ES2953462T3 - Composiciones y métodos para modular y/o estimular respuestas inmunes en seres humanos y/o animales - Google Patents
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Abstract
Se proporciona una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente. La composición se puede usar para modular y/o estimular respuestas inmunes en animales o humanos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para modular y/o estimular respuestas inmunes en seres humanos y/o animales
Campo de la invención
La presente solicitud se refiere a composiciones y métodos para modular y/o estimular respuestas inmunes en seres humanos y/o animales.
Antecedentes de la invención
La levadura y sus derivados se usan cada vez más como complemento nutricional para mejorar la salud intestinal de los animales y los seres humanos a través de la activación de respuestas inmunes antifúngicas iniciadas en la superficie de la mucosa intestinal, principalmente a través de las vías de la dectina 1 y el p-glucano, o mediante la unión directa con bacterias indeseables en el tracto digestivo. Ambos efectos dependen de la especificidad de la expresión del antígeno inmune dentro de la pared celular de la levadura y de la expresión del receptor del antígeno dentro de las células epiteliales intestinales. Sin embargo, cabe señalar que más allá de la bien descrita interacción pglucano/dectina 1, otras interacciones de receptores-"ligandos de levadura" que median la activación de la respuesta inmune, y más específicamente de la respuesta inmune antifúngica, pueden tener funciones importantes y dependen directamente de la composición y la estructura de la pared celular de la levadura. Actualmente existen opciones de mercado que usan productos inactivos inespecíficos a base de levadura que afirman estimular las respuestas inmunes a través de estas vías; sin embargo, estos productos carecen de especificidad y consistencia en términos de composición y resultado. Sería muy deseable disponer de un producto a base de levadura mejorado que mejorara la estimulación de las respuestas inmunes de animales o seres humanos.
Compendio de la descripción
La presente descripción proporciona una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente. Sorprendentemente, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida, cuando se combinan con polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente, dan lugar a una estimulación mejorada de las respuestas inmunes animales o humanas, incluso a una tasa de inclusión baja. En algunas realizaciones, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 1 al 99 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En una realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 50 por cien en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En realizaciones alternativas o complementarias, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 1 al 100 por cien en peso en función del peso total de la composición. En una realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 20 al 80 por cien en peso en función del peso total de la composición. En otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 30 al 60 por cien en peso en función del peso total de la composición. En una realización, la al menos una especie de Candida es Candida utilis. En otra realización, la al menos una especie de levadura diferente es de Saccharomyces sp, Hanseniaspora sp, Hansenula sp, Kluyveromyces sp, Metschnikowia sp, Pichia sp, Starmerella sp y Torulaspora sp o mezcla de estas. La al menos una especie de levadura diferente también comprende híbridos entre especies derivados de cualquiera de estas especies de levadura.
La presente descripción también proporciona usos como se define en las realizaciones anteriores para modular y/o estimular respuestas inmunes en animales y/o seres humanos. En otra realización, el animal es un animal doméstico.
La presente descripción también proporciona un método para modular y/o estimular respuestas inmunes en animales mediante la administración a un animal de una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente. En una realización, la combinación está en forma de aditivo alimentario, alimento para animales o producto farmacéutico. En otra realización, el producto farmacéutico se puede administrar por vía oral o parenteral. En otra realización más, el aditivo alimentario, alimento para animales, se puede presentar en formatos que se añaden a una dieta animal o humana completa o se añaden por separado como pastillas, gránulos o perlas para ser consumidos directamente. En aún otra realización, el animal es un animal doméstico.
Breve descripción de las figuras
Habiendo así descrito de manera general la naturaleza de la invención, ahora se hará referencia a las figuras adjuntas que muestran a modo de ilustración, una realización preferida de la misma, y en las cuales:
La figura 1 muestra el efecto de la inclusión de laminarina en la producción in vitro de especies reactivas de oxígeno (ROS) por monocitos incubados con polisacáridos parietales de diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae de acuerdo con el ejemplo 1, ensayo 1;
La figura 2 muestra la producción in vitro de ROS por monocitos con diferentes concentraciones de una mezcla de polisacáridos parietales de diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae, de acuerdo con el ejemplo 1, ensayo 2;
La figura 3 muestra el efecto comparativo de la laminarina en la producción in vitro de ROS por monocitos incubados con polisacáridos parietales de una cepa de Candida utilis o con polisacáridos parietales de una cepa de Saccharomyces cerevisiae, de acuerdo con el ejemplo 1, ensayo 3;
Las figuras 4a y 4b muestran la producción in vitro de ROS por monocitos incubados con diferentes concentraciones de polisacáridos parietales de cepas de Saccharomyces cerevisiae solas o combinadas con polisacáridos parietales de una cepa de Candida utilis (a) sin laminarina y (b) con 100 gg de laminarina, de acuerdo con el ejemplo 1, ensayo 4;
La figura 5 muestra la función de tasa de supervivencia de camarones peneidos infectados con Vibrio parahaemolyticus y tratados con diferentes composiciones de polisacáridos parietales de acuerdo con el procedimiento estadístico de Kaplan Meyer de acuerdo con el ejemplo 2;
Las figuras 6a y 6b muestran la densidad de microvellosidades del intestino distal de la lubina por microscopía electrónica después de alimentarse con dietas experimentales de acuerdo con la presente descripción en las semanas 5 y 10 de acuerdo con el ejemplo 3; y
La figura 7 muestra la expresión de dos genes inmunes (IL 1p e IL10) en el intestino distal después de alimentarse con dietas experimentales de acuerdo con la presente descripción en la semana 10 de acuerdo con el ejemplo 3.
La figura 8 muestra las tasas de supervivencia de camarones después de 14 días después del desafío (Media ± DE) de acuerdo con el ejemplo 6; las medias indicadas con la misma letra mayúscula no difieren entre tratamientos (prueba de Fisher, 5% de probabilidad).
La figura 9 muestra la dirección del deslizamiento de la espátula para el salmón del Atlántico y la trucha arcαris de acuerdo con el ejemplo 9.
La figura 10 muestra los niveles de expresión relativa de genes relacionados con el nivel de producción de moco en muestras de piel de la trucha arcoíris (O. mykiss) alimentadas durante 8 semanas con dietas experimentales suplementadas con polisacáridos parietales 60 SC y (polisacáridos parietales 50 SC/CU™) de acuerdo con el ejemplo 9. Los datos presentados son diagramas de caja (n = 10/tratamiento). *- indica una regulación al alza significativa; P <0,0001
La figura 11 muestra el rendimiento del crecimiento en peces alimentados control y en truchas arcαris alimentadas con las dietas experimentales durante 56 días de acuerdo con el ejemplo 9.
La figura 12 muestra ejemplos del intestino de lubina alimentada con el control (A y B), polisacáridos parietales 60 SC (C y D), polisacáridos parietales 50 SC/CU (E y F) y durante 10 semanas de acuerdo con el ejemplo 10. Las barras de escala son de 10 gm (imágenes A, C y E) y de 1 gm (imágenes B, D y F).
La figura 13 ilustra las mediciones de densidad de microvellosidades del intestino posterior de lubinas alimentadas con dietas de control y experimentales durante (A) 5 semanas y (B) 10 semanas de acuerdo con el ejemplo 10. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre los peces alimentados con dieta control y los peces alimentados con dieta experimental. (P < 0,001).
La figura 14 ilustra los datos de expresión génica para muestras de intestino posterior de lubina después de 10 semanas de alimentación con dietas experimentales. Los diagramas de caja muestran datos para HSP70, PCNA, IL-1 beta e IL-10 de acuerdo con el ejemplo 10. Los asteriscos indican una regulación significativa a la alza o a la baja en la expresión génica en comparación con los peces alimentados control (P <0,05).
La figura 15 muestra el recuento medio de lesiones intestinales de pollos de engorde expuestos a Eimeria acervulina, E. maxima y E. tenella el día 20 (6 días después del desafío) de acuerdo con el ejemplo 11.
La figura 16 muestra la mortalidad acumulada de pollos de engorde al final del ensayo (en %) de acuerdo con el ejemplo 11.
La figura 17 muestra la excreción fecal de ooquistes (ooquistes de occidios por gramo de materia fecal (OPG)) de pollos de engorde expuestos a Eimeria acervulina, E. maxima y E. tenella el día 20 (6 días después de la exposición) de acuerdo con el ejemplo 11.
Descripción detallada
Las paredes celulares de los hongos consisten predominantemente en polisacáridos parietales que incluyen quitina, estructura a base de manosa y beta-glucanos. Los glucanos componen hasta el 50% de la pared celular y son agentes biológicamente activos que se usan terapéuticamente para modificar las respuestas inmunes. Experimentalmente, estos polisacáridos parietales pueden conferir protección frente una variedad de desafíos que incluyen el desarrollo
de tumores y las infecciones. Recientemente se han hecho muchos avances hacia la comprensión de la respuesta inmune del huésped a las infecciones. Se han descubierto nuevas moléculas de superficie celular que regulan la respuesta del huésped a los microorganismos. Esos receptores se denominan receptores de reconocimiento de patrones asociados a patógenos (PRR) y se conocen principalmente como receptores tipo Toll, receptores de lectina tipo C, receptores carroñeros y receptores del complemento.
