathelminthe et un extrait de plathelminthe dépourvu de microorganismes pathogènes pour l’Homme, utile dans les domaines de la pharmacie, de la cosmétique et de la neutraceutique.
Technique antérieure
[2] Le terme « plathelminthes » désigne un embranchement de vers plats qui comporte quatre classes : les rhabditophora (anciennement « turbellariés ») comme la planaire, les monogènes qui sont des parasites d'organismes aquatiques, les trématodes (douves, digènes) qui sont des parasites comme la douve du foie, et les cestodes comme le ver solitaire ou ténia.
[3] Les planaires sont des vers plats aquatiques appartenant à plusieurs espèces dans la classe des rhabditophora. Elles peuvent être nageuses ou rampantes, et vivre en mer, en eau douce, ou dans les sols très humides (en forêt tropicale). Les planaires sont connues pour leurs capacités de régénération. Elles sont capables de se régénérer perpétuellement, et n’importe quelle partie de son corps, du fait de la présence d’une grande quantité de cellules souches (20-30%) dans ses tissus comparés aux autres organismes vivants pour lesquels la quantité de cellules souches est de l’ordre de Ippm. Les cellules souches de planaires se multiplient et se régénèrent continuellement, à la différence des cellules souches des organismes plus évolués, lesquelles ne se multiplient pas ou peu. Les facteurs biochimiques permettant la multiplication des cellules souche chez une planaire restent non identifiés.
[4] Les plathelminthes sont connus pour se nourrir de substances d’origine animale dans leur environnement naturel, et sont généralement nourris avec du foie de veau ou du foie de poulet lorsqu’ils sont élevés en laboratoire. En raison de leur régime, les plathelminthes abritent dans leur microbiote des microorganismes pathogènes pour l’Homme.
[5] Les extraits de plathelminthes sont décrits dans la littérature comme ayant de nombreuses propriétés pharmacologiques.
[6] La demande de brevet WO2019016346 décrit un extrait aqueux de planaire, non parasitaire et non pathogène chez l’Homme, notamment de l’espèce Schmidtea mediterranea, capable d’ activer la multiplication de cellules souches humaines et qui présente de ce fait, une activité de régénération cellulaire utile dans de nombreuses applications cosmétique, pharmaceutique ou neutraceutique.
[7] Les plathelminthes utilisés pour l’obtention des extraits de plathelminthes sont généralement nourris avec du foie de veau. Or, l’analyse de leur microbiote a révélé la présence de microorganismes pathogènes pour l’Homme, tels que Aeromonas veronii, Staphylococcus capitis, Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter guillouiae, Aeromonas hydrophila, Delftia acidovorans, Comamonas testosteroni, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus et/ou Staphylococcus haemolyticus.
[8] Ces microorganismes peuvent être problématiques dans toutes les applications cosmétiques, pharmaceutiques ou neutraceutiques découlant de l’utilisation des extraits de plathelminthes ou des plathelminthes en tant que tels.
Résumé de l’invention
[9] Dans le cadre de la présente invention, il a été observé qu’il était très difficile de pouvoir nourrir de façon pérenne des plathelminthes avec une alimentation dépourvue d’élément d’origine animale. De façon fortuite, la Demanderesse a pu observer que les plathelminthes acceptent de se nourrir avec de la levure maltée, qui est un aliment dépourvu d’élément d’origine animale.
[10] Dans le cadre de la présente invention, il a également été montré de façon tout à fait fortuite qu’il était possible de disposer de plathelminthes dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’Homme en nourrissant lesdits plathelminthes avec de la levure maltée. Les extraits obtenus à partir de ces plathelminthes « sains » conservant la capacité d’activer la multiplication de cellules souches humaines et présentant de ce fait, une activité de régénération cellulaire notamment des cellules souches ou différenciées.
[11] Un premier objet de la présente invention concerne un procédé de nourrissage de plathelminthes, dans lequel les plathelminthes sont nourris exclusivement avec de la levure maltée.
[12] Un deuxième objet de la présente invention concerne un procédé de préparation d’un extrait de plathelminthes, comprenant les étapes de :
(i) nourrir des plathelminthes en mettant en œuvre le procédé de nourrissage selon le premier objet de l’invention, et
(ii) préparer un extrait des plathelminthes à partir des plathelminthes obtenus à l’étape (i). [13] Un troisième objet de la présente invention concerne un extrait de plathelminthes nourris exclusivement avec de la levure maltée susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre du procédé selon le deuxième objet de l’invention, lesdits plathelminthes étant dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’Homme.
[14] Un quatrième objet de la présente invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs plathelminthes nourris exclusivement avec de la levure maltée, ledit ou lesdits plathelminthes étant dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’Homme.
[15] Un cinquième objet de la présente invention concerne une composition comprenant un extrait selon l’invention.
[16] Un sixième objet de la présente invention concerne un procédé d’élimination de microorganismes pathogènes présents dans un ou plusieurs plathelminthes, ledit procédé comprenant une étape qui consiste à nourrir un ou des plathelminthes, de préférence exclusivement, avec de la levure maltée pendant une durée suffisante pour éliminer lesdits microorganismes pathogènes.
[17] Un septième objet de la présente invention concerne un procédé de préparation d’un extrait de plathelminthe selon l’invention, comprenant les étapes de :
(a) obtenir des plathelminthes dépourvu de microorganismes pathogènes pour l’Homme en mettant en œuvre le procédé d’élimination de microorganismes pathogènes des plathelminthes selon l’invention ;
(b) préparer un extrait de plathelminthe à partir des plathelminthes obtenus à l’étape (a).
[18] Un huitième objet de la présente invention concerne l’utilisation d’un extrait aqueux selon l’invention ou d’une composition comprenant un extrait selon l’invention, pour cultiver des cellules humaines ou animales in vitro ou ex vivo.
[19] Un neuvième objet de la présente invention concerne un extrait selon l’invention ou une composition comprenant un extrait selon l’invention, pour son utilisation comme médicament, par exemple pour être utilisé pour favoriser la cicatrisation d’une plaie de la peau ou d’une brûlure de la peau.
Description détaillée
[20] Définitions [21] Le terme « plathelminthe » désigne un ver plat de l’embranchement du même nom. Dans le cadre de l’invention, le plathelminthe peut être de la classe des rhabditophora, de préférence il s’agit d’une planaire. De préférence, le plathelminthe selon l’invention est non parasitaire et/ou non pathogène chez l’homme. Avantageusement, le plathelminthe selon l’invention est une planaire appartement à l’une des espèces suivantes Schmidtea mediterranea, Dugesia japonica, Dendricoelum lacteum, Polycelis nigra, Polycelys tenuis et Planaria torva, de préférence à l’espèce Schmidtea mediterranea.
[22] La « levure maltée » ou « levure de bière » est bien décrite dans la littérature, elle est le résultat de la culture de saccharomyces cerevisiae avec du malt, généralement du malte d’orge. Elle se présente généralement sous la forme de flocons et est largement utilisée dans l’alimentation végétarienne. La levure maltée selon la présente invention peut être sous toute forme adaptée pour nourrir les plathelminthes, par exemple sous forme de poudre, de paillettes, de granulés ou sous forme liquide, par exemple obtenue en mélangeant des paillettes avec de l’eau. Les levures présentes dans la levure maltée sont dites « actives », c’est à dire qu’elles sont vivantes.
[23] L’expression « plathelminthe dépourvu de microorganismes pathogènes pour 1 ’ Homme » désigne un plathelminthe qui dont le tractus digestif est dépourvu de microorganismes pathogènes pour l’Homme, c’est-à-dire un plathelminthe dont le microbiote est dépourvu de microorganismes pathogènes pour l’Homme. Dans un mode de réalisation particulier, les microorganismes pathogènes pour l’Homme sont Aeromonas veronii, Staphylococcus capitis, Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter guillouiae, Aeromonas hydrophila, Delftia acidovorans, Comamonas testosteroni, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus et Staphylococcus haemolyticus. Dans ce mode de réalisation particulier, le microbiote du plathelminthe de l’invention est donc dépourvu de l’ensemble microorganismes pathogènes susmentionnés.
