WO2022039506A1 - Ｍabc-r 감염에 의한 병적 염증 치료제로서의 미토콘드리아 표적 항산화제 - Google Patents

Ｍabc-r 감염에 의한 병적 염증 치료제로서의 미토콘드리아 표적 항산화제 Download PDF

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sirt3
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mycobacterium
mitochondrial
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating nontuberculous mycobacteria (NTM) infectious diseases comprising a compound represented by the following Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • NTM nontuberculous mycobacteria
  • Mycobacterium abscessus ( Mycobacterium abscessus , Mabc) is a non-tuberculous mycobacterium that causes numerous human infections commonly associated with lung disease (Refs [1,2]).
  • Mycobacterium absesus is a subspecies of the Mabc complex, including Mycobacterium absesus, Mycobacterium massiliense , and Mycobacterium bolletii, which are major due to antibiotic resistance. It has clinical significance (References [2, 3]).
  • Mabc often causes lung infections in immunodeficiency patients, such as cystic fibrosis, and may threaten immune-competent individuals (Refs [4,5]).
  • Mabc is divided into two morphological types: smooth and rough variants (refs [6,7]).
  • the Mabc rough (Mabc-R) variant is more toxic and invasive than the Mabc smooth form.
  • Mabc-R has very minimal glycopeptidolipid (GPL) that masks basic phosphatidyl-myo-inositol mannosides and induces innate immune and inflammatory responses (Ref. [8] ]).
  • GPL glycopeptidolipid
  • Mitochondria are essential intracellular organelles for oxidative energy metabolism, adenosine triphosphate (ATP) production, and calcium homeostasis (Ref. [10]).
  • ATP adenosine triphosphate
  • Ca homeostasis In mitochondria, numerous proteins/enzymes involved in the respiratory chain reaction, dynamics and energy metabolism are regulated by lysine acetylation (Ref. [10]).
  • SIRT3 sirtuin 3
  • NAD+ nicotinamide adenine dinucleotide
  • SIRT3 plays an important role in non-metabolized cells and tissues, including lung and immune cells (refs [10,12-15]).
  • SIRT3 is required for the host's innate defense against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection through a recent study.
  • SIRT3 contributes to mitochondrial homeostasis and xenophagy activation in macrophages during Mtb infection (Ref. [16]).
  • Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae observations of the function of SIRT3 in host defense against a variety of bacterial and fungal infections were inconsistent (Ref. [15]).
  • SIRT3 modulators have recently been identified, which can ultimately be used as promising drugs for the modulation of numerous human disorders (Ref. [12]).
  • the therapeutic potential of SIRT3 targeted therapeutics can be validated as a potential drug target for the treatment of Mycobacterium abscessus infection in vivo.
  • It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for use in the prophylaxis or treatment of non-tuberculous Mycobacterium Infectious Diseases comprising a compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the compound represented by Formula 1 which is a mitochondrial ROS scavenger, confirmed the therapeutic effect on Mabc infection through improvement of pathological inflammation and inhibition of mitochondrial ROS. More specifically, in one embodiment, the effect of the compound represented by Formula 1 in improving the reduced SIRT3 mRNA level due to non-tuberculous mycobacterium infection was confirmed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of non-tuberculous mycobacterium-infectious diseases comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the compound represented by Formula 1 5-[(1,1-dioxido-4-thiomorpholinyl)methyl]-2-phenyl- N- (tetrahydro- 2H -pyran-4- I)-1H-indole-7-amine is a compound disclosed in International Patent Publication No. WO2009-025477 , and is a substance known to exhibit preventive or therapeutic and ameliorating effects on cell necrosis and related diseases.
  • the compound of Formula 1 is known to exhibit preventive or therapeutic and ameliorating effects on cell necrosis and related diseases.
  • the cell necrosis and related diseases are acute/chronic liver diseases (eg hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis), neurodegenerative diseases (eg dementia, Parkinson's disease, Huntington's disease), ischemic heart disease, Reperfusion injury (Korean Patent No.
  • ischemic stroke or ischemic injury pancreatitis, bacterial/viral sepsis, diabetes or diabetic complications, diabetic vascular disease
  • diabetes in particular, are caused by substances that destroy pancreatic cells and , viruses, hyperglycemia, fatty acids, diet, toxins, streptozotocin, etc.], necrotizing procolitis, cystic fibrosis, rheumatoid arthritis, degenerative arthritis, nephropathy, bacterial infection, viruses Infection (eg HIV), multiple sclerosis, leukemia, lymphoma, neonatal respiratory distress syndrome, asphyxiation, tuberculosis, endometriosis, angioplasty, psoriasis, frostbite, complications from steroid treatment, necrosis, tenderness, hemoglobinuria, burns, hyperthermia, Crohn's disease, celiac disease, compartment syndrome, leachate damage, glomerulonephritis, muscular dystrophy
  • cell necrosis caused by drugs and toxic substances and related diseases include alcoholism, cocaine, drugs (eg paracetamol, antibiotics, anticancer drugs, adriamycin, puromycin, bleomycin) , exposure to and/or administration of NSAIDs, cyclosporine, chemical toxins (eg carbon tetrachloride, cyanide, methanol, ethylene glycol), poison gases, pesticides, heavy metals (eg lead, mercury, cadmium) and/or or necrosis associated with self-administration, damage caused by exposure to radiation/UV, and cell necrosis associated therewith.
  • drugs eg paracetamol, antibiotics, anticancer drugs, adriamycin, puromycin, bleomycin
  • NSAIDs eg cyclosporine
  • chemical toxins eg carbon tetrachloride, cyanide, methanol, ethylene glycol
  • poison gases eg lead, mercury, cadmium
  • heavy metals
  • the compound of Formula 1 is a cell necrosis and related diseases, additional acute / chronic kidney disease, traumatic brain injury, neurodegenerative diseases Lou Gehrig's disease, necrotizing colitis, viral infection (eg SARS-CoV) , psoriasis and skin diseases including allergic dermatitis, organ preservation / organ transplantation (refer to Korean Patent Nos. 10-1098583, 10-1941004) are also expected to show prevention or treatment and improvement effects.
  • the pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1 has a function of regulating intracellular calcium, and can improve ER stress and mitochondrial dysfunction caused by abnormal intracellular calcium levels. Accordingly, the pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1 is expected to exhibit preventive or therapeutic and ameliorating effects on related diseases.
  • Related diseases include:
  • Demyelination diseases including demyelination and amyotrophic lateral sclerosis (ALS), hypertension including pulmonary arterial hypertension, stroke, prion disease, epilepsy, ataxia, Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer's disease. Cell Calcium. Oct-Nov 2003;34(4-5) :385-97. Mitochondrial disorders: challenges in diagnosis & treatment. See Indian J Med Res. 2015 Jan;141(1) :13-26. )
  • IBD inflammatory bowel disease
  • metastasis reticulum stress and oxidative stress in cell fate decision and human disease
  • Mitochondrial diseases the contribution of organelle stress responses to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018 Feb;19(2) :77-92.Seminars in medicine of the Beth Israel Hospital , Boston.Mitochondrial DNA and disease.N Engl J Med.1995 Sep 7:333(10) :638-44. Mitochondrial injury and dysfunction in hypertension-induced cardiac damage. Eur Heart J. 2014 Dec 7; 35(46): 3258 -3266. Reference)
  • Duchenne muscular dystrophy is associated with the inhibition of calcium uniport in mitochondria and an increased sensitivity of the organelles to the calcium-induced permeability transition. Biophys Acta Mol Basis Dis . 2020 May 1;1866(5) :165674. Reference)
  • the pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1 exhibits liver protection and liver function improvement effects, as well as chronic liver diseases such as fatty liver, liver fibrosis and cirrhosis, hepatitis caused by viruses or drugs, etc. It shows the effect of preventing or treating chronic liver disease.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can also be used for the treatment of liver diseases selected from liver transplantation, alcoholic or nonalcoholic fatty liver (see Korean Patent No.
  • composition according to the present invention is effective for treating or preventing fatty liver derived from fatty acids or acute or chronic liver disease derived from fatty liver.
  • the compound of Formula I can enhance the differentiation efficiency and maturity of stem cell-derived cardiomyocytes, including the step of culturing the stem cells.
  • the compound of Formula 1 can be used for preventing and treating mucositis.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a non-tuberculous mycobacterium infection disease, comprising administering the pharmaceutical composition according to the present invention to an individual in need thereof.
  • the nontuberculous mycobacterium mycobacteria is Mycobacterium complex and leprosy ( M. leprae )
  • Mycobacterium avium Mycobacterium avium
  • Mycobacterium intra At least one selected from the group consisting of Mycobacterium intracellulare , Mycobacterium kansasii , Mycobacterium fortuitum , and Mycobacterium abscessus . It may be one, preferably Mycobacterium abscessus ( Mycobacterium abscessus ) It may be, but is not limited thereto.
  • the non-tuberculous antibacterial infection disease may include one or more selected from the group consisting of lung disease, lymphadenitis, skin/soft tissue/bone infection, and disseminated disease, Symptoms caused by a fungal infection are not limited.
  • Pulmonary diseases caused by conventional Mycobacterium absesus strains are clarithrimycin together with amikacin, imipenem , and cefoxitin with one of two injections. It is known that medication must be used.
  • the compound represented by Formula 1 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is clarithromycin; and amikacin, imipenem, and cefoxitin.
  • treatment means stopping or delaying the progression of a disease when used in a subject showing symptoms of onset
  • prevention means stopping the symptom of an onset when used in a subject that does not show symptoms of onset but is at high risk. or to delay.
  • the “pharmaceutical composition” may include a pharmaceutically acceptable carrier along with the compound of the present invention, if necessary.
  • the compound of Formula 1 according to the present invention may be administered in various oral and parenteral formulations during clinical administration, and when formulated, commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, diluents such as surfactants, or It is prepared using excipients.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, troches, and the like, and such solid preparations include one or more compounds of the present invention and at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, water It is prepared by mixing sucrose or lactose or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate talc are also used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, or syrups. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. can
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, and the like can be used.
  • the effective dosage of the compound of Formula 1 for the human body of the present invention may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health status and disease level, and is generally about 0.001-100 mg/kg/day and preferably 0.01-35 mg/kg/day. Based on an adult patient weighing 70 kg, it is generally 0.07-7000 mg/day, preferably 0.7-2500 mg/day, and once a day at regular time intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist It may be administered in several divided doses.