Estos receptores inmunes son activados por ligandos específicos, que se encuentran en la superficie de bacterias u hongos. En el caso de los hongos, las unidades de glucosa conectadas por enlaces glicosídicos p-1,3 y p-1,6, denominados p-glucanos, y principalmente extraídos de Saccharomyces cerevisiae, se ha demostrado que inducen actividad antimicrobiana, fungicida y antitumoral. El mecanismo mediante el cual estas moléculas inducen protección involucra a los receptores inmunes; uno de ellos es Dectina 1, el principal receptor de p-glucanos en los monocitos. Contiene un único dominio extracelular de reconocimiento de polisacárido parietal del tipo lectina tipo C capaz de reconocer células de levadura o derivados y contribuye a la movilización de la respuesta inmune. Por lo tanto, se describe el receptor de lectina tipo C Dectina 1 (Marakala y cols., Mamm Genoma (2011) 22: 55-65) que se une a los beta-glucanos de Saccharomyces cerevisiae y que está implicado en la inducción de diversas vías que dan lugar principalmente a la fagocitosis y eliminación de partículas como el zimosano, un extracto de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae, y otros derivados de levadura obtenidos a partir de cepas de Saccharomyces cerevisiae (ejemplos de otros derivados de levadura son, pero no se limitan a, pared celular de levadura, levaduras inactivas o levadura autolizada). Los mecanismos de detección de peligro y las respuestas inmediatas a la infección están fuertemente conservados y las respuestas inmunes se desencadenan en parte por la unión de estos ligandos de patógenos, por ejemplo, los beta-glucanos, a los PRR en la superficie de las células huésped. En cuestión de horas, se activa el sistema inmune innato no específico, asociado a una inflamación. La inflamación local juega un papel importante en esta respuesta inmediata a la infección. Numerosos actores en el sistema inmune innato, que incluyen neutrófilos, monocitos, macrófagos, factores del complemento, citoquinas, péptidos antimicrobianos y proteínas de fase aguda, se movilizan rápidamente en una respuesta compleja y fuertemente regulada para proporcionar una defensa inmediata frente a la infección. Actualmente existen opciones de mercado para productos inactivos a base de levadura que pretenden estimular las respuestas inmunes a través de estas vías; sin embargo, estos productos carecen de especificidad y consistencia en el resultado. Sería muy deseable disponer de un producto a base de levadura mejorado que potenciara la estimulación de las respuestas inmunes de animales o seres humanos.
La presente descripción proporciona una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente. En el contexto de la presente descripción, unos "polisacáridos parietales" son quitina, manano-oligosacáridos, beta 1,3 glucanos y beta 1,6 glucanos. Sorprendentemente, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida cuando se combinan con polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente, dan lugar a una estimulación mejorada de las respuestas inmunes animales o humanas, incluso a una tasa de inclusión baja.
En algunas realizaciones, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 1 al 99 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En una realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 5 al 90 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 5 al 80 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En otra realización más, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 75 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En aún otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 60 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En una realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 20 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En otra realización más, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 15 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En aún otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En aún otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 11, 12, 13, 14 o 15 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición.
En realizaciones alternativas o complementarias, los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 1 al 99 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En una realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 50 al 90 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 70 al el 90 por ciento en peso seco en función del peso total de
polisacáridos parietales en la composición. En otra realización más, los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 80 al 90 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En aún otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad de al menos el 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o 90 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad de al menos el 70, 75, 80, 85 o 90 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición. En otra realización más, los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad de al menos el 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o 90 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición.
En realizaciones alternativas o complementarias, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 1 al 100 por ciento en peso en función del peso total de la composición. En una realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 20 al 80 por ciento en peso en función del peso total de la composición. En otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 30 al 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición. En otra realización más, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad de al menos el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 por ciento en peso en función del peso total de la composición. En aún otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad de al menos el 20, 23, 25, 27, 30, 33, 35, 37, 40, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 60, 63, 65, 67, 70, 73, 75, 77 u 80 por ciento en peso en función del peso total de la composición. En una realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad de al menos el 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
En una realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición; y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 30 al 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
En otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición; y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad que varía del 30 al 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
En otra realización más, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición; y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad de al menos el 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
En aún otra realización, los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición; y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente están en una cantidad de al menos el 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
En una realización, la al menos una especie de Candida es Candida utilis. En la presente descripción, se entiende que Candida utilis incluye tanto la forma sexual (Cyberlindnera jardinií) como la asexual (Candida utilis). En otra realización, la al menos una especie de levadura diferente es de Saccharomyces sp, Hanseniaspora sp, Hansenula sp, Kluyveromyces sp, Metschnikowia sp, Pichia sp, Starmerella sp y Torulaspora sp o una mezcla de estas. La al menos una especie de levadura diferente también comprende híbridos entre especies derivados de cualquiera de estas especies de levadura. En otra realización más, la al menos una especie de levadura diferente es Saccharomyces sp. En aún una realización adicional, la al menos una especie de levadura diferente es Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae también comprende subespecies como, pero no se limitan a, Saccharomyces cerevisiae var. boulardii. En aún otra realización, la al menos una especie de levadura diferente es una mezcla de dos o más Saccharomyces cerevisiae. En aún otra realización, la al menos una especie de levadura diferente es una mezcla de al menos una Saccharomyces cerevisiae y al menos una Saccharomyces cerevisiae var. boulardii.
En una realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para modular y/o estimular respuestas inmunes en animales o seres humanos. Se entenderá que el término "modular", cuando se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier aumento o reducción medible de la respuesta inmune. En otra realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para mejorar la salud animal o humana y la resistencia a la infección. En otra realización más, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para mejorar la resistencia animal o humana a los microorganismos patógenos. En otra realización más, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para promover el rendimiento de la cría de animales. En una realización, el animal es un animal doméstico. Los animales domésticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, peces, camarones, terneros o lechones.
En una realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para promover y/o mejorar la salud intestinal, la integridad intestinal y la morfología intestinal de los animales. En otra realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para estimular una respuesta antiinflamatoria de los animales. En otra realización más, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para promover y/o mejorar los parámetros de rendimiento del crecimiento y la conversión alimenticia de animales de granja. En aún otra realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para reducir la morbilidad y, en particular, durante los tratamientos con antibióticos, y la mortalidad de los animales de granja. En una realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para reducir la mortalidad de animales de granja. En otra realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para reducir la diarrea de los animales. En otra realización más, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para reducir la sensibilidad a los patógenos intestinales. En otra realización más, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para reducir la sensibilidad de los animales a las infestaciones de parásitos y trastornos relacionados. En una realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se puede usar para promover y/o mejorar la producción de moco cutáneo de animales acuáticos o su calidad.
En aún otra realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores es útil como ingrediente en alimentos convencionales para animales.
Todavía en otra realización, la composición tal como se define en las realizaciones anteriores se presenta normalmente en formatos que se añaden a una dieta animal o humana completa o se añaden por separado como pastillas, gránulos o perlas para ser consumidos directamente.
La presente descripción proporciona un método para modular y/o estimular las respuestas inmunes en animales o seres humanos mediante la administración a un animal o a un ser humano de una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente. También se proporciona un método para mejorar la salud animal o humana y/o la resistencia a la infección mediante la administración a un animal o a un ser humano de una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente. También se proporciona un método para mejorar la resistencia animal o humana a los microorganismos patógenos mediante la administración a un animal o a un ser humano de una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente. También se proporciona un método para promover el rendimiento de la cría de animales mediante la administración a un animal o a un ser humano de una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de levadura diferente.
En una realización, la combinación está en forma de un aditivo alimentario, un aditivo para piensos, un material/ingrediente para piensos, un pienso para animales o un producto farmacéutico. En otra realización, el producto farmacéutico se puede administrar por vía oral o parenteral. En otra realización más, el aditivo alimentario, alimento para animales, se puede presentar en formatos que se añaden a una dieta animal o humana completa o se añaden por separado como pastillas, gránulos o perlas para ser consumidos directamente. En otra realización más, el animal es un animal doméstico. Los animales domésticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, peces, camarones, terneros o lechones.
Los siguientes ejemplos sirven para describir y definir adicionalmente la invención y no pretenden limitar la invención de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1:
La dectina 1 no es el único PRR que reconoce los polisacáridos parietales de levadura. Es probable que la estructura y la arquitectura de la pared celular desempeñen un papel importante. Aquí se plantea la hipótesis de que diferentes especies de levadura, incluso con una composición similar de polisacáridos parietales, pueden exhibir diferentes arquitecturas de su red de polisacáridos parietales, lo que da lugar a la activación de un conjunto diferente de PRR, no necesariamente vinculado a la activación de la dectina 1. Para evaluar esta hipótesis se realizaron ensayos de competición in vitro como se muestra en el Ejemplo 1 usando laminarina, un ligando soluble específico con alta afinidad
por la dectina 1.
En este ejemplo, el inventor ha optado por evaluar el impacto de diferentes combinaciones de polisacáridos parietales extraídos de diferentes especies y cepas de levadura sobre la respuesta de la inmunidad innata. El modelo celular usado en estos experimentos fue el cultivo primario de monocitos humanos. Se evaluó la capacidad de los monocitos para generar especies de oxígeno: se estudió la producción del anión superóxido gracias a la quimioluminiscencia. Esta molécula proviene de la NADPH oxidasa, un complejo enzimático que se encuentra en la superficie de los monocitos. Las especies de oxígeno están implicadas en la muerte de bacterias u hongos vivos fagocitados por monocitos.
Material y Métodos
Cultivo de células
Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de capas leucocitarias de donantes de sangre sanos mediante un método estándar de gradiente de Ficoll-Hypaque. Se aislaron monocitos humanos a partir de células mononucleares por adherencia a plástico durante 2 horas en medio SFM optimizado para cultivo de macrófagos, a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Se sembraron en una placa de cultivo de pocillos múltiples y se eliminaron las células no adherentes mediante lavados con HBSS sin calcio ni magnesio. Las células adherentes restantes (> 85 % de monocitos) se incubaron en SFM antes de la estimulación.
Ensayo para la producción de especies de oxígeno
Las células mononucleares se colocaron en una microplaca de 96 pocillos. La producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) se midió por quimioluminiscencia en presencia de 5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona (luminol, Sigma) usando un luminómetro controlado termostáticamente (37 °C) (Wallac 1420 Victor2, Finlandia). La generación de quimioluminiscencia se monitoreó de manera continua durante 60 min después de la incubación de las células con luminol (66 μM) en condiciones basales y en presencia de los diferentes polisacáridos parietales a 100 μg/ml solos o en presencia de un nivel graduado de laminarina (0, 1, 10 y 100 μg/ml dependiendo de los ensayos). Se usó zimosano como control positivo a 100 μg/ml.
