WO2022025007A1 - 細胞外小胞溶液 - Google Patents

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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • extracellular vesicles are extracellular vesicles produced from animal or plant secretions, animal cells or supernatants of plant cell cultures.
  • the secretions include, but are not limited to, biological fluids (including body fluids) such as animal milk, plasma, sweat, urine, saliva, or plant juices.
  • Extracellular vesicles produced from cells selected from the group consisting of B cells, platelets, hematopoietic stem cells, mononuclear cells, fat cells, cancer cells, ES cells and iPS cells.
  • extracellular vesicles are selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, neural stem cells, dendritic cells, NK cells and iPS cells.
  • the concentration of extracellular vesicles in the extracellular vesicle solution is 1 ⁇ 10 12 particles / ml or less, 1 ⁇ 10 11 particles / ml or less, 1 ⁇ 10 10 particles / ml or less, 1 ⁇ 10 9 particles / ml or less.
  • the extracellular vesicle solution derived from mesenchymal stem cells may be a solution containing extracellular vesicles of 1 ⁇ 10 10 particles / ml or less.
  • extracellular vesicle solutions derived from cancer cells contain higher concentrations than those of mesenchymal stem cells, eg, 1 ⁇ 10 12 particles / ml or less.
  • centrifugation may be performed after filtration by an ultrafiltration filter. Centrifugation is preferably carried out at cooler than room temperature, for example at about 4 ° C. The extracellular vesicle solution is further concentrated by centrifugation. The final liquid volume adjustment can be done by centrifugation time.
  • the most frequent particle size of the extracellular vesicle after concentration is within 3 times the most frequent particle size of the extracellular vesicle before concentration. It is preferably within 2 times, more preferably within 1.5 times.
  • the method for producing a concentrated extracellular vesicle solution of the present invention preferably makes it possible to obtain a concentrated extracellular vesicle solution while maintaining biological activity without aggregating extracellular vesicles.
  • the concentrated extracellular vesicle solution has the same biological activity as before concentration.
  • the biological activity of extracellular vesicles is immunomodulation of cells derived from mesoderm, endoderm and external lung lobe, tissue reconstruction / repair, injury resistance, and cancer, for which a relationship between dysactivity and pathogenesis is known. Includes biological activity related to conversion.
  • cytotoxicity inhibitory activity can be measured, for example, by adding or administering a drug to cultured cells or animals and examining the inhibitory effect of the drug on cell death.
  • Cytokine production inhibitory activity induces an inflammatory reaction or allergic reaction to a cell or animal by infection with a bacterium or virus, or by addition or administration of a drug (for example, an immunostimulator), and measures the amount of cytokine. You can find out by doing.
  • Macrophage differentiation regulatory activity differentiates macrophages into cells or animals by infection with bacteria or viruses, or by addition or administration of drugs (for example, cell differentiation inducers), and the degree of differentiation is determined using quantitative PCR. Can be investigated.
  • Anti-fibrosis activity can be determined by adding or administering a fibrosis-enhancing agent to cells or animals and measuring fibrosis markers.
  • Example 1 Concentration of extracellular vesicles derived from bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • extracellular vesicles were purified from the culture supernatant of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a size exclusion chromatography method. The outline of this embodiment is shown in FIG. The particle size distribution and the number of particles of the further concentrated extracellular vesicles were measured.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured using a serum-free medium for culturing mesenchymal stem cells. The culture supernatant was collected and centrifuged to remove cell debris, extracellular vesicles, and large extracellular vesicles> 1 ⁇ m. Then, a purified extracellular vesicle solution was obtained by size exclusion chromatography.
  • Example 1 In order to evaluate the biological activity of the concentrated extracellular vesicle preparation of Example 1, 300 ⁇ g / mL of silica was added to A549 cells, which are alveolar epithelial cells. The effect of suppressing cell death induced by the addition of silica was evaluated by Cell Counting Kit-8 (manufactured by Doujin Chemical Laboratory Co., Ltd.). The concentration of extracellular vesicles to be added was set using CD9 / CD63, which is a surface marker of extracellular vesicles, as an index. The results are shown in the table below. The cell viability is the cell viability when the silica-free cell viability is 100%. The cell viability with the addition of silica and without the addition of extracellular vesicles was 24%.

