WO2021251337A1 - トール様受容体７の活性化阻害剤として有用な新規化合物 - Google Patents

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直樹 岡本
繁人 藤下
貴次 広川
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テイカ製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an activation inhibitor of a Toll-like receptor 7 (TLR7) and a novel compound useful as a prophylactic or therapeutic agent for a disease associated with activation of TLR7 containing the activation inhibitor.
  • TLR7 Toll-like receptor 7
  • the immune system is roughly divided into the innate immune system and the adaptive immune system.
  • the innate immune system is a biological defense mechanism that operates in the early stages of infection, and phagocytic cells such as macrophages and dendritic cells play a central role.
  • lymphocytes play a central role and are an acquired biological defense mechanism for coping with innumerable antigens.
  • Acquired immunity begins when T cells, a type of lymphocyte, receive antigen from activated dendritic cells. That is, activation of innate immunity is indispensable for inducing acquired immunity.
  • TLR7 expressed in the cell membrane and intracellular of phagocytic cells specifically recognizes the constituents of bacteria and viruses and activates transcription factors such as NF- ⁇ B to induce the production of inflammatory cytokines.
  • TLR7 localizes to endosomes and lysosomes of B cells and plasmacytoid dendritic cells and recognizes single-stranded RNA derived from viruses.
  • Ligand-recognized TLR7 protects against viral infection by inducing the production of type I interferon (IFN- ⁇ ).
  • IFN- ⁇ is associated with the onset and exacerbation of non-infectious inflammatory diseases such as autoimmune diseases, as TLR7 also recognizes nucleic acids (self-antigens) released from damaged self-cells and dead cells. It is one of the factors to do.
  • TLR7 also recognizes nucleic acids (self-antigens) released from damaged self-cells and dead cells. It is one of the factors to do.
  • IFN- ⁇ also promotes the differentiation of self-reactive B cells into class switches and plasma cells by inducing the expression of BAFF (B cell activating factor) or APRIL (a proliferation inducing ligand) in dendritic cells.
  • BAFF B cell activating factor
  • APRIL a proliferation inducing ligand
  • Autoimmune diseases are a group of diseases with various characteristic inflammations, often characterized by the appearance of antibodies against self-antigens (such as antinuclear antibodies). With the progress of autoimmune disease or pathological condition, it causes serious damage to various organs including skin, kidney and other multi-organs, muscles, nerves, and blood vessels.
  • Systemic lupus erythematosus is a typical example of an autoimmune disease caused by abnormal signal of TLR7 and production of IFN- ⁇ .
  • systemic lupus erythematosus The number of systemic lupus erythematosus patients is estimated to be 1.4 million worldwide and about 100,000 in Japan (the number of specific disease medical care recipient certificates issued in FY2016 was 63,792 for systemic lupus erythematosus), especially 20- It often occurs in women in their 30s.
  • Systemic lupus erythematosus is an intractable immune disease of unknown cause and has been designated as a specific disease by the Ministry of Health, Labor and Welfare. There are multiple cases in mice and humans that have reported that signal abnormalities in TLR7 cause systemic lupus erythematosus.
  • mice in which the 34th aspartic acid residue of Unc93B1, which is involved in the transport of TLR7 or TLR9 from the endoplasmic reticulum to endosomes, is mutated to an alanine residue show autoimmune disease-like symptoms due to increased responsiveness of TLR7. Hepatitis kills more than half within a year (Fukui, R., et al. Immunity. 35: 69-81, 2011). In human systemic lupus erythematosus patients, the gene expression level of TLR7 in peripheral blood mononuclear cells is higher than that in healthy subjects, and TLR7 ligand stimulation produces a large amount of inflammatory cytokines ( Komatsuda, A., et al.
  • MRL / Mp lpr / lpr mice which are spontaneous autoimmune disease model mice, are representative animal models of human systemic lupus erythematosus, produce autoantibodies such as antinuclear antibodies, and with aging. , Vasculitis, polyarthritis and glomerulonephritis.
  • TLR7 deficiency in MRL / Mp lpr / lpr mice suppresses lymphocyte activation and reduces the symptoms of pyelonephritis (Christensen, S.R., et al. 2006. Immunity. 25 (3): 417-428).
  • TLR9 deficiency in MRL / Mp lpr / lpr mice reduced anti-DNA antibody titers, but did not improve the symptoms of pyelonephritis.
  • Rheumatoid arthritis which has the largest number of patients among autoimmune diseases, is an inflammatory disease in which the synovial joint is the main lesion, and polyarthritis persists, cartilage and bone are damaged, and joint destruction progresses. I'm sick.
  • the involvement of inflammatory cytokines in autoimmune diseases is being analyzed mainly in rheumatoid arthritis model mice and rheumatoid arthritis patients.
  • IL-1 receptor antagonist as IL-1 inhibitory therapy, anti-TNF- ⁇ antibody as TNF- ⁇ inhibitory therapy, and anti-IL-6 receptor antibody as IL-6 inhibitory therapy have been approved as therapeutic agents for rheumatoid arthritis and used in clinical practice.
  • a mouse-human chimeric IgG1 ⁇ monoclonal antibody (trade name: rituximab) against CD20 specifically expressed on the surface of B cells has been used as a therapeutic agent for malignant lymphoma and attracted attention as a therapeutic agent for systemic lupus erythematosus.
  • clinical trials failed due to reports of serious adverse events, including deaths.
  • clinical trials using antibodies against IFN- ⁇ and its receptors are underway, and good results have been obtained in the safety and efficacy evaluation, but multiple adverse events (anemia, lymphocytes) are infrequent. Occurrence of hypocytopenia, decreased liver function, etc.) has been reported.
  • biopharmacy can be expected to have a high effect of improving the pathological condition, but regular and long-term administration is required, which causes problems related to the physical and medical financial burden on the patient, thereby causing problems.
  • the effectiveness of this mode of treatment may be reduced.
  • steroids are used as first-line drugs in many autoimmune diseases for which effective treatments have not yet been established. Steroids have a strong anti-inflammatory effect, but also have an immunosuppressive effect, so long-term administration causes side effects.
  • inhibitors for TLR7 or TLR9 aiming at the creation of alternative therapeutic agents for steroids is underway, and to date, inhibitors for TLR7 and TLR9 based on oligonucleotides (Rommler, F., et al) have been developed. J. Immunol., 191: 3240-3253, 2013) and inhibitors of TLR7 and TLR9 based on small molecule compounds (Lamphier, M., et al. Mol. Pharmacol., 85: 429-440, 2014) Has been reported, but it has not been put into practical use. On the other hand, hydroxychloroquine, which was approved in Japan in 2015, is a small molecule drug that can be orally administered, but it has not been aggressively prescribed due to concerns about side effects such as retinopathy.
  • TLR7 is involved in various diseases other than systemic lupus erythematosus.
  • Alzheimer's disease is a progressive loss of cognitive function, with excess senile plaques consisting of entangled neurofibrils made up of amyloid ⁇ and ⁇ proteins in the patient's cerebral cortex and subcortical gray matter. The main cause of this disease is thought to be the deposition of amyloid ⁇ protein in nerve cells.
  • the juvenile-onset type accounts for 2-7% of cases, while the normal type is hereditary due to mutation and develops in the elderly over 60 years of age, and its prevalence increases with age.
  • the Ministry of Health, Labor and Welfare announced in 2013 that the number of dementia patients in Japan was 4.62 million, most of which are said to be Alzheimer's disease.
  • TLR7 is involved in brain diseases caused by neurodegenerative diseases, stroke or multiple sclerosis. It has been reported that let-7 (microRNA) -induced neurotoxicity, which is abundant in the brain, is dependent on TLR7 (Lehmann, S.M., et al. Nat Neurosci. 15 (6)). : 827-835). Let-7 is more abundant in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients than in healthy subjects, and is thought to be involved in neuronal degeneration.
  • CB-7 which showed the highest TLR7 inhibitory effect, suppresses the activation of TLR7 in mouse immune cells (macrophages, dendritic cells) and human immune cells (peripheral blood mononuclear cells, dendritic cells).
  • mouse immune cells macrophages, dendritic cells
  • human immune cells peripheral blood mononuclear cells, dendritic cells.
  • the TLR7 inhibitory effect in normal mice was weak, and the drug efficacy in systemic lupus erythematosus model mice was also limited.
  • the present inventors have repeatedly investigated methods and substances for creating a compound having a higher TLR7 inhibitory activity than the lead compound CB-7 and showing effectiveness at the animal level. As a result, they found that a plurality of derivatives having a novel structure inhibit the induction of production of the inflammatory cytokine IL-6 or IFN- ⁇ by TLR7 activation up to about 45 times stronger than that of CB-7, and completed the present invention. I let you.
  • a compound represented by the following formula (I) or (II), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof is provided.
  • R 1 is An alkoxy group having 3 to 5 carbon atoms, which contains at least two oxygen atoms.
  • formula: (In the formula, R 2 and R 3 are independently alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms.) Or a group represented by the formula: (During the ceremony, The C ring is a 3- to 7-membered nitrogen-containing heterocycle.
  • R 4 is, -NH -, - O -, - CF 2 -, - CHF -, - a or a group represented by -CHF-X-CHF-, - C 2 H 2 F 2 X is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. ) It is a group represented by. )
  • Such compounds, pharmacologically acceptable salts thereof, or prodrugs thereof can at least inhibit the activation of TLR7.
  • R 1 is Or The above compounds, pharmacologically acceptable salts thereof, or prodrugs thereof are also provided.
  • the above-mentioned compound is also provided as the above-mentioned compound represented by any of the following formulas (III) to (XIII), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof.
  • formulas (III) to (XIII) a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof.
  • the pharmacologically acceptable salt is a hydrochloride or formate, and the above-mentioned compound, the pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof is also provided.
  • the present invention also provides a Toll-like receptor 7 (TLR7) activation inhibitor containing the above compounds, pharmacologically acceptable salts thereof, or prodrugs thereof.
  • TLR7 Toll-like receptor 7
  • the above-mentioned TLR7 activation inhibitor having an inhibitory effect on the production of NF- ⁇ B, IL-6, TNF- ⁇ or IFN- ⁇ caused by the activation of TLR7 is also provided.
  • a prophylactic or therapeutic agent for a disease associated with TLR7 activation which contains the above-mentioned TLR7 activation inhibitor, is also provided.
  • the diseases associated with the activation of TLR7 are autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes, autoimmune pancreatitis, arteriosclerosis, septicemia, neurodegenerative diseases, transplant rejection, and transplant vs. host diseases. , Periodic disease, viral immunodeficiency, IgA nephropathy, primary nephrosis syndrome, primary membranous proliferative glomerulonephritis, purpura nephritis, Langerhans cell histiocytosis, hemophagocytic lymphohistiocytosis, Rosai -The above prophylactic or therapeutic agents for Dorfman's disease, obesity, type 2 diabetes or ulcerative colitis are also provided.
  • the above-mentioned preventive or therapeutic agent in which the above-mentioned disease associated with TLR7 activation is an autoimmune disease is also provided.
  • the above autoimmune diseases include systemic erythematosus, Sjogren's syndrome, scleroderma, polymyositis / dermatomyitis, mixed connective tissue disease, duplication syndrome, antiphospholipid antibody syndrome, Bechet's disease, Adult Still's disease, rheumatic fever, malignant rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, HLA-B27-related rheumatic diseases, IgG4-related syndrome, ANCA-related vasculitis, vasculitis syndrome, polysclerosis, psoriasis vulgaris, inflammatory Intestinal disease, autoimmune thyroid disease, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenia purpura, primary biliary cirrhosis, primary biliary cholangitis, severe myasthenia, Good Pasture syndrome, Gillan Valley syndrome , Chronic atrophic gastric
  • the prophylactic or therapeutic agent in which the autoimmune disease is the systemic lupus erythematosus is also provided.
  • TLR7 signaling abnormalities are one of the causes in patients with systemic lupus erythematosus.
  • a therapeutic strategy that inhibits the activation of TLR7 and the associated production of inflammatory cytokines and IFN- ⁇ is considered important.
  • the use of biologics for the treatment or prevention of autoimmune diseases is not suitable as a long-term therapeutic agent for autoimmune diseases from the viewpoint of physical and medical financial burden on patients. Therefore, as an effective means for treating autoimmune diseases over a long period of time, there is a need for a non-invasive therapeutic means having advantages such as safety, convenience, and economy.
  • the present invention is a non-invasive agent for preventing or treating a disease associated with TLR7 activation, which comprises a TLR7 activation inhibitor and a TLR7 activation inhibitor, and has advantages such as safety, convenience, and economy. be. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a therapeutic / prophylactic agent for an inflammatory disease in which the activity inhibitory action of NF- ⁇ B, IL-6 and IFN- ⁇ is effective.
  • FIG. 1 shows modified areas (areas a and b) in lead compound CB-7.
  • FIG. 2 is a graph showing the TLR7 inhibitory activity (inhibition of IL-6 expression) of CB-7 or B2-24-4-5A / HCOOH in mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM).
  • FIG. 3 is a graph showing that B2-24-4-5A ⁇ HCOOH in mouse BMDM is TLR7 selective.
  • FIG. 4 shows the TLR7 inhibitory activity (IL-) of B2-24-4-5A ⁇ HCOOH, B2-24-4 ⁇ HCl or hydroxychloroquine sulfate (HCQ) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from systemic lupus erythematosus patients.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 5 is a graph showing plasma concentrations of CB-7 or B2-24-4-5A ⁇ HCOOH after oral administration in mice.
  • FIG. 6 is a graph showing plasma concentrations of B2-24-4-5A ⁇ HCOOH after oral administration in systemic lupus erythematosus model mice.
  • FIG. 7 is a graph showing TLR7 inhibitory activity (inhibition of IFN- ⁇ expression) by intraperitoneal administration of B2-24-4-5A ⁇ HCOOH or HCQ in mice.
  • FIG. 8 shows the TLR7 inhibitory activity (inhibition of IFN- ⁇ expression) by intraperitoneal administration of B2-24-4 ⁇ HCl, B2-24-4-5A, B2-24-4-5A ⁇ HCOOH or HCQ in mice. It is a graph which shows.
  • FIG. 9A is a photograph of the spleen of mice (saline-administered group and B2-24-4-5A / HCOOH-administered group) in which systemic lupus erythematosus-like pathology was induced.
  • FIG. 9A is a photograph of the spleen of mice (saline-administered group and B2-24-4-5A / HCOOH-administered group) in which systemic lupus
  • FIG. 9B shows the spleen weight of mice (saline-administered group and B2-24-4-5A / HCOOH-administered group) in which systemic lupus erythematosus-like pathology was induced.
  • FIG. 9C shows the proportion of activated T cells in the spleen of mice (saline-administered group and B2-24-4-5A / HCOOH-administered group) that induced systemic lupus erythematosus-like pathology.
  • FIG. 9C shows the proportion of activated T cells in the spleen of mice (saline-administered group and B2-24-4-5A / HCOOH-administered group) that induced systemic lupus erythematosus-like pathology.
  • FIG. 9D is a photograph showing IgG deposition in the glomerulus of mice (saline-administered group and B2-24-4-5A / HCOOH-administered group) in which systemic lupus erythematosus-like pathology was induced.
  • FIG. 10A shows the systemic lupus erythematosus model mice (saline-administered group, B2-24-4-5A / HCOOH-administered group, B2-24-4 / HCOOH-administered group and HCQ-administered group) during the administration period. The survival rate curve is shown.
  • FIG. 10A shows the systemic lupus erythematosus model mice (saline-administered group, B2-24-4-5A / HCOOH-administered group, B2-24-4 / HCOOH-administered group and HCQ-administered group) during the
  • FIG. 10B shows serum urea nitrogen levels of systemic lupus erythematosus model mice (saline-administered group, B2-24-4-5A / HCOOH-administered group, B2-24-4 / HCOOH-administered group and HCQ-administered group).
  • FIG. 10C shows serum creatinine levels of systemic lupus erythematosus model mice (saline-administered group, B2-24-4-5A / HCOOH-administered group, B2-24-4 / HCOOH-administered group and HCQ-administered group).
  • FIG. 10C shows serum creatinine levels of systemic lupus erythematosus model mice (saline-administered group, B2-24-4-5A / HCOOH-administered group, B2-24-4 / HCOOH-administered group and HCQ-a
  • FIG. 10D shows the amount of urinary albumin in systemic lupus erythematosus model mice (saline-administered group, B2-24-4-5A / HCOOH-administered group, B2-24-4 / HCOOH-administered group and HCQ-administered group).
  • FIG. 10E shows systemic lupus erythematosus model mice (mice in the saline (saline) -administered group (# 1), mice in the B2-24-4-5A / HCOOH-administered group (# 10), B2-24-4 / HCOOH).
  • FIG. 10F shows systemic erythematosus model mice (mice in the saline (saline) -administered group (# 1), mice in the B2-24-4-5A / HCOOH-administered group (# 10), B2-24-4 / HCOOH). It is a photograph showing the deposition of C3 in the mice (# 4) in the administration group and the mice (# 14) in the HCQ administration group) glomeruli.
  • FIG. 10G shows a stained photograph of a renal tissue section of a mouse (# 1) in a saline (saline) -administered group.
  • FIG. 10H shows a stained photograph of a renal tissue section of a mouse (# 1) in the B2-24-4-5A ⁇ HCOOH-administered group.
  • FIG. 11A shows the weight of the spleen of systemic lupus erythematosus model mice (saline-administered group, B2-24-4-5A / HCOOH-administered group and HCQ-administered group).
  • FIG. 11B shows the number of splenocytes in systemic lupus erythematosus model mice (saline-administered group, B2-24-4-5A / HCOOH-administered group and HCQ-administered group).
  • FIGS. 12 (A) to 12 (E) show the ratio of various cells in the spleen.
  • 13 (A) to 13 (E) show the ratio of various cells in the spleen.
  • 14 (A) to (E) show the ratio of various cells in the spleen.
  • FIG. 15 is a graph showing TLR7 inhibitory activity (inhibition of IL-6 expression) of B2-24-4-5A ⁇ HCOOH in mouse Flt-3 ligand-induced dendritic cells (FLDC).
  • the wavy line in the formula represents a covalent bond with the compound represented by the formula (I) or (II).
  • a compound represented by the following formula (I) or (II), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof is provided.
  • R 1 is An alkoxy group having 3 to 5 carbon atoms, which contains at least two oxygen atoms.
  • formula: (In the formula, R 2 and R 3 are independently alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms.) Or a group represented by the formula: (During the ceremony, The C ring is a 3- to 7-membered nitrogen-containing heterocycle.
  • R 4 is, -NH -, - O -, - CF 2 -, - CHF -, - a or a group represented by -CHF-X-CHF-, - C 2 H 2 F 2 X is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. ) It is a group represented by. )
  • R 1 is Or May be.
  • the compound may be the compound represented by any of the following formulas (III) to (XIII), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof.
  • the compound of the present invention may form a salt, and the salt is preferably a pharmacologically acceptable salt.
  • the pharmacologically acceptable salt is not particularly limited as long as it maintains the activity of the compound and does not adversely affect the living body.
  • Etan sulfonic acid 2-hydroxy ethane sulfonic acid, benzene sulfonic acid, paratoluene sulfonic acid (tosyl acid), lauryl sulfate, malic acid, aspartic acid, glutamic acid, adipic acid, cysteine, N-acetyl cysteine, hydrochloric acid, bromide Salts with acids such as hydrous acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydroiodic acid, nicotinic acid, oxalic acid, picric acid, thiocyan acid, undecanoic acid, acrylic acid polymer, carboxyvinyl polymer, lithium, sodium, potassium, calcium, etc.
  • Examples thereof include a salt with an inorganic base, a salt with an organic amine such as morpholin and piperidine, and a salt with an amino acid.
  • a salt with an inorganic base a salt with an organic amine such as morpholin and piperidine
  • a salt with an amino acid Preferably, it is a salt with hydrochloric acid (formate) or a salt with formic acid (formate).
  • the prodrug means a compound that is converted into a compound represented by any of the above formulas (I) to (XIII) by a reaction with an enzyme, gastric acid, or the like under physiological conditions in the living body.
  • an enzyme gastric acid, or the like under physiological conditions in the living body.
  • esters that are hydrolyzed in vivo to release these compounds.
  • the compound of the present invention or a salt thereof may be a solvate.
  • the solvate is preferably non-toxic and water-soluble. Suitable solvates include, for example, solvates with water, solvates with alcoholic solvents (methanol, ethanol, etc.).
  • TLR7 activation is a known activity of TLR7, production of cytokines such as TNF- ⁇ , IL-6, IL-12, IFN- ⁇ or IFN- ⁇ in macrophages or dendritic cells, CCL2, CCL5, CXCL8 or Biological reactions such as chemokine production such as CXCL10, enhancement of cell proliferation in B cells, enhancement of expression of co-stimulatory molecules such as CD80 or CD86, induction of class switch or antibody production, and induction of immune unresponsiveness in T cells. Be done.
  • the TLR7 activation inhibitor of the present invention can suppress the above activation (biological reaction), preferably NF- ⁇ B, IL-6, TNF- ⁇ or IFN- ⁇ resulting from the activation of TLR7. It can have the effect of suppressing production. Inhibition of TLR7 activation increases TLR7 activation (eg, NF- ⁇ B, IL-6, TNF- ⁇ or IFN- ⁇ production) by 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%. , 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% or 99.9%, even if it means reducing the range between two numbers arbitrarily selected from the above numerical group. good.
  • the TLR7 activation inhibitor of the present invention can also be used as a research reagent for analysis of TLR7 expression, function and related signal transduction mechanism.
  • the TLR7 activation inhibitor of the present invention can inhibit TLR7 activation, it is useful as a drug for the prevention or treatment of diseases associated with TLR7 activation. That is, the present invention also provides a prophylactic or therapeutic agent for a disease associated with TLR7 activation, which comprises the TLR7 activation inhibitor of the present invention.
  • Diseases associated with TLR7 activation include, for example, autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes, autoimmune pancreatitis, arteriosclerosis, sepsis, neurodegenerative diseases, transplant rejection, transplant-to-host diseases, periodontal diseases, viruses.
  • sexual immunodeficiency IgA nephropathy, primary nephrosis syndrome, primary membranous proliferative glomerulonephritis, purpura nephritis, Langerhans cell histiocytosis, hemophagocytic lymphohistiocytosis, Rosai-Dorfman disease, obesity, Examples include, but are not limited to, type 2 diabetes and ulcerative colitis.
  • Autoimmune diseases are preferable as the target diseases of the prophylactic or therapeutic agents of the present invention.
  • autoimmunity diseases include systemic erythematosus, Sjogren's syndrome, choriocytosis, polymyositis / dermatomyitis, mixed connective tissue disease, duplication syndrome, antiphospholipid antibody syndrome, Bechet's disease, adult still disease, rheumatic fever, etc.
  • rheumatoid arthritis Malignant rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, HLA-B27-related rheumatic diseases (tonic spondylitis, Reiter syndrome, psoriatic arthritis, etc.), IgG4-related syndromes, ANCA-related vasculitis (microscopic polyangiitis, polyvasculitis, etc.) Flame granulomatosis, eosinophil polyangiitis granulomatosis), vasculitis syndrome (rheumatic polymyopathy, giant cell vasculitis, nodular polyarteritis, etc.), polysclerosis, vulgaris Psoriasis, inflammatory bowel disease, autoimmune thyroid disease (Hashimoto disease, Basedo disease, etc.), autoimmune hemolytic anemia, idiopathic thrombocytopenic purpura, primary biliary cirrhosis, primary biliary vasculitis, Se
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention contains a compound represented by any of the above formulas (I) to (XIII) as an active ingredient, and is a method known as a method for producing a pharmaceutical preparation (for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia).
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive can be appropriately blended and formulated.
  • tablets including sugar-coated tablets, film-coated tablets, sublingual tablets, orally disintegrating tablets, buccal tablets, etc.
  • suppositories powders, granules, capsules (including soft capsules and microcapsules).
  • Troches suppositories, liquids, emulsions, suspensions, release-controlled preparations (eg, immediate-release preparations, sustained-release preparations, sustained-release microcapsules, etc.), aerosols, film preparations (eg, orally disintegrating film).
  • release-controlled preparations eg, immediate-release preparations, sustained-release preparations, sustained-release microcapsules, etc.
  • aerosols eg, orally disintegrating film.
  • Oral mucosa patch film, etc. Injection (eg, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), drip, transdermal absorption type preparation, ointment, lotion, patch , Suppositories (for example, anal suppositories, vaginal suppositories, etc.), pellets, nasal agents, pulmonary agents (inhalants), oral agents such as eye drops, or parenteral agents.
  • the blending ratio of the carrier or the additive can be appropriately set based on the range usually adopted in the pharmaceutical field.
  • the carriers or additives that can be blended are not particularly limited, but various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption promotion Examples thereof include various additives such as agents, lubricants, colorants, flavoring agents, and fragrances.
  • Additives that can be mixed with tablets, capsules, etc. include, for example, gelatin, cornstarch, tragant, binders such as gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, cornstarch, gelatin, arginic acid and the like. Swelling agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavors such as peppermint, reddish oil or cherry are used.
  • the dispensing unit form is a capsule, the above-mentioned type of material can further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Aseptic compositions for injection can be prepared according to conventional formulation procedures (eg, dissolving or suspending the active ingredient in a solvent such as water for injection, natural vegetable oil, etc.).
  • aqueous solution for injection for example, a physiological saline solution, an isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used, and an appropriate solubilizing agent, for example, is used. It may be used in combination with alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50, etc.).
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as solubilizing agents.
  • buffers eg phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalconium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • it may be blended with benzyl alcohol, phenol, etc.), an antioxidant, or the like.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention can be safely administered to humans and mammals other than humans (for example, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention varies depending on the dosage form, administration method, carrier, etc., but the active ingredient is usually 0.01 to 100% (w / w), preferably 0.1 to 95% (w / w) with respect to the total amount of the preparation. ), It can be produced according to a conventional method.
  • the dose of the prophylactic or therapeutic agent of the present invention varies depending on the administration subject, symptom, administration route, etc., but in the case of oral administration, generally, for example, in a human with a body weight of about 60 kg, about 0.01 to 1000 mg per day. , Preferably about 0.1-100 mg, more preferably about 0.5-50 mg.
  • the single dose varies depending on the patient's condition, symptoms, administration method, etc., but for injection, for example, it is usually about 0.01 to 100 mg per 1 kg of body weight, preferably about 0.01 to 50 mg, more preferably.
  • the total daily dose may be a single dose or a divided dose.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention can be used in combination with other agents.
