CN107847536A - 用于调节和/或刺激人和/或动物的免疫应答的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种组合物，其包含来自至少一种假丝酵母属(Candida)物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖。该组合物可用于调节和/或刺激动物或人的免疫应答。

Description

用于调节和/或刺激人和/或动物的免疫应答的组合物和方法
发明领域
本申请涉及用于调节和/或刺激人和/或动物中的免疫应答的组合物和方法。
发明背景
酵母及其衍生物越来越多地被用作营养补充剂，通过激活在肠粘膜表面启动的抗真菌免疫应答，主要通过Dectin 1和β-葡聚糖途径，或通过直接与消化道中不需要的细菌结合，来改善动物和人的肠道健康。这两种效应都依赖于酵母细胞壁内免疫抗原表达和肠上皮细胞内抗原受体表达的特异性。然而，应该注意的是，除了描述得很好的β-葡聚糖/Dectin1相互作用之外，其他“酵母配体”-受体相互作用介导免疫应答(并且更具体而言是抗真菌免疫应答)的激活可能具有显著的作用，并且直接取决于酵母细胞壁的组成和结构。目前有声称通过这些途径刺激免疫应答的使用非特异性基于无活性的酵母的产品的市场选择；然而这些产品缺乏特异性和在组成和结果方面一致性。提供能够增强动物或人免疫应答的刺激的改进的基于酵母的产品将是非常值得期望的。
公开内容的概述
本公开提供了一种组合物，其包含来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖。出乎意料的是，当与来自至少一种不同酵母物种的壁多糖组合时，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖即使在低包含率下也能增强对动物或人免疫应答的刺激。在一些实施方案中，来自所述至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的1至99干重％。在实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至50干重％。在替代或补充的实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的1至100重量％。在实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的20至80重量％。在另一实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的30至60重量％。在实施方案中，所述至少一种假丝酵母属物种是产朊假丝酵母(Candida utilis)。在另一实施方案中，来自至少一种不同酵母物种的壁多糖来自酵母属(Saccharomyces sp)，汉逊酵母属(Hanseniaspora sp)，汉逊酵母属(Hansenula sp)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp)，Metschnikowia sp，毕赤酵母属(Pichia sp)，Starmerella sp和Torulaspora sp或其混合物。所述至少一种不同的酵母物种还包含源自这些酵母物种中的任何一种的物种间杂种。
本公开还提供了如前述实施方案中所定义的用于调节和/或刺激动物和/或人中的免疫应答的用途。在另一实施方案中，动物是家养动物。
本公开内容还提供了通过给动物施用包含来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的组合物来调节和/或刺激动物中的免疫应答的方法。在实施方案中，组合是以食品添加剂、动物饲料或药物产品的形式。在另一实施方案中，药物产品可以口服或胃肠外施用。在又一个实施方案中，食品添加剂、动物饲料可以以添加到完整动物或人饮食中，或者作为片剂、丸粒或珠分开添加以直接消耗的形式呈现。在又一个实施方案中，动物是家养动物。
附图简要说明
因此，已经总体上描述了本发明的本质，现在将参考附图，通过示例的方式示出其优选实施方案，并且其中：
图1显示根据实施例1的测定1，包含昆布多糖对用来自不同酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的壁多糖孵育的单核细胞体外产生活性氧类物质(ROS)的影响；
图2显示根据实施例1的测定2，用不同浓度的来自不同酿酒酵母菌株的壁多糖的共混物孵育的单核细胞体外产生ROS；
图3显示根据实施例1的测定3，昆布多糖对用来自产朊假丝酵母菌株的壁多糖或来自酿酒酵母菌株的壁多糖孵育的单核细胞体外产生ROS的比较效果；
图4a和4b显示根据实施例1的测定4，(a)在不用昆布多糖和(b)用100μg的昆布多糖的情况下，单独用不同浓度的来自酿酒酵母菌株的壁多糖或与来自产朊假丝酵母菌株的壁多糖组合孵育的单核细胞体外产生ROS；
图5显示了根据实施例2的Kaplan Meyer统计程序，用副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)感染并用不同组合的壁多糖处理的对虾(penaed shrimp)的存活率函数；
图6a和6b根据实施例3在第5周和第10周根据本公开在饲喂实验饵料后通过电子显微镜显示鲈鱼(sea bass)远端小肠的微绒毛密度；和
图7显示根据实施例3在第10周根据本公开在饲喂实验饵料后的远端小肠中两种免疫基因(IL 1β和IL10)的表达。
图8显示根据实施例6的攻击后14天后的虾的存活率(平均值±SD)；用相同的大写字母表示的方式在处理之间没有差异(Fisher检验，5％概率)。
图9显示根据实施例9的大西洋鲑鱼(Atlantic salmon)和虹鳟(Rainbow trout)刮铲的方向。
图10显示根据实施例9在饲喂补充有60SC壁多糖(PARIETAL POLYSACCHARIDES)和(50SC/CU壁多糖TM(PARIETAL POLYSACCHARIDESTM))的实验饵料8周的虹鳟(O.mykiss)的皮肤样品中与粘液产生水平相关的基因的相对表达水平。数据以箱形图(boxplot)呈现(n＝10/处理)。*-表示显著上调；P<0.0001
图11显示根据实施例9的对照饲喂的鱼和饲喂实验饵料56天的虹鳟的生长表现。
图12显示根据实施例10饲喂对照(A&B)，60SC壁多糖(C&D)，50SC/CU壁多糖(E&F)并且10周的鲈鱼的肠的实例。比例尺是10μm(图A，C和E)和1μm(图B，D和F)。
图13举例说明根据实施例10的饲喂对照和实验饵料(图13A)5周和(图13B)10周的鲈鱼后肠的微绒毛密度测量结果。星号表示饲喂对照饵料的鱼和饲喂实验饵料的鱼之间的显著差异(P<0.001)。
图14举例说明在饲喂实验饵料10周后的鲈鱼后肠样品的基因表达数据。箱形图显示根据实施例10的HSP70，PCNA，IL-1β和IL-10的数据。星号表示与对照饲喂的鱼相比，基因表达显著上调或下调(P<0.05)。
图15显示根据实施例11在第20天(攻击后第6天)由堆形艾美球虫(Eimeriaacervulina)、巨型艾美球虫(E.maxima)和柔嫩艾美球虫(E.tenella)攻击的肉鸡的平均肠损伤评分。
图16显示根据实施例11在试验结束时肉鸡的累积死亡率(以％表示)。
图17显示根据实施例11在第20天(攻击后第6天)由堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫攻击的肉鸡的卵囊粪便排泄物(球虫卵囊/克粪便物质(occidia Oocystsper Gram Fecal Material)(OPG))。
详述
真菌的细胞壁主要由包括几丁质、基于甘露糖的结构和β-葡聚糖的壁多糖组成。葡聚糖组成高达细胞壁的50％并且是治疗上用于修饰免疫应答的生物活性剂。实验上，这些壁多糖能够赋予针对包括肿瘤发展和感染在内的各种攻击的保护作用。近来在理解宿主对感染的免疫应答方面已经取得了许多进展。已经发现新的调节宿主对微生物应答的细胞表面分子。这些受体被称为病原体相关模式识别受体(PRR)，并且主要被称为Toll样受体，C型凝集素受体，清道夫受体和补体受体。
