WO2022012041A1 - Pva膜固定化酶及其制备方法 - Google Patents

Pva膜固定化酶及其制备方法 Download PDF

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WO2022012041A1
WO2022012041A1 PCT/CN2021/076756 CN2021076756W WO2022012041A1 WO 2022012041 A1 WO2022012041 A1 WO 2022012041A1 CN 2021076756 W CN2021076756 W CN 2021076756W WO 2022012041 A1 WO2022012041 A1 WO 2022012041A1
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enzyme
pva
amino acid
acid sequence
membrane
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PCT/CN2021/076756
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洪浩
詹姆斯•盖吉
肖毅
张娜
维亚撒•威廉姆斯
崔瑜霞
赵佳东
高妍妍
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凯莱英生命科学技术(天津)有限公司
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    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of enzyme immobilization, in particular, to a PVA membrane immobilized enzyme and a preparation method thereof.
  • Biocatalysis is becoming an integral part of manufacturing programs for chemicals, intermediates, fine chemicals, and ultimately pharmaceutical molecules.
  • process demands continue to expand, the efficiency and economics of enzymatic applications become inevitable. Therefore, this requires not only enhanced enzymatic activity, specificity, and productivity, but also improved shelf-life and recyclability, especially to facilitate economic viability for commercial-scale applications.
  • Enzyme immobilization platforms provide an excellent tool for properly integrating enzymes during production. Over the years, several natural and synthetic carrier pairs have been evaluated for their enzymatic immobilization efficiency, as each platform has been specifically evaluated based on its application, economics, and advantages. Immobilized biocatalysts have broad applications in organic synthesis, pollution control, and diagnostic purposes (Enzyme Microb Technol, 31, 171-8; J Pharm Sci, 89, 979-90).
  • Immobilization is achieved by immobilizing the enzyme on or into a solid support, thereby obtaining a heterogeneous immobilized enzyme system.
  • Enzymes can be immobilized by a variety of methods, both physically (weak interactions exist between the carrier and the enzyme) and chemically (the carrier forms a covalent bond with the enzyme) (Analyst, 133, 697-701; Chem Soc Rev, 40, 2567- 92; Berlin Heidelberg: Springer, 95-126.) or a combination of the two, thereby encompassing various functionally active carriers.
  • Methods of physical immobilization of enzymes include adsorption (physical, ionic) on water-insoluble matrices such as adsorption on mesoporous materials, inclusion (or gel embedding), microencapsulation with solid membranes, within membranes or membrane reactors, Microencapsulation with liquid membrane, formation of enzymatic Langmuir-Blodgett membrane (Anal Chem, 1994; 66, 1120A-7A), etc.
  • the resulting enzyme catalyst depends on the properties of the membrane support, such as hydrophilicity, hydrophobicity, reactive functional group density, porosity, pore size distribution, membrane thickness, reactor configuration, and the like.
  • Immobilization The immobilization method is based on the localization of the enzyme within the membrane, and its purpose is to achieve higher expression of the enzyme in addition to being highly stable under operating conditions.
  • the main purpose of the present invention is to provide a PVA membrane-immobilized enzyme and a preparation method thereof, so as to solve the problem that the process of using a porous membrane-immobilized enzyme is complicated in the prior art.
  • a PVA membrane-immobilized enzyme includes a PVA porous membrane and an enzyme embedded on the PVA porous membrane, and the PVA porous membrane is three-dimensional structured PVA porous membrane, the enzyme is selected from aminotransferase, D-lactate dehydrogenase, cyclohexanone monooxygenase, ketoreductase, ene reductase, nitrilase, ammonia lyase, amino acid dehydrogenase, imine reductase, Any one of alcohol dehydrogenase, ammonium formate dehydrogenase, glucose 1-dehydrogenase and their mutants.
  • the above-mentioned enzymes are free enzymes or cross-linked enzyme aggregates.
  • transaminase is the transaminase derived from Chromobacterium violaceum DSM30191 or the transaminase derived from Arthrobacter citreus, or the transaminase derived from B.thuringiensis
  • ketoreductase is the ketoreductase derived from Acetobacter sp.CCTCC M209061, or derived from Candida Ketoreductase of macedoniensis AKU4588;
  • cyclohexanone monooxygenase is cyclohexanone monooxygenase from Rhodococcus sp.
  • Phi1 or cyclohexanone monooxygenase from Brachymonas petroleovorans, or from Rhodococcus ruber- Cyclohexanone monooxygenase of SD1; ammonia lyase is ammonia lyase from Aspergillus niger CBS 513.88 and ammonia lyase from Solenostemon scutellarioides; alkene reductase is alkene reductase from Saccharomyces cerevisiae and from Chryseobacterium alkene reductase of sp.CA49; imine reductase is imine reductase derived from Streptomyces sp and imine reductase of Bacillus cereus; amino acid dehydrogenase is leucine dehydrogenase derived from Bacillus cereus and leucine dehydrogenase derived from Bacillus cereus Phenylalanine dehydr
  • the above-mentioned transaminase derived from Chromobacterium violaceum DSM30191 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence of the mutant of the transaminase is the amino acid sequence obtained by mutation of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.1, wherein The mutation includes at least one of the following mutation sites: 7th, 47th, 90th, 95th, 297th, 304th, 380th, 405th and 416th, and 7th Mutation of threonine to cysteine, serine at position 47 to cysteine, lysine at position 90 to glycine, alanine at position 95 to proline, position 297 Isoleucine is mutated to leucine, lysine at position 304 is mutated to aspartic acid, glutamine at position 380 is mutated to leucine, and arginine at position 405 is mutated to glutamic acid , the arginine at position 416
  • the above-mentioned transaminase derived from Arthrobacter citreus has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.2, and the amino acid sequence of the mutant of the transaminase is the amino acid sequence obtained by mutation of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.2, wherein mutation At least one of the following mutation sites: 3rd, 5th, 60th, 164th, 171st, 178th, 180th, 186th, 187th, 252nd, 1st 370, 384, 389, 404, 411, 423 and 424, and the leucine at position 3 is mutated to serine, and the valine at position 5 is mutated to serine, Cysteine at position 60 is mutated to tyrosine, phenylalanine at position 164 is mutated to leucine, glutamic acid at position 171 is mutated to aspartic acid, and alanine at position 178 is mutated is leucine, isoleu
  • the above-mentioned ketoreductase derived from Acetobacter sp.CCTCC M209061 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.3, and the amino acid sequence of the mutant of the ketoreductase is mutated by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.3
  • the amino acid sequence of the mutant of ketoreductase has a mutation site in the amino acid sequence obtained by mutation, and is consistent with the amino acid obtained by mutation.
  • the sequences have amino acid sequences with more than 80% homology.
  • the above-mentioned cyclohexanone monooxygenase derived from Rhodococcus sp.Phi1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.4, and the amino acid sequence of the mutant of the above-mentioned cyclohexanone monooxygenase is represented by SEQ ID NO.
  • cyclohexanone monooxygenase derived from Rhodococcus ruber-SD1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.5, and the amino acid sequence of the mutant of cyclohexanone monooxygenase is represented by SEQ ID NO.5.
  • the amino acid sequence of the mutant of hexanone monooxygenase has a mutation site in the amino acid sequence obtained by mutation, and has an amino acid sequence that has more than 80% homology with the amino acid sequence obtained by mutation.
  • PVA membrane-immobilized enzymes also include coenzymes and cofactors of each enzyme, and the coenzymes and cofactors are embedded on the PVA porous membrane.
  • the above-mentioned PVA porous membrane also has polyethylene glycol and/or polyethyleneimine, the molecular weight of polyethylene glycol is PEG400 ⁇ PEG 6000, and the molecular weight of polyethyleneimine is 3KDa ⁇ 70KDa.
  • the mass ratio of the polyethylene glycol to the porous PVA is 5:4 to 75:4, and the mass ratio of the polyethyleneimine to the porous PVA is 1:12 to 1:240.
  • the above-mentioned enzymes are crude enzymes.
  • the loading amount of the above enzymes is 0.05-0.4 g free enzyme/cm 2 membrane or 0.03-0.06 g dried cross-linked enzyme aggregates/cm 2 membrane.
  • a preparation method of any of the above-mentioned PVA membrane-immobilized enzymes comprising: step S1, mixing the raw materials comprising the enzyme and the PVA solution for a predetermined time to obtain a mixed system; step S2, adding the mixed system into the mold and drying the mixed system to obtain the membrane-embedded enzyme, and the mold is a three-dimensional structured mold to form a three-dimensional structured PVA porous membrane; and step S3, using phosphate buffer to coat the membrane After the buried enzyme was soaked and washed, the PVA membrane immobilized enzyme was obtained.
  • pH value of the above mixed system is 6.0-6.5.
  • step S1 includes: preparing an enzyme suspension or enzyme solution, the enzyme in the suspension is a cross-linked enzyme aggregate, and the enzyme in the enzyme solution is a free enzyme that removes cells; the suspension or enzyme solution is mixed with PVA solution. Mixed for a predetermined time to obtain a mixed system.
  • the above predetermined time is 10-60 minutes; the PVA molecular weight of the PVA solution is 20KDa-200KDa.
  • the content of PVA in the above PVA solution is 10-50 g/100 mL.
  • acetic acid, methanol and sulfuric acid are dispersed in the above-mentioned PVA solution.
  • the pH value of the above-mentioned PVA solution is between 5.5 and 6.5.
  • the ratio of the above-mentioned enzyme to the PVA solution is 1-50 g/100 mL.
  • the above suspension or enzyme solution also contains phosphate buffer, optional cofactor and optional coenzyme.
  • weight ratio of the coenzyme to the enzyme is 10:1 to 1:10.
  • step S1 includes: mixing the PVA aqueous solution and the cross-linked enzyme particles to form a mixed system.
  • the ratio of the cross-linked enzyme particles to the PVA aqueous solution is 1-50 g/100 mL.
  • the above predetermined time is 10-60 minutes.
  • cross-linked enzyme particles include enzymes, optional cofactors and optional coenzymes.
  • step S1 includes: mixing the PVA aqueous solution and the modifier solution for a first predetermined time to form a second mixed system; and mixing the second mixed system with the enzyme system for a second predetermined time to form a mixed system.
  • the concentration of the above-mentioned PVA aqueous solution is 5-30 g/100 mL, and preferably, the modifier solution includes a cofactor-dispersed polyethylene glycol aqueous solution and/or a cofactor-dispersed polyethyleneimine aqueous solution.
  • the molecular weight of the above polyethylene glycol is PEG400 ⁇ PEG 6000, and the concentration of polyethylene glycol in the mixed system is 3 ⁇ 10g/100mL.
  • the molecular weight of the above polyethyleneimine is 3KDa-70KDa, more preferably 3KDa-50KDa.
  • the concentration of polyethyleneimine in the above mixed system is 0.1-1 g/100 mL, more preferably 0.1-0.3 g/100 mL.
  • the above-mentioned enzyme system includes an enzyme, an optional cofactor, an optional coenzyme and a phosphate buffer.
  • the above-mentioned enzymes are free enzymes that remove cells or aggregates of cross-linked enzyme aggregates.
  • the cofactor concentration in the above enzyme system is 1-20 mg/mL.
  • weight ratio of coenzyme to enzyme in the above enzyme system is 10:1 to 1:10.
  • the ratio of the above-mentioned enzyme to the PVA solution is 1-50 g/100 mL.
  • step S2 includes: the mixing system is placed in the mold and left to stand for a third predetermined time, and then a dehydration accelerator is added to the mold for drying treatment, wherein the dehydration accelerator is selected from any of the group consisting of acetonitrile, ethanol and acetone. one or more.
  • volume ratio of the above-mentioned dehydration accelerator and the mixed system is 1:10-5:1.
  • the above-mentioned third predetermined time is 2 to 4 hours.
  • the above-mentioned mold is a three-dimensional structured mold, and the three-dimensional structured mold has protrusions or grooves.
  • step S3 includes: soaking the membrane-embedded enzyme in a phosphate buffer for 2-16 hours and then washing the membrane-embedded enzyme with a fresh phosphate buffer to obtain the PVA membrane-immobilized enzyme.
  • the technical solution of the present invention is applied, and the PVA porous membrane is used as a carrier to immobilize the enzyme in an embedded manner.
  • the process of embedding and immobilization is simple, the conditions are mild, and the purified enzyme or crude enzyme has a good immobilization effect, and the enzyme is immobilized.
  • the porous structure of the adopted PVA porous membrane can better transfer reactants and products, and is suitable for use in continuous flow biochemical catalysis. Since the above-mentioned embedding and immobilization are mechanical immobilization, they are widely applicable to enzymes.
  • the PVA porous membrane is three-dimensionally structured to have a three-dimensional structure, which in turn has more surface area and provides more embedding sites, thereby improving the enzyme's high activity and stability on the basis of ensuring the high activity and stability of the enzyme. load.
  • Fig. 1 shows the stability curve of PVA membrane-immobilized enzyme according to Example 2 of the present invention with and without PLP added;
  • Figure 2 shows the stability curves of two PVA membrane-immobilized enzymes according to Example 3 of the present invention
  • Figure 3 shows the stability curve of PVA membrane immobilized enzyme according to Example 5 of the present invention with and without PLP added;
  • Figure 4 shows the stability curve of the PVA membrane immobilized enzyme according to Example 6 of the present invention with and without PLP added;
  • Figure 5 shows the stability curve of the PVA membrane immobilized enzyme according to Example 8 of the present invention when adding PLP and adding NAD +;
  • Figure 6 shows the stability curve of the PVA membrane immobilized enzyme according to Example 8 of the present invention when PLP is added and NAD + is added;
  • FIG. 7 shows the stability curves of the PVA membrane-immobilized enzyme according to Example 9 of the present invention with and without PLP added.
