WO2021201657A1 - Epha10 억제제를 포함하는 암 진단, 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Epha10 억제제를 포함하는 암 진단, 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor.
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10 inhibitor
  • the present invention relates to the use of cancer diagnosis through detection of EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10).
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating cancer, comprising administering a composition comprising an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor to a cancer patient.
  • a composition comprising an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor to a cancer patient.
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10 inhibitor
  • Eph (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma) receptors are the largest family of receptor protein tyrosine kinases (RPTKs). Unlike other members of the RPTK family that bind soluble ligands, Eph receptors mediate contact-dependent cell-cell communication through interactions with ligands called ephrins that reside on the surface of adjacent cells. The 14 human Eph receptors are divided into two groups based on the specificity of the ephrins with which they bind.
  • EphA1-A8 and EphA10 interact with five GPI-linked ephrin-A ligands (ephrin-A1-A5), and five EphB receptors (EphB1-B4 and EphB6) interact with three membrane Interacts with transit ephrin-B ligands (ephrin-B1-B3).
  • EphA4 may also bind to the ephrin-B ligand
  • EphB2 may also bind to the ephrin-A5 ligand.
  • Eph receptor binding of ephrin to Eph receptors in cells expressing ephrin and neighboring Eph receptors leads to receptor oligomerization, receptor trans-phosphorylation, activation of tyrosine kinases and recruitment of downstream signaling proteins such as Rho GTPases. It induces forward signal transduction.
  • Eph receptors can induce not only forward signaling, but also reverse signaling by phosphorylation of ephrin and/or recruitment of signaling proteins to ephrin-expressing cells.
  • Eph receptors and ephrins are involved in developmental processes and homeostasis of adult tissues. Thus, aberrant regulation of Eph receptors and ephrin has been implicated in a variety of diseases, including cancer. Interestingly, up-regulation or down-regulation of specific Eph receptors may be associated with tumor promotion or inhibition, respectively, depending on the context. This irregular phenomenon is due to various interactions between phosphorylated receptors and intracellular proteins involved in cell proliferation and survival pathways.
  • EphB6 and EphA10 lack catalytic activity due to the change in essential motifs contributing to the catalytic activity of tyrosine kinase.
  • EphB6 is known to play a dual role as either a tumor suppressor or an oncogene, depending on the cell type and degree of expression. It has been reported that upregulation of EphB6 in breast cancer reduces the expression of matrix metalloproteases (MMP)-7 and MMP-19 and increases the expression of TIMP-2, thereby reducing invasiveness. In breast cancer cells, EphB4 increases invasiveness in the absence of EphB6, but inhibits invasiveness in the presence of EphB4 and EphB6.
  • MMP-7 and MMP-19 matrix metalloproteases
  • EphB6 potentiates tumor initiation, promotes maintenance of tumor initiating cell (tumor stem cell) populations and increases drug sensitivity.
  • EphB6 overexpression with APC gene mutation in colonic epithelial cells increases proliferation, invasion and metastasis.
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2008-0040631 discloses a composition and method for treating a disease related to ephrin signaling with cupredoxin, and relates to a cupredoxin that interferes with the ephrin signaling system. It provides a composition or method for inhibiting cancer cell growth in a mammal using
  • the present inventors selected malignant tumors with high EphA10 expression using the The Cancer Genome Atlas (TCGA) database, and analyzed the carcinogenic association of EphA10 targeting difficult-to-treat pancreatic cancer.
  • the oncogenic phenotype according to EphA10 knockdown and overexpression was analyzed in cultured pancreatic cancer cell lines and xenograft mouse models thereof, and the role of EphA10 in the expression of invasiveness and invasiveness of gelatin soluble enzymes was evaluated.
  • the effect of EphA10 expression on the activation of signaling proteins involved in proliferation, survival, adhesion and invasion was analyzed.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that EphA10 is an important target for the diagnosis and treatment of pancreatic cancer.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an EphA10 inhibitor.
  • an object of the present invention is to provide a use for diagnosing cancer by detecting EphA10.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer comprising administering a composition comprising an EphA10 inhibitor to a cancer patient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor.
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10 inhibitor
  • the EphA10 inhibitor may be an inhibitor of EphA10 expression or function.
  • the EphA10 expression inhibitor may be any one or more selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, miRNAs, siRNAs, and shRNAs that specifically bind to a gene encoding EphA10.
  • the EphA10 function inhibitor may be a neutralizing antibody of the EphA10 polypeptide that specifically binds to the EphA10 polypeptide and inhibits the cancer function.
  • the cancer may be any one or more selected from the group consisting of breast cancer, bile duct cancer, lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, stomach cancer and thyroid cancer.
  • the cancer may be invasive carcinoma.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing cancer comprising an agent detecting EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10).
  • the present invention also provides a kit for diagnosing cancer comprising the composition for diagnosing cancer.
  • the present invention provides an information providing method for diagnosing cancer, comprising measuring the expression level of EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) in a sample isolated from an individual.
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10
  • the present invention provides a cancer prevention or treatment method comprising administering a composition comprising an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor to a cancer patient.
  • a composition comprising an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor to a cancer patient.
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10 inhibitor
  • the EphA10 inhibitor may be an inhibitor of EphA10 expression or function.
  • the EphA10 expression inhibitor may be any one or more selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, miRNAs, siRNAs, and shRNAs that specifically bind to a gene encoding EphA10.
  • the EphA10 function inhibitor may be a neutralizing antibody of the EphA10 polypeptide that specifically binds to the EphA10 polypeptide and inhibits the cancer function.
  • the cancer may be any one or more selected from the group consisting of breast cancer, bile duct cancer, lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, stomach cancer and thyroid cancer.
  • the cancer may be invasive carcinoma.
  • diagnosis of the present invention in a broad sense, means judging the actual condition of a patient's disease in all aspects.
  • the content of the judgment is the disease name, etiology, disease type, severity, detailed mode of the disease, and the presence or absence of complications.
  • Diagnosis in the present invention is preferably to determine the risk of cancer and its development.
  • RNA short interfering RNA
  • siRNA short interfering RNA
  • the "shRNA (short hairpin RNA)" of the present invention is a single-stranded RNA, and is divided into a stem part forming a double-stranded part by hydrogen bonding and a loop part having a ring shape, and eventually is a protein such as Dicer. It is processed by siRNA and converted to siRNA to perform the same function as siRNA.
  • miRNA of the present invention is also called “microRNA”, it is a small non-coding RNA molecule known to play an important role in the transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression, and in the case of humans, there are more than 1,000 miRNAs in the genome. is known to be
  • the "antisense oligonucleotide” of the present invention is a short-length DNA synthetic strand (or DNA analog) that is antisense (or complementary) to a specific DNA or RNA target, and is used to achieve gene-specific inhibition in vivo as well as in vitro.
  • used for Antisense oligonucleotides have been proposed to block the expression of proteins encoded by DNA or RNA targets by binding to the target and stopping expression at the stage of transcription, translation or splicing.
  • Antisense oligonucleotides have also been used successfully in cell culture and in animal models of disease. Another modification of antisense oligonucleotides to render the oligonucleotides more stable and resistant to degradation is known to those skilled in the art.
  • antisense oligonucleotides include double- or single-stranded DNA, double- or single-stranded RNA, DNA/RNA hybrids, DNA and RNA analogs and oligonucleotides with base, sugar or backbone modifications. Oligonucleotides are modified by methods known in the art to increase stability and increase resistance to nuclease degradation. These modifications include, but are not limited to, modifications of the oligonucleotide backbone, modifications of sugar moieties, or modifications of bases, known in the art.
  • a “primer” of the present invention is a single-stranded oligo capable of serving as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (i.e., four different nucleoside triphosphates and a polymerase) in a suitable buffer at a suitable temperature.
  • suitable conditions i.e., four different nucleoside triphosphates and a polymerase
  • a suitable length of a primer varies with various factors, such as temperature and the use of the primer, but is typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form sufficiently stable hybrid complexes with the template.
  • the sequence of the primer does not need to have a completely complementary sequence to a partial sequence of the template, and it is sufficient if it hybridizes with the template and has sufficient complementarity within a range capable of performing an intrinsic function of the primer. Therefore, the primer in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the above-described nucleotide sequence as a template, and it is sufficient if it has sufficient complementarity within a range that can hybridize to this gene sequence and act as a primer.
  • the design of such a primer can be easily performed by those skilled in the art with reference to the above-described nucleotide sequence, for example, using a primer design program (eg, PRIMER 3 program).
  • the "probe” of the present invention means a natural or modified monomer or linear oligomer of linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, capable of specifically hybridizing to a target nucleotide sequence, naturally occurring or artificially synthesized.
  • the probe of the present invention is preferably single-stranded and is an oligodeoxyribonucleotide.
