WO2022005143A1 - 페니바실러스 엘지아이 jck-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물세균병 방제 방법 - Google Patents

페니바실러스 엘지아이 jck-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물세균병 방제 방법 Download PDF

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WO2022005143A1
WO2022005143A1 PCT/KR2021/008125 KR2021008125W WO2022005143A1 WO 2022005143 A1 WO2022005143 A1 WO 2022005143A1 KR 2021008125 W KR2021008125 W KR 2021008125W WO 2022005143 A1 WO2022005143 A1 WO 2022005143A1
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xanthomonas
pgp
phytobacterial
jck
composition
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Application number
PCT/KR2021/008125
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English (en)
French (fr)
Inventor
김진철
리뒤켕
김보라
유난희
이철원
김주은
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전남대학교산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/25—Paenibacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention was made by the unique project number 1395066554 and project number PJ015296042020 under the support of the Rural Development Administration, the research and management agency of the above project is the Rural Development Administration, and the research project name is "Pest damage reduction technology development (R&D) ", the research project name is "Development of burn disease control technology using antagonistic microorganisms with antibacterial activity and induced resistance mechanism", the lead institution is Chonnam National University Industry-Academic Cooperation Foundation, and the research period is 2020-02-01 ⁇ 2020-12-31.
  • the present invention relates to a composition for controlling a phytobacterial disease comprising a culture solution of a Penibacillus elgii JCK-5075 strain or an extract thereof, a method for preparing the same, and a method for controlling a phytobacterial disease, and more particularly, to a method for controlling antibacterial activity It relates to the control effect on the phytobacterial pathogen causative bacteria identified in the culture medium of the Penny bacillus LGI JCK-5075 strain having a and pelgipeptins isolated therefrom.
  • Plant diseases caused by fungi are more common and cause serious damage to crops, but some bacterial damage is also very serious worldwide, especially in humid and hot regions.
  • 10 plant pathogenic bacteria of scientific and economic importance worldwide were described, including Pseudomonas syringae pathovars, Ralstonia solanacearum , Agrobacterium tumer. Fasciens ( Agrobacterium tumefaciens ), Xanthomonas duck jaejae Fasova duckjae ( Xanthomonas oryzae pv.
  • Xanthomonas campestris pathovars ( Xanthomonas campestris pathovars ), Xanthomonas axono pods pathovars), Xanthomonas axono Erwinia amylovora ( Erwinia amylovora ), P. Pearson's bacillus ( Xylella fastidiosa ), Dickeya ( dadantii and solani ), and Pectobacterium carotovorum ( Pectobacterium carotovorum ) and the like belong.
  • Plant diseases caused by bacteria are very difficult to control for the following three reasons. 1) Proliferates very quickly under optimal conditions, 2) The absence of fumigant for the control of soil-mediated pathogenic bacteria, 3) Many plant pathogenic bacteria live in plants, while many control agents are treated on the plant surface. thing.
  • the genus Paenibacillus is a gram-positive, aerobic, rod-shaped, endospore-forming bacterium.
  • the main characteristic of this group is the secretion of extracellular enzymes under neutral and alkaline growth conditions.
  • Some species may also produce polysaccharides, amino acids and secondary metabolites such as antibiotics, pigments, toxins, enzyme inhibitors, pheromones and plant and animal growth promoters.
  • Penibacillus The genus Penibacillus is currently the subject of many studies, and its antibacterial activity has been confirmed against a wide spectrum of microorganisms. Some Penibacillus strains have been used for biocontrol of plant diseases and have become important as antibacterial biocontrol agents because of their ability to degrade chitin, a major compound present in fungal cell walls.
  • the present inventors confirmed that the antibacterial activity was significantly excellent when the culture solution of the Penibacillus elgii JCK-5075 strain or an extract thereof was treated with the causative bacteria of phytobacterial diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for controlling phytobacterial diseases comprising a culture solution of the Pennybacillus LGI JCK-5075 strain deposited with the deposit number KCTC 14196BP or an extract thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a composition for controlling phytobacterial diseases, comprising a culturing step of culturing the Pennybacillus LGI JCK-5075 strain deposited under the accession number KCTC 14196BP to prepare a culture solution.
  • Another object of the present invention is to control a plant bacterial disease comprising a treatment step of treating the plant with a composition for controlling phytobacterial diseases comprising a culture solution of the Pennybacillus LGI JCK-5075 strain deposited with accession number KCTC 14196BP or an extract thereof to provide a way
  • Another object of the present invention relates to a phytobacterial disease control use of the Phenibacillus LGI JCK-5075 strain deposited with accession number KCTC 14196BP.
  • the present invention relates to a composition for controlling a phytobacterial disease comprising a culture solution of a Penibacillus elgii JCK-5075 strain or an extract thereof, a preparation method thereof, and a phytobacterial disease controlling method, and the phytobacterial disease according to the present invention
  • the control composition exhibits excellent antibacterial activity when treated with phytobacterial pathogens.
  • the present inventors confirmed that the antibacterial activity was significantly excellent when the culture medium of the Pennybacillus LGI JCK-5075 strain or an extract thereof was treated with a bacterium causing phytobacterial diseases.
  • One aspect of the present invention is a Penibacillus LGI JCK-5075 strain deposited with accession number KCTC 14196BP having antibacterial activity.
  • compositions for controlling phytobacterial diseases comprising a culture solution of the Pennybacillus LGI JCK-5075 strain deposited with accession number KCTC 14196BP or an extract thereof.
  • culture medium refers to a microorganism containing the microorganism after culturing.
  • 'Culture supernatant' refers to the obtained supernatant from which most microorganisms are removed from the culture solution by centrifugation, and is also called 'supernatant solution'.
  • 'Culture filtrate' means that bacteria are completely removed from the culture solution by centrifugation and filtration.
  • the phytobacterial disease is Acidovorax avenae subsp. Cattleyae (Acidovorax avenae subsp. Cattleyae, the causative agent of Phalaenopsis bacterial brown spot disease), Acidovorax konjaci (Acidovorax konjaci, the causative organism of cucumber black spot disease), Agrobacterium tumorpathy Ens ( Agrobacterium tumefaciens , the causative agent of root lump disease), Burkholderia glumae (Burkholderia glumae, the causative agent of bacterial blight in rice), Pectobacterium carotovora subsp.
  • citri citrus gweyangbyeong organisms
  • janto Monastir Juve Chicago Astoria Xanthomonas euvesicatoria, pepper bacterial jeommnaturebyeong organisms
  • janto Monas duck material Pasova duck material Xanthomonas oryzae pv. oryzae , the causative agent of rice blight
  • Ralstonia solanacearum causative agent of tomato bacterial green blight
  • Clavibacter misiganensis subspecies misiganensis Clavibacter mich iganensis subsp. michiganensis , tomato ulcer disease causative bacteria
  • Clavibacter mich iganensis subspecies misiganensis Clavibacter mich iganensis subsp. michiganensis , tomato ulcer disease causative bacteria
  • the extract of the culture medium of the Pennybacillus LGI JCK-5075 strain deposited with the accession number KCTC 14196BP in the present invention is at least one selected from the group consisting of PGP (Pelgipeptin)-A, PGP-B, PGP-C and PGP-D. may contain, and preferably may be PGP-A, PGP-C and PGP-D.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a composition for controlling phytobacterial diseases comprising a culturing step of culturing the Pennybacillus LGI JCK-5075 strain deposited with the accession number KCTC 14196BP to prepare a culture solution.