Polisacáridos parietales de levadura usados en este estudio:
Polisacáridos parietales extraídos de diferentes cepas de levadura:
Cepas de Saccharomyces cerevisiae: L60, L62, L 69, L72
Cepa de Candida utilis: L75 (NRRL-900)
Niveles de polisacáridos parietales probados en los diferentes ensayos:
Cepa de Candida utilis: los niveles de polisacáridos parietales se estandarizaron al 30 por ciento en peso seco en función del peso total de la composición.
Cepas de Saccharomyces cerevisiae: los niveles de polisacáridos parietales se estandarizaron al 30, 35, 45 y 60 por ciento en peso seco en función del peso total de la composición.
Combinación de Candida utilis y Saccharomyces cerevisiae: los niveles de polisacáridos se estandarizaron al 30, 35, 40, 45 y 50 por ciento en peso seco en función del peso total de la composición. Los niveles de polisacáridos parietales de Candida utilis en esas combinaciones fueron respectivamente del 15, 15, 10, 15 y 5 por ciento en peso seco en función del peso total de la composición o del 50, 43, 25, 33 y 10 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición (Figuras 4a, 4b)
Resultados:
Ensayo 1: Producción in vitro de ROS por monocitos incubados con polisacáridos parietales de diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae con diferentes concentraciones de laminarina. Cada fracción de polisacáridos parietales de cuatro cepas diferentes de Saccharomyces cerevisiae se estandarizó al 60 por ciento en peso seco en función del peso total de la fracción y se probó su afinidad por la dectina 1. Como se muestra en la Figura 1, los polisacáridos parietales de todas las cepas fueron capaces de inducir la producción de ROS y la laminarina inhibió esta inducción de forma lineal en respuesta a la dosis.
Ensayo 2: Respuesta a la dosis de polisacáridos parietales de Saccharomyces cerevisiae sobre la producción in vitro de ROS por monocitos. Se preparó una mezcla de polisacáridos parietales de dos cepas diferentes de Saccharomyces cerevisiae (L62 y L69) y estandarizó al 30, 35, 45 y 60 por ciento de peso seco en función del peso total de la mezcla y se probó su inducción de la producción de ROS. Como se muestra en la Figura 2, se obtuvo una respuesta lineal a la dosis en el intervalo de concentraciones probadas.
Ensayo 3: Efecto comparativo de la laminarina en la producción in vitro de ROS por monocitos incubados con polisacáridos parietales de una especie de Candida utilis o con polisacáridos parietales de una Saccharomyces cerevisiae. La fracción de polisacáridos parietales de una cepa patentada de Candida utilis se estandarizó al 30 por ciento en peso seco en función del peso total de la fracción y se probó su afinidad por la dectina 1. De manera similar, la fracción de polisacáridos parietales de una cepa de Saccharomyces cerevisiae (L62) se estandarizó respectivamente al 30 y 60 por ciento de peso seco en función del peso total de la fracción y se probó su afinidad por la dectina 1. Como se muestra en la Figura 3, en ausencia de laminarina, la fracción de polisacáridos parietales de Candida utilis y las fracciones de polisacáridos parietales de Saccharomyces cerevisiae fueron capaces de inducir la producción de ROS. En la Figura 3, un aumento en la concentración de laminarina aumenta la inhibición de la producción de ROS por parte de las fracciones de polisacáridos parietales de Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, un aumento en la concentración de laminarina no mostró inhibición de la producción de ROS por la fracción de polisacáridos parietales de Candida utilis, incluso a 100 μg/ml.
Ensayo 4: Producción in vitro de ROS por monocitos incubados con diferentes concentraciones de polisacáridos parietales de cepas de Saccharomyces cerevisiae solas o combinadas con polisacáridos parietales de una cepa de Candida utilis (a) sin laminarina y (b) con 100 μg de laminarina;
Como se muestra en las Figuras 4a y 4b, la presencia de polisacáridos parietales de Candida utilis en las diferentes composiciones da lugar a un aumento de la producción de ROS por parte de los monocitos incluso a una tasa de inclusión baja (es decir, al 5 por ciento en peso seco en función del peso total de la composición). Como se muestra en la Figura 4b, las composiciones que comprenden polisacáridos parietales de Candida utilis y polisacáridos parietales de al menos un Saccharomyces cerevisiae no se afectaron por el efecto inhibidor de la laminarina sobre los polisacáridos de Saccharomyces cerevisiae solos (como se muestra en las Figuras 1 y 3), incluso a la tasa de inclusión más baja (es decir, al 5 por ciento en peso seco en función del peso total de la composición o al 10 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición).
Ejemplo 2:
Se probó una composición que comprende polisacáridos parietales de una Candida utilis (CU) y polisacáridos parietales de un Saccharomyces cerevisiae (SC) como una estrategia de alimentación preventiva para mitigar la sensibilidad de los camarones peneidos a la vibriosis. Los polisacáridos parietales estaban en una cantidad del 50 por ciento en peso en función del peso total de la composición (50 SC/CU).
Con el objetivo de evaluar el beneficio de los polisacáridos parietales 50 SC/CU frente a los polisacáridos parietales SC solos, se aplicó un desafío in vivo de enfermedad en camarones peneidos juveniles. El método de infección fue por inmersión y se usó un Vibrio parahaemolyticus virulento capaz de inducir el síndrome de necrosis hepatopancreática aguda.
Los polisacáridos parietales probados fueron:
- polisacáridos parietales 50 SC/CU que contenían el 6 por ciento en peso seco de polisacáridos parietales de Candida utilis NRRL-900 (en función del peso total de la composición, o el 12 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición): se ensayaron 3 dosis: 0,04%; 0,08% y 0,12% en el alimento
- polisacáridos parietales 60 SC de una cepa de S. cerevisiae (CNCM I 1079) probados al 0,12% en el alimento
Los ensayos se realizaron con Litopenaeus vannamei juveniles de 2,07±0,05 g que fueron alimentados durante 21 días con dietas suplementadas o no con los Candidatos ensayados antes de un desafío de inmersión con 100 ml de un cultivo de una cepa de V. parahaemolyticus virulento capaz de inducir AHPNS a 1,1x 109 UFC/ml (cultivados en TSB NaCl al 2% (TSB+) a 28°C durante 18h). Se monitorearon las mortalidades durante 10 días y se comparó estadísticamente la supervivencia acumulada para cada dieta con el control dentro de cada ensayo. También se construyeron las curvas de supervivencia de Kaplan y Meier (Kaplan y Meier, 1958) para cada dieta y las curvas se compararon usando la prueba de rango logarítmico (log-rank) para determinar las diferencias entre las curvas y si las tendencias en la supervivencia eran diferentes entre las curvas. El nivel de significancia se estableció en P = 0,05.
El tratamiento con 50 SC/CU mostró una respuesta lineal en función de la dosis para reducir la mortalidad inducida por la cepa patógena (Log Rank (Mantel-Cox), p<0,01). La supervivencia mejoró significativamente con una tasa de inclusión del 0,04 % en comparación con el control positivo (infectado). El 60 SC/CU solo mostró una mejora marginal al 0,12%.
Protocolo:
Se alimentaron Penaeus vannamei juveniles con una dieta para camarones preparada comercialmente que se mezcló con los productos probados durante 21 días antes de la exposición al baño al Vibrio parahaemolyticus (agente causante de la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda - AHPND) para determinar si el aditivo alimentario tendrá efectos sobre las tasas de supervivencia e infección.
Acuarios y diseño experimental:
Los animales SPF (libres de patógenos específicos) utilizados en este ejemplo se han revisado para la detección de enfermedades infecciosas importantes que incluyen WSSV (Virus del síndrome de la mancha blanca), TSV (Virus del Síndrome de Taura), IMNV (Virus de la Mionecrosis Infecciosa), AHPND (Enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda) usando tanto histopatología como técnicas de PCR. Se transfirieron post-larvas de 12 días de edad del criadero a un laboratorio húmedo y se crecieron en estricta bioseguridad durante otros 45 días para alcanzar el tamaño de 1 -2 gramos. Un día antes del inicio del estudio, se transfirieron P. vannamei SPF de 1-2 gramos/cada uno a 27 tanques de 90 l (35 camarones/tanque). Todos los camarones en cada tanque se pesaron en grupo antes de la siembra para el cálculo de la tasa de crecimiento al final de la prueba. Todos los animales en estos tanques se alimentaron con su respectiva dieta de prueba durante 21 días (Tabla 1).
Se alimentaron cuatro tanques réplica por tratamiento con el alimento preparado que contenía los productos probados. Se designaron cuatro tanques como controles positivos y otros cuatro tanques sirvieron como controles negativos. Los tanques de control negativo también se alimentaron con una dieta de gránulos comerciales para camarones, pero no se les desafió con el Vibrio parahaemolyticus que causa la EMS/AHPND. Todos los tanques recibieron su dieta respectiva aproximadamente al 5% del peso corporal cada día.
Dieciséis tanques de tratamiento se desafiaron con Vibrio parahaemolyticus después de 21 días de la administración del aditivo alimentario que contiene el pienso. Mientras tanto, los tanques de control positivo se alimentaron con la misma dieta comercial para camarones sin ninguna adición y se desafiaron con Vibrio parahaemolyticus el día 21 del ensayo. Los camarones con el desafío se mantuvieron durante otros 10 días para registrar la supervivencia y monitorear la tasa de crecimiento.
Métodos de desafío:
En este estudio, los camarones se sometieron a un desafío de inmersión. Se añadió directamente a los tanques medio de digerido de soja cloruro de sodio al 2% (TSB+) inoculado con una cepa consistentemente virulenta de Vibrio parahaemolyticus incubado durante 18 horas. La suspensión bacteriana se añadió al tanque para alcanzar la densidad bacteriana medida por absorbancia de densidad óptica (OD600 nm). Durante el período de desafío, los camarones se mantuvieron con su respectivo tratamiento dietético durante otros 10 días.
Resultados
Las tasas de supervivencia finales al final del ensayo después del tratamiento estadístico se indican en la Tabla 1. La Figura 5 indica las distribuciones de la tasa de supervivencia durante el transcurso del experimento para los diferentes grupos de camarones de acuerdo con el procedimiento de Kaplan Meyer.