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Abstract

本発明は、濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法及び本発明の方法によって製造された濃縮された細胞外小胞溶液に関する。本発明の濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法は、（ａ）細胞外小胞溶液に二糖を添加し、（ｂ）工程（ａ）の細胞外小胞溶液を限外ろ過フィルターで濃縮する、ことを含む。

Description

細胞外小胞溶液
　本発明は、濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法、および当該方法によって得られる濃縮された細胞外小胞溶液に関する。
　細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶ）は、大部分の真核細胞において、エンドソームの内部に形成される膜結合性の細胞外の小胞である。細胞外小胞の大きさは、５０－１５０ｎｍ程度の小サイズ、１５０－１０００ｎｍの中サイズ、１０００ｎｍ以上の大サイズがある。小サイズの細胞外小胞は、エクソソームと呼称される場合がある。細胞から細胞外に分泌される細胞外小胞は、表面に細胞膜由来、あるいはエンドソーム膜由来のタンパク質や脂質を有し、内部に細胞質由来の核酸及びタンパク質を含み、そして細胞間の情報伝達の機能を担っていることが報告されている（非特許文献１）。また、間葉系幹細胞から分泌された細胞外小胞は抗炎症作用や抗線維化作用を有しているため、間葉系幹細胞由来細胞外小胞を用いた細胞外小胞製剤の開発が進められている（非特許文献２）。
　細胞外小胞の精製方法として、超遠心法、ポリマー法、アフィニティー法、サイズ排除クロマトグラフィー法等がある。サイズ排除クロマトグラフィー法は他の方法に比べて、細胞外小胞以外の不純物が少なく、生理活性を有したインタクトな状態の細胞外小胞が精製できることが利点である（非特許文献３）。しかしながら、サイズ排除クロマトグラフィー法はカラムにローディングする培養液のおよそ３倍以上の液量でエリューションされるため、最終的な細胞外小胞製剤溶液は希釈される。そのため、細胞外小胞製剤として薬理作用を示すには濃度が十分ではない。また、精製工程中又は精製工程後、溶液中で細胞外小胞が凝集してしまうという問題が知られていた。
　濃度が不十分である、不純物が多い、あるいは、細胞外小胞が凝縮してしまう、等の１又は複数の現象により、十分な生物活性を保持する細胞外小胞製剤を得ることができなかった。
Journal of Extracellular Vesicles, 2015, 4: 10.3402/jev.v4.27066. Biomarker Research, 2019,7:8  doi: 10.1186/s40364-019-0159-x Theranostica, 2017, 7(3), 789-804
　本発明者らは、上記問題解決の鋭意研究に努めた結果、濃縮の際に二糖を添加することにより、細胞外小胞の凝集を防ぎつつ生理活性を保持したまま、細胞外小胞を濃縮することが可能であることを見出し、本発明を想到した。
　本発明は、濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明はまた、本発明の方法によって得られる濃縮された細胞外小胞溶液に関する。
　限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
　濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法であって。
　（ａ）細胞外小胞溶液に二糖を添加し、
　（ｂ）工程（ａ）の細胞外小胞溶液を限外ろ過フィルターで濃縮する、
ことを含む方法。
［態様２］
　二糖がトレハロース、マルトース、セロビオース、ラクツトース、ラクトース、スクロース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、β、β－トレハロース、α、β－トレハロース、ソホロース、ラミナリビオースおよびゲンチオビオースからなる群から選択される、態様１に記載の方法。
［態様３］
　細胞外小胞溶液が、サイズ排除クロマトグラフィー法で精製された細胞外小胞を含む、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］
　工程（ａ）において、細胞外小胞溶液に二糖を最終濃度１ｐＭ～２５０ｍＭの範囲の濃度で添加する、態様１－３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
　工程（ａ）の二糖の添加により、二糖を添加しない場合と比較して、工程（ｂ）の濃縮工程において細胞外小胞同士の凝集が抑制される、態様１－４のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］