[24] Le terme « extrait » désigne le produit résultant de l’extraction du contenu des cellules. Ainsi, le terme « extrait d’un ou plusieurs plathelminthes » désigne le produit résultant de l’extraction du contenu des cellules dudit ou desdits plathelminthes.
[25] Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par une agence règlementaire fédérale ou d’Etat ou énuméré dans la pharmacopée américaine ou européenne, ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue, destiné à être utilisé chez les animaux et chez l’homme. Une « composition pharmaceutique » désigne une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par exemple, un véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel l'agent thérapeutique est administré. Ces véhicules peuvent être des liquides stériles, tels que l'eau et des huiles, y compris ceux d'origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, tels que l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame, etc. Des solutions salines et des solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être utilisées comme véhicules liquides, en particulier pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiquement acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou les gélules peuvent être préparés par des moyens classiques avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents liants (par exemple de l'amidon de maïs prégélatinisé, de la polyvinylpyrrolidone ou de l'hydroxypropyl méthylcellulose); des charges (par exemple du lactose, de la cellulose microcristalline ou de l'hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des procédés bien connus dans l’état de la technique. Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre la forme, par exemple, de solutions, de sirops ou de suspensions, ou peuvent être présentées sous forme de produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. De telles préparations liquides peuvent être préparées par des moyens classiques avec des véhicules pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple un sirop de sorbitol, des dérivés de la cellulose ou des graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple des p-hydroxybenzoates de méthyle ou de propyle ou de l'acide sorbique). Les compositions pharmaceutiques peuvent également contenir des sels tampons, des aromatisants, des colorants et des édulcorants, selon le cas.
[26] Le terme « traiter » ou « traitement » englobe tout effet bénéfique ou souhaitable sur une pathologie ou un état pathologique, et peut même inclure une réduction minimale d'un ou plusieurs marqueurs mesurables de la pathologie ou de l'état pathologique. Le traitement peut par exemple impliquer soit la réduction ou l'amélioration des symptômes de la pathologie ou de l'état pathologique, soit le retardement de la progression de la maladie ou de l'état pathologique. Le terme « traitement » ne signifie pas nécessairement l'éradication complète ou la guérison de la pathologie, ni des symptômes associés. [27] Plathelminthe et composition en contenant
[28] La description concerne un plathelminthe nourri exclusivement avec de la levure maltée, ledit plathelminthe étant dépourvu de microorganismes pathogènes pour F Homme.
[29] Les inventeurs se sont aperçus que des plathelminthes nourris exclusivement avec de la levure maltée étaient dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’ Homme, alors que des plathelminthes nourris avec de la nourriture conventionnelles, telle que le foie de veau, ou même nourris avec de la levure de boulanger Saccharomyces ce revis iae), développent dans leur tube digestif des microorganismes pathogènes pour F Homme.
[30] Les inventeurs ont donc montré qu’il suffit de nourrir des plathelminthes exclusivement avec de levure maltée pour obtenir les plathelminthes dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’ Homme.
[31] Ainsi la présente invention ne nécessite pas l’utilisation d’antibiotique pour obtenir des plathelminthes dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’Homme. Les plathelminthes de la présente description sont donc non seulement dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’Homme, mais également dépourvus d’antibiotique.
[32] Le plathelminthe peut être vivant ou mort. Il peut par exemple être congelé, lyophilisé et/ou séché.
[33] Selon la présente description, le plathelminthe est avantageusement dépourvu des microorganismes pathogènes pour l’Homme suivants : Aeromonas veronii, Staphylococcus capitis, Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter guillouiae, Aeromonas hydrophila, Delftia acidovorans, Comamonas testosteroni, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus et Staphylococcus haemolyticus.
[34] L’invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs plathelminthes nourris exclusivement avec de la levure maltée, ledit ou lesdits plathelminthes étant dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’Homme.
[35] Il peut s’agir par exemple d’une composition comprenant le ou les plathelminthes dans leur environnement, par exemple une composition comprenant de l’eau, au moins un plathelminthe selon l’invention et éventuellement de la levure maltée. Il peut par exemple s’agir d’une composition comprenant un ou plusieurs plathelminthes selon la présente description et exclusivement de la levure maltée comme aliment du ou des plathelminthes.
[36] La composition peut être sous différentes formes, par exemple sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. Sous forme lyophilisée, la composition peut en outre comprendre un lyoprotectant, tel qu’un lyoprotectant non-naturel. [37] Procédé de nourrissage de plathelminthes et Procédé de préparation d’un extrait de plathelminthe
[38] Un objet de la présente invention concerne un procédé de nourrissage de plathelminthes, dans lequel les plathelminthes sont nourris exclusivement avec de la levure maltée.
[39] Les inventeurs ont observé qu’il est très difficile de pouvoir nourrir de façon pérenne des plathelminthes avec une alimentation dépourvue d’élément d’origine animale. En effet, les plathelminthes refusent de se nourrir avec la majorité des aliments dépourvus d’éléments d’origine animale.
[40] Par exemple, les inventeurs ont testé les aliments suivants : levure de boulanger, spiruline, protéines de soja, lait de soja, tofu, flocons d’avoine, malt et aucune de ces nourritures n’a été acceptée comme alimentation pérenne par les plathelminthes. En conséquence ces aliments ne permettent pas d’obtenir un ou plusieurs plathelminthes dépourvus d’élément d’origine animale.
[41] De plus, ces aliments n’ont eu aucun impact sur le microbiote des plathelminthes et en particulier sur la population de bactéries pathogènes pour F Homme.
[42] De façon surprenante, alors que les plathelminthes refusent de se nourrir de façon pérenne avec du malt ou de la levure de boulanger Saccharomyces cerevisia ), la Demanderesse a mis en évidence que les plathelminthes acceptent de se nourrir de façon pérenne avec de la levure maltée (Saccharomyces cerevisiae avec du malt). Les plathelminthes acceptent de se nourrir exclusivement avec de la levure maltée ce qui permet avantageusement d’obtenir des plathelminthes non seulement dépourvus de microorganismes pathogènes pour F Homme mais également dépourvus d’élément d’origine animale.
[43] Le procédé de nourrissage selon l’invention comprend une étape qui consiste à nourrir les plathelminthes pendant une durée suffisante pour éliminer les microorganismes pathogènes pour F Homme et/ou éliminer les éléments d’origine animale.
[44] Dans un mode de réalisation particulier, les plathelminthes sont nourris au moins une fois par semaine, de préférence au moins deux fois par semaine, avec une quantité de levure maltée allant de 0,10 mg de levure/400 plathelminthes à 0,20 mg de levure/400 plathelminthes, de préférence une quantité de 0,15 mg de levure/400 plathelminthes.
[45] Les plathelminthes sont nourris pendant le temps nécessaire pour être dépourvus des microorganismes pathogènes pour F Homme. Dans un mode de réalisation particulier, les plathelminthes sont nourris pendant un moins une semaine, de préférence pendant au moins 2 semaines, par exemple pendant 4 semaines. [46] Avantageusement, les plathelminthes sont privés de toute nourriture pendant au moins une semaine avant d’être nourri avec la levure maltée.
[47] Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation d’un extrait de plathelminthes, comprenant les étapes de :
[48] (i) nourrir des plathelminthes en mettant en œuvre le procédé de nourrissage selon l’invention, et
(ii) préparer un extrait des plathelminthes à partir des plathelminthes obtenus à l’étape (i).