Tabla 1: Tasa de supervivencia final: Resumen del tratamiento de las observaciones
Las tablas 2 y 3 muestran las diferencias estadísticas entre las distribuciones de supervivencia de los diferentes grupos de camarones.
Como se muestra en la Tabla 2, todas las pruebas aplicadas revelaron efectos del tratamiento altamente significativos entre las distribuciones de supervivencia.
Tabla 2: Comparación estadística: Prueba de igualdad de distribuciones de supervivencia para diferentes niveles de Tratamientos.
Como se muestra en la Tabla 3, el desafío bacteriano afecta significativamente a la supervivencia de los camarones en todos los grupos cuando se compara la cinética de mortalidad de cada grupo infectado con el control negativo (grupo no infectado) usando el método de Kaplan-Meier y la prueba de Log Rank (Mantel-Cox). Además, estos resultados in vivo confirman el efecto beneficioso de la composición que comprende polisacáridos parietales de Saccharomyces cerevisiae y de Candida utilis en la modulación y/o estimulación de las defensas naturales y en la mejora del rendimiento animal en condiciones desafiantes (Tabla 3).
Tabla 3: Comparación estadística de la distribución mediante la prueba de Log Rank (Mantel-Cox): Prueba de igualdad de distribuciones de supervivencia entre los diferentes tratamientos.
Ejemplo 3:
Los resultados del presente ejemplo en la lubina mostraron un efecto positivo de «polisacáridos parietales 50 SC/CU» frente a «polisacáridos parietales 60 SC» en el rendimiento de los peces y la respuesta al estrés.
Se sometieron Dicentrarchus labrax con un peso promedio de 15,4 g a una prueba de alimentación de diez semanas con un 0,08 % de «polisacáridos parietales 50 SC/CU» frente a un 0,2 % de «polisacáridos parietales 60 SC».
El alimento se formuló para que contuviera altos niveles de harina de soja (40%) como se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4: Formulación de la dieta
Polisacáridos parietales Polisacáridos parietales 50 Ingredientes basales Control 60 SC SC/Cu
Harina de soja 38,93 38,93 38,93
Almidón de maíz 16,63 16,63 16,63
Tres tanques de 25 peces por tratamiento. Estrés salino aplicado en la semana 8. Parámetros registrados: rendimiento de crecimiento/morfología intestinal/microflora intestinal.
La tabla 5 muestra el rendimiento final en la semana 10.
Tabla 5: rendimiento en la semana 10
Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Los datos se transformaron cuando fue necesario y el análisis estadístico se realizó con estadística SPSS versión 18 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Il, EE. UU.) y se aceptó la significancia en el nivel P < 0,05. Todos los datos se analizaron usando un ANOVA de una vía. Las diferencias significativas entre los grupos control y experimental se determinaron mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney.
Las Figuras 6a y 6b muestran los resultados de microscopía electrónica de barrido de la densidad de microvellosidades del intestino distal de la lubina después de alimentarse con dietas experimentales en las semanas 5 y 10 respectivamente. Los datos se expresan como medias ± DE (n = 3). Se indican las diferencias significativas con el control correspondiente (*) P <0,01, y (**) P < 0,001. Los datos se transformaron cuando fue necesario y el análisis estadístico se realizó con estadística SPSS versión 18 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Il, EE. UU.) y se aceptó en el nivel P < 0,05. Se usó un ANOVA de una vía para analizar los datos y se determinaron las diferencias significativas entre los grupos de control y experimental usando la prueba post hoc de Tukey.
Tabla 6: Microscopía óptica en la semana 5 y 10
Todos los datos se presentan en la Tabla 6 como media ± desviación estándar (DE). Los datos se transformaron cuando fue necesario y el análisis estadístico se realizó con estadística SPSS versión 18 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Il, EE. UU.) y se aceptó la significancia en el nivel P < 0,05. Todos los datos se analizaron usando un ANOVA de una vía. Las diferencias significativas entre los grupos de control y experimental se determinaron mediante la prueba post hoc de Tukey HSD.
La Figura 7 muestra la expresión de dos genes inmunes (IL 1p e IL 10) en el intestino distal de la lubina después de alimentarse con dietas experimentales de acuerdo con la presente descripción en la semana 10.
Ejemplo 4:
Este ejemplo demuestra el efecto de la suplementación de lechones destetados con una combinación de polisacáridos parietales de acuerdo con la presente descripción en la 2a fase de alimentación.
Configuración del ensayo
Duración del ensayo: 42 días
Animales materiales y condiciones de cría:
Los lechones destetados se alojaron en corrales de 12 lechones. En un edificio, se asignaron 6 corrales a uno de los dos tratamientos (Control y Tratamiento). Se repitieron dos series de ensayos a lo largo del tiempo, lo que dio lugar a 12 corrales réplica por tratamiento al analizar las 2 series juntas.
Producto de prueba: polisacáridos parietales 50 SC/CU con el 6% de CU
Tratamientos: El ensayo consistió en 2 tratamientos:
T-1 - control - dietas normales, sin derivados de levadura
T-2 - dieta control suplementada con polisacáridos parietales 50 SC/CU al 0,08%
Dietas
Los animales se alimentaron con dietas de harina de dos fases como se muestra en la Tabla 7.
Tabla 7: dietas de comida en dos fases
Parámetros zootécnicos medidos:
- Peso corporal por corral al inicio y al final de cada fase de alimentación,
- Consumo de alimento por corral para la 2a fase de alimentación
- Mortalidad y tasa de sacrificio
Análisis estadístico
Los resultados se analizan con el modelo de GLM univariante (Modelo Lineal Generalizado), usando SPSS.
Resultados:
A. Rendimiento del crecimiento
Como se muestra en la Tabla 8, se detectaron efectos significativos en el peso corporal final y la ganancia diaria promedio. Este efecto se explica principalmente por un rendimiento significativamente mejor durante la segunda fase con una tasa de crecimiento diario y una tasa de conversión alimenticia significativamente más altas en el grupo tratado.
Otras observaciones: Solo murió un lechón en uno de los corrales tratados frente a tres (3) en los corrales de control, todas las muertes se debieron a meningitis. Se observaron menos mordeduras de oreja en el grupo de tratamiento. Heces más líquidas en el grupo Control.
Ejemplo 5:
Este ejemplo evalúa el efecto de una composición de polisacáridos parietales 50 SC/CU cuando se suplementa a través del alimento sólido en el rendimiento zootécnico y de salud de los terneros antes y después del destete. Duración del estudio: 6 semanas.
Materiales y métodos
Animales implicados:
- Animales totales: 129 animales al principio, 125 al final.
- Sexo: Machos
- Raza: Frisona (origen: diferentes granjas de Francia)
Tratamientos experimentales
Se compararon dos tratamientos dietéticos que usaban la misma harina de harina suplementada con diferentes productos:
- Como T0: Dieta de control sin ningún producto.
- T1: misma dieta suplementada con polisacáridos parietales 50 SC/CU
2 primeras semanas: 5 g/animal/día = 2,7 g/kg alimento de inicio
luego: 3 g/animal/día = 1,6 g/kg alimento de inicio
Diseño experimental
A su llegada a la granja, los animales fueron asignados aleatoriamente a los corrales. Seis días después comenzó el ensayo y se pesaron los animales y se homogeneizaron los corrales según el peso corporal promedio y la desviación estándar promedio de los pesos corporales. Todos los corrales se llevaron a cabo simultáneamente. El peso de inicio fue de 53,9 ± 4,3 kg en promedio, mientras que la edad promedio de inicio fue de 27,3 ± 4,4 días.
Descripción del sitio y alimentación
Todos los animales se alojaron en el mismo edificio, en corrales con lechos de paja de 10-11 animales. Participaron cuatro corrales por tratamiento: tres corrales de 11 animales y un corral de 10 animales cada uno = 43 animales por tratamiento. Cada corral tenía un comedero sin ningún contacto entre comederos de un corral a otro. La paja se compartió entre dos corrales, pero sin contaminación cruzada entre tratamientos. La leche se distribuyó individualmente dos veces al día a las 8:00 am y a las 6:00 μm. El concentrado para terneros se distribuyó manualmente una vez al día en comederos, y la cantidad distribuida se pesó cada día antes de la distribución. Todos los animales tuvieron libre acceso a la paja.
Los animales se alimentaron de acuerdo con el siguiente programa:
- A la llegada - 2 semanas: 2 x 1,5 l/día de una dilución de leche de calostro (25% de CP y 19,5% de grasa) y luego sustituto lácteo (22% de CP y 18% de grasa) alimento sólido (harina) a voluntad paja a voluntad agua a voluntad - 2 semanas - destete (34d): 1 x 2l/día de sustituto lácteo (19% de CP y 15% de grasa) alimento sólido (harina) a voluntad paja a voluntad agua a voluntad
- Destete - Salida: alimento sólida (harina) a voluntad paja a voluntad agua a voluntad
El destete se realizó cuando los terneros presentaban buena condición corporal y comenzaban a comer más de 1 kg/día/animal.
Parámetros registrados y métodos aplicados
Pesos vivos individuales: Los terneros se pesaron individualmente cada dos semanas desde el inicio hasta el final del estudio a las 10:00 AM (total de 4 pesos). Consumo de alimento: El consumo de alimento (concentrado) se registró semanalmente por corral = compendio del alimento pesado ofrecido todos los días - rechazo pesado el último día de la semana.
Resultados
Peso corporal (BW) y ganancia diaria promedio (ADG)
Como se muestra en la Tabla 9, el peso corporal (BW) promedio de los animales alimentados con T1 tendía a ser mejor que el de los animales alimentados con T0. No se encontró interacción entre el tratamiento y el período. El BW inicial y final (BW0 y BW42 respectivamente) fueron numéricamente más altos para T1.
Tabla 9: Pesos corporales durante el ensayo
Como se muestra en la Tabla 10, las ganancias diarias promedio no fueron diferentes entre los tratamientos, aunque los animales de T1 tuvieron una ganancia numéricamente mejor que los de T0.