  • Other agents include, for example, autoimmune disease therapeutic agents, hyperlipidemia therapeutic agents, non-steroidal anti-inflammatory agents, steroid agents and the like. Above all, it is preferable to use it in combination with a therapeutic agent for autoimmune diseases.
  • the therapeutic agent for autoimmune diseases include steroids containing glucocorticoids, non-steroidal anti-inflammatory agents, biologics such as antibody drugs, immunosuppressants, antimalaria agents and the like.
  • the present invention includes the following inventions. It is characterized by administering to a mammal an effective amount of a compound represented by any of the above formulas (I) to (XIII), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof. TLR7 activation inhibition method. A compound represented by any of the above formulas (I) to (XIII), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof for inhibiting the activation of TLR7. Use of a compound represented by any of the above formulas (I) to (XIII), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof for producing an activation inhibitor of TLR7.
  • a mammal administering to a mammal an effective amount of a compound represented by any of the above formulas (I) to (XIII), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof.
  • a method for preventing or treating a disease associated with activation of TLR7 A compound represented by any of the above formulas (I) to (XIII), a pharmacologically acceptable salt thereof, or a prodrug thereof for the prevention or treatment of a disease associated with activation of TLR7.
  • Example 1 Synthesis of Derivatives with Modified Areas a and b Areas a and b in CB-7 shown in FIG. 1 were modified. Modifications were commissioned to Albany Molecular Research Inc. (USA). Tables 1 and 2 show the CB-7 derivative obtained by the modification. In addition, B2-24-4 ⁇ HCl was obtained as a hydrochloride.
  • Synthetic reagents for each compound were purchased from the commercial market and used as received.
  • 1 H NMR spectra were obtained with a 300 MHz Bruker AVANCE 300 spectrometer and a 400 MHz Bruker AVANCE 400 spectrometer using tetramethylsilane as an internal reference.
  • Thin layer chromatography (TLC) was performed using a Whatman No. 4500-101 (Diamond No. MK6F silica gel 60 angstrom) plate.
  • Synthesis Example 1 Synthesis of Compounds B2-6 and B2-6A
  • the manufacturing method (also referred to as scheme 1) of compounds B2-6 (also referred to as ALB-208276) and B2-6A (also referred to as ALB-208787) is as follows. be.
  • Synthesis Example 2 Synthesis of compound B2-5A
  • the method for producing compound B2-5A (also referred to as ALB-208786) (also referred to as scheme 2) is as follows.
  • Synthesis Example 3 Synthesis of compound B2-6-7
  • the method for producing compound B2-6-7 (also referred to as ALB-209871) (also referred to as scheme 3) is as follows.
  • Synthesis Example 4 Synthesis of compound B2-22
  • the method for producing compound B2-22 (also referred to as ALB-210362) (also referred to as scheme 4) is as follows.
  • Synthesis Example 5 Synthesis of compound B2-24-1
  • the method for producing compound B2-24-1 (also referred to as ALB-210798) (also referred to as scheme 5) is as follows.
  • Synthesis Example 6 Synthesis of compound B2-24-2
  • the method for producing compound B2-24-2 (also referred to as ALB-210361) (also referred to as scheme 6) is as follows.
  • Synthesis Example 7 Synthesis of compound B2-24-3
  • the method for producing compound B2-24-3 (also referred to as ALB-210795) (also referred to as scheme 7) is as follows.
  • Synthesis Example 8 Synthesis of compound B2-24-4 / HCl
  • the method for producing compound B2-24-4 / HCl (also referred to as ALB-210796) (also referred to as scheme 8) is as follows.
  • Synthesis Example 9 Synthesis of compound B2-13
  • the method for producing compound B2-13 (also referred to as ALB-209346) (also referred to as scheme 9) is as follows.
  • Synthesis Example 10 Synthesis of compound B2-26
  • the method for producing compound B2-26 (also referred to as ALB-209873) (also referred to as scheme 10) is as follows.
  • Synthesis Example 11 Synthesis of compound B2-24
  • the method for producing compound B2-24 (also referred to as ALB-209348) (also referred to as scheme 11) is as follows.
  • Synthesis Example 12 Synthesis of compound B2-5A-9
  • the method for producing compound B2-5A-9 (also referred to as ALB-210799) (also referred to as scheme 12) is as follows.
  • Synthesis Example 14 Synthesis of compound B2-5A-4
  • the method for producing compound B2-5A-4 (also referred to as ALB-211299) (also referred to as scheme 14) is as follows.
  • Synthesis Example 15 Synthesis of compound B2-29
  • the method for producing compound B2-29 (also referred to as ALB-210364) (also referred to as scheme 15) is as follows.
  • Synthesis Example 16 Synthesis of compound B2-28
  • the method for producing compound B2-28 (also referred to as ALB-210359) (also referred to as scheme 16) is as follows.
  • Synthesis Example 17 Synthesis of Compounds B2-27 and B2-21
  • the manufacturing methods (also referred to as scheme 17) of compounds B2-27 (also referred to as ALB-209872) and B2-21 (also referred to as ALB-208788) are as follows. be.
  • Synthesis Example 18 Synthesis of compound B2-19
  • the method for producing compound B2-19 (also referred to as ALB-209870) (also referred to as scheme 19) is as follows.
  • Synthesis Example 19 Synthesis of compound B2-18
  • the method for producing compound B2-18 (also referred to as ALB-208789) (also referred to as scheme 20) is as follows.
  • Synthesis Example 20 Synthesis of compound B2-23
  • the method for producing compound B2-23 (also referred to as ALB-208790) (also referred to as scheme 21) is as follows.
  • Synthesis Example 21 Synthesis of compound B2-5B
  • the method for producing compound B2-5B (also referred to as ALB-210363) (also referred to as scheme 22) is as follows.
  • Preparative HPLC conditions Column: Gemini NX-C18 10 ⁇ m; 150 ⁇ 30 mm Mobile phase A: 0.05% aqueous solution of formic acid; B: Acetonitrile. Gradient (T /% B): 0/10, 2/30, 10/75, 15/95, 15.5 / 98, 17.5 / 98, 18/20, 20/10 Diluted solution: MeOH + THF
  • Synthesis Example 22 Synthesis of compound B2-5A-7
  • the method for producing compound B2-5A-7 (also referred to as ALB-211303) (also referred to as scheme 23) is as follows.
  • Preparative HPLC conditions Column: Gemini NX-C18 10 ⁇ m; 150 ⁇ 30 mm Mobile phase: B: acetonitrile; A: 0.05% aqueous formic acid gradient (min /% B): 0/10, 2/30, 10/55, 15/85, 15.5 / 98, 18.5 / 98, 19/10, 20/10 Diluted solution: MeOH Column flow rate: 30 mL / min
  • Synthesis Example 24 Synthesis of compound B2-5A-1
  • the method for producing compound B2-5A-1 (also referred to as ALB-210360) (also referred to as scheme 25) is as follows.
  • Synthesis Example 25 Synthesis of compounds B2-2A and B2-3A
  • the method for producing compound B2-2A also referred to as ALB-210365
  • scheme 26 also referred to as scheme 26
  • B2-3A also referred to as ALB-210797
  • Preparative HPLC conditions Column: Gemini NX-C18 10 ⁇ m; 150 ⁇ 30 mm Mobile phase: A: acetonitrile; B: 10 mm ammonium formate aqueous solution gradient (min /% A): 0/10, 2/20, 10/40, 15/60, 15.5 / 98, 18/98, 18.2 / 10, 20/10 Diluted solution: MeOH + THF
  • Preparative HPLC conditions Column: Gemini NX-C18 10 ⁇ m; 150 ⁇ 30 mm Mobile phase: A: acetonitrile; B: 0.05% aqueous formic acid gradient (minutes /% A): 0/10, 2/30, 10/60, 15/80, 15.2 / 98, 18/98, 18.2 / 10, 20/10 Diluted solution: MeOH + THF
  • Example 2 Evaluation of TLR7 activation inhibition in each derivative Using mouse TLR7 expression reporter cells (Ba / F3 cells), TLR7 activation inhibition in each derivative and CB-7 was evaluated. These cells were donated by Professor Kensuke Miyake (Infectious Genetics, Institute of Medical Science, University of Tokyo). In these cells, a reporter gene in which the GFP gene is linked downstream of the promoter region of NF- ⁇ B has been introduced. Therefore, the addition of a cell-expressed TLR7 ligand enhances GFP expression. The inhibition of TLR7 activation of each derivative was evaluated using the fact that the fluorescence intensity of GFP was attenuated by the addition of each derivative.
  • Loxoribine (manufactured by Alexis Biochemicals) was used as the ligand for mouse TLR7.
  • Gardiquimod (manufactured by Invivogen) was used as the ligand for human TLR7.
  • loxolibin 250 ⁇ g / mL loxolibin was added to each well and cultured for 18 hours. After culture was complete, the cells were washed with PBS (FACS buffer) containing 2.5% (v / v) FCS and each cell was suspended in 200 ⁇ L FACS buffer containing 25 ⁇ g / mL 7-actinomycin D. The GFP fluorescence intensity of the cells was analyzed by flow cytometry. Flow cytometry was measured with FACSCanto TM II (Becton Dickinson) and the data was analyzed with FlowJo Softfair (Tree Star). The MFI (%) when stimulated with 1-100 ⁇ M derivative or CB-7 is calculated with the MFI when stimulated with loxolibin alone as 100%, and then IC 50 (activity is 50) by logistic regression analysis. % Inhibiting compound concentration) was calculated.
  • the IC 50s of each derivative are shown in Table 3.
  • the IC 50 of CB-7 was 3.12 ⁇ M.
  • the derivatives having higher TLR7 activation inhibitory activity than CB-7 are B2-5A, B2-13, B2-22, B2-24, B2-26, B2-28, B2-. 29, B2-24-1, B2-24-2, B2-24-3, B2-24-4 ⁇ HCl, B2-5A-4, B2-5A-6, B2-5A-7 and B2-5A- It was 9.
  • the derivatives that had TLR7 activation inhibitory activity that was more than twice as high as CB-7 were B2-13, B2-22, B2-24, B2-26, B2-24-1, and B2-. They were 24-2, B2-24-3, B2-24-4 ⁇ HCl, B2-5A-6 and B2-5A-9.
  • B2-24-4 ⁇ HCl had the highest TLR7 activation inhibitory activity compared to other derivatives.
  • Example 3 Analysis of metabolic stability of B2-24 and B2-5A using mouse liver microsomes (cytochrome P450 (CYP)) CB-7, B2-24, and B2-5A are 10 mg / mL DMSO solutions.
  • Each compound was diluted with acetonitrile to prepare 0.1 mg / mL, which was used as a standard product for analysis.
  • the mouse liver microsome fraction was rapidly thawed in a warm bath at 37 ° C. and kept on ice.
  • a CYP coenzyme-containing reaction buffer was prepared on ice and mixed with the microsome fraction. After pre-incubating the reaction solution at 37 ° C. for 5 minutes, the test substance solution was added and mixed well by pipetting.
  • the reaction volume was 200 ⁇ L, and the final concentration of the test substance was 0.1 mg / mL.
  • the reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes or 2 hours, 3 times the amount of acetonitrile was added to the reaction solution, and the reaction was stopped by vortexing. After the reaction was stopped, the sample was centrifuged, the supernatant was separated, and then dried by an evaporator. A 50 ⁇ L 50% aqueous acetonitrile solution was added to the dry sample, and the sample was vortexed for 5 minutes and redissolved. The redissolve was centrifuged and the supernatant was subjected to HPLC analysis.
  • HPLC system used was HITACHI Lachrom ELITE (manufactured by HITACHI), and the column used was COSMOSIL 5C 18 -MS-II, 4.6 mm I.D. ⁇ 150 mm (manufactured by nacalai tesque). The results are shown in Table 4.
  • Example 4 Synthesis of hybrid derivative (B2-24-4-5A) of B2-24-4 / HCl and B2-5A We requested Albany Molecular Research Inc. (USA) to perform B2-24- as shown below. 4. A hybrid derivative of HCl (a derivative having a similar structure to B2-24 and having the highest TLR7 inhibitory activity) and B2-5A (B2-24-4-5A) was prepared. The structure of B2-24-4-5A is expressed by the following equation (X).
  • Example 5 Evaluation of TLR7 activation inhibition in B2-24-4-5A / HCOOH Evaluation of TLR7 activation inhibition in B2-24-4-5A / HCOOH was performed by the method of Example 2. CB-7 and B2-24-4 ⁇ HCl were used as controls. The IC 50s of CB-7 and each derivative are shown in Table 5.
  • Example 6 Confirmation of TLR7 inhibitory effect of B2-24-4-5A / HCOOH in mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) Confirmation of TLR7 inhibitory effect of B2-24-4-5A / HCOOH in mouse BMDM was confirmed.
  • FCS fetal bovine serum
  • penicillin streptomycin
  • L-glutamic acid 2-mercaptoethanol
  • mice BMDM induced differentiation by culture were seeded such that 1.0 ⁇ 10 5 / 100 ⁇ L in each well of 96-well plates. Add 50 ⁇ L of CB-7 or B2-24-4-5A ⁇ HCOOH to each well and incubate for 30 minutes to a final concentration of 1nM, 3nM, 10nM, 30nM, 100nM, 300nM, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M or 30 ⁇ M. did.
  • B2-24-4-5A / HCOOH or CB-7 10 mg / mL physiological saline or DMSO solution was used, respectively.
  • the TLR7 ligand R848 (manufactured by Invivogen) was added at a final concentration of 10 ng / mL and cultured for 24 hours. After culturing, all the culture broth was collected, and the IL-6 concentration in the culture broth was quantified using the ELISA method (kit used: Mouse IL-6 DuoSet ELISA (trade name), manufactured by R & D Systems). The results are shown in FIG.
  • IL-6 production-induced by R848 stimulation was attenuated by pretreatment with B2-24-4-5A / HCOOH.
  • the TLR7 inhibitory activity effect of B2-24-4-5A / HCOOH was about 100 times stronger than that of CB-7.
  • Example 7 Confirmation of TLR7 selectivity of B2-24-4-5A / HCOOH in mouse BMDM TLR7 selectivity of B2-24-4-5A / HCOOH in mouse BMDM was confirmed.
  • FCS fetal bovine serum
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 7 days in the presence of CO 2.
  • TLR ligands Pam2CSK4 (Invivogen), Poly (I: C) (Invivogen), Lipid A (Sigma-Aldrich), R848 (Invivogen) or CpG-B (Invivogen)
  • the cells were cultured for 24 hours. After culturing, all the culture broth was collected, and the IL-6 concentration in the culture broth was quantified using the ELISA method (kit used: Mouse IL-6 DuoSet ELISA (trade name), manufactured by R & D Systems). The results are shown in FIG.
  • B2-24-4-5A ⁇ HCOOH suppressed the production of IL-6 by stimulation with R848, which is a TLR7 ligand, but did not suppress the production of IL-6 by stimulation with other TLR ligands. Therefore, B2-24-4-5A ⁇ HCOOH was shown to be a selective inhibitor of TLR7.
  • Example 8 Confirmation of TLR7 inhibitory effect of B2-24-4-5A / HCOOH using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from systemic lupus erythematosus patient B2-24-4-5A / B2-24-4-5A in PBMC derived from systemic lupus erythematosus patient
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Isolate PBMCs 0.5 ⁇ 10 5 / in 96-well plates containing RPMI1640 medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum (FCS), penicillin, streptomycin, L-glutamic acid, 2-mercaptoethanol.
  • FCS fetal bovine serum
  • the seeds were sown to 100 ⁇ L and cultured at 37 ° C in the presence of 5% (v / v) CO 2.
  • IL-6 production-induced by gardiquimod stimulation was attenuated by pretreatment of all compounds, and the effects were stronger in the order of B2-24-4 / HCl, B2-24-4-5A / HCOOH, and HCQ.
  • Example 9 Analysis of metabolic stability (CYP) of CB-7 and B2-24-4-5A / HCOOH using mouse liver microsomes Metabolic stability analysis of CB-7 and B2-24-4-5A / HCOOH was carried out by the method of Example 5. The results of CB-7 are shown in Table 6, and the results of B2-24-4-5A / HCOOH are shown in Table 7.
  • the number of peaks detected by HPLC in CB-7 was 9 (Table 6 shows 7 out of 9 peaks).
  • the number of peaks detected by HPLC in B2-24-4-5A / HCOOH was 6, which was smaller than that in CB-7.
  • the peak area (Area) of CB-7 after 2 hours was 41.6%, while the peak area (Area) of B2-24-4-5A / HCOOH after 2 hours was 88.4%. .. Therefore, B2-24-4-5A / HCOOH significantly improved drug metabolism mainly by CYP compared with CB-7.
  • Example 10 Plasma concentration of CB-7 or B2-24-4-5A ⁇ HCOOH in mice after oral administration Using normal mice (C57BL / 6N, 11 weeks old, female), CB-7 or B2- 24-4-5A ⁇ The plasma concentration of HCOOH after oral administration was measured. 1 mg of CB-7 or B2-24-4-5A / HCOOH was orally administered to mouse C57BL / 6N. After 0.5 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours or 8 hours, blood was collected from mouse C57BL / 6N to prepare plasma. The concentration of CB-7 or B2-24-4-5A / HCOOH in plasma was measured by LC / MS / MS. The results are shown in FIG.
  • CB-7 could not be detected in plasma after 8 hours, while B2-24-4-5A ⁇ HCOOH was present in plasma after 8 hours at about 500 ng / ml. It was revealed that B2-24-4-5A / HCOOH stays in plasma for a longer period of time than CB-7.
  • Example 11 Plasma concentration of B2-24-4-5A ⁇ HCOOH after oral administration in mice B2-24-4-5A ⁇ HCOOH using systemic lupus erythematosus model mice (NZBWF1, 20 weeks old, female) Plasma concentration after oral administration was measured. 5 mg / kg of B2-24-4-5A ⁇ HCOOH was orally administered to NZBWF1 mice. After 0.5 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 16 hours or 24 hours, blood was collected from NZBWF1 mice to prepare plasma. The plasma concentrations of B2-24-4-5A and HCOOH were measured by LC / MS / MS. The results are shown in FIG.
  • Example 12 Confirmation of TLR7 inhibitory effect by intraperitoneal administration of B2-24-4-5A / HCOOH in mice B2-24-4-5A / B2-24-4-5A / normal mice (C57BL / 6N, 11 weeks old, female) HCOOH (1, 5, 10, 100 and 1000 ⁇ g) or hydroxychloroquine sulfate (HCQ, 1000 ⁇ g) as a comparative drug was intraperitoneally administered, and 30 minutes later, 5 ⁇ g of R848 was intraperitoneally administered. As the solvent, physiological saline was used.
  • IFN- ⁇ production-induced by R848 was attenuated by pretreatment with B2-24-4-5A / HCOOH, and the effect was stronger than that of HCQ.
  • Peritoneal administration of 10 ⁇ g of B2-24-4-5A / HCOOH showed the effect of almost completely suppressing the induction of IFN- ⁇ .
  • the medicinal effect is shown at 0.5 mg / kg. That is, the TLR7 inhibitory effect in vivo was 100 times or more that of HCQ.
  • Example 13 Confirmation of TLR7 inhibitory effect by intraperitoneal administration of B2-24-4 ⁇ HCl, B2-24-4-5A or B2-24-4-5A ⁇ HCOOH in mice Using the same method as in Example 13. , B2-24-4 ⁇ HCl, B2-24-4-5A or B2-24-4-5A ⁇ HCOOH was confirmed to have a TLR7 inhibitory effect by intraperitoneal administration.
  • the dose of B2-24-4 / HCl, B2-24-4-5A and B2-24-4-5A / HCOOH was 10 ⁇ g.
  • the results are shown in FIG.
  • the plot of FIG. 8 shows the data of each individual, each thick line shows the average value of each group data, and each error bar shows the standard error of each group data.
  • IFN- ⁇ production-induced by R848 was attenuated by pretreatment with B2-24-4 ⁇ HCl, B2-24-4-5A or B2-24-4-5A ⁇ HCOOH, the effect of which was B2-24- 4-5A ⁇ HCOOH, B2-24-4-5A, B2-24-4 ⁇ HCl were the strongest in this order.
  • the removed spleen was ground with a slide glass to prepare spleen cells, which were stained with FITC-labeled anti-CD3 antibody and PE-labeled anti-CD69 antibody. After 20 minutes, the cells were washed with FACS buffer and each cell was suspended in 200 ⁇ L FACS buffer containing 25 ⁇ g / mL 7-actinomycin D. The fluorescence intensity of the cells was analyzed by flow cytometry. Flow cytometry was measured with FACSCanto TM II (Becton Dickinson), and the data was analyzed with FlowJo Softfair (Tree Star). CD69-positive cells (activated T cells) among CD3-positive T cells. The ratio of was calculated.
  • Figure 9A is a photograph of the removed spleen.
  • FIG. 9B shows the weight of the spleen.
  • FIG. 9C shows the percentage of activated T cells in spleen T cells.
  • FIG. 9D is a photograph showing the deposition of IgG in the glomerulus.
  • the plots in FIGS. 9B and 9C show the data of each individual, each thick line shows the average value of each group data, and each error bar shows the standard error of each group data.
  • the scale bar in Figure 9D represents 100 ⁇ m.
  • the B2-24-4-5A / HCOOH-administered group suppressed splenomegaly and activated T in spleen T cells as compared with the control saline (saline) -administered group.
  • a decrease in the proportion of cells and suppression of IgG deposition in the glomerulus were observed.
  • Example 15 Synthesis of formate of compound B2-24-4 We commissioned Albany Molecular Research Inc. (USA) to prepare compound B2-24-4 ⁇ HCOOH.
  • the structure of B2-24-4 ⁇ HCOOH is expressed by the following equation (XV).
  • Synthesis Example 27 Synthesis of compound B2-24-4 / HCOOH
  • the method for producing compound B2-24-4 / HCOOH (also referred to as ALB-210796) (also referred to as scheme 28) is as follows.
  • Example 16 Confirmation of therapeutic effect of B2-24-4-5A ⁇ HCOOH in spontaneously-onset systemic lupus erythematosus model mice
  • B2-24-4-5A / HCOOH administration group 10
  • B2-24-4 / HCOOH administration group 5
  • HCQ administration group (n) 15).
  • Saline 100 ⁇ l was orally administered once daily every day.
  • B2-24-4-5A / HCOOH administration group 10 mg / kg of B2-24-4-5A / HCOOH (100 ⁇ l) was orally administered once daily every day.
  • B2-24-4 / HCOOH administration group 10 mg / kg of B2-24-4 / HCOOH (100 ⁇ l) was orally administered once daily every day.
  • HCQ-administered group 10 mg / kg of HCQ (100 ⁇ l) was orally administered once daily every day.
  • mice that died of natural causes during the period from the start of administration to 15 weeks were counted as dead cases, and the survival rate was analyzed by the Kaplan-Meier method.
  • Blood collected from the abdominal aorta of each mouse excluding dead cases was centrifuged to prepare serum.
  • the determination of urea nitrogen level and creatinine level in serum was outsourced to Oriental Yeast Co., Ltd.
  • the urinary albumin concentration was quantified using the ELISA method (kit used: Levis urinary albumin-mouse (S type) (trade name) (manufactured by FUJIFILM Wako Shibayagi Co., Ltd.).
  • the removed kidney was 4% (w).
  • FIG. 10A shows the survival rate curve during the administration period.
  • FIG. 10B shows serum urea nitrogen levels.
  • FIG. 10C shows serum creatinine levels.
  • FIG. 10D shows the amount of urinary albumin.
  • Figure 10E shows mice in the saline (saline) -administered group (# 1), B2-24-4-5A / HCOOH-administered mice (# 10), and B2-24-4 / HCOOH-administered mice (#). 4) and photographs showing IgG deposition in the glomerules of mice (# 14) in the HCQ-administered group.
  • FIG. 10F shows mice in the saline (saline) -administered group (# 1), B2-24-4-5A / HCOOH-administered mice (# 10), and B2-24-4 / HCOOH-administered mice (#). 4) and photographs showing the deposition of C3 in the glomerules of mice (# 14) in the HCQ-administered group.
  • FIG. 10G shows a stained photograph of a renal tissue section of a mouse (# 1) in a saline (saline) -administered group.
  • FIG. 10H shows a stained photograph of a renal tissue section of a mouse (# 1) in the B2-24-4-5A / HCOOH-administered group.
  • FIGS. 10B, 10C and 10D show the data of each individual, each thick line shows the average value of each group data, and each error bar shows the standard error of each group data.
  • the scale bars in FIGS. 10E and 10F represent 100 ⁇ m.
  • the B2-24-4-5A / HCOOH-administered group or the B2-24-4 / HCOOH-administered group was compared with the control saline (saline) -administered group or the HCQ-administered group.
  • Prolonged survival, suppression of increase in serum urea nitrogen level, suppression of increase in serum creatinine level, suppression of increase in urinary albumin level, suppression of IgG deposition in glomerulus, suppression of C3 deposition in glomerulus, lupus nephritis There was a marked decrease in activity.
  • Example 17 Analysis of spleen tissue in NZBWF1 mice treated with B2-24-4-5A ⁇ HCOOH
  • the weight of spleen and the number of spleen cells obtained in Example 16 were analyzed.
  • the weight of the spleen is shown in FIG. 11A, and the number of spleen cells is shown in FIG. 11B.
  • the spleen weight in the B2-24-4-5A / HCOOH-administered group was significantly lower than that in the saline (saline) -administered group and the HCQ-administered group.
  • the number of splenocytes in the B2-24-4-5A / HCOOH-administered group was significantly lower than that in the saline (saline) -administered group and the HCQ-administered group.
  • Example 18 Analysis of spleen in NZBWF1 mice treated with B2-24-4-5A ⁇ HCOOH
  • the spleen obtained in Example 16 was ground with a slide glass to prepare spleen cells, and the spleen was stained with a labeled antibody.
  • the labeled antibodies used were FITC-labeled anti-CD11b antibody, FITC-labeled anti-CD3 antibody, FITC-labeled anti-CD62L antibody, FITC-labeled anti-B220 antibody, FITC-labeled anti-CD71 antibody, PE-labeled anti-CD11c antibody, PE-labeled anti-Gr-1 antibody.
  • B2-24-4-5A In the HCOOH-administered group, plasmacytoid dendritic cells, helper T cells, cytotoxic T cells and naive T cells were compared to the physiological saline (saline) -administered group and the HCQ-administered group. An increase in the proportion and a decrease in the proportion of neutroblasts, erythroblasts, activated T cells, Memory T cells and CD69-positive activated B cells were observed. Therefore, administration of B2-24-4-5A ⁇ HCOOH improved the inflammatory condition associated with the onset of systemic lupus erythematosus.