[49] L’étape (ii) de préparation de l’extrait est décrite plus en détail dans la partie « Extrait de plathelminthe » ci-dessous.
[50] Extrait de plathelminthe
[51] Un autre objet de l’invention concerne un extrait de plathelminthes nourris exclusivement avec de la levure maltée susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre du procédé de préparation d’un extrait de plathelminthes selon l’invention, lesdits plathelminthes étant dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’ Homme.
[52] L’extrait selon l’invention peut par exemple être un extrait aqueux.
[53] Etant donné que les plathelminthes sont nourris exclusivement avec de la levure maltée, l’extrait selon l’invention est dépourvu d’antibiotique. L’absence d’antibiotique au sein de l’extrait selon l’invention rend celui-ci particulièrement adapté pour une utilisation chez l’Homme ou l’animal. De plus, l’extrait selon l’invention est dépourvu d’éléments d’origine animale autres que ceux relatifs au plathelminthe lui-même. Cela permet de façon avantageuse de disposer d’un extrait particulièrement adapté pour une utilisation dans des produits végans c’est-à-dire ne comprenant aucun ingrédient d’origine animale, tels que des produits cosmétiques végans.
[54] La préparation d’un extrait de plathelminthes ne présente aucune difficulté particulière, de nombreux procédés d’extraction étant décrits dans la littérature. La préparation d’un extrait de plathelminthes n’est pas limitée à un procédé particulier, et les procédés classiques peuvent être mis en œuvre pour préparer un extrait selon l’invention, comme par exemple en mettant en œuvre un procédé comprenant les étapes suivantes : (i) broyer des plathelminthes afin d’obtenir un broyât, (ii) débarrasser le broyât des débris solides non solubles afin d’obtenir un extrait, et (iii) éventuellement concentrer ou diluer l’extrait. [55] L’étape (i) peut être mise en œuvre avec toute méthode de broyage permettant d’éclater les cellules de plathelminthe et d’en libérer leur contenu, par exemple en agitant des plathelminthes avec des billes en verre.
[56] L’étape (ii) peut être mise en œuvre en centrifugeant et/ou en filtrant le broyât. Avantageusement, l’extrait selon l’invention est débarrassé de tout débris solide non soluble, notamment débarrassé des débris de membrane issus de l’éclatement des cellules de plathelminthes. Pour obtenir un tel extrait, le procédé de préparation peut comprendre au moins une étape de séparation solide/liquide, par exemple une ou plusieurs étapes de filtration sur membrane ayant un seuil de coupure approprié, par exemple un seuil de coupure de 1,20 pm, par exemple de 0,80 pm, de 0,45 pm, de 0,2 pm. La filtration permet d’obtenir un extrait qui contient des particules de taille inférieure au seuil de coupure du filtre utilisé, par exemple des particules de taille inférieure à l,20pm, par exemple inférieure à 0,80 pm, inférieure à 0,45, inférieure à pm 0,2 pm.
[57] L’étape (iii) peut être mise en œuvre par évaporation ou par l’ajout d’un solvant approprié, par exemple de l’eau.
[58] L’Exemple 3 décrit un procédé de préparation d’un extrait de plathelminthes selon invention.
[59] Les conditions d’extraction seront choisies de telle façon que l’extrait obtenu présente la concentration souhaitée dans l'application envisagée. La concentration en protéine de l’extrait brut peut notamment varier en fonction de la quantité de plathelminthe utilisée (par exemple, lors d’une extraction aqueuse, lorsqu’on augmente le ratio plathelminthe/eau, la concentration en protéines de l’extrait augmente également), le temps d’extraction (par exemple, une augmentation du temps d’extraction lors d’une extraction aqueuse permet généralement d’augmenter la concentration en protéines de l’extrait) et/ou la température d’extraction (par exemple, une augmentation de la température d’extraction lors d’une extraction aqueuse permet généralement d’augmenter la concentration en protéines de l’extrait). Généralement, l’extrait brut comprend de 1 mg à 50 mg de protéines par mL d’extrait (mg/mL). L'absorbance à la longueur d'onde caractéristique de 280 nm (i.e. A280nm) est communément utilisée pour estimer la concentration totale de protéines dans l’extrait.
[60] L’extrait obtenu peut être plus ou moins concentré en protéines selon l’utilisation envisagée. Après extraction, l’extrait peut notamment comprendre entre 15 mg de protéines par mL d’extrait (mg/mL) et 20 mg/mL. L’extrait brut peut être dilué ou même concentré selon l’utilisation envisagée. Dans un mode de réalisation particulier, l’extrait selon l’invention comprend de 15 pg de protéines par mL d’extrait (pg/mL) à 50 mg de protéines par mL d’extrait (mg/mL), par exemple de 15 pg/mL à 20 mg/L, par exemple de 15 pg/mL à 1 mg/L, par exemple de 15 pg/mL à 0,3 mg/L. Dans un autre mode de réalisation particulier, l’extrait selon l’invention comprend moins de 0,5 mg de protéines par mL d’extrait (mg/mL), par exemple moins de 0,3 mg/mL, par exemple entre 15 pg/mL et 0,3 mg/mL, de préférence de 15 pg mg/mL à 75 pg /mL. Une déshydratation totale de cet extrait permet d’obtenir un extrait sous forme de poudre.
[61] Dans un mode de réalisation très particulier, l’extrait selon l’invention a un spectre MALDI TOF correspondant aux données présentées dans le Tableau 1.
[Table 1]
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
[62] M/z : rapports (masse en Dalton/charge) en abscisse des différents pics caractéristiques du spectre ; S/N : rapports (intensité du pic/intensité du bruit de fond) des différents pics caractéristiques du spectre.
[63] Composition comprenant un extrait de plathelminthes
[64] L’invention concerne également une composition comprenant un extrait selon l’invention.
[65] Dans un premier mode de réalisation particulier, la composition est une composition cosmétique et/ou dermatologique et peut comprendre un ou plusieurs supports et/ou excipients appropriés à l’utilisation ciblée. Dans ce mode de réalisation, la composition peut être sous forme de gel, lotion, crème, pommade, pâte ou savon. Ainsi, la composition selon l'invention peut comprendre divers excipients usuels adaptés à une administration topique externe, en particulier des excipients acceptables sur le plan dermatologique et/ou cosmétologique. Ces excipients appropriés pour la formulation sont bien connus de l'homme du métier et comprennent par exemple des agents favorisant la pénétration au niveau de la peau, des agents hydratants, des agents épaississants, des agents stabilisants, des agents émollients et des agents tensioactifs, des agents émulsifiants, des agents conservateurs, des agents ajusteurs de pH, etc. Par exemple, la composition selon l’invention est formulée sous forme de crème comprenant l’extrait de l’invention et au moins les excipients suivants: un agent émulsifiant, un agent émollient, un agent épaississant, un agent hydratant et éventuellement un agent conservateur. Dans un autre exemple, la composition selon l’invention est formulée sous forme de comprenant l’extrait de l’invention et au moins les excipients suivants additionnels: un agent gélifiant, un agent épaississant, un agent hydratant et éventuellement un agent conservateur. Dans ce premier mode de réalisation, la composition selon l’invention peut également comprendre d’autres composés adaptés à une utilisation cosmétique et/ou dermatologique tels que des capteurs de radicaux, des vitamines antioxydantes telles que la vitamine E, la vitamine C, des agents antioxydants comme les polyphénols naturels, des enzymes, des principes actifs végétaux, des substances antiinflammatoires naturelles, des alcools, des polyols, des esters, des électrolytes, des huiles polaires et non polaires, des polymères, des copolymères, des phopholipides, des colorants, des parfums et/ou des agents de gommage de la peau.