　濃縮後の細胞外小胞の平均粒子径が、濃縮前の細胞外小胞の平均粒子径の３倍以内である、態様５に記載の方法。
［態様７］
　工程（ｂ）により細胞外小胞溶液を２倍以上に濃縮する、態様１－６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
　細胞外小胞が、動物又は植物の分泌液、動物細胞又は植物細胞の培養液の上清から産生される細胞外小胞である、態様１－７のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
　細胞外小胞が、
間葉系幹細胞、線維芽細胞、神経幹細胞、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、角膜細胞、肝前駆細胞、肝細胞、膵島細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、心筋細胞、毛包細胞、毛包肝細胞、平滑筋細胞、間質細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、造血幹細胞、単核球、脂肪細胞、がん細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される細胞から産生される細胞外小胞である、態様１－８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
　態様１－９のいずれか１項に記載の方法によって製造された濃縮された細胞外小胞溶液。
［態様１１］
　総タンパク質の濃度が、１１０μｇ／ｍｌ以上である、態様１０に記載の細胞外小胞溶液。
［態様１２］
　二糖を含む、態様１０又は１１に記載の細胞外小胞溶液。
［態様１３］
　濃縮前と同様の生物活性を有する、態様１０－１２のいずれか１項に記載の細胞外小胞溶液。
　本発明によれば、細胞外小胞を凝集させることなく、生物活性を保った状態で濃縮することができ、細胞外小胞製剤として利用できる。また、細胞外小胞同士の凝集を防ぎつつ、濃縮することができる。本発明の濃縮方法によって得られた細胞外小胞は、生物活性の高い医薬品として用いることができる。
図１は、本発明の細胞外小胞濃縮方法の概要を示した図である。 図２は、サイズ排除クロマトグラフィー法を用いて精製した間葉系幹細胞由来の細胞外小胞を、本発明の方法によって濃縮した（ＮＦＦ方式）細胞外小胞製剤の、粒子径分布を示した表である。 図３は、サイズ排除クロマトグラフィー法を用いて精製した間葉系幹細胞由来の細胞外小胞を、本発明の方法によって濃縮した（ＮＦＦ方式）細胞外小胞製剤の、粒子サイズ毎の粒子数の分布を示した図である。Ａ）は、濃縮前の結果を示す。（Ｂ）は、トレハロース不添加、濃縮後（比較例）の結果を示す。縦軸は、濃度（粒子数／ｍｌ）、横軸は、粒子径（ｎｍ）を示す。黒線：平均粒子径（ｎｍ）／濃度。赤エラーバー：＋／－　１平均の標準偏差。 図３は、サイズクロマトグラフィー法を用いて精製した間葉系幹細胞由来のエクソソームを、本発明の方法によって濃縮したエクソソーム製剤の、粒子サイズ毎の粒子数の分布を示した図である。（Ｃ）は、トレハロース添加、濃縮後（実験例）の結果を示す。縦軸は、濃度（粒子数／ｍｌ）、横軸は、粒子径（ｎｍ）を示す。黒線：平均粒子径（ｎｍ）／濃度。赤エラーバー：＋／－　１平均の標準偏差。 図４は、トレハロース未添加の場合（対照）の、Ｚｅｔａｖｉｅｗによる粒度分布測定結果を示す。縦軸は相対濃度（粒子数／ｍｌ）、横軸は粒子径（ｎｍ）。細線は濃縮前、太線は濃縮後（トレハロース未添加）である。細胞外小胞溶液の濃縮はＴＦＦ方式で行った。 図５は、トレハロース添加の場合の、Ｚｅｔａｖｉｅｗによる粒度分布測定結果を示す。縦軸は相対濃度（粒子数／ｍｌ）、横軸は粒子径（ｎｍ）。細線は濃縮前、太線は濃縮後（トレハロース添加）である。細胞外小胞溶液の濃縮はＴＦＦ方式で行った。
　非限定的に本発明は、以下の態様を含む。
　１．濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法
　本発明は、濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法に関する。本発明の方法は、
　（ａ）細胞外小胞溶液に二糖を添加し、
　（ｂ）工程（ａ）の細胞外小胞溶液を限外ろ過フィルターで濃縮する、
ことを含む。
　細胞外小胞は、大部分の真核細胞において、エンドソームの内部に形成される膜結合性の細胞外小胞である。細胞外小胞の由来は特に限定されない。一態様として、非限定的に、動物細胞、植物細胞由来の任意のものを使用可能である。（本明細書において、「一態様として」は、非限定的であることを意味する。）動物は、非限定的に、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類（マウス、ラット等）などの哺乳動物を含む。「細胞外小胞の由来」とは、細胞外小胞が精製等により当該細胞から得られることを意味する。