  • the process of immobilizing an enzyme using a porous membrane in the prior art is complicated.
  • the present application provides a PVA membrane-immobilized enzyme and a preparation method thereof.
  • a PVA membrane-immobilized enzyme in a typical embodiment of the present application, includes a PVA porous membrane and an enzyme embedded on the PVA porous membrane, and the PVA porous membrane is a three-dimensional structured PVA Porous membrane, the enzyme is selected from transaminase (such as ⁇ -transaminase), D-lactate dehydrogenase, formate dehydrogenase, carbonyl reductase, cyclohexanone monooxygenase, ketene reductase, nitrilase, ammonia lyase , amino acid dehydrogenase, imine reductase and any one of their mutants.
  • transaminase such as ⁇ -transaminase
  • D-lactate dehydrogenase such as ⁇ -transaminase
  • formate dehydrogenase carbonyl reductase
  • cyclohexanone monooxygenase ket
  • the PVA porous membrane is used as the carrier to immobilize the enzyme in the way of embedding.
  • the process of embedding and immobilization is simple and the conditions are mild, and it has a good immobilization effect on purified enzyme or crude enzyme.
  • the porous structure of the PVA porous film used can better transfer reactants and products, suitable for Used in continuous flow biochemical catalysis. Since the above-mentioned embedding and immobilization are mechanical immobilization, they are widely applicable to enzymes.
  • the PVA porous membrane is three-dimensionally structured to have a three-dimensional structure, which in turn has more surface area and provides more embedding sites, thereby improving the enzyme's high activity and stability on the basis of ensuring the high activity and stability of the enzyme. load.
  • the enzyme embedded in the PVA membrane-immobilized enzyme of the present application may be a free enzyme or a cross-linked enzyme aggregate, and both the free enzyme and the cross-linked enzyme aggregate can effectively exert their catalytic effect after embedding.
  • cross-linked enzyme aggregates are similar to those in the prior art, which are: after the free enzyme is precipitated with precipitants such as ammonium sulfate or ethanol, acetonitrile, acetone, propanol, PEG, etc., glutaraldehyde, glyoxal or aldehyde are added.
  • the insoluble enzyme aggregates are obtained by covalent cross-linking of bifunctional reagents such as sylated dextran.
  • the transaminase is a transaminase derived from Chromobacterium violaceum DSM30191 or a transaminase derived from Arthrobacter citreus, or derived from B.thuringiensis
  • the transaminase, the ketoreductase is the ketoreductase derived from Acetobacter sp.CCTCC M209061, or the ketoreductase derived from Candida macedoniensis AKU4588;
  • the cyclohexanone monooxygenase is the cyclohexanone monoaddition derived from Rhodococcus sp.Phi1 oxygenase, or cyclohexanone monooxygenase derived from Brachymonas petroleovorans, or cyclohexanone monooxygenase derived from Rho
  • imine reductase is imine reductase from Streptomyces sp and alkene reductase from Bacillus cereus Amine reductase; amino acid dehydrogenase is leucine dehydrogenase derived from Bacillus cereus and phenylalanine dehydrogenase derived from Bacillus sphaericus; nitrilase is nitrilase and source derived from Aspergillus niger CBS 513.88
  • the nitrilase of Neurospora crassa OR74A preferably, the transaminase derived from Chromobacterium violaceum DSM30191 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence of the mutant of the transaminase is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.1
  • Arginine is mutated to glutamic acid, arginine at position 416 is mutated to threonine, or
  • the amino acid sequence of the mutant aminoase has a mutation site in the amino acid sequence obtained by mutation, and has an amino acid sequence with more than 80% homology with the amino acid sequence obtained by mutation; preferably, the transaminase derived from Arthrobacter citreus has The amino acid sequence shown in SEQ ID NO.2, the amino acid sequence of the mutant of transaminase is the amino acid sequence obtained by mutating the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.2, wherein the mutation includes at least one of the following mutation sites: the third bit, 5th, 60th, 164th, 171st, 178th, 180th, 186th, 187th, 252nd, 370th, 384th, 389th, Positions 404, 411, 423 and 424, and the leucine at position 3 is mutated to serine, the valine at position 5 is mut
  • Phi1 Monooxygenase has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.4, and the amino acid sequence of the mutant of cyclohexanone monooxygenase is the amino acid sequence obtained by mutation of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.4, wherein The mutation includes at least one of the following mutation sites: 280, 435, 436, 438, 441, 508 and 510, and the phenylalanine at position 280 is mutated to tyrosine amino acid, phenylalanine at position 435 is mutated to asparagine, phenylalanine at position 436 is mutated to serine, leucine at position 438 is mutated to alanine, and serine at position 441 is mutated to va amino acid, leucine at position 510 is mutated to valine, or the amino acid sequence of a mutant of cyclohexanone monooxygenase has a mutation site in the amino acid sequence obtained by mutation, and is consistent with the amino acid
  • the above-mentioned PVA membrane-immobilized enzyme further includes the coenzyme and cofactor of each enzyme.
  • the coenzyme and cofactor of each enzyme mentioned above means that if the enzyme has the corresponding coenzyme and cofactor, the coenzyme and cofactor of the enzyme are also embedded in the PVA membrane-immobilized enzyme; if the enzyme has no coenzyme or cofactor, Then there is no redundant coenzyme or cofactor in the PVA membrane-immobilized enzyme.
  • the PVA membrane-immobilized enzyme of the present application can be used not only for purified enzymes, but also for crude enzymes. In order to save procedures, the enzymes are preferably crude enzymes. At the same time, since the immobilization method of the present application is embedding, the amount of enzyme that can be loaded is relatively large, and the preferred loading amount of enzyme is 0.05-0.4g free enzyme/cm 2 membrane or 0.03-0.06g dried cross-linked enzyme aggregates /cm 2 film.
  • the above-mentioned PVA porous membrane also has polyethylene glycol and/or polyethyleneimine, the molecular weight of polyethylene glycol is PEG400 ⁇ PEG 6000, and the molecular weight of polyethyleneimine is 3KDa ⁇ 70KDa, preferably It is 3KDa ⁇ 50KDa. Further, preferably, the mass ratio of the polyethylene glycol to the porous PVA is 5:4 to 75:4, and the mass ratio of the polyethyleneimine to the porous PVA is 1:12 to 1:240.
  • the above polyethylene glycol and polyethylene imine make the pore structure in the PVA porous film more abundant.
  • a preparation method of any of the above-mentioned PVA membrane-immobilized enzymes comprising: step S1, mixing raw materials comprising the enzyme and the PVA solution for a predetermined time to obtain a mixed system Step S2, adding the mixed system into the mold and drying the mixed system to obtain the membrane-embedded enzyme, and the mold is a three-dimensional structured mold to form a three-dimensional structured PVA porous film; and step S3, using phosphate buffer to After the membrane-embedded enzyme is soaked and washed, the PVA membrane-immobilized enzyme is obtained, and the pH value of the mixed system is preferably 6.0-6.5.
  • the preparation method of the present application adopts mixing, drying and post-treatment processes to form the PVA membrane immobilized enzyme.
  • the process is simple and easy to operate, and does not require cross-linking or covalent immobilization with glutaraldehyde, amino groups, and carboxyl groups.
  • the PVA porous membrane in the PVA membrane immobilized enzyme is used as a carrier to immobilize the enzyme in an embedded manner, which has a good immobilization effect on purified enzyme or crude enzyme; and the enzyme is embedded and immobilized in the PVA porous membrane. It is stable and not easy to be leached during use; the porous structure of the PVA porous membrane adopted can better transfer reactants and products, and is suitable for use in continuous flow biochemical catalysis.
  • a three-dimensional structured mold is used to three-dimensionally structure the PVA porous membrane, so that it has a three-dimensional structure, which in turn has more surface area and provides more embedding sites, thus ensuring the high activity and stability of the enzyme. , increasing the enzyme loading.
  • step S1 cannot be used as a limitation on the scope of step S1.
  • the above step S1 includes: preparing an enzyme suspension or enzyme solution, the enzyme in the suspension is a cross-linked enzyme aggregate, and the enzyme in the enzyme solution is a free enzyme for removing cells; Or the enzyme solution and the PVA solution are mixed for a predetermined time to obtain a mixed system. Either the enzyme solution or the enzyme suspension can be mixed with the PVA solution, and mechanical stirring or magnetic stirring can be performed during the mixing process.
  • the above-mentioned PVA solution is a mixed solution including PVA, water, acetic acid, methanol and sulfuric acid, preferably the pH value of the mixed solution is between 5.5 and 6.5.
  • the combination of acetic acid, methanol and sulfuric acid makes the obtained membrane have more micropores.
  • the predetermined time is preferably 2 to 4 hours.
  • the PVA molecular weight of the PVA solution is 20KDa to 200KDa.
  • the preferred content of PVA in the PVA solution is 5 to 30 g/100 mL, preferably 10 to 50 g/100 mL.
  • the enzyme load can be larger, preferably the concentration of the enzyme in the above suspension or enzyme solution is 0.1-0.5g/mL, and the preferred ratio of enzyme to PVA solution is 1-50g /100mL, more preferably 5 to 40g/100mL.
  • the suspension or enzyme solution also contains phosphate buffer, optional cofactor and optional coenzyme, preferably the concentration of cofactor is 1-20 mg/mL, preferably coenzyme and enzyme The weight ratio of 10:1 ⁇ 1:10.
  • the above step S1 includes: mixing the PVA aqueous solution and the cross-linked enzyme particles to form a mixed system.
  • the cross-linked enzyme was mixed with the aqueous PVA solution in the form of dry particles, which facilitated dispersion of the cross-linked enzyme particles.
  • the ratio of the cross-linked enzyme particles to the PVA aqueous solution is preferably 1-50 g/100 mL.
  • the predetermined time is preferably 10 to 60 minutes.
  • the cross-linked enzyme particles comprise the enzyme, optional cofactors and optional coenzymes, if desired.
  • the above step S1 includes: mixing the PVA aqueous solution and the modifier solution for a first predetermined time to form a second mixed system; mixing the second mixed system and the enzyme system for a second predetermined time to form mixed system.
  • the film formation of PVA is promoted by using modifiers and the pore structure in it is enriched.
  • the preferred concentration of the PVA aqueous solution is 5-30 g/100 mL.
  • the modifier used in the present application can be selected from the modifiers commonly used in PVA film formation.
  • the modifier solution comprises a mixed solution dispersed with acetic acid, methanol and sulfuric acid and/or dispersed with acetic acid, methanol and sulfuric acid.
  • the polyethylene glycol aqueous solution of the cofactor and/or the polyethyleneimine aqueous solution dispersed with the cofactor wherein the content of acetic acid in the mixed solution is preferably 2 to 4 g/100 mL, the content of methanol is 5 to 9 g/100 mL, and the content of sulfuric acid is preferably 2 to 4 g/100 mL.
  • the content is 0.5 ⁇ 1g/100mL; the preferred molecular weight of polyethylene glycol is PEG400 ⁇ PEG 6000, the preferred concentration of polyethylene glycol in the mixed system is 3 ⁇ 10g/100mL; the preferred molecular weight of polyethyleneimine is 3KDa ⁇ 70KDa, It is more preferably 3KDa to 50KDa, and the concentration of polyethyleneimine in the mixed system is preferably 0.1 to 1 g/100 mL, more preferably 0.1 to 0.3 g/100 mL.
  • the above-mentioned enzyme system can be a commonly used system form for currently supplying enzymes.
  • the enzyme system includes enzyme, optional auxiliary.
  • Factors, optional coenzymes and phosphate buffer, preferably the enzymes are free enzymes that remove cells or aggregates of cross-linked enzyme aggregates.
  • the concentration of the cofactor is 1-20 mg/mL
  • the weight ratio of the coenzyme to the enzyme in the enzyme system is preferably 10:1 to 1:10
  • the ratio of the enzyme to the PVA solution is The ratio is 1 ⁇ 50g/100mL.
  • step S2 includes: placing the mixed system in the mold for a third predetermined time and then adding a dehydration accelerator to the mold for drying.
  • the dehydration accelerator is selected from any one or more of the group consisting of acetonitrile, ethanol and acetone, and the volume ratio of the dehydration accelerator to the mixed system is preferably 1:10 to 5:1.
  • the enzyme was embedded in the formed PVA porous film to form a stable immobilized enzyme structure.
  • the third predetermined time is preferably 2-4 hours.
  • the three-dimensional structured mold has protrusions or grooves.
  • step S3 includes: soaking the membrane-embedded enzyme in phosphate buffer for 2 to 16 hours, and then washing the membrane-embedded enzyme with fresh phosphate buffer, The PVA membrane-immobilized enzyme was obtained.
  • the enzyme used may be a purified enzyme or a crude enzyme.
  • the above-mentioned enzyme is preferably a crude enzyme.
  • the PVA membrane-immobilized enzyme obtained in this application can be further resuspended in buffer, and modified by adding glutaraldehyde, so that the enzyme molecules can be cross-linked through covalent bonding between amino groups and aldehyde groups of glutaraldehyde to form larger
  • the aggregates will not leak from the PVA membrane, and the enzymes attached to the surface of the PVA membrane can also be covalently linked to PVA through the arm action of glutaraldehyde, thereby being more firmly immobilized and increasing the number of times of use.
  • the amount of glutaraldehyde used is 1-2 g/100 mL of suspension.
  • amino acid sequence of TA-Cv transaminase is SEQ ID NO.1:
  • the mutation site and amino acid mutation of mutant 1 are: R416T+T7C+S47C+Q380L; the mutation site and amino acid mutation of mutant 2 (TA-Cv-V2) are: R416T +T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L.