[66] Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la composition est une composition neutraceutique (ou complément alimentaire) et peut comprendre un ou plusieurs supports et/ou excipients appropriés à l’utilisation ciblée. Dans ce mode de réalisation, la composition doit donc pouvoir être ingérée. Elle peut se présenter sous différentes formes galéniques, telle qu’une dispersion, une capsule, un cachet, une poudre, une tablette, etc. La composition neutraceutique peut également se présenter sous la forme d’un aliment, tel qu’un yaourt, une barre de céréales, un gel, un bonbon, une gomme à mâcher, etc.
[67] Dans un troisième mode de réalisation particulier, la composition est une composition pharmaceutique et peut comprendre un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les excipients pharmaceutiques acceptables comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé séché, le glycérol, le propylène glycol, l'eau, l'éthanol et similaires. Lorsque la composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale, les comprimés ou capsules peuvent être préparés par des moyens conventionnels avec des excipients pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de liaison (par exemple l'amidon de maïs prégélatinisé, la polyvinylpyrrolidone ou l'hydroxypropylméthylcellulose); des agents de charges (par exemple, lactose, cellulose microcristalline ou hydrogénophosphate de calcium); des lubrifiants (par exemple, stéarate de magnésium, talc ou silice); des délitants (par exemple, l'amidon de pomme de terre ou le glycolate d'amidon sodique); ou des agents mouillants (par exemple, le laurylsulfate de sodium). Les comprimés peuvent être enrobés par des méthodes bien connues dans l'art. Les préparations liquides pour administration orale peuvent prendre, par exemple, la forme de solutions, de sirops ou de suspensions, ou elles peuvent être présentées comme un produit sec à reconstituer avec de l'eau ou un autre véhicule approprié avant utilisation. Ces préparations liquides peuvent être préparées par des moyens conventionnels avec des additifs pharmaceutiquement acceptables tels que des agents de suspension (par exemple, sirop de sorbitol, dérivés de cellulose ou graisses comestibles hydrogénées); des agents émulsifiants (par exemple, la lécithine ou l'acacia); véhicules non aqueux (par exemple, huile d'amande, esters huileux, alcool éthylique ou huiles végétales fractionnées); et des conservateurs (par exemple, les méthyl ou propyl-p-hydroxybenzoates ou l'acide sorbique). Les préparations peuvent également contenir des sels tampons, des agents aromatisants, colorants et édulcorants, selon le cas.
[68] La composition selon l’invention peut également comprendre un milieu de culture cellulaire, de préférence un milieu de culture apte à cultiver des cellules humaines ou animales. [69] Procédé d’élimination de microorganismes pathogènes présents dans un plathelminthe
[70] L’invention concerne également un procédé d’élimination de microorganismes pathogènes présents dans un ou plusieurs plathelminthes, ledit procédé comprenant une étape qui consiste à nourrir un ou des plathelminthes, de préférence exclusivement, avec de la levure maltée pendant une durée suffisante pour éliminer lesdits microorganismes pathogènes. De façon avantageuse, le procédé selon l’invention ne nécessite pas la mise en œuvre d’antibiotique pour disposer d’un plathelminthe dépourvu de microorganismes pathogènes pour l’ Homme.
[71] Le procédé permet notamment d’obtenir un ou plusieurs plathelminthes selon l’invention, tel que défini dans la partie « Plathelminthe et composition en contenant » ci-dessus.
[72] Dans un mode de réalisation particulier, les plathelminthes sont nourris au moins une fois par semaine, de préférence au moins deux fois par semaine, avec une quantité de levure maltée allant de 0,10 mg de levure/400 plathelminthes à 0,20 mg de levure/400 plathelminthes, de préférence une quantité de 0,15 mg de levure/400 plathelminthes.
[73] Les plathelminthes sont nourris pendant le temps nécessaire pour être dépourvus des microorganismes pathogènes pour l’ Homme. Dans un mode de réalisation particulier, les plathelminthes sont nourris pendant un moins une semaine, de préférence pendant au moins 2 semaines, par exemple pendant 4 semaines.
[74] Avantageusement, les plathelminthes sont privés de toute nourriture pendant au moins une semaine avant d’être nourri avec la levure maltée.
[75] Procédé de préparation d’un extrait de plathelminthe
[76] L’invention concerne également un procédé de préparation d’un extrait de plathelminthe selon l’invention, comprenant les étapes de :
[77] (a) obtenir des plathelminthes dépourvu de microorganismes pathogènes pour l’Homme en mettant en œuvre le procédé d’élimination de microorganismes pathogènes présents dans un ou plusieurs plathelminthes selon l’invention ;
[78] (b) préparer un extrait de plathelminthe à partir des plathelminthes obtenus à l’étape (a).
[79] L’étape (b) de préparation de l’extrait est décrite plus en détail dans la partie « Extrait de plathelminthe » ci-dessus.
[80] Indications non-thérapeutiques
[81] L’invention concerne également l’utilisation d’un extrait selon l’invention ou d’une composition comprenant un extrait selon l’invention, pour cultiver des cellules humaines ou animales in vitro ou ex vivo. En particulier, l’invention concerne l’utilisation d’un extrait selon l’invention ou d’une composition comprenant un extrait selon l’invention, pour cultiver des cellules humaines ou animales in vitro ou ex vivo, dans laquelle lesdites cellules humaines ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines nécessitant la destruction d’un embryon humain et ayant la capacité de se développer en être humain.
[82] L’extrait peut par exemple être utilisé pour régénérer des cellules humaines ou animales, par exemple en stimulant leur différenciation, leur croissance, leur multiplication et/ou leur prolifération. Selon un aspect particulier, l’extrait est utilisé pour régénérer des cellules souches humaines dentaires.
[83] Les cellules humaines ou animales peuvent être tout type de cellules, par exemple des cellules souches ou des cellules différenciées. Lorsque les cellules souches considérées sont des cellules souches humaines, celles-ci ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines nécessitant la destruction d’un embryon humain et ayant la capacité de se développer en être humain.
Parmi les cellules différenciées on peut en particulier faire référence aux cellules épithéliales, aux fibroblastes, aux kératinocyte, aux cellules endothéliales, aux cellules neuronales ou aux cellules nerveuses.
[84] Un autre objet de la présente invention concerne l’utilisation d’un extrait selon l’invention ou d’une composition comprenant un extrait selon l’invention comme agent anti-âge, agent cicatrisant et/ou agent régénérant des cellules humaines ou animales, dans laquelle ledit extrait ou ladite composition est appliqué par voie topique. Par « voie topique » on fait référence à une application sur la peau, les muqueuses, les phanères tels que les ongles, les poils et les cheveux, de préférence la peau, par exemple une application sur une peau saine.
[85] L’Homme du métier saura déterminer la quantité et la fréquence d’application en fonction de l’effet anti-âge, cicatrisant et/ou régénérant recherché et du type de cellules ciblé. Les effets anti-âge, cicatrisant et/ou régénérant peuvent être mesurés par l’analyse de l’expression d’un ou plusieurs gènes dont le rôle dans le vieillissement cellulaire, la cicatrisation ou encore la prolifération cellulaire est connu.
[86] On peut également décrire ici un procédé cosmétique de traitement de la peau, par exemple une peau saine, pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, et en particulier les rides d'expression provoquées par les contractions musculaires faciales incontrôlées, consistant à appliquer sur les zones de la peau nécessitant un tel traitement, une composition cosmétique selon l’invention. [87] Indications thérapeutiques
[88] L’invention concerne également un extrait selon l’invention ou une composition comprenant un extrait selon l’invention, pour son utilisation comme médicament.
[89] L’extrait ou la composition peut être formulé pour une administration parentérale, par exemple une administration intravasculaire (intraveineuse ou intra-artérielle), intrapéritonéale, intramusculaire, entérale ou topique.
[90] L’administration ou l’application peut se faire en une seule fois ou, plus généralement, en plusieurs fois. La durée de traitement peut varier selon la pathologie traitée et le sujet traité.
