WO2022027153A1 - Aditivo para alimento de peces que comprende dos extractos vegetales y un extracto de alga marina (palmaria palmata) como enmascarador de sabor; y método para combatir/eliminar infestaciones de caligus a través de la esterilización de hembras en centros de cultivo de peces y concesiones marinas - Google Patents

Aditivo para alimento de peces que comprende dos extractos vegetales y un extracto de alga marina (palmaria palmata) como enmascarador de sabor; y método para combatir/eliminar infestaciones de caligus a través de la esterilización de hembras en centros de cultivo de peces y concesiones marinas Download PDF

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Marcelo Julio VELASCO REYES
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Acuanativa Spa
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    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/14—Ectoparasiticides, e.g. scabicides

Definitions

  • the present invention relates to aquaculture, in particular, to an additive for fish feed comprising two plant extracts and an extract of seaweed selected from Palmar ⁇ a palmata as a taste-masking agent, and a method for combating ectoparasites in fish. Even more so, in particular, to a food additive and method to combat/eliminate Caligus in fish farms and marine concessions, which results in the sterilization of female ectoparasites.
  • sea lice have a simple life cycle comprising the following instars/stages: attached juveniles (parasites) and mobile (free-swimming) pre-adults and adult stages on the host.
  • Gravid females produce a series of egg chains, which give rise to three free-living planktonic stages before settlement on a host.
  • the exact stages of the life cycle depend on the species.
  • the non-parasitic stage of sea lice corresponds to that of free swimming, while the parasitic stage corresponds to that in which the parasite requires feeding.
  • Ectoparasites also have a certain time to find a host, and therefore, the distance at which this host is found plays an important role in the infestation.
  • the eggs hatch from gravid females, transforming over time into free-swimming larvae.
  • An average time interval between hatching and infectivity of the parasite is approximately 4 days at 10°C and 2 days at 15°C.
  • sea lice fixate especially on the frontal (head), dorsal (back) and perianal regions of the fish, causing serious damage to the skin that, if not treated, will cause the death of the fish due to severe erosion. and exposure of subcutaneous tissues, secondary bacterial infections, osmotic imbalance, extreme stress, among other causes.
  • the aquaculture industry combines preventive practices and approved/authorized treatments, which allow it to combat ectoparasite infestations at certain stages of their life cycle and at a certain water temperature. These treatments are generally administered through food or as topical baths, and for the most part, they are not environmentally friendly or harmless.
  • specially trained people are required to provide the treatments and specific implements around the fish farming cages, without obtaining a high percentage of effectiveness in the prevention or treatment of infestation or re-infestation, despite despite the labor-intensive process. This type of treatment is very stressful for the fish, and is not used frequently.
  • WO2015021534A1 (SYLLETA INC); which provides a limonoid composition for the prevention and control of marine ectoparasites in fish, where said limonoid is selected from the group consisting of azadirachtin, salanin, meliant ⁇ ol, karanjin and nimbin or is an extract of Neem, Milletia pinnata or Azadirachta indica.
  • This composition can be incorporated into the food by microencapsulation, using a specific polymer (which forms a kind of network or matrix where the compound is found) or incorporated directly into the fish feed.
  • WO2014140623A1 (NEEMCO LTD); relates to a fish feed for preventing, treating and/or controlling a variety of diseases, infections and/or infestations in fish, comprising limonene, azadirachtin; Compositions, uses and methods for preparing supplemented fish feeds.
  • deltamethrin a pyrethroid with valuable insecticidal activity against pests and parasites, its mechanism of toxicity from the perspective of direct or mediated oxidative stress, antioxidant status, oxidative signaling pathways, and the modulatory effects of antagonists, synergists, and placebos. on oxidative stress, and reviews its metabolism, including metabolites, metabolic enzymes, and pathways of its toxicity.
  • the present invention proposes an additive for fish feed and a method for combat ectoparasites in fish. Specifically, the present invention proposes an additive for fish feed and a method to combat/eliminate Caligus in fish farming centers and marine concessions, associated with an ectoparasite sterilization method.
  • the fish feed additive comprises a mixture of 2 plant extracts, an extract of seaweed selected from Palmar ⁇ a palmata as a flavor masking agent.
  • FIGURE 1 Shows the average parasite load per diet 9 days post-infestation.
  • FIGURE 2 Shows the average parasite load per diet 20 days post-infestation.
  • FIGURE 3 Shows the percentage of Caligus according to stage of development by pond and diet.
  • FIGURE 4 Sample composition of the number of mobile adult Caligus per pond and diet.
  • FIGURE 5 Shows the percentage of mobile adult Caligus per pond and diet
  • FIGURE 6 Shows the effectiveness in controlling the development of Caligus rogercresseyi embryos, inside the egg sacs, under controlled laboratory conditions (in vitro assay).
  • the present invention relates to an additive for fish feed comprising: (i) a mixture of a first plant extract selected from an extract of nimbus or margosa from India, (ii) a second plant extract selected from pepper, and (iii) a seaweed extract selected from Palmar ⁇ a palmata as a flavor masking agent.
  • the additive allows the control of the infestation by Caligus, caligidosis, limiting the development of the larvae and sterilizing the adult stages of the female of the parasite of the fed fish.
  • the fish feed additive can be incorporated into the feed in doses of 200-4000 grams per ton of feed, preferably in the range of 500-2000 grams per ton of feed, and even more preferably 200-500 grams per ton of feed ranges. .
  • the fish feed additive of the present invention useful in the prevention of Caligidosis, can be administered orally or topically: 1) as a premix powder for fish feed; 2) as a powder, in the oil, prior to oiling the food; 3) in capsules together with one or more antiparasitic treatments for fish; 4) in gel solutions for fish feed; or 5) combined with additional palatants for incorporation into fish feeds.
  • the fish feed additive is prepared by mixing a first plant extract selected from nimbus extract or margosa extract from India and a second plant extract selected from pepper extract and a selected seaweed extract from Palmaria palmata as a masking agent. flavor.
  • the weight ratio of the first botanical extract: second botanical extract: seaweed flavor masking agent is in the range of 70:10:20 to 50:5:45, preferably 65:5:30.
  • the fish feed additive of the present invention is useful in controlling parasitosis by limiting the development of larvae and sterilizing adult stages of the parasite from fed fish.
  • the present invention also relates to a method of combating/eliminating Caligus infestations in fish farms and marine concessions, including sterilizing Caligus by supplying the feed additive of the present invention.
  • Example 1 Obtaining the first plant extract
  • Example 2 Obtaining the second plant extract
  • Palmar ⁇ a palmiata seaweed Freshwater washing of Palmar ⁇ a palmiata seaweed is carried out. Subsequently, they are subjected to a drying process, leaving a humidity level of 8% to go on to be ground, until obtaining a 400-micron powder.
  • Example 4 Obtaining the fish feed additive of the present invention
  • a direct blend/blend of the first and second plant extracts and the seaweed flavor masking agent is made, in selected w/w/w ratios of 70:10:20 to 50:5:45.
  • Example 5 Administration/Feeding fish (in vivo) with the additive of the present invention for the control and elimination of Caligus
  • Table 1 indicates the conditions under which the fish bioassay is carried out, unless another condition is expressly indicated:
  • Table 2 shows the condition of the fish prior to testing/administration of the diets.
  • a total of 300 fish of the species Atlantic Salmon (Salmo salar) with an average weight of 336 grams were used, which were distributed in 6 ponds of 1 m 3 with 50 fish each, starting an acclimatization period of 12 days. .
  • a sanitary checkup of the group was carried out to evaluate the sanitary condition of the fish and rule out the presence of pathogens.
  • pre-administration samples of diets were taken (3 fish/pond) in proportions as indicated in example 4.
  • samples of infective copepodites were taken from each crop prior to infestation.
  • fish from each pond were challenged with infective copepodites of Caligus rogercresseyi at an infestation pressure of 50 cop/fish (challenge/infestation protocol).
  • the administration period of diets with the additive was started in triplicate using the ratio 70: 10: 20 (1st plant extract: 2nd plant extract: seaweed flavor masking agent). respectively, additive of the present invention).
  • the Sea 1 diet (control) and Sea 2 diet (present invention) were provided: 1000g/Ton of feed (in triplicate) for 7 consecutive days.
  • fixation sampling was performed to assess the success of the challenge at 5 fish/pond.
  • the specimens were returned to their respective post-count pond.
