KR20180023262A

KR20180023262A - 페니바실러스 엘기로부터 추출한 신규 추출물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180023262A
Application number: KR1020160108294A
Authority: KR
Inventors: 이철원; 김주은
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2016-08-25
Filing date: 2016-08-25
Publication date: 2018-03-07
Also published as: KR101935816B1

Abstract

본 발명은 페니바실러스 (Paenibacillus )에서 추출 및 단리한 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 신규 화합물은 리포펩티드에 속하는 신규 펠기펩틴 유도체로서 항세균 활성이 우수하고 세포 독성이 매우 낮아 항세균제, 방제제 및 약학 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.

Description

페니바실러스 엘기로부터 추출한 신규 추출물 및 이의 용도{Novel extract from Paenibacillus elgii and uses thereof}

본 발명은 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii) 균주로부터 추출한 신규 화합물 및 이를 이용한 용도에 관한 기술이다.

다양한 미생물로부터 추출된 여러 화합물들은 항생제 등 여러 용도로 이용되고 있다. 미생물의 종류에 따라 생산, 분비하는 화합물들은 공통된 속이나 종으로 분류되는 미생물에서 유사할 수 있다.

그러나, 유사한 화합물들이라도, 화합물의 일부 작용기의 차이 등 화합물의 미세한 구조 차이에 의해 항생 효과가 현저히 달라질 수 있고, 특정 병원체에 고도로 특이적인 효과가 나타날 수도 있다.

예를 들어 한국등록특허 제1565231호, 한국등록특허 제0729938호, 한국등록특허 제0500397호 등은 모두 페니바실러스(paenibacillus) 속에 포함되는 페닐바실러스 균주를 이용하는 발명이나, 페니바실러스로부터 얻은 추출물 등의 용도는 서로 상이하다.

이와 같이, 이미 연구가 활발한 균주나 이들로부터 얻을 수 있는 화합물에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있더라도, 기존에 알려진 균주로부터 신규 화합물을 얻을 수도 있고, 기존에 알려진 화합물의 새로운 용도를 개발할 수 있는 가능성이 있다.

한국 등록특허 제1565231호 한국 등록특허 제0729938호 한국 등록특허 제0500397호

본 발명은 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)로부터 신규 화합물을 추출하고 신규 화합물의 용도를 제공하고자 한다.

본 발명은 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)의 배양액으로부터 추출한 [화합물 I]을 포함하는 추출물 및 이를 수득하는 방법을 제공한다.

[화합물 I]

본 발명은 항세균 활성을 가지는 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 항세균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)로부터 추출한 신규 화합물은 항세균 활성이 우수하면서 세포독성이 매우 낮아 안전한 항세균 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)로부터 추출한 신규 화합물을 나타낸다.
도 2는 신규 화합물인 펠기펩틴 L(pelgipeptin L)의 질량 스펙트럼 결과이다.
도 3은 신규 화합물인 펠기펩틴 L(pelgipeptin L)의 MS/MS 스펙트럼 결과이다.
도 4는 신규 화합물인 펠기펩틴 L (pelgipeptin L)의 2차원 TOCSY (2-dimensional total correlation spectroscopy) 스펙트럼 분석 결과이다.
도 5은 공지된 펠기펩틴 A (pelgipeptin A)의 2차원 TOCSY (2-dimensional total correlation spectroscopy) 스펙트럼 분석 결과이다.
도 6은 신규 화합물인 (A) 펠기펩틴 L (pelgipeptin L) 및 (B) 펠기펩틴 A (pelgipeptin A)의 구조 차이를 나타낸다.
도 7은 신규 화합물인 펠기펩틴 L (pelgipeptin L)와 펠기펩틴 A의 아미노산 서열 비교를 나타낸다.

이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예 에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 페니바실러스 (Paenibacillus), 바람직하게는 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)로부터 추출한 신규 화합물 및 이를 이용한 항세균 조성물을 제공한다.