　一態様において、細胞外小胞は、動物又は植物の分泌液、動物細胞又は植物細胞の培養液の上清から産生される細胞外小胞である。非限定的に、分泌液には、動物の乳汁、血漿、汗、尿、唾液、または、植物の搾り汁などの、生体由来の液体（体液を含む）を含む。
　一態様において、細胞外小胞は、生体から単離した細胞、培養細胞、株化細胞、不死化細胞由来の細胞外小胞を含む。
　細胞外小胞が由来する細胞の種類も特に限定されない。一態様において、細胞外小胞は、間葉系幹細胞、線維芽細胞、神経幹細胞、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、角膜細胞、肝前駆細胞、肝細胞、膵島細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、心筋細胞、毛包細胞、毛包肝細胞、平滑筋細胞、間質細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、造血幹細胞、単核球、脂肪細胞、がん細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される細胞から産生される細胞外小胞である、
　一態様として、細胞外小胞は、間葉系幹細胞、神経幹細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される。
　細胞外小胞溶液は、細胞外小胞を含む溶液である。一態様において、細胞外小胞を含む溶液は、サイズ排除クロマトグラフィー法、超遠心法、ポリマー法、アフィニティー法等の精製方法によって、精製された（粗精製を含む）細胞外小胞を含む溶液である。
　好ましくは、細胞外小胞溶液は、サイズ排除クロマトグラフィー法で精製された細胞外小胞を含む。サイズ排除クロマトグラフィーは公知の方法によって行うことができる。非限定的に、ＥＶｓeｃoｎｄ（ジーエルサイエンス株式会社製）、ｑＥＶ（ＩＺＯＮ社製）、ＰＵＲＥ－ＥＶ（ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ社製）、逆相分取ＨＰＬＣ、多孔質ガラスを用いることができる。
　細胞外小胞溶液の溶媒は、特に限定されない。例えば、細胞外小胞の精製に用いられた溶液、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー法の場合は、リン酸緩衝液、生理食塩水等が含まれる。
　例えば、精製法にサイズ排除クロマトグラフィー法を用いる場合、カラムにローディングする培養液のおよそ３倍以上の液量でエリューションされるため、最終的な細胞外小胞製剤溶液は希釈される。よって、調製された細胞外小胞溶液は、一般に濃度が低い。また、由来する動植物、細胞の種類によっては、得られる細胞外小胞溶液中の細胞外小胞の濃度が低い場合がある。当該濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法は、特に、このような低濃度の細胞外小胞溶液に対して有用である。非限定的に、細胞外小胞溶液中の細胞外小胞の濃度は、1×１０１２粒子／ｍｌ以下、１×１０１１粒子／ｍｌ以下、１×１０１０粒子／ｍｌ以下、１×１０９粒子／ｍｌ以下である。一態様において、例えば、間葉系幹細胞由来の細胞外小胞溶液は、１×１０１０粒子／ｍｌ以下の細胞外小胞を含む溶液である場合がある。非限定的に、例えば、がん細胞由来の細胞外小胞溶液は、間葉系幹細胞の場合より高濃度、例えば、1×１０１２粒子／ｍｌ以下の細胞外小胞を含む。非限定的に、例えば、低密度で培養した細胞由来の細胞外小胞溶液は、高密度で培養した間葉系幹細胞の場合より低濃度、例えば、1×１０９粒子／ｍｌ以下の細胞外小胞を含む。例えば、セルソーターまたは接線流ろ過システムで精製した細胞外小胞溶液は、サイズ排除クロマトグラフィー法の場合より低濃度、例えば、1×１０９粒子／ｍｌ以下の細胞外小胞を含む。
　「二糖」とは、糖類の最小構成単位である単糖二分子が脱水縮合し、グリコシド結合を形成して一分子となった糖である。本発明において二糖の種類は特に限定されない。天然に存在する二糖であっても、人工的に合成された二糖であってもよい。
　一態様において、二糖は、トレハロース、マルトース、セロビオース、ラクツトース、ラクトース、スクロース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、β、β－トレハロース、α、β－トレハロース、ソホロース、ラミナリビオースおよびゲンチオビオースからなる群から選択される。
　「トレハロース」は、グルコースとグルコースが、α（１→）α結合した二糖である。本明細書において、トレハロースは特に明記した場合を除き、α、α－トレハロースを意味する。マルトース及びセロビオースもグルコース二糖からなり、各々、α(1→４）結合、β（１→４）結合である。
　コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、β、β－トレハロース、α、β－トレハロース、ソホロース、ラミナリビオースおよびゲンチオビオースも、グルコース二糖からなる、いわゆる稀少な二糖である。
　ラクツトースはガラクトースとフルクトースの二糖、ラクトースはガラクトースとグルコースの二糖、スクロースはグルコースとフルクトースの二糖である。これらの糖も、タンパク質の高次構造を安定化させる作用を有するため、トレハロースと同様に、細胞外小胞濃縮における効果を奏する。
　細胞外小胞溶液に二糖を添加する濃度は、特に限定されない。生体の細胞から細胞外小胞を精製した場合、通常は、二糖を含まない。非限定に、細胞外小胞溶液中に最終濃度１ｐＭ以上、１０ｐＭ以上、１００ｐＭ以上、１μＭ以上、１０μＭ以上、１００μＭ以上、１ｍＭ以上、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上の濃度で二糖を添加する。１ｐＭは、検出限界と想定される下限であり、人為的に二糖を添加するあらゆる態様を含みうる。二糖の濃度の上限も特に限定されない。非限定的に、細胞外小胞溶液中に最終濃度５００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下の濃度で二糖を添加する。
　一態様において、細胞外小胞溶液に二糖を最終濃度１ｐＭ～２５０ｍＭの範囲の濃度で添加する。好ましくは、細胞外小胞溶液に二糖を最終濃度１０ｐＭ～２００ｍＭの範囲の濃度、１００ｐＭ～１００ｍＭの範囲の濃度、１ｍＭ～１００ｍＭの範囲の濃度、１０ｍＭ～５０ｍＭの範囲の濃度で添加する。
　工程（ｂ）において、工程（ａ）の細胞外小胞溶液を限外ろ過フィルターで濃縮する。
　「限外ろ過」とは、ろ紙などではろ過できないコロイド粒子のような微細な粒子をろ過し、高分子物質と低分子物質を分離する方法の１つである。
　限外ろ過膜の種類は特に限定されない、限外ろ過膜は、中空糸膜が一般的であるが、その他に、スパイラル膜、チューブラー膜、平膜なども存在する。使用する限外ろ過膜の孔径によって、ろ過される粒子径が決定される。
　当該濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法において使用される限外ろ過膜の孔径は特に限定されない。一態様において、１０Ｋ～１０００ＫＤａカットのものを使用するのが好ましい。最も好ましくは１００ＫＤａである。
　一態様において、限外ろ過フィルターとして、アミコン　ウルトラ－１５，ＰＬＨＫ　ウルトラセル－ＰＬ　メンブレン，１００ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０，１００ｋＤａ（ｃｙｔｉｖａ社製）等を用いてもよい。
　限外ろ過のろ過方式には、垂直の方向にろ過される「ノーマルフローフィルトレーション（ＮＦＦ）」と液体が膜表面に沿って水平方向にポンプで送られるろ過される「タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）」がある。上述したアミコン　ウルトラやＶｉｖａｓｐｉｎなどの限外ろ過フィルターを用いるろ過方式は、ＮＦＦ方式である。
　一方、ＴＦＦ方式は、液体を膜表面に沿って水平方向にポンプで送りながら加圧して、液体の一部を強制的に膜からろ液側に送ることで、ＮＦＦの場合と同様、膜孔を通過できない大きい分子は膜の内側に保持されるが、保持された成分が膜表面に溜まることはなく、液の流れによって掃引される。こうした特長から、ＴＦＦは精巧なサイズ分画により好ましい方法で、ウイルスやタンパク質の精製・濃縮によく用いられている。
　一態様において、ＮＦＦ方式には、Ｃｙｔｉｖａのホローファイバーカートリッジ・システムＳｔａｒｔ　ＡＸＭ、Ｓｔａｒｔ　ＡＸＨ、ＰＡＬＬのミニメイト　ＴＦＦ　フィルトレーション　カプセル、オメガメンブレンＴ－シリーズＴＦＦカセット、デルタ再生セルロースメンブレンＴ－シリーズＴＦＦカセット、ミリポアのＰｅｌｌｉｃｏｎ　カセット、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　２カセット、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　３　カセット等を用いてもよい。
　一態様において、最終的な細胞外小胞製剤中の不純物をより減らすため、限外ろ過フィルターを一度ＰＢＳ等で洗浄して用いても良い。
　一態様において、限外ろ過フィルターによるろ過後、遠心処理を行ってもよい。遠心処理は、好ましくは室温よりも冷却下、例えば、約４℃によって行う。細胞外小胞溶液は遠心処理によりさらに濃縮させる。最終的な液量の調整は遠心時間によって行うことができる。