  • samples were taken from 3 fish/pond. which were removed.
  • a count was made to evaluate the parasite load on all the fish. With the results of this count, a second feeding period with experimental diets for 7 consecutive days was considered.
  • a final trial sampling was carried out that considered weight/length sampling, parasite count and sampling of 3 fish/pond.
  • the fish were sampled for weight and length on the first day of the trial and distributed in 6 ponds. Prior to handling, the fish were fasted for 24 hours. The distribution was made at random for 10 fish per pond until the required number was completed. The average weight of the group was 336 g. Prior to distribution, a sanitary checkup was carried out on the group in ponds of origin to assess the initial condition and rule out the presence of pathogens (IPNv, SRS, BKD and Vibrio ordalii).
  • pathogens IPNv, SRS, BKD and Vibrio ordalii
  • the fish were kept in a 12-day acclimatization stage in seawater, in the 6 ponds, with a photoperiod of 12 hours of light and 12 hours of darkness, oxygen saturation between 80 and 120%, with an initial density of 7, 4 kg / m3.
  • the first period was carried out 1 day after the infestation: where the 2 diets were administered in triplicate for a period of 7 consecutive days.
  • the second period was carried out 12 days post-infestation: where the 2 diets were administered in triplicate for a period of 7 consecutive days.
  • the challenge was carried out with infective Caligus rogercresseyi copepodites at an infestation pressure of 50 cop/fish (2,500 copepodites/pond).
  • the Infestations of each pond were carried out as stipulated in the aforementioned challenge/infestation protocol.
  • the infestation was carried out at a retained water flow and in total darkness for 6 hours, lowering the water level of each pond and monitoring parameters every 30 minutes and supplying oxygen whenever it was required. Subsequently, the water flow, volume and photoperiod were restored to normal operating conditions.
  • fixation sampling was carried out on 5 fish/pond. The specimens were sampled and returned to their pond of origin after sampling.
  • Period 1 (7 consecutive days), fish on diet 1 consumed a rate of 1.32% SFR on average and fish on diet 2 a rate of 1.19% SFR on average.
  • fixation percentages of all the ponds are all above 40% and the parasite loads of all the ponds are all above 20 caligus average. These values validate the success of the infestation and are within what is established in the protocol for the trial to continue its course as planned.
  • the average load of the 3 replications of Sea 1 diet was 26.3 caligus/fish and the average parasite load of the 3 replications of Sea 2 diet was 30.5 caligus/fish.
  • Table 8 shows a summary of the counts of C. rogercresseyi registered and the calculation of efficacy, considering the Sea 1 diet as the control group. The efficiency percentage achieved by the 3 replications of the Sea 2 diet is 56.9%. Table 8 Efficacy percentage experimental diet Sea 2 diet
  • Example 6 Administration/feeding of fish (/n live) with the additive of the present invention for safety and efficacy tests in the control and elimination of Caligus
  • Ovigerous females were collected and the larvae that spawned from their sacs were cultured. For 3 days, the cultures were kept in a chamber with controlled environmental conditions (14°C, 8 mg/L O2 and 32 psu of salinity), until the infective copepodites were obtained. After 4 days, 20 fish in ponds 1 and 16 were infected with copepodites of Caligus rogercresseyi, to be used in the efficacy test of the additive of the present invention in a dose of 2000 tons of feed. At the same time, 20 fish from ponds 18 and 19 were infected, maintaining as controls, only with food.
  • tissue samples were collected for histology, sacrificing 3 fish in each efficiency pond, fixing each sample with formalin.
  • the Caligus stages present in these fish were extracted for histological and microscopic analysis.
  • the efficacy of the product was evaluated in two ways: a) obtaining the percentage of mortality of the parasites present at the end of the trial compared to those present at the start of feeding with an additive.
  • % Efficacy average start-average final x 100 Average start b) obtaining the percentage of mortality of the parasites in fish fed with an additive compared to fish fed only with food.
  • the environmental conditions in which the trial was developed were similar for all the ponds, with fluctuations that did not limit the survival of the fish or the parasites.
  • the average thermal condition was 14°C, from day 4, the date on which feeding with this additive began.
  • the oxygen concentration ranged between 7 and 8.5 mg/L, with a decrease at the end of the test in the ponds with fish parasitized and fed with this additive.
  • the parasitized fish When periodically observing the swimming and feeding activities of the fish in the different ponds, the parasitized fish showed more hyperactive swimming during the infestations, decreasing this later. Alongside this, daily feeding was effective in all ponds fed the present additive, including parasitized fish. When comparing the infested fish that were fed with this additive and the control feed, a better reception of the food was obtained in those fed with this additive, until the end of the trial with a better general health condition.
  • the daily feeding of the fish with the additive or control feed was given considering 3% of body weight.
  • the fish were fed in a similar way, varying between 1 and 2%, decreasing consumption the following days to the sampling of day 7, date in which fish were extracted from the ponds and kept fasting for the manipulations.
  • the predominant stages in the fish fed with the present additive were chalimus 3-4 (> 85%), with some representatives of less developed stages (chalimus 1-2) and a small number of adults ( ⁇ 15%).
  • the predominant stages in the fish fed with a control diet were chalimus 3-4 together with adults, sharing similar percentages (40 to 50%) and a small number of less developed stages ( ⁇ 5%).
  • the evaluation of mortality of the parasites in the 13 days of feeding with the present additive was greater than 70%.
  • the fish fed with the control feed showed low mortality, registering less than 5% in one pond and none in the other (Table 9).
  • samples of the different stages of the parasite were collected in fish fed with the diet containing the present additive and fish fed only with the food as control.
  • the samples were preserved in fixatives (formaldehyde, glutaraldehyde, and alcohol) for later microscopic and histological analysis.
  • a first analysis of the samples included checking the presence of gonads, body characteristics and egg sacs, with stereoscopic magnifying glasses and microscopes, in the adults collected on sampling on day 22, the end of the trial.
  • the results of these reviews were:
  • the sex ratio of adult parasites was similar in fish fed the present additive and fish fed control, 60% female and 40% male;
  • the females of the parasites of the fish fed with the control were fertilized by the males, registering 100% gravidity (genital segment with oviducts full of vitellogenic oocytes) or with egg sacs, highlighting a wide genitalia.
  • the great majority of Caligus females did not show evidence of being fertilized, in 80% their genital segments were small, without oviducts with vitellogenic oocytes;
  • the egg sacs in the parasites of the fish fed with the control presented more than 40 eggs per sac, while in the caligus of the fish exposed to the present additive, the number was less than 10.
  • the life cycle of the parasite was recorded as 15 days from copepodites to adults, for fish fed either the diet containing the present additive or control feed, and 18 days from copepodites to ovigerous females. Therefore, the additive of the present invention acted on the metamorphosis of the parasite - without adhering to any theory, it would be due to the ability to inhibit chitin synthesis, limiting development to adults, without significantly affecting the temporality of the cycle.
  • the 13-day diet with the present additive allowed the mitigation of caligidosis in fish infested with Caligus under controlled conditions, improving the sanitary condition of the test fish.
  • the fish were exposed to high parasitosis (> 50 caligus per fish), and after the supply of the additive, the parasitosis was drastically reduced, with effects also on the fecundity of the adult parasites and with optical microscope evidence of differences in chitinization, development of the genital segments of females, and egg sacs reduced in number of eggs.
  • a bioassay was developed to evaluate this additive under controlled environmental conditions (14°C), with seawater (32 ppm, 8 mg/L of oxygen concentration) on a plate.
  • the bioassay was extended for 48 h to observe the effect of this additive on the swimming behavior and survival of ovigerous females of Caligus in comparison with Emamectin Benzoate, widely applied to the treatment used to control parasitosis.
  • the bioassay ended 2 hours after starting, due to the presence of a higher percentage of affected parasites, considering for this the swimming behavior, movements of appendages and intestinal tract, and response to stimuli such as touches with tweezers or movement in the water, when exposed to the present additive, versus the very slow and erratic behavior observed in parasites exposed to emamectin benzoate.
  • the main results of the bioassay are shown in Table 11 and are summarized below:
  • the objective of this experiment was to evaluate the effectiveness in controlling the development of Caligus rogercresseyi embryos inside the egg sacs, under controlled laboratory conditions (in vitro assay). For this, a dose of 2 mg/L of this additive was used, and an assay was prepared comprising its dilution in the organic solvent dimethylsulfoxide (DMSO) and in seawater, as detailed in Table 12. The assay was based in the protocol established by Kumar et al. 2012 (Kumar, A., Raman, RP, Kumar, K. et al. (2012) Antiparasitic efficacy of piperine against Argulus spp. on Carassius auratus (Linn. 1758): in vitro and in vivo study.