这些免疫受体被在细菌或真菌表面遇到的特异性配体激活。在真菌的情况下，被称为β-葡聚糖并且主要从酿酒酵母中提取的通过β-1,3和β-1,6糖苷键连接的葡萄糖单元已经显示出诱导抗微生物、杀真菌和抗肿瘤活性。这些分子诱导保护的机制涉及免疫受体；其中之一是Dectin 1，其为单核细胞上的主要β-葡聚糖受体。它含有单一的细胞外C型凝集素样壁多糖识别结构域，能够识别酵母细胞或衍生物并有助于动员免疫应答。因此，描述了C型凝集素受体Dectin 1(Marakala et al.,Mamm Genome(2011)22:55–65)以结合来自酿酒酵母的β-葡聚糖并参与诱导各种途径，特别是导致如酵母聚糖(酿酒酵母的细胞壁提取物和获得自酿酒酵母的株的其它酵母衍生物(其它酵母衍生物的实例是但不限于酵母细胞壁、无活性的酵母或自溶酵母))的颗粒的吞噬作用和消除。威胁检测机制和对感染的直接应答是高度保守的，免疫应答部分由这些病原体配体(例如β-葡聚糖)与宿主细胞表面上的PRR结合而触发。在几小时内，非特异性先天免疫系统被激活，伴有炎症。局部炎症(LocalInflammation)在感染的即时应答中起着重要的作用。先天性免疫系统中的许多参与者(包括嗜中性粒细胞，单核细胞，巨噬细胞，补体因子，细胞因子，抗微生物肽和急性期蛋白质)以复杂且高度调节的应答而迅速动员，以提供对感染的即时防御。目前有声称通过这些途径刺激免疫应答的基于无活性的酵母的产品的市场选择；然而这些产品缺乏特异性和结果的一致性。提供能够增强动物或人免疫应答的刺激的改进的基于酵母的产品将是非常值得期望的。
本公开提供了一种组合物，其包含来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖。在本公开的上下文中，“壁多糖”是几丁质，甘露寡糖，β1,3葡聚糖和β1,6葡聚糖。出乎意料的是，当与来自至少一种不同酵母物种的壁多糖组合时，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖即使在低包含率下也能增强对动物或人免疫应答的刺激。
在一些实施方案中，来自所述至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的1至99干重％。在实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的5至90干重％。在另一实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的5至80干重％。在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至75干重％。在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至60干重％。在实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至50干重％。在另一实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至20干重％。在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至15干重％。在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50干重％。在另一实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20干重％。在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、11、12、13、14或15干重％。
在替代或补充的实施方案中，来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的1至99干重％。在实施方案中，来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的50至90干重％。在另一实施方案中，来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的70至90干重％。在又一个实施方案中，来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的80至90干重％。在又一个实施方案中，来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少50、55、60、65、70、75、80、85或90干重％。在另一实施方案中，来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少70、75、80、85或90干重％。在又一个实施方案中，来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90干重％。
在备选或补充的实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的1至100重量％。在实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的20至80重量％。在另一实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的30至60重量％。在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95重量％。在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少20、23、25、27、30、33、35、37、40、43、45、47、50、53、55、57、60、63、65、67、70、73、75、77或80重量％。在实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60重量％。
在一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至50干重％；并且来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的30至60重量％。
在另一实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50干重％；并且来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的30至60重量％。
在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至50干重％；并且来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60重量％。
在又一个实施方案中，来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50干重％；并且来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60重量％。
在实施方案中，所述至少一种假丝酵母属物种是产朊假丝酵母。在本公开中，可以理解，产朊假丝酵母包括有性(Cyberlindnera jardinii)和无性(Candida utilis)两种形式。在另一实施方案中，所述至少一种不同的酵母物种来自酵母属，汉逊酵母属，汉逊酵母属，克鲁维酵母属，Metschnikowia sp，毕赤酵母属，Starmerella sp和Torulaspora sp或其混合物。所述至少一种不同的酵母物种还包含源自这些酵母物种中的任何一种的物种间杂种。在又一个实施方案中，所述至少一种不同的酵母物种是酵母属。在又一个实施方案中，所述至少一种不同的酵母物种是酿酒酵母。酿酒酵母还包含亚种，例如但不限于布拉酵母(Saccharomyces cerevisiae var.boulardii)。在又一个实施方案中，所述至少一种不同的酵母物种是两种或更多种酿酒酵母的共混物。在又一个实施方案中，所述至少一种不同的酵母物种是至少一种酿酒酵母和至少一种布拉酵母的共混物。
在实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于调节和/或刺激动物或人的免疫应答。当在本文中使用时，术语“调节”将被理解为指免疫应答的任何可测量的增加或减少。在另一实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于改善动物或人健康和抵抗感染。在又一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于改善动物或人对病原微生物的抗性。在又一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于促进动物育种性能。在实施方案中，动物是家养动物。示例性家养动物包括但不限于鱼，虾，小牛或仔猪。