　工程（ａ）の二糖の添加により、二糖を添加しない場合と比較して、工程（ｂ）の濃縮工程において細胞外小胞同士の凝集が抑制される。「凝集が抑制される」とは、例えば、限外ろ過フィルターで濃縮工程において、または濃縮工程後において、細胞外小胞の平均粒子径（Ｍｅａｎ）または最頻値（Ｍｏｄｅ）が実質的に増加しない、増加しにくい、ことを意味する。あるいは、「凝集が抑制される」とは、例えば、電子顕微鏡の観察により確認することができる、
　非限定的に、濃縮後の細胞外小胞の平均粒子径が、濃縮前の細胞外小胞の平均粒子径の３倍以内である。好ましくは２倍以内、より好ましくは１．５倍以内である。
　非限定的に、濃縮後の細胞外小胞の最頻粒子径が、濃縮前の細胞外小胞の最頻粒子径の３倍以内である。好ましくは２倍以内、より好ましくは１．５倍以内である。
　一態様において、工程（ｂ）により細胞外小胞溶液が２倍以上に濃縮される。一態様において、工程（ｂ）により細胞外小胞溶液が３倍以上、５倍以上、８倍以上、１０倍以上、１５倍以上に濃縮される。
　一態様において、工程（ｂ）により細胞外小胞溶液における（細胞外小胞を含む）総タンパク質の量が、１．２倍上、１．５倍上、１．８倍以上、２倍以上に濃縮される。
　当該濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法は、工程（ｂ）限外ろ過フィルターでの濃縮工程後、濃縮された細胞外小胞溶液から工程（ａ）で添加された二糖を、特に取り除く必要はない。この点においても簡便な方法である。
　２．濃縮された細胞外小胞溶液
　本発明は、濃縮された細胞外小胞溶液に関する。本発明の濃縮された細胞外小胞溶液は、本発明の濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法によって、製造されたものである。
　本項目において特に説明しない用語は、「１．濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法」において説明した通りである。
　一態様において、当該濃縮された細胞外小胞溶液は、濃縮前の１．２倍上、１．５倍上、１．８倍以上、２倍以上の総タンパク質の量を含んでもよい。一態様において、当該濃縮された細胞外小胞溶液は、総タンパク質の濃度が、１１０μｇ／ｍｌ以上である。好ましくは、総タンパク質の濃度が、１５０μｇ／ｍｌ以上、１８０μｇ／ｍｌ以上、２００μｇ／ｍｌ以上、２５０μｇ／ｍｌ以上である。
　本発明の濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法は、工程（ｂ）限外ろ過フィルターでの濃縮工程後、濃縮された細胞外小胞溶液から工程（ａ）で添加された二糖を、特に取り除く必要はない。一態様において、当該濃縮された細胞外小胞溶液は、二糖を含む。濃縮された細胞外小胞溶液に含まれる二糖の量は特に限定されない。「１．濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法」に記載された添加される二糖の量以下である。濃縮されたエクソソーム溶液は、二糖を含むことにより、その後の使用（例えば医薬品等の製造）においても、凝集が抑制される、という利点が得られる。
　本発明の濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法は、好ましくは、細胞外小胞を凝集させることなく、生物活性を保った状態で濃縮された細胞外小胞溶液を得ることを可能にする。一態様において、当該濃縮された細胞外小胞溶液は、濃縮前と同様の生物活性を有する。細胞外小胞の生物活性とは、一態様において、活性異常と病態形成との関連が公知である中胚葉、内胚葉および外肺葉由来細胞の免疫調整、組織再建・修復、傷害抵抗性、ガン化に関わる生物活性などを含む。具体的には、例えば、中胚葉、内胚葉および外肺葉由来の細胞の分化、脱分化、増殖、細胞死、細胞増殖、免疫機能等に関連する生物活性である。例えば、特に、疾患への予防・治療効果との関連が公知である免疫細胞、上皮細胞の分化調節、サイトカイン産生調節、線維芽系細胞の分化、増殖抑制、上皮細胞の傷害抵抗性、がん細胞の増殖抑制等を含む。一態様において、細胞外小胞の生物活性とは、非限定的に、「細胞傷害抑制活性」、「サイトカイン産生抑制活性」、「マクロファージ分化調節活性」「抗線維化活性」を含む。
　これらの生物活性は公知の方法を用いて測定することが可能である。「細胞傷害抑制活性」は、例えば培養細胞または動物に薬剤を添加または投与し、薬剤による誘導される細胞死の抑制効果を調べることによって測定することができる。「サイトカイン産生抑制活性」は、細胞または動物に対して、細菌またはウイルスの感染、あるいは薬剤（例えば、免疫活性化剤など）の添加または投与によって炎症反応またはアレルギー反応を惹起し、サイトカイン量を測定することによって調べることができる。「マクロファージ分化調節活性」は、細胞または動物に対して、細菌またはウイルスの感染、あるいは薬剤（例えば、細胞分化誘導剤など）の添加または投与によってマクロファージを分化させ、その分化度を定量ＰＣＲを用いて調べることができる。「抗線維化活性」は、細胞または動物に対して、線維化亢進剤を添加または投与し、線維化マーカーを測定することによって調べることができる。
