WO2022004878A1 - 滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法 - Google Patents

滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法 Download PDF

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mesenchymal stem
synovial
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enzyme
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一郎 関矢
満 水野
尚子 片野
信武 大関
健太郎 中村
智美 吉田
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富士フイルム株式会社
国立大学法人 東京医科歯科大学
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing synovial-derived mesenchymal stem cells, which comprises washing the mixture after treating the synovial tissue with an enzyme for a predetermined time.
  • the present invention further relates to a method for producing a cell preparation for joint treatment using the above method.
  • articular cartilage injury and meniscus injury are frequently seen as subjects of daily medical practice and are widely recognized as diseases with a large number of patients.
  • articular cartilage injury or meniscus injury occurs, it causes joint pain, reduced range of motion, knee effusion, and impaired movement.
  • Patients with traumatic articular cartilage or meniscus injuries are usually treated by an orthopedic surgeon.
  • Surgical treatment for cartilage and meniscus injuries aims to remove debris that further exacerbates the joint and restore the function of the affected joint.
  • cartilage and meniscal tissue are difficult to self-regenerate.
  • mesenchymal stem cells are expected as a useful cell source for cell therapy.
  • Mesenchymal stem cells can be collected from various body tissues, such as myeloid tissue (Non-Patent Document 1), adipose tissue (Non-Patent Document 2), muscle tissue (Non-Patent Document 3), and synovial tissue (Non-Patent Document 3). 4), It has been reported that it can be isolated from bone membrane tissue (Non-Patent Document 5) and the like.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose treatment using synovial membrane-derived mesenchymal stem cells. On the other hand, in the process of actually producing cells, it has become clear that the production method disclosed above may not achieve a sufficient cell yield for self-treatment.
  • the present inventor has adjusted the time for enzymatic treatment of synovial tissue, and by providing a step of washing cells, a sufficient amount that can be used for treatment. Succeeded in producing synovial membrane-derived mesenchymal stem cells. It should be noted that lengthening the enzyme treatment time of the synovial tissue leads to damage to the synovial tissue, and therefore it has been considered to avoid it as much as possible. In fact, when the enzyme treatment time was changed from 1 hour to 1.5 hours, the cell yield was greatly reduced, and the cell yield could not be increased.
  • the cell yield can be unexpectedly increased by intentionally imparting a cell washing step which was not considered necessary because the enzyme is normally inactivated by self-serum.
  • the present inventor has found that the effect of significantly increasing the cell yield can be obtained for the first time by taking two measures of extending the enzyme treatment time and imparting a cell washing step.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • synovial-derived mesenchymal stem cells from synovial tissue.
  • Synovial-derived mesenchymal stem cells are obtained by treating the synovial tissue with an enzyme for 2 hours or more, and by washing the mixture after the enzyme treatment until the residual enzyme concentration in the supernatant becomes 0.5 ng / mL or less.
  • a method for producing synovial membrane-derived mesenchymal stem cells which comprises.
  • the enzyme is a mixed enzyme containing one or more collagenases and one or more neutral proteases.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the enzyme is Liberase (registered trademark).
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the enzyme concentration in the enzyme treatment is 0.01 mg / ml to 10 mg / ml.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the synovial tissue is of human origin.
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the synovial tissue is a synovial tissue derived from a single donor.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the subject from which the synovium is collected and the subject to which the synovial membrane-derived mesenchymal stem cells are transplanted are the same subject.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the mass ratio of the synovial tissue to the enzyme is 1000: 1 to 10: 1.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the washing comprises washing a plurality of times using a medium.
  • the medium is ⁇ -modified Eagle's minimum essential medium.
  • ⁇ 11> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, which comprises proliferating synovial membrane-derived mesenchymal stem cells by culturing the washed synovial membrane-derived mesenchymal stem cells for 10 days or longer.
  • Method. ⁇ 12> The method according to ⁇ 11>, wherein the culture for 10 days or more is performed without changing the medium.
  • ⁇ 13> The method according to ⁇ 11> or ⁇ 12>, wherein the culture for 10 days or more is performed in a medium containing own serum.
  • a method for producing a cell preparation for joint treatment which comprises. ⁇ 16> The method for producing a cell preparation for joint treatment according to ⁇ 15>, wherein the joint treatment is a treatment for meniscus tear. ⁇ 17> Synovial membrane-derived mesenchymal stem cells produced by the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 14>. ⁇ 18> A cell preparation for joint treatment produced by the method according to ⁇ 15> or ⁇ 16>.
  • ⁇ A> A step of transplanting synovial-derived mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention so as to cover the cartilage-derived or meniscus-injured part with synovial-derived mesenchymal stem cells; and synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • synovial-derived mesenchymal stem cells can be obtained from synovial tissue.
  • the method for producing synovial membrane-derived mesenchymal stem cells is as follows.
  • a method for producing synovial-derived mesenchymal stem cells from synovial tissue is obtained by treating the synovial tissue with an enzyme for 2 hours or more, and by washing the mixture after the enzyme treatment until the residual enzyme concentration in the supernatant becomes 0.5 ng / mL or less. To get, including.
  • Synovial tissue can be harvested from the unloaded portion of the joint under anesthesia.
  • the biological origin of the synovial tissue is not particularly limited, and synovial tissue derived from any organism, preferably a mammal, can be used.
  • synovial tissue derived from primates eg, chimpanzees, Japanese macaques, humans
  • human-derived synovial tissue can be used.
  • the synovial tissue may be a synovial tissue derived from a single donor or a synovial tissue derived from a plurality of donors, but is preferably a synovial tissue derived from a single donor.
  • the amount of synovial tissue collected can be determined in consideration of the type of donor or the required amount of synovial-derived mesenchymal stem cells. For example, 0.1 g to 10 g, preferably 0.1 g to 2.0 g, more preferably 0.1 g to 1.5 g, still more preferably 0.1 g to 1.0 g from synovial tissue to synovial-derived mesenchymal system. Stem cells can be obtained. The collected synovial tissue is shredded with scissors or the like as necessary, and then subjected to the enzyme treatment described later.
  • the synovial tissue is treated with an enzyme for 2 hours or more.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme containing a protease, but is preferably a mixed enzyme containing one or more collagenases and one or more neutral proteases.
  • a particularly preferred enzyme is Liberase®.
  • Liberase® for example, Liberase® MNP-S (manufactured by Roche) can be used, which is an enzyme containing collagenase class I, collagenase class II and a neutral protease (thermosillin). Is.
  • the enzymatic reaction can be carried out in an aqueous solution containing an enzyme, and an aqueous solution containing human serum may be used.
  • the human serum may be self-sero or allogeneic atypical serum, but is preferably self-sero.
  • the enzyme concentration in the enzyme treatment is preferably 0.01 mg / ml to 10 mg / ml, more preferably 0.1 mg / ml to 10 mg / ml, and even more preferably 0.5 mg / ml to 10 mg / ml.
  • the mass ratio of synovial tissue to the enzyme is preferably 1000: 1 to 10: 1, more preferably 500: 1 to 20: 1, and even more preferably 200: 1 to 40: 1.
  • the enzymatic reaction can be carried out at a temperature of preferably 15 ° C to 40 ° C, more preferably 20 ° C to 35 ° C, still more preferably 25 ° C to 35 ° C.
  • the reaction time may be 2 hours or more, more preferably 2.5 hours or more, still more preferably 3 hours or more.
  • the upper limit of the reaction time is not particularly limited, but may be 10 hours or less, 9 hours or less, 8 hours or less, 7 hours or less, 6 hours or less, 5 hours or less, or 4 hours or less.