在实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于促进和/或改善动物的肠道健康、肠道完整性和肠道形态。在另一实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于刺激动物的抗炎反应。在又一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于促进和/或改善养殖动物的生长表现参数和饲料转换。在又一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于降低发病率，特别是在抗生素治疗期间和养殖动物的死亡率。在实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于降低养殖动物的死亡率。在另一实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于减少动物的腹泻。在又一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于降低对肠道病原体的敏感性。在又一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于降低动物对寄生虫感染和相关病症的敏感性。在一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用于促进和/或改善水生动物皮肤粘液的产生或其质量。
在又一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物能够用作常规动物饲料中的成分。
在又一个实施方案中，如前述实施方案中定义的组合物通常以添加完整动物或人饮食中，或者作为片剂、丸粒或珠分开添加以直接消耗的形式呈现。
本公开提供了通过向动物或人施用包含来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的组合物来调节和/或刺激动物或人中的免疫应答的方法。还提供了通过向动物或人施用包含来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的组合物来改善动物或人健康和/或对感染的抗性的方法。还提供了通过向动物或人施用包含来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的组合物来改善动物或人对病原微生物的抗性的方法。还提供了通过向动物或人施用包含来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的组合物促进动物繁殖性能的方法。
在实施方案中，组合是以食品添加剂，饲料添加剂，饲料材料/成分，动物饲料或药物产品的形式。在另一实施方案中，药物产品可以口服或胃肠外给药。在又一个实施方案中，食品添加剂，动物饲料可以以添加到完整动物或人饮食中，或者作为片剂、丸粒或珠分开添加以直接消耗的形式呈现。在又一个实施方案中，动物是家养动物。示例性家养动物包括但不限于鱼，虾，小牛或仔猪。
以下实施例用于进一步描述和限定本发明，而不是以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1:
Dectin 1不是识别酵母壁多糖的唯一PRR。细胞壁的结构与构造可能起着重要的作用。我们在这里假设不同的酵母物种，即使具有相似的壁多糖组成，也可能表现出它们的壁多糖网络的不同的构造，导致激活不同的组PRR，不一定与激活Dectin 1相关。进行如实施例1中所示使用昆布多糖(一种对Dectin 1具有高亲和力的特异性可溶性配体)体外竞争测定以评估该假设。
在该实施例中，本发明人已经做出选择来评估从不同酵母菌株和物种中提取的不同壁多糖组合对先天免疫应答的影响。这些实验中使用的细胞模型是人单核细胞的原代培养物。评估了单核细胞产生氧类物质的能力：多亏了化学发光，研究了阴离子超氧化物的产生。该分子由NADPH氧化酶产生，NADPH氧化酶是在单核细胞表面遇到的酶复合物。氧类物质参与杀死由单核细胞吞噬的活细菌或真菌。
材料和方法
细胞培养
通过标准Ficoll-Hypaque梯度法从健康血液供体血沉棕黄层获得外周血单核细胞(PBMC)。人单核细胞通过在含有5％CO2的潮湿气氛中于37℃在用于巨噬细胞培养优化的SFM培养基中粘附塑料2小时从单核细胞分离。将它们接种到多孔培养板中，通过用不含钙或镁的HBSS洗涤除去未贴壁细胞。在刺激之前在SFM中培养剩下的贴壁细胞(>85％的单核细胞)。
测定氧类物质的产生
将单核细胞置于96孔微量培养板中。在5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮(鲁米诺，Sigma)存在下，使用恒温(37℃)控制的光度计(Wallac1420Victor2，Finland)通过化学发光测量活性氧类物质(ROS)产生。在基础条件下，在存在单独的100μg/ml的不同壁多糖或存在梯度水平的昆布多糖(0、1、10和100μg/ml，取决于测定)的情况下，用鲁米诺(66μM)孵育细胞后60分钟，连续监测化学发光的产生。100μg/ml的酵母聚糖用作阳性对照。
本研究中使用的酵母壁多糖：
从不同的酵母菌株提取的壁多糖：
酿酒酵母菌株：L60，L62，L69，L72
产朊假丝酵母菌株：L75(NRRL-900)
在不同测定中测试的壁多糖的水平：
产朊假丝酵母菌株：壁多糖水平被标准化为基于组合物总重量的30干重％。
酿酒酵母株：多糖水平被标准化为基于组合物总重量的30、35、45和60干重％。
产朊假丝酵母和酿酒酵母的组合：壁多糖水平被标准化为基于组合物总重量的30、35、40、45和50干重％。来自产朊假丝酵母的壁多糖在这些组合中的含量分别为基于组合物总重量的15、15、10、15和5干重％或基于组合物中壁多糖总重量的50、43、25、33和10干重％(图4a，4b)
结果：
测定1：用来自不同酿酒酵母菌株的壁多糖与不同浓度的昆布多糖的孵育的单核细胞体外产生ROS。将来自酿酒酵母的四种不同菌株的每种壁多糖级分标准化为基于级分总重量的60干重％，并测试它们对Dectin1的亲和力。如图1所示，来自所有菌株的壁多糖都能够诱导ROS的产生，而昆布多糖以线性剂量响应方式抑制该诱导。
测定2：来自酿酒酵母的壁多糖对单核细胞体外产生ROS的剂量响应。制备来自两种不同酿酒酵母菌株(L62和L69)的壁多糖的共混物，并标准化为基于共混物总重量的30、35、45和60干重％，并测试它们诱导ROS的产生。如图2所示，在测试浓度范围内获得线性剂量响应。
测定3：昆布多糖对用来自产朊假丝酵母菌株的壁多糖或来自酿酒酵母的壁多糖孵育的单核细胞体外产生ROS的比较效果。将来自产朊假丝酵母的专有菌株的壁多糖级分标准化为基于级分总重量的30干重％，并测试其对Dectin 1的亲和力。类似地，来自酿酒酵母菌株(L62)的壁多糖级分分别标准化为基于级分总重量的30和60干重％，并测试它们对Dectin 1的亲和力。如图3所示，在不存在昆布多糖的情况下，产朊假丝酵母的壁多糖级分和酿酒酵母的壁多糖级分能够诱导ROS的产生。在图3中，增加昆布多糖浓度提高了对酿酒酵母的壁多糖级分产生ROS的抑制。然而，增加昆布多糖浓度没有显示对产朊假丝酵母的壁多糖组分产生ROS的任何抑制，甚至在100μg/ml的浓度下。
测定4：(a)在不用昆布多糖和(b)用100μg的昆布多糖的情况下，单独用不同浓度的来自酿酒酵母菌株的壁多糖或与来自产朊假丝酵母菌株的壁多糖组合孵育的单核细胞体外产生ROS；
如图4a和4b所示，来自产朊假丝酵母的壁多糖在不同组合物中的存在导致单核细胞ROS产生的增强，甚至在低包含率下(即基于组合物总重量的5干重％)。如图4b所示，包含来自产朊假丝酵母的壁多糖和来自至少一种酿酒酵母的壁多糖的组合物不受相对于昆布多糖对单独的来自酿酒酵母的多糖具有抑制作用(如图1和3所示)的影响，甚至在较低的包含率下(即基于组合物总重量的5干重％或基于组合物中的壁多糖的总重量的10干重％)。
实施例2：
测试了包含来自产朊假丝酵母(CU)的壁多糖和来自酿酒酵母(SC)的壁多糖的组合物作为预防性饲喂策略，以减轻对虾对弧菌病的敏感性。壁多糖的量为基于组合物总重量(50SC/CU)的50重量％。