Tabla 10: Ganancias diarias promedio durante la prueba
Las desviaciones estándar dentro del corral dan una buena indicación de la heterogeneidad de los pesos y las ganancias, cuando los granjeros buscan una mejor homogeneidad como consecuencia de ingestas más uniformes. Las desviaciones estándar de T1 son significativamente más bajas que las de T0, lo que significa que los animales de control tienen una mayor heterogeneidad de pesos corporales que los animales tratados (Tabla 11). En cuanto a la heterogeneidad del crecimiento, no se observó significación estadística, aunque, numéricamente, los animales de control tienen un crecimiento más heterogéneo que los animales del grupo tratado.
Tabla 11: Desviaciones estándar de BW y ADG (dentro de los corrales) durante el ensayo
Ingesta de concentrado y eficacia alimenticia (FE) y tasa de conversión alimenticia (FCR)
El análisis estadístico de la ingesta total de concentrado (suma de la ingesta en el período total/número de animales por corral) por semana no mostró ninguna diferencia. El análisis de la relación de conversión alimenticia no mostró ninguna diferencia significativa entre los tratamientos.
Diarreas y morbilidad
Como se muestra en la Tabla 12, los animales de T1 mostraron un menor número de días con diarrea y un menor número de tratamientos con antibióticos en comparación con el control T0.
Tabla 12: Número de días con diarrea y número de tratamientos con antibióticos
Una prueba de Mann Whitney aplicada sobre el porcentaje de animales tratados al menos una vez con diarrea mostró una reducción significativa en T1 en comparación con T0, y una tendencia de reducción para el porcentaje de animales tratados al menos una vez con antibióticos (Tabla 13).
Tabla 13: Porcentaje de animales tratados al menos una vez con antibióticos y con diarrea.
Ejemplo 6:
Se alimentaron Penaeus vannamei juveniles con dietas para camarones preparadas comercialmente que se mezclaron con un producto de aditivo alimentario proporcionado por LALLEMAND durante 14 días antes de un desafío de 14 días con Enterocytozoon hepatopenae, un parásito microsporidiano, para determinar si alguna dosis de los aditivos alimentarios tiene efectos positivos en la tasa de supervivencia, reduce la tasa de infección y la carga parasitaria.
Materiales y métodos
En este estudio se utilizaron camarones juveniles SPF (libres de patógenos específicos). Esos camarones se revisaron para detectar enfermedades infecciosas importantes, incluidas WSSV (Virus del síndrome de la mancha blanca), TSV (Virus del Síndrome de Taura), IMNV (Virus de la Mionecrosis Infecciosa), EMS/AHPND (síndrome de mortalidad temprana/síndrome de necrosis hepatopancreática aguda) y EHP (Enterocytozoon hepatopenaei). Un día antes del inicio del estudio, se transfirieron Penaeus vannamei SPF a 1,50 ± 0,09 gramos por cada uno a tanques de 120 l (con 30 camarones.tanque-1) que contenían 90 l de agua a una salinidad de 20 ppt. Cada tanque estaba equipado con un filtro biológico sumergido que contenía coral activado.
Diseño experimental
El experimento se estableció como un diseño completamente al azar en el que cada tratamiento se diseñó al azar con los diferentes tanques. Duración total de la prueba: 29 días, que incluye 01 día de aclimatación, 14 días de administración de aditivos alimentarios, seguidos de 14 días de desafío con EHP bajo los mismos tratamientos de alimentación de acuerdo con la tabla 13. Los camarones en todos los tanques recibieron sus respectivas dietas hasta la saciedad cuatro veces por día durante el ensayo (Tabla 14). Se alimentaron cinco tanques con el alimento preparado que contenía el aditivo alimentario. Se designaron cinco tanques como controles positivos para un desafío de co habitación y cinco tanques sirvieron como controles negativos.
Tabla 13: Desarrollo del experimento
Tabla 14
Definición de todos los acuarios de 120 l utilizados en el estudio de EHP
Elaboración de dietas para camarones
Los aditivos alimentarios se mezclaron con la harina de alimentación y se les añadió un aglutinante (CMC-carboximetilcelulosa) y humedad antes de extruirlos en una picadora de carne presurizada. A continuación, el alimento se secó a 50 grados Celsius durante 6 horas. El alimento se trituró al tamaño esperado (1,5-2 mm de longitud) usado para el estudio.
Método de desafío
Se usó un método de desafío de co-habitación estandarizado para desafiar camarones juveniles pequeños con el Enterocytozoon hepatopenae que causa EHP - una enfermedad parasitaria microsporidiana que simula las rutas naturales de infección.
Los camarones SPF y afectados fueron separados por un separador de red que permite el libre intercambio de agua. El método de desafío de la co-habitación está diseñado de la siguiente manera: en cada tanque de plástico de 120 litros se coloca una red rectangular de 50 litros cúbicos. Durante el desafío, se sembraron 20 camarones infectados con EHP dentro de la red suspendida y 30 camarones SPF se sembraron afuera. Tanto los camarones infectados con EHP como los camarones SPF se alimentaron con las dietas de prueba de cada tratamiento respectivo durante otros 14 días. El control negativo (F) también se trató con el mismo método de desafío. Sin embargo, los 20 camarones SPF en lugar de los 20 camarones afectados por EHP se almacenaron dentro de la red suspendida. Durante el período de desafío, tanto los camarones dentro de la red como los camarones fuera de la red de control negativo fueron alimentados con una dieta comercial para camarones.
La densidad de carga parasitaria de los camarones afectados por EHP fue de 5,05E+06 UFC/g de Enterocytozoon hepatopenaei al comienzo del desafío.
Muestreo y observación
La prueba por qPCR para EHP se realizó en 05 camarones/tanque/punto de tiempo en 3 puntos de tiempo: día 14 (justo antes del desafío) para confirmar el estado libre de EHP del camarón SPF, día 15 (24 horas después del desafío) y el día 18 (96 horas después del desafío) para cuantificar la carga parasitaria. Al finalizar el estudio del desafío, todos los animales vivos se contaron como supervivientes.
Análisis estadístico
La comparación de las medias de siete tratamientos se realizó con ANOVA usando la prueba LSD de Fisher y se consideraron diferencias significativas cuando P < 0,05.
Resultados
Parámetros de rendimiento de camarones
Los parámetros de producción medios durante los 28 días del período experimental se dan en la tabla 15. Los valores representan las medias de cinco réplicas.
Tabla 15
Tasas de supervivencia de la prueba de desafío
Tasas de supervivencia de los tratamientos después de 14 días posteriores al desafío
Las tasas de supervivencia de los camarones después de 14 días después del desafío se dan en la Figura 8 (Media ± DE) de los tratamientos; las medias indicadas con la misma letra mayúscula no difieren
entre tratamientos (prueba de Fisher, 5% de probabilidad).
El resultado de la prueba de qPCR sobre la carga de parásitos de EHP se proporciona en la tabla 16. Al comienzo del experimento de desafío (justo antes del desafío), hay un estado libre de EHP en los tratamientos. Después de 48 horas posteriores al desafío, los camarones del experimento en el tratamiento A y en el control positivo (G) están afectados con la enfermedad, mientras que el control negativo (F) tenía un estado libre de EHP. Por lo tanto, esto indica que la configuración del ensayo fue aceptable y que no se produjo contaminación cruzada con el control negativo. La carga de parásitos EHP en el tratamiento A y G fue similar después de 48 horas. Sin embargo, después de 120 horas posteriores al desafío, la carga de parásitos de EHP en el tratamiento A estuvo por debajo del límite de detección en 4 tanques de 5, mientras que todos los tanques del control negativo dieron positivo para EHP (5/5).
Ejemplo 7
Evaluación del efecto de polisacáridos parietales 50 SC/CU sobre la resistencia de pollos de engorde al estrés por calor
El estrés por calor es uno de los factores estresantes ambientales más importantes que supone un desafío para la producción avícola en todo el mundo. El estrés por calor afecta negativamente al rendimiento de las aves, reduciendo el crecimiento y la seguridad del producto. Durante los períodos de estrés por calor, los pollos de engorde experimentan importantes adaptaciones de termorregulación para evitar la muerte por agotamiento por calor y esto tiene un efecto perjudicial en el rendimiento.
Diseño experimental
- Ubicación: Granja experimental privada (Francia)
- Diseño experimental: 2 grupos:
- Control (C): sin suplementación; polisacáridos parietales 50 SC/CU (Y): polisacáridos parietales 50 SC/CU a 800 g/ton y 400 g/ton en periodos de inicio y crecimiento, respectivamente. Sin suplementación de polisacáridos parietales 50 SC/CU durante el período de finalización (800-400-0).
- Dietas:
3 fases (inicio, crecimiento y finalización). Las tres fases de alimentación fueron: 0-10, 11-25, 26-35 días.
- Animales:
La prueba se realizó en pollos de engorde de la raza Ross PM3 asignados aleatoriamente a la llegada en 13 corrales para alcanzar una densidad de 20 aves/corral (C: 6 corrales, Y: 7 corrales).
- Desafío del estrés por calor:
La prueba de estrés por calor se realizó en el D20: la temperatura se incrementó hasta 31°C en la estancia en la noche entre el D19 y el D20.
- Mediciones: Número de mortalidad y fechas por corral.
- Análisis estadístico:
La diferencia en la mortalidad entre los 2 grupos durante el ensayo (y en particular la resistencia de las aves al estrés por calor) se analizó mediante la prueba de Kaplan-Meier. Las diferencias entre los grupos se consideraron significativas para un valor de p < 0,1. De lo contrario, los análisis estadísticos aparecen como no significativos (NS). Resultados
- Mortalidad y resistencia de las aves al desafío del estrés por calor: los resultados se dan en la tabla 17
Tabla 17
Cuarenta aves murieron durante el desafío de estrés por calor: 9 aves en el grupo de polisacáridos parietales 50 SC/CU y 31 aves en el grupo de control. El número total de aves muertas fue de 17 en el grupo de polisacáridos parietales 50 SC/CU y de 38 en el grupo de control. El análisis de Kaplan-Meier (prueba estadística que compara el tiempo medio de supervivencia en los 2 grupos) fue fuertemente significativo (p < 0,001) y dio la siguiente estimación: tiempo medio de supervivencia de 29,6 y 32,9 días para los grupos C e Y, respectivamente. Por lo tanto, el grupo de polisacáridos parietales 50 SC/CU fue más resistente al estrés por calor agudo que el grupo de control.