  • Example 19 Analysis of IFN- ⁇ production by microRNA stimulation
  • FLDC Flt-3 ligand-induced dendritic cells
  • the concentration of IFN- ⁇ contained in the medium was quantified using the ELISA method (kit used: Mouse IFN alpha Platinum ELISA (trade name), manufactured by eBioscience). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 15, B2-24-4-5A ⁇ HCOOH suppressed the production of IFN- ⁇ stimulated by microRNA in a concentration-dependent manner.

Abstract

CB-7は、正常マウスにおけるTLR7阻害効果が弱かった。本発明は、CB-7よりもTLR7阻害効果が高い新規な化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグを提供する。また、本発明は、上記TLR7活性化阻害剤を含有する、TLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療薬も提供する。

Description

トール様受容体７の活性化阻害剤として有用な新規化合物
　本発明は、トール様受容体７(TLR7)の活性化阻害剤及び当該活性化阻害剤を含有するTLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療薬として有用な新規化合物に関する。
　免疫系は、自然免疫系と獲得免疫系に大別される。自然免疫系は、感染初期に作動する生体防御機構であり、マクロファージや樹状細胞などの貪食細胞が中心的な役割を担う。一方、獲得免疫系は、リンパ球が中心的な役割を担っており、無数の抗原に対処するための後天的な生体防御機構である。獲得免疫は、リンパ球の1種であるT細胞が、活性化された樹状細胞から抗原を受け取ることで開始する。すなわち、獲得免疫の誘導には自然免疫の活性化が必須である。
　貪食細胞の細胞膜及び細胞内に発現するTLRは、細菌やウイルスの構成成分を特異的に認識して、NF-κBなどの転写因子を活性化することで炎症性サイトカインの産生を誘導する。例えば、TLR7は、B細胞や形質細胞様樹状細胞のエンドソームやリソソームに局在し、ウイルス由来の一本鎖RNAを認識する。リガンドを認識したTLR7は、I型インターフェロン(IFN-α)の産生を誘導することでウイルス感染を防御する。TLR7はまた、障害を受けた自己の細胞や死細胞から放出される核酸(自己抗原)も認識するため、IFN-αは、自己免疫病等の非感染性の炎症疾患の発症・増悪に関連する因子の一つである。IFN-αにより単球から分化誘導した古典的樹状細胞は、死細胞を取り込み活性化されると、抗原提示を通して自己反応性T細胞の増殖・分化を促進する。IFN-αはまた、樹状細胞におけるBAFF(B cell activating factor)又はAPRIL(a proliferation inducing ligand)を発現誘導することで、自己反応性B細胞のクラススイッチ及び形質細胞への分化を促進する。これにより、生体における自己抗体産生が活発になり、核酸と自己抗体から成る免疫複合体が形質細胞様樹状細胞を刺激することでIFN-αの産生が促進される。このようにIFN-αの産生が慢性化することによって、病態が進行・増悪する。
　自己免疫病は、多くの場合、自己抗原に対する抗体(抗核抗体など)の出現を主徴とし、様々な特徴的な炎症を伴う疾患群である。自己免疫病又は、病態の進行に伴い、皮膚、腎臓をはじめとする多臓器、筋肉、神経、及び血管を含む種々の器官に重篤な障害を引き起こす。TLR7のシグナル異常及びIFN-αの産生によって引き起こされる自己免疫病の代表例として全身性エリトマトーデスが挙げられる。全身性エリテマトーデス患者数は、全世界に140万人、日本国内では10万人程度と推定され(平成 28 年度の特定疾患医療受給者証交付件数は、全身性エリテマトーデスにおいて63,792件)、特に20～30代の女性に好発する。全身性エリトマトーデスは、原因不明の免疫難病であり、厚生労働省により特定疾患に指定されている。TLR7のシグナル異常が全身性エリテマトーデスを引き起こすことを報告した例は、マウス及びヒトにおいて複数ある。全身性エリテマトーデスモデルマウスであるBXSBでは、本来X染色体に局在するTLR7遺伝子を含む領域がY染色体へ転座することが病態形成の原因であることが示唆されている(Kumar, K. R., et al. Science. 312:1665-1669, 2006)。TLR7トランスジェニックマウスでは、全身性エリテマトーデス様の糸球体腎炎を発症し、生後20週で約半数が死亡する(Deane, J. A., et al. Immunity. 27:801-810, 2007)。TLR7又はTLR9の小胞体からエンドソームへの輸送に関わるUnc93B1の34番目のアスパラギン酸残基がアラニン残基に変異したマウスは、TLR7の応答性が亢進することで自己免疫病様の症状を呈し、肝炎により1年以内に半数以上が死亡する(Fukui, R., et al. Immunity. 35:69-81, 2011)。ヒトの全身性エリテマトーデス患者では健常人と比べて、末梢血単核球におけるTLR7の遺伝子発現量が高く、TLR7リガンド刺激により多量の炎症性サイトカインを産生する(Komatsuda, A., et al. Clin Exp Immunol. 152: 482-487, 2008)。また、自己免疫病モデルマウスにおけるTLR7の欠損は、病態を改善させることが知られている。自然発症型の自己免疫病モデルマウスであるMRL/Mplpr/lprマウスは、ヒトの全身性エリテマトーデスの代表的な動物モデルであり、抗核抗体などの自己抗体を産生し、加齢に伴って、血管炎、多発性関節炎及び糸球体腎炎を発症する。MRL/Mplpr/lprマウスにおけるTLR7の欠損は、リンパ球の活性化が抑制され、腎炎の症状を軽減させる(Christensen, S. R., et al. 2006. Immunity. 25(3):417-428)。一方、MRL/Mplpr/lprマウスにおけるTLR9の欠損は、抗DNA抗体価を低下させるが、腎炎の症状は改善されなかった。
　自己免疫病の治療には未だ多くの課題が残されている。自己免疫病の中で最も患者数が多い関節リウマチは、関節滑膜を病変の主座とした炎症性疾患で、多発性関節炎が持続し、軟骨、骨が傷害され関節破壊が進行する自己免疫病である。炎症性サイトカインの自己免疫病に対する関与については、関節リウマチのモデルマウス及び関節リウマチ患者を中心に解析が進められている。IL-1阻害療法としてIL-1受容体アンタゴニスト、TNF-α阻害療法として抗TNF-α抗体、IL-6阻害療法として抗IL-6受容体抗体が関節リウマチの治療薬として承認され診療に用いられており、いずれも従来の標準的薬物療法を上回る効果をあげている。全身性エリテマトーデスにおいても、抗体医薬をはじめとする生物学的製剤の有用性が期待されている。実際に、B細胞活性化因子BLyS(B lymphocyte stimulator)に対する遺伝子組換えヒト型IgG1λモノクローナル抗体(商品名：ベリムマブ)には病態の増悪に関与する自己反応性B細胞の増殖を抑える作用があるため、一部の全身性エリテマトーデス患者に対して治療効果が認められており、日本国内及び海外で販売されている。例えば、EUでは標準治療を受けているにも関わらず疾患活動性が高い自己抗体陽性の成人全身性エリテマトーデス患者に対して、追加・併用する治療薬として承認されている。また、米国でも同様の患者の治療に適応されているが、重度の活動性ループス腎炎や中枢神経ループスを発症した患者における有効性はまだ臨床評価されておらず、限定的な処方となっている。2016年11月に発表された日本を含む北東アジアにおける第III相試験では、ベリムマブの効果に肯定的な試験結果が報告されたが、52週の静脈内投与(10 mg/kg)でのレスポンダー率は54%にとどまっている。また、B細胞表面に特異的に発現するCD20に対するマウス-ヒトキメラ型IgG1κモノクローナル抗体(商品名：リツキシマブ)は、悪性リンパ腫の治療薬として使用されており、全身性エリテマトーデスの治療薬として注目を集めたことがあるが、死亡例を含む重篤な有害事象の発生が報告され臨床試験が頓挫した。現在、IFN-αやその受容体に対する抗体を用いた臨床試験が進められており、安全性・有効性評価において良好な結果が得られているが、低頻度ながら複数の有害事象(貧血、リンパ球減少、肝機能低下など)の発生が報告されている。このように、生物学的製剤の使用は、高い病態の改善効果が期待できるが、定期的・長期的な投与が要求され、患者の身体的・医療経済的な負担に関する問題を引き起こし、それによってこの治療様式の有効性が低下する恐れがある。また、未だ有効な治療法が確立されていない多くの自己免疫病では、第一選択薬剤としてステロイド剤が用いられている。ステロイド剤は、強力な抗炎症作用を持つが、免疫抑制作用も持つため、長期的な服用により副作用が生じる。そこで、ステロイド剤の代替治療薬剤の創出を目指したTLR7又はTLR9に対する阻害剤の開発が進められており、現在までにオリゴヌクレオチドを基にしたTLR7及びTLR9の阻害剤(Rommler, F., et al. J. Immunol., 191:3240-3253, 2013)及び低分子化合物を基にしたTLR7及びTLR9の阻害剤(Lamphier, M., et al. Mol. Pharmacol., 85:429-440, 2014)が報告されているが、実用化には至っていない。一方、2015年に日本国内で承認されたヒドロキシクロロキンは、経口投与可能な低分子医薬品であるが、網膜症等の副作用の懸念から、積極的な処方には至っていない。
　全身性エリテマトーデス以外の様々な疾患にもTLR7の関与が示唆されている。アルツハイマー病は、進行性の認知機能喪失で、患者の大脳皮質及び皮質下灰白質内には、アミロイドβ及びτ蛋白質でできている神経原線維のもつれからなる老年斑が過剰に存在している。この病気の主因は、アミロイドβ蛋白質の神経細胞への沈着によるものと考えられている。若年発症型は、症例の2～7％であるが、通常型は、突然変異による遺伝性のものであり、60歳以上の高齢者に発症し、その罹患率は、加齢とともに増加する。厚生労働省が2013年に発表した日本国内の認知症患者数は、462万人であり、その大半がアルツハイマー病であるとされている。アメリカでは、500万人以上のアルツハイマー病患者がいるとされており、家庭医療、家 庭介護、社会的医療、生産性喪失、早死など、年間費用は1,000億米ドル超である。近年、TLR7が神経変性疾患、脳卒中又は多発性硬化症などによって引き起こされる脳疾患に関与することが示唆されている。脳内に豊富に存在するlet-7(マイクロRNA)誘発性の神経毒性がTLR7に依存していることが報告されている(Lehmann, S. M., et al. Nat Neurosci. 15(6):827-835)。let-7は、アルツハイマー病患者の脳脊髄液において健常者に比べて多く存在しており、ニューロン変性に関与していると考えられている。
　以前、発明者らのスクリーニング研究により、マメ科植物オランダビユの成熟種子から分離され、漢方薬の補骨脂にも含まれるシクロバクチオール及びその類縁化合物に、TLR7又はTLR9リガンド刺激によるNF-κB活性化を選択的に阻害する作用を見いだし、共同研究先であるテイカ製薬株式会社及び東京工業大学とともに国際出願した(国際公開番号WO/2017/047769)。
Kumar KR, et al. Regulation of B cell tolerance by the lupus susceptibility gene Ly108. Science. 312:1665-1669, 2006 Deane JA, et al. Control of toll-like receptor 7 expression is essential to restrict autoimmunity and dendritic cell proliferation. Immunity. 27:801-810, 2007 Fukui R, et al. Unc93B1 restricts systemic lethal inflammation by orchestrating Toll-like receptor 7 and 9 trafficking. Immunity. 35:69-81, 2011 Komatsuda A, et al. Up-regulated expression of Toll-like receptors mRNAs in peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol. 152: 482-487, 2008 Christensen SR, et al. Toll-like receptor 7 and TLR9 dictate autoantibody specificity and have opposing inflammatory and regulatory roles in a murine model of lupus. Immunity. 25(3):417-428, 2006 Rommler F, et al. Guanine modification of inhibitory oligonucleotides potentiates their suppressive function. J. Immunol, 191:3240-3253, 2013 Lehmann SM, et al. An unconventional role for miRNA: let-7 activates Toll-like receptor 7 and causes neurodegeneration. Nat Neurosci. 15(6):827-835, 2012
WO/2017/047769
　特許文献１において、最も高いTLR7阻害効果を示したCB-7は、マウス免疫細胞(マクロファージ、樹状細胞)及びヒト免疫細胞(末梢血単核球、樹状細胞)においてTLR7の活性化を抑制したものの、正常マウスにおけるTLR7阻害効果は弱く、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおける薬効も限定的であった。
　本発明者らは、リード化合物CB-7よりもTLR7阻害活性が高く、動物レベルで有効性を示す化合物を創出するための方法や物質について検討を重ねた。その結果、新規構造を持つ複数の誘導体に、TLR7活性化による炎症性サイトカインIL-6又はIFN-αの産生誘導を最大でCB-7の約45倍強く阻害することを見出し、本発明を完成させた。
　本発明によれば、
　下記式(I)又は(II)で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグが提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 (式(I)及び(II)中、
R1は、
　少なくとも２つの酸素原子を含む、炭素数３～５のアルコキシ基、
　少なくとも１つのヒドロキシル基を含む、炭素数２～４のアルコキシ基、
　式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 　(式中、R2及びR3は、それぞれ独立して、炭素数1～3のアルキル基である。)で表される基、又は
　式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　(式中、
　　Ｃ環は、３～７員の含窒素複素環であり、
　　R4は、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＦ２－、－ＣＨＦ－、－Ｃ２Ｈ２Ｆ２－又は－ＣＨＦ－Ｘ－ＣＨＦ－で表される基であり、
　　Ｘは、炭素数1～4のアルキル基である。)
で表される基である。)
　かかる化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグは、少なくともTLR7の活性化を阻害することができる。
　また、本発明によれば、
　R1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 である、上記化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグも提供される。
　また、本発明によれば、上記化合物は、下記式(III)から(XIII)のいずれかで表される、上記化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグも提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　また、本発明によれば、前記薬理学的に許容される塩は、塩酸塩又はギ酸塩である、上記化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグも提供される。
　また、本発明によれば、上記化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグを含有する、トール様受容体７(TLR7)活性化阻害剤も提供される。
　また、本発明によれば、TLR7の活性化に起因するNF-κB、IL-6、TNF-α又はIFN-αの産生の抑制作用を有する上記TLR7活性化阻害剤も提供される。
　また、本発明によれば、上記TLR7活性化阻害剤を含有する、TLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療薬も提供される。
　また、本発明によれば、上記TLR7の活性化を伴う疾患が、自己免疫疾患、自己炎症症候群、自己免疫性膵炎、動脈硬化症、敗血症、神経変性疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病、歯周病、ウイルス性免疫不全症、IgA腎症、一次性ネフローゼ症候群、一次性膜性増殖性糸球体腎炎、紫斑病性腎炎、ランゲルハンス細胞組織球症、血球貪食性リンパ組織球症、Rosai-Dorfman病、肥満、2型糖尿病又は潰瘍性大腸炎である上記予防又は治療薬も提供される。
　また、本発明によれば、上記TLR7の活性化を伴う疾患が自己免疫疾患である上記予防又は治療薬も提供される。
　また、本発明によれば、上記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、混合性結合組織病、重複症候群、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、成人スティル病、リウマチ熱、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、HLA-B27関連リウマチ疾患、IgG4関連症候群、ANCA関連血管炎、血管炎症候群、多発性硬化症、尋常性乾癬、炎症性腸疾患、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症紫斑病、原発性胆汁性肝硬変、原発性胆汁性胆管炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、慢性萎縮性胃炎、急速進行性糸球体腎炎、抗糸球体基底膜腎炎、アジソン病、I型糖尿病、尋常性白斑、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎である上記予防又は治療薬も提供される。
　また、本発明によれば、上記自己免疫疾患が、前記全身性エリテマトーデスである上記予防又は治療薬も提供される。
　臨床研究の長期に渡る観察から、全身性エリテマトーデス患者ではTLR7のシグナル異常が病因の一つであることが明らかにされている。TLR7の活性化及びそれに伴う炎症性サイトカイン及びIFN-αの産生を阻害する治療戦略が重要であると考えられている。自己免疫病の治療又は予防のための生物学的製剤の使用は、患者への身体的・医療経済的負担の観点から、長期に渡る自己免疫病治療薬としては適さない。したがって、長期に渡り自己免疫病を治療するための有効な手段として、非侵襲的で、安全性、簡便性、経済性などの利点を有する治療手段が必要である。
　本発明は、TLR7活性化阻害剤及びTLR7活性化阻害剤を含有するTLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療薬は、非侵襲的であり、安全性、簡便性、経済性などの利点がある。さらに、NF-κB、IL-6及びIFN-αの活性阻害作用が有効な炎症性疾患の治療剤・予防剤を提供することである。
図１は、リード化合物CB-7における改変したエリア(エリアa及びb)を示している。 図２は、マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)におけるCB-7又はB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7阻害活性(IL-6の発現抑制)を示すグラフである。 図３は、マウスBMDMにおけるB2-24-4-5A・HCOOHがTLR7選択的であることを示すグラフである。 図４は、全身性エリテマトーデス患者由来末梢血単核球(PBMC)におけるB2-24-4-5A・HCOOH、B2-24-4・HCl又はヒドロキシクロロキン硫酸塩(HCQ)のTLR7阻害活性(IL-6の発現抑制)を示すグラフである。 図５は、マウスにおけるCB-7又はB2-24-4-5A・HCOOHの経口投与後の血漿中濃度を示すグラフである。 図６は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるB2-24-4-5A・HCOOHの経口投与後の血漿中濃度を示すグラフである。 図７は、マウスにおけるB2-24-4-5A・HCOOH又はHCQの腹腔内投与によるTLR7阻害活性(IFN-αの発現抑制)を示すグラフである。 図８は、マウスにおけるB2-24-4・HCl、B2-24-4-5A、B2-24-4-5A・HCOOH又はHCQの腹腔内投与によるTLR7阻害活性(IFN-αの発現抑制)を示すグラフである。 図９Aは、全身性エリテマトーデス様の病態を誘導させたマウス（生理食塩水(saline)投与群及びB2-24-4-5A・HCOOH投与群）の脾臓の写真である。 図９Ｂは、全身性エリテマトーデス様の病態を誘導させたマウス（saline投与群及びB2-24-4-5A・HCOOH投与群）の脾臓重量を示している。 図９Ｃは、全身性エリテマトーデス様の病態を誘導させたマウス（saline投与群及びB2-24-4-5A・HCOOH投与群）の脾臓中の活性化T細胞の割合を示している。 図９Ｄは、全身性エリテマトーデス様の病態を誘導させたマウス（saline投与群及びB2-24-4-5A・HCOOH投与群）の糸球体におけるIgGの沈着を示す写真である。 図１０Aは、全身性エリテマトーデスモデルマウス（生理食塩水(saline)投与群、B2-24-4-5A・HCOOH投与群、B2-24-4・HCOOH投与群及びHCQ投与群）における投与期間中の生存率曲線を示している。 図１０Bは、全身性エリテマトーデスモデルマウス（saline投与群、B2-24-4-5A・HCOOH投与群、B2-24-4・HCOOH投与群及びHCQ投与群）の血清尿素窒素値を示している。 図１０Cは、全身性エリテマトーデスモデルマウス（saline投与群、B2-24-4-5A・HCOOH投与群、B2-24-4・HCOOH投与群及びHCQ投与群）の血清クレアチニン値を示している。 図１０Dは、全身性エリテマトーデスモデルマウス（saline投与群、B2-24-4-5A・HCOOH投与群、B2-24-4・HCOOH投与群及びHCQ投与群）の尿アルブミン量を示している。 図１０Eは、全身性エリテマトーデスモデルマウス（生理食塩水(saline)投与群のマウス(#1)、B2-24-4-5A・HCOOH投与群のマウス(#10)、B2-24-4・HCOOH投与群のマウス(#4)及びHCQ投与群のマウス(#14)）における糸球体におけるIgGの沈着を示す写真である。 図１０Fは、全身性エリテマトーデスモデルマウス（生理食塩水(saline)投与群のマウス(#1)、B2-24-4-5A・HCOOH投与群のマウス(#10)、B2-24-4・HCOOH投与群のマウス(#4)及びHCQ投与群のマウス(#14)）糸球体におけるC3の沈着を示す写真である。 図１０Gは、生理食塩水(saline)投与群のマウス(#1)の腎組織切片の染色写真を示している。 図１０Hは、B2-24-4-5A・HCOOH投与群のマウス(#1)の腎組織切片の染色写真を示している。 図１１Aは、全身性エリテマトーデスモデルマウス（saline投与群、B2-24-4-5A・HCOOH投与群及びHCQ投与群）の脾臓の重量を示している。 図１１Bは、全身性エリテマトーデスモデルマウス（saline投与群、B2-24-4-5A・HCOOH投与群及びHCQ投与群）の脾細胞数を示している。 図１２(A)から(E)は、脾臓中における各種細胞の割合を示している。 図１３(A)から(E)は、脾臓中における各種細胞の割合を示している。 図１４(A)から(E)は、脾臓中における各種細胞の割合を示している。 図１５は、図２は、マウスFlt-3リガンド誘導性樹状細胞（FLDC）におけるB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7阻害活性(IL-6の発現抑制)を示すグラフである。
＜概要及び定義＞
　以下、本発明の実施形態について、詳しく説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、適宜説明を省略する。
　便宜上、本願で使用される特定の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。文脈で別途明記されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
　本発明で示す数値範囲及びパラメーターは、近似値であるが、特定の実施例に示されている数値は可能な限り正確に記載している。しかしながら、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含んでいる。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者が考慮する場合、許容可能な標準誤差内にあることを意味する。
　式中の波線は、式(I)又は(II)で表される化合物との共有結合を表す。
＜実施形態＞
　本発明によれば、下記式(I)又は(II)で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグが提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 (式(I)及び(II)中、
R1は、
　少なくとも２つの酸素原子を含む、炭素数３～５のアルコキシ基、
　少なくとも１つのヒドロキシル基を含む、炭素数２～４のアルコキシ基、
　式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 　(式中、R2及びR3は、それぞれ独立して、炭素数1～3のアルキル基である。)で表される基、又は
　式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 　(式中、
　　Ｃ環は、３～７員の含窒素複素環であり、
　　R4は、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＦ２－、－ＣＨＦ－、－Ｃ２Ｈ２Ｆ２－又は－ＣＨＦ－Ｘ－ＣＨＦ－で表される基であり、
　　Ｘは、炭素数1～4のアルキル基である。)
で表される基である。)
　R1は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 であってもよい。
　上記化合物は、下記式(III)から(XIII)のいずれかで表される、上記化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグであってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　本発明の化合物は、塩を形成していてもよく、その塩としては薬理学的に許容される塩であることが好ましい。薬理学的に許容される塩は、化合物の活性を維持し、かつ生体に対して悪影響を与えない限り特に限定されない。例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、ステアリン酸、コハク酸、エチルコハク酸、マロン酸、ラクトビオン酸、グルコン酸、グルコヘプトン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸(トシル酸)、ラウリル硫酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アジピン酸、システイン、N-アセチルシステイン、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、ヨウ化水素酸、ニコチン酸、シュウ酸、ピクリン酸、チオシアン酸、ウンデカン酸、アクリル酸ポリマー、カルボキシビニルポリマー等の酸との塩、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の無機塩基との塩、モルホリン、ピペリジン等の有機アミンとの塩、アミノ酸との塩などを挙げることができる。好ましくは、塩酸との塩(塩酸塩)又はギ酸との塩(ギ酸塩)である。
　プロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により上記式(I)から(XIII)のいずれかで表される化合物に変換される化合物を意味する。例えば、生体内で加水分解を受けてこれらの化合物を遊離するエステル等が挙げられる。
　本発明の化合物又はその塩は溶媒和物であってもよい。溶媒和物は非毒性かつ水溶性であることが好ましい。適当な溶媒和物としては、例えば水との溶媒和物、アルコール性溶媒(メタノール、エタノールなど)との溶媒和物が挙げられる。
　本発明は、上記化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグを含有するTLR7活性化阻害剤も提供する。TLR7活性化は、TLR7の公知の活性である、マクロファージ又は樹状細胞におけるTNF-α、IL-6、IL-12、IFN-α又はIFN-β等のサイトカインの産生、CCL2、CCL5、CXCL8又はCXCL10等のケモカインの産生、B細胞における細胞増殖の亢進、CD80又はCD86等の補助刺激分子の発現増強、クラススイッチの誘導又は抗体産生、T細胞における免疫不応答性の誘導などの生体反応が挙げられる。本発明のTLR7活性化阻害剤は、上記活性化(生体反応)を抑制することができ、好ましくは、TLR7の活性化に起因するNF-κB、IL-6、TNF-α又はIFN-αの産生を抑制する作用を有すことができる。TLR7活性化阻害は、TLR7の活性化(例えば、NF-κB、IL-6、TNF-α又はIFN-αの産生量)を10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%若しくは99.9%低下させる又は上記数値群から任意に選択された２つの数値間の範囲低下させることを意味するものであってもよい。本発明のTLR7活性化阻害剤は、TLR7発現、機能及びそれに関連するシグナル伝達機構の解析のための研究用試薬として使用することもできる。
　本発明のTLR7活性化阻害剤は、TLR7活性化を阻害することができるので、TLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療用の医薬として有用である。すなわち本発明は、上記本発明のTLR7活性化阻害剤を含有するTLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療薬も提供する。
　TLR7の活性化を伴う疾患としては、例えば、自己免疫疾患、自己炎症症候群、自己免疫性膵炎、動脈硬化症、敗血症、神経変性疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病、歯周病、ウイルス性免疫不全症、IgA腎症、一次性ネフローゼ症候群、一次性膜性増殖性糸球体腎炎、紫斑病性腎炎、ランゲルハンス細胞組織球症、血球貪食性リンパ組織球症、Rosai-Dorfman病、肥満、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の予防又は治療薬の対象疾患として、自己免疫疾患が好ましい。自己免疫疾患としては、例えば全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、混合性結合組織病、重複症候群、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、成人スティル病、リウマチ熱、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、HLA-B27関連リウマチ疾患(強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節炎等)、IgG4関連症候群、ANCA関連血管炎(顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症)、血管炎症候群(リウマチ性多発筋痛症、巨細胞性血管炎、結節性多発動脈炎等)、多発性硬化症、尋常性乾癬、炎症性腸疾患、自己免疫性甲状腺疾患(橋本病、バセドー病等)、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症紫斑病、原発性胆汁性肝硬変、原発性胆汁性胆管炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、慢性萎縮性胃炎、急速進行性糸球体腎炎、抗糸球体基底膜腎炎、アジソン病、I型糖尿病、尋常性白斑、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎等が挙げられる。より好ましくは全身性エリテマトーデスである。
　本発明の予防又は治療薬は、上記式(I)から(XIII)のいずれかで表される化合物を有効成分とし、医薬製剤の製造法として公知の方法(例えば、日本薬局方に記載の方法等)に従って、薬学的に許容される担体又は添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には、例えば錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠、バッカル錠等を含む)、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤、マイクロカプセル剤を含む)、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、放出制御製剤(例えば速放性製剤、徐放性製剤、徐放性マイクロカプセル剤等)、エアゾール剤、フィルム剤(例えば口腔内崩壊フィルム、口腔粘膜貼付フィルム等)、注射剤(例えば皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等)、点滴剤、経皮吸収型製剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤(例えば肛門坐剤、膣坐剤等)、ペレット、経鼻剤、経肺剤(吸入剤)、点眼剤等の経口剤又は非経口剤が挙げられる。担体又は添加剤の配合割合については、医薬分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定することができる。配合できる担体又は添加剤は特に制限されないが、例えば水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性又は油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、pH調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤化手順(例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解又は懸濁させる等)に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えばD-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど)などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50等)などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤(例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等)、無痛化剤(例えば塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等)、安定剤(例えばヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等)、保存剤(例えばベンジルアルコール、フェノール等)、酸化防止剤などと配合してもよい。
　本発明の予防又は治療薬は、ヒトやヒト以外の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して、安全に投与することができる。
　本発明の予防又は治療薬は、剤型、投与方法、担体等により異なるが、有効成分を製剤全量に対して通常0.01～100%(w/w)、好ましくは0.1～95%(w/w)の割合で添加することにより、常法に従って製造することができる。
　本発明の予防又は治療薬の投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、体重約60kgのヒトにおいては、1日当たり約0.01～1000mg、好ましくは約0.1～100mg、より好ましくは約0.5～50mgである。非経口投与の場合は、その1回投与量は患者の状態、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤では、通常体重1kg当たり約0.01～100mg、好ましくは約0.01～50mg、より好ましくは約0.01～20mgを静脈に投与する。1日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
　本発明の予防又は治療薬は、他の薬剤と併用して用いることができる。他の薬剤としては、例えば自己免疫疾患治療剤、高脂血症治療剤、非ステロイド性抗炎症剤、ステロイド剤などが挙げられる。なかでも自己免疫疾患治療剤と併用することが好ましい。自己免疫疾患治療剤としては、糖質コルチコイドを含むステロイド剤、非ステロイド性抗炎症剤、抗体医薬などの生物学的製剤、免疫抑制剤、抗マラリア薬などが挙げられる。
　本発明には、以下の各発明が含まれる。
　哺乳動物に対して、上記式(I)から(XIII)のいずれかで表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグの有効量を投与することを特徴とするTLR7活性化阻害方法。
　TLR7の活性化阻害のための、上記式(I)から(XIII)のいずれかで表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグ。
　TLR7の活性化阻害剤を製造するための、上記式(I)から(XIII)のいずれかで表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグの使用。
　哺乳動物に対して、上記式(I)から(XIII)のいずれかで表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグの有効量を投与することを特徴とするTLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療方法。
　TLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療のための、上記式(I)から(XIII)のいずれかで表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグ。
　TLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療薬を製造するための、上記式(I)から(XIII)のいずれかで表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグの使用。
実施例１：エリアa及びbを改変した誘導体の合成
　図１に示すCB-7におけるエリアa及びbを改変した。改変は、Albany Molecular Research Inc.(米国)に依頼した。表１及び２は、改変により得られたCB-7誘導体を示している。なお、B2-24-4・HClは、塩酸塩として得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000070
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
各化合物の合成
　試薬は、商業的市場から購入し、受け取ったまま使用した。1H NMRスペクトルは、内部基準としてテトラメチルシランを使用して、300 MHzのBruker AVANCE 300分光計及び400 MHz のBruker AVANCE 400分光計で取得した。薄層クロマトグラフィー(TLC)は、Whatman No. 4500-101(Diamond No. MK6Fシリカゲル60オングストローム)プレートを使用して実施した。
　["化合物"プラス"数字"](例えば、化合物1)又は["化合物Int-"プラス"数字"](例えば、化合物Int-1)により表される化合物の名称(番号付き化合物)は、各合成例においてのみ有効である。従って、ある合成例における番号付き化合物が別の合成例における番号付き化合物と同一であっても、両化合物が構造的に異なる場合があり、ある合成例における番号付き化合物が別の合成例における番号付き化合物と相違していても、両化合物が構造的に同一の場合もある。言い換えれば、番号付き化合物間の同一性は、構造によって決定される。
合成例1　化合物B2-6及びB2-6Aの合成
　化合物B2-6(ALB-208276とも称する)及びB2-6A (ALB-208787とも称する)の製造方法(scheme 1とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
化合物2の製造
　CH2Cl2(1.0 L)、MeCN(1.0 L)及びH2O(1.0 L)に溶解した(-)-β-ピネン(化合物1)(100 g、0.73 mol)の溶液(0℃)に、NaIO4(670 g、3.13 mmol)及びRuCl3・nH2O(4.95 g、0.02 mol)を加えた。反応混合物を室温で5時間撹拌した。この反応混合物をEtOAc(1.0L)で希釈し、水(500 mL)及びブライン(500 mL)で洗浄した。得られた混合物を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物2[97.0 g (粗製物)]を黒褐色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.58-2.51 (m, 3H), 2.38-2.30 (m, 1H), 2.25-2.21 (m, 1H), 2.08-2.01 (m, 1H), 1.98-1.90 (m, 1H), 1.57 (s, 1H), 1.35 (s, 3H), 0.84 (s, 3H)。
化合物3の製造
　MeOH(1.0 L)に溶解した化合物2(97.0 g、0.70 mol、 (PhSe)2(108.57 g、0.35 mol)、SeO2(93.10 g、0.84 mol)、及びH2SO4(29.8 mL、0.559 mol)の混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物をH2O(1.0 L)でクエンチし、EtOAc(1 L×2)で抽出した。有機層をブライン(500 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中5% EtOAcを用いたシリカゲル(60-120メッシュ)カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(100 g、48％)を黄褐色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.61-7.58 (m, 2H),7.32-7.25 (m, 3H), 3.87 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 2.71-2.68 (m, 1H), 2.61-2.52 (m, 2H), 2.24-2.20 (m, 2H), 1.88 (s, 1H), 1.35 (s, 3H), 0.84 (m, 3H)。
化合物4の製造
　CH2Cl2(400 mL)に溶解した化合物3(32.50 g、0.110 mol)の溶液に、7％H2O2(70.00 mL、0.160 mmol)及びピリジン(12.20 mL、0.22 mol)を0℃で加えて、室温で12時間撹拌した。反応混合物をCH2Cl2(500 mL)で希釈し、水(200 mL)及びブライン(250 mL)で洗浄した。得られた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-5% EtOAcを用いたシリカゲル(60-120メッシュ)カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(13.00 g、81％)を褐色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54-7.50 (m, 1H),5.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 2.86-2.83 (m, 1H), 2.73-2.57 (m, 2H), 2.13 (s, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.04 (m, 3H)。
化合物5の製造
　THF(100 mL)に溶解した化合物4(8.00 g、58.8 mmol)の溶液を、THF(10 mL)に溶解した4-メトキシフェニルマグネシウムブロミド (70.60 mL、THF中で1 M、70.6 mmol)及びCuI(5.60 g、29.4 mmol)の混合物に-78℃で加え、混合物を-78℃で2時間撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl(250 mL)でクエンチし、EtOAc(200 mL×2)で抽出した。有機層をブライン(100 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたシリカゲル(60-120メッシュ)カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物5(9.00 g、63％)を無色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.17 (d, J = 8.4 Hz ,2H),6.85 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.377 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.81-2.61 (m, 3H), 2.57-2.51 (m, 1H), 2.39-2.36 (m, 1H), 1.89 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 1.39 (s, 3H), 0.98 (m, 3H)。
化合物6の製造
　Ac2O(100 mL)に溶解した化合物5(10.70 g、43.0mmol)の溶液に、Zn(OAc)2(8.36 g、45.0mmol)、BF3・OEt2(2.81 mL、22.0 mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物をH2O(100 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(100 mL×2)で抽出した。有機層を混合して飽和NaHCO3(1000 mL)及びブライン(500 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物6(7.00 g、56％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.09 (d, J = 8.4 Hz ,2H),6.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.45-5.44 (m, 1H), 4.67-4.59 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.96-2.89 (m, 1H), 2.70-2.64 (m, 1H), 2.39-2.24 (m, 4H), 2.11 (s, 3H), 1.49 (s, 3H)。
化合物7(ALB-208224又はI-7(中間体)とも称する)の製造
　MeOH(100 mL)に溶解した化合物6(7.00 g、28.0 mmol)の溶液(0℃)に、30分間にわたって少しずつNaH(0.57 g、鉱油中で60％、14.0 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl(10 mL)でクエンチし、減圧下でMeOHを蒸発させた。得られた固体を濾過し、水(250mL)で洗浄し、乾燥させて、化合物7(ALB-208224又はI-7(中間体))(5.90g、99％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H),6.75 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.56 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.89-2.82 (m, 1H), 2.67-2.60 (m, 1H), 2.45 (d, J = 10 Hz, 4H), 2.04-2.00 (m,1H), 1.84-1.76 (m, 1H),1.44 (s, 3H)。
化合物8の製造
　THF(25 mL)に溶解したp-トルエンスルホニルメチルイソシアニド(2.39 g、12.2 mmol)、tert-BuOK(2.75 g、24.6 mmol)の氷冷溶液を10分間攪拌して、THF(5.0 mL)に溶解した化合物7(1.50 g、6.14 mmol)の溶液を加えた。反応混合物を0℃で10分間撹拌してMeOH(20 mL)を加えた。得られた混合物を還流下で1時間撹拌し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物8(0.60 g、38％)を無色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.05 (d, J = 8.4 Hz ,2H),6.82 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.64 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 2.96-2.89 (m, 1H), 2.74-2.68 (m, 1H), 2.53-2.49 (m, 4H), 2.11-2.07 (m,1H), 1.91-1.55 (m,1H),1.51 (s, 3H)。
化合物9の製造
　2-プロパノール(30 mL)に溶解した化合物8(2.40 g、9.41 mmol)の溶液に、KOH(5.20 g、94.1 mmol)を室温で加えた。この反応混合物を還流下で16時間撹拌した。反応混合物を冷水(100 mL)で希釈し、HCl(2 N)の添加により酸性化した。得られた混合物をEtOAc(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(100 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物9(2.20 g、85％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.17 (d, J = 8.8 Hz ,2H), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.64 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.37 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.81-2.54 (m, 4H), 2.39-2.36 (m, 1H), 1.89 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 2.11-2.07 (m,1H), 1.91-1.55 (m,1H),1.51 (s, 3H)。
化合物10の製造
　CH3CN(20 mL)に溶解した化合物9(2.30 g、8.424mmol)の氷冷溶液に、K2CO3(3.25 g、23.58mmol)及びMeI(1.57 mL、25.27mmol)を0℃で滴下した。反応混合物を室温で12時間撹拌した。得られた混合物をEtOAc(100 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(100 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物10(2.20 g、91.6％)を淡黄色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.04 (d, J = 8.8 Hz ,2H),6.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.55 (m, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.65 (s, 3H), 2.54-2.45 (m, 2H), 2.30-2.24 (m, 1H), 2.10-2.06 (m, 2H), 1.89-1.85 (m,1H), 1.62-1.58 (m,3H),1.49 (s, 3H)。
化合物11の製造
　THF(6.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(5.20 mL、THF中で2.0 M、10.4mmol)の溶液に、THF(4.0 mL)に溶解した化合物10(1.00 g、3.40mmol)を-78℃で滴下した。反応混合物を-78℃で30分間撹拌した。2-ブロモ酢酸tert-ブチル(1.00 mL、6.80 mmol)を加えて、反応混合物を-78℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(15 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(50 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(25 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物11(0.50 g、36％)を無色の液体として得た。
化合物12の製造
　2,2,2-トリフルオロエタノール(2.0 mL)に溶解した化合物11(0.5 g、1.24 mmol)の溶液(0℃)に、TMSCl(0.5 mL、3.94 mmol )を滴下した。反応混合物を0℃で2時間撹拌した。残留溶媒を蒸発させ、残渣をEtOAc(15 mL)で希釈し、水(20 mL)で洗浄した。有機層をブライン(15mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して無色の粘性物質を得た。これをヘキサン中0-50% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物12(0.40g、74％)を無色の粘性物質として得た。
化合物13の製造
　CH2Cl2(20 mL)に溶解した化合物12(0.14 g、0.40 mmol)の氷冷溶液に、TEA(0.26 mL、1.20 mmol)、T3P(EtOAc中で50％w / w)(0.39 mL、1.20 mmol)を、次にN、N-ジメチルアミン(THF中で1 M)(0.4 mL、0.80 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、H2O(5.0 mL)で希釈した。得られた混合物をCH2Cl2(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-60% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物13(0.15 g、87％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m/z 374 [M+H]+。
化合物ALB-208276(B2-6)及びALB-208787(B2-6A)の製造
　THF(5.0 mL)に溶解した化合物13(0.13 g、0.30 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.50 mL、THF中で2.0 M、0.90 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、H2O及びHCl(2 N)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-70% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、ALB-208276(B2-6)(0.03 g、25％)及びALB-208787(B2-6A)(0.015 g、13％)をオフホワイトの無色の粘性物質として得た。
ALB-208276(B2-6)
　1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.78 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.48 (d, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.60-3.52 (m, 2H), 2.97 (s, 3H), 2.78 (s, 3H), 2.67-2.60 (m, 1H), 2.24-2.22 (m, 3H), 1.79-1.52 (m, 3H), 1.46-1.35 (m, 6H); ESI MS m/z 346 [M+H]+。
ALB-208787(B2-6A) 
　1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.53 (d, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.77-3.60 (m, 2H), 2.71-2.65 (m, 1H), 2.59-2.41 (m, 2H), 2.32 (s, 6H), 2.27-2.20 (m, 1H), 1.88-1.83 (m, 2H), 1.68-1.51 (m, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.48-1.42 (m, 3H); ESI MS m/z 332 [M+H]+。
合成例2　化合物B2-5Aの合成
　化合物B2-5A(ALB-208786とも称する)の製造方法(scheme 2とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
　THF(5.0 mL)に溶解した化合物Int-12(scheme 1の化合物12)(0.10 g、0.28 mmol)の氷冷溶液にLiBH4(1.40 mL、THF中で1.0 M、2.80 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、60℃で12時間加熱し、飽和NH4Cl溶液(10mL)でクエンチした。得られた反応混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。抽出物を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-70% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製した後、質量トリガー分取HPLC(mass triggered preparative-HPLC)を行い、ALB-208786(B2-5A)(0.005 g、6％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.57 (s, 2H), 4.31-4.27 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 2.53-2.46 (m, 1H), 2.35-2.23 (m, 3H), 1.93-1.88 (m, 2H), 1.81-1.77 (m, 1H), 1.67-1.53 (m, 3H), 1.51 (s, 3H); ESI MS m/z 301 [M+H]+。
合成例3　化合物B2-6-7の合成
　化合物B2-6-7(ALB-209871とも称する)の製造方法(scheme 3とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
化合物1の製造
　CH2Cl2(3.0 mL)に溶解した化合物Int-12(scheme 1の化合物12)(0.05 g、0.14 mmol)の氷冷溶液に、TEA(0.04 mL、0.29 mmol)、T3P(EtOAc中で50％w / w)(0.14 mL、0.43 mmol)、そしてモルホリン(0.02 g、0.21 mmol)の順番で0℃で加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、H2O(5.0 mL)で希釈した。得られた反応混合物をCH2Cl2(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-70% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物1(0.055 g、70％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m/z 416 [M+H]+。
化合物ALB-209871(B2-6-7)の製造
　THF(3.0 mL)に溶解した化合物1(0.03 g、0.70 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.10 mL、THF中で2.0 M、0.21 mmol)を加えた。反応混合物を0℃で5分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0mL)で希釈した。得られた反応混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-70% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-209871(B2-6-7)(0.002 g、8％)をオフホワイトの無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.61 - 4.45 (m, 3H), 3.77-3.53 (m, 13H), 2.74-2.67 (m, 1H), 2.39-2.20 (m, 3H), 1.96-1.90 (m, 2H), 1.69-1.54 (m, 3H), 1.51 (s, 4H); ESI MS m/z 388 [M+H]+。
合成例4　化合物B2-22の合成
　化合物B2-22(ALB-210362とも称する)の製造方法(scheme 4とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
化合物２の製造
　DMF(150 mL)に溶解した化合物1(15.0 g、0.09 mol)の攪拌溶液に、イミダゾール(17.1 g、0.29 mol)を、その次にTBDMSCl(22.2 g、0.14 mol)を0℃で少しずつ加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌し、EtOAc(2 × 100 mL)で希釈し、飽和NaHCO3(500 mL)で洗浄した。有機層を混合して無水Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-50% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(12.00 g、48％)をオフホワイトの固体として得た。
化合物３の製造
　1,4-ジオキサン(70 mL)に溶解した化合物Int-4(scheme 1の化合物4)(3.00 g、22.00mmol)の溶液に、化合物2(8.70 g、33.0mmol)、KOH(2 M、2.45 g、44.00 mmol)を入れ、アルゴンで15分間脱気した。[Rh(COD)Cl]2複合体(0.33 g、0.66 mmol)を反応混合物に加え、攪拌し、還流下で12時間加熱した。残留溶媒を蒸発させた。粗製物をCH2Cl2(250 mL)に溶解し、セライト床を通して濾過した。濾液を水(250 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(4.60 g、59％)をオフホワイトの固体として得た。ESI MS m/z 376 [M+NH4]+
化合物４の製造
　Ac2O(20 mL)に化合物3(4.00 g、11.1 mmol)を加えた溶液に、Zn(OAc)2(2.24 g、12.0 mmol)、BF3・OEt2(1.64 mL、13.3 mmol)を加え、室温で12時間撹拌した。反応混合物をH2O(100 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(100 mL×2)で抽出した。有機層を混合して飽和NaHCO3溶液(250 mL)及びブライン(100 mL)で洗浄した。得られた反応混合物をMgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。それをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(2.50g、78％)をオフホワイトの固体として得た。
化合物5の製造
　MeOH(50 mL)に溶解した化合物4(5.00 g、17.4 mmol)の溶液にNaH(0.70 g、鉱油中で60％、17.4 mmol)を0℃で30分間少しずつ加えて、反応混合物を室温で30分間撹拌した。反応混合物を水(10 mL)で0℃でクエンチした。MeOHを蒸発させ、得られた固体を濾過し、水で、その次にヘキサン(250 mL)で洗浄して、化合物5(3.60 g、85％)をオフホワイトの固体として得た。ESI MS m / z 262 [M + NH4]+。
化合物6の製造
　THF(20 mL)に溶解したp-トルエンスルホニルメチルイソシアニド(3.90 g、20.4mmol)及びtert-BuOK(4.59 g、40.9 mmol)の氷冷溶液に、THF(5.0mL)に溶解した化合物5(2.50 g、10.2 mmol)を加えて、0℃で10分間撹拌してMeOH(15 mL)を加えた。得られた混合物を還流下で1時間撹拌し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-50% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物6(1.70 g、65％)を淡黄色の液体として得た。ESI MS m / z 273 [M + NH4]+。
化合物7の製造
　2-プロパノール(40 mL)に溶解した化合物6(2.60 g、10.01mmol)の溶液にKOH(5.70 g、101.00mmol)を室温で加えた。反応混合物を還流下で48時間撹拌した。残留溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物をEtOAc(50 mL)に溶解し、水(50 mL)で洗浄した。HCl(2 N)を加えて水層を中和し、EtOAc(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(50 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物7(1.30 g、48％)を淡黄色固体として得た。ESI MS m / z 273 [M-H]+。
化合物8の製造
　CH3CN：MeOH(15：5 mL)に溶解した化合物7(1.30 g、4.50mmol)の溶液にK2CO3(1.88 g、13.50 mmol)及び MeI(0.83 mL、13.50 mmol)を0℃で滴下した。反応混合物を室温で12時間撹拌し、EtOAc(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(50 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物8[1.10 g(粗製物)]を褐色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 271 [M + NH4]+。
化合物9の製造
　CH2Cl2(10 mL)に溶解した化合物8(0.70 g、2.40 mol)の攪拌溶液に、イミダゾール(0.35 g、6.00 mmol)を、その次にTBDMS-Cl(0.44 g、2.90mmol)を0℃で少しずつ加えた。反応混合物を室温に温め、16時間撹拌した。反応溶液をCH2Cl2(2×500 mL)で希釈し、飽和NaHCO3(500 mL)で洗浄した。有機層を混合して無水Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物9(0.63 g、64％)を無色のオイルとして得た。
化合物10の製造
　THF(15 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(6.30 mL、THF中で2.0 M、12.60mmol)の溶液に、THF(5.0 mL)に溶解した化合物9(1.70 g、4.20mmol)を-78°Cで滴下した。反応混合物を-78℃で30分間撹拌し、-105℃(MeOH、液体N2を使用)に冷却し、フェニルビニルスルホキシド(1.12mL、8.40mmol)を加えた。反応混合物を-105℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(15mL)をフラスコに加えた。得られた混合物をEtOAc(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物10(0.80 g、34％)を淡黄色のオイルとして得た。ESI MS m / z 555 [M + H]+。
化合物11の製造
　キシレン(10 mL)に溶解した化合物10(0.80 g、1.44mmol)とNaHCO3(1.20 g、14.40mmol)の混合物を還流下で18時間攪拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(30 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(25 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物11(0.40 g、60％)を無色の粘性物質として得た。
化合物12の製造
　THF(5.0 mL)に溶解した化合物11(0.40 g、0.93 mmol)の氷冷溶液に、TBAF(1.86 mL、THF中で1 M、1.80 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で6時間撹拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物12(0.15 g、51％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 332 [M + NH4]+。
化合物13の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物12(0.135 g、0.40 mmol)の氷冷溶液にデスマーチンペルヨージナン(0.40 g、0.90 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を飽和Na2S2O3(5.0 mL)、飽和NaHCO3溶液(5.0 mL)でクエンチし、CH2Cl2(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物13(0.11 g、82％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 313 [M + H]+。
化合物14の製造
　MeOH(5.0 mL)及び少量のAcOHに溶解した化合物13(0.025 g、0.06 mmol)の溶液に、ジエチルアミン(0.009 g、0.12 mmol)を、その次にNaCNBH3(0.016 g、0.25 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で48時間撹拌した。MeOHを減圧下で蒸発させ、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物14 [0.025 g(粗製物)]を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 370 [M + H]+。
化合物ALB-210362(B2-22)の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物14(0.025 g、0.06 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.08 mL、THF中で2.0 M、0.16 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、HCl溶液(2N、3 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取-HPLCにより精製して、化合物ALB-210362(B2-22)(0.0055 g、26％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.78-5.71 (m, 1H), 5.16-5.05 (m, 2H), 4.52 (d, 2H), 3.70-3.64 (m, 4H), 2.75-2.69 (m, 1H), 2.64-2.50 (m, 4H), 2.30-2.24 (m, 1H), 1.90-1.86 (m, 2H), 1.70-1.64 (m, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.47-1.41 (m, 2H), 1.108 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ESI MS m/z 342 [M+H]+。
合成例5　化合物B2-24-1の合成
　化合物B2-24-1(ALB-210798とも称する)の製造方法(scheme 5とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
化合物1の製造
　MeOH(4.0 mL)及び少量のAcOHに溶解した化合物Int-13(scheme 4の化合物13)(0.025 g、0.08 mmol)の溶液に、4,4-difluropiperdine hydrochloride(0.025 g、0.12 mmol)を、その次にNaCNBH3(0.016 g、0.25 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。MeOHを蒸発させ、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物1[0.025 g(粗製物)]を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 418 [M + H]+。
化合物ALB-210798(B2-24-1)の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物1(0.025 g、0.05 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.07 mL、THF中で2.0 M、0.14 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取-HPLCにより精製して、化合物ALB-210798(B2-24-1)(0.007 g、26％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.77-5.70 (m, 1H), 5.16-5.04 (m, 2H), 4.53 (d, 2H), 3.70 (m, 2H), 3.50 (s, 2H), 2.76-2.70 (m, 1H), 2.57-2.49 (m, 4H), 2.35-2.25 (m, 1H), 2.02-1.87 (m, 6H), 1.70-1.64 (m, 2H), 1.51 (s, 3H), 1.47-1.44 (m, 2H); ESI MS m/z 390 [M+H]+。
合成例6　化合物B2-24-2の合成
　化合物B2-24-2(ALB-210361とも称する)の製造方法(scheme 6とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
化合物1の製造
　MeOH(4.0 mL)及び少量のAcOHに溶解した化合物Int-13(scheme 4の化合物13)(0.025 g、0.08 mmol)の溶液に、モルホリン(0.014 g、0.12 mmol)を、その次にNaCNBH3(0.016 g、0.25 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。MeOHを蒸発させ、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物1[0.025 g(粗製物)]を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 384 [M + H]+。
化合物ALB-210361(B2-24-2)の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物1(0.025 g、0.05 mmol)の氷冷溶液にLiAlH4(0.10 mL、THF中で2.0 M、0.19 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取HPLCにより精製して、化合物ALB-210361(B2-24-2)(0.007 g、26％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.19 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.78-5.70 (m, 1H), 5.16-5.04 (m, 2H), 4.53 (d, 2H), 3.70 (m, 6H), 3.47 (s, 2H), 2.76-2.70 (m, 1H), 2.44-2.25 (m, 5H), 1.91-1.85 (m, 2H), 1.70-1.64 (m, 3H), 1.50 (s, 3H), 1.47-1.41 (m, 2H); ESI MS m/z 356 [M+H]+.