为了评估50SC/CU壁多糖对单独SC壁多糖的益处，我们将体内疾病攻击应用于对虾幼虾。感染方法是浸泡并且我们使用了能够诱发急性肝胰腺坏死综合征的烈性副溶血性弧菌。
测试的壁多糖是：
-含有6干重％(基于组合物的总重量，或基于组合物中壁多糖总重量的12干重％)的来自产朊假丝酵母NRRL-900的壁多糖的50SC/CU壁多糖：测试的3个剂量：饲料的0.04％；0.08％和0.12％
-来自酿酒酵母的一个菌株(CNCM I 1079)的60SC壁多糖：测试的剂量：饲料的0.12％
用2.07±0.05g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾进行试验，在补充或不补充测试的候选物的情况下饲喂饵料21天，然后用100ml的能够在1.1×109CFU/ml诱导AHPNS(在TSB+2％NaCl(TSB+)中28℃生长18小时)的烈性副溶血性弧菌菌株的培养物浸泡攻击。监测死亡率10天，并将每种饵料的累积存活率与每个试验内的对照进行统计比较。还为每种饵料构建了Kaplan and Meier生存曲线(Kaplan and Meier，1958)，并使用对数秩(log-rank)检验比较曲线，以确定曲线之间的差异以及曲线之间存活趋势是否不同。显著性水平设定在P＝0.05。
50SC/CU处理显示线性剂量响应以降低病原体菌株诱导的死亡率(对数秩(LogRank)(Mantel-Cox)，p<0.01)。与阳性对照(受感染)相比，0.04％的包含率仍显著提高存活率。60SC/CU只有显示0.12％的边际改善。
操作方案：
对少数凡纳滨对虾幼虾饲喂了商业配制的虾饵料(其与测试产品混合21天)，然后浴暴露(bath exposure)于副溶血性弧菌(导致急性肝胰腺坏死疾病-AHPND的药剂)，以确定饲料添加剂是否影响生存和感染率。
水族箱(aquaria)和实验设计：
已经使用组织病理学和PCR技术检查本实施例中使用的SPF(无特定病原体)动物的重要传染病，包括WSSV(白斑综合症病毒)，TSV(桃拉综合征病毒)，IMNV(传染性肌肉坏死病毒)，AHPND(急性肝胰腺坏死病)。将12日龄的后期幼体从孵化处转移至湿实验室，并在严格的生物安全性下再培养45天，以达到1-2克的大小。在研究开始前一天，将每只1-2克的SPF凡纳滨对虾转移到27个90L罐中(35只虾/罐)。在试验终止时，将每只罐中的所有虾在放养前进行组内(in-group)称重以计算生长率。这些罐中的所有动物被饲喂它们各自的测试饵料21天(表1)。
将每个处理的四个重复的罐添加含有测试产品的配制饲料。四个罐被指定为阳性对照，另外四个罐作为阴性对照。阴性对照罐也饲喂商业化的粒状虾饵料，但不用引起EMS/AHPND的副溶血性弧菌攻击。所有罐每天接受它们大约5％体重的各自饵料。
包含饲料添加剂的饲料施用21天后，用副溶血性弧菌攻击十六个处理罐。同时，阳性对照罐饲喂没有任何添加的相同的商业虾饲料，并且在试验的第21天用副溶血性弧菌进行攻击。为了记录生存和监测生长率，攻击虾再保持10天。
攻击方法：
在本研究中，虾经受浸泡攻击。将接种持续孵育18小时的烈性副溶血性弧菌菌株的胰酶大豆肉汤+2％(TSB+)氯化钠直接加入罐中。将细菌悬浮液加入罐中以获得通过光密度吸收(OD600nm)测量的细菌密度。在攻击时间段期间，继续保持虾的各自的饵料再处理10天。
结果
统计处理后试验结束时的最终存活率列于表1中。图5报道了根据Kaplan Meyer程序对不同组的虾在实验过程中的存活率分布。
表1：最终存活率：观察的处理总结
表2和表3显示了不同组的虾的存活率分布之间的统计差异。
如表2所示，应用的所有检验显示存活率分布之间的高度显著的处理效果。
表2：统计比较：检验不同处理水平的存活率分布的相等性。
如表3所示，当使用Kaplan-Meier方法和对数秩(Mantel-Cox)检验将每个感染组的死亡动力学与阴性对照(非感染组)比较时，细菌攻击显著影响所有组中的虾的存活。此外，这些体内结果证实了包含来自酿酒酵母和产朊假丝酵母的壁多糖在调节和/或刺激天然防御并改善动物在攻击条件下的表现的有益作用(表3)。
表3：使用对数秩(Mantel-Cox)检验的分布的统计比较：检验不同处理之间的存活分布的相等性。
实施例3
本实施例在鲈鱼中的实验结果显示，“50SC/CU壁多糖”对“60SC壁多糖”对鱼的表现和对应激的应答有正面影响。
平均重量为15.4g的鲈鱼(Dicentrarchus labrax)进行了10周用0.08％的“50SC/CU壁多糖”对0.2％的“60SC壁多糖”的饲喂试验。
如表4所示，配制含有高水平的豆粕(40％)的饲料。
表4：饵料配方
每次处理3罐25条鱼。在第8周施用盐度应激。记录的参数：生长表现/肠道形态/肠道微生物群落。
表5显示了第10周的最终表现。
表5：第10周的表现
所有数据以平均值±标准差(SD)表示。数据在必要时进行转换，并使用用于Windows的SPSS统计软件版本18(SPSS Inc.，Chicago，Il，USA)进行统计分析并且P<0.05水平被接受为显著。所有数据均采用单因素方差分析。使用曼-惠特尼的非参数检验确定对照组和实验组之间的显著差异。
图6a和6b显示分别在第5周和第10周饲喂实验饵料后鲈鱼远端小肠的微绒毛密度的扫描电子显微镜结果。数据表示为平均值±S.D(n＝3)。与相应对照的显著差异表示为(*)P<0.01，(**)P<0.001。数据在必要的情况下进行转换，并使用用于Windows的SPSS统计软件版本18(SPSS Inc.,Chicago,Il,USA)进行统计分析并且P<0.05的水平被接受。使用单向方差分析来分析数据，并且使用Tukey事后检验确定对照组和实验组之间的显著差异。
表6：第5周和第10周的光学显微镜检查
所有数据在表6中以平均值±标准差(SD)呈现。数据在必要时进行转换，并使用用于Windows的SPSS统计软件版本18(SPSS Inc.，Chicago，Il，USA)进行统计分析并且P<0.05的水平被接受。使用单向方差分析来分析所有数据。使用事后Tukey HSD检验确定对照组和实验组之间的显著差异。
图7显示在第10周根据本公开在饲喂实验饵料之后在鲈鱼远端肠中两种免疫基因(IL 1β和IL10)的表达。
实施例4：
本实施例证实在第二阶段饲料中给断奶仔猪补充根据本公开的壁多糖组合的效果。
试验设置
试验持续时间：42天
动物材料和饲养条件：
断奶仔猪饲养在12头仔猪的圈中。在一座建筑中，6个圈被分配至两种处理之一(对照和处理)。随着时间的推移重复进行两个系列的试验，当一起分析2个系列时每个处理产生12个重复的圈。
测试产品：具有6％CU的50SC/CU壁多糖
处理：试验由2个处理组成：
T-1-对照-正常饲粮，不含酵母衍生物
T-2-以0.08％补充50SC/CU壁多糖的对照饲粮
饵料
如表7所示给动物饲喂两阶段的饲粮。
表7：两阶段膳食饲粮
测量的畜牧学参数：
·在每个饲喂阶段开始和结束时的体重/圈，
·第二饲喂阶段的饲料消耗量/圈
·死亡率和剔除率
统计分析
使用SPSS，使用GLM(广义线性模型)单变量模型分析结果。
结果：
A.生长表现
如表8所示，对最终体重和平均日增重检测到显著效果。该效果主要是由于第二阶段显著更好的表现，在处理组中具有显著较高的日增长率和饲料转换率。
表8：
其他观察结果：处理圈之一只有一只仔猪死亡，而对照圈有三(3)只死亡，所有死亡均因为脑膜炎。在处理组中观察到较少的耳朵咬伤。对照组粪便更多液体。
实施例5：
该实施例评估了当通过固体饲料补充时，50SC/CU壁多糖组合物对断奶前后小牛的畜牧学和健康表现的影响
研究的持续时间：6周。
材料和方法
涉及的动物：
总动物：开始时为129只，最后125只。
性别：雄性
品种：弗里斯兰(Friesian)(来源：来自法国的不同农场)
实验性处理
对两种饲粮处理进行比较，使用补充有不同产品的相同膳食粉：
-作为T0：没有任何产品的对照饲粮。
-T1：补充了50SC/CU壁多糖的相同饲粮
○头2周：5g/只动物/天＝2.7g/kg起始(starter)饲料
○然后：3g/只动物/天＝1.6g/kg起始饲料
实验设计
到达农场后，动物被随机分配到圈中。六天后，开始试验并称重动物，以平均体重和平均体重标准偏差使得圈之间均匀化。所有的圈都是同时进行的。平均起始体重为53.9±4.3kg，而平均起始日龄为27.3±4.4天。
位点描述和饲养
所有动物被安置在同一建筑物中，10-11只动物在安置有秸秆的圈中。每个处理涉及四个圈：各自11只动物的三个圈和10只动物的一个圈＝每个处理43只动物。每个圈都有一个进料器，圈互相之间的进料器之间没有任何接触。两个圈共用稻草，但处理之间没有交叉污染。上午8:00和下午6:00，每天两次分发奶。小牛精饲料每天在饲喂槽中手动分发一次，分发前每天称量分发量。所有的动物都可以随意接近秸秆。