  • DMSO organic solvent dimethylsulfoxide
  • the present additive was transformed into a paste, while, by including this mixture in seawater, a granular solution was obtained, which precipitated at the bottom of glass containers. To keep the mixture homogeneous, it was stirred manually with a glass rod or by strong agitation in the container. Prior to the test, made the mixture of the present additive and 0.5 L of the supernatant was selected, using the latter to apply to the ovigerous females of the parasite in 3 Petri dishes of 20 mL. 3 ovigerous female caligus in early embryonic stage of eggs were used on each plate. Therefore, 9 females were used in the plates with the present additive and 9 in the seawater controls.
  • the trial lasted 4 days, evaluating the development of egg sac maturity each day.
  • the results of the trial show that the present additive has an effect on the maturity of the egg sacs of the treated females, where at the end of the study, 83% of the females had immature sacs, 17% had sacs with medium maturity, no observing maturity of egg sacs in treated females on day 4 (Table 12).

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Abstract

La presente invención se refiere a la acuicultura, en particular, a un aditivo para alimento de peces que comprende dos extractos vegetales y un extracto de alga marina seleccionada de Palmaria palmata como agente enmascarador de sabor, y método para combatir ectoparásitos en peces. Aún más, en particular, a un aditivo alimentario y método para combatir/eliminar Caligus en centros de cultivo de peces y concesiones marinas, que resulta en la esterilización de hembras del ectoparásito.

Description

ADITIVO PARA ALIMENTO DE PECES QUE COMPRENDE DOS EXTRACTOS VEGETALES Y UN EXTRACTO DE ALGA MARINA (PALMARIA PALMATA) COMO ENMASCARADOR DE SABOR; Y MÉTODO PARA COMBATIR/ELIMINAR INFESTACIONES DE CALIGUS A TRAVÉS DE LA ESTERILIZACIÓN DE HEMBRAS EN CENTROS DE CULTIVO DE PECES Y CONCESIONES MARINAS CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la acuicultura, en particular, a un aditivo para alimento de peces que comprende dos extractos vegetales y un extracto de alga marina seleccionada de Palmaría palmata como agente enmascarador de sabor, y método para combatir ectoparasites en peces. Aún más, en particular, a un aditivo alimentario y método para combatir/eliminar Caligus en centros de cultivo de peces y concesiones marinas, que resulta en la esterilización de hembras del ectoparasite.
ARTE PREVIO
Es muy frecuente en los centros de cultivos de peces que ocurran infestaciones por ectoparasites, los que habitan en la piel o excrecencias de la piel de los peces (huésped) durante largos períodos, causando un daño severo en los peces por estrés crónico e infecciones de patógenos oportunistas. Estos ectoparasites son en su mayoría, específicos del huésped, y en los cultivos de salmón y trucha, el principal y más grave problema de infestación corresponde a crustáceos ectoparasitahos. Entre ellos, el más predominante es el artrópodo copépodo, Caligus rogercresseyi (piojos de mar), siendo un problema serio ya que se alimenta de la sangre, mucus y tejido epidérmico del huésped. Para ello, se fija en la piel de los peces provocando comúnmente hemorragias y heridas esponjosas y necróticas en los sitios de fijación.
En general, los piojos de mar tienen un ciclo de vida simple que comprende los siguientes estadios/etapas: juveniles adjuntos (parásitos) y pre-adultos móviles (natación libre) y etapas adultas en el huésped. Las hembras grávidas producen una serie de cadenas de huevos, que dan lugar a tres etapas planctónicas de vida libre antes del asentamiento en un huésped. Las etapas exactas del ciclo de vida dependen de la especie. La etapa no parasitaria de los piojos de mar corresponde a aquella de nado libre, en tanto la etapa parasitaria, corresponde a aquella en que el parásito requiere alimentarse. Los ectoparasites disponen además de un cierto tiempo para encontrar un huésped, y por ello, la distancia a la que se encuentra este huésped juega un rol importante en la infestación. Los huevos eclosionan de hembras grávidas, transformándose en el tiempo en larvas que nadan libremente. Un intervalo de tiempo promedio entre la eclosión y la capacidad infecciosa del parásito es aproximadamente 4 días a 10°C y 2 días a 15°C. Las larvas que pueden nadar libremente a través de las corrientes de la superficie oceánica, una vez que encuentran el huésped, se unen/infectan a éste, comenzando la etapa de alimentación. Al alimentarse, los piojos de mar se fijan especialmente en la región frontal (cabeza), dorsal (espalda) y región perianal de los peces, causando graves daños en la piel que, de no ser tratados causan la muerte de los peces por erosión severa y exposición de tejidos subcutáneos, infecciones bacterianas secundarias, desequilibrio osmótico, estrés extremo, entre otras causas. Cabe señalar que, los efectos de la parasitación dependerán en general, de la especie, edad y condición sanitaria general de los peces. Adicionalmente, el manejo de los piojos de mar debe considerar tanto factores biológicos como etapa del ciclo de vida del ectoparasite como también medioambientales, incluyendo corrientes marinas y temperatura del agua.
La industria acuícola combina prácticas preventivas y tratamientos aprobados/autoñzados, que le permiten combatir infestaciones de ectoparasites en ciertas etapas de su ciclo de vida y a una cierta temperatura del agua. Estos tratamientos en general son administrados a través del alimento o como baños tópicos, y en su mayoría, no son ambientalmente inocuos o amigables. Una alternativa que disminuye tes efectos ambientales del tratamiento antiparasitaño en peces, aunque limitada en su validación, aceptación y extensión de aplicación, es el control del ectoparasite por depredación de especies marinas que son sus predadores naturales. En cualquiera de las estrategias anteriores, se requieren personas especialmente capacitadas para suministrar tes tratamientos e implementos específicos alrededor de las jaulas de cultivo de tes peces, sin obtenerse un alto porcentaje de efectividad en la prevención o tratamiento de la infestación o re-infestación, a pesar de la intensiva labor del proceso. Este tipo de tratamiento es muy estresante para el pez, y no se usan frecuentemente.
No obstante, a pesar de las medidas preventivas y tratamientos existentes, la infestación de ectoparasites marinos sigue siendo un problema importante para la industria de la acuicultura, ya que sumado a la baja eficiencia de tes tratamientos, se suma que tes piojos de mar han desarrollado una resistencia hacia tes tratamientos antes mencionados, y por ello, existe una creciente necesidad de contar con métodos alternativos que mejoren significativamente tes tratamientos antiparasitaños, con una mirada ecosistémica y medioambiental acorde a una producción limpia en acuicultura.
En relación a publicaciones científicas o patentes, es posible mencionar en particular:
WO2015021534A1 (SYLLETA INC); que proporciona una composición limonoide para la prevención y el control de ectoparasites marinos en peces, donde dicho limonoide se selecciona del grupo que consiste en azadiractina, salanina, meliantñol, karanjin y nimbina o es un extracto de Neem, Milletia pinnata o Azadirachta indica. Esta composición puede incorporarse al alimento por microencapsulación, usando un polímero determinado (que forma una especie de red o matriz donde se encuentra el compuesto) o bien incorporarse directamente en el alimento para peces.
WO2014140623A1 (NEEMCO LTD); se refiere a un alimento para peces para prevenir, tratar y/o controlar una variedad de enfermedades, infecciones y/o infestaciones en peces, que comprende el limoneno, azadiractina; composiciones, usos y métodos para preparar alimentos suplementados para peces.
Song et al. (2017); Transchptomics and proteomic studies reveal acahcidal mechanism of octadecanoic acid-3, 4 - tetrahydrofuran diester against Sarcoptes scabiei var. Cuniculi. Sci. Rep. 7, 45479; doi : 10.1038/srep45479 (, se refiere al ácido octadecanoico-3,4-tetrahidrofurano diéster, que posee una potente actividad acahcida a partir del aceite de neem, y propone el mecanismo acaricida de dicho compuesto contra Sarcoptes scabiei var. cuniculi (ácaro asociado a la sarna), señalando que después del tratamiento con ácido octadecanoico-3, diéster de 4-tetrah id roturan o, tes genes del ácaro que están relacionados con el metabolismo energético, se regulaban significativamente hacia arñba/abajo, incluido el ciclo de citrato, la vía de fosforilación oxidativa y el metabolismo de tes ácidos grasos. Aunque muestra efectos reguladores divergentes del diéster 4-tetrahidrofurano de ácido octadecanoico-3-tetrahidrofurano.