  • phytobacterial diseases are Acidoborax avene subspecies Cattleae, Acidoborax conzashi, Agrobacterium tumefaciens, Bulkholderia glume, Pectobacterium carotobora subspecies Carotobora, Pectobac Therium chrysansemi, Irwinia pirifoliae, Irwinia carotobora, Pseudomonas cold dog Passova actinidiae, Pseudomonas cold dog Passova lacrimans, Xanthomonas aboricola passova pruny, Xanthomonas campestris At least one causative organism selected from the group consisting of Pasova citri, Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas duckjae Pasova duckjae, Ralstonia solanasearum, and Clavibacter misiganensis subspecies Misiganensis
  • the method for preparing the composition for controlling phytobacterial diseases may additionally include the following fractionation step:
  • Another aspect of the present invention is a phytobacterial disease control comprising a treatment step of treating a plant with a composition for controlling phytobacterial diseases comprising a culture solution of the Phenibacillus LGI JCK-5075 strain deposited with accession number KCTC 14196BP or an extract thereof way.
  • phytobacterial diseases are Acidoborax avene subspecies Cattleae, Acidoborax conzashi, Agrobacterium tumefaciens, Bulkholderia glume, Pectobacterium carotobora subspecies Carotobora, Pectobac Therium chrysansemi, Irwinia pirifoliae, Irwinia carotobora, Pseudomonas cold dog Passova actinidiae, Pseudomonas cold dog Passova lacrimans, Xanthomonas aboricola passova pruny, Xanthomonas campestris At least one causative organism selected from the group consisting of Pasova citri, Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas duckjae Pasova duckjae, Ralstonia solanasearum, and Clavibacter misiganensis subspecies Misiganensis
  • the extract of the culture medium of the Pennybacillus LGI JCK-5075 strain deposited with accession number KCTC 14196BP contains at least one selected from the group consisting of PGP-A, PGP-B, PGP-C and PGP-D. may be one, preferably PGP-A, PGP-C and PGP-D.
  • the treatment step of the method for controlling phytobacterial diseases may be one or more methods selected from the group consisting of soil irrigation, soil irrigation, foliar spray, stem injection, foliage treatment, rhizome treatment and seed treatment.
  • it may be a soil drench, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a composition for controlling a phytobacterial disease comprising a culture solution of a Penibacillus elgii JCK-5075 strain or an extract thereof, a method for producing the same, and a method for controlling a phytobacterial disease, the culture solution of the strain or an extract thereof When treated with phytobacterial disease causative bacteria, antibacterial activity is extremely excellent, so it can be effectively used for controlling phytobacterial diseases.
  • 1 is a phylogenetic diagram shown through 16S rDNA sequencing of the Penibacillus elgii JCK-5075 strain.
  • Figure 2a is a graph and a photograph showing the control effect on the tomato blight of the Penibacillus LGI JCK-5075 strain culture medium.
  • Figure 2b is a graph and a photograph showing the control effect of the antibacterial active substance PGP (Pelgipeptin)-C on tomato blight.
  • Figure 3a is a graph and a photograph showing the control effect of the culture medium of the Penibacillus LGI JCK-5075 strain on Chinese cabbage blight.
  • Figure 3b is a graph and a photograph showing the control effect of the antibacterial active substance PGP-A on Chinese cabbage blight.
  • FIG. 4 is a graph and a photograph showing the control effect of the culture medium of the Penibacillus LGI JCK-5075 strain on pepper bacterial spot streak.
  • the present invention relates to a Penibacillus elgii JCK-5075 strain deposited with accession number KCTC 14196BP having antibacterial activity.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance is (weight/weight)% solid/solid, (weight/volume)%, and (weight/volume)% for solid/solid, and Liquid/liquid is (vol/vol) %.
  • Example 1 Penibacillus LGI ( Penibacillus elgii ) Molecular biological analysis and phylogenetic analysis of JCK-5075 strain
  • the strains isolated from the soil through the present invention were identified molecularly by sequencing of 16s rDNA.
  • the strain was inoculated in TSA (Tryptic soy agar) medium and then cultured with shaking at 30° C. for 1 day at 150 rpm.
  • Genomic DNA (gDNA) of the strain was extracted according to the protocol using an extraction kit (I-genomic BYF DNA Extraction Mini Kit, iNtRON).
  • the extracted gDNA of the strain and the PCR-premix (Polymerase chain reaction-premix) of Intron Biotechnology, and the primer set 9F/1512R of Table 1 below that can amplify the 16s rDNA of the strain were mixed. Then, the gene was amplified by PCR.
  • Genotech (Daejeon, Korea) was commissioned to analyze the nucleotide sequence of the amplified 16s rDNA PCR product to obtain the nucleotide sequence.
  • the strain was inoculated in TSB (Tryptic Soy Broth) medium and then cultured with shaking at 30° C. for 3 days at 150 rpm. The shaking culture was centrifuged at 4,500 rpm for 10 minutes to obtain 400 ml of a culture supernatant.
  • TSB Traptic Soy Broth
  • the 80% ethanol fraction contained PGP containing [M+H] + ion peaks at m/z 1073.3, 1011.6, 1087.3 and 1087.2 Da as a PGP composite material, and each of them based on retention time Pure separation was carried out into PGP-A, B, C and D, respectively.
  • PGP Penibacillus LGI JCK-5075
  • PGP-B Penibacillus LGI JCK-5075
  • PGP-C Penibacillus LGI JCK-5075
  • the molecular weight was confirmed by mass spectrometry (LC-ESI-MS, API2000, AB SCIEX, USA).
  • Example 3 Penibacillus LGI JCK-5075 strain culture filtrate and antibacterial active substance in vitro against various plant pathogens ( in vitro ) antibacterial activity assay
  • Phytopathogenic bacteria 15 Gram-negative bacteria ( Acidoborax avenae subsp. Cattleyae, causative agent of Phalaenopsis bacterial brown spot disease), Acidovorax konjaci (Cucumber black spot causative agent), Agrobacter Rum tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens , causative agent of root lump disease), Burkholderia glumae ( causative agent of bacterial blight in rice), Pectobacterium carotovora subsp.
  • Acidoborax avenae subsp. Cattleyae causative agent of Phalaenopsis bacterial brown spot disease
  • Acidovorax konjaci Cucumber black spot causative agent
  • Agrobacter Rum tumefaciens Agrobacterium tumefaciens , causative agent of root lump disease
  • Burkholderia glumae causative agent of bacterial
  • citri causative agent of citrus ulcer disease
  • Xanthomonas euvesicatoria the causative bacteria of pepper bacterial puncture
  • Xanthomonas oryzae pv. oryzae causative agent of white leaf blight in rice
  • Ralstonia solanacearum causative agent of bacterial blight in tomato
  • 1 type of gram-positive bacteria clavie
  • Bacter Mishiganensis Subspecies Mishiganensis Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis , the causative bacteria of tomato ulcer disease
  • Each phytopathogenic bacteria stored at -80°C was suspended in a 30% glycerol solution and then streaked in TSA medium and cultured under optimal conditions. After putting 5 ml of TSB into a test tube, blocking the entrance with a cotton plug and sterilizing, one colony of each cultured phytopathogenic bacterial strain was scraped with a loop and inoculated into the sterilized TSB. Shaking culture was performed under optimal growth conditions for each bacterium at 150 rpm. The optimal growth conditions for bacteria are shown in Table 2 below.
  • the phytopathogenic bacteria cultured in liquid in Example 3-1 was adjusted to an OD value of 0.1 using a UV spectrophotometer, diluted with TSB, adjusted to 10 6 CFU/ml, and inoculated into a 96-well microplate.
  • the Penny Bacillus LGI JCK-5075 culture filtrate was obtained by centrifugation and filtration using 0.2 um filter paper (membrane filter) from the Penny Bacillus LGI JCK-5075 culture medium.
  • the culture filtrate of Penibacillus LGI JCK-5075 was made to have a maximum concentration of 10% (v/v), and the PGP composite material of Example 2 ( The material obtained by eluting with 80% ethanol from Diaion HP-20 column chromatography and containing all 4 substances of pelzipeptin) and the reference drugs Streptomycin sulfate and Oxolinic acid were the best, respectively.