  • amino acid sequence of TA-Ac transaminase is SEQ ID NO.2:
  • the mutation site and amino acid mutation of its mutant 1 are: L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q+E171D ;
  • the mutation site and amino acid mutation of mutant 2 are: L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+E424Q+M423K .
  • amino acid sequence of KRED-Ac ketoreductase is SEQ ID NO.3:
  • mutant 1 The mutation site and amino acid mutation of mutant 1 (KRED-Ac-V1) are: E144S+A94N+N156V; the mutation site and amino acid mutation of mutant 2 (KRED-Ac-V2) are: E144S+A94T +N156T.
  • amino acid sequence of CHMO-Rs cyclohexanone monooxygenase is SEQ ID NO.4:
  • the mutation site and amino acid mutation of its mutant 1 are: F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V; the mutation site of mutant 2 (CHMO-Rs-Cv-V2)
  • the point and amino acid mutations are: F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V.
  • amino acid sequence of CHMO-Rr cyclohexanone monooxygenase is SEQ ID NO.5:
  • the mutation sites and amino acid mutations of its mutant 1 are: P190L+Y559M+C249V+C393V+C257A+M45T; the mutation sites and amino acid mutations of mutant 2 (CHMO-Rr-V2) The situation is: Y559M+P190L+P504V.
  • Phosphate buffer (PB) used in the following examples is disodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phosphate buffer.
  • PVA I solution 50 mL of 10% (w/v) PVA (200 KDa) was mixed with 30 mL of 10% (w/v) acetic acid, 50% (v/v) methanol, 10% (w/v) sulfuric acid.
  • PVA membrane encapsulation The pH of the PVA I solution was adjusted to 6.0, and 20 mL of the solution was taken out and mixed with the suspension of TA-CV cross-linking enzyme aggregates (CLEA) (the suspension of TA-CV cross-linking enzyme aggregates CLEA).
  • CLSA TA-CV cross-linking enzyme aggregates
  • the cross-linking enzyme consisting of 0.5 g of TA-CV was stirred for 20 min in 2 ml of 0.1 M phosphate buffer (PB) pH 7.0, and containing 2 mg of PLP (pyrrole aldehyde phosphate) per ml for 20 min to form a mixed system.
  • PB phosphate buffer
  • PLP pyrrole aldehyde phosphate
  • the 3D porous silica gel template in the above Example 1 was replaced with a high temperature-resistant silica gel disk to form a flat PVA membrane-embedded enzyme, and the bottom area of the silica gel disk was 80 square centimeters.
  • R 1 and R 2 in the above reaction formula can be independently selected from H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted hetero Cycloyl, substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, R 1 and R 2 may be connected to form a ring.
  • ketone base 1 Take 0.1 g of ketone base 1, dissolve it in 0.35 mL of methanol, add 3.0 molar equivalents of isopropylamine hydrochloride as an amino donor, add 5 mg of PLP to the reaction system, and then dilute with 0.3 mL of 0.1M PB 7.0 to form the reaction system.
  • 3 mg of TA-CV CLEA or the three-dimensional structured PVA membrane-immobilized enzyme of Example 1 containing 3 mg of TA-CV CLEA or the planar PVA membrane-immobilized enzyme of Comparative Example 1 containing 3 mg of TA-CV CLEA were used as catalysts. After reacting at 30°C for 20 hours, the conversion rate was detected by HPLC method. After each round of reaction, the immobilized enzyme was separated and reused in the next round of reaction. , recorded in Table 2.
  • PVA membrane embedding Take 30mL of PVA solution, add 3g of CLEA wet particles, and 50mg of PLP, stir evenly to form a mixed system, pour it into a 3D porous silica gel template, the bullet holes in each template are circular, and the volume is about 0.15 ⁇ 0.2 cubic centimeter, the bullet hole surface area is about 3-5 square centimeters, and dried at 37°C to obtain the membrane-embedded enzyme. Soak the membrane-embedded enzyme in 0.1M PB7.0 buffer overnight, take out the membrane-embedded enzyme from the buffer, and then wash the membrane-embedded enzyme twice with 0.1M PB7.0 buffer to obtain the implementation of PVA membrane immobilized enzyme of Example 2.
  • ketone base 1 dissolves it in 0.35 mL of methanol, add 3.0 molar equivalents of isopropylamine hydrochloride as an amino donor, add 5 mg of PLP to the reaction system, and then dilute with 0.3 mL of 0.1M PB 7.0 to form a system to be reacted.
  • Each PVA membrane-immobilized enzyme of Example 2 embedded with 6 mg of TA-Cv CLEA with a specific surface area of about 6 square centimeters was cut and used as a catalyst, and parallel reactions were performed without adding PLP. After 4 hours of reaction at 30 °C, the conversion rate was detected by HPLC. Each round of reaction was 20 hours. After one round of reaction, the immobilized enzyme was separated and reused in the next round of reaction. figure 1.
  • PVA-Organic solvent membrane-embedded immobilized TA-CV wet cell free enzyme or TA-CV CLEA PVA-Organic solvent membrane-embedded immobilized TA-CV wet cell free enzyme or TA-CV CLEA:
  • ketone base 1 Take out 0.1 g of ketone base 1, dissolve it in 0.35 mL of methanol, add 3.0 molar equivalents of isopropylamine as the amino donor, add 5 mg of PLP to the reaction system, and then dilute with 0.3 mL of 0.1M PB 7.0 to form the reaction system.
  • the PVA membrane-immobilized enzyme made of embedded TA-CV wet cells or CLEA with a specific surface area of about 6 cm2 was used as a catalyst. After 20 hours of reaction at 30 °C, the conversion rate was detected by HPLC. After each round of reaction, the immobilized enzyme was separated and reused in the next round of reaction. The number of repeated uses was investigated. The test results are shown in Table 6 and Figure 2 .
  • the conversion can still reach 98% after 20 hours of reaction, and it is stable without losing activity after 10 cycles of use.
  • PVA membrane-immobilized enzyme with a specific surface area of about 6 square centimeters embedded TA-CV free enzyme (dried with acetonitrile), embedded TA with a specific surface area of about 6 square centimeters - PVA membrane immobilized enzyme of CV free enzyme (dried in acetonitrile and modified with glutaraldehyde) was used as catalyst. After 20 hours of reaction at 30 °C and repeated 10 cycles, the conversion rate of the reaction for 20 hours was detected by HPLC. After each round of reaction, the immobilized enzyme was separated and reused in the next round of reaction. The results are shown in Table 7.
  • PVA solution prepare a 12% (w/v) solution in water
  • Cofactor-polymer solution Dissolve 2% w/v PEI (polyethyleneimine) (3KDa-70KDa), add 5mg/mL cofactor (PLP) and mix at room temperature for 0.5-3 hours.
  • ketone base 1 Take out 0.1 g of ketone base 1, dissolve it in 0.35 mL of methanol, add 3.0 molar equivalents of isopropylamine as the amino donor, add 5 mg of PLP to the reaction system, and then dilute with 0.3 mL of 0.1M PB 7.0 to form the reaction system.
  • TA-Cv-V2 3 0.1 >35% 17 TA-Cv-V2 3 0.5 >35% 16 TA-Cv-V2 3 0.8 >35% 16 TA-Cv-V2 3 1 >35% 15 TA-Cv-V2 60 0.05 >35% 15 TA-Cv-V2 60 0.3 >35% 18 TA-Cv-V2 60 0.5 >35% 18 TA-Cv-V2 60 1 >35% 14 TA-Cv-V2 60 2 >35% 10
  • PVA solution make a 12% w/v solution in water
  • CFP solution Prepare a 2% w/v PEI (3KDa-70KDa) solution in water, add 5 mg/mL cofactor (PLP), and mix at room temperature for 0.5-3 hours.
  • 3g of TA-CV CLEA was suspended in 10mL of CFP solution, and fully mixed with 30mL of PVA solution to form a mixed system. Then, the mixed system was poured into the porous silica gel template, and dried at 37°C to form membrane-embedded enzymes.
  • the single hole in each template was round or square, with a volume of about 0.15-0.2 cubic centimeters, and a single-hole surface area of about 3- 5 square centimeters. Soak membrane-embedded enzymes in 0.1M PB 7.0 buffer overnight. The membrane-embedded enzyme was taken out of the buffer, and then washed twice with 0.1M PB 7.0 to obtain the PVA membrane-embedded immobilized enzyme of Example 6.
  • PVA solution make a 12% w/v solution in water
  • CFP solution Prepare a 2% w/v PEI (3KDa-70KDa) solution in water, add 5 mg/mL cofactor (PLP), and mix at room temperature for 0.5-3 hours.
  • Test in aqueous buffer system take 0.1 g of ketone matrix 2 and suspend in 1 mL of 0.1 M PB 7.0 buffer, add 3.0 molar equivalents of isopropylamine hydrochloride as amino donor, add 5 mg of PLP to the reaction system, will contain 10 mg of The PVA membrane-embedded immobilized enzyme of Example 7 of TA-Ac free enzyme was used as a catalyst. After 20 hours of reaction at 30°C, the reaction was repeated for 5 cycles, and the conversion rate was detected by HPLC. After each round of reaction, the immobilized enzyme was separated and reused in the next round of reaction. 10.
  • Test in biphasic system take 0.1 g of ketone base 2 and dissolve it in 1 mL of MTBE as non-aqueous phase, add 1 mL of 0.1 M PB 7.0 as aqueous phase, add 3.0 molar equivalents of isopropylamine as amino donor, and add 1 mL of 0.1 M PB 7.0 as aqueous phase to the reaction system.
  • 5mg PLP was added to form the system to be reacted, and the PVA membrane-immobilized enzyme of Example 7 containing 10mg TA-Ac free enzyme was used as a catalyst. After 20 hours of reaction at 30°C, the reaction was repeated for 5 cycles, and the conversion rate was detected by HPLC. After each round of reaction, the immobilized enzyme was separated and reused in the next round of reaction. 10.
  • PVA solution make a 12% (w/v) solution in water
  • CFP solution Prepare 2% (w/v) PEI (3KDa ⁇ 70KDa) dissolved in water, add 5mg/mL cofactor (NAD+ or PLP) as appropriate, and mix for 0.5 ⁇ 3 hours at room temperature.
  • R1 and R2 in the above reaction formula can be independently selected from H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted heterocyclyl , substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, or R1 and R2 may be linked to form a ring.
  • KRFD-Ac PLP enzyme cofactor Cofactor concentration (mg/mL) Conversion rates(%) Cycles KRFD-Ac PLP 0.5 >99% 12 KRFD-Ac PLP 1 >99% 14 KRED-Ac PLP 5 >99% 14 KRED-Ac PLP 10 >99% 14 KRED-Ac PLP 20 >99% 14
  • KRFD-Ac PLP 30 >99% 14 KRED-Ac NAD 0.5 >99% 8 KRED-Ac NAD 1 >99% 10 KRED-Ac NAD 5 >99% 14 KRED-Ac NAD 10 >99% 15 KRED-Ac NAD 20 >99% 15 KRED-Ac NAD 30 >99% 15 KFRD-Ac-V1 PLP 5 >99% 18 KERD-Ac-V1 PLP 10 >99% 18 KERD-Ac-V1 NAD 5 >99% 15 KERD-Ac-V1 NAD 10 >99% 17
  • co-cross-linking enzyme of immobilized transaminase TA-Bt and its coenzymes LDH and FDH is embedded in PVA membrane, and the co-cross-linking enzyme of transaminase TA-Bt and its co-enzymes LDH and FDH is hereinafter referred to as co-cross-linking enzyme.
  • PVAI solution 50 mL of 10% (w/v) PVA (200 KDa) was mixed with 30 mL of 10% (w/v) acetic acid, 50% (v/v) methanol, 10% (w/v) sulfuric acid.
  • PVA membrane encapsulation adjust the pH of the PVA I solution to 4-6.5, take out 20 mL of the solution, and mix it with the suspension of the co-cross-linking enzyme (the composition of the suspension of the co-cross-linking enzyme is 0.5 g of TA-Bt, LDH and The co-crosslinking enzyme of FDH was stirred for 20 min in 2 ml of 0.1 M phosphate buffer (PB) pH 7.0, and each ml contained 2 mg PLP (pyrrole aldehyde phosphate) to form a mixed system.
  • PB phosphate buffer
  • R in the above reaction formula can be selected from H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted heterocyclyl, substituted or unsubstituted Heterocycloalkyl, halogen.
  • PVA (200KDa) solution prepare a 12% (w/v) solution in water
  • CFP solution prepare a 2% (w/v) PEI (3KDa-70KDa) aqueous solution, add 5 mg/mL cofactor (PLP), and mix at room temperature for 0.5-3 hours.
  • the immobilization method is the same as in Example 10, except that the PVA-encapsulated enzyme is changed to cyclohexanone monooxygenase CHMO-Rs or CHMO-Bp, or cyclohexanone monooxygenase CHMO and its coenzyme alcohol dehydrogenase ADH -Tb or glucose dehydrogenase GDH mixed enzyme, the specific enzyme composition is shown in Table 14.
  • R in the above reaction formula can be selected from H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted Heterocyclyl, substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, or R forms a fused ring system with the heterocycle to which it is attached.
  • the activity of the PVA-CFP membrane-immobilized enzyme of CHMO was detected by reacting with the following substrates 6:
  • R1 and R2 in the above reaction formula can be independently selected from H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted heterocyclyl , a substituted or unsubstituted heterocyclic group, or R1 and R 2 form a ring.
  • the immobilization method is the same as that of Example 10, except that the PVA-encapsulated enzyme is changed to imine reductase IRED-Str or IRED-Bc, or it can be the combination of ene reductase and its coenzyme glucose dehydrogenase GDH or ammonium formate dehydrogenase FDH.