Jones et al., (2006); Reduced sensitivity of the salmon louse, Lepeophtheirus salmonis, to the organophosphate dichlorvos. J. Fish Dis. 15, 197-202. 10.1 1 11/j.1365-2761.1992. tb00654.x.
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refiere al uso de un plaguicida organofosforado, diclorvos (2,2-diclorovinil-dimetil fosfato) en piscicultura para la reducción en la sensibilidad de los piojos de salmón, en particular, Lepeophtheirus salmonis, describiendo que este piojo muestra diferencias en la sensibilidad al diclorvos.
Lu, et al., (2018). Deltamethñn toxicity: A review of oxidative stress and metabolism. Environ Res.
170, 260-281 . doi: 10.1016/j.envres.2O18.12.045.
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Se refiere a deltametrina, un piretroide de valiosa actividad insecticida contra plagas y parásitos, su mecanismo de toxicidad desde la perspectiva del estrés oxidativo directo o mediado, el estado antioxidante, las vías de señalización oxidativa y los efectos moduladores de los antagonistas, sinergistas y placebos sobre el estrés oxidativo, y revisa su metabolismo, incluidos metabolites, enzimas metabólicas y vías de su toxicidad.
De esta forma, persiste la necesidad de contar con tratamientos efectivos y ambientalmente amigables para combatir/eliminar ectoparasites en centros de cultivos de peces o concesiones marinas. La presente invención propone un aditivo para alimento de peces y método para combatir ectoparasites en peces. Específicamente, la presente invención propone un aditivo para alimento de peces y método para combatir/eliminar Caligus en centros de cultivo de peces y concesiones marinas, asociados a un método de esterilización del ectoparasite. El aditivo para alimento de peces comprende una mezcla de 2 extractos vegetales un extracto de alga marina seleccionada de Palmaría palmata como agente enmascarador de sabor.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIGURA 1. Muestra la carga parasitaria promedio por dieta 9 días post-infestación.
FIGURA 2. Muestra la carga parasitaria promedio por dieta 20 días post-infestación.
FIGURA 3. Muestra el porcentaje de Caligus según estadio de desarrollo por estanque y dieta.
FIGURA 4. Muestra composición de número de Caligus adultos móviles por estanque y dieta.
FIGURA 5. Muestra el porcentaje de Caligus adultos móviles por estanque y dieta
FIGURA 6. Muestra la efectividad en el control del desarrollo de los embriones de Caligus rogercresseyi, al interior de los sacos ovígeros, en condiciones controladas de laboratorio (ensayo in vitro).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a un aditivo para alimento de peces que comprende: (i) una mezcla de un primer extracto vegetal seleccionado de un extracto de nimbo o margosa de la India, (¡i) un segundo extracto vegetal seleccionado de pimienta, y (iii) un extracto de alga marina seleccionado de Palmaría palmata como agente enmascarador de sabor. El aditivo permite el control de la infestación por Caligus, caligidosis, limitando el desarrollo de las larvas y esterilizando los estadios adultos de la hembra del parásito de los peces alimentados.
El aditivo para alimento de peces se puede incorporar al alimento en dosis de 200-4000 gramos por tonelada de alimento, preferentemente en el rango de 500-2000 gramos por tonelada de alimento, y aún más preferentemente 200-500 gramos por tonelada de alimento rangos.
El aditivo para alimento de peces de la presente invención, útil en la prevención de la Caligidosis, puede ser administrado en forma oral o tópica: 1 ) como premezcla en polvo para el alimento para peces; 2) como polvo, en el aceite, previo al aceitado del alimento; 3) en cápsulas junto con uno o más tratamientos antiparasitarios para peces; 4) en soluciones en gel para alimentación de peces; o 5) combinado con palatantes adicionales para su incorporación en alimentos para peces. El aditivo para alimento de peces se prepara a partir de mezclar un primer extracto vegetal seleccionado de extracto de nimbo o extracto de margosa de la India y segundo extracto vegetal seleccionado de extracto de pimienta y un extracto de alga marina seleccionada de Palmaría palmata como agente enmascarador de sabor. La razón en peso entre el primer extracto botánico: segundo extracto botánico: agente enmascarante de sabor de alga marina está en el rango de 70: 10: 20 a 50:5:45, preferentemente 65:5:30.
El aditivo para alimento de peces de la presente invención es útil en el control de la parasitosis limitando el desarrollo de las larvas y esterilizando los estadios adultos del parásito de los peces alimentados.
La presente invención también se refiere a un método para combatir/eliminar infestaciones de Caligus en centros de cultivo de peces y concesiones marinas, incluyendo esterilizar Caligus al suministrar el aditivo alimentario de la presente invención.
A continuación, se proporcionan ejemplos que ¡lustran la invención sin limitarla:
Ejemplo 1 : Obtención del primer extracto vegetal
Las hojas frescas de Azadirachta indica A. Juss fueron recolectadas e identificadas. Las hojas se secaron al aire, se trituraron y se pulverizaron en polvo fino y se almacenaron en un recipiente de vidrio a 4°C. Se extrajeron exhaustivamente 250 g de la muestra en polvo con agua destilada utilizando el método de reflujo (Trease GE, Evans WC. 1989. A textbook on pharmacognosy, 1 1th. edn. London, Bailliere Tindajl. La mezcla se filtró para eliminar los restos. Posteriormente, se añadieron 200 mi de éter de petróleo a la mezcla, se agitó vigorosamente y se dejó sedimentar. La capa de éter de petróleo (en la parte superior) se retiró y se concentró. Posteriormente, se añadieron 200 mi de cloroformo a la capa acuosa y también se agitó vigorosamente y se dejó sedimentar. La capa acuosa bruta se concentró luego hasta que se obtuvo un extracto de color marrón usando calor suave. Se pesó, etiquetó y selló en un recipiente de plástico y se almacenó a -20°C hasta que se requirió su uso.
Ejemplo 2: Obtención del segundo extracto vegetal
Se colocaron 15 g de pimienta larga molida en un aparato Soxhelt de 250 mi, se agregaron 150 mi de etanol al 95% y 5 chips de ebullición y se calentó a reflujo durante 2 h. Se filtró la mezcla por filtración por succión y luego se concentró el filtrado a un volumen de 10-15 mi por destilación simple mediante el uso de un evaporador rotativo. Se pesó, etiquetó y selló en un recipiente de plástico y se almacenó a 4eC hasta que se requirió su uso. Ejemplo 3: Obtención de extracto de agente enmascarador de sabor
Se realiza el lavado con agua dulce de alga marina Palmaría palmiata. Posteriormente, se someten a un proceso de secado, quedando con un grado de humedad de 8% para pasar a la molienda, hasta obtener un polvo de 400 mieras.
Ejemplo 4: Obtención del aditivo de alimento para peces de la presente invención
Se realiza una combinación/mezcla directa del primer y segundo extractos vegetales y el agente enmascarador de sabor de alga marina, en proporciones p/p/p seleccionadas de 70: 10: 20 a 50:5:45.
Ejemplo 5: Administración/Alimentación peces (in vivo) con el aditivo de la presente invención para el control y eliminación de Caligus
La Tabla 1 señala las condiciones a las que se desarrolla en bioensayo en peces, a no ser que se indique expresamente otra condición:
Tabla 1 Parámetros/condiciones para los bioensayos.
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La Tabla 2 muestra la condición de los peces previo al ensayo/administración de las dietas Tabla 2
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Desarrollo del Ensayo
Se utilizaron un total de 300 peces de la especie Salmón del Atlántico (Salmo salar) de peso promedio 336 gramos, los cuales fueron distribuidos en 6 estanques de 1 m3 con 50 peces cada uno, dando inicio a un período de aclimatación de 12 días. Previo a la conformación se realizó chequeo sanitario del grupo para evaluar condición sanitaria de los peces y descartar la presencia de patógenos. Posterior al período de aclimatación se realizó toma de muestras preadministración de dietas (3 peces/estanque) en proporciones según se indica en el ejemplo 4. Además, se realizó toma de muestras de copepoditos infestivos de cada cultivo previo a la infestación. Posteriormente, los peces de cada estanque fueron desafiados con copepoditos infestivos de Caligus rogercresseyi a presión de infestación de 50 cop/pez (protocolo de desafío/infestación).