  • the term "individual” refers to animals such as horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, etc. with non-tuberculous mycobacterium infection diseases whose symptoms can be improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention; includes humans.
  • administering the pharmaceutical composition for use in prophylaxis or treatment according to the present invention to an individual it is possible to effectively prevent or treat non-tuberculous mycobacterium-infected diseases.
  • administration means introducing a predetermined substance into a human or animal by any suitable method, and the administration route of the composition for prevention or treatment according to the present invention is any general route as long as it can reach the target tissue. It can be administered orally or parenterally.
  • the compound represented by Formula 1 according to the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be used for preventing or treating nontuberculous mycobacteria (NTM) infectious diseases.
  • NTM nontuberculous mycobacteria
  • SIRT3 is essential for host defense against mycobacterial infection in vivo and in vitro (a and b).
  • b shows the result of quantifying a.
  • c Western blot analysis of lung tissue from SIRT3 WT and KO mice shows that they remain uninfected or infected intranasally with Mabc-R (1 ⁇ 10 7 CFU) for 3 days.
  • d shows SIRT3 WT and KO mice intranasally infected with various CFUs of Mabc-R (1 ⁇ 10 7 CFU) or Mabc-S (1 ⁇ 10 7 CFU) and monitored at 5 or 7 days post-infection (dpi). shows Data were expressed as log lung CFU.
  • e shows lung histopathology by H&E staining of SIRT3 WT and KO mice infected with Mabc-R for 5 days. (Quantification of results on right, left, scale bar, 5 mm).
  • f shows the intracellular survival results of Mabc-S evaluated by CFU assay.
  • non-parametric tests FIGS. 1B and 1D ); Student's t-test (bottom c, right e); One-way ANOVA (f). Data represent three independent experiments (a, c top, e left), values are mean ( ⁇ SEM) is shown.
  • FIG. 2 shows that SIRT3 is required to control pathological inflammation and mitochondrial damage during Mabc-R infection.
  • a shows the results of quantitative real-time PCR analysis in lung tissue to measure the mRNA expression of various cytokines/chemokines.
  • b shows the results of applying the supernatant of the lung lysate to an ELISA analysis of TNF (at 3 dpi) (UI: uninfected).
  • Figure 3 shows that SIRT3 is essential for improving proinflammatory cytokine expression and controlling mitochondrial ROS production in BMDM during Mabc-R infection.
  • Quantitative real-time PCR analysis for Tnf , Il6 and Cxcl2 was performed.
  • Scale bar 50 ⁇ m. *P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001. Yes, uninfected.
  • FIG. 4 shows that SIRT3 is required for mitochondrial OXPHOS function and attenuates cell death during Mabc-R infection (a and b).
  • c shows the oxygen consumption rate (OCR) analysis of SIRT3 WT and KO BMDM treated with Mabc-R (WT 18h or KO 18) or not (WT UN or KO UN) for 18 hours.
  • OCR oxygen consumption rate
  • d shows the analysis of basal respiration, reserve respiratory capacity (SRC), ATP production and maximal respiration in c
  • e shows the results of PI staining (left, representative image, right, quantitative analysis) after infection.
  • SRC reserve respiratory capacity
  • e shows the results of PI staining (left, representative image, right, quantitative analysis) after infection.
  • Scale bar 300 ⁇ m. *P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001.
  • ns does not matter. Paired t-test (right); nonparametric test (b and e right); one-way ANOVA (d).Data represent three independent experiments (a, c left and e left).Values represent the mean ( ⁇ SEM) of three or four independent experiments performed in triplicate (a right, b , d and e right))
  • FIG. 5 shows that when the compound represented by Formula 1 is administered to mice, a protective effect against Mabc-R infection appears.
  • Lung tissue was subjected to lung CFU analysis in b, qRT-PCR analysis for cytokines/chemokines in c, and TEM analysis in d. Mitochondria with intact cristae are marked as a in d, and swollen mitochondria with vacuoles in cristae are marked in b in d.
  • e shows the results of qRTPCR analysis of Sirt3 mRNA expression.
  • smooth-morphotype Mabc ATCC19977 WT (Mabc-S) strain and isogenic rough type (Mabc-R) strain were used.
  • This genetically identical rough type of strain Mabc ATCC19977 was obtained through continuous anaerobic passage of the WT strain and was previously used to study the Mabc-R virulence factor.
  • the bacterial culture solution was recovered by centrifugation, and the bacterial pellet was washed three times with PBS buffer to completely remove glycerol and BSA. Because these bacteria, especially Mabc-R, grow in cord-formatt masses, a tissue homogenizer consisting of a Teflon rod and a glass tube (Wheaton, Millville, NJ, USA) was used to Dissociated into single cells at 3000 rpm for 2 min. After the isolation process, the bacterial single cell suspension was aliquoted and stored at -70°C until just before use. Before use, the frozen bacterial stock was thawed on ice and immersed in an ultrasonic bath (As-one, Osaka, Japan) to prevent re-aggregation and used for infection procedures.
  • an ultrasonic bath As-one, Osaka, Japan
  • the Mabc CIP 104536 T R and S strains were kindly provided by Dr. Laurent Kremer (Universite de Struktur, acquainted France).
  • the Mabc CIP 104536 T R and S forms carrying the pMV262-mWasabi plasmid enabling expression of mWasabi were used to evaluate the bacterial dissemination of ZF.
  • the mid-log phase Mabc strain was harvested and clumps removed using a 26-gauge needle to remove the clumps and sonication for 30 seconds at 40 kHz three times ( Branson CPX3800, Danbury, CT, USA). Prior to injection, serially diluted stocks were plated on 7H10 agar to enumerate viable bacterial counts.
  • the inoculum was diluted with phosphate buffered saline-Tween 20 (PBST0 0.05% Tween 80 and resuspended in phenol red 0.085% to obtain 130 CFU/mL.
  • Mycobacterial infection of SIRT3 WT and KO mice was performed as previously described. A group of 6-8 week-old male mice was intranasally infected with Mabc-R (1 x 10 6 or 10 7 CFU/mouse) or Mabc-S (1 x 10 7 CFU/mouse) for 5-7 days. . Twenty-four hours post infection, the number of bacteria in the lungs of at least 3 mice was determined to identify the Mabc-R and Mabc-S inoculum and the average inoculum of mice in each group was presented.
  • SIRT3 WT and KO mice were kindly provided by Dr. Hyunsuk Kim (Ewha Mans University, Seoul, Korea) and were maintained in the absence of specific pathogens at Chungnam National University College of Medicine. Mice used in all experiments were 6-8 weeks old and were gender-matched. All mice were bred and stored according to the guidelines of Chungnam National University College of Medicine for the experiment. The mouse experimental protocol was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (CNUA-18-0117) of Chungnam National University.
  • BMDMs Primary mouse bone marrow-derived macrophages
  • BMDMs Primary mouse bone marrow-derived macrophages
  • PMs Peritoneal macrophages
  • PMs were isolated 2-3 days after injection of 1 ml of PBS supplemented with 3% thioglycolate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Prior to isolation, PMs were collected in the mouse peritoneum with pre-chilled PBS supplemented with 10% FBS.
  • BMDMs and PMs were cultured in a medium consisting of DMEM and penicillin-streptomycin-amphotericin B supplemented with 10% FBS at 37° C., 5% CO 2 atmosphere.
  • MIT-001 C25H32N4O4S2; Patent No. KR2008-0080519) was provided by Mitoimmune Therapeutics Corporation (Seoul, Korea).
  • Antibodies to SIRT3 (5490S) and ACTB (sc-47778) were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) and Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA), respectively.
  • Antibodies to NDUFA9 (ab14713) and UQCRC2 (ab14745) were purchased from Abcam (Cambridge, UK), and antibodies to SDHA (5839) and COX4 (4844) were purchased from Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA) and ATP5A ( 459240) was purchased from Thermo Fisher Scientific.
  • PI Propidium iodide
  • M36008 mitoSOX TM Red
  • 3-TYP S8628 was purchased from elleckchem.
  • Resveratrol was synthesized from 1-ethynyl-3,5-dimethoxybenzene as described in Reference [20].
  • lungs from infected mice were harvested at 5 or 7 days depending on the experimental design.
  • lungs were homogenized in PBST and serial dilutions of the homogenate were plated on duplicate plates of Middlebrook 7H10 agar.
  • CFU assay was performed as previously described in ref. [21]. Briefly, Mabc-infected BMDMs were washed with PBS, fresh medium containing 50 ⁇ g/ml gentamicin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was added and 0.3% saponin (Sigma-Aldrich) was added. ) to release intracellular bacteria. The infected lysates were then vigorously resuspended and transferred to screw-cap tubes and sonicated for 5 min in a preheated 37° C. water bath sonicator (Elma, Singen, Germany).
  • Lungs were harvested from mice infected with Mabc for 10 days. Lungs were fixed with 10% formalin and embedded with paraffin wax. For histopathology, lung paraffin sections (4 ⁇ m) were cut and stained for hematoxylin and eosin (H&E) as described in ref. [21]. To analyze the extent of tissue necrosis, PI staining was performed. To analyze the degree of tissue necrosis, lung paraffin sections (4 ⁇ m) were cut and immunostained with propidium iodide solution (P3566; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
  • P3566 propidium iodide solution
  • section images were acquired using a confocal laser scanning microscope (LSM 710; Zeiss, CLSM, Jena, Germany) with constant excitation, emission, pinhole, and exposure-time parameters. H&E staining was scanned using an Aperio digital pathology slide scanner (Leica) and imaged using an Aperio ScanScope®CS System. To quantify the site of inflammation and necrosis, the MFI of the red threshold was determined using FIJI software.
  • RNA Extraction and Quantitative Real-Time PCR ( qPCR ) analyze
  • RNA extraction and qPCR were performed as previously described in ref. [21]. Briefly, total RNA from BMDM or lung tissue was isolated using TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific). cDNA synthesis was performed using Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, 18064). qPCR was performed using cDNA, primers and SYBR Green PCR kits (Qiagen, 204074) using Real-time PCR Cycler RotorGene Q 2plex system (Qiagen GmbH, 9001620, Hilden, Germany). Samples were amplified for 50 cycles as follows: 95° C. for 5 seconds and 60° C. for 10 seconds. To analyze the qPCR data, relative quantification was performed using the 2 ⁇ Ct method using Gapdh as an internal control gene. Data are expressed as relative fold change. The primer sequences are shown in Table 1.