  • EphA10 is very low or not expressed in most human adult tissues. As described above, studies on the upregulation and oncogenic role of EphA10 in pancreatic cancer are scarce. We analyzed EphA10 mRNA levels in 34 cancer types using the TCGA database, and found that in 17 cancer types, including breast, prostate, colon, stomach, pancreatic, or lung cancer, EphA10 mRNA levels were higher than the average of all cancer tissues. It was confirmed that high EphA10 mRNA levels were shown. By analyzing the mRNA data of tumor tissue and normal tissue in 9 cancer types among 17 cancer types with high EphA10 expression, EphA10 mRNA levels in tumor tissues compared to normal tissues in 7 cancer types out of 9 cancer types were analyzed. was found to be higher (Example 1). Therefore, it could be inferred that the expression of EphA10 is important for cancer development, growth and metastasis in the seven cancer types.
  • pancreatic cancer Although high incidence pancreatic cancer has a 5-year survival rate of 37.4% at the local stage, only 10.3% of patients are diagnosed at the local stage because local pancreatic cancer has no discernable symptoms. Diagnosis of pancreatic cancer at the regional or distant stage is more frequent (up to 59%); However, at the local stage, the 5-year survival rate is 12.4%, and at the distant stage, it is even lower to 2.9%. Therefore, along with early diagnosis, the development of therapies to suppress the spread of pancreatic cancer is important for patient treatment.
  • EphA10 mRNA and polypeptide were higher in Panc-1, MIA PaCa-2 and AsPC-1 pancreatic cancer cells compared to breast cancer MDA-MB-436 cells and melanoma MDA-MB-435 cells.
  • EphA10 mRNA GenBank NM_001099439.2
  • Soluble EphA10 mRNA encoding GenBank NM_173641.2
  • EphA10 In western blot analysis of pancreatic cancer cells, an antibody recognizing the N-terminal region of EphA10 detected a strong signal at 130 kDa and a very weak signal at 97 kDa ( FIG. 1D ). Since the mature EphA10 polypeptide lacking the signal peptide has a calculated molecular weight of 106 kDa and contains two potential glycosylation sites at residues Asn311 and Asn486, the 130 kDa band was expected to correspond to the full-length EphA10 polypeptide. Soluble EphA10 has been reported to be detected at approximately 40 kDa in mammary epithelial MCF-10A cells, but not in pancreatic cancer cells tested.
  • EphA10 knockdown decreased all proliferation, migration and adhesion
  • EphA10 overexpression increased all proliferation, migration and adhesion.
  • the mass and volume of the xenograft tumor and the number of Ki-67-positive proliferating cells were higher than in the control group, and in the case of EphA10-silence, the xenograft tumor was higher than that of the control group. It was confirmed that it decreased compared to
  • pancreatic cancer Tumor invasion and metastasis are closely related. In vivo, the extracellular matrix of tumor cells and host cells is involved in the migration, proliferation and survival of tumor cells.
  • pancreatic cancer One of the main characteristics of pancreatic cancer is that it rapidly develops localized tumors following initial systemic spread. Therefore, identification of target molecules involved in pancreatic cancer cell invasion and metastasis is clinically important.
  • EphA10 overexpression increases invasion of MIA PaCa-2 cells; On the other hand, EphA10 knockdown was shown to decrease invasion. Since type IV collagen is a major component of the basement membrane, it is essential for the stability of the basement membrane.
  • MMP-2 and MMP-9 the gelatin soluble MMPs in solid human tumors, degrades type IV collagen in the basement membrane and is involved in basement membrane loss, invasion and metastasis of cancer cells.
  • EphA10 expression in MIA PaCa-2 cells is related to gelatin degradation and MMP-9 induction.
  • EphA10 Activation of MAP kinases such as ERK and JNK and activation of AKT promote cell proliferation, survival and migration.
  • FAK is involved in cell adhesion, migration and invasion.
  • NF- ⁇ promotes invasion and metastasis by promoting cell proliferation, epithelial mesenchymal metastasis, and basement membrane disruption.
  • EphA10 has no catalytic activity, it has been shown to enhance phosphorylation of signal proteins including ERK, JNK, AKT, FAK and NF- ⁇ as well as tyrosine phosphorylation of intracellular proteins.
  • ERBB3 Catalytically inactive ERBB3 (HER3) binds to other active members of the ERBB family, such as ERBB2 (HER2) and activates downstream oncogenic signaling pathways.
  • Another catalytically defective RPTK, PTK7 binds to active KDR or FGFR1 to activate angiogenesis or oncogenic signaling pathways, respectively.
  • Eph receptors often form heterodimers with other members of the Eph receptor family.
  • EphA10 interacts with EphA7, and the EphA10-EphA7 complex induces the expression of tumor-promoting genes.
  • EphA10 binds to the Eph receptor family or other RPTK family members with catalytic activity to promote phosphorylation of downstream oncogenic signal proteins to induce the expression of oncogenes.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor.
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10 inhibitor
  • the EphA10 inhibitor may be an inhibitor of EphA10 expression or function.
  • the EphA10 expression inhibitor may be any one or more selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, miRNAs, siRNAs, and shRNAs that specifically bind to a gene encoding EphA10.
  • the EphA10 expression inhibitor may be an shRNA that specifically binds to a gene encoding EphA10.
  • the EphA10 function inhibitor may be a neutralizing antibody of the EphA10 polypeptide that specifically binds to the EphA10 polypeptide and inhibits the cancer function.
  • the cancer may be any one or more selected from the group consisting of breast cancer, bile duct cancer, lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, gastric cancer and thyroid cancer.
  • the cancer may be pancreatic cancer.
  • the cancer may be invasive carcinoma.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in various parenteral formulations.
  • one or more buffers eg, saline or PBS
  • antioxidants e.g, bacteriostatic agents, chelating agents (eg, EDTA or glutathione), fillers, bulking agents, binders, adjuvants (eg, aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents, wetting agents, disintegrating agents or surfactants, diluents or excipients.
  • chelating agents eg, EDTA or glutathione
  • fillers eg, bulking agents, binders, adjuvants (eg, aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents, wetting agents, disintegrating agents or surfactants, diluents or excipients.
  • adjuvants eg, aluminum hydroxide
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized formulations or suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, etc. may be used.
  • composition of the present invention may be administered parenterally, and when administered parenterally, it may be formulated according to a method known in the art in the form of an injection for intraperitoneal, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebrovascular injection.
  • an injection for intraperitoneal, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebrovascular injection can be administered parenterally, and when administered parenterally, it may be formulated according to a method known in the art in the form of an injection for intraperitoneal, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebrovascular injection.
  • suitable carriers include, but are not limited to, water, ethanol, polyols (eg, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), mixtures thereof, and/or a solvent or dispersion medium containing vegetable oil.
  • suitable carriers include Hanks' solution, Ringer's solution, PBS containing triethanolamine or sterile water for injection, isotonic solutions such as 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose. .
  • the injection may further include various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like.
  • various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like.
  • the injection may further contain isotonic agents such as sugars or sodium chloride.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • a pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level refers to the patient's disease type, severity, drug activity, drug sensitivity, and administration time. , route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concomitant drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient as a single dose, and may be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered for a long period of time. .
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of disease.
  • a daily dose it can be administered in one to several divided doses so that it is preferably administered in an amount of 0.01 to 50 mg, more preferably 0.1 to 30 mg per 1 kg of body weight per day based on the EphA10 inhibitor when administered parenterally.
  • the dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.
  • the present invention may also provide a composition for diagnosing cancer comprising an agent for detecting EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10).
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10
  • the detecting agent may be a primer or probe that specifically binds to the EphA10 protein or a gene encoding the same.
  • the present invention may provide a kit for diagnosing cancer comprising the composition for diagnosing cancer.
  • the kit may additionally include agents commonly used for detecting proteins in the art.
  • the present invention may provide an information providing method for diagnosing cancer, comprising measuring the expression level of EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) in a sample isolated from a subject.
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10
  • the subject may be a mammal, including a human, and the sample may be urine, blood, body fluid, or cells.
  • the present invention may provide a cancer prevention or treatment method comprising administering a composition comprising an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor to a cancer patient.
  • a cancer prevention or treatment method comprising administering a composition comprising an EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) inhibitor to a cancer patient.
  • EphA10 erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10 inhibitor
  • EphA10 can be used for the diagnosis of pancreatic cancer as it is positively associated with the tumorigenic potential of pancreatic cancer cells.
  • the composition comprising the EphA10 inhibitor of the present invention can significantly reduce the proliferation, migration, adhesion, or invasion of pancreatic cancer cells, so it is effective in preventing or treating pancreatic cancer.