본 발명의 신규 화합물은 페니바실러스로부터 단리한 화합물로, 아래 [화합물 I]과 같다. [화합물 I]은 현재까지 알려진 펠기펩틴 유도체들과 아미노산 서열이 동일 또는 유사하나, 기존의 펠기펩틴 유도체들에 비해 항세균 활성이 우수하면서 세포독성은 현저히 낮은 화합물에 해당한다. 특히, 본 발명의 신규 화합물인 [화합물 I]는 [화합물 Ⅱ]인 펠기펩틴 A(pelgipeptin A)와 동일한 분자량을 가지고, [화합물 Ⅱ]의 β로 표시한 단 한 곳에서 펠기펩틴 A와 상이한 알킬기를 가진다(도 6 참조). 그러나, [화합물 I]을 유효성분으로 포함하는 항세균 조성물은 펠기펩틴 A를 포함한 항세균 조성물에서 예측할 수 없는 효과를 가진다.

[화합물 I]

[화합물 Ⅱ]

본 발명의 신규 화합물인 [화합물 I]은 페니바실러스(Paenibacillus) 속(genus)에 포함하는 페니바실러스 균주로부터 추출 및 단리할 수 있다. 바람직하게는 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)로부터 [화합물 I]을 추출 및 단리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 페니바실러스 속에 속하는 여러 페니바실러스 균주도 신규 화합물을 추출할 수 있는 후보 균주가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 신규 화합물인 [화합물 I]은 그람양성균 및 그람음성균 모두에 대해 항세균 활성을 나타내고, 다른 펠기펩틴 유도체들과 비교하여 세포 독성이 현저히 낮다.

본 발명에서 페니바실러스(Paenibacillus)로부터 단리한 신규 화합물은 리포펩타이드에 속하는 화합물로 리포펩타이드를 수득, 분리, 추출, 단리 및 분석할 수 있는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 페니바실러스를 배양한 배양액에서 균체를 제거한 후 상등액을 얻어 액체 형태로 신규 화합물을 얻거나, 추가 분획 및 건조 과정을 거쳐 건조분말 형태 등으로도 얻을 수 있다. 추출을 위해 유기 용매 등을 이용한 크로마토그래피, 이온-교환 방법, 액체-액체 추출 방법 등 본 분야에 공지된 여러 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 페니바실러스(Paenibacillus)로부터 단리한 신규 화합물은 항세균 활성이 우수하고 세포독성이 적어 항세균제, 방제제 또는 약제학적으로 허용되는 담체 등에 혼합한 약제 조성물로 이용할 수 있다.

본 발명의 신규 화합물은 페니바실러스의 배양액, 발효 브로스(broth) 또는 이들로부터 분리한 상등액에 해당하는 액체 형태일 수 있고, 상등액을 동결 건조한 건조 형태일 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 신규 화합물인 [화합물 I]을 유효성분으로 하고, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보강제 또는 이들 중 하나 이상과의 혼합될 수 있다. 투여 형태에 따라 적절한 부형제를 추가할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여를 위해 물, 에탄올, 글리콜, 글리세린, 감미료, 착향물질, 에멀전제, 현탁제제 또는 이들을 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 [화합물 I]은 다른 펠기펩틴 유도체와 같이 항세균성(antibacterial)을 가진다. [화합물 I]의 항세균 대상인 균은 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin resistant Staphylococcus aureus)을 포함한 그람양성균 및 그람음성균 모두를 포함할 수 있다. 구체적으로, 대장균(E. coli), 살모넬라균(S. typhimurium), 녹농균(P. aeruginosa), 고초균(B. subtilis), 포도상구균(S. epidermidis), 황색포도상구균(S. aureus), 장내구균(E. faecalis), 프로튜스 불가리스(P. vulgaris), 칸디다 알빅칸스(C. albicans), 시들음병균(F. oxysporum), 붉은곰팡이병균(F. graminearum), 푸사륨 모닐리포르메(F. moniliforme), 리족토니아 솔라니(R. solani), 콜레토트리쿰 리니(Colletotrichum lini) 및 메티실린 내성 황색포도상구균 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)로 이루어진 군에서 하나 이상의 균에 대하여 항세균 활성을 가질 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시하기 위해 보다 구체적인 실시예에 대하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 실시예로서 본 발명이 이에 제한되어 해석되는 것은 아니다.