[91] L’extrait ou la composition peut être utilisé en monothérapie ou en association avec des médicaments dont l’intérêt thérapeutique est reconnu dans la pathologie considérée.
[92] En particulier, l’invention concerne un extrait selon l’invention ou une composition comprenant un extrait selon l’invention, pour son utilisation pour favoriser la cicatrisation d’une plaie de la peau ou d’une brûlure de la peau. L’administration par voie topique est préférée dans cette indication.
EXEMPLES
[93] Exemple 1 : Analyse des microorganismes contenus dans des planaires nourries avec différents régimes alimentaires
[94] a) Planaires appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea nourries avec du foie de veau ou de la levure maltée
[95] Un premier groupe de 400 planaires Schmidtea mediterranea) a été nourri 2 fois par semaine, pendant 2 semaines, avec 0,15 g de levure maltée (Markal - Levure Maltée de Bière - Paillettes 250g), soit 0,0375g/100 planaires/nourrissage.
[96] Un deuxième groupe de 400 planaires Schmidtea mediterranea) a été nourri 2 fois par semaine, pendant 2 semaines, avec du foie de veau (société SAPRIMEX, Italie) à hauteur de 0.40mg/400 planaire/nourrissage.
[97] Les microorganismes contenus dans les deux groupes de planaires ont été analysés et recensés en analysant le microbiote selon le protocole détaillé ci-après.
[98] Protocole d’analyse du microbiote [99] Après deux semaines de famine, les planaires ont été lavées dans de l'eau stérilisée par filtration, puis les planaires ont été inoculées sur gelose BCYE (Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Allemagne), Luria Bertani (LB) ou gélose Columbia enrichie avec 5% sang de mouton (bioMérieux, Marcy l’étoile, France). Chacune des inoculations est incubée sous trois conditions différentes de température (19°C, 28°C et 37°C) et sous deux contions de temps d’incubation (24 h et 48 h), à savoir 24h à 19°C, 24h à 28°C, 24h à 37°C, 48h à 19°C, 48h à 28°C ou 48h à 37°C. Chaque colonie bactérienne individuelle a été récoltée et identifiée par MALDI-TOF-MS (Spectromètre Microflex; Bruker Daltonics, Brême, Allemagne). Les spectres obtenus ont été importés dans le Logiciel MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics) et analysés par rapport aux spectres de référence des bactéries inclus dans la base de données (base de données Bruker constamment mise à jour avec la base de données Mediterranee- Infection. Le logiciel MALDI Biotyper RTC a été utilisé pour interpréter les résultats en fonction des scores obtenus: une colonie a probablement été identifiée au niveau de l'espèce niveau pour un score> 2,0, probablement identifié pour un score entre 1,99 et 1,7, mais non identifié pour un score <1,7.
[100] Les colonies bactériennes qui ont été identifiées à l'aide de MALDI-TOF, mais qui n’était pas connues dans la base de données Bruker, ont été identifiées par analyse phylogénétique, en utilisant le séquençage de l'ARNr 16S. L'ADN génomique a été extrait à l'aide d'un automate EZ1 et le kit de tissus ADN (Qiagen, Hilden, Allemagne). L'amplification et le séquençage complets du gène de l'ARNr 16S a été réalisée en utilisant huit amorces sur un séquenceur capillaire ABI Prism 3130x1 Genetic Analyzer (AppliedBio systems, Bedford, MA, États- Unis). Le logiciel CodonCode Aligner a été utilisé pour l'alignement, l'assemblage et la correction des séquences (https://www.codoncode.com/). Pour l'affectation taxonomique, une recherche BLASTn a été effectuée sur la base de données nr. Un seuil de similitude de séquence de 98,65% par comparaison avec les espèces phylogénétiquement les plus proches avec la position dans la nomenclature a été utilisé pour délimiter une nouvelle espèce. Les relations phylogénétiques ont été déduites de la comparaison des séquences d'ARNr 16S en utilisant le Logiciel MEGA7.
[101] Résultats de l’analyse du microbiote
[102] Les planaires nourries avec la levure maltée étaient dépourvues de bactérie susceptible d’être pathogènes pour l’Homme. Les planaires nourries avec la levure maltée comprenaient une seule espèce bactérienne, non pathogène pour l’Homme : Pseudomonas brenneri.
[103] Il est intéressant de noter que les bactéries (non pathogènes) Urmitella massiliensis, Paenibacillus polymyxa et Micrococcus luteus ont été retrouvées dans la levure maltée donnée aux planaires, mais ces bactéries n’ont pas été retrouvées dans les planaires après nourrissage avec de la levure maltée.
[104] Les planaires nourries avec le foie de veau contenaient 11 bactéries susceptibles d’être pathogènes pour l’Homme (Table 2) et 25 bactéries non pathogènes (Table 3). [Table 2]
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[Table 3]
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(*) Bactéries nouvellement identifiées
[105] Il convient de noter que les bactéries non pathogènes Brochothrix thermosphacta, Lactococcus piscium, Pseudomonas frederiksbergensis, Pseudomonas gessardii, Serratia proteamaculans, Staphylococcus hominis et Pseudomonas azotoformans ont été retrouvées dans le foie de veau donné aux planaires, mais ces bactéries n’ont pas été retrouvées dans les planaires après nourrissage avec le foie de veau.
[106] Conclusion : le nourrissage des planaires à la levure maltée a permis d’éliminer les microorganismes susceptibles d’être pathogènes pour l’Homme, et donc d’obtenir des planaires dépourvues de microorganismes pathogènes pour T Hommes. Ces planaires dépourvues de microorganismes pathogènes pour l’Homme sont particulièrement adaptés pour la préparation d’un extrait de planaires qui ne présente pas de risque pour l’Homme.
[107] b) Planaires appartenant à l’espèce Dugesia japonica nourries avec du foie de veau ou de la levure maltée
1) Matériel et méthode
[108] Le matériel et méthode de cet essai est identique à celui mis en œuvre dans l’exemple 1 de la demande de brevet avec des planaires appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea mais avec des planaires appartenant à l’espèce Dugesia japonica.
2) Résultats de l’analyse du microbiote
Les planaires nourries avec le foie de veau contenaient 9 bactéries pathogènes pour l’ Homme (Tableau 4 reproduit ci-dessous).
[Table 4]
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[109] Le nourrissage de Dugesia japonica exclusivement avec de la levure maltée a permis l’élimination de toutes les bactéries pathogènes pour l’Homme détectées lorsque les planaires sont nourries avec du foie de veau. Aucune bactérie pathogène pour l’Homme n’a été détectée chez Dugesia japonica nourri exclusivement avec de la levure maltée.
3) Conclusion
Le nourrissage des planaires Dugesia japonica exclusivement à la levure maltée a permis d’éliminer les microorganismes pathogènes pour l’Homme. Ces planaires dépourvues de microorganismes pathogènes pour l’Homme sont particulièrement adaptés pour la préparation d’un extrait de planaires qui ne présente pas de risque pour l’Homme.
[110] c) Planaires appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea nourries avec de la levure maltée inactivée par la chaleur
1) Matériel et méthode Le matériel et méthode de cet essai est le même que celui mis en œuvre dans l’exemple 1 de la demande de brevet mais en nourrissant les planaires exclusivement avec de la levure maltée inactivée et non pas exclusivement avec de la levure maltée vivante.
La levure maltée est inactivée par traitement à la chaleur à une température de 50 °C pendant 1 heure.
2) Résultats de l’analyse du microbiote Les planaires appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea nourries exclusivement avec de la levure maltée inactivée contiennent des bactéries pathogènes pour l’Homme, à savoir :
[Table 5]
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3) Conclusion
Le nourrissage des planaires avec de la levure maltée inactivée ne permet pas d’éliminer les microorganismes pathogènes pour l’Homme présents dans Schmidtea mediterranea.