  • EphA10 mRNA levels were examined in tumor tissues of 34 cancer types in the TCGA (The Cancer Genome Atlas) database. The horizontal dotted line represents the overall mean value (12.33) of EphA10 mRNA levels of all cancer types tested.
  • EphA10 mRNA levels were compared in 9 cancer types, in which normal (N) and tumor (T) tissues were comparable among 17 cancer types showing higher-than-average EphA10 mRNA levels. *P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001 for normal tissue.
  • C and D EphA10 expression levels were evaluated in Panc-1, MIA PaCa-2 and AsPC-1 pancreatic cancer cells.
  • TCGA cancer Type Abbreviations for TCGA: ACC, adrenocortical carcinoma; BLCA, bladder urocarcinoma; BRCA, breast invasive carcinoma; CCA, cholangiocarcinoma; CESC, cervical squamous cell carcinoma; COAD, colon adenocarcinoma; DLBC, Lymphoid Neoplasia Diffuse Large B-Cell Lymphoma; ESCA, esophageal carcinoma; GBM, glioblastoma multiforme; HNSC, squamous cell carcinoma of the head and neck; KICH, renal chromophobe cell carcinoma; KIRC, renal clear cell carcinoma; LGG, brain low-grade glioma; LIHC, hepatocellular carcinoma; LUAD, lung adenocarcinoma; LUSC, lung squamous cell carcinoma; MESO, mesothelioma; NB, neuroblastoma; OV, ovarian se
  • FIG. 2 shows the reduction of oncogenic properties by EphA10 knockdown in pancreatic cancer cell lines MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells.
  • EphA10 expression levels in MIA PaCa-2 (A) and AsPC-1 (B) cells infected with lentiviruses expressing control (KD vector) and EphA10 knockdown shRNAs (EphA10-KD-341 and EphA10-KD-387) were measured. Analyzed by Western blotting. Proliferation of control and EphA10 knockdown MIA PaCa-2 (C) and AsPC-1 (D) cells was analyzed for 3 days.
  • Control and EphA10 knockdown MIA PaCa-2 (E) and AsPC-1 (F) cells were added and cell adhesion was analyzed 1 hour later.
  • Control and EphA10 knockdown MIA PaCa-2 (G) and AsPC-1 (H) cells were added and cell migration was analyzed 24 hours later.
  • Each bar represents the mean ⁇ standard deviation from three independent experiments. *P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001 for day 0 (C and D) or control vectors (E-H).
  • FIG. 3 shows an increase in oncogenic properties by EphA10 overexpression in MIA PaCa-2 cells.
  • EphA10 expression levels in pancreatic cancer MIA PaCa-2 cells infected with control (OE Vector) or lentivirus expressing EphA10-FLAG were analyzed by western blotting.
  • Proliferation (B), adhesion (C) and migration (D) of control and EphA10-overexpressing MIA PaCa-2 cells were analyzed using the same method as in knockdown cells.
  • Each bar represents the mean ⁇ standard deviation from three independent experiments. *P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001 for day 0 (B) or control vectors (C and D).
  • FIG. 4 shows the effect of EphA10 overexpression and knockdown on tumor growth in a xenograft model.
  • Mice were injected with MIA PaCa-2 cells mock-transfected or overexpressed (EphA10-FLAG) and silenced (EphA10-KD-341 and -387) of EphA10.
  • A Tumor volume was measured for 6 weeks.
  • B Shows a photograph of a tumor obtained from a mouse 6 weeks after injection and a graph of the weight (g).
  • FIG. 5 shows the effect of EphA10 overexpression and knockdown on Ki-67 and MMP-9 expression in a xenograft model.
  • MIA PaCa-2 cells were infected with control (OE vector) and EphA10 overexpressing (EphA10-FLAG) lentiviruses (left panel), control (KD vector) and EphA10 knockdown shRNAs (EphA10-KD-341 and -387). Infection with lentivirus (right panel).
  • OE vector EphA10 overexpressing
  • KD vector EphA10-FLAG lentiviruses
  • KD vector EphA10 knockdown shRNAs
  • C The level of secreted gelatin soluble MMP (MMP-2 and MMP-9) and the level of EphA10 were analyzed by gelatin zymography and Western blotting in the culture medium and cell lysate, respectively.
  • the medium of HT-1080 cells was used as a positive control to indicate the expected localization of MMP-2 and MMP-9. Each bar represents the mean ⁇ standard deviation from three independent experiments. *P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001 for vector control.
  • MIA PaCa-2 cells A and control (KD) infected with lentivirus that control (OE vector) and EphA10 overexpression (EphA10-FLAG) tyrosine phosphorylation of cellular proteins and phosphorylation of ERK, JNK, AKT, FAK and NF- ⁇ vector
  • MIA PaCa-2 cells infected with lentivirus expressing EphA10 knockdown shRNAs (EphA10-KD-341 and -387) (B) were examined by Western blotting.
  • RNA-seq data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) database were used to analyze EphA10 mRNA levels in various cancer types.
  • HEK 293 cells expressing the SV40 T antigen were provided by Dr. Jongbae Park (National Cancer Center, Ilsan, Korea).
  • HEK293T cells were grown in DMEM medium containing 10% bovine serum (BS) (HyClone, Logan, UT, USA), and all other cells were grown in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ ml penicillin and 100 ⁇ g/ml streptomycin were supplemented. All cells were maintained at 37[deg.] C. in 5% CO2.
  • BS bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin 100 U/ ml bovine serum
  • All cells were maintained at 37[deg.] C. in 5% CO2.
  • RNA isolation total RNA was isolated from cultured cells using TRIzol reagent (Ambion, Carlsbad, CA, USA). First strand cDNA was synthesized from total RNA using the oligo(dT)15 primer and the AMV RT system (Promega, Madison, WI, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the primer pair sequences used for reverse transcription (RT)-PCR analysis were 5'-GAGTGAGGTCCCAGAATCCGTTGG-3' for human EphA10 cDNA (5251-5275 of GenBank NM_001099439.1, SEQ ID NO: 1) and 5'-GGCTTGCAGCCCACCTCTGTC-3' (GenBank) 5389-5369 of NM_001099439, SEQ ID NO: 2), 5'-ACTGCTTAGCACCCCTGGCCA-3' for human GAPDH cDNA (488-508 of GenBank BC023632, SEQ ID NO: 3) and 5'-TTGGCAGTGGGGACACGGAAG-3' (740- of GenBank BC023632) 720, SEQ ID NO: 4) (Table 1).
  • PCR amplification conditions were as follows: 30 cycles of initial denaturation at 94 °C for 30 s and denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 55 °C for 60 s and extension at 72 °C for 30 s. PCR products were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • RNA-seq count matrix 20165 samples from the TCGA database was obtained from the UCSC Xenabrowser (https://xenabrowser.net/) of Genomic Data Commons (GDC; https://gdc.cancer.gov/).
  • Gene expression was quantified as fragments per kilobase of transcript per million mapped reads upper quartile (FPKM-UQ), an RNA-Seq-based expression normalization method. EphA10 mRNA levels were plotted as log2 (FPKM-UQ + 1). Pairwise analyzes were performed for EphA10 mRNA levels for certain types of cancer for which mRNA data from normal and tumor tissues were available.
  • mRNA data were available in pairs of normal and tumor tissues in 9 of 17 cancer types with high paired EphA10 mRNA levels ( FIG. 1B ).
  • EphA10 mRNA levels were higher in tumor tissues than in normal tissues in 7 cancer types, including breast invasive carcinoma, cholangiocarcinoma, lung adenocarcinoma, pancreatic adenocarcinoma, prostate adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, and thyroid carcinoma among the above 9 cancer types ( 1B).
  • EphA10 expression is upregulated in certain cancer types.
  • expression of EphA10 was higher in pancreatic carcinoma cell lines such as AsPC-1 and MIA PaCa-2 cell lines compared to breast cancer MDA-MB-436 and melanoma MDA-MB-435 cell lines, which are known to express EphA10 at the mRNA and protein level. It was confirmed that it was high (FIGS. 1C and D).
  • EphA10 was knocked down to construct pancreatic carcinoma cells with greatly reduced expression of human EphA10 polypeptide.
  • EphA10 knockdown vectors (pLKO.1-shRNA-EphA10-341 and 387) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). EphA10 knockdown lentivirus was prepared with 10 ⁇ g of EphA10 knockdown vector (pLKO.1-shRNA-EphA10-341 or 387) or 10 ⁇ g of knockdown control vector (pLKO.1-control) and 7.4 ⁇ g of packaging vector (psPAX2) (Addgene, Cambridge, MA, USA) and 2.6 ⁇ g of the envelope vector (pMD2.G) (Addgene) were generated in HEK293T cells by co-transfection. Pancreatic cancer cells infected with EphA10 knockdown lentivirus were cultured in a medium containing 1 ⁇ g/ml puromycin for 14 days, and puromycin-resistant EphA10-knockdown cells were mixed.