  • R1 and R2 in the above reaction formula can be independently selected from H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted aralkyl, A substituted or unsubstituted heterocyclic group, a substituted or unsubstituted heterocycloalkyl group, or R1 and R2 form a fused ring system with the heterocyclic or aromatic ring to which they are attached.
  • IRED's PVA-CFP membrane-immobilized enzyme was tested using the following substrates8 and as follows:
  • PVA-CFP membrane immobilized enzymes of IRED and GDH were tested by the following methods:
  • the immobilization method is the same as in Example 10, except that the PVA-encapsulated enzyme is changed to the enzyme solution of nitrilase NIT-An or NIT-Nc (enzyme concentration 0.1 g/mL) or the cross-linking enzyme of NIT-An or NIT-Nc Aggregate suspension (0.5 g/mL).
  • the immobilization method was the same as in Example 10, except that the PVA-encapsulated enzyme was changed to ammonia lyase PAL-An or PAL-Ss.
  • the immobilization method is the same as in Example 10, except that the PVA-encapsulated enzyme is changed to amino acid dehydrogenase AADH-Bc or AADH-Bs, or amino acid dehydrogenase and its coenzyme glucose dehydrogenase GDH or ammonium formate dehydrogenase FDH
  • R is substituted or unsubstituted aryl.
  • the activity detection method of AADH and FDH co-immobilized enzyme is as follows:
  • the activity detection method of PVA-CFP membrane immobilized enzyme of AADH and GDH is as follows:
  • the PVA porous membrane is used as a carrier to immobilize the enzyme by embedding.
  • the process of embedding and immobilization is simple and the conditions are mild, and it has a good immobilization effect on purified enzyme or crude enzyme. It is relatively stable in the PVA porous film and is not easy to be leached during use; the porous structure of the PVA porous film used can better transfer reactants and products, and is suitable for continuous flow biochemical catalysis. Since the above-mentioned embedding and immobilization are mechanical immobilization, they are widely applicable to enzymes.
  • the PVA porous membrane is three-dimensionally structured to have a three-dimensional structure, which in turn has more surface area and provides more embedding sites, thereby improving the enzyme's high activity and stability on the basis of ensuring the high activity and stability of the enzyme. load.

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Abstract

提供了一种PVA膜固定化酶及其制备方法。该PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在PVA多孔膜上的酶，PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、醇脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶及它们的突变体中的任意一种。采用三维结构化PVA多孔膜作为载体将酶以包埋的方式固定化，包埋固定化的流程简单、条件温和、比表面积大，酶被包埋固定化在PVA多孔膜中后比较稳定，不容易在使用过程中浸出；所采用的PVA多孔膜的多孔结构能够更好地传递反应物和产物，适用于连续流动生化催化中使用，对酶具有广适性。

Description

PVA膜固定化酶及其制备方法 技术领域
本发明涉及酶固定化技术领域，具体而言，涉及一种PVA膜固定化酶及其制备方法。
背景技术
生物催化正在成为化学品、中间体、精细化学品和最终药物分子制造计划的组成部分。然而，随着工艺需求的不断扩大，酶应用的效率和经济性变得不可避免。因此，这不仅需要增强酶活性、特异性和生产力，还需要提高保质期和可回收性，特别是为了促进商业规模应用的经济可行性。
酶固定平台为生产过程中适宜地整合酶提供了一种优秀的工具。多年来，已经评估了几种天然和合成载体对的酶固定效率，比如每个平台都根据其应用、经济和优势进行了专门评估。固定化生物催化剂在有机合成、污染控制和以诊断为目的等领域具有广泛的应用(Enzyme Microb Technol，31,171-8；J Pharm Sci，89,979-90)。
通过将酶固定到固体载体上或固体载体内来实现固定化，由此获得非均相固定化酶系统。酶可以通过多种方法固定，包括物理方式(载体和酶之间存在微弱的相互作用)以及化学方式(载体与酶形成共价键)(Analyst，133,697-701；Chem Soc Rev，40,2567-92；柏林海德堡：Springer，95-126。)或两者的组合，从而包含各种功能活性的载体。
酶的物理固定方法包括在膜或膜反应器内、在水不溶性基质上的吸附(物理，离子)比如在中孔材料上吸附、包含(或凝胶包埋)、用固体膜微囊化、用液膜微囊化、酶促Langmuir-Blodgett膜的形成(Anal Chem，1994；66,1120A-7A)等。在膜包埋或包封的情况下，所得的酶催化剂取决于膜支持物的性质，例如亲水性、疏水性、反应性官能团密度、孔隙率、孔径分布、膜厚度、反应器配置等。固定化的固定方法基于酶在膜内的定位，其目的是除了在操作条件下高度稳定之外还实现酶的更高表达。
目前，采用多孔膜固定化酶的研究有很多，但是，由于不同酶的结构和活性位点的不同，导致其固定化方法也有不同，比如在采用PVA膜(聚乙烯醇膜)固定脂肪酶时需要采用戊二醛进行交联，才能达到利用固定化改善脂肪酶稳定性和活性的目的。另外，在利用多孔膜固定化木聚糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、β-半乳糖苷酶和抗坏血酸氧化酶等酶类时，通常也利用氨基、羧基、巯基、羟基、咪唑或酚基等基团将多孔膜和酶通过共价键进行结合。由此可见，现有技术中采用交联剂固定化酶时需要采用高纯度酶，导致固定化方法复杂、酶的负载量受限。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种PVA膜固定化酶及其制备方法，以解决现有技术中采用多孔膜固定化酶工艺复杂的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种PVA膜固定化酶，该PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在PVA多孔膜上的酶，PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、醇脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶及它们的突变体中的任意一种。
进一步地，上述酶为游离酶或交联酶聚集体。
进一步地，上述转氨酶为来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或来源于B.thuringiensis的转氨酶，酮还原酶为来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶，或者来源于Candida macedoniensis AKU4588的酮还原酶；环己酮单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶；氨裂解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶；烯还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶和来源于Chryseobacterium sp.CA49的烯还原酶；亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp的亚胺还原酶和Bacillus cereus的亚胺还原酶；氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶和来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；腈水解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurospora crassa OR74A的腈水解酶。
进一步地，上述来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第7位、第47位、第90位、第95位、第297位、第304位、第380位、第405位和第416位，且第7位的苏氨酸突变为半胱氨酸，第47位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第90位的赖氨酸突变为甘氨酸，第95位的丙氨酸突变为脯氨酸，第297位的异亮氨酸突变为亮氨酸，第304位的赖氨酸突变为天冬氨酸，第380位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第405位的精氨酸突变为谷氨酸，第416位的精氨酸突变为苏氨酸，或者转氨酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，上述来源于Arthrobacter citreus的转氨酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第3位、第5位、第60位、第164位、第171位、第178位、第180位、第186位、第187位、第252位、第370位、第384位、第389位、第404位、第411位、第423位和第424位，且第3位的亮氨酸突变为丝氨酸，第5位的缬氨酸突变为丝氨酸，第60位的半胱氨酸突变为酪氨酸，第164位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，第171位的谷氨酸突变为天冬氨酸，第178位的丙氨酸突变为亮氨酸，第180位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第186位的丝氨酸突变为甘氨酸，第187位的丝氨酸突变为丙氨酸，第252位的 缬氨酸突变为异亮氨酸，第370位的亮氨酸突变为丙氨酸，第384位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第389位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，第404位的亮氨酸突变为谷氨酰胺，第411位的甘氨酸突变为天冬氨酸，第423位的甲硫氨酸突变为赖氨酸，第424位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，或者转氨酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，上述来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，酮还原酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第94位、第144位和第156位，且第94位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第144位的谷氨酸突变为丝氨酸，第156位的天冬酰胺突变为苏氨酸或缬氨酸，或者酮还原酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，上述来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，上述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第280位、第435位、第436位、第438位、第441位、第508位和第510位，且第280位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第435位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第436位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，第438位的亮氨酸突变为丙氨酸，第441位的丝氨酸突变为缬氨酸，第510位的亮氨酸突变为缬氨酸，或者环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，上述来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第45位、第190位、第249位、第257位、第393位、第504位和第559位，且第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸，第190位的脯氨酸突变为亮氨酸，第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第504位的脯氨酸突变为缬氨酸，第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸，或者环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，上述PVA膜固定化酶还包括每种酶的辅酶和辅因子，辅酶和辅因子包埋在PVA多孔膜上。
进一步地，上述PVA多孔膜上还具有聚乙二醇和/或聚乙烯亚胺，聚乙二醇的分子量为PEG400～PEG 6000，聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa。
进一步地，上述聚乙二醇与PVA多孔的质量比为5:4～75:4，聚乙烯亚胺与PVA多孔的质量比为1:12～1:240。
进一步地，上述酶为粗酶。
进一步地，上述酶的负载量为0.05～0.4g游离酶/cm 2膜或0.03～0.06g干燥的交联酶聚集体/cm 2膜。
根据本发明的又一方面，提供了一种上述任一种的PVA膜固定化酶的制备方法，制备方法包括：步骤S1，将包含酶与PVA溶液的原料混合预定时间，得到混合体系；步骤S2，将混合体系加入到模具中并对混合体系进行干燥处理，得到膜包埋的酶，模具为三维结构化模具以形成三维结构化PVA多孔膜；以及步骤S3，利用磷酸缓冲液对膜包埋的酶进行浸泡处理和洗涤后，得到PVA膜固定化酶。
进一步地，上述混合体系的pH值为6.0～6.5。
进一步地，上述步骤S1包括：配制酶的悬浮液或酶溶液，悬浮液中的酶为交联酶聚集体，酶溶液中的酶为去除细胞的游离酶；将悬浮液或酶溶液与PVA溶液混合预定时间，得到混合体系。
进一步地，上述预定时间为10～60分钟；PVA溶液的PVA分子量为20KDa～200KDa。
进一步地，上述PVA溶液中PVA的含量为10～50g/100mL。
进一步地，上述PVA溶液中分散有乙酸、甲醇及硫酸。