动物根据以下时间表饲喂：
○Ds到达-2周：2×1.5L/天的初乳奶稀释(25％CP和19.5％脂肪)，然后代乳(22％CP和18％脂肪)+固体饲料(粉膳食)随意+秸秆随意+水随意
○2周-断奶(34天)：1×2L/天的代乳(19％CP和15％脂肪)+固体饲料(粉膳食)随意+秸秆随意+水随意
○断奶-离开：固体饲料(粉膳食)随意+秸秆随意+水随意
当小牛表现出良好的身体状况并且开始吃超过1kg/天/只动物时断奶。
记录的参数和应用的方法
个体活重：从研究开始直到研究结束每两周，上午10点，单独称量小牛(总共4次称重)。饲料消耗：饲料消耗量(精饲料)每周以圈为单位记录＝总结为每天提供的称重饲料-该周中的最后一天称重拒绝饲料。
结果
体重(BW)和平均日增重(ADG)
如表9所示，饲喂T1的动物的平均体重(BW)倾向于比饲喂T0的动物更好。处理与时间段之间没有发现相互作用。初始和最终BW(分别为BW0和BW42)对于T1而言数值上更高。
表9：试验期间的体重
如表10所示，虽然来自T1的动物在数值上比来自T0的动物具有更好的增重，但处理之间的平均日增重没有差异。
表10：试验期间的平均日增重
圈内的标准偏差很好地反映了农民在更均匀摄入后寻求更好的均匀性时的重量和增重的异质性。T1的标准偏差显著低于T0，这意味着比对照动物具有比处理的动物更大的体重异质性(表11)。考虑到生长的异质性，没有观察到统计显著性，但是在数值上，对照动物比处理组动物具有更多的异质性生长。
表11：试验期间BW和ADG的标准偏差(圈内)
精饲料采食量和饲料效率(FE)和饲料转换率(FCR)
统计分析总精饲料采食量(圈的总时间段上的采食量总数/动物数)逐周没有显示任何差异。饲料转换率分析没有显示出处理之间的任何显著差异。
腹泻和发病
如表12所示，与对照T0相比，来自T1的动物显示腹泻的天数更少，抗生素治疗的数量更少。
表12：腹泻天数和抗生素治疗次数
曼惠特尼检验应用于至少一次治疗腹泻的动物的百分比显示T1与T0相比的显著降低，和用抗生素治疗的动物的百分比减少的趋势。
用抗生素治疗至少一次的动物和至少治疗一次腹泻的动物的百分比。
实施例6：
凡纳滨对虾幼虾用商业配制的虾饵料(与LALLEMAND提供的饲料添加剂产品混合)饲喂14天，然后用微孢子虫寄生虫肠肝胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)攻击14天，以确定是否有任何剂量的饲料添加剂对存活率、降低感染率和寄生虫负荷有正面影响。
材料和方法
本研究中使用SPF(无特定病原体)的幼虾。检查了这些虾的WSSV(白斑综合症病毒)，TSV(桃拉综合征病毒)，IMNV(传染性肌肉坏死病毒)，EMS/AHPND(早期死亡综合征/急性肝胰坏死综合征)和EHP(肠肝胞虫)。在研究开始前一天，将每只1.50±0.09克的凡纳滨对虾转移到含有90L水、盐度为20ppt的120L罐(30只虾/罐)中。每个罐配备有一个含活化珊瑚的浸没式生物过滤器。
实验设计
实验被设定为完全随机的设计，其中，用不同的罐随机设计每个处理。试验的总时间长度：29天，根据表13，包括1天的适应环境，14天的饲料添加剂施用，然后在相同的饲喂处理下14天的EHP攻击。在试验期间所有罐的虾每天饱食四次接受各自的饵料(表14)。五个罐装有含有饲料添加剂的配制饲料。五个罐被指定为同居攻击的阳性对照，五个罐作为阴性对照。
表13：实验的时间安排
表14
EHP研究中使用的所有120L水族箱的定义
虾饵料制造
将饲料添加剂与饲料粉混合并添加增稠剂(CMC-羧甲基纤维素)和水分，然后用加压绞肉机挤出。然后将饲料在50摄氏度下干燥6小时。将饲料粉碎至预期尺寸(长1.5-2mm)用于研究。
攻击方法
使用标准的同居攻击方法，用导致EHP(模拟天然感染途径的微孢子虫寄生虫病)的肠肝胞虫攻击小型幼虾。
SPF和受感染的虾被允许水自由交换的网分隔器隔开。同居攻击法设计如下：在每个120升的塑料罐中安装一个50升(cubic liter)的矩形网。在攻击期间，20只感染EHP的虾放养在吊网内，30只SPF虾放养在吊网外面。EHP感染的虾和SPF虾二者分别再饲喂各自处理的试验饵料14天。阴性对照(F)也用相同的攻击方法处理。然而，20只SPF虾而不是20只EHP受感染的虾放养在吊网内。在攻击期间，阴性对照的网内的虾和网外的虾都饲喂商业虾饵料。
受EHP感染的虾的寄生虫负荷密度在攻击开始时为5.05E+06CFU/g的肠肝胞虫。
取样和观察
EHP的qPCR测试是在5只虾/罐/时间点上在3个时间点完成的：在第14天(就在攻击前)确认SPF虾的无EHP状态，在第15天(攻击后24小时)和在第18天(攻击后96小时)定量寄生虫负荷。在攻击研究结束时，所有活的动物被计为存活者。
统计分析
使用Fisher LSD检验用方差分析比较来自七个处理的平均值，当P<0.05时认为是显著差异。
结果
虾的表现参数
表15给出了28天的实验期内平均生产参数。数值表示五个重复的平均值。
表15
攻击试验存活率
攻击后14天后处理的存活率
攻击后14天后处理的虾的存活率在图8中给出(平均值±SD)；用相同的大写字母表示的方式在处理之间没有差异(Fisher检验，5％概率)。
表16中给出了对EHP寄生虫负荷的qPCR测试结果。在攻击实验开始时(就在攻击之前)，处理中存在无EHP的状态。攻击后48小时，处理A和阳性对照(G)中的实验虾受到疾病的侵袭，而在阴性对照(F)中是无EHP的状态。因此，这表明试验设置是可以接受的，并且阴性对照没有发生交叉污染。处理A和G中的EHP寄生虫负荷在48小时后是相似的。然而，在攻击后120小时后，处理A中5个罐中有4个中的EHP寄生虫负荷低于检测限，而来自阴性对照的所有罐均为EHP阳性(5/5)。
实施例7
评估50SC/CU壁多糖对肉鸡抵抗热应激的影响
热应激是世界范围内挑战家禽生产的最重要的环境应激源之一。热应激负面影响家禽表现，降低生长和产品安全。在热应激期间，肉鸡经受大量的热调节适应以防止因热耗竭而死亡，这对表现有不利影响。
实验设计
地点：私人实验农场(法国)
实验设计：2组：
对照(C)：没有补充；50SC/CU壁多糖(Y)：在起始期和生长期50SC/CU壁多糖分别为800g/吨和400g/吨。在催肥期间没有补充50SC/CU壁多糖(800-400-0)。
饲粮：
3个阶段(起始、生长和育肥)。三个饲喂阶段是：第0-10、11-25、26-35天。
动物：
试验在Ross PM3品种的肉鸡上进行试验，到达后随机分配到13个圈，密度达到20只/圈(C：6个圈，Y：7个圈)。
热应激攻击：
在第20天进行热应激攻击：在第19天和第20天之间的夜间，室内温度升高到31℃。
测量：每圈的死亡数和日期。
统计分析：
通过Kaplan-Meier检验分析试验期间2个组之间死亡率的差异(并且尤其是禽对热应激的抵抗)。各组之间的差异在p值为p<0.1被认为是显著的。否则统计分析显示不显著(NS)。
结果
禽对热应急攻击的死亡率和抵抗：结果在表17中给出
表17
在热应激攻击期间有40只禽死亡：50SC/CU壁多糖组中有9只禽，而对照组中有31只禽。50SC/CU壁多糖组中的死亡总数为17只，而对照组为38只。Kaplan-Meier分析(比较两组平均存活时间的统计检验)非常显著(p<0.001)，并给出以下估计：C组和Y组的平均存活时间分别为29.6和32.9天。因此，50SC/CU壁多糖组比对照组对急性热应激攻击的抵抗更强。
总之，饲喂50SC/CU壁多糖导致对热应激更强的抵抗。
实施例8
介绍和目的
本试验的目的是测试撤除药物后，50SC/CU PARTILE多糖对断奶仔猪的表现、发病率和腹泻发生率的影响。
实验设计
动物和畜舍
总共有4个连续批次的480只断奶仔猪(母系：大白(Large White)×长白(Landrace)，父系：杜洛克(Danbred Duroc))分布在8个保育室中，每个保育室4个圈，每组20只仔猪/圈。它们的分布使得初始体重在一个圈内和处理之间尽可能地均匀，并且在每个圈中放置10只小母猪和10只小公猪。
在7日龄和21日龄时对仔猪接种针对支原体(Mycoplasma)的疫苗，并在21日龄时接种针对圆环病毒(Circovirus)的疫苗。
时间段
试验平均从19日龄断奶开始，持续55天。
处理
仔猪饲喂两阶段饲喂计划，并在整个实验期间随意接近饲料和水
有两种处理(表18)：对照(C)和试验1(T1)。