  • Cell proliferation assay was performed by adding DMEM supplemented with 10% FBS to a flat-bottomed 96-well cell culture plate (SPL, Pocheon, Korea) in cells (0.1 mL, 3 ⁇ 104 cells/mL) and cultured for 1 to 3 days. .
  • SPL phosphate buffered saline
  • cells were washed with phosphate buffered saline (PBS; 8.06 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.6 mM KCl; pH 7.4) and 0.1 ml DMEM containing 0.5 mg/ml MTT. was added and incubated for 4 hours.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cells were washed with PBS and solubilized with 0.1 ml DMSO. Absorbance was measured at 565 nm using a SpectraMax M3 microplate reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).
  • the isolated cell suspension (1 ⁇ 10 4 cells/0.1 ml) was loaded into a 96-well plate coated with rat tail type I collagen (1 ⁇ g/well) and incubated for 90 minutes. Then, cells were fixed with 3.7% paraformaldehyde in PBS and stained with 0.005% crystal violet. Stained cells were lysed with 1% SDS and absorbance was measured at 600 nm.
  • the chemotactic migration assay was performed by transwelling an isolated cell suspension (1 ⁇ 10 5 cells/0.2 ml) into transwells (Corning, Tewksbury, MA, USA) whose lower surface was pre-coated with 10 ⁇ l of 0.1% gelatin. was loaded into the upper compartment of The lower compartment of each well was filled with 0.6 ml DMEM with 10% FBS as a chemoattractant. The chamber was incubated at 37° C. for 24 hours. Cells that migrated to the lower surface of the transwell were fixed with 3.7% paraformaldehyde in PBS for 15 minutes and stained with 0.005% crystal violet for 5 minutes. After removing the cells remaining on the upper surface of the transwell with a cotton swab, the cells stained on the lower surface were solubilized with 1% SDS and absorbance was measured at 600 nm.
  • EphA10 was knocked down in pancreatic cancer MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells cultured by infection with a lentivirus (EphA10 shRNA) encoding EphA10 shRNA (EphA10-KD-341 and -387).
  • EphA10 knockdown by EphA10-KD-341 and -387 reduced EphA10 expression in MIA PaCa-2 cells by 30% and 10%, respectively, and by 20% and 5% in AsPC-1 cells, respectively (Fig. 2A and B) ).
  • EphA10 knockdown by EphA10-KD-341 and -387 reduced cell proliferation in MIA PaCa-2 cells by 78% and 56% and in AsPC-1 cells by 75% and 65%, respectively, compared to the control vector at day 3 of culture. decreased (FIGS. 2C and D).
  • EphA10 knockdown reduced cell adhesion to collagen-coated surfaces to 67-78% in MIA PaCa-2 cells and 70-80% in AsPC-1 cells compared to control cells (Fig. 2E,F). ).
  • EphA10 knockdown reduced cell migration measured using a gelatin-coated Boyden chamber to 70-81% in MIA PaCa-2 cells and 55-81% in AsPC-1 cells (Fig. 2G and H).
  • EphA10 knockdown reduced proliferation, migration and adhesion of MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells, substantially reducing the tumorigenic potential of pancreatic cancer cells.
  • pancreatic carcinoma cells overexpressing human EphA10 polypeptide. wanted to build.
  • EphA10 cDNA encoding the EphA10 polypeptide and a C-terminal FLAG-tag were amplified by PCR.
  • the DNA product was synthesized using the oligo(dT)15-prime cDNA mixture of breast cancer MDA-MB-436 cells as a template and PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TaKaRa, Kusatsu, Japan).
  • the upstream primer used for this (5'-CCCAAGCTTGCCACCATGGAGACCTGCGCCGG-3', SEQ ID NO: 5) contains 20 nucleotides (84-103 of NM_001099439.1) around the HindIII site (underlined) and the start codon (bold) of the EphA10 cDNA. .
  • the downstream primer (5'-CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCACCTGCACCCCGGGGCCC-3', SEQ ID NO: 6) is 19 nucleotides before the stop codon of EphA10 cDNA (3110-3092 of NM_001099439.1), FLAG-tag coding sequence (slope), stop codon (bold) and XhoI sites (underlined).
  • the PCR product was digested with HindIII and XhoI restriction enzymes, and inserted between the HindIII sites of pcDNA3.1, a mammalian expression vector.
  • the product, pcDNA3.1-EphA10-FLAG was sequenced in both directions to avoid PCR errors.
  • a DNA fragment containing the EphA10-FLAG-coding sequence was amplified by PCR using the pcDNA3.1-EphA10-FLAG vector and PrimeSTAR GXL DNA polymerase as templates.
  • the upstream primer (5'-GATCTCGACGCGGCCGCTACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCT-3', SEQ ID NO: 7) contains a NotI site (underlined) in pHRST-IRES-eGFP (nt. 2839-2855) and pcDNA3.1 (nt. 866-893) ; slope) of 28 nucleotides.
  • the downstream primer (5'-GGGCGGAATTGGATCCGAAGGCACAGTCGAGGCTGATCAG-3', SEQ ID NO: 8) was 16 nucleotides containing a BamHI site (underlined) in pHRST-IRES-eGFP (nt. 2871-2856) and 24 nucleotides of pcDNA3.1 (nt. .1037-1014; slope).
  • the PCR product was ligated to the NotI and BamHI sites of the pHRST-IRES-eGFP vector using the In-fusion HD cloning kit (Takara).
  • the product, pHRST-EphA10-FLAG-IRES-eGFP was sequenced in both directions to avoid PCR errors.
  • EphA10-expressing lentiviruses were prepared with 13 ⁇ g of EphA10 overexpression vector (pHRST-EphA10-FLAG-IRES-eGFP) or 10 ⁇ g of overexpression control vector (pHRST-IRES-eGFP) and 7.4 ⁇ g of packaging vector (psPAX2) (Addgene, Cambridge, MA, USA) and 2.6 ⁇ g of the envelope vector (pMD2.G) (Addgene) were generated in HEK293T cells by co-transfection. Pancreatic cancer cells infected with EphA10-overexpressing lentivirus were used for oncogenicity assays.
  • EphA10-FLAG lentivirus infection in MIA PaCa-2 cells increased the EphA10 level to 200% (FIG. 3A).
  • Overexpression of EphA10 increased cell growth by 152% and 176% on days 1 and 2 of culture, respectively, compared to the control vector ( FIG. 3B ).
  • EphA10 overexpression also increased adhesion and migration of MIA PaCa-2 cells by 148% and 234%, respectively (Fig. 3C,D).
  • mice of 5 weeks of age were transplanted into the back (1 ⁇ 10 6 cells/site). Tumor volumes were measured weekly using calipers (length ⁇ width ⁇ depth/2). All animal experiments were conducted in accordance with the operating guidelines of the National Cancer Center Laboratory Animal Laboratory.
  • the tumor volume was significantly increased by EphA10 overexpression and significantly decreased by EphA10 knockdown compared with the mock control (Fig. 4A).
  • animals were sacrificed and tumor weights were recorded.
  • the weight of the tumor mass increased to 260% in tumors implanted with EphA10 overexpressing cells and decreased to 4-36% in tumors implanted with EphA10 silenced cells compared with the sham control (Fig. 4B).
  • the xenografted tumor was recovered, the tumor weight was measured, and a paraffin tissue block was prepared. Specifically, the tumor tissue was fixed in 10% neutral buffered formalin (Sigma-Aldrich) for 15 h and processed in a HistoCore Pearl tissue processor (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany) with 70% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol, xylene and treated with paraffin.
  • 10% neutral buffered formalin Sigma-Aldrich
  • HistoCore Pearl tissue processor Leica Biosystems, Wetzlar, Germany
  • Tumor tissue was embedded in paraffin, cut into 4 ⁇ m sections with a rotary microtome micron HM355S (Thermo Scientific, Walldorf, Germany), and mounted on silane-coated glass slides (MUTO PURE CHEMICALS, Tokyo, Japan).
  • Sections were then washed with PBS, incubated with the HRP polymer conjugate for 15 min at room temperature, and stained with DAB Chromogen (ScyTek Laboratory, West Logan, USA) for 5 min at room temperature. To detect cell morphology in xenograft tumor tissue, deparaffinized sections were stained with hematoxylin and eosin (H & E).
  • EphA10 staining confirmed that the level of EphA10 was elevated in EphA10-FLAG tumors and decreased in EphA10-KD-341 and -387 tumors compared to the sham control ( FIG. 5 ).