  • TNF concentration in lung tissue was measured using a commercially available ELISA kit (BD Biosciences, 558534, San Jose, CA, USA). Experiments were performed according to the protocol provided by the manufacturer.
  • Tissue homogenates were prepared in radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1%) supplemented with a platease and phosphatase inhibitor cocktail (Roche, Basel, Switzerland). NP-40, 0.5% DOC (deoxycholic acid), 0.1% SDS, 1 mM PMSF) (ELPIS Bio, Lexington, MA, USA). Equal amounts of protein were mixed with 5X SDS sample buffer (ELPIS) and heated for 5 minutes.
  • RIPA radioimmunoprecipitation assay
  • Proteins were then separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Millipore, Burlington, MA, USA). Membranes were blocked in 5% skim milk of TBS-T (Trisbuffered saline-Tween 20) for 1 h at room temperature and incubated overnight at 4° C.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • anti-SIRT3 5490, Cell Signaling Technologies
  • anti-ACTB sc-47778, Santa Cruz Biotechnology
  • anti-NDUFA9 ab14713, Abcam, Cambridge, UK
  • anti-SDHA 5839, Cell Signaling Technologies
  • anti-UQCRC2 ab14745, Abcam
  • anti- COX4 4844, Cell Signaling Technologies
  • anti-ATP5A 459240, Thermo Fisher Scientific
  • Blots were imaged using a chemiluminescence assay kit (Millipore) on a UVitec Alliance mini chemiluminescence device (BioSPX, Abcoude, Netherlands). ImageJ software was used to quantify band density and data were normalized to ⁇ -actin loading control.
  • Mitochondrial ROS was measured as previously described in ref. [16].
  • SIRT3 WT and KO BMDM were incubated with 3 ⁇ M MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator (Invitrogen, M36008). After 20 min, cells were washed and measured using immunofluorescence assay. At the same time, the nucleus was stained by incubation with 4'diamidino-2-phenylindole (Sigma Aldrich). Immunofluorescence images were acquired using a confocal laser-scanning microscope (Zeiss). Mean fluorescence intensity (MFI) levels of mitochondrial ROS were calculated for each sample. Each experiment was performed in triplicate, and at least 200 cells per well were counted.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • XF24 biosensor cartridges were activated with 1 ml of XF24 calibration solution (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) per well for 24 h at 37 °C in a non-CO 2 culture system.
  • SIRT3 WT and KO BMDMs infected with Mabc for 18 h were seeded at 2 x 10 4 cells per well and incubated at 37 °C for 24 h.
  • the cell plate was incubated for 1 hour at 37° C. in a non-CO 2 culture system after adding 590 ⁇ l assay medium to each well.
  • ATPase inhibitor oligomycin A (20 ⁇ g/mL, Sigma-Aldrich, MO, USA), uncoupler carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP, 50 ⁇ M, Sigma-Aldrich, MO, USA) and mitochondrial complex I
  • the inhibitor rotenone (20 ⁇ M, Sigma-Aldrich, MO, USA) was sequentially added to each well after basal OCR measurement.
  • a Seahorse Bioscience XF24 analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, Mass.) was used to measure the oxygen consumption rate of the entire process.
  • SIRT3 WT and KO mouse lung tissues were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer (pH 7.2) containing 0.1% CaCl2. After 3 hours, cells were post-fixed with 1% OsO 4 in 0.1M sodium cacodylate buffer containing 0.1% CaCl 2 for 2 hours. The tissue was rinsed with cold distilled water and dehydrated slowly using an ethanol series and propylene oxide at 4°C. Tissues were embedded in Embed-812 and cured at 60 °C for 30 hours. Ultrathin sections (70 nm) were cut with a diamond knife and a ULTRACUT UC7 ultramicrotome (Leica) and mounted on a formvar-coated copper grid.
  • Sections were stained with 4% uranyl acetate for 7 minutes and with lead citrate for 7 minutes.
  • TEM-stained sections were scanned using a bio high voltage EM system (JEM-1400 Plus and JEM-1000 BEF; JEOL Ltd., Tokyo, Japan).
  • SIRT3 WT and SIRT3 KO mice were infected with either Mabc-R or Mabc-S.
  • the in vivo bacterial load in the lungs was significantly higher in SIRT3 KO mice than in SIRT3 WT mice after Mabc-R or Mabc-S infection (Fig. 1d).
  • SIRT3 KO mice improved lung pathology at 5 dpi using Mabc-R (ie, granulomatous and inflammatory lesions of the lung) than SIRT3 WT mice (Fig. 1e).
  • Intracellular viability assays using Mabc-R were not performed because Mabc-R infection significantly induced cell death at MOI 1 (2 dpi, data not shown).
  • Mabc-R variant is more toxic and active in inducing inflammation than Mabc-S (Ref. [8])
  • Mabc-R strain was used to demonstrate the lung inflammatory response between SIRT3 WT and SIRT3 KO mice. were compared.
  • lung tissues were collected at 1 and 3 dpi and qRT-PCR analysis was performed on the mRNA levels of proinflammatory cytokines/chemokines.
  • SIRT3 is essential for mitochondrial homeostasis and functions to protect various cells and tissues from stress-induced apoptosis (Refs. [22-25]). Furthermore, we reported that SIRT3 is required for the maintenance of mitochondrial homeostasis during Mtb infection (Ref. [16]).
  • TEM data showed swollen and destroyed cristae in SIRT3-deficient lungs when compared to SIRT3 WT mice at Mabc-R infection at 5 dpi. ), showed a significant accumulation of damaged mitochondria (Fig. 2c).
  • Mabc -R increases inflammatory response and mitochondrial oxidative stress in macrophages during infection SIRT3 lack of
  • the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system is essential for energy production and cellular homeostasis (Ref. [31]).
  • OXPHOS mitochondrial oxidative phosphorylation
  • the mitochondrial ROS scavenger MIT-001 (formerly NecroX-7) abrogates mitochondrial ROS, calcium and reactive nitrogen species (refs [32,33]).
  • BMDM mitochondrial ROS
  • MIT-001 significantly inhibited mitochondrial ROS generation in response to Mabc-R infection (Fig. 5a).
  • MIT-001 significantly inhibited mitochondrial ROS generation in response to Mabc-R infection (Fig. 5a).
  • MIT-001 significantly inhibited mitochondrial ROS generation in response to Mabc-R infection.
  • MIT-001 at 1, 3, 5, 7 and 9 dpi
  • MIT-001 significantly inhibited the in vivo bacterial load in the lungs of infected mice (Fig. 5b), suggesting that inhibition of excess mitochondrial ROS is beneficial in controlling bacterial replication against Mabc infection.
  • MIT-001 the effect of MIT-001 on the pathological inflammatory response during Mabc-R infection in vivo was investigated.
  • mRNA expression of Tnf and Il6 was dramatically increased in mouse lung after Mabc-R infection ( FIG. 5c ).
  • Administration of MIT-001 markedly improved the expression of numerous inflammatory cytokines/chemokines, including Tnf , Il1b , Il6 , Cxcl2 and Cxcl5 , in the lung tissue of Mabc-R-infected mice ( FIG. 5c ).
  • TNF secretion was significantly downregulated in lung tissue of mice infected with Mabc-R by MIT-001 treatment.
  • NecroX-7 improves nonalcoholic steatohepatitis in ob/ob mice through suppression of mitochondrial ROS/RNS and inflammation. Liver Int 2015;35:1341-1353.
  • Rhoades ER Archambault AS, Greendyke R, et al.
  • Mycobacterium abscessus glycopeptidolipids mask underlying cell wall phosphatidyl-myo-inositol mannosides blocking induction of human macrophage TNF-alpha by preventing interaction with TLR2. J Immunol 2009;183:1997-2007.
  • Pillai VB Samant S, Sundaresan NR, et al. Honokiol blocks and reverses cardiac hypertrophy in mice by activating mitochondrial Sirt3. Nat Commun 2015;6:6656.

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Abstract

본 발명은 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위해 사용될 수 있다.

Description

Ｍabc-R 감염에 의한 병적 염증 치료제로서의 미토콘드리아 표적 항산화제
본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 출원일자 2020년 8월 19일자, 출원번호 10-2020-0103849, 명칭 "Ｍａｂｃ－Ｒ 감염에 의한 병적 염증 치료제로서의 미토콘드리아 표적 항산화제"에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 발명의 일부로 포함시킨다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021010982-appb-img-000001
마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus, Mabc)는 일반적으로 폐 질환과 관련된 수많은 인간 감염을 유발하는 비결핵항상균이다(참고문헌 [1,2]). 마이코박테리움 압세수스는 마이코박테리움 압세수스, 마이코박테리움 마실리엔스(Mycobacterium massiliense) 및 마이코박테리움 볼레티(Mycobacterium bolletii)를 포함하는 Mabc 복합체의 아종으로 항생제 내성으로 인해 주요한 임상적 의의를 갖는다(참고문헌[2,3]). Mabc는 종종 낭포성 섬유증과 같은 면역 결핍 환자에서 폐 감염을 일으키며, 면역 능력이 있는 개인을 위협할 수도 있다(참고문헌 [4,5]). Mabc는 콜로니 표현형에 따라 두 가지 형태학적 유형인 매끄럽고 거친 변이체로 나뉜다(참고문헌 [6,7]). Mabc 거친 (Mabc-R) 변이체는 Mabc 매끄러운 형태에 비해 더 독성이 강하고 침습적이다. Mabc-R은 기본 포스파티딜-미오-이노시톨 만노사이드(phosphatidyl-myo-inositol mannosides)를 가리고 타고난 면역 및 염증 반응을 유도하는 매우 최소의 글리코펩티도지질(glycopeptidolipid, GPL)을 가지고 있다(참고문헌 [8]).
비결핵항상균 감염 질환과 관련된 여러 위험 인자(예: 노령, 면역 조절제, 폐 기저질환)가 보고되었지만(참고문헌 [5,9]), 마이코박테리움 압세수스 감염 동안 발병과 관련된 숙주 인자는 크게 알려져 있지 않았다.
미토콘드리아는 산화 에너지 대사, 아데노신 삼인산(ATP) 생산 및 칼슘 항상성에 필수적인 세포 내 소기관이다(참고문헌 [10]). 미토콘드리아에서는 호흡 연쇄 반응, 역학 및 에너지 대사와 관련된 수많은 단백질/효소가 라이신 아세틸화에 의해 조절된다(참고문헌 [10]).