페니바실러스 엘기 ( Paenibacillus elgii ) 균주의 배양

페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii) 균주로 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii) BC34-6 균주를 전남 곡성에 위치한 미생물 방제센터로부터 분양 받아 사용하였다. 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii) BC34-6 균주를 TS배지(pancreatic digest of casein 17g, papaic digest of soybean 3g, dextrose 2.5g, sodium chloride 5g, dipotassium phosphate 2.5g/L)를 이용하여 30℃에서 150rpm으로 2일 동안 배양 한 후 M9배지(Na₂HPO₄ 6g, KH₂PO₄ 3g, NH₄Cl 1g, NaCl 0.5 g/L, 1% sucrose, 0.5% yeast extract)에 접종하여 30℃에서 150rpm으로 5일간 배양하였다.

페니바실러스 엘기 ( Paenibacillus elgii ) 균주의 배양액으로부터 신규 화합물 단리 및 신규 화합물의 확인

페니바실러스 엘기 (Paenibacillus elgii) BC34-6의 항세균활성 물질을 정제하기 위해 실시예 1의 배양 조건에 따라, 12L 배양한 배양액을 4,585×g 으로 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액만을 취하였다. 취한 상등액을 Diaion HP-20 (IONTEC, Korea)컬럼 크로마토그래피를 사용하여 물과 에탄올(100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 20:80, 0:100 v/v)의 분획을 받았다. 각각의 분획을 진공 농축 증발기(evaporator)로 증발 시킨 후 AB Sciex사 API2000을 이용하여 분석하였다. 그 결과 80% 에탄올 분획에서 분자량 1073.3을 갖는 신규한 화합물을 확인하였다(도 2). 확인된 신규 화합물을 단리하기 위해 고성능액체 크로마토그래피 (Shimadzu HPLC, Japan)를 실시하였다. 고정상 컬럼은 μBondapak C₁₈(3.9×300 mm, Waters)을 이용하였으며, 이동상 용매는 0.05 부피%(v/v)의 트리플루오로 아세트산이 포함된 물과 아세토니트릴을 사용하였다. 아세토니트릴 농도는 40 부피%(v/v)에서 42 부피%(v/v)를 사용하였고, 유속은 10㎖/min, 파장 230nm의 조건에서 수행하였다. 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 단리한 화합물 중 1073.3m/z의 분자량을 갖는 화합물은 공개된 것이 아니며, 이는 페르메티나의 부류에 속하는 리포펩타이드 중 하나이다. 신규 화합물은 LC-MS/MS 분석에 의해 특정되었고, LC-MS/MS 분석으로 얻은 스펙트럼은 도 3에 도시된 바와 같다. 질량 스펙트럼에서 관찰된 1073.3m/z의 신호는 펠기펩틴 A(pelgipeptin A)와 같은 분자량을 갖고 있으나, 핵자기공명(nuclear magnetic resonance) 측정 스펙트럼을 통해 지질의 탄소사슬의 형태 차이를 확인하였고(도 4, 5), 이를 통해 펠기펩틴 A와 화합물 구조가 다른 신규한 화합물인 것을 알 수 있었다(도 6, 7). 신규한 화합물을 펠기펩틴 L (pelgipeptin L)로 명명하였다.