  • the enzyme-treated mixture contains synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • the enzyme-treated mixture can be transferred to a centrifuge tube through a cell strainer and centrifuged to recover synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • the mixture after the enzyme treatment is washed until the residual enzyme concentration in the supernatant becomes 0.5 ng / mL or less.
  • the residual enzyme concentration in the supernatant is preferably 0.3 ng / mL or less, more preferably 0.2 ng / mL or less, and particularly preferably 0.1 ng / mL or less.
  • Washing can be performed by resuspending the synovial membrane-derived mesenchymal stem cells recovered by the above-mentioned centrifugation in a medium and centrifuging again (400 g for 5 minutes, etc.).
  • a medium ⁇ -modified Eagle's minimum essential medium ( ⁇ MEM) can be used, but is not particularly limited.
  • the washing may be performed a plurality of times (twice or more) using the medium as described above.
  • synovial membrane-derived mesenchymal stem cells may be proliferated by culturing the washed synovial membrane-derived mesenchymal stem cells for 10 days or longer.
  • the medium used in the above culture can be prepared using the medium used for normal animal cell culture as the basal medium.
  • the medium may be a medium containing serum or a medium not containing serum.
  • the medium may contain allogeneic serum. That is, when producing synovial membrane-derived mesenchymal stem cells from human tissue for the purpose of administration to humans, a medium containing human serum may be used.
  • sera When serum are used, they may be their own sera or allogeneic atypical sera, but they are preferably their own sera.
  • the amount of serum added to the medium is, for example, 20% by volume or less, 10% by volume or less, or 5% by volume or less.
  • the cell culture conditions are not particularly limited, and normal cell culture conditions can be adopted.
  • culture at a temperature of 30 to 40 ° C. and 3 to 7% CO 2 can be mentioned, but is not particularly limited.
  • culture at a temperature of 37 ° C. and 5% CO 2 can be mentioned.
  • the above-mentioned culture it is preferable to carry out the above-mentioned culture for 10 days or more without changing the medium. Further, in the above-mentioned culture for 10 days or more, it is preferable that synovial membrane-derived mesenchymal stem cells are produced without being co-cultured with cells other than synovial membrane-derived mesenchymal stem cells.
  • the culture period is preferably 5 days or more, 7 days or more, 10 days or more, more preferably 10 to 14 days, 10 to 21 days, or 10 to 28 days, still more preferably 10 to 21 days.
  • Mesenchymal stem cells are differentiated into chondrocytes by culturing them in a chondrogenic medium supplemented with transforming growth factor ⁇ 3 (TGF- ⁇ 3), dexamethasone, and bone morphogenetic factor 2 (BMP-2), and in vitro. It is known that it is possible to produce cartilage tissue. Therefore, in the present invention, in order to prevent synovial-derived mesenchymal stem cells from differentiating into chondrocytes, synovial-derived mesenchyme isolated in the absence of TGF- ⁇ 3, dexamethasone, or BMP-2. It is preferable to culture line stem cells.
  • synovial membrane-derived mesenchymal stem cells have a decrease in in situ cartilage forming ability in inverse proportion to the number of passages of mesenchymal stem cells in vitro. Therefore, in order to prepare undifferentiated mesenchymal stem cells, it is preferable to produce synovial-derived mesenchymal stem cells in the primary or first passage.
  • the serum used in the autologous treatment is self-derived, the amount of serum that can be collected from the donor in the autologous treatment is limited, and the cell density is above a certain level from the viewpoint of proliferation of synovial-derived stem cells. Since it is necessary, the synovial stem cells derived from the synovial membrane after enzyme treatment are 100 cells / cm 2 or more and 5000 cells / cm 2 or less, 200 cells / cm 2 or more and 5000 cells / cm 2 or less, 500 cells / cm 2 or more.
  • the number of cells obtained at the end of the culture may be 1.0 ⁇ 10 7 cells or more, 2.0 ⁇ 10 7 cells or more, 2.5 ⁇ 10 7 cells or more, or 3.0 ⁇ 10 7 cells or more. It is preferably 4.0 ⁇ 10 7 cells or more, more preferably 5.0 ⁇ 10 7 cells or more, and particularly preferably 6.0 ⁇ 10 7 cells or more.
  • Mesenchymal stem cells are somatic stem cells derived from mesoderm tissue (mesoderm). Mesenchymal stem cells are known to be present in bone marrow, synovial membrane, adipose tissue, adipose tissue, muscle tissue, and have the ability to differentiate into osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, and muscle cells. Has been done. In connection with the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes, the addition of BMP or TGF- ⁇ to the culture medium promotes the differentiation of undifferentiated mesenchymal stem cells into chondrocytes, and the chondrocyte is in. It is known that it can be regenerated under vitro conditions.
  • Mesenchymal stem cells can detect and confirm molecules characteristic of mesenchymal stem cells, such as enzymes, receptors, and low molecular weight compounds.
  • Examples of the molecule characteristic of mesenchymal stem cells include, but are not limited to, cell surface markers (positive markers) such as CD73, CD90, CD105, and CD166.
  • Negative markers not expressed in mesenchymal stem cells include, but are not limited to, CD19, CD34, CD45, HLA-DR, CD11b, CD14 and the like.
  • CD is an abbreviation for Crusters of differentiation
  • HLA-DR is an abbreviation for human leukocyte antigen-D-related.
  • synovial membrane-derived mesenchymal stem cells are stem cells contained in the synovium.
  • Synovial-derived mesenchymal stem cells are a type of mesenchymal stem cells.
  • Synovial membrane-derived mesenchymal stem cells can be detected, for example, by detecting CD90-positive, CD45-negative, and cartilage differentiation potential, but the detection method is not particularly limited.
  • synovial membrane-derived mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention are provided.
  • the synovial membrane-derived mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention can be used as a cell preparation for joint treatment.
  • the synovial membrane-derived mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention are used, for example, for research on the differentiation of mesenchymal stem cells, drug screening for various diseases, efficacy / safety evaluation of drug candidate compounds, and the like. You can also do it.
  • the present invention comprises producing synovial membrane-derived mesenchymal stem cells by the method of the present invention described above, and producing a cell preparation for joint treatment using the synovial membrane-derived mesenchymal stem cells.
  • the present invention relates to a method for producing a cell preparation for joint treatment, including the above.
  • a cell preparation for joint treatment produced by the above-mentioned method for producing a cell preparation for joint treatment. That is, according to the present invention, it is possible to produce a cell preparation for joint treatment containing synovial membrane-derived mesenchymal stem cells obtained by the method of the present invention as an active ingredient.
  • Joint treatment may include treatment of joint damage, damage or inflammation, including treatment of joint disease resulting from degeneration and / or inflammation of connective tissues such as cartilage, or non-inflammatory joint disease.
  • Joint treatments include, for example, meniscus injury, traumatic cartilage injury, transected osteochondritis, aseptic osteonecrosis, osteoarthritis (eg, osteoarthritis of the knee), rheumatoid arthritis (eg, chronic joints).
  • Treatment of diseases selected from the group consisting of rheumatoid arthritis), gout, reactive arthritis, psoriatic arthritis, juvenile arthritis, inflammatory arthritis, and articular cartilage defects can be mentioned, but not limited to these diseases. No.
  • the synovial membrane-derived mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention are used as a cell preparation for joint treatment
  • the cells are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method to form an individual.
  • the preparation may be in a form suitable for administration to.
  • the carrier include distilled water for injection made isotonic by adding physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, prokine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Agents, antioxidants and the like may be blended.