한편, 시르투인 3(SIRT3)이 미토콘드리아의 주요 탈아세틸화효소이며(참고문헌 [11]) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 의존성 단백질 탈아세틸화를 통해 미토콘드리아 기능에 영향을 미치는 것으로 알려졌다(참고문헌 [12]). SIRT3의 기능이 대사 조직에서 연구되었으며 축적된 데이터는 SIRT3이 폐 및 면역 세포를 포함한 비대사성 세포 및 조직에서 중요한 역할을 한다는 것을 암시하였다(참고문헌 [10,12-15]).
본 발명자들은 최근 연구를 통해 결핵균(Mtb) 감염에 대한 숙주의 선천적 방어에 SIRT3가 필요함을 확인하였다. 중요하게도, SIRT3는 Mtb 감염 동안 대식세포에서 미토콘드리아 항상성과 제노파지(xenophagy) 활성화에 기여한다(참고문헌 [16]). 그러나 대장균(Escherichia coli) 및 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae) 감염을 포함하여 다양한 세균 및 진균 감염에 대한 숙주 방어에서 SIRT3의 기능에 대한 관찰은 일치하지 않았다(참고문헌 [15]). 또한 최근 연구에서는 SIRT3/5 이중 녹아웃(KO) 마우스는 리스테리아(listeria) 감염에 대한 저항성이 개선된 것으로 나타났다(참고문헌 [17]). 따라서 현재까지 비결핵항상균 감염에서 SIRT3의 추정 역할은 알려져 있지 않다. 또한, 최근에는 SIRT3 조절자를 밝혀졌고, 이는 궁극적으로 수많은 인간 장애의 조절을 위한 유망한 약물로 사용될 수 있다(참고문헌 [12]). 이와 관련하여 SIRT3 표적 치료제의 치료 가능성은 생체내 마이코박테리움 압세수스 감염 치료를 위한 잠재적인 약물 표적으로 검증될 수 있다.
본 발명의 목적은 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비결핵항상균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 기술한 배경하에, 본 발명자들은 미토콘드리아 항상성이 Mabc 감염에 대한 숙주 보호에 중요한지 여부 및 SIRT3-매개 미토콘드리아 표적 요법이 생체내에서 Mabc 감염을 제어하는 데 유익한지 여부를 확인하였다. 그 결과, Mabc 감염은 대식세포에서 SIRT3의 발현 감소, 미토콘드리아 ROS(reactive oxygen species) 생성 및 미토콘드리아 기능 장애로 이어졌으며, SIRT3 결핍이 박테리아 부하(load), 미토콘드리아 ROS 및 기능 장애, Mabc 감염에 대한 병리학적 염증을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
아울러, 미토콘드리아 ROS 제거제(scavenger)인 화학식 1로 표현되는 화합물 이 병리학적 염증의 개선과 미토콘드리아 ROS의 억제를 통해 Mabc 감염에 대한 치료 효과를 확인하였다. 더욱 구체적으로, 일 실시예에서 화학식 1로 표현되는 화합물이 비결핵항산균 감염으로 인해 감소된 SIRT3 mRNA 수준을 향상시키는 효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 화학식 1로 표현되는 화합물, 5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민은 국제특허공개공보 WO2009-025477 를 통해 개시된 화합물로, 세포괴사 및 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타내는 것으로 알려진 물질이다.
WO2009-025477에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 세포괴사 및 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. WO2009-025477에 따르면, 상기 세포괴사 및 관련 질환은 급성/만성 간 질환 (예를 들어 간염, 간섬유화, 간경변), 신경퇴행성 질환 (예를 들어 치매, 파킨슨병, 헌팅톤병), 허혈성 심장질환, 재관류 손상 (한국 등록특허 10-1325272), 허혈성 뇌졸중 또는 허혈성 손상, 췌장염, 박테리아성/바이러스성 패혈증, 당뇨병 또는 당뇨병성 합병증, 당뇨병성 혈관 질환 [이들 당뇨병은 특히, 췌장세포 파괴 물질들에 기인하며, 바이러스, 고혈당, 지방산, 다이어트, 독소, 스트렙토조토신 (streptozotocin) 등에 의해 매개된다], 괴사성 프로콜리티스 (necrotizing procolitis), 낭포성 섬유증, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 신증, 박테리아 감염, 바이러스 감염 (예를 들어 HIV), 다발성 경화증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란증후군, 질식, 결핵, 자궁내막증, 혈관무력증, 건선, 동상, 스테로이드처리 합병증, 회저병, 압통, 혈색소뇨증, 화상, 고열증, 크론씨병, 셀리악병, 구획증후군, 나상맥 손상, 사구체신염, 근이양증, 대사성 유전질환, 마이코플라즈마 질환, 탄저병, 앤더슨병, 선천성 마이토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반경색, 매독, 무균성 괴사 등을 포함한다. 또한 약물 및 독성 물질에 의한 세포괴사 및 관련 질환으로는 알코올 중독 및 코카인, 약물 (예를 들어 파라세타몰 (paracetamol), 항생제, 항암제, 아드리아마이신 (adriamycin), 퓨로마이신 (puromycin), 블레오마이신 (bleomycin), NSAID, 사이클로스포린 (cyclosporine), 화학독소 (예를 들어 사염화탄소, 시아니드, 메탄올, 에틸렌 글리콜), 독가스, 농약, 중금속 (예를 들어 납, 수은, 카드뮴)에의 노출 및/또는 이들의 투여 및/또는 자가투여와 관련된 괴사, 방사능/UV에의 노출에 의한 손상 및 이와 관련된 세포괴사로 구성된 그룹에서 선택된다.
또한 상기 화학식 1의 화합물은 세포괴사 및 관련 질환 중, 추가적으로 급성/만성 신장질환, 외상성뇌손상, 신경퇴행성 질환인 루게릭병, 괴사성 대장염 (necrotizing colitis), 바이러스 감염 (예를 들어 SARS-CoV), 건선 및 알러지성 피부염을 포함하는 피부질환, 장기보존/장기이식(한국 등록특허10-1098583, 10-1941004 참조) 등에서도 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
또한 화학식 1의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 세포 내 칼슘 조절의 기능을 가지고, 비정상적 세포내 칼슘 레벨에 의한 ER 스트레스 및 미토콘드리아 기능 이상을 개선할 수 있다. 따라서 화학식 1의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 이와 연관된 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 관련 질환은 다음과 같다.
급성폐장애신드롬/급성 폐질환, 폐렴, 결핵, 천식, 폐동맥 고혈압, 만성폐쇄성 폐질환 (chronic obstruction pulmonary disease), 특발성 폐섬유화증 (idiopathic pulmonary fibrosis) 및 낭포성 폐섬유화증 (cystic fibrosis)을 포함하는 염증성 폐질환 (chronic Inflammatory pulmonary disease)(Mitochondrial dysfunction in fibrotic diseases. Cell Death Discov . 2020 Sep 5;6 :80. Mitochondrial dysfunction in lung aging and diseases. Eur Respir Rev. 2020 Oct 15;29(157) :200165. 참조, 한국 등록 특허 10-1636563 참조)
탈수초화 (demyelination)와 근위축측삭경화증 (ALS; amyotrophic lateral sclerosis)를 포함하는 탈수초질환, 폐동맥고혈압을 포함하는 고혈압, 뇌졸중, 프라이온 질병 (prion disease), 뇌전증, 운동실조 (ataxia), 편두통, 인지력 감퇴, 발작, 떨림, 정신질환 (예를 들어 우울증) (Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer's disease. Cell Calcium. Oct-Nov 2003;34(4-5) :385-97. Mitochondrial disorders: challenges in diagnosis & treatment. Indian J Med Res. 2015 Jan;141(1) :13-26. 참조)
인슐린저항성, 고지혈증, 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 크론병과 궤양성결장염을 포함하는 염증성 장질환 (IBD; inflammatory bowel disease), 각종 암 및 암의 전이 (reticulum stress and oxidative stress in cell fate decision and human disease. Antioxid Redox Signal. 2014 Jul 20;21(3) :396-413. 참조)
시각장애 관련 질병 (예를 들어 색소 망막염, 시신경병, 백내장, 녹내장), 빈혈, 담즙울혈 (cholestasis), 부갑상선 기능저하증, 범혈구 감소증, 췌장 장애, 젖산 산증 (lactic acidosis), 젖산혈증 (lactacidaemia), 청력손실, 저신장, 장폐색증, 심장 전도 결함 (cardiac conduction defect), 심장근육병증 (cardiomyopathy), 자궁내막증, 불임, 조기 갱년기(Mitochondrial diseases: the contribution of organelle stress responses to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018 Feb;19(2) :77-92. Seminars in medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Mitochondrial DNA and disease. N Engl J Med . 1995 Sep 7;333(10) :638-44. Mitochondrial injury and dysfunction in hypertension-induced cardiac damage. Eur Heart J. 2014 Dec 7; 35(46): 3258 -3266. 참조)
림바그리드/베커 근위측증 (GGMD/BMD; limbar gride/Becker muscular dystrophy)와 뒤센 근위축증 (DMD; Duchenne muscular dystrophy)을 포함하는 근위측증 질환(Duchenne muscular dystrophy is associated with the inhibition of calcium uniport in mitochondria and an increased sensitivity of the organelles to the calcium-induced permeability transition. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis . 2020 May 1;1866(5) :165674. 참조)
노화 및 노화관련 질환(Interrelation between ROS and Ca2+ in aging and age-related diseases. Redox Biology. 2020 ; 6 :101678. 참조)
WO2009-025477에 따르면, 화학식 1의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 간 보호 및 간 기능 개선 효과를 나타낼 뿐아니라 지방간, 간섬유화 및 간경변 등의 만성 간 질환, 바이러스 또는 약물로 인한 간염 등과 같은 급, 만성 간 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다. 또한, 그 결과로서 문맥 고혈압 (portal hypertension) 등의 간 질환 합병증을 예방 또는 치료할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 더욱 특히, 본 발명에 따른 의약 조성물은 또한, 간이식, 알콜성 또는 비알콜성 지방간 (한국 등록특허10-2006247 참조), 간섬유증, 간경변, 바이러스 또는 약물로 인한 간염 중에서 선택된 간 질환의 치료 또는 예방에 효과적이며, 알콜성 급, 만성 간 질환에 효과적이다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 지방산으로부터 유래된 지방간 또는 지방간으로부터 유래된 급, 만성 간질환의 치료 또는 예방에 효과적이다.