  • the concentration 200 ug/ml the concentration was sequentially lowered by two times using an octapipette from the next well. 1% methanol was used as a negative control, and the experiment was repeated 3 times.
  • the growth of phytopathogenic bacteria was measured by absorbance at 595 nm in a microplate reader (iMark, Bio-Rad), and the minimum growth inhibitory concentration (MIC) was determined as shown in Table 3.
  • MIC Minimum growth inhibitory concentration
  • JCK-5075 streptomycin sulfate ug/ml
  • Oxolinic acid ug/ml
  • culture filtrate %, v/v
  • PGP compound ug/ml
  • PGP-A, PGP-B, PGP-C, and PGP-D which are antibacterial active substances isolated from the Penibacillus LGI JCK-5075 strain
  • PGP-A, PGP-B, PGP-C, and PGP-D which are antibacterial active substances isolated from the Penibacillus LGI JCK-5075 strain
  • a total of 16 phytopathogenic bacteria were found in the culture filtrate and Pelji Growth was inhibited by peptin.
  • MIC Minimum growth inhibitory concentration of Pelzipeptin (PGPs) isolated from Penibacillus LGI JCK-5075 strain against various phytopathogenic bacteria phytopathogenic bacteria Minimum growth inhibitory concentration (MIC, ug/ml) PGP-A PGP-B PGP-C PGP-D A. avenae subsp. cattleyae 8 32 8 8 A. konjaci 16 32 8 16 A. tumefaciens 8 16 4 4 B. glumae >32 >32 32 32 C. michiganensis subsp. michiganensis 16 >32 32 32 P. carotovorum subsp. carotovorum 16 >32 32 P. chrysanthemi 16 32 32 P.
  • PGP-A PGP-B PGP-C PGP-D A. avenae subsp. cattleyae 8 32 8 A. konjaci 16 32 8 16 A. tumefaciens 8 16 4 4 B. glumae >32 >32 32
  • PGP-A inhibited the growth of other bacteria except for Burkholderia glumae , the causative agent of bacterial blight in rice, and PGP-C and PGP-D grew against all 16 phytopathogenic bacteria. inhibited. All phytopathogenic bacteria of the genus Xanthomonas used in the test were strongly inhibited by pelzipeptin, and PGP-A, PGP-C, and PGP-D were the minimum growth inhibitory concentration values for Xanthomonas aboricola fesova pruni. It was found to be 2 ug/ml.
  • Example 4 In vivo (Penibacillus LGI JCK-5075 strain culture medium and Pelzipeptin against tomato blight ( in vivo ) Evaluation of control effect
  • the culture solution of Penibacillus LGI JCK-5075 was diluted 5, 10, and 20 times using distilled water, and Tween-20 was added to a final concentration of 250 ug/ml. After dissolving PGP-C in methanol at about 5% of the final volume, it was diluted with distilled water to 200, 100, and 50 ug/ml.
  • the untreated group was treated with a solution in which Tween 20 was added at a level of 250 ug/ml, and as a control agent, an excellent pesticide (active ingredient: oxolinic acid 20% WP, Dongbang Agro, Korea) was diluted 1,000 times and treated. All treatment groups were treated with soil irrigation by 20 ml per pot.
  • the pathogen Ralstonia solanacearum colonies cultured for 3 days in TSA medium were harvested with sterile water to prepare a bacterial suspension, using a spectrophotometer (Bio-Rad)
  • the OD value at 600 nm was adjusted to 0.1 (10 8 CFU/ml)
  • the bacterial suspension was inoculated with soil drench by 20 ml per pot.
  • the inoculated plants were placed in a constant temperature and humidity room at 30° C. to maintain the dark conditions for 24 hours, then the photoperiod was 12 hours, the relative humidity was maintained at 75%, and the severity of the disease was investigated after 10 days.
  • the severity is an index from 0 to 4 (0: asymptomatic, 1: withered one leaf, 2: withered 2-3 leaves, 3: withered 4 or more leaves, 4: completely that was discarded).
  • the disease control value was calculated by substituting the disease severity value into Equation 1.
  • the culture medium of JCK-5075 and PGP-C reduced the occurrence of tomato blight in a concentration-dependent manner, and in particular, the control drug, a 5-fold dilution of the culture medium and PGP-C 200 ug/ml at a concentration of 200 ug/ml.
  • the control effect was similar to that of Ilpom (86%).
  • control was 81%, 58% and 36%, respectively
  • PGP-C was 200 ug/ml, 100 ug/ml and 50 ug/ml. Treatment showed 83%, 56% and 31% control, respectively.
  • Penibacillus LGI JCK-5075 strain After streaking the Penibacillus LGI JCK-5075 strain in TSA, it was cultured stationary for 3 days at 30°C. After putting 5 ml of TSB in a test tube, blocking the entrance with a face shield, and sterilizing, one colony of the JCK-5075 strain cultured for 1 day was inoculated by dipping in a loop. Then, it was cultured with shaking under aerobic conditions at 30°C and 150 rpm for 24 hours. After that, 50 ml of TSB was put into a 250 ml Erlenmeyer flask, the mouth was sealed and sterilized, and 1% of the liquid cultured JCK-5075 strain was inoculated and cultured with shaking for 3 days.
  • the JCK-5075 strain culture was diluted 5, 10, and 20 times using distilled water, and Tween 20 was added to a final concentration of 250 ug/ml.
  • PGP-A which showed strong activity against Pectobacterium kerotoborium subspecies kerotoborium
  • a solution in which Tween-20 was added at a level of 250 ug/ml was prepared, and as a control agent, a 1,000-fold diluted pesticide was prepared. All treatment groups were treated with soil irrigation by 20 ml per pot.
  • the pathogen Pectobacterium kerotoborium subspecies kerotoborium colonies cultured for 3 days in TSA medium were harvested with sterile water to prepare a bacterial suspension, and spectrophotometer (Bio-Rad) was used at 600 nm The OD value was adjusted to 0.1 (10 7 CFU/ml), and then, 20 ml of a bacterial suspension to which 10 mM magnesium chloride was added was inoculated by soil drench per pot. The inoculated plants were placed in a constant temperature and humidity room at 30°C to maintain dark conditions for 24 hours. After that, the photoperiod was 12 hours, relative humidity was maintained at 100%, and the severity of disease was investigated after 8 days.
  • the severity is an index from 0 to 5 (0: no symptoms, 1: one or two slender lesions, 2: two or more slender lesions, 3: chlorosis on leaves) occurrence, 4: necrosis of leaves, 5: complete death), and the control value was calculated using Equation 1 of Example 4-3.
  • the culture medium of JCK-5075 and PGP-A reduced the occurrence of tomato blight in a concentration-dependent manner, and the 5-fold dilution of the culture solution and 200 ug/ml treatment of PGP-A were treated with the control drug Ilpoom ( 89%) showed a similar control effect.
  • the control was 84%, 60% and 29%, respectively, and PGP-A was 200 ug/ml, 100 ug/ml and 50 ug/ml.
  • the control was 76%, 53% and 29%, respectively.
  • red pepper bacterial spot disease Cauliflower (Nongwoo Bio, Republic of Korea) red pepper seeds were filled with commercial horticultural tops manufactured by Bunong (Gyeongju, Korea). It was sown in a plastic cup (6 cm in diameter) and cultivated with a photoperiod of 12 hours. Red peppers of the 5-leaf or 6-leaf stage were transplanted into plastic cups with a diameter of 7.5 cm 24 hours before treatment.
  • the culture solution of Penibacillus LGI JCK-5075 was diluted 5, 10, and 20 times using distilled water, and Tween 20 was added to a final concentration of 250 ug/ml.