  • Ki-67 staining a proliferation marker, was stronger in EphA10-overexpressing tumors and weaker in EphA10-knockdown tumors compared to control tumors (Fig. 5).
  • EphA10 is involved in the invasiveness of pancreatic cancer cells, whether a gelatin lytic enzyme is involved in EphA10-dependent cell invasion, and the gelatinase involved in EphA10-mediated gelatine degradation, MIA PaCa- overexpressing or knocking down EphA10 Chemotactic invasion assay and fluorescent gelatin degradation assay were performed in 2 cells.
  • the chemotactic invasion assay was the chemotactic shift of ⁇ Example 2>, except that 25 ⁇ g of growth factor-reduced Matrigel (Corning) was coated on the upper surface of the transwell and incubated for 48 hours. The same analysis was performed.
  • EphA10 significantly increased the invasion of MIA PaCa-2 cells to 306% of the control group;
  • knockdown of EphA10 significantly reduced invasion to 71-81% of the control group (Fig. 6A).
  • EphA10 overexpression increased the degradation of FITC-labeled gelatin to 171% of the control group, and EphA10 knockdown reduced gelatin degradation to 23-53% of the control group ( FIG. 6B ).
  • a culture medium of MIA PaCa-2 cells overexpressing or knocking down EphA10 was obtained and analyzed by gelatin zymography.
  • MMP-9 secretion was significantly increased by EphA10 overexpression and decreased by EphA10 knockdown, whereas MMP-2 secretion was not detected in the culture medium of MIA PaCa-2 cells ( FIG. 6C ).
  • IHC analysis of MIA PaCa-2 xenograft tumors revealed that MMP-9 staining was stronger in EphA10-overexpressing xenograft tumors and weaker in EphA10-knockdown xenograft tumors than mock controls (Fig. 5).
  • EphA10 The role of EphA10 in the activation of cellular oncogenesis-associated signaling proteins
  • EphA10 activates signaling pathways for cell proliferation, survival, migration, adhesion and invasion, thereby increasing tumorigenesis of EphA10-positive cells such as pancreatic cancer.
  • EphA10 can be used for the diagnosis of pancreatic cancer as it is positively associated with the tumorigenic potential of pancreatic cancer cells.
  • the composition comprising the EphA10 inhibitor of the present invention can significantly reduce the proliferation, migration, adhesion, or invasion of pancreatic cancer cells, and thus can be effectively used as a pharmaceutical composition for preventing or treating pancreatic cancer, thereby increasing industrial applicability. Big.
  • SEQ ID NO: 1 shows the forward primer sequence for human EphA10 cDNA.
  • SEQ ID NO: 2 shows the reverse primer sequence for human EphA10 cDNA.
  • SEQ ID NO: 3 shows the forward primer sequence for human GAPDH cDNA.
  • SEQ ID NO: 4 shows the reverse primer sequence for human GAPDH cDNA.
  • SEQ ID NO: 5 shows the upstream primer sequence of the expression vector.
  • SEQ ID NO: 6 shows the downstream primer sequence of the expression vector.
  • SEQ ID NO: 7 shows the upstream primer sequence of the expression vector.
  • SEQ ID NO: 8 shows the downstream primer sequence of the expression vector.

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Abstract

본 발명은 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 검출을 통한 암 진단 용도에 대한 것이다. 또한 본 발명은 암 환자에 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법에 대한 것이다. 상기 EphA10은 췌장암 세포의 종양 형성 가능성과 양성적으로 관련이 있으므로 췌장암 진단에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 EphA10 억제제를 포함하는 조성물의 경우 췌장암 세포의 증식, 이동, 접착 또는 침습을 유의적으로 감소시킬 수 있어 췌장암 예방 또는 치료에 효과적이다.

Description

EPHA10 억제제를 포함하는 암 진단, 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도
본 출원은 2020년 04월 03일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0041158호 를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
또한 본 발명은 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 검출을 통한 암 진단 용도에 대한 것이다.
또한 본 발명은 암 환자에 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법에 대한 것이다.
Eph (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma) 수용체는 수용체 단백질 티로신 키나제(RPTK)의 가장 큰 패밀리이다. 수용성 리간드에 결합하는 RPTK 계열의 다른 구성원과 달리, Eph 수용체는 인접한 세포 표면에 존재하는 에프린(ephrins)으로 불리는 리간드와 상호 작용을 통해 접촉 의존적 세포-세포 통신을 매개한다. 14 개의 인간 Eph 수용체는 그들과 결합하는 에프린의 특이성에 기초하여 2 가지 그룹으로 나뉜다. 9 개의 EphA 수용체(EphA1-A8 및 EphA10)는 5 개의 GPI-연결된 에프린-A 리간드(ephrin-A1-A5)와 상호 작용을 하고, 5 개의 EphB 수용체(EphB1-B4 및 EphB6)는 3 개의 막 통과 에프린-B 리간드(ephrin-B1-B3)와 상호 작용을 한다. 단, EphA4는 에프린-B 리간드와도 결합할 수 있고, EphB2는 에프린-A5 리간드와도 결합할 수 있다. 에프린을 발현하는 세포와 이웃한 Eph 수용체를 발현하는 세포에서 에프린과 Eph 수용체의 결합은 수용체 올리고머화, 수용체 트랜스-인산화, 티로신 키나제의 활성화 및 Rho GTPase와 같은 하류 신호 단백질의 동원을 유도하는 정방향 신호 전달을 유도한다. 또한, Eph 수용체는 정방향 신호전달 뿐 아니라, 에프린-발현 세포에 에프린의 인산화 및/또는 신호 전달 단백질의 동원에 의해 역방향 신호 전달도 유도할 수 있다.
Eph 수용체 및 에프린은 발생 과정 및 성인 조직의 항상성에 관여한다. 따라서 Eph 수용체 및 에프린의 비정상적인 조절은 암을 포함한 다양한 질병에 연루되어 있다. 흥미롭게도, 특정 Eph 수용체의 상향 조절(up-regulation) 또는 하향 조절(down-regulation)은 상황에 따라 각각 종양 촉진 또는 억제와 관련될 수 있다. 이러한 불규칙한 현상은 인산화된 수용체와 세포 증식 및 생존 경로에 관여하는 세포 내 단백질들이 다양한 상호 작용을 하기 때문이다.
Eph 수용체 중 EphB6 및 EphA10은 티로신 키나제의 촉매 활성에 기여하는 필수 모티프가 변화되어 촉매 활성이 결여되어 있다. EphB6는 세포 유형 및 발현 정도에 따라 종양 억제 또는 종양 유전자로서 이중 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 유방암에서 EphB6의 상향 조절은 매트릭스 메탈로 프로테아제(MMP)-7 및 MMP-19의 발현을 감소시키고 TIMP-2의 발현을 증가시켜 침습성을 감소시키는 것으로 보고되었다. 유방암 세포에서 EphB4는 EphB6가 없을 때 침습성을 증가시키지만, EphB4 및 EphB6가 같이 있을 때에는 침습성을 억제한다. 그러나, 삼중 음성 유방암에서 EphB6는 종양 개시를 강화하고 종양 개시세포(종양 줄기세포) 집단의 유지를 촉진하며 약물 감수성을 증가시킨다. 또한, 대장 상피 세포에서 APC 유전자 돌연변이와 함께 EphB6 과발현은 증식, 침윤 및 전이를 증가시킨다.
EphB6과 달리 EphA10은 종양 유전자로만 제안되지만, 종양 유전자로서의 EphA10은 광범위하게 연구되지 않았다. 대한민국 공개특허 제 10-2008-0040631 호는 에프린 신호전달과 관련된 질환을 쿠프레독신으로 치료하기 위한 조성물과 방법에 대한 것으로서, 에프린(ephrin) 신호전달 체계를 간섭하는 쿠프레독신(cupredoxin)을 이용하는 포유동물의 암 세포 성장 저해용 조성물 내지 방법을 제공한다.
그러나, 에프린 수용체, 특히 EphA10와 췌장암과의 상관관계에 대한 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.