  • the present invention further relates to a method of treating a joint. More specifically, the present invention relates to meniscus injury, traumatic cartilage injury, transected osteochondritis, aseptic osteonecrosis, osteoarthritis (eg, osteoarthritis of the knee), rheumatoid arthritis (eg, rheumatoid arthritis). , Chronic rheumatoid arthritis), gout, reactive arthritis, psoriatic arthritis, juvenile arthritis, inflammatory arthritis, articular cartilage defect.
  • the method for treating joints of the present invention A step of transplanting a synovial-derived mesenchymal stem cell produced by the method of the present invention so as to cover a cartilage damaged part or a meniscus damaged part with a synovial-derived mesenchymal stem cell; and a cartilage-derived mesenchymal stem cell.
  • the cartilage injured part or the meniscus injured part When transplanting synovial membrane-derived mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention into a patient, in order to efficiently treat the cartilage injured part or the meniscus injured part, the cartilage injured part or the meniscus injured part should be treated.
  • synovial-derived mesenchymal stem cells By transplanting synovial-derived mesenchymal stem cells to the cartilage-derived or meniscus-damaged part, the cartilage-derived or meniscus-damaged part is covered with synovial-derived mesenchymal stem cells. Transplantation of synovial-derived mesenchymal stem cells can be performed by open surgery or arthroscopic surgery. In order to minimize the invasion, it is preferable to transplant synovial-derived mesenchymal stem cells under arthroscopy.
  • the cartilage injured part or the meniscus injured part may be covered with a suspension of synovial membrane-derived mesenchymal stem cells or may be covered with a cell sheet of synovial membrane-derived mesenchymal stem cells.
  • a bioabsorbable gel such as gelatin or collagen can be used as a gel-like substance.
  • Synovial-derived mesenchymal stem cells have a high ability to adhere to cartilage injured areas and meniscus injured areas.
  • the minimally invasive procedure of the present invention is characterized by covering the cartilage damaged area with synovial-derived mesenchymal stem cells, and the following steps: Hold the position so that the cartilage injury is facing upwards; Placing a cell sheet of synovial-derived mesenchymal stem cells, a suspension of synovial-derived mesenchymal stem cells, or a gel-like substance containing synovial-derived mesenchymal stem cells on the surface of the cartilage injury; Maintaining the position for a period of time, thereby adhering synovial-derived mesenchymal stem cells to the surface of the cartilage injury; including.
  • the minimally invasive procedure of the present invention is characterized by covering the injured meniscus with synovial-derived mesenchymal stem cells, and the following steps: Hold the position so that the injured part of the meniscus faces down; Injecting a suspension of synovial-derived mesenchymal stem cells into the knee joint; and maintaining a specific time position to allow synovial-derived mesenchymal stem cells to adhere to the injured meniscus; including.
  • synovial-derived mesenchymal stem cells adhere to the surface of the cartilage-injured or meniscus injured, at least 10 of the transplanted synovial-derived mesenchymal stem cells should be placed on the surface of the cartilage-injured or meniscus. It is preferably held for a minute, preferably 15 minutes. To achieve this, the position is intended to direct the cartilage or meniscus tear upwards and to retain synovial-derived mesenchymal stem cells in the upwardly cartilage or meniscus tears. Is held for at least 10 minutes, preferably 15 minutes.
  • cartilage-derived mesenchymal stem cells Cover the cartilage-derived mesenchymal stem cells with cartilage-injured or meniscus-injured areas with synovium to further adhere the synovial-derived mesenchymal stem cells to the cartilage-injured or meniscus-injured areas. Can be done. Surgery is completed after holding synovial-derived mesenchymal stem cells on the surface of the cartilage injured or meniscal injured for at least 10 minutes.
  • the transplanted synovial membrane-derived mesenchymal stem cells differentiate into chondrocytes at the cartilage injured part and the meniscus injured part, and regenerate the cartilage tissue in situ at the cartilage injured part or the meniscus injured part.
  • cartilage tissue regenerates according to the local microenvironment (nutrition supply, cytokine environment, etc.), so no external manipulation is required.
  • cartilage tissue is regenerated at the cartilage injured or meniscus injured to repair the injury and, in the case of cartilage injury, the bone region, cartilage and bone.
  • the border with the cartilage, the center of the cartilage, the surface area, and the area adjacent to the original cartilage are formed as the original cartilage tissue, or in the case of meniscus tear, the meniscus cartilage is formed.
  • Synovial-derived mesenchymal stem cells were prepared from synovial tissue using a human sample by a conventional production method. Specifically, a C1 sample (synovial tissue 0.5 g) was shredded with scissors and immersed in 5.0 mL of a Liberase aqueous solution. As the Liberase aqueous solution, 5.0 mg of Liberase MNP-S (manufactured by Roche) was dissolved in 5.0 mL of water for injection containing a final concentration of 20% human autologous serum.
  • the enzymatic reaction was carried out at room temperature of 25 ° C. for 1 hour. Then, the tissue digestive juice was transferred to a 50 mL centrifuge tube through a cell strainer and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was removed, and the obtained concentrated cell suspension was suspended in a medium and the whole amount was seeded in a flask (seed density 200 cells / cm 2 ).
  • the medium used was ⁇ MEM in which human self-serum had a final concentration of 10%.
  • the culture was carried out in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ), and after 2 weeks, the cells were collected from the flask to produce synovial membrane-derived mesenchymal stem cells. It should be noted that it is also a feature of this cell production that the medium is not exchanged during the culture period. Thus, the finally obtained cell yield is C1 was 1.8 ⁇ 10 7 cells.
  • Table 1 A summary of the results is shown in Table 1.
  • synovial membrane-derived mesenchymal stem cells Production of synovial membrane-derived mesenchymal stem cells by a manufacturing process in which the enzyme treatment time is extended (enzyme treatment time 1.5 hours, no washing step) Using human specimens, synovial membrane-derived mesenchymal stem cells were prepared from synovial tissue under the condition that the enzyme treatment time was extended by 30 minutes compared to the usual production method. Specifically, a C2 sample (synovial tissue 0.9 g) was shredded with scissors and immersed in 5.0 mL of a Liberase aqueous solution.
  • Liberase aqueous solution 5.0 mg of Liberase MNP-S (manufactured by Roche) was dissolved in 5.0 mL of water for injection containing a final concentration of 20% human autologous serum. The enzymatic reaction was carried out at room temperature of 25 ° C. for 1.5 hours. Then, the tissue digestive juice was transferred to a 50 mL centrifuge tube through a cell strainer and centrifuged at 400 g for 5 minutes. The supernatant was removed, and the obtained concentrated cell suspension was suspended in a medium and the whole amount was seeded in a flask (seed density: 1,880 cells / cm 2 ).
  • the medium used was ⁇ MEM in which human self-serum had a final concentration of 10%.
  • the culture was carried out in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ), and after 2 weeks, the cells were collected from the flask to produce synovial membrane-derived mesenchymal stem cells. It should be noted that it is also a feature of this cell production that the medium is not exchanged during the culture period. Thus, the finally obtained cell yield was 0.8 ⁇ 10 7 cells as C2. This was below 1.0 ⁇ 10 7 cells, which is considered necessary for treatment, and the amount of cells required for treatment could not be provided. A summary of the results is shown in Table 1.
  • Example 1 Production of synovial membrane-derived mesenchymal stem cells by a manufacturing process in which the enzyme treatment time is extended and an enzyme washing step is added (enzyme treatment time is 3 hours, and there is a washing step). Using human specimens, synovial membrane-derived mesenchymal stem cells were prepared from synovial tissue under the condition that the enzyme treatment time was extended by 2 hours compared to the usual production method.