进一步地，上述PVA溶液的pH值在5.5～6.5之间。
进一步地，上述酶与PVA溶液的比例为1～50g/100mL。
进一步地，上述悬浮液或酶溶液还包含磷酸缓冲液、可选的辅因子和可选的辅酶。
进一步地，上述辅酶与酶的重量比例为10:1～1:10。
进一步地，上述步骤S1包括：将PVA水溶液、交联酶颗粒进行混合，形成混合体系。
进一步地，上述交联酶颗粒与PVA水溶液的比例为1～50g/100mL。
进一步地，上述预定时间为10～60分钟。
进一步地，上述交联酶颗粒包括酶、可选的辅因子和可选的辅酶。
进一步地，上述步骤S1包括：将PVA水溶液、修饰剂溶液进行混合第一预定时间，形成第二混合体系；将第二混合体系与酶体系混合第二预定时间，形成混合体系。
进一步地，上述PVA水溶液的浓度为5～30g/100mL，优选修饰剂溶液包括分散有辅因子的聚乙二醇水溶液和/或分散有辅因子的聚乙烯亚胺水溶液。
进一步地，上述聚乙二醇的分子量为PEG400～PEG 6000、混合体系中聚乙二醇的浓度为3～10g/100mL。
进一步地，上述聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa，更优选为3KDa～50KDa。
进一步地，上述混合体系中聚乙烯亚胺的浓度为0.1～1g/100mL，更优选为0.1～0.3g/100mL。
进一步地，上述酶体系包括酶、可选的辅因子、可选的辅酶和磷酸缓冲液。
进一步地，上述酶为去除细胞的游离酶或交联酶聚集体聚集体。
进一步地，上述酶体系中辅因子浓度为1～20mg/mL。
进一步地，上述酶体系中辅酶与酶的重量比例为10：1～1：10。
进一步地，上述酶与PVA溶液的比例为1～50g/100mL。
进一步地，上述步骤S2包括：将混合体系置于模具中静置第三预定时间后向模具中加入脱水促进剂进行干燥处理，其中脱水促进剂选自乙腈、乙醇和丙酮组成的组中的任意一种或多种。
进一步地，上述脱水促进剂与混合体系的体积比例为1：10～5：1。
进一步地，上述第三预定时间为2～4小时。
进一步地，上述模具为三维结构化模具，三维结构化模具具有突起或凹槽。
进一步地，上述步骤S3包括：将膜包埋的酶在磷酸缓冲液中浸泡2～16小时后利用新鲜的磷酸缓冲液洗涤膜包埋的酶，得到PVA膜固定化酶。
应用本发明的技术方案，采用PVA多孔膜作为载体将酶以包埋的方式固定化，包埋固定化的流程简单、条件温和，对纯化酶或粗酶均具有良好的固定化效果，且酶被包埋固定化在PVA多孔膜中后比较稳定，不容易在使用过程中浸出；所采用的PVA多孔膜的多孔结构能够更好地传递反应物和产物，适用于连续流动生化催化中使用。由于上述包埋固定为机械固定，因此对酶具有广适性。将PVA多孔膜进行三维结构化，使其具有立体结构，进而具有更多的表面积，提供更多的包埋位点，进而在保证了酶的高活性和稳定性的基础上，提高了酶的负载量。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例2的PVA膜固定化酶在添加PLP和没有添加PLP时的稳定性曲线；
图2示出了根据本发明实施例3的两种PVA膜固定化酶的稳定性曲线；
图3示出了根据本发明实施例5的PVA膜固定化酶在添加PLP和没有添加PLP时的稳定性曲线；
图4示出了根据本发明实施例6的PVA膜固定化酶在添加PLP和没有添加PLP时的稳定性曲线；
图5示出了根据本发明实施例8的PVA膜固定化酶在添加PLP和添加NAD +时的稳定性曲线；
图6示出了根据本发明实施例8的PVA膜固定化酶在添加PLP和添加NAD +时的稳定性曲线；
图7示出了根据本发明实施例9的PVA膜固定化酶在添加PLP和没有添加PLP时的稳定性曲线。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
如本申请背景技术所分析的，现有技术中采用多孔膜固定化酶的工艺复杂，为了解决该问题，本申请提供了一种PVA膜固定化酶及其制备方法。
在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种PVA膜固定化酶，该PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在PVA多孔膜上的酶，PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，酶选自转氨酶(比如ω-转氨酶)、D-乳酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、羰基还原酶、环己酮单加氧酶、烯酮还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶及它们的突变体中的任意一种。
本申请采用PVA多孔膜作为载体将酶以包埋的方式固定化，包埋固定化的流程简单、条件温和，对纯化酶或粗酶均具有良好的固定化效果，且酶被包埋固定化在PVA多孔膜中后，相对于在平面PVA膜中的固定，更为稳定，不容易在使用过程中浸出；所采用的PVA多孔膜的多孔结构能够更好地传递反应物和产物，适用于连续流动生化催化中使用。由于上述包埋固定为机械固定，因此对酶具有广适性。将PVA多孔膜进行三维结构化，使其具有立体结构，进而具有更多的表面积，提供更多的包埋位点，进而在保证了酶的高活性和稳定性的基础上，提高了酶的负载量。
本申请的PVA膜固定化酶所包埋的酶可以为游离酶也可以为交联酶聚集体，无论是游离酶还是交联酶聚集体在包埋后其催化效果均可以有效发挥。
所谓的交联酶聚集体与现有技术中相似，都是为：游离酶用硫酸铵或乙醇，乙腈，丙酮，丙醇、PEG等沉淀剂沉淀后，加入戊二醛，乙二醛或醛基化右旋糖苷等双功能试剂进行共价交联，得到的不溶性酶聚集体。
如前，本申请的PVA膜固定化酶对酶具有广适性，其中对以下酶类更为适用，转氨酶为来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或来源于B.thuringiensis的转氨酶，酮还原酶为来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061 的酮还原酶，或者来源于Candida macedoniensis AKU4588的酮还原酶；环己酮单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶；氨裂解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶；烯还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶和来源于Chryseobacterium sp.CA49的烯还原酶；亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp的亚胺还原酶和Bacillus cereus的亚胺还原酶；氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶和来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；腈水解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurospora crassa OR74A的腈水解酶，优选地，来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第7位、第47位、第90位、第95位、第297位、第304位、第380位、第405位和第416位，且第7位的苏氨酸突变为半胱氨酸，第47位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第90位的赖氨酸突变为甘氨酸，第95位的丙氨酸突变为脯氨酸，第297位的异亮氨酸突变为亮氨酸，第304位的赖氨酸突变为天冬氨酸，第380位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第405位的精氨酸突变为谷氨酸，第416位的精氨酸突变为苏氨酸，或者转氨酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列；优选地，来源于Arthrobacter citreus的转氨酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第3位、第5位、第60位、第164位、第171位、第178位、第180位、第186位、第187位、第252位、第370位、第384位、第389位、第404位、第411位、第423位和第424位，且第3位的亮氨酸突变为丝氨酸，第5位的缬氨酸突变为丝氨酸，第60位的半胱氨酸突变为酪氨酸，第164位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，第171位的谷氨酸突变为天冬氨酸，第178位的丙氨酸突变为亮氨酸，第180位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第186位的丝氨酸突变为甘氨酸，第187位的丝氨酸突变为丙氨酸，第252位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第370位的亮氨酸突变为丙氨酸，第384位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第389位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，第404位的亮氨酸突变为谷氨酰胺，第411位的甘氨酸突变为天冬氨酸，第423位的甲硫氨酸突变为赖氨酸，第424位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，或者转氨酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列；优选地，来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，酮还原酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第94位、第144位和第156位，且第94位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第144位的谷氨酸突变为丝氨酸，第156位的天冬酰胺突变为苏氨酸或缬氨酸，或者酮还原酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列；优选地，来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第280 位、第435位、第436位、第438位、第441位、第508位和第510位，且第280位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第435位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第436位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，第438位的亮氨酸突变为丙氨酸，第441位的丝氨酸突变为缬氨酸，第510位的亮氨酸突变为缬氨酸，或者环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列；优选地，来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第45位、第190位、第249位、第257位、第393位、第504位和第559位，且第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸，第190位的脯氨酸突变为亮氨酸，第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第504位的脯氨酸突变为缬氨酸，第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸，或者环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
为了提高PVA膜固定化酶的催化效率，优选上述PVA膜固定化酶还包括每种酶的辅酶和辅因子。上述每种酶的辅酶和辅因子表示，如果该酶具有相应的辅酶和辅因子，则PVA膜固定化酶中还包埋有该酶的辅酶和辅因子；如果该酶没有辅酶或辅因子，则PVA膜固定化酶中不设置多余的辅酶或辅因子。
本申请的PVA膜固定化酶不仅可以适用于纯化酶，而且还适用于粗酶，为了节约程序，优选该酶为粗酶。同时，由于本申请的固定化方式为包埋，因此能够负载的酶量较多，优选酶的负载量为0.05～0.4g游离酶/cm 2膜或0.03～0.06g干燥的交联酶聚集体/cm 2膜。
在另一种实施例中，上述PVA多孔膜上还具有聚乙二醇和/或聚乙烯亚胺，聚乙二醇的分子量为PEG400～PEG 6000，聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa，优选为3KDa～50KDa。进一步地，优选上述聚乙二醇与PVA多孔的质量比为5:4～75:4，聚乙烯亚胺与PVA多孔的质量比为1:12～1:240。上述聚乙二醇、聚乙烯亚胺使得PVA多孔膜中的孔结构更为丰富。
在本申请另一种典型的实施方式中，提供了上述任一种PVA膜固定化酶的制备方法，该制备方法包括：步骤S1，将包含酶与PVA溶液的原料混合预定时间，得到混合体系；步骤S2，将混合体系加入到模具中并对混合体系进行干燥处理，得到膜包埋的酶，模具为三维结构化模具以形成三维结构化PVA多孔膜；以及步骤S3，利用磷酸缓冲液对膜包埋的酶进行浸泡处理和洗涤后，得到PVA膜固定化酶，优选混合体系的pH值为6.0～6.5。
本申请的制备方法采用混合、干燥和后处理工艺即可形成PVA膜固定化酶，过程简单、易于操作，不需要采用戊二醛、氨基、羧基等进行交联或共价固定，所形成的PVA膜固定化酶中的PVA多孔膜作为载体将酶以包埋的方式固定化，对纯化酶或粗酶均具有良好的固定化效果；且酶被包埋固定化在PVA多孔膜中后比较稳定，不容易在使用过程中浸出；所采用的PVA多孔膜的多孔结构能够更好地传递反应物和产物，适用于连续流动生化催化中使用。由于上述包埋固定为机械固定，因此对酶具有广适性。采用三维结构化模具以将PVA多孔膜进 行三维结构化，使其具有立体结构，进而具有更多的表面积，提供更多的包埋位点，进而在保证了酶的高活性和稳定性的基础上，提高了酶的负载量。
上述形成混合体系的方式可以根据提供酶的形式不同而有所变化，以下提供几种优选的混合体系的形成方式，以下对步骤S1的描述不能作为对步骤S1的范围限定。
在本申请一种实施例中，上述步骤S1包括：配制酶的悬浮液或酶溶液，悬浮液中的酶为交联酶聚集体，酶溶液中的酶为去除细胞的游离酶；将悬浮液或酶溶液与PVA溶液混合预定时间，得到混合体系。无论是酶溶液还是酶的悬浮液，均可与PVA溶液进行混合，其中混合过程中可以进行机械搅拌或磁力搅拌。
上述PVA溶液为包括PVA、水、乙酸、甲醇和硫酸的混合溶液，优选混合溶液的pH值在5.5～6.5之间，乙酸，甲醇和硫酸组合起来使得制得的膜具有更多的微孔。
为了提高酶在PVA溶液中分散的均匀性，优选上述预定时间为2～4小时。
为了形成机械强度更可靠的凝胶薄膜，PVA溶液的PVA分子量为20KDa～200KDa，另外为了进一步形成丰富孔隙率的PVA多孔膜并且有利于酶在其中的分散，优选PVA溶液的中PVA的含量为5～30g/100mL，优选为10～50g/100mL。
基于PVA膜包埋酶这一机械固定化方式，酶负载量可以较大，优选上述悬浮液或酶溶液中酶的浓度为0.1～0.5g/mL，优选酶与PVA溶液的比例为1～50g/100mL，更优选为5～40g/100mL。
在混合过程中，为了保持酶的高活性，优选悬浮液或酶溶液还包含磷酸缓冲液、可选的辅因子和可选的辅酶，优选辅因子浓度为1～20mg/mL，优选辅酶与酶的重量比例为10:1～1:10。
在本申请另一种实施例中，上述步骤S1包括：将PVA水溶液、交联酶颗粒进行混合，形成混合体系。在该实施例中，交联酶以干颗粒的形式与PVA水溶液混合，易于交联酶颗粒的分散。为了保证酶的负载量，优选交联酶颗粒与PVA水溶液的比例为1～50g/100mL。同样地，为了提高交联酶颗粒在PVA水溶液中分散的均匀性，优选预定时间为10～60分钟。此外，需要时，优选交联酶颗粒包括酶、可选的辅因子和可选的辅酶。
在本申请又一种实施例中，上述步骤S1包括：将PVA水溶液、修饰剂溶液进行混合第一预定时间，形成第二混合体系；将第二混合体系与酶体系混合第二预定时间，形成混合体系。通过使用修饰剂促进PVA的成膜并丰富其中的孔结构。
为了进一步形成丰富孔隙率的PVA多孔膜并且有利于酶在其中的分散，优选PVA水溶液的浓度为5～30g/100mL。用于本申请的修饰剂可以从PVA成膜时常用的修饰剂中进行选择，为了避免修饰剂对酶的影响，优选修饰剂溶液包括分散有乙酸、甲醇及硫酸的混合液和/或分散有辅因子的聚乙二醇水溶液和/或分散有辅因子的聚乙烯亚胺水溶液，其中，优选混合液中乙酸的含量为2～4g/100mL、甲醇的含量为5～9g/100mL、硫酸的含量为0.5～1g/100mL；优选聚乙二醇的分子量为PEG400～PEG 6000，优选混合体系中聚乙二醇的浓度为 3～10g/100mL；优选聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa，更优选为3KDa～50KDa，优选混合体系中聚乙烯亚胺的浓度为0.1～1g/100mL，更优选为0.1～0.3g/100mL。
上述添加了修饰剂溶液时，对于酶体系与第二混合体系的混合并不会产生明显影响，因此，上述酶体系可以为目前供应酶的常用体系形式，优选酶体系包括酶、可选的辅因子、可选的辅酶和磷酸缓冲液，优选酶为去除细胞的游离酶或交联酶聚集体聚集体。为了提高酶的负载量，当需要使用辅因子和辅酶时，辅因子浓度为1～20mg/mL，优选酶体系中辅酶与酶的重量比例为10：1～1：10，酶与PVA溶液的比例为1～50g/100mL。