目前农场使用的抗生素策略是：准备期(Prestarter)：120ppm粘杆菌素(colistine)+300ppm阿莫西林+2400ppm ZnO；起始期：1600ppm ZnO。
对于试验，为了攻击仔猪，药物变成：准备期：2400ppm ZnO；起始期：空白饲料。
表18处理
实验设置和观察
-体重：个体。在实验开始和结束时，以及在改变饲粮时。
-采食量：每圈。在改变饲粮时，为改变当天的饲料供应和剩余饲料之间的差异。
-发病率：个体和组的健康护理干预，包括定期畜群预防。
-死亡率：日期、重量和明显的原因。
-腹泻：每圈。每天检查腹泻发病率。
统计
根据以下模型，用SPSS 22.0(IBM)中的通用线性模型分析方差：
Yjk＝μ+a x IBW+批次j+处理k+批次j*处理k+ejk
其中：
Y＝最终体重(FBW)，平均日增重(ADG)，平均日采食量(ADFI)，饲料转换率(FCR)，死亡率；IBW＝用作协变量的初始体重；批次＝批次(j＝1、2、3、4)引起的固定效应；处理＝处理(k＝C、T1)引起的固定效应；批次*处理＝实验处理和批次之间的相互作用；e＝误差。实验单位是圈。从P<0.05宣布显著性。
处理和批次之间没有发现相互作用。因此，它被从模型中去除了。
结果
表现
在FBW(P<0.01)、起始期和总体生长(P<0.05)和起始期FCR中(P<0.05)中存在显著差异，其中T1中的仔猪BW更高、生长更快和较低的FCR。此外，T1仔猪在起始期中生长速度较快(P<0.1)，在起始期中进食更多(P<0.1)。表现结果示于表19中。
表19在处理C和T1中仔猪的期和总体表现结果
对照 T1 SEM P值
IBW(kg) 6.40 6.40 0.089 -
BW准备期(kg) 11.33 11.63 0.123 0.101
FBW(kg) 30.43 31.58 0.276 0.008
ADG准备期(g/d) 240 255 6 0.098
ADG起始期(g/d) 581 607 7 0.015
总体ADG(g/d) 449 470 4 0.012
ADFI准备期(g/d) 350 382 13 0.090
ADFI起始期(g/d) 960 963 17 0.915
总体ADFI(g/d) 724 737 14 0.484
FCR准备期(g/g) 1.457 1.499 0.042 0.496
FCR起始期(g/g) 1.657 1.585 0.023 0.041
总体FCR(g/g) 1.614 1.566 0.023 0.160
起始期的差异比准备期阶段的差异更大的事实可能是由于农场的健康状况良好的事实，并且在起始期进食空白饲粮的仔猪比准备期受到更多攻击。
在实验期间死亡率很低，处理之间没有差异。整个时间段中平均为1.8％。试验期间共有13头仔猪死亡。
结论：
这个试验的主要结论是：
-在断奶后饲粮中添加50SC/CU壁多糖相对于有限药物的对照饲粮提高了最终体重、整体平均日增重和数量上的总体饲料转换率。
-起始期的影响似乎比准备期要大，这可能取决于农场的健康状况。
-在起始期过程中，50SC/CU壁多糖可能是ZnO和/或抗生素的很好的替代品。
建议测试50SC/CU壁多糖代替抗生素的可能性，将50SC/CU壁多糖处理与阳性对照进行比较，以及紧接着抗生素添加50SC/CU壁多糖的可能的补充效应。
实施例9
设施、样品描述和实验饵料
用虹鳟(Oncorhynchus mykiss)鱼苗进行实验。适应环境四周后，将480条鱼(23.07±0.2g)随机分配到含有充气再循环淡水的16×150-l玻璃纤维罐(每罐30条鱼)中。在三个饲喂时间(0900、1300和1700小时)内，将鱼以3％体重的固定方式饲喂饵料56天。鱼在24小时饥饿期后每两周分批称重一次，在14.5±0.5℃下用12:12小时光照：黑暗光周期饲养。水的pH保持在6.8-7.5，溶解氧在7.5-8mg/l，铵在0.04-0.08mg/l，亚硝酸盐在0.02-0.06mg/l，硝酸盐在54-58mg/l。对于每个处理，虹鳟饲喂四种饵料方式之一，一式四份的罐：1]对照，2]60SC壁多糖，3]50SC/CU壁多糖-连续进料和4]50SC/CU壁多糖-脉冲56天(参考表21的饵料组成)。
表21.用于普利茅斯实验的实验饵料的配方。每种成分组分以每种饵料的g/kg表示。
方法
粘液收集
按照试验站操作规程，随机选择鱼并人道杀死。MS222是麻醉剂的首选。当网鱼结束时必须小心，尽可能快地完成，使得对鱼的粘膜表面破坏最小化。死后，立即用从鳃盖边缘到肛门的一把小刮刀刮鱼的一侧来收集粘液(图9：大西洋鲑鱼和虹鳟鱼刮铲的方向)。将鱼尾端积累的粘液转移到1ml预先称重的注射器中。将粘液储存在1ml eppendorf管中并立即在-80℃冷冻，等待分析。
实时qPCR样品收集
从虹鳟中收集皮肤样品(<100mg)，转移到1mL RNAlater溶液(AppliedBiosystems，Warrington，UK)中，并在4℃保存24小时，然后在-80℃保存直至RNA提取。在RNA提取后，应用qPCR来观察粘液生成的特定生物标志物的表达。
生长表现计算
通过增重(WG)，比生长率(SGR)，饲料转换率(FCR)，蛋白质效率比(PER)，肥满度(K)评估生长。使用以下公式进行计算：NWG(g)＝FW-IW；SGR(％BW/天)＝100((lnFW-lnIW)/T)；FCR(g/g)＝FI/WG；PER＝WG/PI；K＝FW/(FL3)。其中FW＝最终体重(g)，IW＝初始体重(g)，T＝饲喂持续时间(天)，WG＝湿增重(g)，FI＝采食量(g)，PI＝摄入蛋白质(g)并且FL＝最终长度(cm)。
结果
粘液样本分析
表22给出了粘液产生的数据。与对照相比，饲喂60SC和50SC/CU的鱼的粘液产生增加，其数值优势有利于50SC/CU。
表22.在实验饵料饲喂28和56天后，鱼的皮肤粘液产生(mg/cm)。数据以平均值±SD表示。
实时qPCR分析
虹鳟鱼皮肤样品的基因表达分析显示，与对照饲喂的鱼(1.16±0.48NEL)相比，连续(2.31±1.26NEL；P＝0.0003)和脉冲(2.09±0.58NEL；P<0.0001)饲喂50SC/CU壁多糖的鱼的粘液生成特异性生物标志物的表达显著上调。数据显示在图10中，其显示饲喂补充有60SC壁多糖和(50SC/CU壁多糖TM)的实验饵料8周的虹鳟(O.mykiss)皮肤样品中该基因的相对表达。数据以箱形图呈现(n＝10/处理)。*-表示显著上调；P<0.0001
生长表现
与对照饲喂的鱼相比，饲喂实验饵料56天，发现虹鳟的生长表现没有显著差异。数据显示在图11中，显示了饲喂试验饵料56天虹鳟的生长表现。
实施例10：
鱼、实验设计和饵料配方
在适应环境4周后，将225条鲈鱼(15.45±0.1g)随机分配到9×110-l玻璃纤维罐(每罐25条鱼)中。在9:00、13:00和16:30小时的3个饲喂时间内，以每天2.0％体重的固定比例饲喂鲈鱼10周。在24小时饥饿期后，将鱼每周分批称重，并在24.14±0.85℃、盐度26.58±4.32和12:12小时光照：黑暗光周期饲养。水的pH保持在6.8-7.5，溶解氧在7.5-8mg/l，铵在0.04-0.08mg/l，亚硝酸盐在0.02-0.06mg/l，硝酸盐在54-58mg/l。
配制饵料以含有高包含水平的大豆粉(包含40％)，饵料配方示于表23中。
表23.实验饵料的配方。表示了每种成分组分(％包含水平)。
方法
光学显微镜分析(LM)
取出鱼的远端肠，用10％海洋福尔马林固定并在4℃下保持48小时，随后转移到70％乙醇中储存。在分析之前，根据Dimitriglou等(Journal of animal science，2009,87,3226-3234)将肠道样品脱水(Leica TP 1020)并包埋在石蜡中。
样品以5μm厚度切片(Leica RM2235切片机)，在烘箱中干燥过夜，然后用苏木精和伊红(HE)自动染色(Leica Autostainer XL)。使用DPX将载玻片安装上盖玻片并晾干。然后拍摄染色样品的照片(Leica DMIRB显微镜和Olympus E410数码单反相机)。图像分析使用Image J 1.47v(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA)软件进行。除杯状细胞(GC)外，用LM图像计算皱襞长度(FL)和固有层宽度(LP-W)，测量超过200μm。对于周长比(PR)，在转换为8位后，调整图像阈值。内部周长除以外部周长来计算周长比。数据表示为平均值±标准偏差(SD)，并且使用用于windows的SPSS统计版本15(SPSS Inc.，Il，USA)进行统计分析并且在P<0.05时被接受。使用单因素方差分析来分析组织学数据。使用事后TukeyHSD检验来确定对照组和处理组之间的显著差异。