合成例7　化合物B2-24-3の合成
　化合物B2-24-3(ALB-210795とも称する)の製造方法(scheme 7とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
化合物1の製造
　MeOH(4.0 mL)及び少量のAcOHに溶解した化合物Int-13(scheme 4の化合物13)(0.025 g、0.08 mmol)の溶液に、3,3-difluoroazitidine hydrochloride(0.02 g、0.12 mmol)、その次にNaCNBH3(0.016 g、0.25 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。MeOHを蒸発させ、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物1[0.025 g(粗製物)]を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 390 [M + H]+。
化合物ALB-210795(B2-24-3)の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物1(0.025 g、0.05 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.08 mL、THF中で2.0 M、0.15 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取-HPLCにより精製して、化合物ALB-210795(B2-24-3)(0.005 g、26％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.16 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.77-5.70 (m, 1H), 5.15-5.04 (m, 2H), 4.53 (d, 2H), 3.69 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 3.57 (t, J = 12.0 Hz, 4H), 2.76-2.69 (m, 1H), 2.30-2.24 (m, 1H), 1.91-1.87 (m, 2H), 1.70-1.64 (m, 3H), 1.50 (s, 3H), 1.47-1.41 (m, 2H); ESI MS m/z 362 [M+H]+。
合成例8　化合物B2-24-4・HClの合成
　化合物B2-24-4・HCl (ALB-210796とも称する)の製造方法(scheme 8とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
化合物1の製造
　MeOH(5.0 mL)及び少量のAcOHに溶解した化合物Int-13(scheme 4の化合物13)(0.035 g、0.11 mmol)の溶液に、tert-butyl piperzine-1-carboxylate(0.041 g、0.22 mmol)を、その次にNaCNBH3(0.022 g、0.30 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。MeOHを蒸発させ、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物1[0.050 g(粗製物)]を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 483 [M + H]+。
化合物2の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物1(0.050 g、0.10 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.15 mL、THF中で2.0 M、0.31 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取-HPLCにより精製して、化合物2(0.005 g、26％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 455 [M + H]+。
化合物ALB-210796(B2-24-4・HCl)の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物2(0.050 g、0.10 mmol)の氷冷溶液に、ジオキサン・HCl(4 N、0.5 mL)を0℃で追加した。反応混合物を室温で3時間撹拌した。残留溶媒を減圧下で蒸発させた。ヘキサンに溶解した30％ CH2Cl2で粗製物を洗浄し、質量トリガー分取HPLCにより精製し、化合物ALB-210796(B2-24-4・HCl)(0.012 g、27％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.15-7.10 (m, 4H), 5.88-5.81 (m, 1H), 4.94-4.89 (m, 2H), 4.54-4.44 (d, 2H), 3.54 (s, 2H), 3.39 (s, 2H), 2.84 (t, J=4.4 Hz, 4H), 2.78-2.67 (m, 1H), 2.37-2.27 (m, 5H), 1.77-1.51 (m, 4H), 1.49 (s, 3H), 1.41-1.25 (m, 2H); ESI MS m/z 355 [M+H]+。
合成例9　化合物B2-13の合成
　化合物B2-13(ALB-209346とも称する)の製造方法(scheme 9とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
化合物2の製造
　DMF(1.0 mL)に溶解した化合物Int-12(scheme 4の化合物12)(0.025 g、0.07 mmol)及びNaH(0.012 g、鉱油中で60％、0.32 mmol)の懸濁液(0℃)に、化合物1(0.022g、0.15mmol)を0℃で加えて反応混合物とした。反応混合物を室温に温め、6時間撹拌し、HCl溶液(1 N、5.0 mL)の添加によりクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してMgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残渣を得た。これをヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.015g、51％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 390 [M + NH4]+。
化合物ALB-209346(B2-13)の製造
　THF(5.0 mL)に溶解した化合物2(0.015 g、0.04 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(THF中で2.0 M、0.06 mL、0.12 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、飽和NH4Cl(10 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-50% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-209346(B2-13)(0.0085 g、43％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.77-5.70 (m, 1H), 5.15-5.04 (m, 2H), 4.54 (d, 2H), 4.51 (s, 2H), 3.69 (s, 2H), 3.69-3.57 (m, 4H), 3.38 (s, 3H), 2.77-2.70 (m, 1H), 2.33-2.26 (m, 1H), 1.91-1.84 (m, 2H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.48-1.41 (m, 2H); ESI MS m/z 362 [M+NH4]+。
合成例10　化合物B2-26の合成
　化合物B2-26(ALB-209873とも称する)の製造方法(scheme 10とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
化合物2の製造
　CH2Cl2(10 mL)に溶解した化合物1(0.50 g、3.60 mmol)の攪拌溶液に、イミダゾール(0.53 g、9.00 mmol)を、その次にTBDMSCl(0.65 g、4.30 mmol)を0℃で少しずつ加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌し、CH2Cl2(50 mL)で希釈し、飽和NaHCO3(50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.5 g、54％)を無色のオイルとして得た。
化合物3の製造
　DMF(3.0 mL)に溶解した化合物Int-12(scheme 4の化合物12)(0.04 g、0.13 mmol)の溶液に、NaH(0.02 g、鉱油中で60％、0.51 mmol)を0℃で入れ、15分間撹拌した。化合物2(0.064 g、0.25 mmol)を反応混合物に0℃で添加した。反応を室温で6時間実施し、HCl(2 N、5.0 mL)の添加によりクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残渣を得た。それをヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(0.025 g、40％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 487 [M + H]+。
化合物4の製造
　THF(3.0 mL)に溶解した化合物3(0.025 g、0.05 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(THF中で2.0 M、0.08 mL、0.15 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、飽和NH4Cl(10 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-40% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(0.02 g、85％)を無色のオイルとして得た。
化合物ALB-209873(B2-26)の製造
　THF(2.0 mL)に溶解した化合物4(0.02 g、0.04 mmol)の氷冷溶液に、TBAF(0.08 mL、THF中で1 M、0.08 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で8時間撹拌し、H2O(5.0 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。抽出物を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-50% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-209873(B2-26)(0.009 g、60％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.77-5.70 (m, 1H), 5.15-5.04 (m, 2H), 4.54 (d, 2H), 4.47 (s, 2H), 3.78 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.70 (s, 2H), 3.65 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.75-2.71 (m, 1H), 2.33-2.26 (m, 1H), 1.91-1.83 (m, 4H), 1.70-1.60 (m, 2H), 1.52 (s, 3H), 1.48-1.41 (m, 2H); ESI MS m/z 362 [M+NH 4 ]+。
合成例11　化合物B2-24の合成
　化合物B2-24(ALB-209348とも称する)の製造方法(scheme 11とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
化合物1の製造
　CH2Cl2(10 mL)に溶解した化合物Int-8(scheme 4の化合物8)(0.28 g、0.97 mmol)の氷冷溶液に、デスマーチンペルヨージナン(0.82 g、1.90 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温に温め、同じ温度で2時間撹拌した。反応混合物を飽和Na2S2O3溶液(5.0 mL)、飽和NaHCO3溶液(5.0 mL)でクエンチし、CH2Cl2(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物1(0.2 g、72％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 287 [M + H]+。
化合物2の製造
　MeOH(5.0 mL)及び少量のAcOHに溶解した化合物1(0.2 g、0.69 mmol)の溶液に、ピロリジン(0.10 mL、1.30 mmol)を、その次にNaCNBH3(0.13 g、2.08 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。MeOHを蒸発させ、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-90% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.15 g、63％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 342 [M + H]+。
化合物3の製造
　THF(5.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(0.65 mL、THF中で2.0 M、1.30 mmol)の溶液に、THF(4.0 mL)に溶解した化合物2(0.15 g、0.43 mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間攪拌し、その後-105℃(MeOH、液体N2)に冷却し、フェニルビニルスルホキシド(0.12 mL、0.87 mmol)を加えた。反応混合物を-105℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(15mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(20 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物3[0.2 g(粗製物)]を褐色のオイルとして得た。ESI MS m / z 494 [M + H]+。
化合物4の製造
　キシレン(5.0 mL)中に溶解した化合物3[0.20 g(粗製物)、0.40 mmol]及びNaHCO3(0.34 g、4.00 mmol)の溶液を還流下で16時間攪拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(30 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物4[0.10 g(粗製物)]を褐色の液体として得た。ESI MS m / z 368 [M + H]+。
化合物ALB-209348(B2-24)の製造
　THF(2.0 mL)に溶解した化合物4(0.06 g、0.12 mmol)の氷冷溶液にLiAlH4(0.18 mL、THF中で2.0 M、0.36 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取-HPLCにより精製して、化合物ALB-209348(B2-24)(0.007 g、8％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.78-5.71 (m, 1H), 5.17-5.05 (m, 2H), 4.52 (d, 2H), 4.03-3.99 (m, 2H), 3.80-3.63 (m, 3H), 3.09-3.05 (m, 3H), 2.79-2.74 (m, 1H), 2.31-2.25 (m, 1H), 2.08-2.04 (m, 4H), 1.91-1.87 (m, 3H), 1.70-1.64 (m, 2H), 1.51 (s, 3H), 1.48-1.41 (m, 2H); ESI MS m/z 340 [M+H]+。
合成例12　化合物B2-5A-9の合成
　化合物B2-5A-9(ALB-210799とも称する)の製造方法(scheme 12とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
化合物1の製造
　THF(6.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(3.73mL、THF中で2.0M、7.40mmol)の溶液に、THF(4.0mL)に溶解した化合物Int-9(scheme 4の化合物9)[1.0 g(粗製物)、2.48mmol]を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間撹拌し、反応混合物に2-ブロモ酢酸tert-ブチル(1.00mL、4.90mmol)を加えた。反応混合物を-78℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(15mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(25 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮し、化合物1[0.90 g(粗製物)]を褐色の液体として得た。
化合物2の製造
　THF(15 mL)に溶解した化合物10(0.90 g、1.70 mmol)の氷冷溶液に、TBAF(5.20 mL、THF中で1 M、5.20 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で12時間撹拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(25 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.40 g、40％)を無色の粘性物質として得た。
化合物3の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物2(0.15 g、0.40 mmol)の氷冷溶液に、デスマーチンペルヨージナン(0.32 g、0.80 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を飽和Na2S2O3(10 mL)、飽和NaHCO3(10 mL)溶液でクエンチし、CH2Cl2(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物3[0.15 g(粗製物)]を無色のオイルとして得た。
化合物4の製造
　MeOH(5.0 mL)及び少量のAcOHに溶解した化合物3(0.15 g、3.70mmol)の溶液に、ピロリジン(0.06 g、7.50mmol)を、その次にNaCNBH3(0.07 g、1.13 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で18時間撹拌した。MeOHを蒸発させ、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して無色のオイルを得た。これをヘキサン中0-90% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(0.15 g、88％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 456 [M + H]+。
化合物5の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物4(0.13 g、0.28 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(THF中で2.0 M、0.90 mL、0.85 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で3分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(15 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物5[0.08 g(粗製物)]を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 428 [M + H]+。
化合物ALB-210799(B2-5A-9)の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物5(0.08 g、0.18 mmol)の溶液に、p-トルエンスルホン酸(0.040 g、0.37 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3溶液(10 mL)でクエンチし、CH2Cl2(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取-HPLCにより精製して、化合物ALB-210799(B2-5A-9)(0.00775 g、8％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.22 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.28 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.58 (s, 2H), 2.56-2.50 (m, 5H), 2.35-2.25 (m, 3H), 1.93-1.89 (m, 2H), 1.82-1.78 (m, 5H), 1.70-1.53 (m, 3H), 1.48 (s, 3H); ESI MS m/z 354 [M+H]+。 
合成例13　化合物B2-5A-6の合成
　化合物B2-5A-6(ALB-211297とも称する)の製造方法(scheme 13とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
化合物1の製造
　MeOH(5.0 mL)及び少量のAcOHに溶解した化合物Int-3(scheme 12の化合物3)(0.10 g、0.25 mmol)の溶液に、ジエチルアミン(0.05 g、0.50 mmol)を、その次にNaCNBH3(0.05 g、0.75 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で48時間撹拌した。MeOHを蒸発させ、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して無色のオイルを得た。これをヘキサン中0-90% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物1(0.06 g、52％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m / z 458 [M + H]+。
化合物2の製造
　THF (4.0 mL)に溶解した化合物1(0.06 g、0.13 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(THF中で2.0 M、0.39 mL、0.39 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で3分間撹拌し、飽和NH4Cl(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAcで抽出した (10 mL×2)。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して化合物2[0.05 g(粗製物)]を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 430 [M + H]+。
化合物ALB-211297(B2-5A-6)の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物2(0.05 g、0.11 mmol)の溶液に、p-トルエンスルホン酸(0.03 g、0.23 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3溶液(5.0 mL)でクエンチし、CH2Cl2(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取HPLCで精製して、化合物ALB-211297(B2-5A-6)(0.0075 g、8％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.22-7.20 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.05-7.03 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.28 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.51 (s, 2H), 2.53-2.48 (m, 5H), 2.35-2.25 (m, 3H), 1.93-1.90 (m, 2H), 1.81-1.77 (m, 1H), 1.70-1.53 (m, 3H), 1.49 (s, 3H), 1.03 (t, 6H)。ESI MS m/z 356 [M+H]+。
合成例14　化合物B2-5A-4の合成
　化合物B2-5A-4(ALB-211299とも称する)の製造方法(scheme 14とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
化合物2の製造
　DMF(3.0 mL)に溶解した化合物Int-2(scheme 12の化合物2)(0.08 g、0.19 mmol)及びNaH(0.016 g、鉱油中で60％、0.39 mmol)の懸濁液に、化合物1(0.037g、0.39mmol)を0℃で加えて反応混合物とした。反応を室温で6時間実施し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)の添加によりクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してMgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残渣を得た。これをヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.04g、50％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 478 [M + NH4]+。
化合物3の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物2(0.04 g、0.08 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(THF中で2.0 M、0.26 mL、0.26 mmol)を0℃で混合した。反応混合物を0℃で3分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物3(0.018 g、49％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 450 [M + NH4]+。
化合物ALB-211299(B2-5A-4)の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物3(0.018 g、0.04 mmol)の溶液に、p-トルエンスルホン酸(0.007 g、0.08 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3溶液(5.0 mL)でクエンチし、CH2Cl2(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を質量トリガー分取HPLCにより精製して、化合物ALB-211299(B2-5A-4)(0.012 g、72％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.58 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.54 (s, 2H), 4.31 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.64-3.62 (m, 2H), 3.60-3.58 (m, 2H), 3.41(s, 3H), 2.60-2.53 (m, 1H), 2.37-2.29 (m, 3H), 1.96-1.89 (m, 2H), 1.84-1.80 (m, 1H), 1.70-1.60 (m, 3H), 1.50 (s, 3H); ESI MS m/z 376 [M+NH4]+。
合成例15　化合物B2-29の合成
　化合物B2-29(ALB-210364とも称する)の製造方法(scheme 15とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
化合物2の製造
　CH2Cl2(10 mL)に溶解した化合物1 (0.50 g、3.27mmol)の溶液に、イミダゾール(0.55 g、8.16mmol)を加え、その次にTBDMSCl(0.59 g、3.92mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌し、CH2Cl2(25 mL)で希釈し、飽和NaHCO3(20 mL)で洗浄した。反応混合物をNa2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-40% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.50 g、57％)を無色の液体として得た。
化合物3の製造
　THF(5.0 mL)に溶解した化合物Int-10(scheme 1の化合物10)(0.20 g、0.69 mmol)の氷冷溶液に、LDA(1.04 mL、THF中で2.0 M、2.08 mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間攪拌した。臭化アリル(0.18 g、1.39 mmol)を反応混合物に加えた。混合物を-78℃で30分間撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl溶液(10 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(20 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(0.18 g、79％)を淡黄色の液体として得た。
化合物4の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物3(0.18 g、0.55 mmol)の攪拌溶液に、BBr3(CH2Cl2中で1 M)(1.60 mL 、1.64mmol)を-78℃で加えた。反応混合物を、-78℃から室温まで4時間かけて徐々に温めた。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。これをヘキサン中0-60% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(0.035g、20％)を無色のオイルとして得た。
化合物5の製造
　DMF(3.0 mL)に溶解した化合物4(0.035 g、0.11 mmol)の攪拌溶液に、NaH(0.01 g、鉱油中で60%、0.28 mmol)を0℃で加えて、5分間攪拌した。化合物2(0.04 g、0.14 mmol)を5分後に反応混合物に加えた。混合物を室温で5時間撹拌し、冷H2O(20 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(30 mL×2)で抽出した。抽出物を混合してブライン(20 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-40% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物5(0.02 g、46％)を無色の液体として得た。
化合物ALB-210364(B2-29)の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物5(0.02 g、0.05mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.07 mL、THF中で2.0 M、0.16 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、H2O及びNa2SO4・10H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。抽出物を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-60% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-210364(B2-29)(0.0039 g、21％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.03 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.93-5.83 (m, 1H), 5.09-5.04 (m, 2H), 4.53 (d, J=5.6 Hz, 2H), 3.95-3.85 (m, 2H), 3.68 (t, J=4.4 Hz, 4H), 2.66-2.59 (m, 1H), 2.23-2.14 (m, 2H), 2.07-1.99 (m, 2H), 1.76 (d, J = 13.6 Hz,2H), 1.62-1.58 (m, 5H),1.49 (s, 3H), 1.38-1.28 (m, 2H), 1.01 (d, J = 7.6 Hz, 3H). ESI MS m/z 359 [M+H]+。
合成例16　化合物B2-28の合成
　化合物B2-28(ALB-210359とも称する)の製造方法(scheme 16とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
化合物2の製造
　THF(5.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(1.04 mL、THF中で2.0 M、2.08mmol)の溶液に、化合物Int-10(scheme 1の化合物10)(0.20 g、0.69mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間攪拌した。化合物1 (0.09 mL、1.04 mmol)を反応混合物に-78℃で加えた。反応混合物を-78℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(10 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(20 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.18 g、79％)を淡黄色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.71-5.63 (m, 1H), 5.02-4.96 (m, 2H), 4.53 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 2.62-2.57  (m, 1H), 2.32-2.19 (m, 4H), 1.73-1.69 (m, 1H), 1.53-1.50 (m, 1H), 1.46 (s, 3H), 1.33-1.25 (m, 2H).
化合物3の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物2(0.09 g、0.27 mmol)の溶液に、CH2Cl2に溶解したBBr3(0.82 mL、0.82 mmol)を-78℃で加えた。反応混合物を室温まで加温して、3時間撹拌し、HCl(1 N、2.0 mL)の添加によりクエンチした。得られた混合物をEtOAc(30 mL×3)で抽出し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残渣を得た。それをヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(0.03 g、35％)を無色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.72 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.71-5.65 (m, 1H), 5.02-4.97 (m, 2H), 4.52 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 2.62-2.55 (m, 1H), 2.32-2.19 (m, 5H), 1.72-1.68 (m, 1H), 1.45 (s, 4H), 1.33-1.23 (m, 4H)。
化合物4の製造
　DMF(1.0 mL)に溶解した化合物3(0.02 g、0.06 mmol)の氷冷溶液に、NaH(0.005 g、0.13 mmol)を0℃で加えた。30分後、(3-ブロモプロポキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン(0.032 g、0.13 mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を0℃で4時間撹拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(0.03 g、97％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 387 C29H46O4Si + H]+。
化合物5の製造
　THF(1.0 mL)に溶解した化合物4(0.03 g、0.06 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.18 mL、THF中で1.0 M、0.18 mmol)を0℃で加えた。混合物を0℃で15分間撹拌し、H2O及びNa2SO4・10H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物5(0.015 g、68％)を無色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.71 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.85-5.79 (m, 1H), 5.02-4.97 (m, 2H), 4.46 (m, 2H), 4.06-3.94 (m, 2H), 3.72-3.49 (m, 6H), 2.58-2.49 (m, 1H), 2.18-2.11 (m, 1H), 1.89-1.68 (m, 6H), 1.48 (s, 4H), 0.81 (m, 9H), 0.00 (m, 6H)。
化合物ALB-210359(B2-28)の製造
　THF(1.0 mL)に溶解した化合物5(0.015 g、0.041 mmol)の氷冷溶液に、TBAF(0.12 mL、THF中で1.0 M、0.12 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で2時間撹拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-60% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-210359(B2-28)(0.0065 g、45％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.93-5.83 (m, 1H), 5.09-5.04 (m, 2H), 4.53 (m, 2H), 4.08 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.70 (m, 2H), 2.66-2.59 (m, 1H), 2.33-2.19 (m, 1H), 2.04-2.00 (m, 4H), 1.78-1.58 (m, 6H), 1.49 (s, 4H).ESI MS m/z 345 C22H32O3 +H]+。
合成例17　化合物B2-27及びB2-21の合成
　化合物B2-27(ALB-209872とも称する)及びB2-21(ALB-208788とも称する)の製造方法(scheme 17とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
化合物1の製造