페니바실러스 엘기 ( Paenibacillus elgii ) 균주의 배양액에서 단리한 신규 화합물의 항세균활성 시험

실시예 2에서 단리하여 확인한 신규 화합물인 펠기펩틴 L(pelgipeptin L)의 활성을 시험하기 위해 최저억제농도(Minimum inhibitory concentration)을 측정하였다. 펠기펩틴 L (pelgipeptin L)를 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin resistant Staphylococcus aureus)을 포함한 그람양성균과 그람음성균에 처리하였고, 모든 균에 대해 항세균 활성이 나타나는 것을 확인하였다(표 1). 이러한 결과는 단리한 신규 화합물인 펠기펩틴 L (pelgipeptin L)가 여러 가지 항세균효과를 나타낼 수 있으며, 방제용 제제로도 이용될 수 있음을 보여준다.

Strain		최저억제농도(㎍/㎖)
그람음성균	E. coli KCTC 1682	2
	S. typhimurium KCTC 1926	4
	P. aeruginosa KCTC 1637	4
그람양성균	B. subtilis KCTC 3068	4
	S. epidermidis KCTC 1917	2
	S. aureus KCTC 1621	4
	MRSA CCARM 3089	8
	MRSA CCARM 3090	8
	MRSA CCARM 3095	8

페니바실러스 엘기 ( Paenibacillus elgii ) 균주의 배양액에서 단리한 신규 화합물의 독성 시험

실시예 2에서 단리하여 확인한 신규 화합물인 펠기펩틴 L (pelgipeptin L)의 독성을 시험하기 위해 용혈현상 (Hemolysis assay)을 측정하였다. 갓 채취한 혈액을 인산완충식염수 (phosphate buffer saline)에 세척한 후 1,000×g 에서 10분간 원심분리 하여 혈장을 제거하고 적혈구만을 얻어내어 최종 4 부피%(v/v)의 적혈구를 시험에 사용하였다. 마이크로플레이트리더(Microplate reader)를 분석에 이용하였으며, 파장은 405nm에서 측정하였다. 독성 시험은 페르메니타 리포펩타이드 과에 속한 펠기펩틴 C, D와 비교하였으며, 200μM처리하였을 때 약 50%에 가까운 독성 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 그리고, 신규 화합물인 펠기펩틴 L(pelgipeptin L)의 최저억제농도의 평균 값(GM)과 용혈현상이 50% 일어났을 때의 농도(HC₅₀) 및, 이를 최저억제농도의 평균값으로 나눈 값(TI)을 통해 항세균활성 효과가 높으면서 세포 독성은 매우 낮은 것을 알 수 있었다(표 2).

펩타이드	최저억제농도 평균(μM)	HC₅₀(μM)	TI(HC_50/GM)
펠기펩틴 C (pelgipeptin C)	3.4	80	23.7
펠기펩틴 D (pelgipeptin D)	4.3	72	16.8
펠기펩틴 L (pelgipeptin L)	4.6	> 200	> 43.9

Claims

페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)의 배양액으로부터 추출한 하기 [화합물 I]을 포함하는 추출물.
[화합물 I]
항세균 활성을 가지는 페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 항세균용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 유효성분은 하기 [화합물 I]인 항세균용 조성물.
[화합물 I]
제3항에 있어서,
항세균 대상은 대장균(E. coli), 살모넬라균(S. typhimurium), 녹농균(P. aeruginosa), 고초균(B. subtilis), 포도상구균(S. epidermidis), 황색포도상구균(S. aureus), 장내구균(E. faecalis), 프로튜스 불가리스(P. vulgaris), 칸디다 알빅칸스(C. albicans), 시들음병균(F. oxysporum), 붉은곰팡이병균(F. graminearum), 푸사륨 모닐리포르메(F. moniliforme), 리족토니아 솔라니(R. solani), 콜레토트리쿰 리니(Colletotrichum lini) 및 메티실린 내성 황색포도상구균 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)로 이루어진 군에서 선택되는 균주인 항세균용 조성물.
페니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)의 배양으로부터 하기 [화합물 I]을 포함하는 추출물을 수득하는 방법.
[화합물 I]