이에 본 발명자들은, The Cancer Genome Atlas(TCGA) 데이터베이스를 사용하여 EphA10 발현이 높은 악성 종양들을 선별했으며, 이 중 치료가 어려운 췌장암을 대상으로 EphA10의 발암 연관성을 분석하였다. 배양한 췌장암 세포주 및 이의 이종 이식 마우스 모델에서 EphA10의 녹다운 및 과발현에 따른 발암성 표현형을 분석하였으며, 침습성 및 침습에 관여하는 젤라틴 융해성 효소의 발현에 EphA10의 역할을 평가했다. 마지막으로, EphA10 발현이 증식, 생존, 접착 및 침습에 관여하는 신호 전달 단백질의 활성화에 미치는 영향을 분석하였다. 종합적으로, 본 발명자들은 EphA10 이 췌장암의 진단 및 치료를 위한 중요한 표적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 EphA10 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 EphA10 검출을 통한 암 진단 용도를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 암 환자에 EphA10 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10 억제제는 EphA10의 발현 또는 기능 억제제인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10의 발현 억제제는 EphA10을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10의 기능 억제제는 EphA10 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여 암화 기능을 억제하는 EphA10 폴리펩티드의 중화항체인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 유방암, 담관암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 침습성 암(invasive carcinoma)인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10)을 검출하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 시료에서 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명은 암 환자에 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10 억제제는 EphA10의 발현 또는 기능 억제제인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10의 발현 억제제는 EphA10을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10의 기능 억제제는 EphA10 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여 암화 기능을 억제하는 EphA10 폴리펩티드의 중화항체인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 유방암, 담관암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 침습성 암(invasive carcinoma)인 것일 수 있다.
본 발명의 “진단(diagnosis)”은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 바람직하게는 암 및 이의 발병 위험성을 판단하는 것이다.
본 발명의 "siRNA (short interfering RNA)"는 20-25 bp 크기의 이중가닥 RNA 분자로서 RNA 간섭 경로(RNA interfering pathway)에 의해 해당 siRNA에 특이적인 유전자의 발현을 간섭하는 역할을 수행한다.
본 발명의 "shRNA (short hairpin RNA)"는 단일가닥 RNA로서 수소결합에 의해 이중가닥 부분을 형성하는 줄기(stem) 부분과 고리 형태를 띄는 루프(loop) 부분으로 구분되며 결국 Dicer 등의 단백질에 의해 프로세싱되어 siRNA로 변환되어 siRNA와 동일한 기능을 수행한다.
본 발명의 "miRNA"는 "microRNA"라고도 불리우며, 작은 비암호화 RNA 분자로서 유전자 발현의 전사 및 전사후 조절에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고, 인간의 경우 게놈 내에 1,000개가 넘는 miRNA가 존재하는 것으로 알려지고 있다.
본 발명의 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 발명의 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
EphA10은 대부분의 인간 성인 조직에서 매우 낮게 발현되거나 발현되지 않는다. 상기 기재한 바와 같이, 췌장암에서 EphA10의 상향 조절 및 발암성 역할에 대한 연구는 미비하다. 본 발명자들은 TCGA 데이터베이스를 사용하여 34 종 암 유형에서 EphA10 mRNA 수준을 분석하여, 유방암, 전립선암, 결장암, 위암, 췌장암 또는 폐암을 포함하는 17 종 암 유형에서 전체 암 조직의 EphA10 mRNA 수준의 평균보다 높은 EphA10 mRNA 수준을 보이는 것을 확인하였다. EphA10 발현이 높은 17 종의 암 유형 중에서 9 종의 암 유형에서 종양 조직과 정상 조직의 mRNA 자료를 분석하여, 9 종의 암 유형 중 7 종의 암 유형에서 정상 조직에 비해 종양 조직에서 EphA10 mRNA 수준은 더 높다는 것을 발견할 수 있었다(실시예 1). 따라서, 상기 7 종 암 유형에서는 EphA10의 발현이 암 발생, 성장 및 전이에 중요하다는 것을 추론할 수 있었다.
발병률이 높은 췌장암은 국소(local) 단계에서 5 년 생존율은 37.4%이지만, 국소 췌장암은 식별할 수 있는 증상이 없기 때문에 환자의 10.3% 만이 국소 단계에서 진단받는다. 국부(regional) 또는 먼(distant) 단계에서 췌장암의 진단이 더 빈번하다(최대 59%); 그러나 국부 단계에서 5 년 생존율은 12.4% 이고, 먼 단계로 가면 2.9% 로 더욱 낮아진다. 따라서 조기 진단과 함께, 췌장암의 확산을 억제하는 치료법 개발이 환자 치료에 중요하다.
EphA10 mRNA 및 폴리펩티드의 발현은 유방암 MDA-MB-436 세포 및 흑색종 MDA-MB-435 세포와 비교하여 Panc-1, MIA PaCa-2 및 AsPC-1 췌장암 세포에서 더 높았다. 인간의 EphA10 mRNA에는 2 개의 주요 EphA10 이소형(isotype)이 알려져 있다: 1,008 개의 아미노산으로 구성된 전장 분자를 암호화하는 EphA10 mRNA(GenBank NM_001099439.2) 및 아미노 말단 283 개의 아미노산으로 구성된 에프린-결합 도메인을 암호화하는 가용성 EphA10 mRNA(GenBank NM_173641.2). 췌장암 세포의 웨스턴 블롯 분석에서, EphA10의 N-말단 영역을 인식하는 항체는 130 kDa에서 강한 신호를, 97 kDa에서 매우 약한 신호를 검출 하였다(도 1D). 신호 펩티드가 결여된 성숙 EphA10 폴리펩티드는 106 kDa의 계산된 분자량을 가지며 Asn311 및 Asn486 잔기에서 2 개의 잠재적 글리코실화 부위를 함유하므로, 130 kDa 밴드는 전장 EphA10 폴리펩티드에 해당하는 것으로 예상되었다. 가용성 EphA10은 유선 상피 MCF-10A 세포에서 대략 40 kDa으로 검출되었다고 보고된 바 있으나, 시험한 췌장암 세포에서는 검출되지 않았다.
본 발명자들은 췌장 세포에서 EphA10 녹다운은 증식, 이동 및 접착을 모두 감소시키고, EphA10 과발현은 증식, 이동 및 접착을 모두 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 마우스에 생성한 MIA PaCa-2 이종 이식편 종양 분석에서도, EphA10 과발현의 경우 이종 이식편 종양의 질량과 부피와 Ki-67-양성 증식 세포의 수가 대조군에 비하여 더 높았고, EphA10-침묵의 경우 대조군에 비하여 감소하는 것을 확인하였다.
종양의 침습 및 전이는 밀접하게 관련되어 있는데, 생체 내에서 종양 세포와 숙주 세포의 세포외기질이 종양 세포의 이동, 증식 및 생존에 관여한다. 췌장암의 주요 특징 중 하나는 초기의 전신 전파에 이어서 빠르게 국소 종양이 성장한다는 점이다. 따라서 췌장암 세포의 침습과 전이에 관여하는 표적 분자의 식별은 임상적으로 중요하다. 본 발명에서 EphA10 과발현은 MIA PaCa-2 세포의 침습을 증가시키고; 반면 EphA10 녹다운은 침습을 감소시키는 것으로 나타났다. IV 형 콜라겐은 기저막의 주요 구성 성분이므로, 기저막의 안정성에 필수적이다. 고형 인간 종양에서 젤라틴 융해성 MMP인 MMP-2 및 MMP-9의 발현 증가는 기저막에서 IV 형 콜라겐을 분해하여 기저막 손실, 암세포의 침습과 전이에 관여한다. 본 발명에서는 MIA PaCa-2 세포에서 EphA10 발현이 젤라틴 분해 및 MMP-9 유도와 관련이 있음을 규명했다 또한, 마우스에서 MIA PaCa-2 이종 이식편 종양 조직의 IHC 염색을 통하여 EphA10 과발현 및 침묵이 각각 MMP-9 발현을 증가 및 감소시켰음을 확인하였다.
ERK 및 JNK와 같은 MAP 키나아제의 활성화 및 AKT의 활성화는 세포 증식, 생존 및 이동을 촉진한다. FAK는 세포 부착, 이동 및 침입에 관여한다. 또한, NF-κ는 세포 증식, 상피 간충직 전이, 기저막 붕괴를 촉진하여 침습 및 전이를 촉진한다. EphA10은 촉매 활성이 없지만, 세포내 단백질들의 티로신 인산화뿐만 아니라 ERK, JNK, AKT, FAK 및 NF-κ를 포함한 신호 단백질의 인산화를 향상시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 EphA10이 촉매적으로 활성을 갖는 RPTK 구성원을 직접 또는 간접적으로 활성화시킨다는 것을 시사한다. 촉매적으로 비활성인 ERBB3 (HER3)은 ERBB2 (HER2)와 같은 ERBB 계열의 다른 활성 구성원에 결합하고 다운 스트림 발암 신호 전달 경로를 활성화한다. 또 다른 촉매적으로 결함이 있는 RPTK인 PTK7은 활성을 갖는 KDR 또는 FGFR1과 결합하여 각각 혈관신생 또는 발암 신호 전달 경로를 활성화한다. Eph 수용체는 종종 Eph 수용체 패밀리의 다른 구성원과 이종 이합체를 형성한다. 예를 들어, EphA10은 EphA7과 상호 작용하고, EphA10-EphA7 복합체는 종양-촉진 유전자의 발현을 유도한다. 종합적으로, EphA10는 촉매 활성을 갖는 Eph 수용체 패밀리 또는 다른 RPTK 패밀리 구성원과 결합하여 하류 발암 신호 단백질의 인산화를 촉진하여 발암 유전자의 발현을 유도하는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명은 EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10 억제제는 EphA10의 발현 또는 기능 억제제인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10의 발현 억제제는 EphA10을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 EphA10의 발현 억제제는 EphA10을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 shRNA인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 EphA10의 기능 억제제는 EphA10 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여 암화 기능을 억제하는 EphA10 폴리펩티드의 중화항체인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 유방암, 담관암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 바람직하게 상기 암은 췌장암일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 침습성 암(invasive carcinoma)일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 EphA10 억제제를 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10)을 검출하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 검출하는 제제는 EphA10 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공할 수 있다. 상기 키트는 해당 기술분야에서 단백질을 검출하는데에 통상적으로 사용되는 제제들을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 시료에서 EphA10 (erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.