　THF(20 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(20.8 mL、THF中で1.0 M、20.8mmol)の溶液に、化合物Int-10(scheme 1の化合物10)(2.00 g、6.94mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間攪拌し、その後-105℃に冷却(MeOH、液体N2)した。フェニルビニルスルホキシド(2.10 g、13.88 mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を-105℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(25 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(50 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物1(1.70 g、56.6％)を無色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.56-7.48 (m, ,5H), 7.03-6.99 (m, ,2H), 6.80-6.77 (m, ,2H), 4.52 (s, 2H), 3.76-3.70 (m,6H), 2.73-2.52 (m, 3H), 2.33-2.17 (m, 3H), 1.87-1.59 (m, 5H), 1.89-1.85 (m,1H), 1.49 (s, 3H); ESI MS m/z 441 C26H32O4S+H]+。
化合物2の製造
　キシレン(20 mL)に溶解した化合物11(1.00 g、2.27 mmol)とNaHCO3(2.40 g、22.72 mmol)の混合物を還流下で16時間攪拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(30 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(25 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.30 g、42％)を淡黄色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.07 (d, J = 8.8 Hz ,2H),6.80 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.85-5.78 (m, 1H), 5.09-5.03 (m, 2H), 4.54 (m, 2H), 3.77 (s, 6H) 2.66-2.60 (m, 1H), 2.58-2.28 (m, 4H), 1.78-1.74 (m, 1H), 1.47 (s, 4H)。
化合物3の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物2(0.15 g、0.48 mmol)の溶液に、CH2Cl2に溶解したBBr3(0.95 mL、0.95 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温に加温して16時間撹拌し、HCl溶液(1 N、5.0 mL)の添加によりクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残渣を得た。これをヘキサン中0-60% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(0.07g、51％)を無色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.03 (d, J = 8.4 Hz ,2H),6.73 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.91-5.84 (m, 1H), 5.20-5.11 (m, 2H), 4.56 (m, 2H), 2.72-2.65 (m, 1H), 2.46-2.40 (m, 3H), 2.29-2.23 (m, 1H), 1.81-1.56 (m, 4H), 1.49 (s, 3H)。
化合物ALB-209872(B2-27)の製造
　CH3CN(1.0 mL)に溶解した化合物13(0.03 g、0.10 mmol)の氷冷溶液に、K2CO3(0.03 g、0.21 mmol)及びMeI(0.02 g、 0.16 mmol)を0℃で滴下した。反応混合物を室温で16時間撹拌した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-209872(B2-27)(0.012 g、50％)を淡黄色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.75 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.87-5.80 (m, 1H), 5.12-5.06 (m, 2H), 4.59-4.50 (m, 2H), 3.79 (s, 2H), 2.65-2.42 (m, 3H), 2.28-2.22 (m, 1H), 1.80-1.76 (m, 1H), 1.49 (s, 4H), 1.43-1.38 (m, 2H); ESI MS m/z 301 C19H24O3 +H]+。
化合物5の製造
　CH2Cl2(1.0 mL)に溶解した化合物ALB-209872(B2-27)(0.03 g、0.10 mmol)の混合物に、化合物4 (0.24 g、0.20 mmol)、Cu(OAc)2(0.036 g、0.20 mmol)及びピリジン(0.015 g、0.20 mmol)を室温で滴下した。反応混合物を48時間撹拌した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物5(0.02 g、54％)を無色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.07 (t, J = 7.6 Hz, 3H),6.98 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.86-5.79 (m, 1H), 5.11-5.05 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.68-2.61 (m, 1H), 2.47-2.44 (m, 2H), 2.28-2.23 (m, 1H), 1.79-1.75 (m, 1H), 1.48 (s, 4H), 1.43 - 1.40 (m, 1H); ESI MS m/z 315 C20H26O3 +H]+。ESI MS m/z 376 [M+H]+。
化合物ALB-208788(B2-21)の製造
　THF(1.0 mL)に溶解した化合物5(0.02 g、0.05 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.08 mL、THF中で2.0 M、0.16 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、H2O及びNa2SO4・10H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-208788(B2-21)(0.0095 g、55％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33-7.29 (m, 2H), 7.11-7.05 (m, 3H), 6.99, 6.96 (dd, J = 1.2, 8.8 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.78-5.71 (m, 1H), 5.17-5.06 (m, 2H), 4.56 (m, 2H), 3.70 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.76-2.69 (m, 1H), 2.28-2.21 (m, 1H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.70-1.64 (m, 2H), 1.49 (s, 4H), 1.48-1.43 (m, 2H); ESI MS m/z 349 C24H28O2 +H]+。
合成例18　化合物B2-19の合成
　化合物B2-19(ALB-209870とも称する)の製造方法(scheme 19とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
化合物2の製造
　1,4-ジオキサン：水(40 mL：10 mL)に溶解した化合物Int-4(scheme 1の化合物4)(5.00 g、36.76 mmol)の溶液を化合物1 (7.58 g、44.11 mmol)及びKOH(4.10 g、73.52 mmol)の混合物に室温で加えた。反応混合物をアルゴンで15分間脱気し、[Rh(COD)Cl]2(0.54 g、1.10 mmol)を加えた。反応混合物を還流下で16時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3(30 mL)でクエンチし、EtOAc(20 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(20mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(2.00 g、定量)を褐色の半固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.65 (s, 1H), 7.49-7.36 (m, 3H), 3.58 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.91-2.77 (m, 2H), 2.68-2.52 (m, 3H),1.43 (s, 3H), 1.03 (m, 3H)。
化合物3の製造
　Ac2O(10 mL)に溶解した化合物2(1.60 g、6.06 mmol)の溶液に、Zn(OAc)2(1.10 g、6.06 mmol)、BF3・OEt2(0.54 mL、3.03 mmol)を加えて、室温で12時間攪拌した。反応混合物をH2O(20 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(20 mL×3)で抽出した。有機層を混合して飽和NaHCO3(250 mL)、ブライン(50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた産物をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(1.80g、78%)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.79-7.74 (m, 3H), 7.61 (s, 1H), 7.45-7.38 (m, 2H), 7.35-7.32 (m, 1H), 5.50-5.48 (m, 1H), 4.71-4.54 (m, 2H), 3.19-3.12 (m, 1H), 2.88-2.81 (m, 1H), 2.56-2.49 (m, 2H), 2.40-2.25 (m, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.51 (s, 3H)。
化合物4の製造
　MeOH(10 mL)に溶解した化合物3(1.20 g、3.92 mmol)の溶液(0℃)に、NaH(0.078 g、鉱油中で60％、1.96 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl(10 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(50 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(50 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(1.20 g、77％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80-7.76 (m,  3H), 7.57 (s, 1H), 7.46-7.43 (m, 2H), 7.35-7.32 (m, 1H), 4.69-4.56 (m, 2H), 3.17-3.13 (m, 1H), 2.93-2.87 (m, 1H), 2.69-2.55 (m, 4H), 2.17-2.12 (m, 4H), 1.98-1.91 (m, 1H), 1.53 (s, 3H)。
化合物5の製造
　THF(5.0 mL)に溶解したp-トルエンスルホニルメチルイソシアニド(0.74 g、3.79 mmol)及びt-BuOK(0.85 g、7.57 mmol)の氷冷溶液に、THF(5.0 mL)に溶解した化合物4(0.50 g、1.89 mmol)を加えて、0℃で10分間撹拌した後、MeOH(10 mL)を加えた。得られた混合物を還流下で1時間撹拌し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物5(0.25 g、48％)を無色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.80-7.75 (m, 3H), 7.60 (s, 1H), 7.45-7.42 (m, 2H), 7.31-7.28 (m, 1H), 4.61 (m, J = 11.2 Hz, 1H), 4.51 (m, 1H), 3.14-3.10 (m, 1H), 2.75-2.63 (m, 2H), 2.51-2.14 (m, 2H), 1.96-1.74 (m, 4H), 1.49 (s, 3H)。
化合物6の製造
　2-プロパノール(5.0 mL)に溶解した化合物5(0.25 g、0.91 mmol)の溶液に、KOH(0.51 g、9.09 mmol)を室温で加えた。反応混合物を還流下で16時間撹拌し、HCl溶液(2 N)の添加によりクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(20 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物6(0.20 g、75％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78-7.73 (m,  3H), 7.56 (s, 1H), 7.44-7.37 (m, 2H), 7.32, 7.29 (dd, J = 1.6 Hz, 8.4 Hz, 1H), 4.58-4.49 (m, 2H), 2.76-2.60 (m, 1H), 2.59-2.40 (m, 2H), 2.23-2.10 (m, 2H), 1.96-1.92 (m, 1H), 1.78-1.66 (m, 2H), 1.51 (s, 3H)。
化合物7の製造
　CH3CN：MeOH(3.0 mL：1.0 mL)に溶解した化合物6(0.20 g、0.68 mmol)の氷冷溶液に、K2CO3(0.19 g、1.36mmol)、CH3I(0.15 g、1.02mmol)を0℃で滴下した。反応混合物を室温で18時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物7(0.15 g、71％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78-7.73 (m, 3H), 7.56 (s, 1H), 7.44-7.37 (m, 2H), 7.32, 7.29 (dd, J = 1.6 Hz, 8.4 Hz, 1H), 4.58-4.48 (m, 2H), 3.67 (s, 3H), 2.78-2.72 (m, 1H), 2.57-2.42 (m, 2H), 1.95-1.91 (m, 2H), 1.76-1.64 (m, 2H), 1.51 (s, 3H)。
化合物8の製造
　THF(1.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(0.73 mL、THF中で2.0 M、1.46mmol)の溶液に、化合物7(0.15 g、0.49mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間攪拌し、その後-105℃(MeOH、液体N2)に冷却し、フェニルビニルスルホキシド(0.13 mL、0.97 mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を-105℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(10mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物8(0.07 g、31％)を淡黄色の液体として得た。
化合物9の製造
　キシレン(2.0 mL)に溶解した化合物8(0.07 g、0.15 mmol)とNaHCO3(0.16 g、1.52 mmol)の混合物を還流下で16時間攪拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物9(0.015 g、30％)を無色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.79-7.74 (m, 3H), 7.58 (s, 1H), 7.43-7.31 (m, 3H), 5.87-5.80 (m, 1H), 5.10-5.05 (m, 2H), 4.58-4.48 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.88-2.82 (m, 1H), 2.52-2.44 (m, 3H), 1.83-1.80 (m, 1H), 1.49 (s, 4H)。
化合物ALB-209870(B2-19)の製造
　THF(1.0 mL)に溶解した化合物9(0.015 g、0.04 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.13 mL、THF中で2.0 M、0.13 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、H2O及びNa2SO4・10H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-209870(B2-19)(0.005 g、30％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.71-7.66 (m, 3H), 7.50 (s, 1H), 7.37-7.32 (m, 2H), 7.26, 7.24 (dd, J = 1.6 Hz, 8.8 Hz, 1H), 5.72-5.65 (m, 2H), 5.09-4.98 (m, 2H), 4.47 (m, 2H),3.67 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 2.88-2.82 (m, 1H), 2.41-2.34 (m, 1H), 1.90-1.83 (m, 2H), 1.68-1.62 (m, 2H), 1.46 (s, 3H), 1.30-1.29 (m, 2H); ESI MS m/z 307 C22H26O+H]+。
合成例19　化合物B2-18の合成
　化合物B2-18(ALB-208789とも称する)の製造方法(scheme 20とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
化合物2の製造
　1,4-ジオキサン(120 mL)に溶解した化合物Int-4 (scheme 1の化合物4) (11.0 g、79.00mmol)の溶液に、化合物1(16.2 g、79.00mmol)、KOH(2 M、8.84 g、158.0 mmol)を加え、アルゴンで15分間脱気した。[Rh(COD)Cl]2複合体(1.16 g、2.30 mmol)を反応混合物に加えた。得られた混合物を撹拌し、12時間加熱還流した。残留溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物をCH2Cl2(250 mL)に溶解し、セライト床を通して濾過した。濾液を水(250 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(13.00 g、55％)を黄色の固体として得た。
化合物3の製造
　Ac2O(20 mL)に溶解した化合物2(3.50 g、11.9mmol)の溶液に、Zn(OAc)2(1.30 g、7.00mmol)、及びBF3・OEt2(0.40 mL、2.90 mmol)を加えて、室温で12時間攪拌した。反応混合物をH2O(100 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(100 mL×2)で抽出した。有機層を混合して飽和NaHCO3溶液(250 mL)及びブライン(100 mL)で洗浄した。得られた混合物をMgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3[3.00 g (粗製物)]を褐色のオイルとして得た。ESI MS m/z 337 [M + H]+。
化合物4の製造
　MeOH(30 mL)に溶解した化合物3(3.00 g、6.20 mmol)の溶液(0℃)に、NaH(0.13 g、60％鉱油、3.00 mmol)を加えて、室温で30分間攪拌した。反応混合物を飽和NH4Cl溶液(25mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(100 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(2.10 g、61％)をオフホワイトの固体として得た。
化合物5の製造
　THF(10 mL)に溶解したp-トルエンスルホニルメチルイソシアニド(2.71 g、13.70mmol)及びt-BuOK(3.10 g、27.40mmol)の氷冷溶液に、THF(10 mL)に溶解した化合物4(2.00 g、6.85mmol)を加えて、0℃で10分間撹拌した後、MeOH(15 mL)を加えた。得られた混合物を還流下で1時間撹拌し、濃縮した。粗物質をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物5(1.20 g、60％)を淡黄色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.05 (d, J = 8.4 Hz ,2H),6.82 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.64 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 2.96-2.89 (m, 1H), 2.74-2.68 (m, 1H), 2.53-2.49 (m, 4H), 2.11-2.07 (m,1H), 1.91-1.55 (m,1H),1.51 (s, 3H)。
化合物6の製造
　2-プロパノール(10mL)中に溶解した化合物5(0.48 g、1.57 mmol)の溶液に、KOH(0.89 g、15.70 mmol)を室温で加えた。反応混合物を還流下で16時間撹拌し、HCl溶液(2 N、10 mL)の添加によりクエンチした。 得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(25 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して、化合物6[0.50 g(粗製物)]をオフホワイトの固体として得た。ESI MS m / z 323 [M + H]+。
化合物7の製造
　CH3CN(5.0 mL)に溶解した化合物6(0.40 g、1.24 mmol)の氷冷溶液に、K2CO3(0.51 g、3.72 mmol)及びCH3I(0.23 mL、3.72 mmol)を0℃で滴下した。反応混合物を室温に温めて12時間撹拌した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物7(0.30 g、72％)を無色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.04 (d, J = 8.8 Hz ,2H),6.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.55 (m, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.65 (s, 3H), 2.54-2.45 (m, 2H), 2.30-2.24 (m, 1H), 2.10-2.06 (m, 2H), 1.89-1.85 (m, 1H), 1.62-1.58 (m, 3H),1.49 (s, 3H)。
化合物8の製造
　1,4-ジオキサン(10 mL)に溶解した化合物7(0.08 g、0.24mmol)の溶液に、フェニルボロン酸(0.06 g、0.47mmol)、Na2CO3(0.063 g、2 M、0.59 mmol)を加えて、アルゴンで15分間脱気した。Pd(dppf)Cl2・CH2Cl2複合体(0.019 g、0.02 mmol)を反応混合物に加えた。得られた混合物を撹拌し、16時間加熱還流した。残留溶媒を蒸発させた。粗製物をCH2Cl2(10 mL)に溶解し、セライト床を通して濾過した。濾液を水(10 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物8(0.08 g、69％)をオフホワイトの固体として得た。ESI MS m/z 352 [M + NH4]+。
化合物9の製造
　THF(3.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(0.50 mL、THF中で2.0 M、0.89 mmol)の溶液に、THF(3.0 mL)に溶解した化合物8(0.10 g、0.30mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間攪拌し、その後-105℃(MeOH、液体N2)に冷却し、フェニルビニルスルホキシド(0.091 g、0.60 mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を-105℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物9(0.06 g、41％)を褐色の液体として得た。ESI MS m/z 487 [M + H]+。
化合物10の製造
　キシレン(3.0 mL)に溶解した化合物9(0.06 g、0.12 mmol)とNaHCO3(0.10 g、1.23 mmol)の混合物を還流下で18時間撹拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物10(0.03 g、68％)を色付きのオイルとして得た。ESI MS m/z 361 [M + H]+。
化合物ALB-208789(B2-18)の製造
　THF(3.0 mL)に溶解した化合物10(0.03 g、0.08 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.12 mL、THF中で2.0 M、0.24 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、H2O及びNa2SO4・10H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-208789(B2-18)(0.005 g、19％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.51 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36-7.24 (m, 5H), 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.70-5.63 (m, 1H), 5.09-4.97 (m, 2H), 4.52 (d, 2H), 4.48 (s, 1H), 3.66-3.61 (m, 2H), 2.75-2.61 (m, 1H), 2.28-2.13 (m, 2H), 1.85-1.80 (m, 2H), 1.66-1.60 (m, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.41-1.25 (m, 3H)。
合成例20　化合物B2-23の合成
　化合物B2-23(ALB-208790とも称する)の製造方法(scheme 21とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
化合物2の製造
　1,4-ジオキサン(3.0 mL)に溶解した化合物Int-7(scheme 20の化合物7)(0.30 g、0.89 mmol)の溶液に、化合物1 (0.27 g、1.78 mmol)、Na2CO3(2 M、0.19 g、1.79 mmol)を加え、アルゴンで15分間脱気した。Pd(dppf)Cl2・CH2Cl2複合体(0.07 g、0.09 mmol)を反応混合物に加えた。得られた混合物を撹拌し、マイクロ波照射下で1時間還流した。残留溶媒を蒸発させた。粗製物をCH2Cl2(10 mL)に溶解し、セライト床を通して濾過した。濾液を水(10 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.26 g、80％)をオフホワイトの固体として得た。
化合物3の製造
　THF(5.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(1.20 mL、THF中で2.0 M、2.38mmol)の溶液に、THF(3.0 mL)に溶解した化合物2(0.29 g、0.79mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間撹拌し、その後-105℃(MeOH、液体N2)に冷却し、フェニルビニルスルホキシド(0.24 g、1.59 mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を-105℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(0.16 g、40％)を褐色の液体として得た。
化合物4の製造
　キシレン(3.0 mL)に溶解した化合物3(0.16 g、0.31mmol)、NaHCO3(0.328 g、3.10mmol)の混合物を還流下で18時間攪拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(10 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮して残留オイルを得た。これをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(0.04 g、33％)を色付きオイルとして得た。ESI MS m/z 391 [M + H]+。
化合物ALB-208790(B2-23)の製造
　THF(4.0 mL)に溶解した化合物4(0.04 g、0.10 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.2 mL、THF 中で2.0 M、0.30 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、H2O及びNa2SO4・10H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-208790(B2-23)(0.015 g、40％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.51 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.79-5.71 (m, 1H), 5.17-5.06 (m, 2H), 4.58 (d, 2H), 3.82 (s, 3H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.37-2.30 (m, 2H), 1.94-1.88 (m, 2H), 1.73-1.66 (m, 2H), 1.50-1.43 (m, 5H); ESI MS m/z 363 [M+H]+。
合成例21　化合物B2-5Bの合成
　化合物B2-5B(ALB-210363とも称する)の製造方法(scheme 22とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
化合物1の製造
　THF(5.0 mL)に溶解した化合物Int-11(scheme 1の化合物11)(0.15 g、0.373 mmol、IN-BSC-J-51)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.37 mL、THF中で2.0 M、0.746 mmol)を0℃で追加した。反応混合物を0℃で6分間撹拌した。反応の進行をTLCで監視し、Na2SO4・10H2Oでクエンチし、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物1 (0.045 g、32％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m/z 375 C23H24O4 + H]+。
化合物2の製造
　CH2Cl2(10 mL)に溶解した化合物1(0.03 g、0.080 mmol)の氷冷溶液に、プロトンスポンジ(シグマアルドリッチ社 ; 登録商標)(0.0859 g、0.40 mmol)を、その次にMe3OBF4(0.059 g、0.40 mmol)を0℃で加えた。その後、反応混合物を室温で20時間撹拌し、反応混合物を水(25mL)で希釈し、CH2Cl2(25mL×2)で抽出した。有機層を混合して無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗製物を得た。粗製物をヘキサン中0-6% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.022 g、79％)を無色の粘性物質として得た。
化合物ALB-210363(B2-5B)の製造
　MeOH(1.0 mL)、THF(2.0 mL)、水(0.5 mL)に溶解した化合物2(0.022 g、0.0635 mmol)の攪拌溶液に、LiOH・H2O(0.013 g、0.317 mmol)を加えた。その反応を16時間室温で撹拌し、減圧下で濃縮した。残渣を水(25 mL)で希釈し、HCl溶液(2N、3.0 mL)で酸性化し、EtOAc(25 mL×2)で抽出した。有機層を混合して無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗製物を得た。粗製物を分取-HPLCカラムクロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥にて分取画分を蒸発させて、化合物ALB-210363(B2-5B)(0.006 g、28％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.55 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.63 (d, 9.2 Hz, 1H), 3.56 (d, 9.2 Hz, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.67-2.57 (m, 1H), 2.388 (s, 2H), 2.31-2.18 (m, 2H), 1.91 (t, 14.8 Hz, 2H), 1.51 (m, 1H), 1.50 (s, 3H), 1.49-1.37 (m, 3H); ESI MS m/z 331.2 C20H28O4 -H]+。
分取HPLC条件：
　カラム：Gemini NX-C18 10 μm; 150×30 mm
　移動相A：0.05％ギ酸水溶液; 
　　　　B：アセトニトリル。
　勾配(T /％B)：0/10、2/30、10/75、15/95、15.5/98、17.5/98、18/20、20/10
　希釈液：MeOH+THF
合成例22　化合物B2-5A-7の合成
　化合物B2-5A-7(ALB-211303とも称する)の製造方法(scheme 23とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
化合物2の製造
　NMP(8.0 mL)に溶解した化合物Int-10(scheme 1の化合物10)(0.75 g、2.60 mmol)、K2CO3(0.718 g、5.202 mmol)の懸濁液に、化合物1(1.1 mL、10.4 mmol)を室温で加えた。反応を密封チューブ内で220℃で5時間行い、HCl溶液(2N、40 mL)の添加によりクエンチした。得られた混合物をMTBE(60 mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残渣を得た。これをヘキサン中0-80% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.38 g、56％)を淡黄色固体として得た。ESI MS m / z 259 [C16H20O3 -H]+。
化合物3の製造
　アセトニトリル(20 mL)に溶解した化合物2(0.38 g、1.46mmol)の攪拌溶液に、K2CO3(0.604 g、4.38mmol)を、その次にヨウ化メチル(0.415 g、2.92 mmol)で0℃加えた。反応を室温で16時間実施し、濾過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。これをヘキサン中0-50% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(0.33g、82％)を無色の粘性液体として得た。
化合物4の製造
　アセトニトリル(20 mL)に溶解した化合物3(0.4 g、1.458mmol)の攪拌溶液に、K2CO3(0.603 g、4.374mmol)を、その次に(3-ブロモプロポキシ)(tert-ブチル)ジメチルシラン(0.44 g、1.74 mmol)を室温で加えた。反応を80℃で48時間実施し、濾過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。それをヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(0.52g、79.8％)を無色の液体として得た。
化合物5の製造
　THF(8.0 mL)に溶解した化合物4(0.52 g、1.164mmol)の攪拌溶液に、リチウムジイソプロピルアミド(1.74 mL、THF中で2.0 M、3.492mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間撹拌した後、反応混合物に2-ブロモ酢酸tert-ブチル(0.454g、2.32mmol)を加えた。反応混合物を-78℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(10 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(20 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物5(0.36 g、55％)を無色の粘性液体として得た。
化合物6の製造
　THF(6.0 mL)に溶解した化合物5(0.18 g、0.328 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(THF中で2.0 M、0.5 mL、0.962 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で3分間撹拌し、飽和NH4Cl(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(30 mL×2)で抽出した。有機層を混合してブライン(10 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残渣を得た。それをヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物6(0.065 g、38％)を無色の液体として得た。
化合物ALB-211303(B2-5A-7)の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物6(0.065 g、0.1219 mmol)の撹拌溶液に、p-トルエンスルホン酸一水和物(0.696 g、0.365 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物をCH2Cl2(50 mL)で希釈し、飽和NaHCO3溶液(30 mL)及びブライン(20 mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物ALB-211303(B2-5A-7)(0.014 g、33％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.01 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.57 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 4.30-4.25 (q, 2H), 4.09 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.85 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 2.56-2.45 (m, 1H), 2.34 (d, J = 3.2 Hz, 2H), 2.29-2.22 (m, 1H), 2.08-2.00 (m, 2H), 1.93-1.86 (m, 2H), 1.81-1.77 (m, 2H), 1.66-1.52 (m, 3H), 1.49 (s, 3H); ESI MS m/z 345 C21H28O4 +H]+。
合成例23　化合物B2-5A-7-1の合成
　化合物B2-5A-7-1(ALB-211355とも称する)の製造方法(scheme 24とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