  • the untreated group was treated with a solution in which Tween 20 was added at a level of 250 ug/ml, and as a control agent, a 1,000-fold diluted pesticide was treated. All treatment groups were foliar sprayed with 5 ml per port.
  • the pathogen Xanthomonas euvezicatoria colonies cultured for 3 days in TSA medium were harvested with sterile water to prepare a bacterial suspension, and the OD value at 600 nm using a spectrophotometer (Bio-Rad) was adjusted to 0.1 ( 107 CFU/ml), and then the bacterial suspension was inoculated with soil drench at 5 ml per pot.
  • the inoculated plants were covered with a plastic cover to maintain 100% relative humidity, and placed in a constant temperature and humidity room at 25° C. to maintain dark conditions for 24 hours.
  • the severity is an index from 0 to 7 (0: asymptomatic, 1: no symptoms, 2: necrotic lesions on some lobules, 3: combined lesions on some leaves, 4: lesions on many leaves) These are combined, 5: lesions on many leaflets, 6: severe lesions and fallen leaves, 7: death of plants).
  • the disease control value was calculated using Equation 1 of Example 4-3.
  • the culture solution of JCK-5075 reduced the occurrence of red pepper bacterial spot streak in a concentration-dependent manner, and the 5-fold dilution of the culture solution showed a control effect similar to that of the control drug Ilpoom.
  • the control values were 67%, 51%, and 37%, respectively, and the control drug Ilpoom showed 76% control value.
  • the present invention relates to a composition for controlling a phytobacterial disease comprising a culture solution of a Penibacillus elgii JCK-5075 strain or an extract thereof, a method for preparing the same, and a method for controlling a phytobacterial disease, and more particularly, to a method for controlling antibacterial activity It relates to the control effect on the phytobacterial pathogen causative bacteria identified in the culture medium of the Penny bacillus LGI JCK-5075 strain having a and pelgipeptins isolated therefrom.

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Abstract

본 발명은 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물세균병 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 식물세균병 원인균에 처리하였을 때 항세균 활성이 월등히 우수하므로, 이를 효과적으로 식물세균병의 방제에 이용할 수 있다.

Description

페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물세균병 방제 방법
본 발명은 농촌진흥청의 지원 하에서 고유과제번호 1395066554, 과제번호 PJ015296042020에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 농촌진흥청, 연구사업명은 "과수화상병 등 현안문제 병해충 피해 경감 기술 개발(R&D)", 연구과제명은 "항균활성 및 유도저항성 기작의 길항미생물을 이용한 화상병 방제기술 개발", 주관기관은 전남대학교산학협력단, 연구기간은 2020-02-01~2020-12-31이다.
본 특허출원은 2020년 6월 29일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2020-0079097호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물세균병 방제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항세균활성을 갖는 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액 및 이로부터 분리한 펠지펩틴(Pelgipeptins)에서 확인된 식물세균병 원인균에 대한 방제 효과에 관한 것이다.
작물에 있어서 진균에 의한 식물병이 더 많고 심각한 피해를 일으키지만, 전세계적으로, 특히 습하고 더운 지역에서는 몇몇의 세균에 의한 피해도 매우 심각하다. 과학적 및 경제학적으로 전세계적으로 중요한 10가지 식물병원 세균을 2012년에 기술하였는데, 이에는 슈도모나스 시린개 패소바(Pseudomonas syringae pathovars), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 잔토모나스 오리재 패소바 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 잔토모나스 캄페스트리스 패소바(Xanthomonas campestris pathovars), 잔토모나스 액소노포디스 패소바(Xanthomonas axonopodis pathovars), 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 포도피어슨병균(Xylella fastidiosa), Dickeya (dadantii and solani), 및 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum) 등이 속한다.
세균에 의한 식물병은 다음의 세가지 이유로 인하여 방제가 매우 어렵다. 1) 최적의 환경하에서 매우 빠르게 증식한다는 것, 2) 토양매개 병원성 세균의 방제를 위한 훈증제가 부재하다는 것, 3) 많은 식물병원 세균은 식물체 내에 서식하는 반면에 많은 방제제는 식물체 표면에 처리된다는 것.
지난 수십년 동안에 세균병을 방제하기 위하여 항생물질과 동화합물 등과 같은 화학적 방제 방법을 사용하여 왔으나, 반복적인 사용으로 토양환경의 오염, 유익한 미생물의 감소, 잔류 독성 및 내성 균주 발생 등의 문제점이 발생하였다. 이에 따라 화학농약을 대체하기 위하여 미생물 및 천연물질을 이용한 생물학적 제제가 대안으로 제시되어 많은 연구가 진행되었다. 하지만, 생물학적 제제의 효능 및 종류는 아직 충분하지 않으므로 더 우수한 생물학적 제제의 개발이 요구되고 있다.
페니바실러스(Paenibacillus) 속은 그람양성, 호기성, 막대형, 내생포자 형성 세균이다. 상기 그룹의 주요 특성은 중성 및 알칼리 생장 조건에서 세포외 효소의 분비이다. 일부 종은 또한 다당류, 아미노산 및 이차 대사 산물, 예를 들면, 항생물질, 색소, 독소, 효소 저해제, 페로몬 및 식물 및 동물 생장 촉진제를 생산할 수 있다.
페니바실러스 속은 현재로 많은 연구의 주제이며, 이의 항균활성은 다양한 스펙트럼의 미생물에 대해 확인되었다. 일부 페니바실러스 균주는 식물병의 생물방제에 이용되었으며, 곰팡이 세포벽에 존재하는 주요 화합물인 키틴을 분해하는 능력 때문에 항균 생물방제제로서 중요하게 되었다.
이에 본 발명자들은 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 식물세균병 원인균에 처리하였을 때 항세균 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 항세균활성을 갖는 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 식물세균병 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물을 식물체에 처리하는 처리 단계를 포함하는 식물세균병 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 식물세균병 방제 용도에 관한 것이다.
본 발명은 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물세균병 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 식물세균병 방제용 조성물은 식물세균병 원인균에 처리하였을 때 우수한 항세균 활성을 나타낸다.
본 발명자들은 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 식물세균병 원인균에 처리하였을 때 항세균 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 항세균 활성을 갖는 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주이다.
본 발명의 다른 양태는 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물이다.
본 명세서상의 용어 “배양액”은 미생물을 배양한 후 상기 미생물을 포함한 것을 의미한다. '배양 상층액' 은 원심분리 방법을 통해 배양액으로부터 대부분의 미생물을 제거한 획득한 상층의 액을 의미하며, '상징액'이라고도 한다. '배양여액'은 원심분리 및 여과를 수행함으로써 배양액으로로부터 세균을 완전히 제거한 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 식물세균병은 아시도보락스 아베네 아종 카틀레애(Acidovorax avenae subsp. Cattleyae, 호접란 세균성갈색점무늬병 원인균), 아시도보락스 콘자시(Acidovorax konjaci, 오이 검은점무늬병 원인균), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens, 뿌리혹병 원인균), 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae, 벼 세균성알마름병 원인균), 펙토박테리움 카로토보라 아종 카로토보라(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora, 배추 무름병 원인균), 펙토박테리움 크리산쎄미(Pectobacterium chrysanthemi, 국화 세균성마름병 원인균), 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae, 사과나무 검은가지마름병 원인균), 어위니아 캐로토보라(Erwinia amylovora, 사과나무 화상병 원인균), 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디애(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, 키위 궤양병 원인균), 슈도모나스 시린개 패소바 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans, 오이 반점세균병 원인균), 잔토모나스 아보리콜라 패소바 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni, 복숭아 세균성구멍병 원인균), 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 시트리(Xanthomonas campestris pv. citri, 감귤 궤양병 원인균), 잔토모나스 유베시카토리아(Xanthomonas euvesicatoria, 고추 세균성점무늬병 원인균), 잔토모나스 오리재 패소바 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 벼 흰잎마름병 원인균), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum, 토마토 세균성풋마름병 원인균) 및 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, 토마토 궤양병 원인균)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 원인균으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양액의 추출물은 PGP(Pelgipeptin)-A, PGP-B, PGP-C 및 PGP-D로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 것일 수 있고, 바람직하게는 PGP-A, PGP-C 및 PGP-D인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 식물세균병 방제용 조성물의 제조방법이다.