扫描电子显微镜(SEM)
在0.1M二甲胂酸钠缓冲液与2.5％戊二醛(1:1的体积比，pH7.2)中固定样品。然后将样品在每个步骤中在梯度乙醇系列(30％醇，50％，70％，90％和100％x2)中脱水15分钟，并且用乙醇作为中间流体并且CO2作为过渡流体进行临界点干燥(K850Emitech)。然后将样品用金溅射涂覆(K550Emitech)并用JSM 6610LV扫描电子显微镜观察。对于每个样品，以x500-x 20,000的放大倍率捕获多个图像以评估肠的整体完整性。使用Image J(V1.45)使用x 20,000放大倍数的图像进行微绒毛密度测量(图13)。使用单因素方差分析来分析SEM数据。使用事后Tukey HSD检验来确定对照组和处理组之间的显著差异。
实时qPCR样品收集
从欧洲鲈鱼收集后肠样品(<100mg)，转移至1mL RNAlater溶液(AppliedBiosystems，Warrington，UK)中，并在4℃保存24小时，然后在-80℃保存直至RNA提取。
RNA提取和cDNA合成
使用TRI试剂(Ambion，Life technologies，UK)根据制造商的说明并进行一些修改提取总RNA。简言之，从RNAlater溶液中取出50-100mg肠样品，并通过在无菌纸巾之间压样品来除去过量的溶液。将样品(<100mg)转移到含有1mL TRI试剂的试管中并均质10分钟。接着加入200μl氯仿，混合后，样品以12,000×g离心15分钟。将上层水相转移到含有等体积异丙醇的管中。将混合物涡旋振荡并以14,000×g离心15分钟。弃去上清液，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀的RNA沉淀物。将总RNA溶解在焦碳酸二乙酯(DEPC)中，并根据制造商的说明书(Qiagen，UK)使用RNeasy Plus Mini Kit纯化除去任何污染的基因组DNA。通过测量260/280nm和260/230nm吸光度比(NanoDrop Technologies，Wilmigton，USA)测定每个样品中RNA的浓度和质量。通过在Bio-analyser上运行样品证实RNA的完整性，RNA完整数(RIN)范围为8.0-9.5(Agilent technologies，UK)，样品储存在-80℃。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，UK)将总量为1μg的RNA用于cDNA合成。将反应物于25℃放置5分钟，然后42℃放置30分钟，并在85℃灭活5分钟。iScript cDNA合成试剂盒包含oligo dT和随机六聚体的组合，可用于多种靶标。
实时PCR测定
使用StepOne PlusTM实时PCR热循环仪(Applied Biosystems)，使用SYBR green方法进行PCR反应。对每个分析的样品进行重复PCR反应。通过将2μl稀释的(1/10)cDNA与5.5μl含作为荧光插入剂的SYBR Green的2×浓缩的iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)、0.3μM正向引物和0.3μM反向引物混合，将每个PCR反应置于384孔板上。所用的引物及其序列示于表1中。所有反应的热曲线是在95℃下10分钟，然后是40个循环的95℃下15秒、59℃下60秒。在每个循环结束时监测荧光。进行额外的解离曲线分析，并且在所有情况下显示一个单峰。β-肌动蛋白和GAPDH被用作每个样品中的参考基因，以通过消除mRNA和cDNA数量和质量的变化来标准化结果(Bustin et al.，2009)。实际上，根据geNormTM软件使用的算法(Vandesompele et al.,Genome biology,2002,3(7),research 0034)，证实了GAPDH和β-肌动蛋白作为参照基因的稳定性和适宜性。
为每个参考基因产生表达稳定性值“M”。在阴性对照中没有观察到扩增产物，在对照模板中未观察到引物二聚体形成。基因表达的修饰是针对与处理同时取样的对照来表示的。
循环阈值(Ct)被定义为荧光明显高于背景荧光上升的点，对于每次运行手动确定。使用方程E(PCR效率)＝10(-1/斜率)，使用连续稀释的cDNA(n＝3)和得到的Ct对对数cDNA输入的曲线确定每组引物的PCR效率。根据未知样品与对照样品的Ct偏差(ΔCt)计算靶基因的标准化表达水平(NEL)，并且根据geNormTM手册(http://medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm/)和Vandesompele等人(Genome biology,2002,3(7),research 0034)概述的计算与参照基因GAPDH和β-肌动蛋白相比进行表示。
RT-qPCR数据的所有统计均使用在R中排列检验进行。
生长表现计算
通过增重(WG)，比生长率(SGR)，饲料转换率(FCR)，蛋白质效率比(PER)，肥满度(K)评估生长。使用以下公式进行计算：NWG(g)＝FW-IW；SGR(％BW/天)＝100((lnFW-lnIW)/T)；FCR(g/g)＝FI/WG；PER＝WG/PI；K＝FW/(FL3)。其中FW＝最终体重(g)，IW＝初始体重(g)，T＝饲喂持续时间(天)，WG＝湿增重(g)，FI＝采食量(g)，PI＝摄入蛋白质(g)并且FL＝最终长度(cm)。
结果
光学显微镜
光学显微镜显示，饲喂对照和实验饵料的鲈鱼显示出完整的上皮屏障和有组织的绒毛状粘膜皱襞的粘膜排列。肠粘膜由简单的上皮组织和包括分散的IEL的固有层(LP)组成(见图12A)。与饲喂对照饵料的鱼相比，在实验时间段的第5周和第10周饲喂50SC/CU壁多糖饵料的鱼中周长比(周长比越高表明由更多的和/或更长的粘膜皱襞引起更高的吸收性肠表面)显著升高(见表24A和B)。相反，与饲喂对照的鱼相比，饲喂60SC壁多糖饵料方案的鱼仅在饲喂10周后就显示PR显著升高(参见表24B)。
表24A.饲喂实验饵料5周后的光学显微镜数据。数据表示为平均值±标准偏差(n＝6/处理)。a-b上标表示使用Tukey的HSD事后检验的显著差异
表24B.饲喂实验饵料10周后的光学显微镜数据。数据表示为平均值±标准偏差(n＝18/处理)。a-b上标表示使用Tukey的HSD事后检验的显著差异
SEM分析
所有鱼的上皮表面似乎是健康的，具有统一的肠细胞形成和密集的微绒毛，没有细胞或微绒毛破坏或坏死迹象。每种处理中的鱼的代表性图像呈现在图12中，微绒毛密度测量分析呈现在图13A和13B中。饲喂实验饵料5周后(见图13A)，与饲喂对照的鱼(1.58±0.5a.u.)相比，饲喂60SC壁多糖(2.90±1.0a.u.)和50SC/CU壁多糖(4.81±1.0a.u.)显示微绒毛密度显著升高(P<0.001)。同样饲喂试验饵料10周后(见图13B)，与饲喂对照饵料的鱼(1.66±0.2)相比，饲喂60SC壁多糖(3.51±0.4a.u.)和50SC/CU壁多糖(3.48±0.7a.u.)的鱼显示出微绒毛密度的显著升高(P<0.001)。
实时qPCR
基因表达数据显示，与饲喂对照的鱼(0.48±0.15NEL)相比，饲喂60SC壁多糖(0.17±0.07NEL)和50SC/CU壁多糖(0.11±0.08NEL)饵料的鱼表现出热休克蛋白70(HSP70)的显著下调(P＝0.03)。同样，与饲喂对照饵料的鱼(0.47±0.14NEL)相比，饲喂鱼的60SC壁多糖(0.14±0.1NEL)和50SC/CU壁多糖(0.12±0.04NEL)表现出增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达的显著下调(P＝0.03)。相反，炎症效应细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)的基因表达数据显示，与饲喂对照饵料的鱼(0.51±0.4NEL)相比，饲喂50SC/CU壁多糖饵料的鱼(1.74±0.4NEL)表现出显著上调(P＝0.03)。类似地，抗炎效应细胞因子白介素-10(IL-10)的基因表达数据显示，与饲喂鱼饲料对照饵料的鱼(0.36±0.2NEL)相比，饲喂50SC/CU壁多糖饵料的鱼(2.79±2.0NEL)表现出显著上调(P＝0.05)。所有数据如图14所示。
实施例11：市售肉鸡暴露于堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的混合攻击中的50SC/CU壁多糖的抗球虫效力