　2,2,2 -トリフルオロエタノール(0.25 mL)に溶解した化合物Int-5(scheme 23の化合物5)(0.05 g、0.0891 mmol)の氷冷溶液に、TMSCl(0.075 mL)を0℃で加えた。その後、反応混合物を室温に温め、2時間撹拌した。反応の進行をTLCにより監視した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製物を得た。粗製物を分取-HPLCカラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥にて分取画分を蒸発させて、化合物ALB-211355(B2-5A-7-1)(0.01 g、28.7％)を無色の粘性物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.53 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.759 (s, 3H), 2.86-2.75 (m, 1H), 2.63 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.49 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.39-2.19 (m, 4H), 2.08-1.98 (m, 2H), 1.75-1.60 (m, 2H),1.47 (s. 3H), 1.47-1.3 (m, 2H); ESI MS m/z 391 C22H30O6 +H]+。
分取HPLC条件：
　カラム：Gemini NX-C18 10 μm; 150×30 mm
　移動相：B：アセトニトリル; 
　　　　　A：0.05％ギ酸水溶液
　勾配(min /％B)：0/10、2/30、10/55、15/85、15.5/98、18.5/98、19/10、20/10
　希釈液：MeOH
　カラム流速：30 mL / min
合成例24　化合物B2-5A-1の合成
　化合物B2-5A-1(ALB-210360とも称する)の製造方法(scheme 25とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
化合物2の製造
　THF(2.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(0.24 mL、THF中で2.0 M、0.41mmol)の溶液に、化合物Int-7(scheme 19の化合物7)(0.05 g、0.162mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間撹拌し、その後、化合物1 (0.04 mg、0.19 mmol)を加えた。反応混合物を-78℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl溶液(5.0 mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(10 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。残渣をヘキサン中0-10% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物2(0.03 g、44％)を無色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.57 (s, 1H), 7.45-7.30 (m, 3H), 4.58-4.47 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.05-2.98 (m, 1H), 2.59-2.43 (m, 9H), 1.75-1.70 (m, 2H), 1.68-1.67 (m, 1H), 1.45 (s, 3H), 1.39 (s, 9H)。
化合物3の製造
　THF(3.0 mL)に溶解した化合物2(0.03 g、0.07 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(0.14 mL、THF中で1.0 M、0.14 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、H2O及びNa2SO4・10H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-30% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(0.01 g、36％)を無色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.74-7.71 (m, 3H), 7.55 (s, 1H), 7.43-7.36 (m, 2H), 7.31, 7.28 (dd, J = 1.6 ,8.4 Hz, 2H), 4.57-4.46 (m, 2H), 3.82 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.07-2.85 (m, 1H), 2.44-2.35 (m, 2H), 2.22 (s, 2H),1.96-1.87 (m, 3H), 1.69-1.65 (m, 3H), 1.49 (s, 4H), 1.41 (s, 9H)。
化合物ALB-210360(B2-5A-1)の製造
　CH2Cl2(1.0 mL)に溶解した化合物3(0.01 g、0.025 mmol)の氷冷溶液に、p-TSA(0.009 g、0.05 mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌し、H2Oで希釈した。得られた混合物をEtOAc(5.0 mL×3)で抽出した。有機層を混合してブライン(5.0 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたcombiflashカラムクロマトグラフィーで精製し、分取HPLCを使用して化合物ALB-210360(B2-5A-1)(0.0008 g)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.77-7.72 (m, 3H), 7.52 (s, 1H), 7.42-7.39 (m, 3H), 4.58-4.50 (m, 2H), 4.31 (s, 2H), 2.74-2.67 (m, 1H), 2.46-2.39 (m, 1H), 2.34 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 1.96-1.72 (m, 3H), 1.66-1.60 (m, 2H), 1.49 (s, 3H); ESI MS m/z 321 C22H24O2 +H]+。
合成例25　化合物B2-2A及びB2-3Aの合成
　化合物B2-2A(ALB-210365とも称する)の製造方法(scheme 26とも称する)及びB2-3A(ALB-210797とも称する)の製造方法は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
化合物1の製造
　THF(3.0 mL)及びt-BuOH(2.0 mL)に溶解した化合物Int-7(scheme 1の化合物7)(0.02 g、0.081 mmol)の溶液(0℃)に、t-BuOK(0.0137 g 、0.122mmol)を、その次にCH3NO2(0.01g、0.1639)を加えて、0℃で1時間撹拌した。その後、反応混合物を室温で20時間撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl(20 mL)で希釈し、MTBE(2 x 20 mL)で抽出し、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過し、濃縮して粗製物を得た。粗製物をヘキサン中0-20% EtOAcを用いたカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物1(0.005 g、20％)を無色の液体として得た。 ESI MS m/z 306 C17H23NO4 + H]+。
化合物2の製造
　EtOH(5.0 mL)及びH2O(2.0 mL)に溶解した化合物1(0.05 g、0.163 mmol)の攪拌溶液に、Fe(0.036 g、0.655 mmol)を、その次にNH4Cl(0.034 g、0.655 mmol)を加えて、90℃で４時間撹拌した。反応混合物をセライトでろ過し、水(40 mL)で希釈し、CH2Cl2(50 mL×2)で抽出した。有機層をブライン(10 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物2[0.055 g(粗製物)]を褐色の液体として得た。粗製物を精製せずに次のステップで粗製物を使用した。
化合物ALB-210365(B2-2A)の製造
　MeOH(5.0 mL)に溶解して、その次にAcOH(0.02 mL)に溶解した化合物2(0.045 g、0.163 mmol)の攪拌溶液に、ホルムアルデヒド(1.0 mL)を室温で追加して、室温で16時間攪拌した。NaCNBH3(0.030 g、0.490 mmol)を反応混合物に0℃で加えた。その後、反応混合物を室温で4時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3(40 mL)で希釈し、CH2Cl2(50 mL×2)で抽出した。有機層を混合して無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗製物を得た。粗製物を分取-HPLCカラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥にて分取画分を蒸発させて、化合物ALB-210365(B2-2A)(0.02 g、40％)を無色の粘性液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.80 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.58 (d, J = 15.2 Hz, 2H),3.78 (s, 3H), 3.15-3.02 (m, 1H), 2.86-2.74 (m, 1H), 2.73 (s, 6H), 2.72-2.62 (m, 1H), 2.45-2.35 (m, 1H), 2.12-1.98 (m, 3H),1.71-1.61 (m, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.48-1.35 (m, 3H); ESI MS m/z 304 C19H29NO2 +H]+。
分取HPLC条件：
　カラム：Gemini NX-C18 10 μm; 150×30 mm
　移動相：A：アセトニトリル; 
　　　　　B：10 mmギ酸アンモニウム水溶液
勾配(分/％A)：0/10、2/20、10/40、15/60、15.5/98、18/98、18.2/10、20/10
希釈液：MeOH + THF
化合物ALB-210797(B2-3A)の製造
　CH2Cl2(5.0 mL)に溶解した化合物Int-2(scheme 26の化合物2)(0.01 g、0.036 mmol)の攪拌溶液に、トリエチルアミン(0.007 g、0.072 mmol)を、その次にメシルクロリド(0.004 g、0.036)を0℃で加えた。その後、反応混合物を0℃で2時間撹拌した。反応混合物を水(20 mL)で希釈し、CH2Cl2(30 mL×2)で抽出した。有機層を混合して無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗製物を得た。粗製物を分取HPLCカラムクロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥にて分取画分を蒸発させて、化合物ALB-210797(B2-3A)(0.004 g、31％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.04 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.74 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.15-3.02 (m, 2H), 2.97 (s, 3H), 2.96-2.84 (m, 1H), 2.32-2.20 (m, 1H), 1.98 (brs, 1H), 1.92-1.83 (m, 3H), 1.72-1.65 (m, 1H), 1.52 (s, 3H), 1.51-1.38 (m, 2H); ESI MS m/z 352 C18H27NO4 S-H]+。
分取HPLC条件：
　カラム：Gemini NX-C18 10 μm; 150×30 mm
　移動相：A：アセトニトリル; 
　　　　　B：0.05％ギ酸水溶液
　勾配(分/％A)：0/10、2/30、10/60、15/80、15.2/98、18/98、18.2/10、20/10
　希釈液：MeOH + THF
実施例２：各誘導体におけるTLR7活性化阻害の評価
　マウスTLR7発現レポーター細胞(Ba/F3細胞)を用いて、各誘導体及びCB-7におけるTLR7活性化阻害を評価した。これらの細胞は、三宅健介教授(東京大学医科学研究所感染遺伝学分野)から供与された。これらの細胞には、NF-κBのプロモーター領域の下流にGFP遺伝子をつないだレポーター遺伝子が導入されている。したがって、細胞が発現するTLR7のリガンドを添加することによりGFPの発現が増強される。このGFPの蛍光強度が各誘導体の添加により減弱することを指標に、各誘導体のTLR7活性化阻害を評価した。
　マウスTLR7のリガンドにはロキソリビン(Loxoribine、Alexis Biochemicals社製)を使用した。ヒトTLR7のリガンドにはガーディキモド(Gardiquimod、Invivogen社製)を使用した。
　10%(v/v)ウシ胎仔血清(FCS)、50U/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、50μM 2-メルカプトエタノール、1ng/mL インターロイキン-3を含むRPMI1640培地で培養したBa/F3細胞を、1ウェルあたりの細胞数が1.0×105個/100μLになるように96ウェルプレートに分注した。終濃度が1、5、10、25、50及び100μMになるように調製した50μLの誘導体又はCB-7を各ウェルに加えた。96ウェルプレートを5%CO2存在下37℃で30分間インキュベートした。次に、250μg/mL ロキソリビンを各ウェルに添加し、18時間培養した。培養終了後、2.5%(v/v)FCSを含むPBS(FACSバッファー)で細胞を洗浄し、25μg/mLの7-アクチノマイシンDを含む200μL のFACSバッファーでそれぞれの細胞を懸濁した。細胞のGFP蛍光強度を、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリーの測定は、FACSCantoTMII(Becton Dickinson社製)で行い、データをFlowJoソフトフェア(Tree Star社製)で解析した。ロキソリビン単独での刺激時のMFIを100 %として、1-100μM 誘導体又はCB-7存在下でのロキソリビン刺激時のMFI(%)を算出し、次に、ロジスティック回帰分析により IC50(活性を50%阻害する化合物濃度)を算出した。
　各誘導体のIC50を表３に示している。なお、CB-7のIC50は、3.12μMであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000097
　表３の通り、CB-7よりも高いTLR7活性化阻害活性を有していた誘導体は、B2-5A、B2-13、B2-22、B2-24、B2-26、B2-28、B2-29、B2-24-1、B2-24-2、B2-24-3、B2-24-4・HCl、B2-5A-4、B2-5A-6、B2-5A-7及びB2-5A-9であった。これらのうち、CB-7よりも２倍以上高いTLR7活性化阻害活性を有していた誘導体は、B2-13、B2-22、B2-24、B2-26、B2-24-1、B2-24-2、B2-24-3、B2-24-4・HCl、B2-5A-6及びB2-5A-9であった。B2-24-4・HClは、他の誘導体と比較して最も高いTLR7活性化阻害活性を有していた。
　また、エリアbへのN原子の導入が高い活性の発現に重要であることが示唆された。エリアaをラクトン環に置換しても、TLR7活性化阻害活性に影響を与えなかった。
実施例３：マウス肝ミクロソームを用いたB2-24及びB2-5Aの代謝安定性(シトクロムP450(CYP))の解析
　CB-7、B2-24、及びB2-5Aは10 mg/mLのDMSO溶液を用いた。それぞれの化合物をアセトニトリルで希釈して0.1mg/mLとなるように調製し、これを分析用標準品とした。マウス肝ミクロソーム画分を37℃の温浴槽で急速解凍し、氷上に保持した。CYP補酵素含有反応用バッファーを氷上で調製し、ミクロソーム画分と混和した。反応液を37℃で5分間プレインキュベートした後、被験物質溶液を添加してピペッティングでよく混和した。反応液量は200μLとし、被験物質の終濃度は0.1 mg/mLとした。反応液を37℃で30分間又は2時間インキュベートし、反応液の3倍量のアセトニトリルを添加しボルテックスして反応停止した。反応停止後のサンプルを遠心分離し、上清を分取した後エバポレーターで乾固した。乾固サンプルに50μLの50%アセトニトリル水溶液を添加し、5分間ボルテックスして再溶解した。再溶解液を遠心分離し、上清をHPLC分析に供した。HPLCシステムはHITACHI Lachrom ELITE (HITACHI社製)、カラムはCOSMOSIL 5C18-MS-II, 4.6 mmI.D.×150 mm　(nacalai tesque社製)を用いた。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
　CB-7における、HPLCにより検出されたピーク数は、7であった。一方、B2-24及びB2-5Aにおける、HPLCにより検出されたピーク数は、4であり、CB-7よりもピーク数が少なかった。よって、B2-24及びB2-5Aは、CB-7と比較して、主にCYPによる薬物代謝が改善した。この結果から、B2-24とB2-5Aのハイブリット型の誘導体は、TLR7阻害活性が高く、なおかつ代謝安定性を向上させることが予想された。
実施例４：B2-24-4・HClとB2-5Aのハイブリッド型誘導体(B2-24-4-5A)の合成
　Albany Molecular Research Inc.(米国)に依頼して、以下に示すB2-24-4・HCl (B2-24と類似構造を持ちTLR7阻害活性が最も高い誘導体)とB2-5Aのハイブリッド型誘導体(B2-24-4-5A)を作成した。B2-24-4-5Aの構造は、以下の式(X)で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
 　B2-24-4-5A・HCOOHの構造は、以下の式(XIV)で表される。
合成例26　化合物B2-24-4-5A及びB2-24-4-5A・HCOOHの合成
　化合物B2-24-4-5A及びB2-24-4-5A・HCOOHの製造方法(scheme 27とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
化合物2の製造
　CH2Cl2(1.0 L)、CH3CN(1.0 L)及び水(1.50 L)に溶解した(-)-β-ピネン(100.0 g、0.735 mol)の溶液(0℃)に、NaIO4(626.4 g、2.94 mol )及びRuCl3・nH2O(4.56g、22.0mmol)を加えた。反応混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物をEtOAc (1.0 L)で希釈し、水(1.0 L)及びブライン(500 mL)で洗浄した。得られた混合物を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物2[96.0g(粗製物)、定量]を褐色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.58-2.51 (m, 3H), 2.38-2.30 (m, 1H), 2.25-2.21 (m, 1H), 2.08-2.01 (m, 1H), 1.98-1.90 (m, 1H), 1.57 (s, 1H), 1.35 (s, 3H), 0.84 (s, 3H)。
化合物3の製造
　メタノール(1.0 L)に溶解した化合物2(96.0 g、695.0 mol)、(PhSe)2(108.0 g、347.0 mol)、SeO2(91.2 g、834.0 mol)、及びH2SO4(25.9 mL、486.0 mol)の混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物を水(1.0 L)でクエンチし、EtOAc(1.0 L×2)で抽出した。有機抽出物をブライン(500mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン中5% EtOAcを用いたシリカゲル(60-120メッシュ)カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物3(80.0g、39％)を緑褐色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.61-7.58 (m, 2H),7.32-7.25 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 2.71-2.68 (m, 1H), 2.61-2.52 (m, 2H), 2.24-2.20 (m, 2H), 1.88 (s, 1H), 1.35 (s, 3H), 0.84 (m, 3H)。
化合物4の製造
　CH2Cl2(800 mL)に溶解した化合物3(80.0 g、272.0 mol)の溶液に、7％H2O2(140.0 mL、408.0 mol)を0℃で、その次にピリジン(43.8 mL、544.0 mol)を加え、室温で12時間攪拌した。反応混合物をCH2Cl2(1.0 L)で希釈し、水(1.0 L)及びブライン(500 mL)で洗浄した。得られた混合物を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物をヘキサン中0-5% EtOAcを用いたシリカゲル(60-120メッシュ)カラムクロマトグラフィーで精製し、化合物4(30.0 g、81％)を油性液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54-7.50 (m, 1H),5.95 (d, J = 8.8 Hz, 3H), 2.86-2.83 (m, 1H), 2.73-2.57 (m, 2H), 2.13 (s, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.04 (m, 3H)。
化合物5の製造
　1,4-ジオキサン(100 mL)及び水(20.0 mL)に溶解した化合物4(10.0 g、73.5mmol)の溶液に、化合物4a(scheme 4の化合物1)(14.5 g、95.5mmol)、KOH(8.20 g、147.0mmol)を加えて、15分間脱気した。[Rh(COD)Cl]2複合体(2.17 g、4.40 mmol)を反応混合物に加え、攪拌し、80℃で12時間加熱した。残留溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物をCH2Cl2(500 mL)に溶解し、セライト床で濾過した。濾液を水(500 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣を溶離液ヘキサン中0-40% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製して、化合物5(6.15g、34％)を無色のオイルとして得た。ESI MS m / z 227 [M-NH4]+。
化合物6の製造
　Ac2O(60 mL)に溶解した化合物5(6.15 g、25.0mmol)の溶液に、Zn(OAc)2(5.07 g、27.7mmol)、BF3・OEt2(3.42 mL、27.7mmol)を加えて、室温で12時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3(500 mL)で中和した。得られた混合物をEtOAc(2×250 mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(250 mL)で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これを溶離液ヘキサン中0-30% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製して、化合物6(5.00 g、69 ％)をオフホワイトの固体として得た。ESI MS m / z 269 [M-NH4]+。
化合物7の製造
　メタノール(50 mL)に溶解した化合物6(5.00 g、17.4mmol)の溶液に、30分間にわたって少しずつNaH(0.70 g、鉱油中で60％、17.4mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で30分間撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl水溶液(25 mL)で0℃でクエンチした。メタノールを減圧下で蒸発させた。残留懸濁液を濾過し、水(100 mL)、その次にヘキサン(100 mL)で洗浄して、化合物7(4.50 g、粗製物)をオフホワイトの固体として得た。ESI MS m/z 227 [M-NH4]+。
化合物8の製造
　THF(15 mL)に溶解したp-トルエンスルホニルメチルイソシアニド(1.59 g、8.2 mmol)及びt-BuOK(1.83 g、16.3 mmol)の氷冷溶液に、THF(15.0 mL)に溶解した化合物7(1.00 g、4.00 mmol)を加えて、0℃で10分間撹拌し、メタノール(25 mL)を加えた。得られた混合物を還流下で1時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残渣を、溶離液ヘキサン中0-50% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製して、化合物8(0.80g、77％)を淡黄色液体として得た。このステップを複数回実行することにより化合物8を77%で得た。
化合物9の製造
　2-プロパノール(40 mL)に溶解した化合物8(4.00 g、15.0mmol)の溶液に、KOH(8.70 g、156.0mmol)を室温で加えた。反応混合物を100℃に温め、還流下で48時間撹拌した。残留溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物をEtOAc(100mL)に溶解し、水(50mL)で洗浄した。水層に2N HCl溶液を加えて中和し、EtOAc(2×100 mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物9(2.50g、粗製物)を褐色の粘性物質として得た。 ESI MS m / z 273 [M-H]+。
化合物10の製造
　アセトニトリル：メタノール(15：5 mL)に溶解した化合物9(2.50 g、9.12 mmol)の溶液に、K2CO3(3.80 g、27.3 mmol)及びMeI(3.84 mL、27.3 mmol)を0℃で滴下した。反応混合物を室温に温め、16時間撹拌した。反応混合物を水(100 mL)で希釈し、EtOAc(2×50 mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を溶離液ヘキサン中0-30% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製して、化合物10(1.25g、48％)を油状粘性物質として得た。 ESI MS m / z 271 [M-NH4]+。
化合物11の製造
　CH2Cl2(15 mL)に溶解した化合物10(1.25 g、4.30 mol)の撹拌溶液に、イミダゾール(0.63 g、10.8mmol)を、その次にTBDMSCl(0.78 g、5.20mmol)を0℃で少しずつ加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌し、CH2Cl2(100mL)で希釈し、飽和NaHCO3水溶液(50mL)で洗浄した。得られた反応混合物を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、溶離液ヘキサン中0-10% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製して、化合物11(1.25g、72％)を淡黄色のオイルとして得た。
化合物12の製造
　THF(8.0 mL)に溶解したリチウムジイソプロピルアミド(5.78 mL、THF中で2.0 M、11.5mmol)の溶液に、THF(8.0 mL)に溶解した化合物11(1.55 g、3.80mmol)を-78℃で滴下した。溶液を-78℃で30分間撹拌し、2-ブロモ酢酸tertブチル(1.60mL、7.70mmol)を反応混合物に加えた。反応混合物を-78℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl水溶液(15mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(2×50 mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(25mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を溶離液ヘキサン中0-10% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製して、化合物12(2.1g、粗製物)を淡黄色のオイルとして得た。
化合物13の製造
　THF(20 mL)に溶解した化合物12(2.10 g、4.06 mmol)の氷冷溶液に、TBAF (8.10 mL、THF中で1 M、8.13 mmol)を０℃で加えた。反応混合物を室温で8時間撹拌して、水(50 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(2×50 mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(25 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して残留オイルを得た。これを溶離剤ヘキサン中0-30% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物13(1.48 g、90％)を無色の粘性物質として得た。
化合物14の製造
　CH2Cl2(15 mL)に溶解した化合物13(1.48 g、3.60 mmol)の氷冷溶液に、デスマーチンペルヨージナン(3.12 g、7.36 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を飽和Na2S2O3水溶液(20mL)、飽和NaHCO3水溶液(20mL)で0℃でクエンチし、セライト床を通して濾過し、CH2Cl2(2×50mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物14[1.50g(粗製物)]を無色のオイルとして得た。 ESI MS m / z 401 [M + H]+。
化合物15の製造
　メタノール(5.0 mL)及び少量のAcOH(0.06 ml、1.10mmol)に溶解した化合物14(1.50 g、3.75mmol)の溶液に、化合物14a(1.39 g、7.50mmol)を、その次にNaCNBH3(0.71 g、11.20mmol)を室温で加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した。メタノールを蒸発させ、水(50 mL)で希釈した。得られた混合物をEtOAc(2×50 mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(25mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を溶離液ヘキサン中0-40% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製して、化合物15(1.60g、75％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m/z 571 [M + H]+。
化合物16の製造
　THF(10.0 mL)に溶解した化合物15(0.10 g、0.17 mmol)の氷冷溶液に、LiAlH4(THF中で2.0 M、0.87 mL、1.70 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を0℃で3分間撹拌し、飽和NH4Cl水溶液(5.0mL)でクエンチした。得られた混合物をEtOAc(2×10 mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(5mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を溶離液ヘキサン中0-60% EtOAcを使用するシリカゲルのcombiflashクロマトグラフィーにより精製して、化合物16(0.034g)を無色のオイルとして得た。このステップを複数回実行することにより化合物16を36%で得た。ESI MS m/z 543 [M + H]+。
化合物B2-24-4-5A・HCOOHの製造
　CH2Cl2(10.0 mL)に溶解した化合物16(0.53 g、0.97 mmol)の溶液に、p-トルエンスルホン酸(0.74 g、3.90 mmol)を室温で加えて、室温で16時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(10 mL)でクエンチし、CH2Cl2(2×25mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(25 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮した。残渣を質量トリガー分取HPLCにより精製して、化合物B2-24-4-5A・HCOOH(0.208g、51％)をオフホワイトの固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.46 (s, 1H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.06 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.28 (s, 2H), 3.49 (s, 2H), 3.09-3.03 (m, 4H), 2.60-2.50 (m, 5H), 2.39-2.25 (m, 3H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.82-1.78 (m, 1H), 1.68-1.52 (m, 3H) 1.46 (s, 3H). ESI MS m/z 369 [M+H]+.
化合物B2-24-4-5Aの製造
水(5 mL)に溶解した化合物B2-24-4-5A・HCOOH(100 mg)をCH2Cl2に溶解した 10%メタノール(10 mL×8)で抽出した。有機層を混合して無水MgSO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物B2-24-4-5A (45 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.19 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.28 (s, 2H), 3.45 (s, 2H), 2.94 (t, 4H), 2.57-2.42 (m, 5H), 2.35-2.25 (m, 3H), 1.92-1.75 (m, 3H), 1.68-1.52 (m, 4H) 1.48 (s, 3H). ESI MS m/z 369 [M+H]+.
実施例５： B2-24-4-5A・HCOOHにおけるTLR7活性化阻害の評価
　B2-24-4-5A・HCOOHのTLR7活性化阻害の評価は、実施例２の方法によって行った。コントロールとして、CB-7とB2-24-4・HClを使用した。CB-7及び各誘導体のIC50を表５に示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
　表５の通り、マウスTLR7阻害効果に関しては、B2-24-4-5A・HCOOHとB2-24-4・HClはほぼ同等であった。
実施例６：マウス骨髄由来マクロファージ(BMDM)におけるB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7阻害効果の確認
　マウスBMDMにおけるB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7阻害効果の確認を行った。マウス骨髄細胞を10μg/ml M-CSF、10% (v/v)ウシ胎仔血清(FCS)、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミン酸、2-メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地中で5% (v/v) CO2存在下37℃で７日間培養した。培養によって分化誘導したマウスBMDMを、96ウェルプレートの各ウェルに1.0×105/100μLとなるように撒種した。1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM、10μM又は30μMの終濃度となるように50μLのCB-7又はB2-24-4-5A・HCOOHを各ウェルに加えて30分間インキュベートした。なお、B2-24-4-5A・HCOOH又はCB-7はそれぞれ10 mg/mLの生理食塩水又はDMSO溶液を用いた。次に、TLR7リガンドであるR848(Invivogen社製)、を終濃度10 ng/mLで加えて24時間培養した。培養後、全ての培養液を回収し、培養液中のIL-6濃度をELISA法(使用キット：Mouse IL-6 DuoSet ELISA(商品名)、R&D Systems社製)を利用して定量した。結果を図２に示す。
　R848刺激により産生誘導されたIL-6は、B2-24-4-5A・HCOOHの前処理によって減弱した。B2-24-4-5A・HCOOHのTLR7阻害活性効果は、CB-7のものよりも約100倍強かった。
実施例７：マウスBMDMにおけるB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7選択性の確認
　マウスBMDMにおけるB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7選択性の確認を行った。マウス骨髄細胞を10μg/ml M-CSF、10% (v/v)ウシ胎仔血清(FCS)、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミン酸、2-メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地中で5% (v/v) CO2存在下37℃で７日間培養した。培養によって分化誘導したマウスBMDMを、96ウェルプレートの各ウェルに1.0×105/100μLとなるように撒種した。1nM、10nM又は100nMの終濃度となるように50μLのB2-24-4-5A・HCOOHを各ウェルに加えて30分間インキュベートした。TLRリガンドであるPam2CSK4(Invivogen社製)、Poly(I:C)(Invivogen社製)、Lipid A(Sigma-Aldrich社製)、R848(Invivogen社製)又はCpG-B(Invivogen社製)を各ウェルに加えて24時間培養した。培養後、全ての培養液を回収し、培養液中のIL-6濃度をELISA法(使用キット：Mouse IL-6 DuoSet ELISA(商品名)、R&D Systems社製)を利用して定量した。結果を図３に示す。
　B2-24-4-5A・HCOOHは、TLR7リガンドであるR848刺激によるIL-6の産生は抑制したが、他のTLRリガンド刺激によるIL-6の産生は抑制しなかった。従って、B2-24-4-5A・HCOOHは、TLR7に選択的な阻害剤であることが示された。
実施例８：全身性エリテマトーデス患者由来末梢血単核球(PBMC)を用いたB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7阻害効果の確認
　全身性エリテマトーデス患者由来PBMCにおけるB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7阻害効果の確認を行った。全身性エリテマトーデス患者から採取した7mLの血液からPBMCを単離した。単離したPBMCを、10% (v/v)ウシ胎仔血清(FCS)、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミン酸、2-メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地を含む96ウェルプレートの各ウェルに0.5×105/100μLとなるように撒種し、5% (v/v) CO2存在下37℃で培養した。0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM又は50μMの終濃度となるように50μLのB2-24-4-5A・HCOOH、B2-24-4・HCl又は比較薬剤であるヒドロキシクロロキン硫酸塩(HCQ)を各ウェルに加えて30分間インキュベートした。TLR7リガンドであるガーディキモド(Gardiquimod、Invivogen社製)を終濃度3μg/mLで加えて24時間培養した。培養後、全ての培養液を回収し、培養液中のIL-6濃度をELISA法(使用キット：human IL-6 DuoSet ELISA(商品名)、R&D Systems社製)を利用して定量した。結果を図４に示す。
　ガーディキモド刺激により産生誘導されたIL-6は、全ての化合物の前処理によって減弱し、その効果はB2-24-4・HCl、B2-24-4-5A・HCOOH、HCQの順に強かった。
実施例９：マウス肝ミクロソームを用いたCB-7及びB2-24-4-5A・HCOOHの代謝安定性(CYP)の解析