  • J1 sample (synovial tissue 0.8 g), J2 sample (synovial tissue 0.6 g), J3 sample (synovial tissue 0.7 g), J4 sample (synovial tissue 0.5 g), J5
  • Each sample (synovial tissue 0.3 g) was shredded with scissors and immersed in 5.0 mL of a Liberase aqueous solution.
  • a Liberase aqueous solution 5.0 mg of Liberase MNP-S (manufactured by Roche) was dissolved in 5.0 mL of water for injection containing a final concentration of 20% human autologous serum. The enzymatic reaction was carried out at room temperature of 25 ° C. for 3 hours. Then, the tissue digestive juice was transferred to a 50 mL centrifuge tube through a cell strainer and centrifuged at 400 g for 5 minutes.
  • washing step a step of discarding the supernatant, resuspending it in 20 mL of ⁇ MEM, and centrifuging at 400 g for 5 minutes was added. This cleaning step was repeated twice in total.
  • the medium used was ⁇ MEM in which human self-serum had a final concentration of 10%.
  • the culture was carried out in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ), and after 2 weeks, the cells were collected from the flask to produce synovial membrane-derived mesenchymal stem cells. It should be noted that it is also a feature of this cell production that the medium is not exchanged during the culture period.
  • the finally obtained cell yields were 4.9 ⁇ 10 7 cells for J1, 7.6 ⁇ 10 7 cells for J2, 5.8 ⁇ 10 7 cells for J3, and 9.0 ⁇ 10 7 cells for J4.
  • J5 became 6.5 ⁇ 10 7 cells. This was significantly higher than 1.0 ⁇ 10 7 cells considered to be necessary for treatment, and was at a level capable of providing a sufficient and stable amount of cells required for treatment.
  • Table 1 A summary of the results is shown in Table 1.
  • Example 2 Quantification of residual enzyme liberase The amount of liberase remaining in the medium was quantified in the production steps carried out in Comparative Example 1, Comparative Example 2, and Example 1. As a result, it was clarified that C1 was 10.2 ng / mL, C2 was 59.8 ng / mL, and J1 to J5 were all 0.1 ng / mL or less (below the detection limit of the kit). The results are shown in Table 1.
  • Example 3 Confirmation test of mesenchymal stem cell marker A confirmation test was conducted on the expression of the mesenchymal stem cell marker in Comparative Examples 1 and 2 and the synovial membrane-derived mesenchymal stem cell prepared in Example 1. As a result, CD90-positive, CD45-negative, and cartilage differentiation potential were shown in all the cells, confirming that they were synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • the yield of J1 to J5 cells obtained by the above production is significantly higher than 1.0 ⁇ 10 7 cells considered to be necessary for treatment, and the amount of cells that can show an effect even if it is an allogeneic cell (cell mass). Since it greatly exceeds 2.0 ⁇ 10 7 cells), it is considered to have remarkable value as a method for producing synovial-derived mesenchymal stem cells assuming autologous cell therapy.
  • Example 4 The synovial-derived mesenchymal stem cells produced as J1 to J5 were actually produced from the specimens of the meniscus injured patients themselves, and were administered to the meniscus injured patients as autologous cell therapy after the production. As a result, good symptom relief was observed until 52 weeks after administration in all meniscal injured patients to whom synovial membrane-derived mesenchymal stem cells produced as J1 to J5 were administered.
  • the Lisholm score (see Table 2 below), which is known as the symptom score, showed an improvement of 22 points or more 52 weeks after administration compared to before treatment, and the meniscus was confirmed by MRI (magnetic resonance imaging). It was also found that the patient was reduced and showed good treatment results.

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Abstract

本発明の課題は、滑膜組織から十分な量の滑膜由来間葉系幹細胞を得ることを可能にする、滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法、上記した滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法を利用した関節治療用細胞製剤の製造方法、滑膜由来間葉系幹細胞、及び関節治療用細胞製剤を提供することである。本発明によれば、滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する方法であって、滑膜組織を酵素で２時間以上処理すること、および酵素処理後の混合物を、上清中の残存酵素濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ以下になるまで洗浄することにより滑膜由来間葉系幹細胞を得ること、を含む、滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法が提供される。

Description

滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法