본 발명에 있어서 식물세균병은 아시도보락스 아베네 아종 카틀레애, 아시도보락스 콘자시, 아그로박테리움 튜머파시엔스, 벌크홀데리아 글루메, 펙토박테리움 카로토보라 아종 카로토보라, 펙토박테리움 크리산쎄미, 어위니아 피리폴리애, 어위니아 캐로토보라, 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디애, 슈도모나스 시린개 패소바 라크리만스, 잔토모나스 아보리콜라 패소바 프루니, 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 시트리, 잔토모나스 유베시카토리아, 잔토모나스 오리재 패소바 오리재, 랄스토니아 솔라나세아룸 및 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 원인균으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물세균병 방제용 조성물의 제조방법은 다음과 같은 분획 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다:
이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 배양액으로부터 제1 활성분획을 획득하는 제1 분획 단계; 및
고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 제2 활성분획을 획득하는 제2 분획 단계.
상기 제1 분획 단계는 에탄올:증류수 = 0~100:100~0의 농도구배에 따라 전개하여 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 에탄올:증류수의 농도구배를 이용하여 제1 활성분획을 획득하는 과정은 순차적으로 0:100, 20:80, 40:60, 60:40, 80:20 및 100:0인 것일 수 있다.
상기 제2 분획 단계는 제1 분획 단계에서 생성된 6개의 제1 활성분획 중 1개 이상을 선택하여 수행되는 것일 수 있다. 바람직하게, 6개의 활성분획 중 5번째 활성분획(에탄올:증류수 = 80:20)을 선택하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물을 식물체에 처리하는 처리 단계를 포함하는 식물세균병 방제 방법이다.
본 발명에 있어서 식물세균병은 아시도보락스 아베네 아종 카틀레애, 아시도보락스 콘자시, 아그로박테리움 튜머파시엔스, 벌크홀데리아 글루메, 펙토박테리움 카로토보라 아종 카로토보라, 펙토박테리움 크리산쎄미, 어위니아 피리폴리애, 어위니아 캐로토보라, 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디애, 슈도모나스 시린개 패소바 라크리만스, 잔토모나스 아보리콜라 패소바 프루니, 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 시트리, 잔토모나스 유베시카토리아, 잔토모나스 오리재 패소바 오리재, 랄스토니아 솔라나세아룸 및 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 원인균으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양액의 추출물은 PGP-A, PGP-B, PGP-C 및 PGP-D로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 것일 수 있고, 바람직하게는 PGP-A, PGP-C 및 PGP-D인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물세균병 방제 방법의 처리 단계는 토양관주, 토양관수, 엽면분무, 수간주사, 경엽 처리, 근권 처리 및 종자 처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있고, 예를 들어, 토양관주인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물세균병 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 식물세균병 원인균에 처리하였을 때 항세균 활성이 월등히 우수하므로, 이를 효과적으로 식물세균병의 방제에 이용할 수 있다.
도 1은 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 16S rDNA 염기서열 분석을 통해 나타낸 계통도이다.
도 2a는 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양액의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 2b는 항세균활성 물질 PGP(Pelgipeptin)-C의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 3a는 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양액의 배추 무름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 3b는 항세균활성 물질 PGP-A의 배추 무름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 4는 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액의 고추 세균성점무늬병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
본 발명은 항세균활성을 갖는 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 페니바실러스 엘지아이( Penibacillus elgii ) JCK-5075 균주의 분자생물학적 분석 및 계통도 분석
본 발명을 통해 토양으로부터 분리한 균주는 16s rDNA의 염기서열 분석을 통해 분자생물학적으로 동정하였다. 균주를 TSA(Tryptic soy agar) 배지에 접종한 다음 30℃에서 1일 동안 150 rpm으로 진탕배양하였다. 추출 키트(I-genomic BYF DNA Extraction Mini Kit, iNtRON)를 이용하여 프로토콜에 따라서 균주의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다.
구체적으로, 균주의 추출된 gDNA와 인트론 바이오테크놀로지(iNtRON Biotechnology)의 PCR-프리믹스(Polymerase chain reaction-premix), 그리고 균주의 16s rDNA를 증폭할 수 있는 하기 표 1의 프라이머 세트 9F/1512R를 혼합한 후 PCR을 통해 유전자를 증폭하였다.
서열번호 명칭 서열(5'->3')
1 9F primer GAG TTT GAT CCT GGC TCA G
2 1512R primer ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT
PCR은 95℃ 5분을 시작으로 95 ℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 30초를 30번 반복한 후, 72℃ 7분, 12℃에서 증폭을 끝냈다. 증폭된 16s rDNA PCR 산물의 염기서열 분석을 제노텍(대전, 대한민국)에 의뢰하여 염기서열을 얻었다.
NCBI의 BlastN 검색을 이용하여 GenBank 데이터베이스의 염기서열을 비교한 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 JCK-5075 균주는 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii)로 동정되었으며, 상기 균주를 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075로 명명하였다.
실시예 2: 항세균활성 물질의 분리 및 구조 동정
본 발명의 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주가 생산하는 항세균활성 물질을 분리하기 위해, 상기 균주를 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지에 접종한 다음 30℃에서 3일간 150 rpm으로 진탕배양하였다. 상기 진탕배양한 배양물을 4,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 배양 상층액 400 ml을 얻었다.
상기 배양 상층액을 다이아이온(Diaion) HP-20 컬럼(7.5 cm 컬럼 내경 x 26 cm 컬럼 길이, IONTEC, 대한민국)에 가한 다음 0%(v/v), 20%(v/v), 40%(v/v), 60%(v/v), 80%(v/v) 및 100%(v/v) 에탄올 용매(에탄올:증류수 = 0~100:100~0)로 각각 1.6 L씩 용출하여 분획물을 감압 농축하였다.
더욱 순화하기 위하여 이 중 80% 에탄올 분획을 ShimPack C18(20 x 250 mm) 컬럼이 장착된 분취용 HPLC(Shimadzu, Japan)를 이용하였다. 용출용매는 0.05% 트리플루오르초산(TFA)이 첨가된 증류수 및 아세토나이트릴을 이용하였으며, 30%부터 46%의 0.05% 트리플루오르초산(TFA)이 첨가된 아세토나이트릴을 25분 동안 유속 10 ml/min으로 용출하였다. 활성물질은 PDA(Photodiode Array) 디텍터로 검출하였으며 검출파장은 230 nm에서 확인하였다.
상기 80% 에탄올 분획은 PGP 복합물질로서, m/z 1073.3, 1011.6, 1087.3 및 1087.2 Da에서 [M+H]+이온 피크를 포함하는 PGP를 함유하였고, 머무름시간(retention time)을 기준으로 이를 각각 PGP-A, B, C 및 D로 각각 순수 분리하였다.
페니바실러스 엘지아이 JCK-5075로부터 항세균 활성물질인 PGP(Pelgipeptins)-A, PGP-B, PGP-C 및 PGP-D를 분리하였고, 분리된 물질은 동결건조하여 양이온 모드의 액체 크로마토그래피 전기분무 질량분석법(LC-ESI-MS, API2000, AB SCIEX, USA)을 통해 분자량을 확인하였다.