En conclusión, la alimentación con polisacáridos parietales 50 SC/CU dio lugar a una mejor resistencia al estrés por calor.
Ejemplo 8
Introducción y objetivo
El objetivo del ensayo actual fue probar el efecto de los polisacáridos parietales 50 SC/CU sobre el rendimiento, la morbilidad y la incidencia de diarrea de lechones después del destete, después de la eliminación de los medicamentos. Diseño experimental
Animales y alojamiento
En total, se distribuyeron 480 lechones destetados (línea materna: Large White x Landrace; línea paterna: Danbred Duroc) de 4 lotes posteriores en 8 salas de transición de 4 corrales cada una, en grupos de 20 lechones/corral. Se distribuyeron de manera que el peso corporal inicial fuera lo más homogéneo posible dentro de un corral y entre tratamientos, y colocando 10 nulíparas y 10 machos en cada corral.
Los lechones fueron vacunados frente a Mycoplasma a los 7 y 21 días de edad, y para Circovirus a los 21 días de edad.
Período
El ensayo tuvo lugar desde el destete a los 19 días de edad en promedio y tuvo una duración de 55 días.
Tratamientos
Los lechones fueron alimentados con un programa de alimentación de dos fases y tuvieron libre acceso al alimento y al agua durante todo el período experimental.
Hubo 2 tratamientos (tabla 18): Control (C) y prueba 1 (T1).
La estrategia antibiótica que se usa actualmente en la granja es: Pre-inicio: 120 ppm de colistina 300 ppm de amoxicilina 2.400 ppm de ZnO; Inicio: 1.600 ppm de ZnO.
Para el ensayo, con el objetivo de desafiar a los lechones, la medicación pasó a ser: Pre-inicio: 2.400 ppm de ZnO; Inicio: alimentación en blanco.
Tabla 18. Tratamientos
Montaje experimental y observaciones.
- Peso corporal: individual. Al inicio y al final del experimento y en el cambio de dieta.
- Ingesta de alimento: por corral. En el cambio de dieta, como la diferencia entre el alimento suministrado y el sobrante el día del cambio.
- Morbilidad: intervención sanitaria individual y grupal, incluida la profilaxis habitual del rebaño.
- Mortalidad: fecha, peso y motivo aparente.
- Diarrea: por corral. Control diario de la incidencia de diarrea.
Estadísticas
Análisis de la varianza con el Modelo lineal general en SPSS 22.0 (IBM), de acuerdo con el modelo:
Yjk = m a x IBW lotej tratamientok lotej*tratamientok ejk
Dónde:
Y = peso corporal final (FBW), ganancia diaria promedio (ADG), ingesta de alimento diario promedio (ADFI), tasa de conversión alimenticia (FCR), mortalidad; IBW = peso corporal inicial usado como una covariable; lote = efecto fijo causado por lote (j = 1, 2, 3, 4); tratamiento = efecto fijo causado por el tratamiento (k = C, T1); lote*tratamiento = interacción entre el tratamiento experimental y el lote; e = error. La unidad experimental fue el corral. Se declaró significancia a partir de P<0,05.
No se encontró interacción entre tratamiento y el lote. Como consecuencia, se eliminó del modelo.
Resultados
Rendimiento
Hubo diferencias significativas en FBW (P<0,01), crecimiento de inicio y general (P<0,05) y en FCR de inicio (P<0,05), siendo los lechones en T1 los que presentaron mayor BW, crecimiento más rápido y menor FCR. Además, los lechones T1 tendieron a crecer más rápido en el inicio (P<0,1) y a comer más en el inicio (P<0,1). Los resultados de rendimiento se muestran en la tabla 19.
Tabla 2 Resultados de rendimiento por período y en general de los lechones en los tratamientos C y T1
El hecho de que las diferencias sean más fuertes en el período de inicio que en el de pre-inicio probablemente se deba a que la granja tenía un buen estado de salud, y en el período de inicio los lechones fueron más desafiados con una dieta en blanco que durante la fase de pre-inicio.
La mortalidad fue baja durante el período experimental y no hubo diferencias entre tratamientos. En promedio, a lo largo de todo el período, fue del 1,8 %. En total, 13 lechones murieron durante el ensayo.
Conclusiones:
Las principales conclusiones de este ensayo son:
- La adición de polisacáridos parietales 50 SC/CU en las dietas post-destete mejora el peso corporal final, la ganancia diaria promedio general y numéricamente la tasa de conversión alimenticia general, con respecto a una dieta de control con medicación limitada.
- El impacto parece ser más fuerte en el período de inicio que en el período de pre-inicio, probablemente dependiendo del estado de salud de la granja.
- Los polisacáridos parietales 50 SC/CU podrían ser un buen sustituto potencial de ZnO y/o antibióticos durante la fase inicial.
Se recomienda probar el potencial de los polisacáridos parietales 50 SC/CU para reemplazar los antibióticos, comparando un tratamiento de polisacáridos parietales 50 SC/CU con un control positivo, y el posible efecto complementario de la adición de los polisacáridos parietales 50 SC/CU además de los antibióticos.
Ejemplo 9
Instalaciones, Descripciones de muestras y Dietas experimentales
El experimento se llevó a cabo con alevines de trucha arcαris (Oncorhynchus mykiss). Después de cuatro semanas de aclimatación, se distribuyeron aleatoriamente 480 peces (23,07 ± 0,2 g) en tanques de fibra de vidrio de 16 x 150 l (30 peces por tanque) que contenían agua dulce recirculada aireada. Los peces fueron alimentados con dietas a un régimen fijo del 3% del peso corporal por día distribuido en tres tiempos de alimentación (09:00, 13:00 y 17:00 horas) durante 56 días. Los peces se pesaron por lotes cada dos semanas después de un período de inanición de 24 h y se criaron a 14,5 ± 0,5 °C con un fotoperíodo de luz: oscuridad de 12:12 h. El pH del agua se mantuvo entre 6,8 y 7,5, el oxígeno disuelto entre 7,5 y 8 mg/l, el amonio entre 0,04 y 0,08 mg/l, el nitrito entre 0,02 y 0,06 mg/l y el nitrato entre 54 y 58 mg/l. Las truchas arcoíris se alimentaron con uno de los cuatro regímenes dietéticos con tanques cuadruplicados para cada tratamiento: 1] control, 2] polisacáridos parietales 60 SC, 3] alimentación continua de polisacáridos parietales 50 SC/CU y 4] pulsada de polisacáridos parietales 50 SC/CU durante 56 días (consúltese la Tabla 21 para conocer la composición de las dietas).
Tabla 21. Formulación de dietas experimentales para el experimento de Plymouth. Cada componente de ingrediente se expresa en g/kg por dieta.
Metodología
Recogida de moco
Los peces se seleccionarán al azar y se sacrificarán sin crueldad de acuerdo con los protocolos de la estación de prueba. MS222 es la opción preferida de anestesia. Se debe tener cuidado al pescar con redes para que esto se haga lo más rápido posible con la mínima alteración de las superficies mucosas de los peces. Inmediatamente después de la muerte, se recogerá el moco raspando un lado del pescado usando una espátula pequeña desde el borde del opérculo hasta el ano (Figura 9: Dirección del deslizamiento de la espátula para el salmón del Atlántico y la trucha arco iris). El moco acumulado en el extremo de la cola del pez se debe transferir a una jeringa previamente pesada de 1 ml. El moco se almacena en tubos eppendorf de 1 ml y se congela inmediatamente a -802C, en espera del análisis. Recogida de muestras de qPCR en tiempo real
Se recogieron muestras de piel (<100 mg) de trucha arcαris, se transfirieron a 1 ml de solución RNAlater (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) y se almacenaron a 4 °C durante 24 h y luego a -80 °C hasta la extracción del ARN. Después de la extracción del ARN, se aplicó una qPCR para observar la expresión de un biomarcador específico de producción de moco.
Cálculos del rendimiento de crecimiento
El crecimiento se evaluó mediante la ganancia de peso (WG), la tasa de crecimiento específica (SGR), el índice de conversión alimenticia (FCR), el índice de eficiencia proteica (PER), el factor de condición (K). Los cálculos se realizaron usando las siguientes fórmulas: NWG (g) = FW-IW; s Gr (%BW/día) = 100((lnFW-lnlW)/T); FCR (g/g) = FI /WG; PER = WG/PI; K = FW/(FL3). Donde FW = peso final (g), IW = peso inicial (g), T = duración de la alimentación (días), WG = ganancia de peso húmedo (g), FI = ingesta de alimento (g), PI = proteína ingerida (g) y FL = longitud final (cm).
Resultados
Análisis de muestras de moco
Los datos para la producción de moco se presentan en la Tabla 22. La producción de moco aumentó en los peces alimentados con 60 SC y 50 SC/CU frente al control, con una ventaja numérica a favor de 50 SC/CU.
Tabla 22. Producción de moco cutáneo de peces (mg/cm) después de 28 y 56 días de alimentación con dietas experimentales. Los datos se presentan como medias ± DE.
Análisis de qPCR en tiempo real
El análisis de la expresión génica de las muestras de piel de la trucha arcoíris reveló una regulación a la alza significativa de la expresión de un biomarcador específico de la producción de moco en peces alimentados con una dieta de polisacáridos parietales 50 SC/CU continuos (2,31 ± 1,26 NEL; P = 0,0003) y pulsados (2,09 ± 0,58 NEL; P < 0,0001), en comparación con peces alimentados con control (1,16 ± 0,48 NEL). Los datos se presentan en la Figura 10, que muestra la expresión relativa de este gen en muestras de piel de trucha arcαris (O. mykiss) alimentadas durante 8 semanas con dietas experimentales suplementadas con polisacáridos parietales 60 SC y (polisacáridos parietales 50 SC/CU™). Datos presentados en diagramas de caja (n = 10/tratamiento). *- indica una significativa regulación al alza; P <0,0001
Rendimiento del crecimiento
En comparación con los peces alimentados con control, la trucha arcαris alimentada con las dietas experimentales durante 56 días no reveló diferencias significativas en el rendimiento del crecimiento. Los datos se presentan en la figura 11 que muestra el rendimiento del crecimiento de truchas arcoíris alimentadas con dietas experimentales durante 56 días.