상기 개체는 인간을 포함한 포유류 동물일 수 있으며, 상기 시료는 소변, 혈액, 체액 또는 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 암 환자에 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
EphA10은 췌장암 세포의 종양 형성 가능성과 양성적으로 관련이 있으므로 췌장암 진단에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 EphA10 억제제를 포함하는 조성물의 경우 췌장암 세포의 증식, 이동, 접착 또는 침습을 유의적으로 감소시킬 수 있어 췌장암 예방 또는 치료에 효과적이다.
도 1은 다양한 암 조직에서 EphA10의 발현 수준을 나타낸다. (A) EphA10 mRNA 수준을 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터베이스에 있는 34 가지 암 유형의 종양 조직에서 검사하였다. 가로 점선은 시험된 모든 암 유형의 EphA10 mRNA 수준의 전체 평균값(12.33)을 나타낸다. (B) 평균값보다 높은 EphA10 mRNA 수준을 나타내는 17 가지 암 유형 중 정상(N) 및 종양(T) 조직의 비교가 가능한 9가지 암 유형에서 EphA10 mRNA 수준을 비교하였다. 정상 조직에 대하여 * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. (C 및 D) EphA10 발현 수준은 Panc-1, MIA PaCa-2 및 AsPC-1 췌장암 세포에서 평가되었다. 흑색종 MDA-MB-435 및 유방암 MDA-MB-436 세포를 양성 대조군으로 포함시켰다. RT-PCR (C) 및 웨스턴 블롯 (D)에 의해 발현을 분석하였다. 웨스턴 블롯으로 EphA10을 탐지하기 위한 일차 항체로 GeneTex (Hsinchu, Taiwan)사의 항-EphA10 항체를 사용하였다. GAPDH 및 β액틴은 각각 RT-PCR 및 웨스턴 블롯에 대한 내인성 대조군으로서 사용되었다. RT-PCR (C)의 음성 대조군으로서 주형 불포함(No template) 시료를 사용하였다. TCGA의 암 유형 약어: ACC, 부신피질 암종; BLCA, 방광 요로암종; BRCA, 유방 침윤성 암종; CCA, 담관암 종; CESC, 자궁 경부 편평 상피 세포 암종; COAD, 결장 선암종; DLBC, 림프성 신생물 확산성 거대 B 세포 림프종; ESCA, 식도 암종; GBM, 다형성 교모세포종; HNSC, 두경부 편평 세포 암종; KICH, 신장 비염색성(chromophobe) 세포 암종; KIRC, 신장 투명 세포 암종; LGG, 뇌 저급 신경 교종; LIHC, 간 세포 암종; LUAD, 폐 선암종; LUSC, 폐 편평 세포 암종; MESO, 중피종; NB, 신경 모세포종; OV, 난소 장액성 낭선암종; PAAD, 췌장 선암종; PCPG, 갈색 세포종 및 부신경 교종; PRAD, 전립선 선암종; READ, 직장 선암종; SARC, 육종; SKCM, 피부 피부 흑색종; STAD, 위 선암종; TGCT, 고환 생식 세포 종양; THCA, 갑상선 암종; THYM, 흉선종; UCEC, 자궁 말초 자궁 내막 암종; UCS, 자궁암 육종; UVM, 포도막 흑색종; WT, 고위험 윌름스 종양.
도 2는 췌장암 세포주 MIA PaCa-2 및 AsPC-1 세포에서 EphA10 녹다운에 의한 발암 특성의 감소를 나타낸다. 대조군(KD 벡터) 및 EphA10 녹다운 shRNA (EphA10-KD-341 및 EphA10-KD-387)를 발현하는 렌티 바이러스로 감염된 MIA PaCa-2 (A) 및 AsPC-1 (B) 세포에서의 EphA10 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 대조군 및 EphA10 녹다운 MIA PaCa-2 (C) 및 AsPC-1 (D) 세포의 증식을 3 일 동안 분석하였다. 대조군 및 EphA10 녹다운 MIA PaCa-2 (E) 및 AsPC-1 (F) 세포를 가하고 1 시간 후에 세포 접착을 분석하였다. 대조군 및 EphA10 녹다운 MIA PaCa-2 (G) 및 AsPC-1 (H) 세포를 가하고 24 시간 후에 세포 이동을 분석하였다. 각 막대는 세 개의 독립적인 실험에서 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 0 일 (C 및 D) 또는 대조군 벡터 (E-H)에 대하여 * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 3은 MIA PaCa-2 세포에서 EphA10 과발현에 의한 발암 특성의 증가를 나타낸다. (A) 대조군(OE Vector) 또는 EphA10-FLAG을 발현하는 렌티 바이러스로 감염된 췌장암 MIA PaCa-2 세포에서의 EphA10 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 대조군 및 EphA10-과발현 MIA PaCa-2 세포의 증식(B), 접착(C) 및 이동(D)을 녹다운 세포에서와 동일한 방법을 사용하여 분석하였다. 각 막대는 세 개의 독립적인 실험에서 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 0 일(B) 또는 대조군 벡터(C 및 D)에 대하여 * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 4는 이종 이식 모델에서 종양 성장에 대한 EphA10의 과발현 및 녹다운의 효과를 나타낸다. 마우스에 모의(mock) 형질감염 또는 EphA10을 과발현(EphA10-FLAG) 및 침묵(EphA10-KD-341 및 -387) 시킨 MIA PaCa-2 세포를 주사하였다. (A) 종양 부피는 6 주 동안 측정하였다. (B) 주사 6 주 후 마우스로부터 얻은 종양의 사진과 중량(g)의 그래프를 나타낸다.
도 5는 이종 이식 모델에서 Ki-67 및 MMP-9 발현에 대한 EphA10의 과발현 및 녹다운의 효과를 나타낸다. 각 실험군 마우스에서 EphA10, Ki-67 및 MMP-9에 대한 IHC 염색과 H & E 염색의 대표적인 이미지를 나타낸다(스케일 바 = 50 ㎛). Ki-67 및 MMP-9 염색의 상대 강도를 그래프로 나타내었다. 각 막대는 3 마리 마우스의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 모의 형질감염된 세포에 대하여 * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 6은 MIA PaCa-2 세포에서 침습, 젤라틴 분해 및 젤라틴 융해성 MMP 발현에 대한 EphA10 과발현 및 녹다운의 효과를 나타낸다. MIA PaCa-2 세포를 대조군(OE 벡터) 및 EphA10 과발현(EphA10-FLAG)하는 렌티 바이러스로 감염시켰고(왼쪽 패널), 대조군(KD 벡터) 및 EphA10 녹다운 shRNA(EphA10-KD-341 및 -387)하는 렌티 바이러스로 감염시켰다(오른쪽 패널). (A) Matrigel-코팅된 Boyden 챔버에 EphA10을 과발현 또는 침묵시키는 MIA PaCa-2 세포를 가하고 24 시간 후 세포 침습. (B) 세포를 FITC-젤라틴이 코팅된 커버 유리(cover glass) 상에 플레이팅하고 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 로다민-팔로이딘(rhodamine-phalloidin) 및 DAPI로 염색하고 형광 현미경(x100)으로 분석하였다. 상대적 젤라틴 분해는 대조군 세포와 비교하여 EphA10-과발현 또는 -침묵 세포에서 DAPI 강도로 정규화된 FITC-젤라틴 분해 정도로 나타내었다. (C) 분비된 젤라틴 융해성 MMP(MMP-2 및 MMP-9)의 수준 및 EphA10의 수준을 각각 배양한 배지 및 세포 용해물에서 젤라틴 지모그래피 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. HT-1080 세포의 배지를 MMP-2 및 MMP-9의 예상 위치를 나타내기 위해 양성 대조군으로 사용하였다. 각 막대는 세 개의 독립적인 실험에서 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 벡터 대조군에 대하여 * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 7은 MIA PaCa-2 세포에서 신호 전달 분자의 활성화에 대한 EphA10의 과발현 및 녹다운의 효과를 나타낸다. 세포 단백질의 티로신 인산화 및 ERK, JNK, AKT, FAK 및 NF-κ의 인산화를 대조군(OE 벡터) 및 EphA10 과발현(EphA10-FLAG)하는 렌티 바이러스로 감염된 MIA PaCa-2 세포(A)와 대조군(KD 벡터) 및 EphA10 녹다운 shRNA (EphA10-KD-341 및 -387)를 발현하는 렌티 바이러스로 감염된 MIA PaCa-2 세포(B)에서 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다.