　一態様において、本発明の濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法により、細胞外小胞溶液が２倍以上、３倍以上、５倍以上、８倍以上、１０倍以上、１５倍以上に濃縮される。非限定的に、濃縮された細胞外小胞溶液中の細胞外小胞の濃度は、1×１０８粒子／ｍｌ以上、１×１０９粒子／ｍｌ以上、１×１０１０粒子／ｍｌ以上、１×１０１１粒子／ｍｌ以上である。一態様において、例えば、間葉系幹細胞由来の細胞外小胞溶液は、濃縮により１×１０１０粒子／ｍｌ以上の細胞外小胞を含む溶液である場合がある。
　本発明は、本発明の細胞外小胞溶液を含む、医薬品（製剤）、化粧品、サプリメント、及び研究用試薬に関する。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　実施例１　骨髄由来間葉系幹細胞由来の細胞外小胞の濃縮
　本実施例では、骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清からサイズ排除クロマトグラフィー法で細胞外小胞を精製した。本実施例の概略を図１に示す。さらに濃縮した細胞外小胞の粒子径分布及び粒子数を測定した。
　骨髄由来間葉系幹細胞を、間葉系幹細胞培養用の無血清培地を用いて培養した。培養上清を回収し、遠心により細胞破片、アポトーシス小胞、＞１μｍの大サイズの細胞外小胞の除去を行った。その後、サイズ排除クロマトグラフィー法によって精製細胞外小胞溶液を得た。
　得られた精製細胞外小胞溶液に１２５ｍＭトレハロース溶液を１／５量添加した。アミコン　ウルトラ－１５，ＰＬＨＫ　ウルトラセル－ＰＬ　メンブレン，１００ｋＤａをＰＳＢで洗浄し、トレハロース含有細胞外小胞溶液を添加し、限外ろ過を行った。処理後、４０００ｇ、４℃、１時間遠心を行った。
　比較例として、トレハロース添加を行わない精製細胞外小胞溶液を用いて、同様に限外ろ過、遠心処理を行った。
　実施例及び比較例について、粒子径分布（細胞外小胞の平均粒子径（Ｍｅａｎ）または最頻値（Ｍｏｄｅ））及び粒子数を測定した。具体的には、得られた細胞外小胞の粒子径分布と粒子数とをナノサイトを用いて測定した。ナノサイトはＰＢＳで５０－２５０倍に希釈し、５回繰り返し測定し、データを得た。
　結果を図２及び図３に示す。図２及び図３に示すように、実験例および比較例のいずれも精製細胞外小胞溶液は限外ろ過、遠心処理により約２０倍に濃縮された（粒子濃度）。そして、比較例１において得られた細胞外小胞溶液と比較して、実施例において得られた細胞外小胞溶液は平均粒子径の増大が見られないことが明らかになった。
　実施例２　細胞外小胞溶液の濃縮によるタンパク質濃度の変化
　本実施例では、細胞外小胞溶液の濃縮による総タンパク質濃度の変化を調べた。
　実施例１の試料について、限外ろ過による濃縮前と濃縮後にたんぱく質濃度をＢＣＡ法により測定した。具体的には、ＢＣＡタンパク質定量キット（アプロサイエンス社製）を用い、手順書に従いＲｅａｇｅｎｔ　ＡとＲｅａｇｅｎｔ　Ｂを混和後、混和液２００μｌをサンプル１０μＬに添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、吸光度分光光度計（ｘＭａｒｋ，ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用い、５６２ｎｍの吸光度を測定した。測定した値は、プロテインスタンダート（アプロサイエンス社製）を用いて作製した検量線式により、総たんぱく質濃度を算出した。
　その結果、限外ろ過による濃縮前が１０６μｇ／ｍｌ、濃縮後が２８１μｇ／ｍｌであった。
　実施例３　濃縮した細胞外小胞の細胞傷害抑制効果
　本実施例では、実施例１で得た濃縮された細胞外小胞溶液を用いて、細胞傷害抑制効果を評価した。
　実施例１の濃縮された細胞外小胞製剤の生物活性を評価するため、肺胞上皮細胞であるＡ５４９細胞にシリカ３００μｇ／ｍＬを添加した。シリカ添加により誘導される細胞死の抑制効果をＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（株式会社同人化学研究所社製）で評価した。添加する細胞外小胞の濃度は、細胞外小胞の表面マーカーであるＣＤ９／ＣＤ６３を指標に設定した。結果を以下の表に示す。細胞生存率は、シリカ未添加の細胞生存率を１００％とした場合の細胞の生存率である。なお、シリカ添加且つ細胞外小胞未添加の細胞生存率は、２４％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、細胞外小胞の濃度がいずれの場合も、トレハロースの添加により濃縮後の細胞生存率が上昇することが明らかになった。
　実施例４　骨髄由来間葉系幹細胞由来の細胞外小胞の濃縮（ＮＮＦによる限外ろ過）