　本発明は、滑膜組織を酵素で所定の時間処理した後の混合物を洗浄することを含む滑膜由来間葉系幹細胞を製造する方法に関する。本発明はさらに、上記方法を利用した関節治療用細胞製剤の製造方法に関する。
　整形外科領域において、関節軟骨損傷や半月板損傷は、日常的な診療行為の対象として頻繁に見られ、多数の患者がいる疾病として広く認識されている。関節軟骨損傷や半月板損傷が生じた場合、関節痛、可動域の減少、関節水腫、および運動障害などを生じる。外傷で生じた関節軟骨損傷や半月板損傷を有する患者は、通常は整形外科医の治療を受ける。軟骨損傷や半月板損傷に対する外科的治療は、関節をさらに悪化させる要因となる破片を取り除き、患部関節の機能を回復させることを目的としている。しかし、一般的に軟骨および半月板組織は自己再生が困難であることが知られている。
　一方、近年の再生医療技術の進歩により、軟骨や半月板を修復し得る細胞治療が盛んになっている。中でも、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、有用な細胞治療の細胞源として期待されている。間葉系幹細胞は種々の体組織から採取が可能であり、骨髄組織（非特許文献１）、脂肪組織（非特許文献２）、筋肉組織（非特許文献３）、滑膜組織（非特許文献４）、骨膜組織（非特許文献５）などから単離できることが報告されている。特に、滑膜由来間葉系幹細胞は、骨髄などのさまざまな間葉系組織由来の間葉系幹細胞に比べて高い増殖能および軟骨形成能を有することが報告されている（非特許文献６）。また、特許第５９２８９６１号公報および特許第５６５６１８３号公報には、滑膜由来間葉系幹細胞を用いて関節軟骨損傷や半月板損傷を治療する方法が開示されている。
Prockop, D.J., 1997, Science. 276:71-4 Zuk, P.A. et al., 2002, Mol Biol Cell. 13:4279-95 Cao et al., 2003, Nat Cell Biol. 5:640-6 De Bari, C. et al., 2001, Arthritis Rheum. 44:1928-42 Fukumoto, T. et al., 2003, OsteoarthritisCartilage. 11:55-64 Sakaguchi, et al. , 2005, Arthritis Rhum. 52:2521-9
特許第５９２８９６１号公報 特許第５６５６１８３号公報
　特許文献１および２においては、滑膜由来間葉系幹細胞を用いた治療が開示されている。その一方、実際に細胞を製造していく過程において、上記で開示されている製造法では自家治療に供するだけの十分な細胞収量を達成できない場合があるという課題が明らかとなってきた。
　本発明は、滑膜組織から十分な量の滑膜由来間葉系幹細胞を得ることを可能にする、滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法を提供することを課題とする。本発明はさらに、上記した滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法を利用した関節治療用細胞製剤の製造方法を提供することを課題とする。本発明はさらに、滑膜由来間葉系幹細胞、及び関節治療用細胞製剤を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、滑膜組織を酵素処理する時間を調節し、かつ細胞を洗浄する工程を付与することにより、治療に供することが可能な十分な量の滑膜由来間葉系幹細胞を製造することに成功した。なお、滑膜組織の酵素処理時間を長くすることは滑膜組織の損傷に繋がるため、なるべく避ける方向に考えられていた。実際、酵素処理時間を１時間から１．５時間にした場合には、細胞収量が大きく減少し、細胞収量を増加させることはできなかった。一方で、通常では自己血清により酵素が不活化されるため、必要とは考えられていなかった細胞洗浄工程を、あえて付与することにより、予想外に細胞収量を増加できることを見出した。本発明者は、酵素処理時間の延長と細胞洗浄工程の付与という２つの工夫がなされることによって、はじめて大幅な細胞収量の増加という効果を得られることを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する方法であって、
滑膜組織を酵素で２時間以上処理すること、および
酵素処理後の混合物を、上清中の残存酵素濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ以下になるまで洗浄することにより滑膜由来間葉系幹細胞を得ること、
を含む、滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法。
＜２＞　酵素が、１種以上のコラゲナーゼと１種以上の中性プロテアーゼを含む混合酵素である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞　酵素が、リベラーゼ（登録商標）である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞　酵素処理における酵素濃度が、０．０１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌである、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜５＞　滑膜組織がヒト由来である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞　滑膜組織が、単一ドナー由来の滑膜組織である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜７＞　滑膜が採取される対象と、滑膜由来間葉系幹細胞が移植される対象とが、同一対象である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜８＞　滑膜組織と酵素の質量比率が、１０００：１～１０：１である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞　上記洗浄が、培地を用いて複数回洗浄することを含む、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
＜１０＞　上記培地が、α改変イーグル最小必須培地である、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞　洗浄後の滑膜由来間葉系幹細胞を１０日間以上培養することにより、滑膜由来間葉系幹細胞を増殖させることを含む、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法。
＜１２＞　上記１０日間以上の培養を、培地交換なしで行う、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞　上記１０日間以上の培養を、自己の血清を含む培地中で行う、＜１１＞または＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞　滑膜由来間葉系幹細胞以外の他の細胞と共培養されることなく、滑膜由来間葉系幹細胞が製造される、＜１＞から＜１３＞の何れか一に記載の方法。
＜１５＞　＜１＞から＜１４＞の何れか一に記載の方法により滑膜由来間葉系幹細胞を製造すること、および
上記滑膜由来間葉系幹細胞を用いて関節治療用細胞製剤を製造すること、
を含む、関節治療用細胞製剤の製造方法。
＜１６＞　関節治療が、半月板損傷の治療である、＜１５＞に記載の関節治療用細胞製剤の製造方法。
＜１７＞　＜１＞～＜１４＞の何れか一に記載の方法により製造された、滑膜由来間葉系幹細胞。
＜１８＞　＜１５＞または＜１６＞に記載の方法により製造された、関節治療用細胞製剤。
＜Ａ＞　軟骨損傷部または半月板損傷部を滑膜由来間葉系幹細胞により覆うように、本発明の方法により製造した滑膜由来間葉系幹細胞を移植する工程；および
　滑膜由来間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させることによって、軟骨損傷部または半月板損傷部でｉｎ　ｓｉｔｕで軟骨組織を再生させる工程；
を含む、関節の治療方法。
　本発明によれば、滑膜組織から十分な量の滑膜由来間葉系幹細胞を得ることができる。
　以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
［滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法］
　本発明による滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法は、
滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する方法であって、
滑膜組織を酵素で２時間以上処理すること、および
酵素処理後の混合物を、上清中の残存酵素濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ以下になるまで洗浄することにより滑膜由来間葉系幹細胞を得ること、
を含む。
＜滑膜組織＞
　滑膜組織は、麻酔下で関節の非荷重部分から採取することができる。
　滑膜組織の生物由来は特に限定されず、任意の生物、好ましくは哺乳動物に由来する滑膜組織を使用することができる。例えば、霊長類（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の滑膜組織を使用することができ、特に好ましくは、ヒト由来の滑膜組織を使用することができる。
　滑膜組織は、単一ドナー由来の滑膜組織でも、複数のドナーに由来する滑膜組織でもよいが、好ましくは単一ドナー由来の滑膜組織である。