目的
该研究的目的是测量50SC/CU壁多糖对堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的混合物的抗球虫效力/敏感性。
实验设计
该研究由45个笼子开始，每个笼子10只鸡。八个处理重复九次。
处理
动物
孵化日，雄性肉鸡(品系Ross 708)用于本试验。在孵化场，区分禽的性别并接受常规疫苗接种。在本研究中只使用健康的鸡。本研究开始时，禽被安置(第0天)，在那时它们被分配到实验笼子。在研究过程中没有禽被替换。在第0、14、20、28天称重禽笼。
禽舍
到达后，将鸡放入层架式笼中。每只动物的地板面积为0.51平方英尺/只禽。恒温控制的煤气炉/空调保持均匀的温度。甚至通过沿墙壁垂直悬挂的荧光灯提供连续的照明。饲料和水随意提供。
生物剂
球虫接种物由三个物种的艾美球虫的混合培养物组成。物种是堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫。在感染处理中球虫接种物通过口服灌胃施用于禽。
在研究的第14天，在未感染的处理中，每只禽用口吸管(p.o.)接受1ml蒸馏水。感染处理中的禽接受稀释至1ml体积滴度(平均卵囊数对于堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫分别为75,000、25,000和50,000个)的球虫接种物(p.o.)。
损伤评分
在第20天，每笼五(5)只禽人道安乐死，并进行组称重。根据感染的肠道区域对禽进行球虫病损伤评分。
攻击时间表
■D14：球虫病攻击对于堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫分别为75,000、25,000和50,000个
■D20：粪便物质中的卵囊数(每笼混合)
肠道病变评分(5只禽/笼)
结果
在图15至17中给出结果
如图15所示，饲喂50SC/CU壁多糖的动物显示较低的与堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫感染相关的特异性损伤。这种作用导致显著较低的平均损伤评分。
有趣的是，如图16所示，由艾美球虫属(Eimeria sp.)感染的肉鸡的死亡率在实验过程中也以剂量依赖的方式数值上减少。
如图17所示，在第20天(感染后6天)的病原体卵囊排泄在饲喂50SC/CU壁多糖的禽以剂量依赖性方式显著降低。
这些结果支持以下事实：用50SC/CU壁多糖饲喂肉鸡能够减轻与艾美球虫属感染相关的负面影响。
虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应当理解的是，本发明能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖本发明根据本发明的原理的任何变型、用途或者修改，并且包括来自在本发明所属的并且如可应用于上文所阐述的基本特征并且如按照所附权利要求书的范围的领域内的已知或惯用实践而从本公开出发的内容。

Claims (25)

1.组合物，其包含来自至少一种假丝酵母属物种(Candida species)的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至50干重％。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至15干重％。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50干重％。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、11、12、13、14或15干重％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的20至80重量％。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的30至60重量％。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少20、23、25、27、30、33、35、37、40、43、45、47、50、53、55、57、60、63、65、67、70、73、75、77或80重量％。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60重量％。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至50干重％；并且来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的30至60重量％。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50干重％；并且来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的30至60重量％。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的10至50干重％；并且来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60重量％。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖的量为基于组合物中壁多糖总重量的至少10、15、20、25、30、35、40、45或50干重％；并且来自至少一种假丝酵母属物种的壁多糖和来自至少一种不同酵母物种的壁多糖的量为基于组合物总重量的至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60重量％。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述至少一种假丝酵母属物种是产朊假丝酵母(Candida utilis)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中来自至少一种不同酵母物种的壁多糖来自酵母属(Saccharomyces sp)，汉逊酵母属(Hanseniaspora sp)，汉逊酵母属(Hansenula sp)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp)，Metschnikowia sp，毕赤酵母属(Pichia sp)，Starmerella sp和Torulaspora sp或其混合物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于调节和/或刺激动物的免疫应答。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于改善动物的肠道健康、肠道完整性和肠道形态。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于刺激动物的抗炎反应。
19.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于改善养殖动物的生长表现参数和饲料转换。
20.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于降低养殖动物的发病率和死亡率，并且特别是抗生素治疗。
21.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于降低养殖动物的死亡率。
22.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于减少动物的腹泻。
23.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于降低对肠道病原体的敏感性。
24.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于降低动物对寄生虫感染和相关病症的敏感性。
25.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，用于改善水生动物的皮肤粘液的产生。
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