Posterior al desafío con copepoditos (a las 24 horas), se inició el período de administración de dietas con el aditivo en triplicado usando la proporción 70: 10: 20 (1 er extracto vegetal: 2do extracto vegetal: agente enmascarador de sabor de algas marinas respectivamente, aditivo de la presente invención). Se proporcionó la dieta Sea 1 (control) y dieta Sea 2 (presente invento): 1000g/Tonelada de alimento (en triplicado) por 7 días consecutivos. Durante este período, a los 5 días post-infestación, se realizó muestreo de fijación para evaluar el éxito del desafío a 5 peces/estanque. Los ejemplares fueron devueltos a su respectivo estanque post-conteo. Al día siguiente post-administración de dietas se realizó toma de muestras a 3 peces/estanque los cuáles fueron eliminados. A los 9 días post-infestación se realizó conteo para evaluar la carga parasitaria a la totalidad de los peces. Con los resultados de este conteo se consideró realizar un segundo período de alimentación con dietas experimentales por 7 días consecutivos. Finalizado este período se realizó muestreo final de ensayo que consideró muestreo de peso/longitud, conteo de parásitos y toma de muestras a 3 peces/estanque.
Como criterio de inclusión y exclusión de peces y después de realizar un muestreo exploratorio para establecer el peso promedio de la población de peces destinados al ensayo, se incluyeron sólo peces que presentaron buena condición de adaptación y condición sanitaria aprobada por un veterinario, excluyéndose todos los animales que no presentaron una condición adecuada para el bioensayo. Se administró la dieta y el control, en triplicado. La codificación de bolsas recepcionadas fue la siguiente: Dieta Sea 1 (2 bolsas; 24 kilos aprox.) y Dieta Sea 2 (2 bolsas; 26 kilos aprox.). Ambas dietas de calibre 4 mm. La Dieta Sea 2 contiene el aditivo de la presente invención según se definió más arriba en este ejemplo y en la proporción alimento peces (Dieta): aditivo antes mencionada.
Los peces fueron muestreados en su peso y longitud el primer día del ensayo y distribuidos en 6 estanques. Previo al manejo, los peces se mantuvieron en ayuno por 24 horas. La distribución se realizó al azar para 10 peces por estanque hasta completar el número requerido. El peso promedio del grupo fue de 336 g. Previo a la distribución, se realizó chequeo sanitario al grupo en estanques de origen para evaluar condición inicial y descartar la presencia de patógenos (IPNv, SRS, BKD y Vibrio ordalii).
Los peces fueron mantenidos en etapa de aclimatación de 12 días en agua de mar, en los 6 estanques, con un fotoperiodo de 12 horas luz y 12 horas oscuridad, saturación de oxígeno entre los 80 y 120%, con una densidad inicial de 7,4 Kg/m3.
Se realizaron 2 períodos de entregas de dietas experimentales según el siguiente protocolo de alimentación post-infestación:
El primer período se realizó 1 día posterior a la infestación: donde se administraron las 2 dietas en triplicado por un período de 7 días consecutivos.
El segundo período se realizó 12 días post-infestación: donde se administraron las 2 dietas en triplicado por un período de 7 días consecutivos.
Posterior al período de aclimatación, se realizó el desafío con copepoditos infestivos de Caligus rogercresseyi a una presión de infestación de 50 cop/pez (2.500 copepoditos/estanque). Las infestaciones de cada estanque se realizaron según lo estipulado en protocolo de desafío/infestación antes mencionado. La infestación se realizó a flujo de agua retenido y en total oscuridad por 6 horas, disminuyendo el nivel de agua de cada estanque y supervisando cada 30 minutos parámetros y suministrando oxígeno cada vez que fue requerido. Posteriormente el flujo de agua, volumen y fotoperiodo fueron restablecidos a las condiciones normales de operación.
Posterior a la infestación, se realizaron 3 muéstreos de carga parasitaria para observar y cuantificar estadio y número de parásitos:
- A los 5 días post-desafío se procedió con muestreo de fijación a 5 peces/estanque. Los ejemplares fueron muestreados y devueltos a su estanque de origen posterior al muestreo.
- A los 9 días post-desafío se procedió con muestreo de carga parasitaria a la totalidad de los peces/estanque. Los ejemplares fueron muestreados y devueltos a su estanque de origen posterior al muestreo.
- A los 20 días post-desafío se procedió con muestreo final a la totalidad de los peces/estanque. Los ejemplares fueron muestreados en su peso y longitud y eliminados a las 24 horas post-conteo.
Durante la aclimatación los peces fueron alimentados al 1 ,12% SFR (Tasa especifica de alimentación, del inglés Specific Feeding Rate) como promedio. La cantidad de alimento se calculó diariamente y fue entregado en dos raciones diarias: un 70% de la ración am y un 30% de la ración pm. El alimento no consumido, fue recolectado y pesado 2 veces al día (12:30 h y 16:00 h), para estimar el consumo real/día. Se entregó alimento comercial Biomar dieta Golden óptima (calibre 4 mm). Durante la administración de tratamientos, la determinación del SFR entregó los siguientes resultados:
En el Período 1 (7 días consecutivos), los peces de la dieta 1 consumieron una tasa del 1 ,32% SFR en promedio y los peces de dieta 2 un 1 ,19% SFR en promedio.
En el Período 2 (7 días consecutivos), los peces de la dieta 1 consumieron una tasa del 1 ,26% SFR en promedio y los peces de dieta 2 un 1 ,19% SFR.
Durante el desarrollo del bioensayo se realizó toma de muestras en diferentes tiempos y etapas. Las muestras tomadas fueron: Mucus, piel, músculo e hígado, las que fueron posteriormente almacenadas (congeladas -20°C o congeladas -80°C). Se realizó maestreo al azar de 5 peces/estanque para evaluar el éxito de la infestación con copepoditos (5 días post-infestación). Cabe señalar que este maestreo se realizó posterior a la rutina de alimentación del día con el propósito de no interrumpir la alimentación con las dietas experimentales. Con respecto al ciclo de vida de Caligus, se observó que todos los parásitos adheridos en los peces (para dieta Sea 1 y dieta Sea 2) correspondían a Chalimus I. El detalle de N° caligus promedio/estanque se observa en Tabla 3.
Tabla 3: Maestreo de fijación por estanque
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Se puede observar que los porcentajes de fijación de todos los estanques están todos sobre el 40% y las cargas parasitarias de todos los estanques están todas sobre 20 caligus promedio. Estos valores validan el éxito de infestación y están dentro de lo establecido en protocolo para que ensayo siguiera su curso según lo planificado. En el maestreo de fijación la carga promedio de las 3 réplicas de dieta Sea 1 fue de 26,3 caligus/pez y la carga parasitaria promedio de las 3 réplicas de dieta Sea 2 fue de 30,5 caligus/pez.
A los 9 días post-infestación se realizó maestreo de carga parasitaria a la totalidad de los peces por estanque (Tabla 4). La carga parasitaria promedio de los peces en los 6 estanques analizados fue de 24,3 caligus/pez, donde la carga promedio por dieta fue de 25,1 para Sea 1 y 23,5 para Sea 2 (Figura 1 ). La carga parasitaria promedio más alta la obtiene los peces del estanque 17 (dieta Sea 1 ) con 26 caligus/pez mientras que la carga parasitaria promedio más baja la obtiene el estanque 20 (dieta Sea 2) con 22,3 caligus/pez (Tabla 4). Con respecto al ciclo de vida de caligus, se observó que todos los parásitos adheridos en los peces (dieta Sea 1 ) y dieta Sea 2 correspondían a Chalimus II y III. El detalle de caligus promedio/estanque se puede revisar en Tabla 4. Tabla 4 Maestreo de carga parasitaria (9 días post-infestación)
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Se realizó un maestreo de peso final de ensayo en la totalidad de los peces/estanque con un peso promedio del grupo fue de 442 g. El peso promedio más alto lo obtiene el estanque 21 (dieta Sea 1 ) con 453,8 g. y el peso promedio más bajo lo obtiene el estanque 18 (dieta Sea 2) con 422,6 g. Detalles de este maestreo se observan en Tabla 5.