在形成混合体系后，可以将混合体系静置干燥，为了加快成膜进程，优选上述步骤S2包括：将混合体系置于模具中静置第三预定时间后向模具中加入脱水促进剂进行干燥处理，其中脱水促进剂选自乙腈、乙醇和丙酮组成的组中的任意一种或多种，优选脱水促进剂与混合体系的体积比例为1：10～5：1。在成膜过程中，酶被所形成的PVA多孔膜包埋，形成稳定的固定化酶结构。为了避免成膜过快，导致酶不能被完全包覆，优选第三预定时间为2～4小时。另外，为了简化三维结构化模具结构，优选三维结构化模具具有突起或凹槽。
在成膜后，为了使酶的固定化更加牢固，优选上述步骤S3包括：将膜包埋的酶在磷酸缓冲液中浸泡2～16小时后利用新鲜的磷酸缓冲液洗涤膜包埋的酶，得到PVA膜固定化酶。
本申请上述制备方法中，所采用的酶可以为纯化酶，也可以为粗酶，为了节约成本，优选上述酶为粗酶。
本申请所得到的PVA膜固定化酶可进一步用缓冲液重悬，并加入戊二醛修饰，以使酶分子间通过氨基与戊二醛的醛基共价结合而相互交联形成更大的聚集体，不会从PVA膜中漏出，同时附着在PVA膜表层的酶也可以通过戊二醛的手臂作用与PVA共价连接，从而更稳固地被固定化，提高使用次数。优选地，戊二醛的用量为1～2g/100mL悬浮液。
以下将结合实施例和对比例进一步说明本申请的有益效果。
以下实施例中用到的酶及其来源见下表1。
表1
Figure PCTCN2021076756-appb-000001
其中，TA-Cv转氨酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.1：
Figure PCTCN2021076756-appb-000002
其突变体1(TA-Cv-V1)的突变位点和氨基酸突变情况为：R416T+T7C+S47C+Q380L；突变体2(TA-Cv-V2)的突变位点和氨基酸突变情况为：R416T+T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L。
其中，TA-Ac转氨酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.2：
Figure PCTCN2021076756-appb-000003
其突变体1(TA-Ac-V1)的突变位点和氨基酸突变情况为：L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q+E171D；突变体2(TA-Ac–V2)的突变位点和氨基酸突变情况为：L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+E424Q+M423K。
其中，KRED-Ac酮还原酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.3：
Figure PCTCN2021076756-appb-000004
其突变体1(KRED-Ac-V1)的突变位点和氨基酸突变情况为：E144S+A94N+N156V；突变体2(KRED-Ac-V2)的突变位点和氨基酸突变情况为：E144S+A94T+N156T。
其中，CHMO-Rs环己酮单加氧酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.4：
Figure PCTCN2021076756-appb-000005
其突变体1(CHMO-Rs-Cv-V1)的突变位点和氨基酸突变情况为：F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V；突变体2(CHMO-Rs-Cv-V2)的突变位点和氨基酸突变情况为：F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V。
其中，CHMO-Rr环己酮单加氧酶的氨基酸序列是SEQ ID NO.5：
Figure PCTCN2021076756-appb-000006
其突变体1(CHMO-Rr-V1)的突变位点和氨基酸突变情况为：P190L+Y559M+C249V+C393V+C257A+M45T；突变体2(CHMO-Rr-V2)的突变位点和氨基酸突变情况为：Y559M+P190L+P504V。
以下实施例所采用的磷酸盐缓冲液(PB)为磷酸氢二钠-磷酸二氢纳缓冲液。
实施例1
通过PVA膜包埋固定转氨酶TA-CV CLEA(交联酶)：
PVA I溶液的制备：50mL 10％(w/v)PVA(200KDa)与30mL 10％(w/v)乙酸、50％(v/v)甲醇、10％(w/v)硫酸混合。
PVA膜包封：将PVA I溶液的pH调节至6.0，并取出20mL溶液，与TA-CV交联酶聚集体(CLEA)的悬浮液混合(TA-CV交联酶聚集体CLEA的悬浮液的组成为0.5g的TA-CV的交连酶在2ml的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)pH7.0中，且每毫升含2mg PLP(磷酸吡咯醛))搅拌20min，形成混合体系。将其倒入3D多孔硅胶模板中，每个模板中弹孔为正方形，容积约为0.1～0.2立方厘米，弹孔表面积约为2～5平方厘米，在37℃下干燥，得到膜包埋的酶。将膜包埋的酶浸泡在0.1M PB(pH 7.0)+0.5M NaCl的缓冲液中3小时，将膜包埋的酶从缓冲液中取出，然后用0.1M PB(pH 7.0)洗涤该膜包埋的酶3次，得到实施例1的PVA膜固定化酶。
对比例1
将上述实施例1中的3D多孔硅胶模板替换为耐高温硅胶盘以形成平面PVA膜包埋的酶，硅胶盘的底面积为80平方厘米。
同时，考察不同分子量大小的PVA，PVA浓度，酶与PVA的比例等参数对PVA固定化酶活性和稳定性的影响。
转换和稳定性测试：
转化研究中使用的模型反应：
Figure PCTCN2021076756-appb-000007
上述反应式中的R 1和R 2可以各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，R 1和R 2可连接成环。
Figure PCTCN2021076756-appb-000008
取0.1g酮基质1，溶解在0.35mL甲醇中，加入3.0摩尔当量异丙胺盐酸盐作为氨基供体，在反应体系中加入5mg PLP，然后用0.3mL 0.1M PB 7.0稀释形成待反应体系。将3mg TA-CV CLEA或包含3mgTA-CV CLEA的实施例1的三维结构化PVA膜固定化酶或者3mgTA-CV CLEA的对比例1的平面PVA膜固定化酶用作催化剂。在30℃下反应20小时后，通过HPLC方法检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，并测试循环11次的转化率，记录在表2中。
表2
Figure PCTCN2021076756-appb-000009
此外，PVA分子量、PVA浓度、酶与PVA溶液的比例对PVA固定化酶的活性和稳定性影响结果见表3。
表3
Figure PCTCN2021076756-appb-000010
混合体系的pH值对酶活性和稳定性的影响见表4。
表4
Figure PCTCN2021076756-appb-000011
实施例2
通过PVA膜包埋固定转氨酶TA-CV CLEA
PVA II溶液的制备：12％～15％(w/v)PVA水溶液。
PVA膜包埋：取30mL PVA溶液，加入3克CLEA湿颗粒，以及50mg PLP，搅拌均匀形成混合体系，倒入3D多孔硅胶模板中，每个模板中弹孔为圆形，容积约为0.15～0.2立方厘米，弹孔表面积约为3～5平方厘米，37℃干燥，得到膜包埋的酶。将膜包埋的酶浸泡在0.1M PB 7.0缓冲液中过夜，从缓冲液取出膜包埋的酶，然后用0.1M PB7.0缓冲液对该膜包埋的酶进行2次洗涤，得到实施例2的PVA膜固定化酶。
在添加CLEA之前，将一定量的PEG 400～PEG6000分别溶解在PVA II溶液中进行平行实验。
按照实施例1的底物类型进行转换和稳定性测试：
取出0.1g酮基质1，溶解在0.35mL甲醇中，加入3.0摩尔当量异丙胺盐酸盐作为氨基供体，在反应体系中加入5mg PLP，然后用0.3mL 0.1M PB 7.0稀释形成待反应体系。剪取具有约6平方厘米比表面积的包埋6mg TA-Cv CLEA的实施例2的各PVA膜固定化酶用作催化剂，在不添加PLP的情况下进行平行反应。在30℃下反应4小时后，通过HPLC方法检测转化率，每一轮反应20h，结束一轮反应后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，测试结果见图1。
根据图1可以看出，实施例2的PVA膜固定化酶的活性和稳定性非常好，使用14个周期后没有活性减少。当没有添加PLP时活性略低，但稳定性与添加PLP的稳定性一样好，且根据图1可以看出，添加PEG400或PEG6000可提高反应速度。
此外，考察PEG分子量和混合体系中PEG浓度对酶活性和稳定性的影响，结果见表5。
表5
Figure PCTCN2021076756-appb-000012
实施例3
PVA-有机溶剂膜包埋固定TA-CV湿细胞游离酶或TA-CV CLEA：
取7.0mL 10％(w/v)PVA溶液，并与5mL TA-CV游离酶溶液(其中含有5mg/mL PLP)或1克TA-CV CLEA混合，搅拌30min形成混合体系，将混合体系倒入玻璃或耐高温盘中，并在室温下静置3小时，然后将15mL有机溶剂乙腈轻轻倒入倒入3D多孔硅胶模板中，每个模板中弹孔为圆形，容积约为0.15～0.2立方厘米，弹孔表面积约为3～5平方厘米，在37℃下干燥，形成膜包埋的酶。将膜包埋的酶浸泡在0.1M PB 7.0+0.5M NaCl的缓冲液中2～3小时，将膜包埋的酶从缓冲液中取出，然后用0.1M PB(pH 7.0)洗涤该膜包埋的酶3次，得到实施例3的两种PVA膜固定化酶。
按照实施例1的底物类型进行转换和稳定性测试：
取出0.1g酮基质1，溶解在0.35mL甲醇中，加入3.0摩尔当量异丙胺作为氨基供体，在反应体系中加入5mg PLP，然后用0.3mL 0.1M PB 7.0稀释形成待反应体系。剪取具有约6平方厘米比表面积的包埋TA-CV湿细胞或CLEA制成的PVA膜固定化酶用作催化剂。在30℃ 下反应20小时后，通过HPLC方法检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，测试结果见表6和图2。
表6
Figure PCTCN2021076756-appb-000013
反应20小时后转化率仍然可达98％，并且在使用10个循环后稳定而不会失去活性。
实施例4
通过PVA-有机溶剂TA-CV包埋制备高比表面积固定化TA-CV：
取出5.0mL 10％(w/v)PVA溶液，并与5mL TA-CV游离酶溶液(酶浓度0.1g/mL，含有5mg/mL PLP)混合，搅拌20min形成混合体系，赶走气泡，并将0.1mL混合体系滴入3D多孔硅胶模板中，每个模板中单孔为圆形或方形，容积约0.15～0.2立方厘米，单孔表面积约3～5平方厘米。在室温下静置3小时，然后将0.06mL有机溶剂丙酮或乙腈轻轻滴入孔中，在37℃下干燥，在各孔中形成中空块状的成膜包埋的酶。将这些中空块状的成膜包埋的酶浸泡在0.1M PB 7.0+0.5M NaCl缓冲液中2-3小时。然后除去缓冲液，再用0.1M PB7.0 3次洗涤中空块状成膜包埋的酶得到实施例4的各PVA膜固定化酶。
取部分成膜包埋的酶通过戊二醛进一步修饰：用0.1M PB 7.0重新悬浮成膜包埋的酶，并滴加戊二醛，每100mL悬浮液中滴加1～2g戊二醛，在室温下温和搅拌2小时，去除缓冲液，用0.1M PB 7.0×3次洗涤戊二醛修饰后的中空块状的成膜包埋的酶，得到戊二醛修饰的PVA膜固定化酶。
按照实施例1的底物类型进行反应活性和稳定性测试：
取出0.1g酮基质，溶解在0.35mL甲醇中，加入3.0摩尔当量异丙胺盐酸盐作为氨基供体，在反应体系中加入5mg辅因子PLP，然后用0.3mL 0.1M PB 7.0稀释形成待反应体系。剪取具有约6平方厘米比表面积的包埋TA-CV游离酶(经丙酮干燥)的PVA膜固定化酶、具有约6平方厘米比表面积的包埋TA-CV游离酶(经丙酮干燥且经戊二醛修饰)的PVA膜固定化酶、具有约6平方厘米比表面积的包埋TA-CV游离酶(经乙腈干燥)的PVA膜固定化酶、具有约6平方厘米比表面积的包埋TA-CV游离酶(经乙腈干燥且经戊二醛修饰)的PVA膜固定化酶用作催化剂。在30℃下反应20小时后并重复10个周期，通过HPLC方法检测反应20h转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，测试结果见表7。
表7
Figure PCTCN2021076756-appb-000014
另外，考察脱水剂与PVA-酶混合体系的比例对酶活性和稳定性的影响，结果见表8。
表8
Figure PCTCN2021076756-appb-000015
根据表7中的数据可以看出使用实施例4的PVA膜固定化酶作为催化剂时，10个周期后没有活性减少。当通过GA修饰时，虽然酶活性略低，但稳定性与没有GA修改的稳定性一样好。
实施例5
通过PVA-CFP膜包埋固定TA-CV游离酶
PVA溶液：在水中制备12％(w/v)溶液；
辅因子-聚合物溶液(CFP溶液)：溶解2％w/v PEI(聚乙烯亚胺)(3KDa～70KDa)，加入5mg/mL辅因子(PLP)并在室温下混合0.5～3小时。
取35mL PVA溶液和5mL CFP溶液，充分混合30分钟，然后加入5mL酶溶液(酶浓度0.1g/mL)和3～5mg辅因子PLP，在室温下混合30分钟形成混合体系。然后将混合体系倒入3-D结构化的多孔硅胶模板中并在37℃下干燥，得到膜包埋的酶，每个模板中单孔为圆形或方形，容积约0.15～0.2立方厘米，单孔表面积约3～5平方厘米。将膜包埋的酶在0.1M PB 7.0缓冲液中浸泡过夜。除去缓冲液后，用0.1M PB7.0洗涤2次膜包埋的酶得到实施例5的PVA膜固定化酶。
按照实施例1的底物类型进行活性和稳定性测试：
取出0.1g酮基质1，溶解在0.35mL甲醇中，加入3.0摩尔当量异丙胺作为氨基供体，在反应体系中加入5mg PLP，然后用0.3mL 0.1M PB 7.0稀释形成待反应体系。剪取具有约3-4平方厘米比表面积的包埋3mg TA-CV游离酶的实施例4的PVA膜固定化酶用作催化剂，在不添加PLP的情况下进行平行反应。在30℃下反应20小时后并重复14个周期，通过HPLC方法测试反应4h的转化率，测试结果见图3。
由图3可以看出，所形成的PVA膜固定化酶的活性和稳定性非常好，使用14个周期后没有活动减少。当没有添加PLP时活性略低，但稳定性与添加PLP的稳定性一样好。
此外，考察了PEI分子量和混合体系中PEI的浓度对酶活性和稳定性的影响，结果见表9。
表9
酶 PEI分子量(KDa) 添加PEI的浓度 4h转化率(％) 循环次数
TA-Cv-V2 无 无 ＞25％ 14
TA-Cv-V2 0.6 0.3 ＞25％ 14
TA-Cv-V2 3 0.3 ＞35％ 16
TA-Cv-V2 10 0.3 ＞35％ 18
TA-Cv-V2 25 0.3 ＞35％ 16
TA-Cv-V2 50 0.3 ＞35％ 75
TA-Cv-V2 60 0.3 ＞35％ 18
TA-Cv-V2 70 0.3 ＞35％ 15
TA-Cv-V2 100 0.3 ＞35％ 11
TA-Cv-V2 3 0.05 ＞35％ 15
TA-Cv-V2 3 0.1 ＞35％ 17
TA-Cv-V2 3 0.5 ＞35％ 16
TA-Cv-V2 3 0.8 ＞35％ 16
TA-Cv-V2 3 1 ＞35％ 15
TA-Cv-V2 60 0.05 ＞35％ 15
TA-Cv-V2 60 0.3 ＞35％ 18
TA-Cv-V2 60 0.5 ＞35％ 18
TA-Cv-V2 60 1 ＞35％ 14
TA-Cv-V2 60 2 ＞35％ 10
实施例6
通过PVA-CFP膜包埋固定TA-CV CLEA
PVA溶液：在水中制备12％w/v的溶液
CFP溶液：在水中制备2％w/v PEI(3KDa～70KDa)溶液，加入5mg/mL辅因子(PLP)，在室温下混合0.5～3小时。
将3g TA-CV CLEA悬浮于10mL CFP溶液中，并与30mL PVA溶液充分混合形成混合体系。然后将混合体系倒入多孔硅胶模板中，并在37℃下干燥形成膜包埋的酶，每个模板中单孔为圆形或方形，容积约0.15～0.2立方厘米，单孔表面积约3～5平方厘米。将膜包埋的酶浸泡在0.1M PB 7.0缓冲液中过夜。将膜包埋的酶从缓冲液中取出，用然后0.1M PB 7.0洗涤2次，得到实施例6的PVA膜包埋固定化酶。
按照实施例1的底物类型进行活性和稳定性测试：
取出0.1g酮基质1，溶解在0.35mL甲醇中，加入3.0摩尔当量异丙胺作为氨基供体，在反应体系中加入5mg PLP，然后用0.3mL 0.1M PB 7.0稀释形成待反应体系。将包埋有6mg TA-CV CLEA的比表面积约5cm 2实施例6的PVA膜包埋固定化酶用作催化剂，在不添加PLP的情况下进行平行反应。在30℃下反应20小时后并重复14个周期，通过HPLC方法检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，测试结果见图4。
根据图4可以看出，PVA膜包埋固定化酶活性和稳定性非常好，使用14个周期后没有活动减少。当没有添加PLP时活性略低，但稳定性与添加PLP的稳定性一样好。
实施例7
通过PVA-CFP膜包埋固定TA-Ac游离酶
PVA溶液：在水中制备12％w/v的溶液
CFP溶液：在水中制备2％w/v PEI(3KDa～70KDa)溶液，加入5mg/mL辅因子(PLP)，在室温下混合0.5～3小时。