한국 등록 특허 10-1852304에 따라 화학식 I의 화합물은 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하여 줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율 및 성숙도를 증진시킬 수 있다.
또한, WO2016-072692에 따르면, 화학식 1의 화합물은 점막염 예방 및 치료 용도로도 사용 가능하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서, 상기 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM)이란, 결핵균종(Mycobacterium complex)과 나병균(M. leprae)를 제외한 다른 모든 마이코박테리아를 지칭하는 것으로서, 예를 들면, 마이코박테리움 아비늄(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 인트라셀룰레어(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 포푸이툼(Mycobacterium fortuitum) 및 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로 본 발명에 있어서, 비결핵항상균 감염 질환은 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 및 파종성 질환(disseminated disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 비결핵항산균 감염에 의해 나타나는 증상이라면 제한되지 않는다.
종래 마이코박테리움 압세수스 균주에 의해 나타나는 폐질환은 클래리스로마이신(Clarithrimycin)과 함께 아미카신 (Amikacin), 이미페넴 (Imipeneme), 세폭시틴 (Cefoxitin) 중 하나와 함께, 2가지 주사약제를 사용해야 하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 클래리스로마이신; 및 아미카신(Amikacin), 이미페넴(Imipeneme) 및 세폭시틴(Cefoxitin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 아상의 약물과 병용될 수 있다.
본 명세서에서, “치료”란 발병 증상을 보이는 개체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, “예방”이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 본 발명의 화합물과 함께 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물을 의약품으로 제형화할 경우 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 비결핵항산균 감염 질환을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써, 비결핵항산균 감염 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.
이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위해 사용될 수 있다.
도 1은 SIRT3이 생체 내 및 시험관 내에서 마이코박테리아 감염에 대한 숙주 방어에 필수적임을 보여준다(a 및 b). WT BMDM은 표시된 시간에 Mabc-R (MOI=3)에 감염되었고, 액틴 단백질 수준은 내부 대조군으로서 면역블롯팅에 의해 평가되었다. b는 a를 정량화한 결과를 보여준다. c는 SIRT3 WT 및 KO 마우스의 폐 조직에 대한 웨스턴 블롯 분석은 3일 동안 Mabc-R (1 x 107 CFU)로 비내 감염되지 않거나 감염된 상태로 유지됨을 보여준다. d는 SIRT3 WT 및 KO 마우스를 Mabc-R (1 × 107 CFU) 또는 Mabc-S (1 × 107 CFU)의 다양한 CFU로 비강 내 감염시키고 감염 후 5 또는 7 일 (dpi)에서 모니터링한 결과를 보여준다. 데이터는 로그 폐 CFU로 표시되었다. e는 5일 동안 Mabc-R에 감염된 SIRT3 WT 및 KO 마우스의 H&E 염색에 의한 폐 조직병리학을 보여준다. (오른쪽, 왼쪽에 결과의 정량화, 스케일 바, 5mm). f는 CFU 분석에 의해 평가된 Mabc-S의 세포내 생존 결과를 보여준다. SIRT3 WT 및 KO BMDM은 Mabc-S(왼쪽의 경우 MOI = 1, 오른쪽의 경우 MOI = 3)로 4시간 동안 감염된 다음 용해되어 0 및 3 dip에서 세포내 박테리아 부하를 결정하였다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 비모수 테스트(도 1b 및 1d); 스튜던트 t-검정(c 하단, e 오른쪽); 일원 분산 분석(f). 데이터는 세 가지 독립적인 실험을 나타낸다(a, c 상단, e 왼쪽), 값은 3회 반복(b, c 하단, e 오른쪽 및 f)으로 수행된 3~4개의 독립적인 실험에서 얻은 평균(± SEM)을 나타낸다.
도 2는 SIRT3가 Mabc-R 감염 동안 병리학적 염증과 미토콘드리아 손상을 제어하는 데 필요함을 보여준다. (a 및 b). SIRT3 WT 및 KO 마우스(n = 8 각 그룹)는 Mabc-R(1 x 107 CFU)로 비강 내 감염되었고 1 및 3 dpi에서 모니터링되었다. a는 폐 조직이 다양한 사이토카인/케모카인의 mRNA 발현 측정을 위해 정량적 실시간 PCR 분석을 거친 결과를 보여준다. b는 폐 용해물의 상청액을 TNF의 ELISA 분석(3dpi에서)에 적용한 결과를 보여준다(UI: uninfected). c는 SIRT3 WT 및 KO 마우스 (n = 3 각 그룹)가 Mabc-R (1 × 107 CFU)로 비강 내 감염되고 5 dpi에서 모니터링된 결과를 보여준다. 폐 조직을 채취한 후 TEM 분석을 실시하였다(왼쪽). 완전한 크리스태를 가진 미토콘드리아는 다음과 같이 표시된다. 크리스태에 공포가 있는 부은 미토콘드리아는 b에 표시되었다. 오른쪽은, Mabc-R로 비강내 감염된 SIRT3 WT 및 KO 마우스의 폐 조직에서 최소 8개의 EM 이미지에 대한 정량 분석(1 × 107 CFU, n = 각 그룹 3)을 보여준다. 전체 미토콘드리아 중 손상된 미토콘드리아의 비율을 정량적으로 계산하였다. (스케일 바, 500 nm. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s., SIRT3 WT 조건과 비교하여 유의하지 않음; 비모수 검정; 데이터는 3개의 독립적인 실험(c 왼쪽)을 나타내고 값은 3회 반복으로 수행된 3개 또는 4개의 독립적인 실험의 평균(± SEM)을 나타낸다)
도 3은 SIRT3이 Mabc-R 감염 동안 BMDM에서 전염증성 사이토카인 발현을 개선하고 미토콘드리아 ROS 생성을 제어하는 데 필수적임을 보여준다. a는 SIRT3 WT 및 KO 마우스의 BMDM을 Mabc-R(MOI = 3)에 감염시키고 3, 6 또는 18시간 동안 배양한 결과를 보여준다 (b 및 c). b의 BMDM 및 c의 PM은 SIRT3 WT 및 KO 마우스에서 제조되었으며 3-TYP(50 μM)의 존재 또는 부재하에 Mabc-R(MOI = 3)에 3 시간 동안 감염되었다. Tnf , Il6 및 Cxcl2에 대한 정량적 실시간 PCR 분석을 수행하였다. d는 SIRT3 WT 및 KO BMDM을 Mabc-R(MOI = 3)에 2시간 동안 감염시키고 MitoSOX Red 염색을 실시한 결과를 보여준다(대표 이미지는 왼쪽 패널에 표시되고 정량 분석은 오른쪽 패널에 표시됨). (스케일 바, 50μm. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 유, 감염되지 않았음. 일원 분산 분석(a-d). 데이터는 3개의 독립적인 실험(d 왼쪽)을 나타내며 값은 3중으로 수행된 3개 또는 4개의 독립적인 실험(a-c, d 오른쪽)의 평균(± SEM)을 나타냄)
도 4는 SIRT3이 미토콘드리아 OXPHOS 기능에 필요하고 Mabc-R 감염 동안 세포 사멸의 약화시키는 것을 보여준다(a 및 b). SIRT3 WT 및 KO 마우스(n = 8 각 그룹)는 Mabc-R(1 x 107 CFU)로 비강 내 감염되었고 1 및 3 dpi에서 모니터링되었다. 폐 조직을 수집하고 OXPHOS 단백질 발현 측정을 위한 웨스턴 블롯 분석(왼쪽, 대표 이미지, 오른쪽, 정량 분석) 및 qRT-PCR 분석을 수행하였다(a 및 b). c는 18시간 동안 Mabc-R로 처리(WT 18h 또는 KO 18)되거나 처리되지 않은(WT UN 또는 KO UN) SIRT3 WT 및 KO BMDM의 산소 소비율(OCR) 분석결과를 보여준다. d는 기초 호흡, 예비 호흡 능력(SRC), ATP 생산 및 c의 최대 호흡 분석을 보여주고, e는 감염 후 PI 염색(왼쪽, 대표 이미지, 오른쪽, 정량 분석) 결과를 보여준다. (스케일 바, 300μm. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. n.s., 중요하지 않습니다. 쌍 t-검정(오른쪽); 비모수 테스트(b 및 e 오른쪽); 일원 분산 분석(d). 데이터는 세 가지 독립적인 실험(a, c 왼쪽 및 e 왼쪽)을 나타냄. 값은 삼중으로 수행된 3개 또는 4개의 독립적인 실험의 평균(± SEM)을 나타냄(a 오른쪽, b, d 및 e 오른쪽))
도 5는 마우스에 화학식 1로 표현되는 화합물을 투여할 때 Mabc-R 감염에 대한 보호 효과가 나타남을 보여준다. a는 WT BMDM을 화학식 1로 표현되는 화합물 (20 μM)의 존재 또는 부재하에 2시간 동안 Mabc-R(MOI = 5)에 감염시키고 MitoSOX Red 염색(왼쪽, 대표 이미지, 오른쪽, 정량 분석)을 실시한 결과를 보여준다. 스케일 바, 50μm. (be) WT 마우스(n = 각 그룹 5)는 화학식 1로 표현되는 화합물 (30mg/kg)의 유무에 관계없이 처리하기 전에 Mabc-R(1 x 107 CFU)로 감염되지 않거나 비강내로 감염된 상태로 두었다가 감염 10일 후에 모니터링하였다. 폐 조직은 b의 폐 CFU 분석, c의 사이토카인/케모카인에 대한 qRT-PCR 분석, d의 TEM 분석에 적용되었다. 완전한 크리스태를 가진 미토콘드리아는 d의 a와 같이 표시되고 크리스태에 공포가 있는 부은 미토콘드리아는 d의 b에 표시되었다. 오른쪽은, Mabc-R(1 × 107 CFU, n =3 각 그룹)로 비강내 감염된 마우스의 각 그룹의 폐 조직에서 최소 8개의 EM 이미지의 정량 분석한 결과를 보여준다. 전체 미토콘드리아 중 손상된 미토콘드리아의 비율을 정량적으로 계산하였다 (스케일 바, 200 nm). e는 Sirt3 mRNA 발현에 대한 qRTPCR 분석결과를 보여준다. (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s., 유의하지 않음. 일원 분산 분석(오른쪽) 또는 비모수 검정(b, c, d 오른쪽 및 e)). (데이터는 3개의 독립적인 실험(a 왼쪽 및 d)을 나타내고 값은 3중으로 수행된 3개 또는 4개의 독립적인 실험(a 오른쪽, b, c 및 e)의 평균(± SEM)을 나타냄)
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실험예 및 제조예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실험예 및 제조예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
하기 실시예에서 본 명세서에 따른 화학식 1로 표현되는 화합물은 MIT-001로 기술된다.