Ejemplo 10:
Peces, diseño experimental y formulación de dietas
Después de 4 semanas de aclimatación, se distribuyeron aleatoriamente 225 lubinas (15,45 ± 0,1 g) en 9 tanques de fibra de vidrio de 110 l (25 peces por tanque). Las lubinas se alimentaron a una tasa fija del 2,0 % del peso corporal por día distribuidas en 3 horarios de alimentación a las 9:00, 13:00 y 16:30 h durante 10 semanas. Los peces se pesaron por lotes semanalmente después de un período de inanición de 24 h y se criaron a 24,14 ± 0,85 °C, salinidad de 26,58 ± 4,32 con un fotoperíodo de luz: oscuridad de 12:12 h. El pH del agua se mantuvo entre 6,8 y 7,5, el oxígeno disuelto entre 7,5 y 8 mg/l, el amonio entre 0,04 y 0,08 mg/l, el nitrito entre 0,02 y 0,06 mg/l y el nitrato entre 54 y 58 mg/l.
Las dietas se formularon para que contuvieran un alto nivel de inclusión de harina de soja (40% de inclusión), la formulación dietética se muestra en la Tabla 23.
Tabla 23. Formulación de dietas experimentales. Está expresado cada componente de ingrediente (% nivel de inclusión).
Metodología
Análisis de microscopía óptica (LM)
Se extrajo el intestino distal del pescado, se fijó en formalina marina al 10 % y se mantuvo a 4 °C durante 48 horas y posteriormente se transfirió a etanol al 70 % para su almacenamiento. Antes del análisis, las muestras intestinales se deshidrataron (Leica TP 1020) y se incluyeron en cera de parafina de acuerdo con Dimitriglou y cols. (Journal of animal science, 2009, 87, 3226-3234).
Las muestras se seccionaron con un grosor de 5 gm (microtomo Leica RM2235), se secaron en un horno durante toda la noche y luego se auto-tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) (Leica Autostainer XL). Los portaobjetos se montaron con cubreobjetos usando DPX y se dejaron secar. A continuación, se tomaron fotografías de las muestras teñidas (microscopio Leica DMIRB y cámara SLR digital Olympus E410). El análisis de imágenes se realizó usando el software Image J 1.47v (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, EE. UU.). Las imágenes de LM se usaron para calcular la longitud del pliegue (FL) y el ancho de la lámina propria (LP-W), además de la célula caliciforme (GC) y se midieron en 200 gm. Para las relaciones perimetrales (PR), se ajustó el umbral de la imagen, seguido de la conversión a 8 bits. El perímetro interior se dividió por el perímetro exterior para calcular el índice. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) y el análisis estadístico se realizó con estadística SPSS versión 15 para Windows (SPSS Inc., Il, EE. UU.) y se aceptó en P <0,05. Los datos histológicos se analizaron usando ANOVA de una vía. Las diferencias significativas entre los grupos de control y de tratamiento se determinaron usando la prueba post-hoc HSD de Tukey.
Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Las muestras se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (1:1 vol., pH 7,2). Luego se deshidrataron las muestras en una serie graduada de etanol (30 %, 50 %, 70 %, 90 % y 100 % de alcohol x2) durante 15 min en cada etapa y se secaron en el punto crítico (K850 Emitech) con etanol como fluido intermedio y CO2 como el fluido de transición. A continuación, las muestras se recubrieron por pulverización (K550 Emitech) con oro y se observaron con un microscopio electrónico de barrido JSM 6610 LV. Se tomaron múltiples imágenes para cada muestra con aumentos que oscilaban entre x 500 y x 20.000 para evaluar la integridad intestinal general. Las mediciones de la densidad de las microvellosidades se realizaron usando Imagen J (V1.45) que usa imágenes con un aumento de x 20.000 (Figura 13). Los datos de SEM se analizaron usando ANOVA de una vía. Las diferencias significativas entre los grupos de control y de tratamiento se determinaron usando la prueba post-hoc HSD de Tukey.
Recogida de muestras de qPCR en tiempo real
Se recogieron muestras intestinales posteriores (<100 mg) de lubina europea, se transfirieron a 1 ml de solución RNAlater (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) y se almacenaron a 4 °C durante 24 h y luego a -80 °C hasta la extracción del ARN.
Extracción del ARN y síntesis de ADNc
El ARN total se extrajo con el reactivo TRI (Ambion, Life Technologies, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones. Brevemente, se extrajeron 50-100 mg de muestras intestinales de la solución de RNAlater y se eliminó el exceso de solución presionando la muestra entre tejido estéril. Las muestras (<100 mg) se transfirieron a un tubo que contenía 1 ml de reactivo TRI y se homogeneizaron durante 10 min. A continuación, se añadieron 200 gl de cloroformo y, después de mezclar, las muestras se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 min. La fase acuosa superior se transfirió a un tubo que contenía un volumen igual de isopropanol. Las mezclas se agitaron en vortex y se centrifugaron a 14.000 x g durante 15 min. Se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos de ARN precipitados se lavaron con 1 ml de etanol al 75 %. El ARN total se disolvió en dietilpirocarbonato (DEPC) y, para eliminar cualquier ADN genómico contaminante, se purificó usando el RNeasy Plus Mini Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Reino Unido). La concentración y la calidad del ARN en cada muestra se determinaron midiendo las proporciones de absorbancia a 260/280 nm y a 260/230 (NanoDrop Technologies,
Wilmigton, EE. UU.). La integridad del ARN se confirmó analizando muestras en el Bioanalizador, los números de integridad del ARN (RIN) oscilaron entre 8,0 y 9,5 (Agilent Technologies, Reino Unido), las muestras se almacenaron a -80 °C. Se usó una cantidad total de 1 gg de ARN para la síntesis de ADNc, empleando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Reino Unido). La reacción se colocó a 25 °C durante 5 min, luego a 42 °C durante 30 min y se inactivó a 85 °C durante 5 min. El kit de síntesis de ADNc iScript contiene una combinación de oligo dTs y hexámeros aleatorios para trabajar con una amplia variedad de dianas.
Ensayo de PCR en tiempo real
Las reacciones de PCR se realizaron con el método SYBR green usando un termociclador de PCR en tiempo real StepOne Plus™ (Applied Biosystems). Se llevaron a cabo reacciones de PCR por duplicado para cada muestra analizada. Cada reacción de PCR se puso en una placa de 384 pocillos mezclando 2 gl de ADNc diluido (1/10) con 5,5 gl de iQ SYBR Green Supermix™ concentrado 2 x (Bio-Rad), que contiene SYBR Green como agente intercalante fluorescente, cebador directo 0,3 gM y cebador inverso 0,3 gM. El cebador usado y sus secuencias se presentan en la Tabla 1. El perfil térmico para todas las reacciones fue de 10 min a 95 °C y luego 40 ciclos de 15 s a 95 °C, 60 s a 59 °C. El seguimiento de la fluorescencia se produjo al final de cada ciclo. Se realizó un análisis adicional de la curva de disociación y mostró en todos los casos un solo pico. Se usaron p-actina y GAPDH como genes de referencia en cada muestra con el fin de estandarizar los resultados al eliminar la variación en la cantidad y calidad del ARNm y el ADNc (Bustin y cols., 2009). De hecho, la estabilidad y la idoneidad de GAPDH y p-actina como genes de referencia se confirmaron de acuerdo con los algoritmos usados por el software geNorm™ (Vandesompele y cols., Genome Biology, 2002, 3(7), investigación 0034).
Se generó un valor de estabilidad de expresión “M” para cada gen de referencia. No se observó ningún producto de amplificación en los controles negativos y no se observaron formaciones de dímeros de cebadores en los moldes de control. Se representa la modificación de la expresión génica con respecto a los controles que se muestrean al mismo tiempo que el tratamiento.
El ciclo umbral (Ct), definido como el punto en el que la fluorescencia se eleva apreciablemente por encima de la fluorescencia de fondo, se determinó manualmente para cada ejecución. Las eficiencias de PCR para cada conjunto de cebadores se determinaron mediante diluciones en serie del ADNc (n = 3) y las gráficas resultantes de Ct frente al registro logarítmico de ADNc, mediante la ecuación E (eficiencia de PCR) = 10(-1/pendiente). El nivel de expresión normalizado (NEL) de los genes diana se calculó en función de la desviación de Ct (ACt) de la muestra desconocida frente a una muestra de control y se expresó en comparación con los genes de referencia GAPDH y p-actina de acuerdo con los cálculos descritos por el manual geNorm™ (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/) y Vandesomele y cols. (Genome Biology, 2002, 3(7), investigación 0034).
Todas las estadísticas para los datos de RT-qPCR se llevaron a cabo mediante la prueba de permutación en R.
Cálculos del rendimiento de crecimiento
El crecimiento se evaluó mediante la ganancia de peso (WG), la tasa de crecimiento específica (SGR), el índice de conversión alimenticia (FCR), el índice de eficiencia proteica (PER), el factor de condición (K). Los cálculos se realizaron usando las siguientes fórmulas: NWG (g) = FW-IW; Sg R (%BW/día) = 100((lnFW-lnlW)/T); FCR (g/g) = FI/WG; PER = WG/PI; K = FW/(FL3). Donde FW = peso final (g), IW = peso inicial (g), T = duración de la alimentación (días), WG = ganancia de peso húmedo (g), FI = ingesta de alimento (g), PI = proteína ingerida (g) y FL = longitud final (cm).