　ヒトへの投与を目的として、滑膜由来間葉系幹細胞を製造する場合、好ましくはレシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致または類似したドナーより採取された滑膜組織を使用することが好ましい。より好ましくは、滑膜が採取される対象と、滑膜由来間葉系幹細胞が移植される対象とが、同一対象である。即ち、レシピエント自身より採取された滑膜組織を使用すること（自家移植）が好ましい。
　滑膜組織の採取量は、ドナーの種類、または必要とされる滑膜由来間葉系幹細胞の量を考慮して決めることができる。例えば、０．１ｇ～１０ｇ、好ましくは０．１ｇ～２．０ｇ、より好ましくは０．１ｇ～１．５ｇ、さらに好ましくは０．１ｇ～１．０ｇの滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を得ることができる。 採取した滑膜組織は、必要に応じてハサミ等で細断した後、後記する酵素処理に供される。
＜酵素による処理＞
　本発明においては、滑膜組織を酵素で２時間以上処理する。
　酵素としては、プロテアーゼを含む酵素であれば特に限定されないが、好ましくは、１種以上のコラゲナーゼと１種以上の中性プロテアーゼを含む混合酵素である。特に好ましい酵素は、リベラーゼ（登録商標）である。リベラーゼ（登録商標）としては、例えば、リベラーゼ（登録商標）ＭＮＰ－Ｓ（ロシュ製）を使用することができるが、これはコラゲナーゼクラスＩとコラゲナーゼクラスＩＩと中性プロテアーゼ（サーモシリン）とを含む酵素である。
　酵素反応は、酵素を含む水溶液中で行うことができ、ヒト血清を含む水溶液を用いてもよい。ヒト血清は、自己の血清であってもよいし、同種異型の血清であってもよいが、好ましくは自己の血清である。
　酵素処理における酵素濃度は、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに一層好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～５．０ｍｇ／ｍｌであり、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは０．７ｍｇ／ｍｌ～２．０ｍｇ／ｍｌである。
　滑膜組織と酵素の質量比率は、好ましくは１０００：１～１０：１であり、より好ましくは５００：１～２０：１であり、さらに好ましくは２００：１～４０：１である。
　酵素反応は、好ましくは１５℃から４０℃、より好ましくは２０℃から３５℃、さらに好ましくは２５℃から３５℃の温度で行うことができる。
　反応時間は、２時間以上であればよく、より好ましくは、２．５時間以上、さらに好ましくは３時間以上である。反応時間の上限は特に限定されないが、１０時間以内、９時間以内、８時間以内、７時間以内、６時間以内、５時間以内、または、４時間以内でもよい。
　酵素処理された混合物には、滑膜由来間葉系幹細胞が含まれている。
  酵素処理された混合物は、セルストレーナーを通して遠沈管に移し、遠心処理することにより滑膜由来間葉系幹細胞を回収することができる。
＜洗浄＞
　本発明においては、酵素処理後の混合物を、上清中の残存酵素濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ以下になるまで洗浄する。上清中の残存酵素濃度は、好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ以下であり、特に好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以下である。
　洗浄は、上記した遠心処理により回収した滑膜由来間葉系幹細胞を培地に再懸濁し、再度遠心（４００ｇで５分間など）することにより行うことができる。培地としては、α改変イーグル最小必須培地（αＭＥＭ）を用いることができるが、特に限定されない。洗浄は、上記のように培地を用いて複数回（２回以上）行ってもよい。
＜増殖＞
　本発明においては、洗浄後の滑膜由来間葉系幹細胞を１０日間以上培養することにより、滑膜由来間葉系幹細胞を増殖させてもよい。
　上記の培養において使用する培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。通常の動物細胞の培養に用いられる培地としては、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２＝１：１）、ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＲＰＭＩ１６４０培地など）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＲＰＭＩの混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２：ＲＰＭＩ＝１：１）などを挙げることができるが、特に限定されない。
　培地としては、血清を含む培地でもよいし、血清を含まない培地でもよい。生体への投与を目的として、自己の組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する場合には、培地は、同種血清を含有するものであってもよい。即ち、ヒトへの投与を目的として、ヒトの組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する場合には、ヒト血清を含む培地を使用してもよい。血清を使用する場合、自己の血清であってもよいし、同種異型の血清であってもよいが、好ましくは自己の血清である。血清を使用する場合には、培地における血清の添加量は、例えば、２０体積％以下、１０体積％以下、または５体積％以下である。
　細胞の培養条件は特に限定されず、通常の細胞培養の条件を採用できる。例えば、温度３０～４０℃、３～７％ＣＯ2での培養を挙げることができるが、特に限定されるものではない。一例としては、温度３７℃、５％ＣＯ2での培養を挙げることができる。
　本発明においては、上記した１０日間以上の培養を、培地交換なしで行うことが好ましい。また、上記した１０日間以上の培養においては、滑膜由来間葉系幹細胞以外の他の細胞と共培養されることなく、滑膜由来間葉系幹細胞が製造されることが好ましい。
　滑膜由来間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化は、培養期間が長くなるほど進行し、従って培養期間が特定の長さを超えると滑膜由来間葉系幹細胞のｉｎ　ｓｉｔｕでの軟骨形成能は低下することが知られている。そのため、本発明においては、滑膜由来間葉系幹細胞を未分化の状態で、そして良好なｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成能を有する状態で増殖させるために、培養期間を調整することが好ましい。また、本発明においては、軟骨損傷部を覆い、そして患部を再生させるために十分な数の未分化滑膜幹細胞を用意する必要性を考慮することが必要である。従って、培養期間は、５日間以上、７日間以上、１０日間以上であることが好ましく、１０～１４日間、１０～２１日間、または１０～２８日間がより好ましく、１０～２１日間がさらに好ましい。
　間葉系幹細胞を、トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦ－β３）、デキサメタゾン、骨形成因子２（ＢＭＰ－２）を添加した軟骨形成培地中で培養することにより、軟骨細胞に分化し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで軟骨組織を作製することが可能であることが知られている。従って、本発明では、滑膜由来間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化しないようにするためには、ＴＧＦ－β３、デキサメタゾン、またはＢＭＰ－２の非存在下で、単離した滑膜由来間葉系幹細胞を培養することが好ましい。
　滑膜由来間葉系幹細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの間葉系幹細胞の継代数と反比例して、ｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成能が低下することも知られている。従って、未分化の間葉系幹細胞を調製するためには、初代あるいは第１継代での滑膜由来間葉系幹細胞を製造することが好ましい。
　本発明においては、自家治療において使用する血清は自己由来であり、自家治療においてドナーから採取できる血清の量は限られており、また、滑膜由来幹細胞の増殖の観点で一定以上の細胞密度が必要であるため、酵素処理後の滑膜由来間葉系幹細胞を、１００細胞／ｃｍ2以上５０００細胞／ｃｍ2以下、２００細胞／ｃｍ2以上５０００細胞／ｃｍ2以下、５００細胞／ｃｍ2以上５０００細胞／ｃｍ2以下、５００細胞／ｃｍ2以上２５００細胞／ｃｍ2以下、または５００細胞／ｃｍ2以上２０００細胞／ｃｍ2以下の細胞数で播種し、培養することが好ましい。また、酵素処理後に滑膜由来間葉系幹細胞を増殖させるために、１０日間以上培養することがより好ましい。
　培養終了時に得られる細胞数は、１．０×１０7細胞以上、２．０×１０7細胞以上、２．５×１０7細胞以上、または、３．０×１０7細胞以上であることが好ましく、４．０×１０7細胞以上であることがより好ましく、５．０×１０7細胞以上であることがさらに好ましく、６．０×１０7細胞以上であることが特に好ましい。
＜滑膜由来間葉系幹細胞＞
　間葉系幹細胞とは、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は骨髄、滑膜、骨膜、脂肪組織、筋肉組織に存在することが知られており、そして骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、および筋細胞に分化する能力を有することが知られている。間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化に関連して、ＢＭＰあるいはＴＧＦ－βを培養液に添加することにより、未分化間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化が促進され、そして軟骨組織がｉｎ　ｖｉｔｒｏ条件下で再生できることが知られている。