[실시예]
재료 및 실험방법
1. 감염에 대한 마이코박테리아 균주 및 접종원 준비
본 발명에서는 매끄러운 형태(smooth-morphotype)의 Mabc ATCC19977 WT (Mabc-S) 균주 및 동질 유전자형의(isogenic) 거친 유형(rough type) (Mabc-R) 균주가 사용되었다. Mabc ATCC19977 균주의 이러한 유전적으로 동일한 거친 유형은 WT 균주의 지속적인 혐기성 계대를 통해 얻었으며, 이전에 Mabc-R 독성 인자에 대해 연구하는데 사용하였다. 박테리아는 10% 올레산 알부민 덱스트로스 카탈라아제 (BD, Franklin Lakes, NJ)를 함유하는 Middlebrook 7H9 배지에서 중간 로그 단계 (OD600nm=0.6)까지 (오비탈 쉐이커(Middlebrook 7H9)를 사용하여 37℃에서 배양하였다.
배양 후 원심분리하여 세균 배양액을 회수하고, 세균 펠렛을 PBS 완충 용액으로 3회 세척하여 글리세롤과 BSA를 완전히 제거하였다. 이러한 박테리아, 특히 Mabc-R은 코드-형태(cord-formatt)의 덩어리로 성장하기 때문에 테플론(Teflon) 막대와 유리관 (Wheaton, Millville, NJ, USA)으로 구성된 조직 균질기(tissue homogenizer)를 사용하여 3000 rpm에서 2분 동안 단일 세포로 분리하였다. 분리 과정 후, 박테리아 단일 세포 현탁액을 분취하여 사용 직전까지 -70℃에서 보관하였다. 사용 전 냉동된 세균 스톡을 얼음에 해빙하고 초음파 수조 (As-one, Osaka, Japan)에 담가 재응집을 방지하여 감염 절차에 사용하였다.
Mabc CIP 104536T R 및 S 균주는 Laurent Kremer 박사 (Universite de Montpellier, Montpellier, France)가 친절히 제공해주었다. mWasabi의 발현을 가능하게 하는 pMV262-mWasabi 플라스미드를 운반하는 Mabc CIP 104536T R 및 S 형태는 ZF의 세균 파종(dissemination) 평가에 사용되었다. 중간-로그상(mid-log phase) Mabc 균주를 수확하고 26-게이지 바늘을 사용하여 냉동 스톡을 제조하기 전에 덩어리(clump)를 제거하고 40 kHz에서 30초 동안 3회 소니케이션(sonication)하였다 (Branson CPX3800, Danbury, CT, USA). 주입 전에, 7H10 아가(agar)에 연속 희석된 스톡을 플레이팅하여 생존 가능한 박테리아 수를 나열했다. ZF 감염의 경우, 접종물(inoculum)을 인산염완충 식염수-트윈 20 (PBST0 0.05% 트윈 80으로 희석하고 페놀 레드 0.085%에 재현탁하여 130 CFU/mL를 획득하였다.
2. 마우스의 마이코박테리아 감염
SIRT3 WT 및 KO 마우스의 마이코박테리아 감염은 이전에 기술한 것과 같이 수행하였다. 행후 6-8주된 수컷 마우스 군(group)을 Mabc-R (1 x 106 또는 107 CFU/mouse) 또는 Mabc-S (1 x 107 CFU/mouse)로 5~7일 동안 비강내 감염시켰다. 감염 후 24시간에, Mabc-R 및 Mabc-S 접종물을 확인하기 위해 적어도 3마리의 마우스의 폐에 있는 박테리아 수를 결정하고 각 군의 마우스의 평균 접종물을 나타냈다.
3. 마우스 유지 및 대식세포 분리
SIRT3 WT 및 KO 마우스는 김현석 박사 (이화여자대학교, 서울, 한국)께서 친절히 제공해주었으며 충남대학교 의과대학에서 특정 병원균이 없는 조건에서 유지되었다. 모든 실험에 사용된 마우스는 6-8 주령이고 성별이 일치했다. 모든 마우스는 실험을 위해 충남대학교 의과대학 지침에 따라 사육되고 보관되었다. 마우스 실험 프로토콜은 충남대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (CNUA-18-0117)의 승인을 받았다.
1차 마우스 골수-유래 대식세포 (BMDMs)를 이전에 기술한 것과 같이 분리하고 배양하였다. BMDM은 25 ng/ml 대식세포 콜로니-자극 인자 (R&D Systems, Minneapolis, MIN, USA)를 함유하는 배지에서 4-5일 동안 배양한 후 분리 및 분화되었다. 복막 대식세포 (peritoneal macrophages, PMs)는 3% 티오글리콜레이트 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 보충된 PBS 1ml를 주입한 후 2-3일 후에 분리되었다. 분리 전에, PM은 마우스 복강에서, 10% FBS가 보충된 전냉각된 PBS로 수집되었다. BMDMs 및 PMs는 37℃, 5% CO2 대기에서 10% FBS로 보충된 DMEM 및 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B로 구성된 배지로 배양되었다.
4. 항체 및 화학물질
MIT-001 (C25H32N4O4S2; 특허번호 KR2008-0080519)은 미토이뮨 테라퓨틱 법인 (서울, 한국)에 의해 제공되었다. SIRT3 (5490S) 및 ACTB (sc-47778)에 대한 항체는 각각 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) 및 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. NDUFA9 (ab14713) 및 UQCRC2 (ab14745)에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였고 SDHA (5839) 및 COX4 (4844)에 대한 항체는 Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며 ATP5A (459240)에 대한 항체는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI) 용액 (P3566) 및 mitoSOXTM Red (M36008)은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 3-TYP (S8628)는 elleckchem에서 구입하였다. 레스베라트롤(resveratrol)은 참고문헌 [20]에 기술된 것과 같이, 1-에티닐(ethynyl)-3,5-디메톡시벤젠(dimethoxybenzene)으로 합성되었다.
5. Mabc -감염 폐 및 대식세포의 CFU 측정
생체 내(in vivo) CFU 분석의 겨우, 실험 설계에 따라 감염된 마우스의 폐를 5 또는 7일에 수확했다. 박테리아 버든(burden)의 측정을 위해, 폐를 PBST에서 균질화하고 균질물의 연속 희석액을 Middlebrook 7H10 아가의 이중 플레이트에 플레이팅 하였다.
대식세포로부터 세포내 박테리아의 정량을 위해, CFU 분석은 이전에 참고문헌 [21]에 기술된 것과 같이 수행되었다. 요약하면, Mabc에 감염된 BMDM을 PBS로 세척하고, 50 μg/ml 젠타마이신(gentamicin) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 함유하는 새로운 배지를 첨가하고 0.3% 사포닌 (Sigma-Aldrich)으로 용해하여 세포내 박테리아를 방출시켰다. 그 다음, 감염된 용해물을 강력히 재현탁하고 나사-캡 튜브로 옮겨 예열된 37℃ 수조 소니케이터 (Elma, Singen, Germany)에서 5분 동안 소니케이션하였다. 소니케이션 처리액의 분취량을 7H9 배지에서 5배로 희석하고 균질액을 Middlebrook 7H10 아가의 이중 플레이트에 플레이팅 하였다. 박테리아 콜로니는 37℃에서 3-5일 동안 배양한 후 계수되었다.
6. Mabc -감염 폐 조직에 대한 면역조직화학 ( IHC ) 및 PI 염색
10일 동안 Mabc에 감염된 마우스로부터 폐를 수확하였다. 폐를 10% 포르말린으로 고정하고 파라핀 왁스로 포매하였다. 조직병리학을 위해, 폐 파라핀 절편 (4 μm)을 절단하고 참고문헌 [21]에 기술한 것과 같이 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)에 대해 염색하였다. 조직 괴사이 정도를 분석하기 위해, PI 염색이 수행되었다. 조직 괴사의 정도를 분석하기 위해, 폐 파라핀 절편 (4 μm)을 절단하고 프로피디움 요오드화물 용액 (P3566; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA )으로 면역염색하였다. 시작 후, 일정한 여기(excitation), 방출, 핀홀, 및 노출-시간 매개변수로, 공초점 레이저스캐닝 현미경 (LSM 710; Zeiss, CLSM, Jena, Germany)을 사용하여 형강 이미지를 획득하였다. H&E 염색은 Aperio 디지털 병리학 슬라이드 스캐너 (Leica)를 사용하여 스캔하고 Aperio ScanScope®CS System을 사용하여 이미지화했다. 염증 부위와 괴사를 정량화하기 위해, FIJI 소프트웨어를 사용하여 적색 역치의 MFI를 결정하였다.
7. RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR ( qPCR ) 분석
RNA 추출 및 qPCR은 이전에 참고문헌 [21]에 기술된 것과 같이 수행되었다. 요약하면, TRIzol 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 BMDM 또는 폐 조직의 총 RNA를 단리하였다. cDNA 합성은 Superscript II 역전사효소 (Invitrogen, 18064) 를 사용하여 수행하였다. Real-time PCR Cycler RotorGene Q 2plex system (Qiagen GmbH, 9001620, Hilden, Germany)을 사용하여 cDNA, 프라이머 및 SYBR Green PCR kits (Qiagen, 204074)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. 시료는 하기와 같이 50 주기 동안 증폭되었다: 5초 동안 95℃ 및 10초 동안 60℃. qPCR 데이터를 분석하기 위해, Gapdh를 내부 대조군 유전자로 사용하여 2ΔΔCt 방법을 이용하여 상대 정량화를 수행하였다. 데이터는 상대적 배수 변화로 표현되었다. 프라이머 서열은 표 1에 도시되었다.
[표 1]
Figure PCTKR2021010982-appb-img-000002
Figure PCTKR2021010982-appb-img-000003
8. 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA)
폐 조직의 TNF 농도는 시판되는 ELISA 키트 (BD Biosciences, 558534, San Jose, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다.