[111] d) Planaires appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea nourries avec de la levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae)
1) Matériel et méthode
Le matériel et méthode de cet essai est le même que celui mis en œuvre dans l’exemple 1 de la demande de brevet mais en nourrissant les planaires exclusivement avec de la levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae et non pas exclusivement avec de la levure maltée Saccharomyces cerevisiae + malt selon l’invention).
2) Résultats de l’analyse du microbiote
[112] Les planaires appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea nourries exclusivement avec de la levure de boulanger contiennent des bactéries pathogènes pour l’Homme, à savoir :
[113] [Table 6]
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Figure imgf000022_0002
3) Conclusion
Le nourrissage des planaires avec de la levure de boulanger ne permet pas d’éliminer les microorganismes pathogènes pour l’Homme présents dans Schmidtea mediterranea.
[114] Exemple 2 : Essais de différents régimes alimentaires sans élément d’origine animale sur des planaires appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea.
[115] Les planaires appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea sont nourries selon la même méthode qu’à l’ Exemple 1 partie a) avec différentes nourritures sans élément d’origine animale. Les différentes nourritures testées sont les suivantes : levure de boulanger, spiruline, tofu, protéines de soja, lait de soja, flocons d’avoine ou malt.
Les résultats obtenus sont reproduits dans le tableau ci-dessous.
[Table 7]
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* après (*) après deux nourrissages les planaires refusent de se nourrir de levure de boulanger [116] Les plathelminthes ne se nourrissent de façon pérenne avec aucune de ces nourritures sans élément d’origine animale. De façon étonnante, les plathelminthes n’acceptent pas de se nourrir avec du malt contrairement à la levure maltée. Le nourrissage des plathelminthes avec chacun des aliments dépourvus d’éléments d’origine animale, sauf la levure maltée, ne permet pas d’éliminer les microorganismes pathogènes pour F Homme présents dans Schmidtea mediterranean
[117] De façon encore surprenante, les plathelminthes n’acceptent pas de se nourrir de façon pérenne avec de la levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) mais acceptent de se nourrir avec de la levure maltée (Saccharomyces cerevisiae avec du malt), qui diffère de la levure de boulanger seulement par la présence de malt.
[118] Exemple 3 : Préparation de l’extrait de planaires nourris à la levure maltée
[119] 1. Préparation des planaires
[120] Environ 400 planaires (Schmidtea mediterranean nourries avec de la levure maltée conformément à l’Exemple 1 (masse humide comprise entre 0,1g et 0,4g) ont été privées de nourriture pendant 2 semaines.
[121] Les planaires ont été lavées 2 fois avec 200 ml d’eau stérile (céramique : microfiltration (0,2 micron), intérieur de la céramique anti bactérie, charbon actif compacté). Les planaires lavées ont été transférées dans un tube et l’eau a été enlevée puis les planaires ont été congelés à - 80°C.
[122] 2. Obtention de l’extrait
[123] Le tube contenant les planaires congelées a été posé sur de la glace jusqu'à décongélation. 20 ml d’eau stérile (température de 4°C) ont été ajoutés aux planaires décongelées. 1 cm de bille verre stérile (diamètre 3 mm) ont été ajoutées dans le tube (tube A).
[124] Le tube A a été mixé à l’aide d’un agitateur mécanique pendant 5 minutes, à 2500 cycles/minute. Le contenu du tube A a été passé au travers d’une seringue équipé d’une aiguille 23 g et placé dans un nouveau tube (tube B).
[125] Au tube A, contenant les billes de verre et les résidus qui sont restés collés aux billes, il a été ajouté 20 ml d’eau stérile (température de 4°C). Le tube A a été de nouveau mixé à l’aide d’un agitateur mécanique pendant 5 minutes, à 2500 cycles/minute. Le contenu du tube A a été de nouveau passé au travers d’une seringue équipé d’une aiguille 23 g puis transféré dans le tube B. Le tube B contient maintenant 40 ml d’extrait brut de planaire. [126] Le tube Best centrifugé 5 min à 3220g à 4°C puis le surnageant du tube B a été filtré sur une membrane 1,20 m (filtrat 1). Le filtrat 1 a ensuite été filtré sur membrane 0,80 m (filtrat 2). Le filtrat 2 a ensuite été filtré sur membrane 0,45 pm (filtrat 3). Le filtrat 3 a ensuite été filtré sur membrane 0,2 pm (filtrat 4). Le filtrat 4 ne contenait que des particules inferieures à 0,2 pm.
[127] La concentration protéique du filtrat 4 a été déterminée par absorbance à la longueur d'onde de 280 nm. Pour 400 planaires de départ (masse humide comprise entre 0,1g et 0,4g) la concentration protéique obtenue était comprise entre 17,5 et 20 mg de protéine/mL.
[128] Le filtrat 4 (correspondant à un extrait aqueux débarrassé de tout débris solide non soluble de taille supérieure à 0,2 pm) a été lyophilisé et conservé à 4°C pour une utilisation ultérieure.
[129] Le filtrat 4 a été analysé en triplicat par MALDI-TOF selon le protocole détaillé ci-après.
[130] Protocole d’analyse MALDI-TOF
[131] Un échantillon de 1 pL d'extrait aqueux de l'exemple 4A a été dilué au l/20ème avec un mélange acide trichloracétique, acétonitrile et eau a été déposé sur une matrice HCCA. Puis, 1 pL de matrice saturée HCCA a été ajoutée par-dessus, puis le tout a été séché pendant 10 minutes. L'analyse de l’extrait a été effectuée avec un spectromètre de masse Maldi-Tof Microflex LT10 (Bruker). Les résultats ont été collectés avec le logiciel MALD1 Biotyper RTC.
[132] La méthode d'acquisition des spectres comprenait les étapes et caractéristiques suivantes :
- introduire la plaque (cible Microflex modèle de référence 224989 dénommé M5P 96) contenant les dépôts dans le spectromètre de masse Microflex LT,
- démarrer l'ordinateur associé au spectromètre pour lancer les analyses et
- lancer l'acquisition des spectres de masse MALDI-TOF.
[133] Les paramètres appliqués au spectromètre de masse étaient les suivants : mode linéaire positifl Electrode 151 : 20,00 kV, Electrode 152 : 18,05 kV, Electrode de focalisation : 6 kVl Fréquence du laser : 60Hz, Gain du détecteur : 8,8 X, Post Ion Extraction (PIE) : 120 ns, Gamme de masse : de 700 à 20000 Da.
[134] Les spectres ont été obtenus via une méthode automatique contrôlée par le logiciel FLEXCONTROL® du fabricant BRUKER DALTONICS® les paramètres étaient les suivants pour chaque spot mombres séries de 40 tirs: 6 sur des positions différentes du spot (6x40=240 spectres), afin que les tirs aient balayé l'ensemble de l'échantillon de façon homogène l'acquisition se fait sur 6 positions différentes selon une géométrie hexagonale, pré- tirs : 10 tirs à 40% de la puissance maximum laser servent à dessaler l'échantillon (contamination par les sels minéraux), puissance laser : 30 % à 45 % régulée via le logiciel FLEXCONTROL®, sélection du spectre : sur une gamme de masse de 2000 à 20 000 Da. L'acquisition des spectres est au final réalisée via le logiciel BIOTYPER® du fabricant BRUKER DALTONICS® qui permet d'appliquer la méthode automatique décrite ci-dessus à une série d'échantillons en prenant en compte les critères mentionnés précédemment et un score de qualité ou score de validation qui représentent l'addition de 2 notes ni + n2 (ni étant fonction du nombre de pics et n2 fonction du rapport signal/bruit de fond) :
- ni est la note attribuée en fonction du nombre de pics caractéristiques du spectre n, avec : ni = 0 pour n ::s: 8, ni = 1 pour 8 < n ::s: 27, ni = 2 pour 27 < n :s; 43, ni = 3 pour 43 < n :s; 78, ni = 4 pour 78 < n 86, ni = 5 pour 86 < n 110, ni = 6 pour 110 < n, et
- n2 est la note attribuée en fonction de la valeur du rapport signal/bruit (Rmax) du pic de plus grande intensité du spectre, avec n2 = 0 pour Rmax :s; 6,8, n2 = 1 pour 6,8 < Rmax ::s: 26,8, n2 = 2 pour 26,8 < Rmax ::s: 52,6, n2 = 3 pour 52,6 < Rmax ::s: 208,6, n2 = 4 pour 208,2 < Rmax 398,6, n2 = 5 pour 398,6 < Rmax ::s: 1092,2, n2 = 6 pour 1092,2 < Rmax.