　間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞に特徴的な分子、例えば酵素、レセプター、低分子化合物等を検出して確認することができる。間葉系幹細胞に特徴的な分子としては、細胞表面マーカー（ポジティブマーカー）であるＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、間葉系幹細胞には発現していないネガティブマーカーとしては、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、ＣＤは、Ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎの略であり、ＨＬＡ－ＤＲは、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄ－ｒｅｌａｔｅｄの略である。これらのポジティブマーカーおよびネガティブマーカーを利用して、間葉系幹細胞であることを確認することができる。これらのマーカーの検出には免疫学的方法を利用できるが、各分子のｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。
  本明細書において滑膜由来間葉系幹細胞とは、滑膜に含まれる幹細胞である。滑膜由来間葉系幹細胞は間葉系幹細胞の一種である。滑膜由来間葉系幹細胞は、例えば、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性、軟骨分化能を検出することにより検出することができるが、検出方法は特に限定されない。
　本発明によれば、本発明の方法により製造された、滑膜由来間葉系幹細胞が提供される。
　本発明の方法で製造される滑膜由来間葉系幹細胞は、関節治療用細胞製剤として使用することができる。さらに、本発明の方法で製造される滑膜由来間葉系幹細胞は、例えば、間葉系幹細胞の分化に関する研究や種々の疾患に関する医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。
［関節治療用細胞製剤の製造方法］
　本発明は、上記した本発明の方法により滑膜由来間葉系幹細胞を製造すること、および
上記滑膜由来間葉系幹細胞を用いて関節治療用細胞製剤を製造すること、
を含む、関節治療用細胞製剤の製造方法に関する。本発明によれば、上記した関節治療用細胞製剤の製造方法方法により製造された、関節治療用細胞製剤が提供される。
　即ち、本発明によれば、本発明の方法で得られる滑膜由来間葉系幹細胞を有効成分として含有する関節治療用細胞製剤を製造することができる。
　関節治療としては、関節の損傷、損害または炎症を伴う疾患の治療を挙げることができ、軟骨等の結合組織の変性および／または炎症から起こる関節疾患、または非炎症性の関節疾患の治療を挙げることができる。関節治療としては、例えば、半月板損傷、外傷性軟骨損傷、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、変形性関節症（例えば、変形性膝関節症）、関節リウマチ（例えば、慢性関節リウマチ）、痛風、反応性関節炎、乾癖性関節炎、若年性関節炎、炎症性関節炎、関節軟骨欠損からなる群より選択される疾患の治療を挙げることができるが、これらの疾患に限定されるものではない。
　本発明の方法により製造された滑膜由来間葉系幹細胞を、関節治療用細胞製剤とする場合には、常法により、上記細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
［関節の治療方法］
　本発明はさらに、関節の治療方法に関する。より具体的には、本発明は、半月板損傷、外傷性軟骨損傷、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死、変形性関節症（例えば、変形性膝関節症）、関節リウマチ（例えば、慢性関節リウマチ）、痛風、反応性関節炎、乾癖性関節炎、若年性関節炎、炎症性関節炎、関節軟骨欠損からなる群より選択される疾患の治療方法に関する。
　本発明の関節の治療方法は、
　軟骨損傷部または半月板損傷部を滑膜由来間葉系幹細胞により覆うように、本発明の方法により製造した滑膜由来間葉系幹細胞を移植する工程；および
　滑膜由来間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させることによって、軟骨損傷部または半月板損傷部でｉｎ　ｓｉｔｕで軟骨組織を再生させる工程；
を含む。
　本発明の方法により製造された滑膜由来間葉系幹細胞を患者に移植する際、軟骨損傷部または半月板損傷部を効率的に治療するためには、軟骨損傷部または半月板損傷部あたり、２．０×１０7～１．０×１０11個、または、２．５×１０7～１．０×１０11個、または、３．０×１０7～１．０×１０11個、４．０×１０7～１．０×１０11個、または、２．５×１０7～１．０×１０10個、または、２．５×１０7～１．０×１０9個、または、２．５×１０7～１．０×１０8個、または、２．０×１０7～１．０×１０8個の滑膜由来間葉系幹細胞、より好ましくは２．０×１０7～１．０×１０8個の滑膜由来間葉系幹細胞を適用することが好ましい。
　滑膜由来間葉系幹細胞を軟骨損傷部または半月板損傷部に移植することにより、軟骨損傷部または半月板損傷部は滑膜由来間葉系幹細胞で覆われる。滑膜由来間葉系幹細胞の移植は、観血的手術により、または関節鏡視下手術により行うことができる。侵襲を出来る限り小さくするために、関節鏡視下に滑膜由来間葉系幹細胞を移植することが好ましい。
　軟骨損傷部または半月板損傷部は、滑膜由来間葉系幹細胞の懸濁液で覆われても、滑膜由来間葉系幹細胞の細胞シートで覆われてもよい。例えば、ゼラチンやコラーゲンなどの生体吸収性のゲルをゲル状物質として使用することができる。滑膜由来間葉系幹細胞は、軟骨損傷部や半月板損傷部に接着する能力が高い。
　軟骨損傷の治療の場合、本発明の低侵襲性手技は、滑膜由来間葉系幹細胞により軟骨損傷部を覆うことを特徴としており、以下のステップ：
　軟骨損傷部を上方に向けるように体位を保持すること；
　滑膜由来間葉系幹細胞の細胞シート、滑膜由来間葉系幹細胞の懸濁液、または滑膜由来間葉系幹細胞を含むゲル状物質を軟骨損傷部の表面に静置すること；そして
　特定の時間体位を保持して、それにより滑膜由来間葉系幹細胞を軟骨損傷部の表面に接着させること；
を含む。
　半月板損傷の治療の場合、本発明の低侵襲性手技は、滑膜由来間葉系幹細胞により半月板損傷部を覆うことを特徴としており、以下のステップ：
　半月板損傷部が下向きになるように体位を保持すること；
　滑膜由来間葉系幹細胞の懸濁液を膝関節内に注射すること；そして
　特定の時間体位を保持して、滑膜由来間葉系幹細胞を半月板損傷部に接着させること；
を含む。
　軟骨損傷部あるいは半月板損傷部の表面に滑膜由来間葉系幹細胞を確実に接着させるために、移植した滑膜由来間葉系幹細胞を、軟骨損傷部あるいは半月板損傷部の表面に少なくとも１０分間、好ましくは１５分間、保持することが好ましい。これを実現するため、軟骨損傷部または半月板損傷部を上方に向けること、そして上方に向けた軟骨損傷部または半月板損傷部に滑膜由来間葉系幹細胞を保持することを目的として、体位を少なくとも１０分間、好ましくは１５分間保持する。
　滑膜由来間葉系幹細胞を伴う軟骨損傷部や半月板損傷部をさらに、滑膜由来間葉系幹細胞の軟骨損傷部または半月板損傷部への接着をより強固にするため、骨膜で覆うことができる。滑膜由来間葉系幹細胞を軟骨損傷部の表面や半月板損傷部の表面に少なくとも１０分間保持したのち手術は完了する。
　本発明において、移植した滑膜由来間葉系幹細胞は、軟骨損傷部や半月板損傷部で軟骨細胞に分化し、そして軟骨損傷部または半月板損傷部にてｉｎ　ｓｉｔｕで軟骨組織を再生する。
　滑膜由来間葉系幹細胞のｉｎ　ｓｉｔｕでの軟骨形成過程の間、局所微小環境（栄養供給およびサイトカイン環境など）に従って、軟骨組織が再生するため、外部からの操作は必要とされない。滑膜由来間葉系幹細胞のｉｎ　ｓｉｔｕ軟骨形成の結果、軟骨組織が軟骨損傷部または半月板損傷部にて再生されて、損傷を修復し、そして軟骨損傷の場合には骨領域、軟骨と骨との境界、軟骨中心部、表面領域、そしてもとの軟骨に隣接する領域がもとの軟骨組織として形成され、または半月板損傷の場合には半月板軟骨が形成される。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜比較例１＞通常の製造工程による滑膜由来間葉系幹細胞の製造（酵素処理時間１時間、洗浄工程なし）
　ヒト検体を用いて、通常の製造法により滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を作製した。具体的には、Ｃ１検体（滑膜組織０．５ｇ）をハサミで細断し、リベラーゼ水溶液５．０ｍＬに浸漬させた。尚、リベラーゼ水溶液はリベラーゼＭＮＰ－Ｓ（ロシュ製）５．０ｍｇを、最終濃度２０％ヒト自己血清を含む注射用水５．０ｍＬに溶解したものを用いた。酵素反応は室温２５℃で１時間反応させた。その後、組織消化液をセルストレーナーを通して、５０ｍＬ遠沈管に移して４００ｇで５分間遠心した。上清を除き、得られた細胞濃厚懸濁液を培地に懸濁しフラスコへ全量を播種した（播種密度２００個／ｃｍ2）。尚、培地はαＭＥＭに最終濃度１０％ヒト自己血清を溶解させた物を用いた。培養はＣＯ2インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）にて行い、２週間後にフラスコから細胞を回収し、滑膜由来間葉系幹細胞を製造した。なお、培養期間中、培地交換を実施しない点は本細胞製造の特徴でもある。こうして、最終的に得られた細胞収量はＣ１が１．８×１０7ｃｅｌｌｓであった。結果のまとめを表１に記載した。
＜比較例２＞酵素処理時間を延長した製造工程による滑膜由来間葉系幹細胞の製造（酵素処理時間１．５時間、洗浄工程なし）