실시예 3: 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양여액 및 항세균활성 물질의 다양한 식물병원균에 대한 인 비트로( in vitro ) 항세균활성 검정
3-1. 16종 식물병원성 세균 배양액의 준비
식물병원성 세균으로 15종의 그람음성 세균(아시도보락스 아베네 아종 카틀레애(Acidovorax avenae subsp. Cattleyae, 호접란 세균성갈색점무늬병 원인균), 아시도보락스 콘자시(Acidovorax konjaci, 오이 검은점무늬병 원인균), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens, 뿌리혹병 원인균), 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae, 벼 세균성알마름병 원인균), 펙토박테리움 카로토보라 아종 카로토보라(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora, 배추 무름병 원인균), 펙토박테리움 크리산쎄미(Pectobacterium chrysanthemi, 국화 세균성마름병 원인균), 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae, 사과나무 검은가지마름병 원인균), 어위니아 캐로토보라(Erwinia amylovora, 사과나무 화상병 원인균), 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디애(Pseudomonas syringae pv. actinidiae, 키위 궤양병 원인균), 슈도모나스 시린개 패소바 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans, 오이 반점세균병 원인균), 잔토모나스 아보리콜라 패소바 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni, 복숭아 세균성구멍병 원인균), 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 시트리(Xanthomonas campestris pv. citri, 감귤 궤양병 원인균), 잔토모나스 유베시카토리아(Xanthomonas euvesicatoria, 고추 세균성점무늬병 원인균), 잔토모나스 오리재 패소바 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 벼 흰잎마름병 원인균) 및 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum, 토마토 세균성풋마름병 원인균))과 1종의 그람양성세균(클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, 토마토 궤양병 원인균))을 이용하여 실험을 수행하였다.
-80℃에 저장되어 있던 각 식물병원성 세균을 30% 글리세롤 용액에 현탁한 후 TSA 배지에 스트리킹하여 최적조건에서 배양하였다. 시험관에 TSB 5 ml을 넣어 입구를 면전(cotton plug)으로 막고 멸균한 후, 배양시킨 각 식물병원성 세균 균주 콜로니 하나를 루프로 긁어 멸균한 TSB에 접종하였다. 150 rpm으로 각 세균의 최적 생장조건에서 진탕배양하였다. 세균의 최적 생장조건은 하기 표 2와 같다.
항세균활성 검정에 사용된 다양한 식물병원성 세균의 최적 생장조건
식물병원성 세균 배지 온도(℃) 배양일(day)
그람음성 세균(Gram-negative bacteria)
Acidovorax avenae subsp. cattleyae TSA, TSB 30 1
Acidovorax konjaci
Agrobacterium tumefaciens
Burkholderia glumae
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum
Pectobacterium chrysanthemi
Erwinia pyrifoliae
Erwinia amylovora
Pseudomonas syringae pv. actinidiae 25
Pseudomonas syringae pv. lachrymans 30
Xanthomonas euvesicatoria 28 2
Xanthomonas arboricola pv. pruni
Xanthomonas axonopodis pv. citri
Xanthomonas oryzae pv. oryzae 30
Ralstonia solanacearum
그람양성 세균(Gram-positive bacteria)
Clavibacter michiganensis subsp. miciganensis TSA, TSB 30 2
3-2. 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법을 이용한 인 비트로( in vitro ) 항세균활성 조사
실시예 3-1에서 액체배양한 식물병원성 세균은 UV 스펙트로포토메타를 사용하여 OD값을 0.1로 조정한 후, TSB로 희석하여 106 CFU/ml로 맞추고 96-웰 마이크로플레이트에 접종하였다.
페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 배양여액은 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 배양액으로부터 원심분리 및 0.2 um의 여과지(membrane filter)를 이용한 여과에 의하여 수득되었다.
그람음성 및 양성을 포함하는 16개의 다양한 식물병원성 세균이 접종된 TSB 배지에 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 배양여액은 최고농도 10%(v/v)이 되도록 하고, 실시예 2의 PGP 복합물질(Diaion HP-20 컬럼크로마토그레피에서 80% 에탄올로 용출하여 획득한 물질로서 펠지펩틴 4개의 물질을 모두 포함하고 있음)과 대조약제 스트렙토마이신 설페이트(Streptomycin sulfate) 및 옥솔린산(Oxolinic acid)을 각각 최고농도 200 ug/ml이 되도록 한 후, 다음 웰부터 옥타피펫을 사용하여 2배씩 순차적으로 농도를 낮추었다. 음성대조구로 1% 메탄올을 사용하였으며 실험은 3회 반복 수행하였다. 최적 생장조건에서 정치배양한 후 식물병원성 세균의 생육은 마이크로플레이트 리더(iMark, Bio-Rad)에서 595 nm의 흡광도로 측정하였고, 표 3과 같이 최소 생육저해 농도값(MIC)을 결정하였다.
페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양여액 및 PGP 복합물질의 다양한 식물병원성 세균에 대한 최소 생육저해 농도(MIC)
식물병원성 세균 최소 생육저해 농도(MIC)
JCK-5075 스트렙토마이신 설페이트
(ug/ml)		 옥솔린산 (ug/ml)
배양여액
(%, v/v)		 PGP 복합물질 (ug/ml)
c. avenae subsp. cattleyae 1.25 12.50 >200.00 0.05
A. konjaci 2.50 25.00 6.25 0.78
A. tumefaciens 0.63 6.25 200.00 0.78
B. glumae 10.00 100.00 12.50 0.10
C. michiganensis subsp. michiganensis 10.00 100.00 12.50 0.10
P. carotovorum subsp. carotovorum 2.50 25.00 12.50 1.56
P. chrysanthemi 5.00 50.00 >200 0.10
P. syringae pv. actinidiae 10.00 100.00 12.50 3.13
P. syringae pv. lachrymans 10.00 100.00 12.50 1.56
R. solanacearum 10.00 100.00 6.25 0.19
X. euvesicatoria 0.63 6.25 50.00 0.10
X. arboricola pv. pruni 0.31 3.13 12.50 0.39
X. axonopodis pv. citri 0.63 6.25 50.00 0.78
X. oryzae pv. oryzae 0.63 6.25 6.25 0.78
Erwinia pyrifoliae 2.5 12.5 3.125 0.39
Erwinia amylovora 1.25 6.25 3.125 0.39
표 3에서 확인할 수 있듯이, 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075의 항세균활성을 조사한 결과, 총 16개의 식물병원성 세균이 배양여액과 PGP 복합물질에 의해 생장이 저해되었다. 복숭아나무 세균성구멍병의 원인균인 잔토모나스 아보리콜라 패소바 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni)의 생장이 강하게 억제되었으며, 최소 생육저해 농도값(MIC)은 각각 0.31%, 3.13 ug/ml이었다. 시험에 사용된 아그로박테리움 튜메페시언스와 모든 잔토모나스(Xanthomonas) 속 식물병원성 세균은 JCK-5075 균주의 배양여액과 PGP 복합물질에 의해 매우 강하게 억제되었다.
페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주로부터 분리한 항세균활성 물질인 PGP-A, PGP-B, PGP-C 및 PGP-D의 항세균 활성을 조사한 결과, 총 16개의 식물병원성 세균이 배양여액과 펠지펩틴에 의해 생장이 저해되었다.