Tabla 5 Detalle maestreo de peso final
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Se realizó muestreo final de ensayo (48 hrs. de finalizado segundo período de administración de las dietas) y se consideró realizar conteo de Caligus a la totalidad de los peces/estanque. La carga parasitaria más alta la obtiene el estanque 19 (dieta Sea 1 ) con 13,8 Caligus/pez mientras que la carga parasitaria más baja la obtiene el estanque 20 (dieta Sea 2) con 4,1 Caligus/pez. Detalles del muestreo se pueden observar en la Tabla 6.
Tabla 6 Muestreo de Caligus final
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Con respecto a la carga parasitaria por tratamiento se observa que de la dieta Sea 2 se obtiene un promedio de 5,7 Caligus/pez en comparación con dieta Sea 1 de la que se obtiene un promedio de 12,8 Caligus/pez. Ver Figura 1 .
Al realizar el análisis de carga parasitaria según estadio, se observa que el producto causa algún efecto en el desarrollo del ciclo de vida (Tabla 7). En la dieta 1 se observó que en promedio el 99% de los parásitos contabilizados en los peces se encuentran en estadio adulto móvil (hembras, machos y hembras ovígeras), mientras que para la dieta Sea 2 se observó que tan sólo el 53% (promedio) (de los parásitos contabilizados en los peces se encontraban en estadio adulto móvil (hembras, machos y hembras ovígeras) y el 47% (promedio) restante de parásitos contabilizados se retrasaron en su desarrollo encontrándose en estadios Chalimus III y IV. También se observó que para una de las réplicas de la dieta Sea 2 (estanque 18) aún se encontraban parásitos en estadio Chalimus II (después de 20 días posterior a la infestación con copepoditos).
Tabla 7 Número de caligus por estadio de desarrollo
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Al analizar las cargas parasitarias con respecto al grupo de adultos móviles se observa que la conformación de este grupo post-tratamiento presenta algunas diferencias entre la dieta experimental administrada (Sea 2) y el control (Sea 1 ) (Figura 2). En los estanques control con dieta Sea 1 , la población se compone de manera más homogénea entre machos y hembras (hembras ovígeras + hembras). Las hembras (sumadas como total) componen entre el 44 y el 55% de la población (Figura 5), proporción que se da normalmente en grupos control. Por el contrario, los estanques tratados con dieta Sea 2 la mayor parte de la población la componen parásitos machos y se presentan cargas muy bajas de hembras ovígeras. Esto indica que probablemente los individuos machos fueron más resistentes al tratamiento y que la población más afectada y más sensible al tratamiento fueron las hembras ovígeras, las cuáles se presentan en un bajo porcentaje (entre el 1 ,8 al 8,1% entre sus réplicas, (Figura 5).
En tabla 8 se observa un resumen de los conteos de C. rogercresseyi registrados y el cálculo de eficacia, considerando dieta Sea 1 como grupo control. El porcentaje de eficacia alcanzado por las 3 réplicas de dieta Sea 2 es de un 56,9%. Tabla 8 Porcentaje de eficacia dieta experimental dieta Sea 2
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Con los datos obtenidos de los muéstreos de carga parasitaria, se realizó un análisis estadístico de varianza verificando previamente si los datos cumplen con la condición de normalidad y homocedasticidad mediante Test de Shapiro Wilks y Test de Levene respectivamente. Debido a que los datos cumplieron con la condición de normalidad y homocedasticidad, se realizó un análisis de varianza de una vía aplicando el Test de comparaciones de LSD Fisher, con el cual se analizaron sí las medias de las cargas parasitarias (promedio de caligus/pez) por tratamiento presentaban o no diferencias significativas entre dietas experimentales. Para los análisis se utilizó el software estadístico Infostat (versión libre). El análisis estadístico aplicado indica que las cargas parasitarias si presentan diferencias significativas (p < 0,05) entre la dieta control (Sea 1 ) y la dieta experimental evaluada (Sea 2) (Figura 6).
Ejemplo 6: Administración/alimentación de peces(/n vivo) con el aditivo de la presente invención para pruebas de seguridad y eficacia en el control y eliminación de Caligus
Ensayo de Eficacia del aditivo de la presente invención
Se colectaron hembras ovígeras y se cultivaron las larvas que desovaron desde sus sacos. Durante 3 días se mantuvieron los cultivos en una cámara con condiciones ambientales controladas (14°C, 8 mg/L de O2 y 32 psu de salinidad), hasta obtener a los copepoditos infectivos. Luego de 4 días, se infectaron con copepoditos de Caligus rogercresseyi, 20 peces en estanques 1 y 16, para utilizar en la prueba de eficacia del aditivo de la presente invención en una dosis de 2000 tonelada de alimento. Paralelamente, se infectaron 20 peces de estanques 18 y 19, manteniendo como controles, sólo con alimento. A los 7 días se revisaron las infecciones, y al día 8 se inició la alimentación con el alimento conteniendo el aditivo de la presente invención en una dosis de 2000 g/Tonelada de alimento, a saciedad con una ración de 3% del peso corporal promedio de cada estanque. Las evaluaciones de las infecciones se realizaron a los 7 y 13 días de comenzada la alimentación. El peso, longitud, índice de condición, mortalidad de los peces se evaluó al inicio y final del ensayo. Ver Tablas 9 y 10. Las variables ambientales (temperatura y concentración de oxígeno) se evaluaron diariamente. El alimento consumido con el presente aditivo y alimento control, se evaluó diariamente, mediante el descuento del peso del alimento sobrante, del asignado como ración a cada estanque. Además, a los 7 y 13 días de iniciada la alimentación, se colectaron muestras de tejidos para histología, sacrificando 3 peces en cada estanque de eficacia, fijando con formol cada muestra. Junto a esto, se extrajeron los estadios de Caligus presentes en dichos peces para análisis histológicos y microscópicos. La eficacia del producto se evaluó de dos formas: a) obteniendo el porcentaje de mortalidad de los parásitos presentes al finalizar el ensayo respecto de los presentes al inicio de la alimentación con un aditivo.
% Eficacia= promedio inicio-promedio final x 100 Promedio inicio b) obteniendo el porcentaje de mortalidad de los parásitos en peces alimentados con un aditivo respecto de los peces alimentados solo con el alimento.
% Eficacia= promedio control-promedio aditivo x 100 Promedio control
Ensayo de Seguridad del aditivo de la presente invención
En paralelo al ensayo de eficacia, se evaluó la seguridad del aditivo de la presente invención al ser incorporado en el alimento para Salmo salar en dosis de 2000 g/tonelada de alimento. Para esto se utilizaron 20 peces en dos estanques (13 y 14), los que fueron alimentados por 13 días con la dieta (alimento + aditivo) y 20 peces en un estanque (15) como controles, (alimentados sólo con el alimento sin aditivo). La ración de alimento fue similar al ensayo de eficacia, y también la forma de evaluar el alimento consumido. El peso, longitud, índice de condición, mortalidad de los peces se evaluó al inicio y final del ensayo. Ver Tablas 9 y 10. Las variables ambientales (temperatura y concentración de oxígeno) se evaluaron diariamente. Ver Tablas 9 y 10. A los 7 y 13 días de comenzada la alimentación, se colectaron muestras de tejidos para histología, sacrificando 3 peces en cada estanque de seguridad y 6 peces en el estanque control.
Las condiciones ambientales en las que se desarrolló el ensayo fueron similares para todos los estanques, con fluctuaciones que no limitaron la sobrevivencia de los peces o los parásitos. La condición térmica promedio fue de 14°C, desde el día 4, fecha en que se inició la alimentación con el presente aditivo. La concentración de oxígeno osciló entre 7 y 8,5 mg/L, con un descenso al finalizar el ensayo en los estanques con peces parasitados y alimentados con el presente aditivo.
Las condiciones fisiológicas de los peces utilizados en el ensayo fueron similares al inicio y termino de la prueba, con un factor de condición similar cercano a 1 , en especial en los peces parasitados y alimentados con el presente aditivo. En las Tablas 9 y 10, se resumen el peso, longitud y factor de condición en ambos muéstreos (día 1 , inicio y día 22, término). Al comparar cada variable entre inicio y término del ensayo, se registró aumento de peso y longitud de los peces en los estanques en que se alimentó con el presente aditivo y el alimento control, destacando un mayor incremento en los peces alimentados con el presente aditivo (> 15 g).
abla 9 Peso, longitud y factor de condición de los peces en los 7 estanques del ensayo con el presente aditivo
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peces fallantes sacrificados por histología **1 pez muerto + 3 histología *** muertos por caligidosis
Resultados de seguridad
La alimentación diaria fue efectiva en todos los estanques en que se alimentó con el presente aditivo, No hubo mortalidad en los peces de los dos estanques de seguridad, ni en el estanque control alimentado con la dieta control, sólo 1 pez murió en uno de los estanques alimentados con el presente aditivo. En general, la condición sanitaria de los peces sin parásitos (Ensayo de seguridad) alimentados con el presente aditivo, fue mejor a la registrada en los peces alimentados con la dieta control.