　CB-7及びB2-24-4-5A・HCOOHの代謝安定性解析は、実施例５の方法によって行った。CB-7の結果を表６に示し、B2-24-4-5A・HCOOHの結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000103
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000104
　CB-7における、HPLCにより検出されたピーク数は、9であった(表６では9つのピークのうち7つのピークを示している)。一方、B2-24-4-5A・HCOOHにおける、HPLCにより検出されたピーク数は、6であり、CB-7よりもピーク数が少なかった。2時間後のCB-7のピーク面積(Area)は、41.6%であるのに対して、2時間後のB2-24-4-5A・HCOOHのピーク面積(Area)は、88.4%であった。よって、B2-24-4-5A・HCOOHは、CB-7と比較して、主にCYPによる薬物代謝が大幅に改善した。
実施例１０：マウスにおけるCB-7又はB2-24-4-5A・HCOOHの経口投与後の血漿中濃度
　正常マウス(C57BL/6N、11週齢、雌)を用いて、CB-7又はB2-24-4-5A・HCOOHの経口投与後の血漿中濃度を測定した。1mgのCB-7又はB2-24-4-5A・HCOOHをマウスC57BL/6Nに経口投与した。0.5時間、1時間、2時間、4時間又は8時間後、マウスC57BL/6Nから血液を採取して血漿を調製した。血漿中のCB-7又はB2-24-4-5A・HCOOHの濃度をLC/MS/MSにより測定した。結果を図５に示す。
　CB-7は、8時間後の血漿中では検出することができなかった一方で、B2-24-4-5A・HCOOHは、8時間後の血漿中に約500ng/ml存在していた。B2-24-4-5A・HCOOHは、CB-7と比較して長時間、血漿中に留まることが明らかになった。
実施例１１：マウスにおけるB2-24-4-5A・HCOOHの経口投与後の血漿中濃度
　全身性エリテマトーデスモデルマウス(NZBWF1、20週齢、雌)を用いて、B2-24-4-5A・HCOOHの経口投与後の血漿中濃度を測定した。5mg/kgのB2-24-4-5A・HCOOHをNZBWF1マウスに経口投与した。0.5時間、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間又は24時間後、NZBWF1マウスから血液を採取して血漿を調製した。血漿中のB2-24-4-5A・HCOOHの濃度をLC/MS/MSにより測定した。結果を図６に示す。
　B2-24-4-5A・HCOOHは、0.5時間後の血漿中に88.1ng/ml存在していた。その後消失していき、8時間後にほぼ底値となった。
実施例１２：マウスにおけるB2-24-4-5A・HCOOHの腹腔内投与によるTLR7阻害効果の確認
　正常マウス(C57BL/6N、11週齢、雌)を用いて、B2-24-4-5A・HCOOH (1、5、10、100及び1000μg)又は比較薬剤としてヒドロキシクロロキン硫酸塩(HCQ、1000μg)を腹腔投与し、30分後に5μgのR848を腹腔投与した。溶媒は、生理食塩水を用いた。R848投与から1時間後に採血し、血清に含まれるIFN-αの濃度をELISA法(使用キット：Mouse IFN alpha Platinum ELISA(商品名)、eBioscience社製)を利用して定量した。結果を図７に示す。図７のプロットは、各個体のデータ、各太線は、各群データの平均値、各エラーバーは、各群データの標準誤差を表している。
　R848により産生誘導されたIFN-αは、B2-24-4-5A・HCOOHの前処置によって減弱し、その効果はHCQよりも強かった。10μgのB2-24-4-5A・HCOOH腹腔投与では、ほぼ完全にIFN-αの誘導を抑制する効果を示した。この結果は、マウスの体重を20gとすると、0.5 mg/kgで薬効を示したことになる。すなわち、in vivoでのTLR7阻害効果は、HCQの100倍以上であった。
実施例１３：マウスにおけるB2-24-4・HCl、B2-24-4-5A又はB2-24-4-5A・HCOOHの腹腔内投与によるTLR7阻害効果の確認
　実施例１３と同じ方法を用いて、マウスにおけるB2-24-4・HCl、B2-24-4-5A又はB2-24-4-5A・HCOOHの腹腔内投与によるTLR7阻害効果を確認した。B2-24-4・HCl、B2-24-4-5A及びB2-24-4-5A・HCOOHの投与量は、10μgとした。結果を図８に示す。図８のプロットは、各個体のデータ、各太線は、各群データの平均値、各エラーバーは、各群データの標準誤差を表している。
　R848により産生誘導されたIFN-αは、B2-24-4・HCl、B2-24-4-5A又はB2-24-4-5A・HCOOHの前処置によって減弱し、その効果はB2-24-4-5A・HCOOH、B2-24-4-5A、B2-24-4・HClの順に強かった。
実施例１４：薬剤誘導性の全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるB2-24-4-5A・HCOOHの治療効果の確認
　正常マウス(BALB/c、7週齢、雌、n=10)の右耳にベセルナクリーム(商品名)を週3回8週間塗布することで全身性エリテマトーデス様の病態を誘導させた。その後、これらのマウスを生理食塩水(saline)投与群(対照、n=5)とB2-24-4-5A・HCOOH投与群(n=5)に分けた。Saline投与群は、ベセルナクリーム(商品名)の塗布を同様に継続しながらSaline(100 μl)を1日1回連日経口投与した。B2-24-4-5A・HCOOH投与群は、ベセルナクリームの塗布を同様に継続しながら5 mg/kgのB2-24-4-5A・HCOOH(100 μl)を1日1回連日経口投与した。投与開始から6週間後、マウスを安楽死させた。安楽死後、マウスの腹部大動脈から血液を採取し、脾臓及び腎臓を摘出した。摘出した脾臓は写真撮影および重量測定した。
　摘出した脾臓をスライドガラスで磨り潰して脾細胞を調製し、FITC標識抗CD3抗体及びPE標識抗CD69抗体で染色した。20分後、FACSバッファーで細胞を洗浄し、25μg/mLの7-アクチノマイシンDを含む200μL のFACSバッファーでそれぞれの細胞を懸濁した。細胞の蛍光強度を、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリーの測定は、FACSCantoTMII(Becton Dickinson社製)で行い、データをFlowJoソフトフェア(Tree Star社製)で解析し、CD3陽性のT細胞に占めるCD69陽性細胞(活性化T細胞)の割合を算出した。
　摘出した腎臓は4%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学染色を株式会社モルフォテクノロジーに委託した。腹部大動脈から採取した血液を遠心分離し、血清を調製した。血清中の尿素窒素値とクレアチニン値の定量は、オリエンタル酵母株式会社に委託した。結果を図9Aから9Dに示す。
　図9Aは、摘出した脾臓の写真である。図９Bは、脾臓重量を示している。図9Cは、脾臓T細胞中の活性化T細胞の割合を示している。図９Dは、糸球体におけるIgGの沈着を示す写真である。図９B、9Cのプロットは、各個体のデータ、各太線は、各群データの平均値、各エラーバーは、各群データの標準誤差を表している。図9Dのスケールバーは100 μmを表している。
　図9Aから9Dから明らかな通り、B2-24-4-5A・HCOOH投与群では対照の生理食塩水(saline)投与群に比べて、脾臓の腫大の抑制、脾臓T細胞中の活性化T細胞の割合の減少、糸球体におけるIgGの沈着の抑制が認められた。
実施例１５：化合物B2-24-4のギ酸塩の合成
　Albany Molecular Research Inc.(米国)に依頼して、化合物B2-24-4・HCOOHを作成した。B2-24-4・HCOOHの構造は、以下の式(XV)で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
 合成例27　化合物B2-24-4・HCOOHの合成
化合物B2-24-4・HCOOH(ALB-210796とも称する)の製造方法(scheme 28とも称する)は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
化合物２の製造
　CH2Cl2(1.0L)、アセトニトリル(1.0L)及び水(1.0L)中の(-)-β-ピネン(100.0g、0.73mol)の撹拌溶液に、0℃でNaIO4(626.4g、2.94mol)を少しずつ加え、反応混合物を同じ温度で10分間撹拌した。反応混合物にRuCl3-nH2O(4.56g、22.0mmol)を0℃で少しずつ加えて室温で5時間撹拌した後、反応混合物にセライトを加えてセライトパッドでろ過し、CH2Cl2(500mL)で洗浄した。ろ液をH2O(1.0L)で希釈し、CH2Cl2(2×500mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(500 mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた後、減圧下で濃縮して化合物2(100.0g、粗製物)を褐色の液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.58-2.51 (m, 3H), 2.38-2.30 (m, 1H), 2.25-2.21 (m, 1H), 2.08-2.01 (m, 1H), 1.98-1.90 (m, 1H), 1.57 (s, 1H), 1.35 (s, 3H), 0.84 (s, 3H)。
化合物3の製造
　メタノール(500mL)中の化合物2(50.0g、0.362mol)の撹拌溶液に、(PhSe)2(56.5g、0.181mol)及びSeO2(48.2g、0.434mol)を加え、続いてH2SO4(13.5mL、0.253mol)を0℃で滴下した。反応混合物を室温で10時間撹拌し、氷冷水(1.0L)でクエンチし、EtOAc(1.0L)を加えてセライトパッドでろ過した。有機層を分離し、ブライン(500mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中5-10%のEtOAcを使用するシリカゲル(60-120メッシュ)のカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物3(50.0g、47%)をワインレッドの液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.61-7.58 (m, 2H), 7.32-7.25 (m, 3H), 3.87 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 2.71-2.68 (m, 1H), 2.61-2.52 (m, 2H), 2.24-2.20 (m, 2H), 1.88 (d, J = 8.00 Hz, 1H), 1.35 (s, 3H), 0.84 (m, 3H)。
化合物4の製造
　CH2Cl2(450 mL)中の化合物3(45.0g、0.153mol)の撹拌溶液に、30% aq.H2O2(26.0mL、0.229 mol)を0℃で滴下し、続いてピリジン(43.8mL、0.544mol)を10分間かけて滴下し、反応混合物を5℃以下で3時間撹拌した。反応混合物をチオ硫酸ナトリウム(250mL)でクエンチし、CH2Cl2(2×250mL)で抽出した。有機層を混合して0.5N塩酸(2×250mL)、水(200mL)及びブライン(200mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、25℃以下で減圧濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中5-10％のEtOAcを使用するシリカゲル(60-120メッシュ)のカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物4(15.0g、72％)を淡黄色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.54-7.50 (m, 1H), 5.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 2.86-2.83 (m, 1H), 2.76-2.70 (m, 1H), 2.64-2.56 (m, 1H), 2.15 (d, J = 8 Hz, 1H), 1.51 (s, 3H), 1.04 (m, 3H)。
化合物5の製造
　1, 4-ジオキサン(160mL)及び水(40.0mL)中の化合物4(15.0g、110.29 mmol)の撹拌溶液に、化合物4a(scheme 4の化合物1)(25.14g、165.43 mmol)及びKOH(12.37g、220.58 mmol)を加え、反応混合物をアルゴン下で15分間脱気した。[Rh(COD)Cl]2複合体(1.63g、3.30mmol)を加え、再びアルゴン下で5分間脱気した。得られた反応混合物を100℃で16時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、CH2Cl2(500mL)で希釈し、セライト床でろ過した。ろ液をH2O(500mL)で洗浄し、有機層を混合して無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この粗製化合物を溶離液ヘキサン中20-40％のEtOAcを使用するシリカゲル(60-120メッシュ)のカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物5(20g、74％)をワインレッドのオイルとして得た。ESI MS m/z 245 [M+H]+。
化合物6の製造
　Ac2O(200mL)中の化合物5(20g、81.91mmol)の撹拌溶液に、10℃以下でZn(OAc)2(18g、98.29mmol)及びBF3・OEt2(12.1mL、98.29mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3(500mL)で中和し、EtOAc(2×250mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(250mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中30-40％のEtOAcを使用するシリカゲル(60-120メッシュ)のカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物6(18.5g、68%)をオフホワイトの固体として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.25 (d, J = 8.40 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.00 Hz, 2H), 5.47-5.46 (m, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.68 (s, 1H), 4.61 (s, 1H), 3.03-3.00 (m, 1H), 2.75-2.69 (m, 1H), 2.43-2.29 (m, 4H), 2.09 (s, 6H), 1.50 (s, 3H)。
化合物7の製造
　メタノール(185mL)中の化合物6(18.5g、56.40 mmol)の溶液に、0℃でNaH(2.26g、ミネラルオイル中60%、56.40 mmol)を少しずつ加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した後、0℃で飽和aq.NH4Cl水溶液(100mL)でクエンチし、水(100mL)で希釈して、EtOAc(2×250mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(200mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物をヘキサン(2×50mL)で洗浄し、乾燥させて、化合物7(13.5g、粗製物)をオフホワイトの固体として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 7.30 (d, J = 8.00 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8.00 Hz, 2H), 4.66 (s, 3H), 4.62 (s, 1H), 3.03-2.98 (m, 1H), 2.81-2.74 (m, 1H), 2.55-2.51 (m, 4H), 2.15-2.08 (m, 1H), 1.93-1.82 (m, 1H), 1.73-1.70 (m, 1H), 1.52 (s, 3H)。
化合物8の製造
　THF(80mL)中のp-トルエンスルホニルメチルイソシアニド(6.40g、32.78mmol)の氷冷溶液に、0℃でTHF中の1M tert-BuOK溶液(65.56mL、65.56mmol)を滴下して、同じ温度で10分間撹拌した。反応混合物に、THF(10mL)中の化合物7(4g、16.39mmol)を5℃以下で加えて、15分間撹拌した。反応物にメタノール(40mL)を加え、還流下で1時間撹拌し、残留溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた残渣にH2O(100mL)を加え、EtOAc(2×100mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中30-40％のEtOAc溶出を使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物8(1.53g、36%)を淡黄色の粘性物質として得た。これをさらに精製することなく次の反応に使用した。
化合物9の製造
　2-プロパノール(20mL)中の化合物8(2.0g、7.83 mmol)の撹拌溶液に、KOH(4.4g、78.38mmol)を室温で加えた。反応混合物を還流下で48時間撹拌した。残留溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた粗製物をEtOAc(100mL)に溶解し、水(50mL)で洗浄した。水層を2M塩酸で中和し、EtOAc(2×100mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮し、化合物9(1.0g、粗製物)を灰色の固体として得た。ESI MS m/z 273 [M-H]+。
化合物10の製造
　アセトニトリル(150mL)及びメタノール(30mL)中の化合物9(13.0g、47.44mmol)の撹拌溶液に、K2CO3(19.78g、142.32mmol)を加え、続いて5℃以下でMeI(8.8mL、142.32mmol)を滴下した。反応混合物を室温で16時間撹拌した。残留溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣に水(100mL)を加え、EtOAc(2×100mL)で抽出した。有機層を混合して水(50mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この粗製化合物を溶離液ヘキサン中10-20%のEtOAcを使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物10(8.20g、60%)を無色のオイルとして得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.64 (d, J = 4.80 Hz, 2H), 4.56-4.53 (m, 2H), 3.65 (s, 3H), 2.59-2.46 (m, 2H), 2.36-2.30 (m, 1H), 2.12-2.08 (m, 2H), 1.91-1.86 (m, 1H), 1.67-1.60 (m, 3H), 1.52-1.49 (m, 4H)。
化合物11の製造
　CH2Cl2(160mL)中の化合物10(8.20g、28.45mmol)の撹拌溶液に、0℃でイミダゾール(4.8g、71.12mmol)及びTBDMSCl(5.14g、34.14mmol)を少しずつ加えた。反応混合物を室温で16時間撹拌した後、飽和aq.NaHCO3(200mL)でクエンチし、CH2Cl2(2×100mL)で抽出した。有機層を混合して水(50mL)及びブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中10-20%のEtOAcを使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物11(10.0g、87％)を無色のオイルとして得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 7.20 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.70 (s, 2H), 4.55 (s, 1H), 4.53 (s, 1H), 3.65 (s, 3H), 2.47-2.45 (m, 2H), 2.35-2.28 (m, 1H), 2.11-2.08 (m, 2H), 1.90-1.86 (m, 1H), 1.67-1.59 (m, 2H), 1.51 (s, 1H), 1.49 (s, 3H), 0.93 (s, 9H), 0.08 (s, 6H)。
化合物12の製造
　THF(60mL)中の化合物11(1.20g、2.98mmol)の撹拌溶液に、THF中の2Mリチウムジイソプロピルアミド溶液(4.47mL、8.94mmol)を-78℃で滴下した。反応混合物を-78℃で30分間撹拌した後、(MeOH、液体N2を使用して)-105℃まで冷却し、フェニルビニルスルホキシド(0.6mL、4.47mmol)を加えた。反応混合物を-105℃で30分間撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl水溶液(25mL)でクエンチし、EtOAc(2×50mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中30-40%のEtOAcを使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物12(0.47g、28%)を淡黄色のオイルとして得た。ESI MS m/z 555 [M+H]+。
化合物13の製造
　キシレン(51mL)中の化合物12(3.40g、6.128mmol)の撹拌溶液に、室温でNaHCO3(5.1g、61.28mmol)を加え、反応混合物を還流下で16時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、H2O(50mL)で希釈し、EtOAc(3×50 mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50 mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中10-30%のEtOAcを使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、13(2.0g、76％)を無色の粘性物質として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) : δ 7.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.87-5.78 (m, 1H), 5.09-5.04 (m, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.54-4.52 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.69-2.61 (m, 1H), 2.43-2.41 (m, 2H), 2.33-2.27 (m, 1H), 1.80-1.75 (m, 1H), 1.58 (s, 1H), 1.51-1.39 (m, 6H), 0.93 (s, 9H), 0.08 (s, 6H)。
化合物14の製造
　THF(40.0mL)中の化合物13(2.0g、4.66mmol)の撹拌溶液に、0℃でTHF中の1M TBAF(9.32mL、9.32mmol)を加えた。反応混合物を室温で3時間撹拌した後、H2O(50mL)でクエンチし、EtOAc(2×50mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中20-40%のEtOAcを使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物14(1.20g、82％)を淡黄色の粘性物質として得た。ESI MS m/z 332 [M+ H2O]+。
化合物15の製造
　CH2Cl2(25.0mL)中の化合物14(1.20g、3.81mmol)の撹拌溶液に、0℃でデスマーチンペルヨージナン(3.23g、7.63mmol)を加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、飽和Na2S2O3(25.0mL)でクエンチし、10分間撹拌した後、CH2Cl2(2×50mL)で抽出した。有機層を飽和NaHCO3水溶液(25.0mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中10-20%のEtOAcを使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物15(1.0g、84%)を淡黄色の粘性物質として得た。ESI MS m/z 313 [M+H]+。
化合物16の製造
　MeOH(20.0mL)中の化合物15(1.0g、3.20mmol)の撹拌溶液に、AcOH(0.1mL、1.6mmol)を加え、続いてtert-butyl piperzine-1-carboxylate(1.2g、6.40mmol)を加え、反応混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を0℃でNaCNBH3(0.60g、9.6mmol)を少しずつ加え、室温で16時間撹拌した。反応混合物をH2O(25mL)でクエンチし、CH2Cl2(2×50mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製物を溶離液ヘキサン中30-40%のEtOAcを使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物15(1.25g、81％)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m/z 483 [M+H]+。
化合物17の製造
　THF(50mL)中の化合物16(1.0g、2.07mmol)の撹拌溶液に、0℃でTHF中の2M LiAlH4(3.1mL、6.2mmol)を滴下した。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、飽和NH4Cl水溶液(25.0mL)でクエンチし、EtOAc(2×50.0mL)で抽出した。有機層を混合してブライン(25.0mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗製化合物を溶離液ヘキサン中30-50%のEtOAcを使用するcombiflashクロマトグラフィーにより精製し、化合物17(1.0g、88%)を無色の粘性物質として得た。ESI MS m/z 455 [M+H]+。
化合物ALB-210796(B2-24-4・HCOOH)の製造
　CH2Cl2(25mL)中の化合物17(1.0g、2.21mmol)の撹拌溶液に、0℃で1,4-ジオキサン(10mL)中の4M塩酸を滴下した。反応混合物を室温で4時間撹拌し、残留溶媒を減圧下で蒸発させた。粗製物をヘキサン(2×20mL)で洗浄し、緩衝液としてギ酸アンモニウムを用いてH2O中のCH3CNで溶出する分取HPLCで精製した。精製画分を減圧下で濃縮した後、凍結乾燥して、ALB-210796のギ酸塩(B2-24-4・HCOOH) (420mg、47%)をオフホワイトの固体として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8.30 (s, 1H), 7.15-7.10 (m, 4H), 5.89-5.81 (m, 1H), 4.94-4.89 (m, 2H), 4.54 (d, J = 1.60 Hz, 1H), 4.45-4.44 (m, 1H), 3.54 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 2.84-2.67 (m, 5H), 2.36-2.26 (m, 5H), 1.77-1.58 (m, 5H), 1.48 (s, 3H), 1.40-1.31 (m, 2H)。
実施例１６：自然発症型の全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるB2-24-4-5A・HCOOHの治療効果の確認
　全身性エリテマトーデスモデルマウス(NZBWF1、20週齢、雌、n=55)を生理食塩水(saline)投与群(対照、n=25)、B2-24-4-5A・HCOOH投与群(n=10)、B2-24-4・HCOOH投与群(n=5)、HCQ投与群(n=15)に分けた。Saline投与群は、Saline(100 μl)を1日1回連日経口投与した。B2-24-4-5A・HCOOH投与群は、10 mg/kgのB2-24-4-5A・HCOOH(100 μl)を1日1回連日経口投与した。B2-24-4・HCOOH投与群は、10 mg/kgのB2-24-4・HCOOH(100 μl)を1日1回連日経口投与した。HCQ投与群は、10 mg/kgのHCQ(100 μl)を1日1回連日経口投与した。投与開始から15週間後、生存していた生理食塩水(saline)投与群(対照、n=17)、B2-24-4-5A・HCOOH投与群(n=10)、B2-24-4・HCOOH投与群(n=5)、HCQ投与群(n=12)のマウスについて、採尿しマウスを安楽死させた。安楽死後、マウスの腹部大動脈から血液を採取し、腎臓と脾臓を摘出した。
　投与開始から15週間までの期間中に自然死したマウスは、死亡例としてカウントし、Kaplan Meier法により生存率解析を行った。死亡例を除く各マウスの腹部大動脈から採取した血液を遠心分離し、血清を調製した。血清中の尿素窒素値とクレアチニン値の定量は、オリエンタル酵母株式会社に委託した。尿中のアルブミン濃度をELISA法(使用キット：レビス 尿中アルブミン-マウス(Sタイプ)(商品名)(富士フイルムワコーシバヤギ株式会社製)を利用して定量した。摘出した腎臓は4%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学染色を株式会社モルフォテクノロジーに委託した。PAS染色した腎組織切片において、100個の糸球体の組織所見を評価し、その内、メサンギウム領域の細胞および基質の増加、毛細血管内腔の内皮細胞腫大と細胞浸潤（管内増殖）及び炎半月体を伴う糸球体（管外増殖）については、100個の糸球体それぞれを重症度によってgrade0からgrade2までの階級に振り分け、6点満点にて点数化した。結果を図10Aから図10H、表8に示す。
　図10Aは、投与期間中の生存率曲線を示している。図10Bは、血清尿素窒素値を示している。図10Cは、血清クレアチニン値を示している。図10Dは、尿アルブミン量を示している。図10Eは、生理食塩水(saline)投与群のマウス(#1)、B2-24-4-5A・HCOOH投与群のマウス(#10)、B2-24-4・HCOOH投与群のマウス(#4)及びHCQ投与群のマウス(#14)の糸球体におけるIgGの沈着を示す写真である。図10Fは、生理食塩水(saline)投与群のマウス(#1)、B2-24-4-5A・HCOOH投与群のマウス(#10)、B2-24-4・HCOOH投与群のマウス(#4)及びHCQ投与群のマウス(#14)の糸球体におけるC3の沈着を示す写真である。図10Gは、生理食塩水(saline)投与群のマウス(#1)の腎組織切片の染色写真を示している。生理食塩水(saline)投与群のマウス(#1)の腎組織切片において、びまん性のメサンギウム増殖及び管内増殖等の活動性糸球体腎炎の所見が認められた。図10Hは、B2-24-4-5A・HCOOH投与群のマウス(#1)の腎組織切片の染色写真を示している。B2-24-4-5A・HCOOH投与群のマウス(#1)の腎組織切片において、局所的なメサンギウム細胞・基質の増加のみが認められた。図１０B、１０C及び１０Dのプロットは、各個体のデータ、各太線は、各群データの平均値、各エラーバーは、各群データの標準誤差を表している。図１０Eと図１０Fのスケールバーは100 μmを表している。
　図10Aから図10Hから明らかな通り、B2-24-4-5A・HCOOH投与群又はB2-24-4・HCOOH投与群では対照の生理食塩水(saline)投与群又はHCQ投与群に比べて、生存率の延長、血清尿素窒素値の増加の抑制、血清クレアチニン値の増加の抑制、尿アルブミン値の増加の抑制、糸球体におけるIgGの沈着の抑制、糸球体におけるC3の沈着の抑制、ループス腎炎の活動性の顕著な低下が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000108
　対照の生理食塩水(saline)投与群では腎炎の活動性に個体差があった一方で、B2-24-4-5A・HCOOH投与群の多くでは糸球体腎炎のみならず、尿細管間質炎も改善していた。
実施例１７：B2-24-4-5A・HCOOHを投与したNZBWF1マウスにおける脾臓組織の解析
　実施例１６において取得した脾臓の重量と脾細胞数を解析した。脾臓の重量は図11Aに、脾細胞数は図11Bに示している。
　B2-24-4-5A・HCOOH投与群における脾臓重量は、生理食塩水(saline)投与群及びHCQ投与群における脾臓重量よりも有意に低かった。B2-24-4-5A・HCOOH投与群における脾細胞数は、生理食塩水(saline)投与群及びHCQ投与群における脾細胞数よりも有意に少なかった。図11A及び11Bから明らかな通り、B2-24-4-5A・HCOOH投与群では対照の生理食塩水(saline)投与群及びHCQ投与群に比べて、脾臓の腫大の抑制が認められた。
実施例１８：B2-24-4-5A・HCOOHを投与したNZBWF1マウスにおける脾臓の解析
　実施例１６において取得した脾臓をスライドガラスで磨り潰して脾細胞を調製し、標識抗体で染色した。使用した標識抗体は、FITC標識抗CD11b抗体、FITC標識抗CD3抗体、FITC標識抗CD62L抗体、FITC標識抗B220抗体、FITC標識抗CD71抗体、PE標識抗CD11c抗体、PE標識抗Gr-1抗体、PE標識抗CD8抗体、PE標識抗CD44抗体、PE標識抗CD69抗体、PE標識抗CD21抗体、PE標識抗CD86抗体、PE標識抗Ter-119抗体、PE-Cy7標識抗CD23抗体、APC標識抗F4/80抗体、APC標識抗Ly-6G抗体、APC標識抗CD4抗体、APC標識抗B220抗体、APC標識抗CD19抗体、APC標識抗CD11c抗体又はAPC標識抗PDCA-1抗体である。20分後、FACSバッファーで細胞を洗浄し、25μg/mLの7-アクチノマイシンDを含む200μL のFACSバッファーでそれぞれの細胞を懸濁した。細胞の蛍光強度を、フローサイトメトリーで分析した。フローサイトメトリーの測定は、FACSCantoTMII(Becton Dickinson社製)で行い、データをFlowJoソフトフェア(Tree Star社製)で解析し、脾臓中における各種細胞の割合を算出した。結果を図12(A)-(E)、図13(A)-(E)、及び図14(A)-(E)に示す。
　B2-24-4-5A・HCOOH投与群では、生理食塩水(saline)投与群及びHCQ投与群に比べて、形質細胞様樹状細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞及びナイーブT細胞の割合の増加、好中球、赤芽球、活性化T細胞、Memory T細胞及びCD69陽性活性化B細胞の割合の減少が認められた。従って、B2-24-4-5A・HCOOHの投与によって、全身性エリテマトーデスの発症に伴う炎症病態が改善していた。
実施例１９：micro RNA刺激によるIFN-αの産生に対する解析
　マウスFlt-3リガンド誘導性樹状細胞（FLDC）におけるB2-24-4-5A・HCOOHのTLR7刺激性micro RNAに対する阻害効果を検討した。マウス骨髄細胞を100ng/ml Flt-3リガンド、10% (v/v)ウシ胎仔血清(FCS)、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミン酸、2-メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地中で5% (v/v) CO2存在下37℃で8日間培養した。培養によって分化誘導したマウスFLDCを1.0×105 cells/100μLとなるように撒種した。その後、0.1、0.3又は1μMのB2-24-4-5A・HCOOHを添加した。B2-24-4-5A・HCOOHの添加の30分後に、Vehicle又は0.5若しくは2 μg/mlのmicroRNAを含むmicroRNA-cationic liposomal vehicle (DOTAP)複合体を添加した。使用したmicroRNAの配列を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109
　microRNA-DOTAP複合体の添加から24時間後に、培地中に含まれるIFN-αの濃度をELISA法(使用キット：Mouse IFN alpha Platinum ELISA(商品名)、eBioscience社製)を利用して定量した。結果を図15に示す。図15の通り、B2-24-4-5A・HCOOHは、micro RNA刺激によるIFN-αの産生を濃度依存的に抑制した。

Claims (11)

  1. 　下記式(I)又は(II)で表される化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     (式(I)及び(II)中、
    R1は、
    　少なくとも２つの酸素原子を含む、炭素数３～５のアルコキシ基、
    　少なくとも１つのヒドロキシル基を含む、炭素数２～４のアルコキシ基、
    　式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　(式中、R2及びR3は、それぞれ独立して、炭素数1～3のアルキル基である。)で表される基、又は
    　式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　(式中、
    　　Ｃ環は、３～７員の含窒素複素環であり、
    　　R4は、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＦ２－、－ＣＨＦ－、－Ｃ２Ｈ２Ｆ２－又は－ＣＨＦ－Ｘ－ＣＨＦ－で表される基であり、
    　　Ｘは、炭素数1～4のアルキル基である。)
    で表される基である。)
  2. 　R1は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     である、請求項１に記載の化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグ。
  3. 　前記化合物は、下記式(III)から(XIII)のいずれかで表される、請求項１又は２に記載の化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
  4. 　前記薬理学的に許容される塩は、塩酸塩又はギ酸塩である、請求項１から３のいずれかに記載の化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグ。
  5. 　請求項１から４のいずれかに記載の化合物、その薬理学的に許容される塩、又はこれらのプロドラッグを含有する、トール様受容体７(TLR7)活性化阻害剤。
  6. 　TLR7の活性化に起因するNF-κB、IL-6、TNF-α又はIFN-αの産生の抑制作用を有する請求項５に記載のTLR7活性化阻害剤。
  7. 　請求項５又は６に記載のTLR7活性化阻害剤を含有する、TLR7の活性化を伴う疾患の予防又は治療薬。
  8. 　前記TLR7の活性化を伴う疾患が、自己免疫疾患、自己炎症症候群、自己免疫性膵炎、動脈硬化症、敗血症、神経変性疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病、歯周病、ウイルス性免疫不全症、IgA腎症、一次性ネフローゼ症候群、一次性膜性増殖性糸球体腎炎、紫斑病性腎炎、ランゲルハンス細胞組織球症、血球貪食性リンパ組織球症、Rosai-Dorfman病、肥満、2型糖尿病又は潰瘍性大腸炎である請求項７に記載の予防又は治療薬。
  9. 　前記TLR7の活性化を伴う疾患が自己免疫疾患である請求項８に記載の予防又は治療薬。
  10. 　前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、混合性結合組織病、重複症候群、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、成人スティル病、リウマチ熱、悪性関節リウマチ、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、HLA-B27関連リウマチ疾患、IgG4関連症候群、ANCA関連血管炎、血管炎症候群、多発性硬化症、尋常性乾癬、炎症性腸疾患、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症紫斑病、原発性胆汁性肝硬変、原発性胆汁性胆管炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、慢性萎縮性胃炎、急速進行性糸球体腎炎、抗糸球体基底膜腎炎、アジソン病、I型糖尿病、尋常性白斑、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎である請求項９に記載の予防又は治療薬。
  11. 　前記自己免疫疾患が、前記全身性エリテマトーデスである請求項１０に記載の予防又は治療薬。
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