9. 웨스턴 블롯 분석
조직 균질물은 플테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일 (Roche, Basel, Switzerland)이 보충된 방사성면역침전 분석 (radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC (deoxycholic acid), 0.1% SDS, 1 mM PMSF) (ELPIS Bio, Lexington, MA, USA)에 용해시켰다. 동일한 양의 단백질을 5X SDS 시료 완충액 (ELPIS)와 혼합하고 5분 동안 가열하였다. 그 다음 단백질을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride, PVDF) 멤브레인 (Millipore, Burlington, MA, USA)으로 옮겼다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 TBS-T (Trisbuffered saline-Tween 20)의 5% 스킴 밀크에서 차단하고 다음과 같은 특정 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다: 항-SIRT3 (5490, Cell Signaling Technologies), 항-ACTB (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), 항-NDUFA9 (ab14713, Abcam, Cambridge, UK), 항-SDHA (5839, Cell Signaling Technologies), 항-UQCRC2 (ab14745, Abcam), 항-COX4 (4844, Cell Signaling Technologies), 항-ATP5A (459240, Thermo Fisher Scientific). TBS-T로 세척한 후, 멤브레인을 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)-결합 2차 항체 (Cell Signaling Technologies)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 블롯은 UVitec Alliance 미니화학발광 장치 (BioSPX, Abcoude, Netherlands)에서 화학 발광 분석 키트 (Millipore)를 사용하여 이미지화되었다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 정량화하고 데이터를 β-액틴 로딩 대조군으로 정규화하였다.
10. 미토콘드리아 ROS 측정 및 면역형광
미토콘드리아 ROS는 이전에 참고문헌 [16]에 기술된 바와 같이 측정되었다. SIRT3 WT 및 KO BMDM을 3 μM MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator (Invitrogen, M36008)와 함께 배양하였다. 20분 후, 세포를 세척하고 면역형광 분석을 사용하여 측정하였다. 동시에 핵(nuclei)은 4′디아미디노(diamidino)-2-페닐인돌(phenylindole) (Sigma Aldrich)과 함께 배양하여 염색되었다. 면역형광 이미지는 공초점 레이저-스캐닝 현미경 (Zeiss)을 사용하여 획득하였다. 미토콘드리아 ROS의 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity, MFI) 수준은 각 시료에 대해 계산되었다. 각 실험은 삼중으로 수행되었으며, 웰(well)당 적어도 200개의 세포가 계수되었다.
11. 미토콘드리아 산소 소비율 (OCR) 분석
XF24 바이오센서 카트리지는 비-CO2 배양 시스템에서 37°C에서 24시간 동안 웰당 1ml의 XF24 보정 용액 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA)으로 활성화되었다. Mabc로 18시간 동안 감염된 SIRT3 WT 및 KO BMDM을 웰당 2 x 104 세포로 시딩하고 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 플레이트를 각 웰에 590㎕ 분석 배지를 첨가한 후 비-CO2 배양 시스템에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. ATPase 억제제 올리고마이신 A (20 μg/mL, Sigma-Aldrich, MO, USA), 언커플러 카르보닐 시안화물 3-클로로페닐히드라존 (CCCP, 50 μM, Sigma-Aldrich, MO, USA) 및 미토콘드리아 복합체 I 억제제 로테논 (20 μM, Sigma-Aldrich, MO, USA)을 기초 OCR 측정 후 각 웰에 순차적으로 첨가하였다. Seahorse Bioscience XF24 분석기 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA)를 사용하여 전체 공정의 산소 소비율을 측정하였다.
12. 투과 전자 현미경 ( TEM ) 분석
SIRT3 WT 및 KO 마우스 폐 조직은 0.1% CaCl2를 함유하는 0.1M 카코딜레이트 완충액 (pH 7.2)에서 2.5% 글루타르알데히드로 고정되었다. 3시간 후, 세포를 0.1% CaCl2를 함유하는 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액에서 1% OsO4로 2시간 동안 후고정시켰다. 조직을 차가운 증류수로 헹구고 4℃에서 에탄올 시리즈와 프로필렌 옥사이드를 사용하여 천천히 탈수하였다. 조직을 Embed-812에 포매하고 60°C에서 30시간 동안 치료(cure)하였다. 초박형 섹션 (70nm)을 다이아몬드 나이프와 ULTRACUT UC7 울트라마이크로톰 (Leica)으로 절단하고 포름바(formvar)-코팅된 구리 그리드에 장착하였다. 절편을 4% 우라닐 아세테이트로 7분 동안 염색하고 시트르산 납으로 7분 동안 염색하였다. TEM-염색된 섹션은 바이오 고전압 EM 시스템 (JEM-1400 Plus 및 JEM-1000 BEF; JEOL Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 스캔되었다.
13. 통계 분석
통계 분석은 Prism (GraphPad Software, v5.01, 2007)에서 수행되었다. 데이터는 평균 ± SEM (평균의 표준 오차)으로 표시되었다. 데이터는 양측 스튜던트 t-검정(two-tailed Student's t-test) 또는 비-모수 검정(non-parametric test)을 사용하여 분석되었다. 비-모수 검정에서 Mann-Whitney U-Test를 사용하여 두 가지 조건을 비교하고 해당되는 경우 Dunn의 다중 비교 테스트와 일원 분산 분석을 사용하여 세 개 이상의 조건을 비교하였다. 특정 p 값은 도면 범례에 자세히 설명되어 있다. ZF 생존 연구를 위해 Kaplan-Meier 생존 곡선을 생성하고 Gehan-Breslow-Wilcoxon 검정로 분석하였다.
결과
1. Mabc 감염에 대한 숙주 방어를 위해 필요한 SIRT3
Mtb 감염 동안 SIRT3의 이전 발견을 감안할 때 (참고문헌 [16]), 우리는 먼저 Mabc 감염이 대식세포 및 생체 내에서 SIRT3 수준을 감소시켰는지 여부를 조사하였다. 우리는 Mabc-R 감염이 시간 의존적 방식으로 대식세포에서 SIRT3의 발현을 유의하게 감소시킨다는 것을 발견하였다 (도 1a 및 b). SIRT3 WT 마우스가 Mabc-R으로 비강내 감염되었을 때, SIRT3 단백질 수준은 마우스의 폐 조직에서 감염 후 1일 (days post-infection, dpi)에 유의하게 감소하였다 (~2배) (도 1c). 다음으로 우리는 SIRT3 WT 및 SIRT3 KO 마우스를 사용하여 생체 내 항균 반응에서 SIRT3의 역할을 조사했다. SIRT3 WT 및 SIRT3 KO 마우스는 Mabc-R 또는 Mabc-S에 감염되었다. 폐의 생체 내 세균 부하는 Mabc-R 또는 Mabc-S 감염 후 SIRT3 WT 마우스보다 SIRT3 KO 마우스에서 유의하게 더 높았다 (도 1d). SIRT3 WT와 KO 마우스 사이에 Mabc의 접종 용량에는 큰 차이가 없었다.
또한, SIRT3 KO 마우스는 SIRT3 WT 마우스보다 Mabc-R (즉, 폐의 육아종성 및 염증성 병변)을 사용하여 5dpi에서 폐 병리를 향상시켰다 (도 1e). 세포내 생존 분석은 SIRT3 KO BMDM이 SIRT3 WT BMDM에 비해 세포내 Mabc-S (감염 다중도 [MOI] = 1 및 3)가 상당히 더 높은 것으로 나타났다 (도 1f). Mabc-R 감염은 MOI 1 (2dpi, 데이터는 표시되지 않음)에서 유의하게 세포사를 유도했기 때문에 Mabc-R을 이용한 세포내 생존 분석을 수행하지 않았다. 종합적으로, 이러한 데이터는 SIRT3가 Mabc-R 및 Mabc-S 감염에 대한 항균 반응에 기여함을 나타낸다.
2. 병적 염증을 개선하고 Mabc -R 감염 동안 미토콘드리아 손상을 조절하는 데 필요한 SIRT3
Mabc-R 변이체는 Mabc-S보다 염증 유도에 더 독성이 있고 활성이 있기 때문에(참고문헌 [8]), 우리는 다음으로 Mabc-R 균주를 이용하여 SIRT3 WT와 SIRT3 KO 마우스 사이의 폐 염증 반응을 비교하였다. 이를 조사하기 위해 1 및 3 dpi에서 폐 조직을 수집하고 전염증성 사이토카인/케모카인의 mRNA 수준에 대해 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 도 2a에 나타난 바와 같이, 다양한 전염증성 사이토카인/케모카인 (Tnf, Il1b , Il6 , Cxcl2 , Ccl2, 및 Cxcl5)는 1 및 3 dpi에서 SIRT3 WT 마우스의 폐 조직보다 SIRT3 KO 마우스의 폐 조직에서 유의하게 더 높았다. TNF의 단백질 수준은 또한 SIRT3 WT 마우스의 폐 조직보다 SIRT3 KO 마우스의 폐 조직에서 상향 조절되었다 (도 2b, 3dpi). 그러나 Ifng 및 Il12p40 mRNA 발현 수준은 SIRT3 WT 마우스의 것과 비교하여 SIRT3 KO 마우스의 폐에서 현저하게 저하되었다 (도 2a).
SIRT3는 미토콘드리아 항상성에 필수적이며 스트레스로 인한 세포 사멸로부터 다양한 세포와 조직을 보호하는 기능을 한다는 것은 잘 알려져 있다(참고문헌 [22-25]). 또한, 우리는 Mtb 감염 동안 미토콘드리아 항상성 유지를 위해 SIRT3가 필요하다고 보고하였다(참고문헌 [16]). 다음에 우리가 감염 후 SIRT3 WT와 KO 폐 사이의 미세 구조 분석을 수행했을 때, TEM 데이터는 5dpi의 Mabc-R 감염에서 SIRT3 WT 마우스와 비교할 때 SIRT3 결핍 폐에, 부어 오르고 파괴된 크리스테(cristae)에 해당되는, 손상된 미토콘드리아가 현저하게 축적되었음을 보여주었다 (도 2c). 그러나 감염 전 SIRT3 WT와 KO 폐 사이의 미토콘드리아 형태에는 유의한 차이가 없었다 (도 2c 오른쪽). 이러한 데이터는 SIRT3 결핍이 Mabc-R 감염 동안 미토콘드리아 손상 및 과도한 염증 반응의 현저한 증가를 초래함을 의미한다.