페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주로부터 분리한 펠지펩틴(PGPs)의 다양한 식물병원성 세균에 대한 최소 생육저해 농도(MIC)
식물병원성 세균 최소 생육저해 농도(MIC, ug/ml)
PGP-A PGP-B PGP-C PGP-D
A. avenae subsp. cattleyae 8 32 8 8
A. konjaci 16 32 8 16
A. tumefaciens 8 16 4 4
B. glumae >32 >32 32 32
C. michiganensis subsp. michiganensis 16 >32 32 32
P. carotovorum subsp. carotovorum 16 >32 32 32
P. chrysanthemi 16 32 32 32
P. syringae pv. actinidiae 32 >32 32 32
P. syringae pv. lachrymans 32 >32 32 32
R. solanacearum 32 >32 32 32
X. euvesicatoria 4 16 2 4
X. arboricola pv. pruni 2 8 2 2
X. citri 4 16 4 4
X. oryzae pv. oryzae 4 16 4 4
E. pyrifoliae 16 >64 16 32
E. amylovora 4 32 4 8
PGP-A는 벼 세균성알마름병의 원인균인 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae)를 제외한 나머지 세균들에 대해 생장을 억제시켰으며, PGP-C 및 PGP-D는 16개의 식물병원성 세균 모두에 대하여 생장을 저해하였다. 시험에 사용된 모든 잔토모나스(Xanthomonas) 속 식물병원성 세균은 펠지펩틴에 의해 강하게 억제되었으며, PGP-A, PGP-C, PGP-D는 잔토모나스 아보리콜라 페소바 프루니에 대한 최소 생육저해 농도값이 2 ug/ml로 나타났다.
실시예 4: 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양액 및 펠지펩틴의 토마토 풋마름병에 대한 인 비보( in vivo ) 방제효과 평가
4-1. 식물체 준비
토마토 풋마름병의 원인균인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에 대한 방제활성을 조사하기 위해 서광(팜한농) 토마토 씨앗을 부농(경주, 대한민국)에서 제조한 상업용 원예 상토로 채워진 플라스틱 컵(직경 6 cm)에 파종하여 광주기 12시간을 주어 재배하였다. 3엽기나 4엽기의 토마토를 처리 24시간 전에 직경 7.5 cm의 플라스틱 컵에 이식하였다.
4-2. 시료 처리
페니바실러스 엘지아이 JCK-5075의 배양액은 증류수를 이용하여 5, 10 및 20배 희석하였고, 트윈 20(Tween-20)을 최종농도 250 ug/ml 수준이 되도록 첨가하였다. PGP-C는 최종 부피의 5% 정도의 메탄올로 용해한 후에 200, 100 및 50 ug/ml이 되도록 증류수로 희석하였다. 무처리구는 트윈 20이 250 ug/ml 수준으로 첨가된 용액을 처리하였으며, 대조약제로는 일품 농약(활성성분: oxolinic acid 20% WP, 동방아그로, 대한민국)을 1,000배 희석하여 처리하였다. 모든 처리구는 포트 하나 당 20 ml씩 토양관주 처리하였다.
4-3. 인 비보( In vivo ) 생물검정
실시예 4-2의 시료 처리로부터 24시간 후 TSA 배지에서 3일간 배양한 병원균 랄스토니아 솔라나세아룸 콜로니를 멸균수로 수확하여 균 현탁액을 준비하고, 스펙트로포토미터(Bio-Rad)를 사용하여 600 nm에서 OD값을 0.1(108 CFU/ml)로 조절한 다음, 균 현탁액을 포트 당 20 ml씩 토양관주 접종하였다. 접종한 식물체를 30℃의 항온 항습실에 두어 24시간 동안 암조건을 유지시켜주었고, 그 후 광주기 12시간, 상대습도 75%를 유지시켜주었으며 10일 후에 발병도를 조사하였다.
발병도는 0부터 4까지의 지수(0: 증상이 나타나지 않은 것, 1: 한 개의 잎이 시든 것, 2: 2 내지 3개의 잎이 시든 것, 3: 4개 이상의 잎이 시든 것, 4: 완전히 고사한 것)로 나타내었다. 병 방제가는 발병도 값을 식 1에 대입하여 계산하였다.
[식 1]
방제가(%) =
Figure PCTKR2021008125-appb-I000001
도 2a 및 2b에서 확인할 수 있듯이, JCK-5075의 배양액과 PGP-C는 토마토 풋마름병 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 특히 배양액 5배 희석액과 PGP-C 200 ug/ml의 농도에서 대조약제인 일품(86%)과 비슷한 방제효과를 나타냈다. 배양액은 5배, 10배 및 20배 희석하여 처리하였을 때, 각각 방제가 81%, 58% 및 36%가 나타났으며 PGP-C를 200 ug/ml, 100 ug/ml 및 50 ug/ml으로 처리하였을 때, 각각 방제가 83%, 56% 및 31%가 나타났다.
따라서 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075의 배양액 및 분리한 항세균물질 PGP-C가 토마토 풋마름병에 대하여 우수한 방제효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
실시예 5. 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양액 및 펠지펩틴의 배추 무름병에 대한 인 비보( in vivo ) 방제효과 평가
5-1. 식물체 준비
배추 무름병의 원인균인 펙토박테리움 케로토보륨 아종 케로토보륨(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)에 대한 방제활성을 조사하기 위해 춘광(사카다코리아, 서울, 대한민국) 배추 씨앗을 부농(경주, 대한민국)에서 제조한 상업용 원예 상토로 채워진 플라스틱 컵(직경 6 cm)에 파종하여 광주기 12시간을 주어 재배하였다. 5엽기나 6엽기의 배추를 처리 24시간 전에 직경 7.5 cm의 플라스틱 컵에 이식하였다.
5-2. 시료 처리
페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주를 TSA에 스트리킹 한 후 30℃에서 3일 동안 정치배양 하였다. 시험관에 TSB 5 ml을 넣어 입구를 면전으로 막고 멸균한 후, 1일간 정치배양한 JCK-5075 균주의 콜로니 하나를 루프에 찍어 접종하였다. 그리고 30℃150 rpm에서 24시간 동안 호기적인 조건에서 진탕배양하였다. 이후 250 ml 삼각플라스크에 TSB 50 ml을 넣어 입구를 면전으로 막고 멸균한 후, 액체배양한 JCK-5075 균주 1%를 접종하여 3일 동안 진탕배양하였다.
JCK-5075 균주 배양액을 증류수를 이용하여 5, 10 및 20배 희석하였고, 트윈 20을 최종농도 250 ug/ml 수준이 되도록 첨가하였다. 분리한 물질 중 펙토박테리움 케로토보륨 아종 케로토보륨에 대하여 강한 활성을 나타낸 PGP-A는 메탄올로 용해한 후에 200, 100 및 50 ug/ml이 되도록 증류수로 희석하였으며, 메탄올의 최종 농도는 5%였다. 무처리구는 트윈-20이 250 ug/ml 수준으로 첨가된 용액을 준비하였으며, 대조약제로는 일품 농약을 1,000배 희석하여 준비하였다. 모든 처리구는 포트 하나 당 20 ml씩 토양관주 처리하였다.
5-3. 인 비보( In vivo ) 생물검정
처리 24시간 후 TSA 배지에서 3일간 배양한 병원균 펙토박테리움 케로토보륨 아종 케로토보륨 콜로니를 멸균수로 수확하여 균 현탁액을 준비하고, 스펙트로포토미터(Bio-Rad)를 사용하여 600 nm에서 OD값을 0.1(107 CFU/ml)로 조절한 다음, 10 mM의 염화마그네슘을 첨가한 균 현탁액을 포트 당 20 ml씩 토양관주 접종하였다. 접종한 식물체를 30℃의 항온 항습실에 두어 24시간 동안 암조건을 유지시켜주었다 그 후 광주기 12시간, 상대습도 100%를 유지시켜주었고 8일 후 발병도를 조사하였다.
발병도는 0부터 5까지의 지수(0: 증상이 나타나지 않은 것, 1: 한 개 또는 두 개의 가느다란 병반이 생긴 것, 2: 2개 이상의 가느다란 병반이 생긴 것, 3: 잎에 백화현상이 발생한 것, 4: 잎의 괴사가 발생한 것, 5: 완전히 고사한 것)로 나타내었고, 방제가는 실시예 4-3의 식 1을 사용하여 계산하였다.