取35mL PVA溶液和5mL CFP溶液，充分混合30分钟，然后加入5mL TA-Ac酶溶液(酶浓度0.1)和3-5mg辅因子PLP，在室温下混合30分钟，得到混合体系。然后将混合体系倒入D多孔硅胶模板中，每个模板中单孔为圆形或方形，容积约0.15～0.2立方厘米，单孔表面积约3～5平方厘米，并在37℃下干燥，得到膜包埋的酶。将膜包埋的酶在0.1M PB 7.0中浸泡过夜。将膜包埋的酶从缓冲液中取出，用然后0.1M PB 7.0洗涤2次，得到实施例7的PVA膜包埋固定化酶。
按照实施例1的底物类型进行活性和稳定性测试：
具体的采用酮基质2
Figure PCTCN2021076756-appb-000016
替换实施例1中所采用的酮基质1。
在水性缓冲体系中测试：取0.1g酮基质2并悬浮于1mL 0.1M PB 7.0缓冲液中，加入3.0摩尔当量异丙胺盐酸盐作为氨基供体，在反应体系中加入5mg PLP，将包含10mg TA-Ac游离酶的实施例7的PVA膜包埋固定化酶用作催化剂。在30℃下反应20小时后重复5个周期，通过HPLC方法检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，测试结果见表10。
在双相系统中测试：取0.1g酮基质2并溶解在作为非水相的1mL MTBE中，加入1mL 0.1M PB 7.0作为水相，加入3.0摩尔当量的异丙胺作为氨基供体，在反应体系中加入5mgPLP形成待反应体系，将包含10mg TA-Ac游离酶的实施例7的PVA膜固定化酶用作催化剂。在30℃下反应20小时后重复5个周期，通过HPLC方法检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，测试结果见表10。
表10
Figure PCTCN2021076756-appb-000017
根据表10中的数据可以看出，实施例7的PVA膜固定化酶的活性和稳定性非常好，使用5个周期后没有活性减少。
考察PVA分子量、PVA浓度、酶与PVA溶液的比例对酶的活性和稳定性的影响，结果见表11。
表11
Figure PCTCN2021076756-appb-000018
实施例8
通过PVA-CFP膜包埋固定酮还原酶
PVA溶液：在水中制备12％(w/v)溶液
CFP溶液：制备溶解在水中的2％(w/v)PEI(3KDa～70KDa)，视情况加入5mg/mL辅因子(NAD+或PLP)，在室温下混合0.5～3小时。
取35mL PVA溶液和5mL CFP溶液，充分混合30分钟，然后加入5mL KRED-Ac或KRED-Cm的酶溶液(酶浓度0.1g/mL)和4mg辅助因子NAD +，在室温下混合30分钟形成混合体系。然后将混合体系倒入3-D硅氧烷模板中，每个模板中单孔为圆形或方形，容积约0.15～0.2立方厘米，单孔表面积约3～5平方厘米。并在37℃下干燥形成膜包埋的酶。将膜包埋的酶在0.1M PB 7.0中浸泡过夜。将膜包埋的酶从缓冲液中取出，用然后0.1M PB 7.0洗涤2次，得到实施例8的含有NAD +的PVA膜固定化酶。
采用PLP替换辅助因子NAD +重复上述过程，得到实施例8的含有PLP的PVA膜固定化酶。
活性和稳定性测试：
转化研究中使用的模型反应：
Figure PCTCN2021076756-appb-000019
上述反应式中的R1和R2可以各自独立的选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或R1与R2可连接成环。
酮基质：
Figure PCTCN2021076756-appb-000020
取出0.1g酮基质3或4，并溶解在0.5mL异丙醇中，在反应体系中加入0.5mL含有5mg辅因子NAD +的0.1M PB 7.0形成待反应体系，向待反应体系中施加包埋30mg酮还原酶KRED-Ac(使用酮基质3验活)或酮还原酶KRED-Cm(使用酮基质4验活)的实施例8的PVA膜包埋固定化酶作为催化剂。在30℃下反应20小时后并重复11个周期，用GC法检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，结果见图5，图6，其中图5对应的底物是酮基质3，图6对应的底物是酮基质4。
由图5可以看出，实施例8的PVA膜固定化酶KRED-Ac针对酮基质3的活性和稳定性非常好，转化率达到99％，重复使用11个循环后没有活性损失。当PLP制备CFP溶液时，活性比NAD +好得多。
由图6可以看出，实施例8所得到的PVA膜包埋固定化酶KRED-Cm的活性和稳定性非常好，转化率达到99％，重复使用10个循环后没有活性损失。当PLP制备CFP溶液时，活性比NAD +好得多。
考察辅因子在酶体系中的浓度，结果见表12。
表12
酶 辅因子 辅因子浓度(mg/mL) 转化率(％) 循环次数
KRFD-Ac PLP 0.5 ＞99％ 12
KRFD-Ac PLP 1 ＞99％ 14
KRED-Ac PLP 5 ＞99％ 14
KRED-Ac PLP 10 ＞99％ 14
KRED-Ac PLP 20 ＞99％ 14
KRFD-Ac PLP 30 ＞99％ 14
KRED-Ac NAD 0.5 ＞99％ 8
KRED-Ac NAD 1 ＞99％ 10
KRED-Ac NAD 5 ＞99％ 14
KRED-Ac NAD 10 ＞99％ 15
KRED-Ac NAD 20 ＞99％ 15
KRED-Ac NAD 30 ＞99％ 15
KFRD-Ac-V1 PLP 5 ＞99％ 18
KERD-Ac-V1 PLP 10 ＞99％ 18
KERD-Ac-V1 NAD 5 ＞99％ 15
KERD-Ac-V1 NAD 10 ＞99％ 17
实施例9
PVA膜包埋固定化转氨酶TA-Bt及其辅酶LDH、FDH的共交联酶，转氨酶TA-Bt及其辅酶LDH、FDH的共交联酶以下简称共交联酶。
PVAI溶液的制备：50mL 10％(w/v)PVA(200KDa)与30mL 10％(w/v)乙酸、50％(v/v)甲醇、10％(w/v)硫酸混合。
PVA膜包封：将PVA I溶液的pH调节至4～6.5，并取出20mL溶液，与共交联酶的悬浮液混合(共交联酶的悬浮液的组成为0.5g的TA-Bt与LDH及FDH的共交联酶在2ml的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)pH7.0中，且每毫升含2mg PLP(磷酸吡咯醛))搅拌20min，形成混合体系。将其倒入3D多孔硅胶模板中，每个模板中弹孔为正方形，容积约为0.1～0.2立方厘米，弹孔表面积约为2～5平方厘米，在37℃下干燥，得到膜包埋的酶。将膜包埋的酶浸泡在0.1M PB(pH 7.0)+0.5M NaCl的缓冲液中3小时，将膜包埋的酶从缓冲液中取出，然后用0.1M PB(pH 7.0)洗涤该膜包埋的酶3次，得到实施例1的PVA膜固定化酶。
活性和稳定性测试。
转化研究中使用的反应模型：
Figure PCTCN2021076756-appb-000021
上述反应式中的R可以选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基、卤素。
Figure PCTCN2021076756-appb-000022
5mL的0.1M PB(pH 8.0)装入10ml的反应瓶中，随后加入100毫克上述底物5、80mg甲酸铵及5mg PLP，调节pH至pH 7.5～8.0，然后加入5mg NAD +和10mg膜固定化酶(湿的，含有50～80％的水)。在30℃下反应20小时，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。具体地考察了TA-Bt与辅酶共固定化酶中主酶与辅酶的比例对酶活性和稳定性的影响，结果见表13。
表13
Figure PCTCN2021076756-appb-000023
实施例10
通过PVA-CFP膜包埋将TA-Bt和辅酶D-LDH，FDH共同固定化
PVA(200KDa)溶液：在水中制备12％(w/v)溶液
CFP溶液：制备2％(w/v)PEI(3KDa～70KDa)水溶液，加入5mg/mL辅助因子(PLP)，室温下混合0.5～3小时。
取35mL PVA溶液和5mL CFP溶液，充分混合30分钟，然后加入5mLTA-Bt酶溶液(酶浓度0.08g/mL)、0.08g辅酶D-LDH、0.1g辅酶FDH及和4mg辅助因子NAD +，在室温下混合30分钟，形成混合体系。然后将混合体系倒入3-D硅氧烷模板中，每个模板中单孔为圆形或方形，容积约0.15～0.2立方厘米，单孔表面积约3～5平方厘米。并在37℃下干燥形成膜包埋的酶。将膜包埋的酶在0.1M PB 7.0中浸泡过夜。将膜包埋的酶从缓冲液中取出，用然后0.1M PB 7.0洗涤2次，得到实施例10的含有PLP和NAD +的PVA-CFP膜固定化酶。
采用实施例9的模型进行活性和稳定性测试：
将5mL的0.1M PB(pH 8.0)装入10ml的反应瓶中，随后加入100毫克上述底物5、80mg甲酸铵及5mg PLP，调节pH至pH 7.5～8.0，然后加入5mg NAD +和10mg含有PLP和NAD +的PVA-CFP膜固定化酶(湿的，含有50～80％的水)。在30℃下反应20小时，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，在不添加PLP的情况下进行平行反应。
在30℃下反应4小时后重复9个周期，通过HPLC方法检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数，测试结果图7。
根据图7可以看出，所得到的PVA膜固定化酶的活性和稳定性非常好，在使用9个循环后没有明显的活性丧失，且反应体系不加PLP与添加PLP的活性和稳定性一样好。
实施例11
PVA-CFP膜固定化环己酮单加氧酶：
固定化方法同实施例10，只是将PVA包封的酶变为环己酮单加氧酶CHMO-Rs或CHMO-Bp，也可以是环己酮单加氧酶CHMO与其辅酶醇脱氢酶ADH-Tb或葡萄糖脱氢酶GDH混和酶，具体酶组成见表14。
活性和稳定性测试：
转化研究中使用的反应模型：
Figure PCTCN2021076756-appb-000024
上述反应式中的R可以选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或R与其所连接的杂环形成稠环体系。
CHMO的PVA-CFP膜膜固定化酶的活性通过利用以下底物6进行反应来检测：
Figure PCTCN2021076756-appb-000025
3mL的0.1M PB(pH 8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入50毫克底物6、100mg葡萄糖及5mg NADP+、50mg醇脱氢酶ADH-Tb、5mg葡萄糖脱氢酶GDH，然后加入含有20mg环己酮单加氧酶的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应20小时，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
CHMO与辅酶GDH的PVA-CFP膜固定化酶的活性检测通过以下反应条件进行：
3mL的0.1M PB(pH 8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入50毫克底物6、100mg葡萄糖及5mg NADP+，然后加入30mg的CHMO与GDH混和酶的共固定化酶。在30℃下反应20小时，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
CHMO与辅酶ADH-Tb的PVA-CFP膜固定化酶的活性检测通过以下反应条件进行：
3mL的0.1M PB(pH 8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入50毫克底物6、200ul的异丙醇及5mg NADP+，然后加入30mg的CHMO与ADH混和酶的共固定化酶。在30℃下反应20小时，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
测试结果见表14。
表14
Figure PCTCN2021076756-appb-000026
Figure PCTCN2021076756-appb-000027
实施例12
PVA-CFP膜固定化烯还原酶：
固定化方法同实施例10，只是将PVA包封的酶变为烯还原酶ERED-Sc或ERED-Chr，也可以是烯还原酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸铵脱氢酶FDH的混和酶，两种酶的重量比例为ERED:GDH(或FDH)＝5：1。
活性和稳定性测试。
转化研究中使用的反应模型：
Figure PCTCN2021076756-appb-000028
上述反应式中的R1和R2可以各自独立的选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或R1与R 2成环。
ERED的PVA-CFP膜固定化酶的活性通过以下底物7的反应进行检测：
Figure PCTCN2021076756-appb-000029
3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入100mg的底物7、接着加入20mg NAD(P) +、80mg甲酸铵、5mg FDH及含有30mg烯还原酶的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
ERED与FDH的PVA-CFP膜固定化酶的活性通过以下底物7的反应进行检测：
3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入100mg的底物7、接着加入20mg NAD(P) +、80mg甲酸铵及含有40mg烯还原酶与FDH混和酶的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
ERED与GDH的PVA-CFP膜固定化酶的活性通过以下反应来检测：
3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入100mg的底物7、接着加入20mg NAD(P) +、120mg葡萄糖及含有40mg烯还原酶与GDH混和酶的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见表15。
表15
Figure PCTCN2021076756-appb-000030
Figure PCTCN2021076756-appb-000031
实施例13
PVA-CFP膜固定化亚胺还原酶
固定化方法同实施例10，只是将PVA包封的酶变为亚胺还原酶IRED-Str或IRED-Bc，也可以是烯还原酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸铵脱氢酶FDH的混和酶，两种酶的比例为ERED:GDH(或FDH)＝4：1。
活性和稳定性测试。
转化研究中使用的反应模型：
Figure PCTCN2021076756-appb-000032
上述反应式中的R1和R2可以各自独立的选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或R1和R2与其所连接的杂环或芳环形成稠环体系。
IRED的PVA-CFP膜膜固定化酶的活性采用以下底物8，并按以下方法测试：
Figure PCTCN2021076756-appb-000033
将2mL 0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应瓶中，然后加入100mg上述底物8、10mg NAD(P) +、60mg甲酸铵、10mg FDH和含有40mg IRED的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
IRED和FDH的PVA-CFP膜固定化酶的活性采用底物8，并按以下方法测试：
将2mL 0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应瓶中，并加入100mg上述底物8、然后加入10mg NAD(P) +、60mg甲酸铵，然后加入含有50mg IRED和FDH混和酶的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
IRED和GDH的PVA-CFP膜固定化酶的活性以下方法测试：
3mL的0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应瓶中，随后加入100mg底物8，再加入10mg NAD(P) +、100mg葡萄糖和含有50mg IRED和GDH混和酶的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时后，进行转化率测试。测试结果见表16。
表15
CFP-PVA包封的酶 转换率(％) 循环次数
IRED-Str ＞90％ 6
IRED-Bc ＞90％ 7
IRED-Str+FDH ＞90％ 5
IRED-Str+GDH ＞90％ 6
IRED-Bc+FDH ＞90％ 4
IRED-Bc+GDH ＞90％ 6
实施例14
PVA-CFP膜固定化腈水解酶
固定化方法同实施例10，只是将PVA包封的酶变为腈水解酶NIT-An或NIT-Nc的酶溶液(酶浓度0.1g/mL)或NIT-An或NIT-Nc的交联酶聚集体悬浮液(0.5g/mL)。
活性和稳定性测试。
转化研究中使用的反应模型：
Figure PCTCN2021076756-appb-000034
腈水解酶的PVA-CFP膜固定化酶的活性采用以下底物9，并按以下方法测试：
Figure PCTCN2021076756-appb-000035