3. Mabc -R 감염 동안 대식세포에서 염증 반응과 미토콘드리아 산화 스트레스를 증가시키는 SIRT3 결핍
우리는 다음으로 Mabc-R 감염 후 SIRT3 WT 및 SIRT3 KO 마우스의 BMDM에서 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 비교하였다. Tnf, Il6 및 Cxcl2의 Mabc-R 매개 mRNA 생성은 시간 의존적 방식으로 감염 후 SIRT3 WT 마우스와 비교하여 SIRT3 KO 마우스의 BMDM에서 유의하게 증가하였다 (도 3a). TNF의 단백질 수준은 Mabc-R 감염 후 SIRT3 WT BMDM과 비교하여 SIRT3 KO BMDM에서 증가하였다 (데이터는 표시되지 않음). 유사하게, 우리는 Mabc-R 감염 전에 3-TYP로 전처리된 SIRT3 WT 및 SIRT3 KO BMDM 또는 PM 모두에서 전염증성 사이토카인 (Tnf, Il6 및 Cxcl2)의 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 도 3b, c에서 볼 수 있듯이, 우리는 SIRT3 WT BMDM 또는 PM을 3-TYP로 전처리하면 Mabc-R에 반응하여 Tnf, Il6 및 Cxcl2의 mRNA 발현이 유의하게 증가한다는 것을 발견하였다. SIRT3 WT BMDM 또는 PM과 비교할 때 SIRT3 KO BMDM 또는 PM은 Mabc-R 감염 후 Tnf, Il6 및 Cxcl2의 mRNA 수준이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 3-TYP 전처리는 Mabc-R 감염 후 SIRT3 KO BMDM 또는 PM에서 염증성 사이토카인의 mRNA 발현에 유의한 영향을 미치지 않았다 (도 3b, c). 이러한 데이터는 SIRT3 억제가 Mabc-R 감염 후 대식세포에서 Tnf, Il6 및 Cxcl2의 발현 수준을 증가시킨다는 것을 강력하게 시사한다.
이전 연구는 미토콘드리아 ROS 생성이 다양한 세포에서 SIRT3에 의해 조절된다는 것을 보여주었다(참고문헌 [26-29]). 따라서 미토콘드리아 산화 환원 상태는 미토콘드리아 O2 - 검출을 위한 고도로 선택적인 형광 프로브인 MitoSOX Red를 사용하여 SIRT3 WT와 SIRT3 KO BMDM을 비교하였다(참고문헌 [30]). 우리는 먼저 Mabc-R이 Mabc-S보다 WT BMDM에서 더 많은 미토콘드리아 ROS를 생성하는지 여부를 조사하였다. 우리는 BMDM을 Mabc-R 또는 Mabc-S로 감염시켰고 Mabc-R이 감염 후 2시간에 Mabc-S보다 더 많은 미토콘드리아 ROS 생산을 유도한다는 것을 발견하였다. 또한, 우리는 Mabc-R 감염 후 SIRT3 WT BMDM과 비교할 때 SIRT3 KO BMDM에서 미토콘드리아 O2 - 생성이 유의하게 증가한다는 것을 발견하였다(도 3d). 이러한 데이터는 SIRT3 결핍이 Mabc-R 감염 동안 대식세포에서 산화 스트레스를 확장하고 전염증성 사이토카인 발현을 상향 조절함을 의미한다.
4. Mabc -R 감염 중 산화적 인산화 기능의 유지 및 과장된 세포 사멸의 차단에 필수적인 SIRT3
미토콘드리아 산화적 인산화 (oxidative phosphorylation, OXPHOS) 시스템은 에너지 생산과 세포 항상성에 필수적이다(참고문헌 [31]). 우리는 Mabc-R 감염 동안 SIRT3 WT 및 KO 폐의 주요 미토콘드리아 단백질 수준을 추가로 결정하였다. 우리는 OXPHOS의 단백질 발현 수준이 Mabc-R 감염의 3dpi에서, SIRT3 WT 폐의 것과 비교할 때 SIRT3 KO 폐에서 극적으로 억제된다는 것을 발견하였다 (Ⅰ: NDUFA9, Ⅱ: SDHA, Ⅲ: UQCRC2, Ⅳ: COX4, Ⅴ: ATP5A) (도 4a). 그런 다음 Mabc-R에 감염된 SIRT3 WT 및 KO 마우스의 폐에서 미토콘드리아 OXPHOS 유전자의 차등 발현 프로필을 평가하였다 (도 4b). 특히 미토콘드리아 OXPHOS의 유전자 발현은 Mabc-R 감염의 5dpi에서, SIRT3 WT 마우스의 폐와 비교할 때 SIRT3 KO 마우스의 폐에서 유의하게 저하되었다 (도 4b). Seahorse XF24 분석기를 사용하여 OCR을 측정하여 SIRT3 WT 및 SIRT3 KO 마우스의 BMDM에서 생체 에너지 특징을 추가로 분석하였다 (도 4c, d). Mabc-R 감염 후 SIRT3 WT BMDM에 비해 SIRT3 KO BMDM에서 기초 호흡, 미토콘드리아 예비 호흡 용량, ATP 생산 및 최대 호흡이 크게 감소하였다 (도 4c, d). 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 mRNA 및 단백질 발현 데이터와 결합된, 이러한 데이터는 SIRT3이 Mabc-R 감염 동안 미토콘드리아 호흡의 유지에 필요함을 강력하게 시사한다.
SIRT3 결핍이 미토콘드리아 결함과 ROS 생성을 증가시키지만 OXPHOS 활성을 저하시킨다는 발견을 감안할 때, 우리는 다음으로 SIRT3 WT 마우스의 폐에 비해 SIRT3 KO 마우스의 폐에서 세포 사멸이 상향 조절되는지 여부를 조사했다. 우리는 이전에 Mabc-R 변이체가 평활주보다 RAW264.7 세포에서 더 큰 세포 사멸을 유도함을 보였다(참고문헌 [18]). 따라서 우리는 Mabc-R 감염이 마우스의 감염된 폐에서 PI 양성 세포 사멸의 활성화를 유도하는지 여부를 설명했다. 도 4e에 나타낸 바와 같이, 폐 조직의 PI 염색은 Mabc-R 감염 후 SIRT3 WT 마우스의 것과 비교하여 SIRT3 KO 마우스의 폐 조직에서 세포 사멸이 현저하게 증가함을 보여주었다. 또한, 이러한 데이터는 미토콘드리아 OXPHOS 기능은 극적으로 하향 조절되었지만 숙주 세포 사멸은 Mabc-R 감염 동안 SIRT3 KO 폐에서 현저하게 상향 조절되었음을 시사한다.
5. 항균 반응을 향상시키고 Mabc -R 감염 동안 병리학적 염증을 개선하는 초과 미토콘드리아 ROS의 차단
미토콘드리아 ROS 제거제 MIT-001 (이전의 NecroX-7)은 미토콘드리아 ROS, 칼슘 및 반응성 질소 종을 폐지한다(참고문헌 [32,33]). 예상대로 BMDM을 MIT-001로 처리하면 Mabc-R 감염에 대한 반응으로 미토콘드리아 ROS 생성이 현저히 억제되었다 (도 5a). 우리는 다음으로 미토콘드리아 ROS 생성의 억제가 생체 내에서 항균 효과를 강화하는지 여부를 결정하였다. 마우스를 Mabc-R로 비강내 감염시키고 MIT-001 (1, 3, 5, 7 및 9 dpi에서)으로 처리하고 생체내 CFU 측정을 위해 10 dpi에서 희생시켰다. MIT-001은 감염된 마우스의 폐에서 생체 내 박테리아 부하를 유의하게 억제했으며 (도 5b), 초과된 미토콘드리아 ROS의 억제가 Mabc 감염에 대한 박테리아 복제를 제어하는 데 유익함을 시사한다.
다음으로 생체 내 Mabc-R 감염 동안 병리학적 염증 반응에 대한 MIT-001의 효과를 조사하였다. Tnf와 Il6의 mRNA 발현은 Mabc-R 감염 후 마우스 폐에서 극적으로 증가하였다 (도 5c). MIT-001의 투여는 Mabc-R에 감염된 마우스의 폐 조직에서 Tnf, Il1b, Il6, Cxcl2 및 Cxcl5를 포함한 수많은 염증성 사이토카인/케모카인의 발현을 현저하게 개선하였다 (도 5c). 또한, TNF 분비는 MIT-001 처리에 의해 Mabc-R에 감염된 마우스의 폐 조직에서 유의하게 하향 조절되었다.
생체 내 미토콘드리아 손상을 추가로 분석하기 위해, 우리는 MIT-001 처리 여부에 관계없이 Mabc-R에 감염된 마우스의 폐 조직에 대한 TEM 분석을 수행하였다. MIT-001로 처리한 후, 대조군 마우스보다 Mabc-R에 감염된 마우스의 폐 조직의 폐포 세포에서 파괴된 크리스테를 가진 손상된 미토콘드리아가 상당히 적었다 (도 5d). 또한, Sirt3 mRNA 수준은 Mabc-R 감염 후 마우스 폐에서 현저하게 억제되었으며 MIT-001 처리 후 유의하게 회복되었다 (도 5e). 또한, 이러한 데이터는 생체 내 세균 성장과 병리학적 염증이 MIT-001 처리에 의해 상당히 감소되었음을 보여주었으며, 이는 미토콘드리아 ROS를 제어하는 것이 Mabc-R 감염 동안 숙주 방어를 촉진하는 데 필수적임을 암시한다.
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Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021010982-appb-img-000004
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비결핵항산균은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)인, 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 클래리스로마이신; 및 아미카신(Amikacin), 이미페넴(Imipeneme) 및 세폭시틴(Cefoxitin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 아상의 약물과 병용되는, 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 비결핵항산균 감염 질환은 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 및 파종성 질환(disseminated disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 비결핵항산균 감염으로 인해 감소된 SIRT3 mRNA 수준을 향상시키는 것인, 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    경구 투여 또는 비경구 투여를 위한, 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 주사제의 제형인, 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
  8. 제1항에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비결핵항산균 감염 질환의 예방 또는 치료방법.
PCT/KR2021/010982 2020-08-19 2021-08-18 Ｍabc-r 감염에 의한 병적 염증 치료제로서의 미토콘드리아 표적 항산화제 WO2022039506A1 (ko)

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