　ヒト検体を用いて、通常の製造法よりも酵素処理時間を３０分延長した条件で、滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を作製した。具体的には、Ｃ２検体（滑膜組織０．９ｇ）を、ハサミで細断し、リベラーゼ水溶液５．０ｍＬに浸漬させた。尚、リベラーゼ水溶液はリベラーゼＭＮＰ－Ｓ（ロシュ製）５．０ｍｇを、最終濃度２０％ヒト自己血清を含む注射用水５．０ｍＬに溶解したものを用いた。酵素反応は室温２５℃で１．５時間反応させた。その後、組織消化液をセルストレーナーを通して、５０ｍＬ遠沈管に移して４００ｇで５分間遠心した。上清を除き、得られた細胞濃厚懸濁液を培地に懸濁しフラスコへ全量を播種した（播種密度１,８８０個／ｃｍ2）。なお、培地はαＭＥＭに最終濃度１０％ヒト自己血清を溶解させた物を用いた。培養はＣＯ2インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）にて行い、２週間後にフラスコから細胞を回収し、滑膜由来間葉系幹細胞を製造した。尚、培養期間中、培地交換を実施しない点は本細胞製造の特徴でもある。こうして、最終的に得られた細胞収量はＣ２として０．８×１０7ｃｅｌｌｓとなった。これは治療に必要と考えられる１．０×１０7ｃｅｌｌｓを下回っており、治療に必要な細胞量を提供出来ない水準になった。結果のまとめを表１に記載した。
＜実施例１＞酵素処理時間を延長し、酵素洗浄工程を付与した製造工程による滑膜由来間葉系幹細胞の製造（酵素処理時間３時間、洗浄工程あり）
　ヒト検体を用いて、通常の製造法よりも酵素処理時間を２時間延長した条件で、滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を作製した。具体的には、Ｊ１検体（滑膜組織０．８ｇ）、Ｊ２検体（滑膜組織０．６ｇ）、Ｊ３検体（滑膜組織０．７ｇ）、Ｊ４検体（滑膜組織０．５ｇ）、Ｊ５検体（滑膜組織０．３ｇ）を、それぞれハサミで細断し、リベラーゼ水溶液５．０ｍＬに浸漬させた。なお、リベラーゼ水溶液はリベラーゼＭＮＰ－Ｓ（ロシュ製）５．０ｍｇを、最終濃度２０％ヒト自己血清を含む注射用水５．０ｍＬに溶解したものを用いた。酵素反応は室温２５℃で３時間反応させた。その後、組織消化液をセルストレーナーを通して、５０ｍＬ遠沈管に移して４００ｇで５分間遠心した。
　さらにその後、洗浄工程として、上清を廃棄して２０ｍＬのαＭＥＭで再懸濁して４００ｇで５分間遠心する、という工程を付与した。この洗浄工程は計２回繰り返し行った。
　その後、上清を除き、得られた細胞濃厚懸濁液を培地に懸濁しフラスコへ全量を播種した（播種密度はＪ１が１，８７４個／ｃｍ2、Ｊ２が１，０５９個／ｃｍ2、Ｊ３が１，９８７個／ｃｍ2、Ｊ４が１，５１３個／ｃｍ2）。なお、培地はαＭＥＭに最終濃度１０％ヒト自己血清を溶解させた物を用いた。培養はＣＯ2インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）にて行い、２週間後にフラスコから細胞を回収し、滑膜由来間葉系幹細胞を製造した。尚、培養期間中、培地交換を実施しない点は本細胞製造の特徴でもある。
　こうして、最終的に得られた細胞収量はＪ１が４．９×１０7ｃｅｌｌｓ、Ｊ２が７．６×１０7ｃｅｌｌｓ、Ｊ３が５．８×１０7ｃｅｌｌｓ、Ｊ４が９．０×１０7ｃｅｌｌｓ、Ｊ５が６．５×１０7ｃｅｌｌｓとなった。これは治療に必要と考えられる１．０×１０7ｃｅｌｌｓを大幅に上回っており、治療に必要な細胞量を十分に、かつ安定に提供出来る水準であった。結果のまとめを表１に記載した。
＜実施例２＞残存酵素リベラーゼの定量
　比較例１、比較例２、および実施例１で実施した製造工程において、培地に残存したリベラーゼ量を定量した。結果、Ｃ１は１０．２ｎｇ／ｍＬ、Ｃ２は５９．８ｎｇ／ｍＬ、Ｊ１～Ｊ５はいずれも０．１ｎｇ／ｍＬ以下（キットの検出限界以下）であることが明らかになった。結果を表１に示す。
＜実施例３＞間葉系幹細胞マーカーの確認試験
　比較例１および２、並びに実施例１で作製した滑膜由来間葉系幹細胞について、間葉系幹細胞マーカーの発現について確認試験を実施した。その結果、いずれの細胞においても、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５陰性、軟骨分化能が示されたことから、滑膜由来間葉系幹細胞であることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜結果の解釈＞
　表１に示した結果から、細胞収量に対して滑膜組織の重量が支配的なパラメータでないことが明らかとなった。また、酵素処理時間を延長することは、滑膜組織に対して損傷を与えることから忌避すべきものと考えられていた通り、実際に、Ｃ１に対して酵素処理時間を３０分延長したＣ２では細胞収量が著しく減じてしまうことが分かった。一方で、培地中に血清が存在することから必ずしも必要ではないと考えていた洗浄工程をあえて付与し、かつ酵素処理時間をさらに延長するという組み合わせを実施することにより、Ｊ１～Ｊ５のように大幅な細胞収量の増加を達成出来ることが明らかとなった。滑膜組織からの細胞製造工程では、今まで組み入れられなかった上記２つの工夫が、非常に重要となることを見出した。加えて、上記の製造により得られたＪ１～Ｊ５細胞収量は、治療に必要と考えられる１．０×１０7ｃｅｌｌｓを大幅に上回り、これが他家細胞であっても効果を示し得る細胞量（２．０×１０7ｃｅｌｌｓ）をも大幅に上回るため、自家細胞治療を想定した滑膜由来間葉系幹細胞製造の方法として顕著な価値を有すると考えられた。
＜実施例４＞
　Ｊ１～Ｊ５として製造された滑膜由来間葉系幹細胞は、実際に半月板損傷患者自身の検体から製造され、製造後に自家細胞治療として半月板損傷患者に投与された。その結果、Ｊ１～Ｊ５として製造された滑膜由来間葉系幹細胞が投与された全ての半月板損傷患者において、投与５２週後まで良好な症状緩和が認められた。症状のスコアとして知られるリスホルムスコア（下記表２を参照）において、治療前と比較し投与５２週後では、２２点以上の改善が確認され、ＭＲＩ（磁気共鳴画像診断）での半月板確認においても、整復されていることが認められ、良好な治療成績を示すことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (18)

  1. 滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する方法であって、
    滑膜組織を酵素で２時間以上処理すること、および
    酵素処理後の混合物を、上清中の残存酵素濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ以下になるまで洗浄することにより滑膜由来間葉系幹細胞を得ること、
    を含む、滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法。
  2. 酵素が、１種以上のコラゲナーゼと１種以上の中性プロテアーゼを含む混合酵素である、請求項１に記載の方法。
  3. 酵素が、リベラーゼ（登録商標）である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 酵素処理における酵素濃度が、０．０１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌである、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 滑膜組織がヒト由来である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  6. 滑膜組織が、単一ドナー由来の滑膜組織である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 滑膜が採取される対象と、滑膜由来間葉系幹細胞が移植される対象とが、同一対象である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
  8. 滑膜組織と酵素の質量比率が、１０００：１～１０：１である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
  9. 前記洗浄が、培地を用いて複数回洗浄することを含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
  10. 前記培地が、α改変イーグル最小必須培地である、請求項９に記載の方法。
  11. 洗浄後の滑膜由来間葉系幹細胞を１０日間以上培養することにより、滑膜由来間葉系幹細胞を増殖させることを含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
  12. 前記１０日間以上の培養を、培地交換なしで行う、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記１０日間以上の培養を、自己の血清を含む培地中で行う、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 滑膜由来間葉系幹細胞以外の他の細胞と共培養されることなく、滑膜由来間葉系幹細胞が製造される、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
  15. 請求項１から１４の何れか一項に記載の方法により滑膜由来間葉系幹細胞を製造すること、および
    前記滑膜由来間葉系幹細胞を用いて関節治療用細胞製剤を製造すること、
    を含む、関節治療用細胞製剤の製造方法。
  16. 関節治療が、半月板損傷の治療である、請求項１５に記載の関節治療用細胞製剤の製造方法。
  17. 請求項１～１４の何れか一項に記載の方法により製造された、滑膜由来間葉系幹細胞。
  18. 請求項１５または１６に記載の方法により製造された、関節治療用細胞製剤。
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