Resultados
Microscopía óptica
La microscopía óptica reveló que la lubina alimentada con las dietas de control y experimental mostró una barrera epitelial intacta y una disposición de la mucosa de los pliegues de la mucosa organizados similares a vellosidades. La mucosa intestinal consistía en un epitelio simple y una lámina propria (LP) que comprendía IELs dispersos (véase la Figura 12A). La relación perimetral en comparación con la dieta de control de alimentación para peces (una relación perimetral más alta indica una superficie intestinal de mayor absorción provocada por pliegues mucosos más numerosos y/o más largos) fue significativamente elevada en los peces alimentados con dietas de polisacáridos parietales 50 SC/CU en ambas semanas 5 y 10 del período experimental (véase la Tabla 24A y B). En contraste, en comparación con los peces alimentados con control, los peces alimentados con el régimen dietético de polisacáridos parietales 60 mostraron una elevación significativa en PR solo después de 10 semanas de alimentación (véase la Tabla 24B).
Tabla 24A. Datos de microscopía óptica después de 5 semanas de alimentación con dietas experimentales. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (n = 6/tratamiento). Los superíndices a-b indican una diferencia significativa usando la prueba post-hoc HSD de Tukey
Tabla 24 B. Datos de microscopía óptica después de 10 semanas de alimentación con dietas experimentales. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (n = 18/tratamiento). Los superíndices a-b indican una diferencia significativa usando la prueba post-hoc HSD de Tukey
Análisis SEM
Las superficies epiteliales de todos los peces parecían estar sanas con formaciones uniformes de enterocitos y microvellosidades densamente empaquetadas sin signos de ruptura o necrosis celular o de microvellosidades. Las imágenes representativas de peces dentro de cada tratamiento se presentan en la Figura 12 y los análisis de medición de densidad de microvellosidades se presentan en las Figuras 13A y 13B. Después de 5 semanas de alimentación con dietas experimentales (consúltese la Figura 13A), en comparación con los peces alimentados con control (1,58 ± 0,5 a.u.), los peces alimentados con polisacáridos parietales 60 SC (2,90 ± 1,0 a.u.) y polisacáridos parietales 50 SC/CU (4,81 ± 1,0 a.u.) revelaron una elevación significativa en la densidad de microvellosidades (P < 0,001). Asimismo, después de 10 semanas de alimentación con las dietas experimentales (véase la Figura 16B), los peces alimentados con polisacáridos parietales 60 SC (3,51 ± 0,4 a.u.) y polisacáridos parietales 50 SC/CU (3,48 ± 0,7 a.u.) exhibieron una elevación significativa (P <0,001) en densidad de microvellosidades en comparación con los peces alimentados con la dieta de control (1,66 ± 0,2).
qPCR en tiempo real
Los datos de expresión génica revelaron que, en comparación con los peces alimentados con control (0,48 ± 0,15 NEL), los peces alimentados con polisacáridos parietales 60 SC (0,17 ± 0,07 NEL) y con polisacáridos parietales 50 SC/CU (0,11 ± 0,08 NEL) exhibieron una regulación a la baja significativa (P = 0,03) para la proteína de choque térmico 70 (HSP70). Del mismo modo, para la expresión génica del antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA), los peces alimentados con polisacáridos parietales 60 SC (0,14 ± 0,1 NEL) y con polisacáridos parietales 50 SC/CU (0,12 ± 0,04 NEL) exhibieron una regulación a la baja significativa (P = 0,03) en comparación con los peces alimentados con la dieta de control (0,47 ± 0,14 NEL). En contraste, los datos de expresión génica para el efector inflamatorio de citoquina, la interleuquina-1beta (IL-1beta), revelaron que los peces alimentados con una dieta de polisacáridos parietales 50 SC/CU (1,74 ± 0,4 NEL) exhibieron una regulación positiva significativa (P = 0,03) en comparación con los peces alimentados con la dieta de control (0,51 ± 0,4 NEL). De manera similar, los datos de expresión génica para el efector antiinflamatorio de citoquina, la interleuquina-10 (IL-10), revelaron que los peces alimentados con la dieta con polisacáridos parietales 50 SC/CU (2,79 ± 2,0 NEL) exhibieron una regulación positiva significativa (P = 0,05) en comparación con los peces alimentados con la dieta de control (0,36 ± 0,2 NEL). Todos los datos se presentan en la Figura 14.
Ejemplo 11: Eficacia anticoccidial de los de polisacáridos parietales 50 SC/CU en pollos de engorde comerciales expuestos a un desafío mixto de Eimeria acervulina, E. maxima y E. tenella
Objetivo
El objetivo del estudio fue medir la eficacia/sensibilidad anticoccidial de polisacáridos parietales 50SC/CU frente a una mezcla de Eimeria acervulina, E. maxima y E. tenella.
Diseño experimental
El estudio consistió en 45 jaulas comenzando con 10 pollitos cada una. Los ocho tratamientos se replicaron nueve veces.
Tratamientos
Animales
Para este ensayo se usaron pollitos de engorde machos del día de la eclosión (cepa Ross 708). En el criadero, las aves fueron sexadas y recibieron las vacunas de rutina. En el estudio sólo se usaron pollitos de aspecto saludable. El estudio comenzó cuando se colocaron las aves (Día 0), momento en el que se repartieron en las jaulas experimentales. No se reemplazaron aves durante el transcurso del estudio. Las aves se pesaron por jaula los días 0, 14, 20 y 28.
Alojamiento
A su llegada, los pollitos se colocaron en jaulas en batería. El espacio de suelo por animal era de 0,51 pie cuadrado/ave. El aire acondicionado/calefacción a gas controlado termostáticamente mantiene una temperatura uniforme. Incluso, la iluminación continua fue proporcionada por lámparas fluorescentes colgadas verticalmente a lo largo de la pared. Se les proporcionó alimento y agua ad libitum.
Agente del organismo
El inóculo coccidial consistió en un cultivo mixto de tres especies de Eimeria. Las especies fueron E. acervulina, E. maxima y E. Tenella. El inóculo coccidial se administró por sonda oral a las aves en los tratamientos infectados.
El día 14 del estudio, cada ave del tratamiento no infectado recibió 1 ml de agua destilada mediante pipeta oral (p.o.). Las aves en los tratamientos infectados recibieron el inóculo coccidial diluido a un volumen de 1 ml (p.o.) titulando a un recuento promedio de ooquistes de 75.000, 25.000 y 50.000 para E. acervulina, E. maxima y E. tenella, respectivamente.
Puntuación de lesiones
El día 20, se sacrificaron humanitariamente cinco (5) aves por jaula y se pesó el grupo. Las aves se puntuaron en cuanto a lesiones por coccidiosis de acuerdo con la(s) región(es) infectada(s) del intestino.
Esquema del desafío
- D14: desafío de coccidiosis = 75.000, 25.000 y 50.000 para E. acervulina, E. maxima y E. tenella, respectivamente - D20: recuento de ooquistes en materia fecal (mezclado por jaula) puntuación de lesiones intestinales (5 aves/jaula) Resultados
Se dan en las figuras 15 a 17.
Como se muestra en la Figura 15, los animales alimentados con polisacáridos parietales 50 SC/CU mostraron menores lesiones específicas asociadas a la infección por Eimeria acervulina, E. maxima y E. tenella. Este efecto dio como resultado una puntuación promedio significativamente más baja de las lesiones.
De manera interesante, la mortalidad de pollos de engorde infectados por Eimeria sp. durante el transcurso del experimento también se redujo numéricamente de manera dependiente de la dosis, como se muestra en la Figura 16. La excreción fecal de ooquistes patógenos en el día 20 (6 días después de la infección) se redujo significativamente en las aves alimentadas con polisacáridos parietales 50 SC/CU de manera dependiente de la dosis, como se muestra en la figura 17.
Estos resultados apoyan el hecho de que la alimentación de pollos de engorde con polisacáridos parietales 50 SC/CH puede mitigar los efectos negativos asociados a una infección por Eimeria sp.
Si bien la invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que es susceptible de modificaciones adicionales y esta solicitud pretende abarcar cualquier variación, uso o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo las desviaciones de la presente descripción que entran dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y que se pueden aplicar a las características esenciales establecidas anteriormente, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (24)
1. Una composición que comprende polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces, en donde dichos polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces son quitina, mananooligosacáridos, Beta-1,3 glucanos y Beta-1,6 glucanos, en una cantidad que varía del 20 al 80 por ciento en peso en función del peso total de dicha composición.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que vería del 10 al 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 15 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición.
4. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición.
5. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 11, 12, 13, 14 o 15 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición.
6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces están en una cantidad que varía del 30 al 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces están en una cantidad de al menos el 20, 23, 25, 27, 30, 33, 35, 37, 40, 43, 45, 47, 50, 53, 55, 57, 60, 63, 65, 67, 70, 73, 75, 77 u 80 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces están en una cantidad de al menos el 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
9. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición; y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces están en una cantidad que varía del 30 al 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
10. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición; y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces están en una cantidad que varía del 30 al 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
11. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad que varía del 10 al 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición; y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces están en una cantidad de al menos el 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
12. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida están en una cantidad de al menos el 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 por ciento en peso seco en función del peso total de polisacáridos parietales en la composición; y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Candida y los polisacáridos parietales de al menos una especie de Saccharomyces están en una cantidad de al menos el 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 por ciento en peso en función del peso total de la composición.
13. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde al menos una especie de Candida es Candida utilis.
14. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde los polisacáridos parietales de al menos una Saccharomyces son de Saccharomyces cerevisiae sp.
15. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la modulación y/o estimulación de respuestas inmunes en animales.
16. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la mejora de la salud intestinal, la integridad intestinal y la morfología intestinal de los animales.
17. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la estimulación de una respuesta antiinflamatoria de animales.
18. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la mejora de los parámetros de rendimiento del crecimiento y de conversión alimenticia de animales de granja.
19. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la reducción de la morbilidad y, en particular, de los tratamientos con antibióticos y de la mortalidad de los animales de granja.
20. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la reducción de la mortalidad de animales de granja.
21. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la reducción de la diarrea de los animales.
22. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la reducción de la sensibilidad a patógenos intestinales.
23. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la reducción de la sensibilidad de los animales a las infestaciones de parásitos y trastornos relacionados.
24. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en la mejora de la producción de moco en la piel de animales acuáticos.
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