将2mL 0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应瓶中，并加入100mg上述底物9，然后加入含有20mg NIT的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
测试结果见表17。
表17
CFP-PVA包封的酶 转换率(％) 循环次数
NIT-An ＞98％ 5
NIT-Nc ＞98％ 4
NIT-An交联酶聚集体交联酶聚集体 ＞98％ 8
NIT-Nc交联酶聚集体交联酶聚集体 ＞98％ 8
实施例15
PVA-CFP膜固定化氨裂解酶
固定化方法同实施例10，只是将PVA包封的酶变为氨裂解酶PAL-An或PAL-Ss。
活性和稳定性测试。
转化研究中使用的反应模型：
Figure PCTCN2021076756-appb-000036
氨裂解酶PAL的PVA-CFP膜固定化酶的活性采用以下底物10，并按以下方法测试：
Figure PCTCN2021076756-appb-000037
将8mL 4M氨基甲酸铵水溶液(pH 9.0～9.5)加入10mL反应瓶中，并加入100mg上述底物10，然后加入含有40mg NIT的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。。
测试结果见表18。
表18
CFP-PVA包封的酶 转换率(％) 循环次数
PAL-An ＞98％ 18
PAL-Ss ＞98％ 17
实施例16
PVA-CFP膜固定化氨基酸脱氢酶
固定化方法同实施例10，只是将PVA包封的酶变为氨基酸脱氢酶AADH-Bc或AADH-Bs，也可以是氨基酸脱氢酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸铵脱氢酶FDH的混和酶，两种酶的比例为AADH∶GDH(或FDH)＝4∶1。
活性和稳定性测试。
转化研究中使用的反应模型：
Figure PCTCN2021076756-appb-000038
R为取代或未取代的芳基。
AADH的PVA-CFP膜固定化酶的活性采用以下底物11或12，并按以下方法测试：
Figure PCTCN2021076756-appb-000039
将5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0～9.0)加入10mL反应瓶中，然后加入100mg底物11或12、108mg氯化铵，调节pH至7.5～8.0，然后加入10mg NAD +、150mg葡萄糖和10mg GDH，最后加入包埋20mg AADH的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
AADH及FDH共固定化酶的活性检测方法如下：
将5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0～9.0)加入10mL反应瓶中，然后加入100mg底物11或12、108mg氯化铵，调节pH 7.5～8.0，然后加入10mg NAD +、80mg甲酸铵和包埋50mg AADH与FDH混和酶的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。
AADH及GDH的PVA-CFP膜固定化酶的活性检测方法如下：
将5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0～9.0)加入10mL反应瓶中，然后加入100mg底物11或12、108mg氯化铵，调节pH 7.5～8.0，然后加入10mg NAD +、150mg葡萄糖和包埋50mg AADH与GDH混和酶的PVA-CFP膜固定化酶。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见表19。
表19
CFP-PVA包封的酶 转换率(％) 循环次数
AADH-Bc ＞95％ 7
AADH-Bs ＞95％ 9
AADH-Bc+FDH ＞95％ 6
AADH-Bc+GDH ＞95％ 8
AADH-Bs+FDH ＞95％ 8
AADH-Bs+GDH ＞95％ 7
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
本申请采用PVA多孔膜作为载体将酶以包埋的方式固定化，包埋固定化的流程简单、条件温和，对纯化酶或粗酶均具有良好的固定化效果，且酶被包埋固定化在PVA多孔膜中后比较稳定，不容易在使用过程中浸出；所采用的PVA多孔膜的多孔结构能够更好地传递反应物和产物，适用于连续流动生化催化中使用。由于上述包埋固定为机械固定，因此对酶具有广适性。将PVA多孔膜进行三维结构化，使其具有立体结构，进而具有更多的表面积，提供更多的包埋位点，进而在保证了酶的高活性和稳定性的基础上，提高了酶的负载量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

  1. 一种PVA膜固定化酶，其特征在于，所述PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在所述PVA多孔膜上的酶，所述PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，所述酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、醇脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶及它们的突变体中的任意一种。
  2. 根据权利要求1所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述三维结构化PVA多孔膜具有突起或凹槽形成的三维结构，优选所述酶为游离酶或交联酶聚集体。
  3. 根据权利要求1或2所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述转氨酶为来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或来源于B.thuringiensis的转氨酶，所述酮还原酶为来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶，或者来源于Candida macedoniensis AKU4588的酮还原酶；所述环己酮单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶；所述氨裂解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶；所述烯还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶和来源于Chryseobacterium sp.CA49的烯还原酶；所述亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp的亚胺还原酶和Bacillus cereus的亚胺还原酶；所述氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶和来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；所述腈水解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurospora crassa OR74A的腈水解酶；优选地，所述来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第7位、第47位、第90位、第95位、第297位、第304位、第380位、第405位和第416位，且第7位的苏氨酸突变为半胱氨酸，第47位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第90位的赖氨酸突变为甘氨酸，第95位的丙氨酸突变为脯氨酸，第297位的异亮氨酸突变为亮氨酸，第304位的赖氨酸突变为天冬氨酸，第380位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第405位的精氨酸突变为谷氨酸，第416位的精氨酸突变为苏氨酸，或者所述转氨酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列；优选地，所述来源于Arthrobacter citreus的转氨酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第3位、第5位、第60位、第164位、第171位、第178位、第180位、第186位、第187位、第252位、第370位、第384位、第389位、第404位、第411位、第423位和第424位，且第3位的亮氨酸突变为丝氨酸，第5位的缬氨酸突变为丝氨酸，第60位的半胱氨酸突变为酪氨酸，第164位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，第171位的谷氨酸突变为天冬氨酸，第178位的丙氨酸突变为亮氨酸，第180位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第186位的丝氨酸突变为甘氨酸，第187位的丝氨酸突变为丙氨酸， 第252位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第370位的亮氨酸突变为丙氨酸，第384位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第389位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，第404位的亮氨酸突变为谷氨酰胺，第411位的甘氨酸突变为天冬氨酸，第423位的甲硫氨酸突变为赖氨酸，第424位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，或者所述转氨酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列；优选地，所述来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述酮还原酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第94位、第144位和第156位，且第94位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第144位的谷氨酸突变为丝氨酸，第156位的天冬酰胺突变为苏氨酸或缬氨酸，或者所述酮还原酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列；优选地，所述来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第280位、第435位、第436位、第438位、第441位、第508位和第510位，且第280位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第435位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第436位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，第438位的亮氨酸突变为丙氨酸，第441位的丝氨酸突变为缬氨酸，第510位的亮氨酸突变为缬氨酸，或者所述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列；优选地，所述来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第45位、第190位、第249位、第257位、第393位、第504位和第559位，且第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸，第190位的脯氨酸突变为亮氨酸，第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第504位的脯氨酸突变为缬氨酸，第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸，或者所述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求1所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述PVA膜固定化酶还包括每种酶的辅酶和辅因子，所述辅酶和所述辅因子包埋在所述PVA多孔膜上。
  5. 根据权利要求1至4中任一项所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述PVA多孔膜上还具有聚乙二醇和/或聚乙烯亚胺，优选所述聚乙二醇的分子量为PEG400～PEG 6000，优选所述聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa；优选地，所述聚乙二醇与所述PVA多孔的质量比为5:4～75:4，所述聚乙烯亚胺与所述PVA多孔的质量比为1:12～1:240。
  6. 根据权利要求1所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述酶为粗酶。
  7. 根据权利要求1或6所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述酶的负载量为0.05～0.4g游离酶/cm 2膜或0.03～0.06g干燥的交联酶聚集体/cm 2膜。
  8. 一种权利要求1至7中任一项所述的PVA膜固定化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
    步骤S1，将包含酶与PVA溶液的原料混合预定时间，得到混合体系；
    步骤S2，将所述混合体系加入到模具中并对所述混合体系进行干燥处理，得到膜包埋的酶，所述模具为三维结构化模具以形成三维结构化PVA多孔膜；以及
    步骤S3，利用磷酸缓冲液对所述膜包埋的酶进行浸泡处理和洗涤后，得到所述PVA膜固定化酶；优选所述混合体系的pH值为6.0～6.5。
  9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
    配制酶的悬浮液或酶溶液，所述悬浮液中的酶交联酶聚集体，所述酶溶液中的酶为去除细胞的游离酶；
    将所述悬浮液或所述酶溶液与所述PVA溶液混合预定时间，得到所述混合体系，优选所述预定时间为10～60分钟；所述PVA溶液的PVA分子量为20KDa～200KDa；优选所述PVA溶液中PVA的含量为10～50g/100mL；优选所述PVA溶液中分散有乙酸、甲醇及硫酸；优选所述PVA溶液的pH值在5.5～6.5之间；优选所述酶与所述PVA溶液的比例为1～50g/100mL；优选所述悬浮液或所述酶溶液还包含磷酸缓冲液、可选的辅因子和可选的辅酶；优选所述辅酶与所述酶的重量比例为10:1～1:10。
  10. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
    将PVA水溶液、交联酶颗粒进行混合，形成所述混合体系；优选所述交联酶颗粒与所述PVA水溶液的比例为1～50g/100mL；优选所述预定时间为10～60分钟；优选所述交联酶颗粒包括酶、可选的辅因子和可选的辅酶。
  11. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
    将PVA水溶液、修饰剂溶液进行混合第一预定时间，形成第二混合体系；
    将所述第二混合体系与酶体系混合第二预定时间，形成所述混合体系；优选所述PVA水溶液的浓度为5～30g/100mL；优选所述修饰剂溶液包括分散有辅因子的聚乙二醇水溶液和/或分散有辅因子的聚乙烯亚胺水溶液；优选所述聚乙二醇的分子量为PEG400～PEG6000、优选所述混合体系中所述聚乙二醇的浓度为3～10g/100mL；优选所述聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa，更优选所述聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～50KDa；优选所述混合体系中所述聚乙烯亚胺的浓度为0.1～1g/100mL，更优选所述混合体系中所述聚乙烯亚胺的浓度为0.1～0.3g/100mL；优选所述酶体系包括酶、可选的辅因子、可选的辅酶和磷酸缓冲液；优选所述酶为酶去除细胞的游离酶或交联酶聚集体聚集体；优选所述酶体系中所述辅因子浓度为1～20mg/mL；优选所述酶体系中所述辅酶与所述酶的重量比例 为10：1～1：10；优选所述酶与所述PVA溶液的比例为1～50g/100mL。
  12. 根据权利要求8至11中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括：
    将所述混合体系置于模具中静置第三预定时间后向所述模具中加入脱水促进剂进行干燥处理，其中所述脱水促进剂选自乙腈、乙醇和丙酮组成的组中的任意一种或多种；优选所述脱水促进剂与混合体系的体积比例为1：10～5：1；优选所述第三预定时间为2～4小时；优选所述模具为三维结构化模具，所述三维结构化模具具有突起或凹槽。
  13. 根据权利要求8至11中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3包括：
    将所述膜包埋的酶在所述磷酸缓冲液中浸泡2～16小时后利用新鲜的所述磷酸缓冲液洗涤所述膜包埋的酶，得到所述PVA膜固定化酶。
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