[135] Un spectre est pris en compte si son score de validation (nl+n2) est supérieur à 2.
[136] Résultats de l’analyse MALDI-TOF
[137] Les données sont présentées dans le tableau 8 (m/z : masse sur charge, intensité : intensité du signal ; S/N : signal sur bruit).
[Table 8]
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
[138] Exemple 4 : effet de l’extrait aqueux de planaire (filtrat 4 obtenu à l’Exemple 3)
[139] 1. Toxicité de l’extrait aqueux de planaire
[140] La cytotoxicité de l’extrait aqueux obtenu à l’Exemple 3 (filtrat 4) a été testée sur des cellules lymphocytaires humaines HL60 (ATCC CCL-240). Les cellules ont été mises en contact avec différentes dilutions de l’extrait. Brièvement, 5xl04 cellules / puit (plaque de 24 puits) ont été mises en culture dans du milieu RPMI (GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/ml, 5000pg/ml respectivement), à 37°C, et sous atmosphère 5% CO2. [141] A la dilution de 1:5 (soit 0,3 mg de protéines/ml d’extrait) l’extrait a entrainé la mort des cellules. Les dilutions 1:20 (soit 75 pg de protéines/ml d’extrait) et 1:100 (soit 15pg de protéines/ml d’extrait), n’ont pas affectées la viabilité des cellules (Figure 1). [142] 2. Effet de l’extrait aqueux de planaire sur la multiplication des cellules souches humaines
[143] Les cellules utilisées étaient des cellules souche humaine (ATCC CLS-300702). Les cellules ont été mises en contact avec différentes dilutions de l’extrait. Brièvement, 5xl03 cellules / puit, sur une plaque de 48 puits, ont été mises en culture dans du milieu DMEM/E12 (GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/ml, 5000pg/ml respectivement), à 37°C, et sous atmosphère 5% CO2. Les résultats sont présentés à la Ligure 2A à D. Seule une dilution (1/20 ; Ligure 2B), qui est comprise entre 1:5 (Ligure 2A) et 1:100 (Ligure 2C), a permis une induction significative (*p<0.05) de la prolifération des cellules souche humaine comparé aux cellules non traité. L’induction de la multiplication était d’environ 1,6 fois. La Ligure 2D montre la croissance des cellules souches humaines traitées par l’extrait aqueux de planaire dilué au l/20e pendant 9 jours et le contrôle sans traitement. Les cellules ont été colorées au Giemsa.
[144] 3. Mesure de l’effet de l’extrait aqueux de planaire sur la multiplication de cellules épithéliale humaine
[145] Les cellules utilisées étaient des cellules humaines épithéliales (ATCC CCL-2). Les cellules ont été mises en contact avec différentes dilutions de l’extrait. Brièvement, 5xl03 cellules / puit, sur une plaque de 48 puits, ont été mises en culture dans du milieu DMEM (GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/ml, 5000pg/ml respectivement), à 37°C, et sous atmosphère 5% CO2.
[146] Une dilution (1/20 ; Ligure 3B), allant de 1:5 (Ligure 3A) à 1:100 (Ligure 3C), a permis une induction significative (*p<0.05) de la prolifération des cellules épithéliales humaines comparé aux cellules non traitées. L’induction de la multiplication était d’environ 1,8 fois. La Ligure 3D montre la croissance des cellules épithéliales humaines traitées par l’extrait aqueux dilué au l/20e pendant 9 jours et le contrôle sans traitement. Les cellules ont été colorées au Giemsa.
[147] 4. Effet de l’extrait aqueux de planaire sur la multiplication des cellules endothéliales humaines
[148] Les cellules utilisées étaient des cellules humaines endothéliales (ATCC CRL-1730). Les cellules ont été mises en contact avec différentes dilutions de l’extrait. Brièvement, 5xl03 cellules / puit, sur une plaque de 48 puits, ont été mises en culture dans du milieu DMEM (GibCoBRL) complémenté avec du sérum de veaux fœtal (10%) et de la pénicilline et streptomycine (5000U/ml, 5000pg/ml respectivement), à 37°C, et sous atmosphère 5% CO2. [149] Une dilution (1/20 ; Figure 4B), allant de 1:5 (Figure 4A) à 1:100 (Figure 4C), a permis une induction significative (*p<0.05) de la prolifération des cellules endothéliales humaines comparé aux cellules non traitées. L’induction de la multiplication a été d’environ 1,38 fois.
[150] 5. Effet de l’extrait aqueux de planaire traité par la chaleur sur la réplication des cellules souches humaines (ATCC CLS-300702), endothéliales humaines (ATCC CRL-1730), épithéliales humaines (ATCC CCL-2)
[151] Une dilution au 1/20 de l’extrait aqueux de planaire obtenu à l’Exemple 3 (filtrat 4) a été traité à 95°C pendant 10 minutes est ajouté aux cellules humaines d’intérêt. La multiplication des cellules a été mesurée âpres 9 jours.
[152] La chaleur a inactivé l’activité de l’extrait puisque qu’aucune prolifération cellulaire n’a été observée, que ce soit pour les cellules souches humaines (Figure 5A), épithéliales humaines (Figure 5B), ou endothéliales humaines (Figure 5C). L’extrait aqueux de planaire inactivé par la chaleur n’induit pas la multiplication cellulaire.
[153] Cela suggère que les propriétés de l’extrait proviennent des protéines contenues dans l’extrait.
[154] 6. Effet de l’extrait aqueux de planaire sur la cicatrisation d’un tapis cellulaire de cellules souches humaines (ATCC CLS-300702) et de cellules épithéliales humaines (ATCC CCL-2)
[155] Les cellules ont été cultivées à confluence jusqu'à former un tapis cellulaire. Une lésion de 325 pin de large du tapis cellulaire a été faite à l’aide d’une aiguille calibrée, puis une dilution au 1/20 de l’extrait aqueux de planaire a été ajoutée ou pas à la culture cellulaire. La cicatrisation du tapis cellulaire (remplissage complet de la lésion par des cellules neuve) a été suivie au cours du temps.
[156] Les résultats sont illustrés aux figures [Fig. 6 A] et [Fig. 6B].
[157] Il a été observé que pour les cellules souches humaines, comme pour les cellules épithéliales, la cicatrisation de la lésion du tapis cellulaire était quasi complète après 24h, et la lésion était totalement fermée après 48h de traitement avec l’extrait aqueux de planaire dilué au 1:20e. En absence d’extrait la cicatrisation n’était pas complète après 48h.
[158] 7. Effet l’extrait aqueux de planaire sur l’induction de gènes dans les cellules humaine
[159] Des cellules humaine épithéliales, endothéliales (ATCC CRL-1730) et souches (ATCC CLS- 300702) ont été traitées avec une dilution au l/20e de l’extrait aqueux de planaire, puis l’expression de certains gènes a été mesurée par PCR quantitative. L’expression a été exprimée en « fold change ». Plus le « fold change » est élevé plus le gène est exprimé.