Resultados del Ensayo de Eficacia
Al observar periódicamente las actividades natatorias y alimentarias de los peces en los diferentes estanques, los peces parasitados evidenciaron natación más hiperactiva durante las infestaciones, disminuyendo esto posteriormente. Junto a esto, la alimentación diaria fue efectiva en todos los estanques en que se alimentó con el presente aditivo, incluidos los peces parasitados. Al comparar los peces infestados que se alimentaron con el presente aditivo y el alimento control, se obtuvo mejor recepción del alimento en los alimentados con el presente aditivo, hasta finalizar el ensayo con una mejor condición sanitaria general.
El cultivo de Salmo salar por 13 días, alimentado con una dieta incluyendo el presente aditivo en una dosis de 2000 grs por tonelada de alimento, fue efectivo, con crecimiento en tamaño y longitud.
En general, la condición sanitaria de los peces con (Ensayo de Eficacia) parásitos alimentados con el presente aditivo, fue mejor a la registrada en los peces parasitados y alimentados con la dieta control.
La alimentación diaria de los peces con el aditivo o alimento control fue entregada considerando un 3% de peso cuerpo. En los 4 estanques del ensayo de eficacia (2 estanques con peces parasitados + aditivo, 2 estanques con peces parasitados + control sin aditivo), los peces se alimentaron de forma similar, vahando entre el 1 y 2%, disminuyendo el consumo los días posteriores al muestreo del día 7, fecha en que se extrajeron peces de los estanques y se mantuvieron en ayunas para las manipulaciones.
El día 15 y el día 22, se realizaron los muéstreos, después de 7 y 13 días de alimentación con el presente aditivo y el alimento control. En los 4 estanques se muestrearon 10 peces por estanque en primer muestreo y la totalidad en el segundo, los que evidenciaron altas caligidosis, superior a 50 parásitos por pez en el primero y menos de 20 parásitos en el segundo.
Los peces alimentados con el presente aditivo presentaron parasitosis levemente inferiores a los estanques control (< 10%) en el primer muestreo, en tanto que al finalizar el ensayo se registraron diferencias de un 80% en las caligidosis de los peces alimentados con el presente aditivo respecto a los controles.
En el primer muestreo, los estadios predominantes en los peces alimentados con el presente aditivo fueron chalimus 3-4 (> 85%), con algunos representantes de estadios menos desarrollados (chalimus 1 -2) y escaso número de adultos (< 15%). Los estadios predominantes en los peces alimentados con dieta control fueron chalimus 3-4 junto a adultos, compartiendo porcentajes similares (40 a 50%) y un número ínfimo de estadios menos desarrollados (< 5%).
Al finalizar el ensayo, los estadios predominantes en los 4 estanques fueron los adultos, incluidas hembras ovígeras. Sin embargo, en los peces alimentados con el presente aditivo se registró la presencia de chalimus en diferentes estadios, los que no estuvieron presentes en los peces de estanques controles. Por ende, el producto afectó el desarrollo en esos estadios, evitando la madurez a adultos. Ver Tabla 9.
La evaluación de mortalidad de los parásitos en los 13 días de alimentación con el presente aditivo fue superior a 70%. Los peces alimentados con el alimento control evidenciaron escasa mortalidad, registrándose menos de 5% en un estanque y nula en el otro (Tabla 9).
Por ende, junto al retraso en maduración a adultos en los peces alimentados con el presente aditivo, también se observó una alta mortalidad de los estadios chalimus, madurando a adultos menos del 30%. Al calcular la eficacia del presente aditivo comparando las abundancias de parásitos al inicio y término del ensayo para cada estanque, los valores fueron cercanos al 70%. En tanto que, al comparar los resultados de los estanques con peces alimentados con el aditivo control, el valor fue cercano al 80%. abla 10. Abundancia promedio de los estadios de C. rogercresseyi en los peces alimentados con dieta Aditivo y dieta Control en el ensayo de Eficaciaunto al porcentaje de mortalidad en los 13 días de experimentación.
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Durante los muéstreos realizados a los 7 y 13 días de alimentación con el presente aditivo, se colectaron muestras de los diferentes estadios del parásito, en peces alimentados con la dieta que contiene el presente aditivo y peces alimentados sólo con el alimento como control. Las muestras se preservaron en fijadores (formol, glutaraldehído y alcohol) para realizar posteriormente análisis microscópicos e histológicos.
Un primer análisis de las muestras incluyó revisar la presencia de gónadas, características corporales y sacos ovígeros, con lupas estereoscópicas y microscopios, en los adultos colectados en el muestreo del día 22, término del ensayo. Los resultados de estas revisiones fueron:
La proporción sexual de los parásitos adultos fue similar en los peces alimentados con el presente aditivo y los peces alimentados con el control, 60% de hembras y 40% de machos;
Los parásitos adultos de ambos sexos, en los peces alimentados ya sea con alimento conteniendo el presente aditivo o sólo alimento, presentaron gónadas formadas y de similares características (ovarios y oviductos en hembras, testículos y espermatóforos los machos);
Las hembras de los parásitos de los peces alimentados con el control, fueron fecundadas por los machos, registrándose el 100% en gravidez (segmento genital con oviductos llenos de ovocitos vitelogénicos) o con sacos ovígeros, destacando un genital ancho. En los peces alimentados con el aditivo, las hembras de Caligus en su gran mayoría no evidenciaron estar fecundadas, en un 80% sus segmentos genitales fueron pequeños, sin oviductos con ovocitos vitelogénicos;
Al comparar la quitinización de los cuerpos de los parásitos adultos, se observó diferencias entre ambos sexos, registrándose un mayor grosor en parásitos de los peces alimentados con el control respecto a los parásitos de los peces alimentados con el presente aditivo, donde los menos quitinizados por transparencia dejan en evidencia los órganos internos;
Los sacos ovígeros en los parásitos de los peces alimentados con el control presentaron más de 40 huevos por saco, en cambio en los caligus de los peces expuestos al presente aditivo, el número fue inferior a 10.
Después de 13 días de experimentación con el presente aditivo a una dosis de 2000 gramos por tonelada de alimento, se observó que: En los primeros 7 días de alimentación, los peces evidenciaron parasitosis altas, con diferencias en los estadios dominantes de los parásitos, entre los peces alimentados con el presente aditivo y los peces alimentados con el alimento control. Se evidenció un retraso en el desarrollo de los estadios juveniles (chalimus 1 a 4) en los parásitos de los peces alimentados con alimento de peces conteniendo el presente aditivo.
- Al concluir el ensayo, a los 13 días posteriores a la alimentación, se registraron parásitos adultos de ambos sexos y hembras ovígeras en los peces alimentados con la dieta que contiene el presente aditivo y los controles. Sin embargo, quedó demostrada la eficacia del presente aditivo ya que en los dos estanques donde los peces fueron alimentados con el alimento suplementado, es decir, con alimento conteniendo el presente aditivo, éstos mostraron el 20% de la carga/presencia de parásitos comparada con los peces alimentos con el alimento control.
El ciclo de vida del parásito se registró en 15 días desde copepoditos a adultos, para los peces ya sea alimentados con la dieta conteniendo el presente aditivo o alimento control y 18 días de copepoditos a hembras ovígeras. Por ende, el aditivo de la presente invención actuó en la metamorfosis del parásito - sin adherirse a ninguna teoría, se debería a la capacidad de inhibir la síntesis de quitina, limitando el desarrollo hasta adultos, sin afectar significativamente la temporalidad del ciclo.
Los parásitos que lograron madurar hasta adultos, sólo en un escaso porcentaje se transformaron en generadores de larvas, sólo un 10% fueron hembras ovígeras y grávidas, en los peces alimentados con la dieta conteniendo el presente aditivo comparadas con el 40% de los parásitos de los peces alimentos con el control.