　実施例１と同様に、骨髄間葉系幹細胞の培養上清からサイズ排除クロマトグラフィー法によって精製した細胞外小胞溶液を用いた。アミコンウルトラメンブレンを用いたＮＦＦ方式の限外ろ過の代わりに、ＴＦＦ膜としてＣｙｔｉｖａのホローファイバーカートリッジ・システムＳｔａｒｔ　ＡＸＭ　１００Ｋを使用したＴＦＦ方式による限外ろ過を行った。ＴＦＦにより、細胞外小胞溶液細胞外小胞溶液１００ｍＬが１６ｍＬに濃縮された。具体的には、細胞外小胞溶液１００ｍＬに１２５ｍＭトレハロース水溶液２５ｍＬを添加し、ＴＦＦによって１６ｍＬに濃縮した。対照として、トレハロースを添加しない細胞外小胞溶液を濃縮したものを用いた。
　ナノトラッキングシステム（Ｚｅｔａｖｉｅｗ）を用いて、濃縮後のサンプルの粒子径を測定した。
　トレハロースを添加せずＴＦＦを行ったサンプルでは濃縮後に一部巨大な粒子径が出現しており、凝集塊が確認された（図４）。一方、トレハロースを添加しＴＦＦを行ったサンプルは濃縮前と比べてヒストグラムに大きな変化がなかったことから、凝集を抑制できた（図５）。各サンプルの平均粒子径をまとめた結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の細胞外小胞の濃縮方法によれば、細胞外小胞の生物活性を失活させることなく、濃縮することができる。また、細胞外小胞同士の凝集を防ぎ濃縮することができる。本発明の濃縮方法によって得られた細胞外小胞は、高純度かつ高濃度で生物活性の高い医薬品として用いることができる。特に、細胞外小胞の注射剤を開発する場合に最適な濃縮方法である。

Claims (13)

  1. 　濃縮された細胞外小胞溶液を製造する方法であって。
    　（ａ）細胞外小胞溶液に二糖を添加し、
    　（ｂ）工程（ａ）の細胞外小胞溶液を限外ろ過フィルターで濃縮する、
    ことを含む方法。
  2. 　二糖がトレハロース、マルトース、セロビオース、ラクツトース、ラクトース、スクロース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、β、β－トレハロース、α、β－トレハロース、ソホロース、ラミナリビオースおよびゲンチオビオースからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　細胞外小胞溶液が、サイズ排除クロマトグラフィー法で精製された細胞外小胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　工程（ａ）において、細胞外小胞溶液に二糖を最終濃度１ｐＭ～２５０ｍＭの範囲の濃度で添加する、請求項１－３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　工程（ａ）の二糖の添加により、二糖を添加しない場合と比較して、工程（ｂ）の濃縮工程において細胞外小胞同士の凝集が抑制される、請求項１－４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　濃縮後の細胞外小胞の平均粒子径が、濃縮前の細胞外小胞の平均粒子径の３倍以内である、請求項５に記載の方法。
  7. 　工程（ｂ）により細胞外小胞溶液を２倍以上に濃縮する、請求項１－６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　細胞外小胞が、動物又は植物の分泌液、動物細胞又は植物細胞の培養液の上清から産生される細胞外小胞である、請求項１－７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　細胞外小胞が、
    間葉系幹細胞、線維芽細胞、神経幹細胞、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、角膜細胞、肝前駆細胞、肝細胞、膵島細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、心筋細胞、毛包細胞、毛包肝細胞、平滑筋細胞、間質細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血小板、造血幹細胞、単核球、脂肪細胞、がん細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される細胞から産生される細胞外小胞である、請求項１－８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　請求項１－９のいずれか１項に記載の方法によって製造された濃縮された細胞外小胞溶液。
  11. 　総タンパク質の濃度が、１１０μｇ／ｍｌ以上である、請求項１０に記載の細胞外小胞溶液。
  12. 　二糖を含む、請求項１０又は１１に記載の細胞外小胞溶液。
  13. 　濃縮前と同様の生物活性を有する、請求項１０－１２のいずれか１項に記載の細胞外小胞溶液。
     
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