도 3a 및 3b에서 확인할 수 있듯이, JCK-5075의 배양액과 PGP-A는 토마토 풋마름병 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 배양액 5배 희석액과 PGP-A 200 ug/ml 처리구는 대조약제인 일품(89%)과 비슷한 방제효과를 나타냈다. 배양액은 5배, 10배 및 20배 희석하여 처리하였을 때, 각각 방제가 84%, 60% 및 29%로 나타났으며 PGP-A를 200 ug/ml, 100 ug/ml 및 50 ug/ml으로 처리하였을 때, 각각 방제가 76%, 53% 및 29%로 나타났다.
따라서 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075의 배양액 및 분리한 항세균물질 PGP-A가 배추 무름병에 대하여 우수한 방제효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
실시예 6. 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주 배양액 및 펠지펩틴의 고추 세균성점무늬병에 대한 인 비보( in vivo ) 방제효과 평가
6-1. 식물체 준비
고추 세균성점무늬병의 원인균인 잔토모나스 유베지카토리아(Xanthomonas euvesicatoria)에 대한 방제활성을 조사하기 위해 조생신탑(농우바이오, 대한민국) 고추 씨앗을 부농(경주, 대한민국)에서 제조한 상업용 원예 상토로 채워진 플라스틱컵(직경 6 cm)에 파종하여 광주기 12시간을 주어 재배하였다. 5엽기나 6엽기의 고추를 처리 24시간 전에 직경 7.5 cm의 플라스틱 컵에 이식하였다.
6-2. 시료 처리
페니바실러스 엘지아이 JCK-5075의 배양액은 증류수를 이용하여 5, 10 및 20배 희석하였고, 트윈 20을 최종농도 250 ug/ml 수준이 되도록 첨가하였다. 무처리구는 트윈 20이 250 ug/ml 수준으로 첨가된 용액을 처리하였으며, 대조약제로는 일품 농약을 1,000배 희석하여 처리하였다. 모든 처리구는 포트 하나 당 5 ml씩 엽면분무 처리하였다.
6-3. 인 비보( In vivo ) 생물검정
처리 24시간 후 TSA 배지에서 3일간 배양한 병원균 잔토모나스 유베지카토리아 콜로니를 멸균수로 수확하여 균 현탁액을 준비하고, 스펙트로포토미터(Bio-Rad)를 사용하여 600 nm에서 OD값을 0.1(107 CFU/ml)로 조절한 다음, 균 현탁액을 포트 당 5 ml씩 토양관주 접종하였다. 접종한 식물체는 플라스틱 커버를 덮어 상대습도 100%를 유지시켜주었으며, 25℃의 항온 항습실에 두어 24시간 동안 암조건을 유지시켜준 후 광주기 12시간을 주어 16일 후에 발병도를 조사하였다.
발병도는 0부터 7까지의 지수(0: 증상이 나타나지 않은 것, 1: 무병징, 2: 일부 소엽에 괴사성 병반이 나타난 것, 3: 일부 잎에 병반이 합쳐진 것, 4: 많은 잎에 병반이 합쳐진 것, 5: 많은 소엽에 병반이 발생한 것, 6: 심각한 병반과 낙엽이 발생한 것, 7: 식물체가 고사한 것)로 나타내었다. 병 방제가는 실시예 4-3의 식 1을 사용하여 계산하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, JCK-5075의 배양액은 고추 세균성점무늬병 발생을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 배양액 5배 희석액은 대조약제인 일품과 비슷한 방제효과를 나타냈다. 배양액은 5배, 10배 및 20배 희석하여 처리하였을 때, 각각 방제가 67%, 51% 및 37%가 나타났으며 대조약제인 일품은 76%의 방제가가 나타났다.
따라서 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075의 배양액이 고추 세균성점무늬병에 대하여 우수한 방제효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
본 발명은 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물, 이의 제조방법 및 식물세균병 방제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항세균활성을 갖는 페니바실러스 엘지아이 JCK-5075 균주의 배양액 및 이로부터 분리한 펠지펩틴(Pelgipeptins)에서 확인된 식물세균병 원인균에 대한 방제 효과에 관한 것이다.
Figure PCTKR2021008125-appb-I000002

Claims (12)

  1. 항세균활성을 갖는 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주.
  2. 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 식물세균병은 아시도보락스 아베네 아종 카틀레애(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락스 콘자시(Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae), 펙토박테리움 카로토보라 아종 카로토보라(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora), 펙토박테리움 크리산쎄미(Pectobacterium chrysanthemi), 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae), 어위니아 캐로토보라(Erwinia amylovora), 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디애(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 슈도모나스 시린개 패소바 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 잔토모나스 아보리콜라 패소바 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 시트리(Xanthomonas campestris pv. citri), 잔토모나스 유베시카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 오리재 패소바 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 및 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 원인균으로 하는 것인, 식물세균병 방제용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 추출물은 PGP(Pelgipeptin)-A, PGP-B, PGP-C 및 PGP-D로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 것인, 식물세균병 방제용 조성물.
  5. 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 식물세균병 방제용 조성물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 식물세균병은 아시도보락스 아베네 아종 카틀레애(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락스 콘자시(Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae), 펙토박테리움 카로토보라 아종 카로토보라(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora), 펙토박테리움 크리산쎄미(Pectobacterium chrysanthemi), 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae), 어위니아 캐로토보라(Erwinia amylovora), 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디애(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 슈도모나스 시린개 패소바 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 잔토모나스 아보리콜라 패소바 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 시트리(Xanthomonas campestris pv. citri), 잔토모나스 유베시카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 오리재 패소바 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 및 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 원인균으로 하는 것인, 식물세균병 방제용 조성물의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 방법은 다음과 같은 분획 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 식물세균병 방제용 조성물의 제조방법:
    이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 배양액으로부터 제1 활성분획을 획득하는 제1 분획 단계; 및
    고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 제2 활성분획을 획득하는 제2 분획 단계.
  8. 제7항에 있어서, 제1 분획 단계는 증류수:에탄올 = 100~0:0~100의 농도구배에 따라 전개하여 수행되는 것인, 식물세균병 방제용 조성물의 제조방법.
  9. 기탁번호 KCTC 14196BP로 기탁된 페니바실러스 엘지아이(Penibacillus elgii) JCK-5075 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물세균병 방제용 조성물을 식물체에 처리하는 처리 단계를 포함하는 식물세균병 방제 방법.
  10. 제9항에 있어서, 식물세균병은 아시도보락스 아베네 아종 카틀레애(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락스 콘자시(Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 벌크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae), 펙토박테리움 카로토보라 아종 카로토보라(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora), 펙토박테리움 크리산쎄미(Pectobacterium chrysanthemi), 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae), 어위니아 캐로토보라(Erwinia amylovora), 슈도모나스 시린개 패소바 액티니디애(Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 슈도모나스 시린개 패소바 라크리만스(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 잔토모나스 아보리콜라 패소바 프루니(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 잔토모나스 캄페스트리스 패소바 시트리(Xanthomonas campestris pv. citri), 잔토모나스 유베시카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 오리재 패소바 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 및 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 원인균으로 하는 것인, 식물세균병 방제 방법.
  11. 제9항에 있어서, 추출물은 PGP(Pelgipeptin)-A, PGP-B, PGP-C 및 PGP-D로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 것인, 식물세균병 방제 방법.
  12. 제9항에 있어서, 처리 단계는 토양관주, 토양관수, 엽면분무, 수간주사, 경엽 처리, 근권 처리 및 종자 처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것인, 식물세균병 방제 방법.
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