- Además, sin adherirse a ninguna teoría, se estima que debido a la participación de glándulas generadoras de quitina (glándula del cemento) en la reproducción (Asencio, 2015. Caligidosis en Chile. Aprendiendo Acuicultura Compendio, Tomo II. Salmonexpert 100 pag.) tanto en machos como en hembras, habría un efecto en la presencia de hembras grávidas u ovígeras. Las hembras y machos evidenciaron órganos maduros, pero para el logro de la fecundación y formación de los huevos se requeriría la participación de la glándula de quitina presente en el segmento genital de ambos sexos, y el presente aditivo tendría un efecto en estos procesos fisiológicos. Para probar esto se requiere realizar análisis histológico de las gónadas y segmento genital de machos y hembras colectados en este ensayo, para determinar si hubo fecundación de las hembras (presencia de espermios en la espermateca de las hembras) y actividad de las glándulas del cemento (tamaño menor).
La dieta de 13 días con el presente aditivo, permitió la mitigación de la caligidosis en los peces infestados con Caligus en condiciones controladas, mejorando la condición sanitaria de los peces del ensayo. Se expuso a los peces a una alta parasitosis (> a 50 caligus por pez), y después del suministro del aditivo, la parasitosis fue reducida drásticamente, con efectos también en la fecundidad de los parásitos adultos y con evidencias al microscopio óptico de diferencias en quitinización, desarrollo de los segmentos genitales de las hembras, y sacos ovígeros reducidos en número de huevos.
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Comparación del presente aditivo con Benzoato de emamectina en combatir parásitos en ensayos in vitro:
Se desarrolló un bioensayo para evaluar el presente aditivo en condiciones ambientales controladas (14°C), con agua de mar (32 ppm, 8 mg/L de concentración de oxígeno) en placa.
El bioensayo se prolongó por 48 h para observar el efecto del presente aditivo en la conducta natatoria y sobrevivencia de las hembras ovígeras de Caligus en comparación con Benzoato de Emamectina, aplicado ampliamente al tratamiento utilizado para el control de la parasitosis. El bioensayo finalizó a las 2 horas de iniciado, debido a la presencia de un mayor porcentaje de parásitos afectados, considerando para ello la conducta natatoria, movimientos de apéndices y tracto intestinal, y respuesta a estímulos como toques con pinzas o movimiento en el agua, al ser expuestos al presente aditivo, versus la conducta muy lenta y errática observada en los parásitos expuestos a benzoato de emamectina. Los principales resultados del bioensayo se muestran en la Tabla 11 y se resumen a continuación:
- El 67% de las hembras de los parásitos fueron afectadas por el presente aditivo, el 33% de las hembras restantes mostraba conducta errática y natación lenta.
- El 25% de las hembras de los parásitos expuestos a benzoato de emamectina mostraron escasa natación o respuesta a estímulos externos. Sin embargo, el 75% de las hembras estaban vivas nadaban lentamente, con respuesta lenta a estímulos y adheridas a recipientes de experimentación.
- Entre el 87 y 100% de los parásitos sobrevivieron en los controles con los solventes (metanol y DMSO) utilizados para preparar cada producto y en agua de mar. En estas condiciones las hembras nadaron activamente y respondieron rápidamente a estímulos como burbujas del sistema de aireación o manipulación con pinzas. Tabla 1 1
Figure imgf000026_0001
Los resultados evidencian una rápida acción del presente aditivo en las hembras ovigeras, provocando cambios conductuales desde los primeros 60 minutos. Al término del ensayo, se registró a todos los parásitos sumergidos en el aditivo sedimentado, sin registrarse natación en el agua.
Con el benzoato de emamectina hubo una respuesta más lenta que con el presente aditivo, registrándose natación de las hembras de parásitos en el agua, adhesión a los recipientes y respuesta natatoria al tocarlas con pinzas. Dado que no hubo efecto en las hembras de parásitos expuestas sólo a los solventes (metanol y DMSO) utilizados para cada antiparasitario (presente aditivo y benzoato de emamectina), la lentitud y mortalidad sería un resultado de ambos productos evaluados.
Ejemplo 8: Evaluación de mortalidad del aditivo en placa (In vitro)
El objetivo de este experimento fue evaluar la efectividad en el control del desarrollo de los embriones de Caligus rogercresseyi al interior de los sacos ovígeros, en condiciones controladas de laboratorio (ensayo in vitro). Para ello, se utilizó una dosis de 2 mg/L del presente aditivo, y se preparó un ensayo comprendiendo su dilución en el solvente orgánico dimetilsulfóxido (DMSO) y en agua de mar, como se detallan en la Tabla 12. El ensayo se basó en el protocolo establecido por Kumar y col. 2012 (Kumar, A., Raman, R.P., Kumar, K. et al. (2012) Antiparasitic efficacy of piperine against Argulus spp. on Carassius auratus (Linn. 1758): in vitro and in vivo study. Parasitol Res 11 1 , 2071-2076). Para el ensayo, el presente aditivo se transformó en una pasta, en tanto que, al incluir esta mezcla en agua de mar, se obtuvo una solución granulosa, la que precipitó al fondo de unos contenedores de vidrio. Para mantener la mezcla homogénea se agitó manualmente con una varilla de vidrio o agitación fuerte al contenedor. Previo al ensayo se realizó la mezcla del presente aditivo y se seleccionó 0,5 L del sobrenadante, utilizando este último para aplicar a las hembras ovígeras del parásito en 3 placas de Petri de 20 mL. 3 hembras ovígeras de caligus en estadio embrionario inicial de los huevos fueron utilizadas en cada placa. Por ende, se usaron 9 hembras en las placas con el presente aditivo y 9 en los controles con agua de mar. El ensayo duró 4 días, evaluando el desarrollo de la madurez de los sacos ovígeros cada día. Los resultados del ensayo dan cuenta que el presente aditivo tiene un efecto sobre la madurez de los sacos ovígeros de las hembras tratadas, donde al final del estudio, el 83% de las hembras tenían sacos inmaduros, 17% con sacos con madurez media, no observándose madurez de sacos ovígeros en hembras tratadas al día 4 (Tabla 12).
Tabla 12 Estadio del Desarrollo Saco Ovígero
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Claims

TI REIVINDICACIONES
1. Aditivo para alimento de peces para el control de la parasitosis caracterizado porque comprende una mezcla de un primer extracto botánico seleccionado de un extracto de nimbo o margosa de la India y un segundo extracto botánico seleccionado de pimienta y un agente enmascarador de sabor seleccionado de un extracto de alga marina.
2. El aditivo de la reivindicación 1 caracterizado porque dicha alga marina es Palmaría palmata.
3. Alimento para peces para el control de la parasitosis caracterizado porque comprende el aditivo de la reivindicación 1 en un alimento de peces en una dosis de 200-4000 gramos por tonelada de alimento.
4. El alimento de la reivindicación 3 caracterizado porque dicha dosis es 500-2000 gramos por tonelada de alimento.
5. El alimento de la reivindicación 4 caracterizado porque dicha dosis es 200-500 gramos por tonelada de alimento rangos.
6. Uso del aditivo de la reivindicación 1 caracterizado porque es útil en la prevención de la caligidosis.
7. El alimento de la reivindicación 4 caracterizado porque dicho alimento de peces es una premezcla en polvo de alimento de peces.
8. El aditivo de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho aditivo es un aditivo en polvo en un aceite en aceite.
9. El aditivo de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho aditivo es una capsula.
10. El aditivo de la reivindicación 1 caracterizado porque dicho aditivo es una solución en gel.
1 1 . El aditivo de la reivindicación 1 caracterizado porque comprende adicionalmente palatantes adicionales.
12. El aditivo de la reivindicación 1 caracterizado porque la razón en peso entre el primer extracto botánico: segundo extracto botánico: agente enmascarante de sabor de alga marina está en el rango de 70: 10: 20 a 50:5:45 El aditivo de la reivindicación 13 caracterizado porque la razón en peso entre el primer extracto botánico: segundo extracto botánico: agente enmascarante de sabor de alga marina es 65:5:30. Uso del aditivo de la reivindicación 1 caracterizado porque es útil en el control de la parasitosis limitando el desarrollo de las larvas y esterilizando los estadios adultos del parásito. Un método para combatir/eliminar infestaciones de Caligus en centros de cultivo de peces y concesiones marinas incluyendo esterilizar Caligus, caracterizado porque comprende suministrar a dichos peces el aditivo de la reivindicación 1 por vía oral o tópica.
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