[160] Les résultats sont présentés dans le tableau 9. [Table 9]
Figure imgf000029_0001
[161] En fonctions du type cellulaire, il a été observé que l’extrait aqueux de planaire induisait les gènes de la cicatrisation, des gènes immunitaires, des gènes du renouvellement cellulaire, des gènes de la migration cellulaire, des gènes de la protection contre le photo-aging, des gènes anti mort cellulaire, et des gènes activateur des récepteurs a l’acide hyaluronique.
Brève description des dessins
[162] La Figure 1 illustre la mesure de la cytotoxicité de l’extrait aqueux de planaire sur les cellules lymphocytaire humaine.
[163] Les figures 2A à 2D illustrent la mesure de l’extrait aqueux de planaire sur la multiplication de cellule souche humaine. Seule une dilution comprise (1/20, B) entre 1/5 (A) et 1/100 (C) permet une induction significative (*p<0.05) de la prolifération des cellules souches humaine scomparé aux cellules non traitées. La Figure 2D montre la croissance des cellules souches humaines traitées par l’extrait aqueux de planaire dilué au 1/20 pendant 9 jours et le contrôle sans traitement. Les cellules sont colorées au Giemsa.
[164] Les figures 3A à 3D illustrent la mesure de l’effet l’extrait aqueux de planaire sur la multiplication de cellules épithéliales humaines. Les cellules utilisées sont des cellules humaines épithéliales (ATCC CCL-2). Une dilution (1/20 ; B) et 1:5 (A) et 1:100 (C) permet une induction significative (*p<0.05) de la prolifération des cellules épithéliales humaines comparé aux cellules non traité. La Figure 3D montre la croissance des cellules épithéliales humaines traitées par l’extrait aqueux de planaire dilué au 1/20 pendant 9 jours et le contrôle sans traitement. Les cellules sont colorées au Giemsa.
[165] Les figures 4A à 4C illustrent la mesure de l’effet de l’extrait aqueux de planaire sur la prolifération des cellules endothéliales humaines. Les cellules utilisées sont des cellules humaines endothéliales (ATCC CRL-1730). Une dilution (1/20 ; B) et 1:5 (A) et 1:100 (C) permet une induction significative (*p<0.05) de la prolifération des cellules endothéliales humaines comparé aux cellules non traitées.
[166] Les figures 5A à 5C illustrent la mesure de l’effet de l’extrait aqueux de planaire traité par la chaleur sur la réplication des cellules souche humaine (ATCC CLS-300702), endothéliales humaines (ATCC CRL-1730), épithéliale humaine (ATCC CCL-2). Une dilution au 1/20 de l’extrait aqueux de planaire est traité à 95°C pendant 10 minutes est ajouté aux cellules humaines d’intérêt et la multiplication des cellules est mesuré après 9 jours. La chaleur inactive l’activité de l’extrait aqueux de planaire puisque qu’aucune prolifération cellulaire n’est observée que ce soit pour les cellules souches humaines (A), épithéliales humaines (B), ou endothéliales humaines (C). L’extrait aqueux de planaire inactivé par la chaleur n’induit pas la multiplication cellulaire.
[167] Les figures 6A et 6B illustrent la mesure l’effet de l’extrait aqueux de planaire sur la cicatrisation d’un tapis cellulaire de cellules souches humaines et de cellules épithéliales humaines. Les cellules humaines d’intérêt sont cultivées à confluence jusqu'à former un tapis cellulaire. Une lésion de 325 pm de large, du tapis cellulaire est faite à l’aide d’une aiguille calibrée, puis l’extrait aqueux de planaire dilué au l/20e est ajouté ou pas à la culture cellulaire. La cicatrisation du tapis cellulaire (remplissage complet de la lésion par des cellules neuves) est suivie au cours du temps. Nous observons que pour les cellules souches humaines, comme pour les cellules épithéliales, la cicatrisation de la lésion du tapis cellulaire est quasi complète après 24h, et la lésion est totalement fermée après 48h de traitement avec l’extrait aqueux de planaire dilué au l/20e. En absence de traitement la cicatrisation n’est pas complète après 48h.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Procédé de nourrissage de plathelminthes, dans lequel les plathelminthes sont nourris exclusivement avec de la levure maltée.
[Revendication 2] Procédé de préparation d’un extrait de plathelminthes, comprenant les étapes de :
(i) nourrir des plathelminthes en mettant en œuvre le procédé de la revendication 1 , et
(ii) préparer un extrait des plathelminthes à partir des plathelminthes obtenus à l’étape (i).
[Revendication 3] Extrait de plathelminthes nourris exclusivement avec de la levure maltée susceptible d’être obtenu par la mise en œuvre du procédé de la revendication 2, lesdits plathelminthes étant dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’ Homme.
[Revendication 4] Extrait selon la revendication 3, lesdits microorganismes pathogènes pour l’Homme sont Aeromonas veronii, Staphylococcus capitis, Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter guillouiae, Aeromonas hydrophila, Delftia acidovorans, Comamonas testosteroni, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus et Staphylococcus haemolyticus.
[Revendication 5] Extrait selon l’une quelconque des revendications 3 ou 4, le plathelminthe étant de la classe des rhabditophora, de préférence étant une planaire, de préférence appartenant à l’espèce Schmidtea mediterranea.
[Revendication 6] Extrait selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, étant débarrassé de tout débris solide non soluble.
[Revendication 7] Extrait selon l’une quelconque des revendications 3 à 6, comprenant de 15 pg à 50 mg de protéines par mL d’extrait (mg/mL).
[Revendication 8] Extrait selon l’une quelconque des revendications 3 à 7, comprenant moins de 0,5 mg/mL de protéines par mL d’extrait (mg/mL), par exemple entre 15 pg/mL et 0,3 mg/mL, de préférence de 15 pg/mL à 75 pg/mL.
[Revendication 9] Extrait selon l’une quelconque des revendications 3 à 8, ayant un spectre MALDI-TOF correspondant aux données présentées dans le Tableau 1.
[Revendication 10] Composition comprenant un ou plusieurs plathelminthes nourris avec de la levure maltée, ledit ou lesdits plathelminthes étant dépourvus de microorganismes pathogènes pour l’Homme.
[Revendication 11] Composition comprenant un extrait selon l’une quelconque des revendications 3 à 9.
[Revendication 12] Procédé d’élimination de microorganismes pathogènes présents dans un ou plusieurs plathelminthes, ledit procédé comprenant une étape qui consiste à nourrir un ou des plathelminthes exclusivement avec de la levure maltée pendant une durée suffisante pour éliminer lesdits microorganismes pathogènes.
[Revendication 13] Procédé de préparation d’un extrait selon l’une quelconque des revendications 3 à 9, comprenant les étapes de : (a) obtenir des plathelminthes dépourvu de microorganismes pathogènes pour l’Homme en mettant en œuvre le procédé de la revendication 12 ;
(b) préparer un extrait de plathelminthe à partir des plathelminthes obtenus à l’étape (a).
[Revendication 14] Utilisation d’un extrait selon l’une des revendications 3 à 9 ou d’une composition selon la revendication 11 , pour cultiver des cellules humaines ou animales in vitro ou ex vivo, dans laquelle lesdites cellules humaines ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines nécessitant la destruction d’un embryon humain et ayant la capacité de se développer en être humain.
[Revendication 15] Extrait selon l’une quelconque des revendications 3 à 9 ou composition selon la revendication 11 pour son utilisation comme médicament. [Revendication 16] Extrait selon l’une quelconque des revendications 3 à 9 ou composition selon la revendication 11, pour son utilisation pour favoriser la cicatrisation d’une plaie de la peau ou d’une brûlure de la peau.
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