[실시예 1]
다양한 암종에서의 EphA10 발현
The Cancer Genome Atlas(TCGA) 데이터베이스의 RNA-seq 데이터를 사용하여 다양한 암 유형의 EphA10 mRNA 수준을 분석했다.
인간 췌장 선암종 PANC-1, MIA PaCa-2 및 AsPC-1 세포; 유방암 MDA-MB-436 세포; 흑색종 MDA-MB-435 세포는 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. SV40 T 항원(HEK293T)을 발현하는 HEK 293 세포는 박종배 박사(National Cancer Center, Ilsan, Korea)로부터 제공받았다. HEK293T 세포는 10% 소 혈청(BS)을 포함하는 DMEM 배지(HyClone, Logan, UT, USA)에서, 다른 모든 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 DMEM 배지에서 성장시켰고, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충되었다. 모든 세포를 5% CO2에서 37 ℃로 유지시켰다.
RNA 분리는 TRIzol 시약(Ambion, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 배양된 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 제조업자의 지시에 따라 올리고(dT)15 프라이머 및 AMV RT 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 총 RNA로부터 제 1 가닥 cDNA를 합성하였다. 역전사(RT)-PCR 분석에 사용한 프라이머 쌍 서열은, 인간 EphA10 cDNA 에 대하여는 5'-GAGTGAGGTCCCAGAATCCGTTGG-3' (GenBank NM_001099439.1의 5251-5275, 서열번호 1) 및 5'-GGCTTGCAGCCCACCTCTGTC-3' (GenBank NM_001099439의 5389-5369, 서열번호 2)이고, 인간 GAPDH cDNA에 대하여는 5'-ACTGCTTAGCACCCCTGGCCA-3' (GenBank BC023632의 488-508, 서열번호 3) 및 5'-TTGGCAGTGGGGACACGGAAG-3' (GenBank BC023632의 740-720, 서열번호 4)이다(표 1). PCR 증폭 조건은 다음과 같다: 94 ℃에서 30 초 동안 초기 변성 및 94 ℃에서 30 초 동안 변성, 55 ℃에서 60 초 동안 어닐링 및 72 ℃에서 30 초 동안 연장의 30 사이클. PCR 생성물을 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동(PAGE)으로 분석하였다.
명칭 서열 서열번호
인간 EphA10 cDNA 정방향 5'-GAGTGAGGTCCCAGAATCCGTTGG-3' 1
역방향 5'-GGCTTGCAGCCCACCTCTGTC-3' 2
인간 GAPDH cDNA 정방향 5'-ACTGCTTAGCACCCCTGGCCA-3' 3
역방향 5'-TTGGCAGTGGGGACACGGAAG-3' 4
TCGA 데이터베이스에서 20,165 개 표본의 전처리된 RNA-seq 카운트 매트릭스는 Genomic Data Commons(GDC; https://gdc.cancer.gov/)의 UCSC Xenabrowser(https://xenabrowser.net/)에서 얻었다. 유전자 발현은 RNA-Seq-기반 발현 정규화 방법인 백만 맵핑된 판독 상한 사분위수(FPKM-UQ) 당 전사체의 킬로베이스 당 단편으로서 정량화되었다. EphA10 mRNA 수준은 log2(FPKM-UQ + 1)로 도시되었다. 정상 및 종양 조직의 mRNA 자료가 이용 가능한 특정 유형의 암에 대해서는 EphA10 mRNA 수준에 대해 쌍으로 분석을 수행하였다.
그 결과, 분석된 34 종의 암 유형 중 EphA10 mRNA의 중간 수준은 모든 암 조직의 전체 평균 [Log2 (FPKM-UQ + 1) = 12.33]보다 17 종의 암 유형에서 더 높았다(도 1A). 쌍을 이룬 EphA10 mRNA 수준이 높은 17 종의 암 유형 중 9 가지에서 정상 및 종양 조직의 쌍으로 mRNA 데이터가 이용 가능했다(도 1B). 이상의 9 종의 암 유형 중 유방 침습성 암종, 담관암 종, 폐 선암종, 췌장 선암종, 전립선 선암종, 위 선암종 및 갑상선 암종을 포함하는 7 종의 암 유형에서 정상 조직보다 종양 조직에서 EphA10 mRNA 수준이 더 높았다(도 1B). 이들 데이터는 EphA10 발현이 특정 암 유형에서 상향 조절됨을 확인시켜 준다. 또한, mRNA 및 단백질 수준에서 EphA10을 발현하는 것으로 알려진 유방암 MDA-MB-436 및 흑색종 MDA-MB-435 세포주에 비해 AsPC-1 및 MIA PaCa-2 세포주 등의 췌장 암종 세포주에서 EphA10의 발현이 더 높은 것을 확인할 수 있었다(도 1C 및 D).
[실시예 2]
췌장암 세포의 증식, 이동 및 접착에 EphA10의 녹다운의 영향
췌장암 세포의 발암 특성에 대한 EphA10 하향 조절의 영향을 조사하기 위해 EphA10을 녹다운하여 인간 EphA10 폴리펩티드의 발현이 크게 감소한 췌장 암종 세포를 구축하였다.
EphA10 녹다운 벡터(pLKO.1-shRNA-EphA10-341 및 387)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. EphA10 녹다운 렌티 바이러스는 10 ㎍의 EphA10 녹다운 벡터(pLKO.1-shRNA-EphA10-341 또는 387) 또는 10 ㎍의 녹다운 대조군 벡터(pLKO.1-control)와 7.4 ㎍의 패키징 벡터(psPAX2)(Addgene, Cambridge, MA, USA) 및 2.6 ㎍의 엔벨로프 벡터(pMD2.G)(Addgene)의 공동 형질 감염에 의해 HEK293T 세포에서 생성되었다. EphA10 녹다운 렌티 바이러스로 감염된 췌장암 세포를 14 일 동안 1 ㎍/㎖ 퓨로마이신 포함 배지에서 배양하여 퓨로마이신-내성 EphA10-녹다운 세포들을 혼합 배양하였다.
세포 증식 분석은 세포(0.1 ㎖, 3×104 세포/㎖)를 평평한 바닥의 96-웰 세포 배양 플레이트(SPL, Pocheon, Korea)에 10% FBS가 보충된 DMEM을 가하여 1 내지 3 일 동안 배양하였다. 살아있는 세포의 수를 측정하기 위해, 세포를 인산 완충 식염수(PBS; 8.06 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.6 mM KCl; pH 7.4)로 세척하고 0.5 mg/㎖ MTT를 함유하는 0.1 ㎖ DMEM을 가하여 4 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 세포를 PBS로 세척하고 0.1 ㎖ DMSO로 가용화시켰다. SpectraMax M3 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 접착 분석은, 분리된 세포 현탁액(1×104 세포/0.1 ㎖)을 랫트 꼬리 I 형 콜라겐 (1 ㎍/well)으로 코팅된 96-웰 플레이트에 로딩하고 90분 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS 중 3.7% 파라 포름 알데히드로 고정시키고 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 염색된 세포를 1% SDS로 용해시키고, 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
화학 주성(chemotactic) 이동 분석은, 하부 표면을 10 ㎕의 0.1% 젤라틴으로 미리 코팅한 트랜스 웰(Corning, Tewksbury, MA, USA)에 분리된 세포 현탁액(1 × 105 세포/0.2 ㎖)을 트랜스 웰의 상부 구획에 로딩하였다. 각 웰의 하부 구획에는 화학 유인 물질로서 10% FBS가 있는 0.6 ㎖ DMEM을 충전하였다. 챔버를 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 트랜스 웰의 하부 표면으로 이동한 세포를 PBS 중 3.7% 파라포름 알데히드로 15 분 동안 고정시키고 0.005% 크리스탈 바이올렛으로 5 분 동안 염색하였다. 면봉으로 트랜스 웰의 상부 표면에 남아 있는 세포를 제거한 후, 하부 표면에 염색된 세포를 1% SDS로 가용화하고 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, EphA10 shRNA를 암호화하는 렌티 바이러스(EphA10 shRNA)를 감염시켜 배양한 췌장암 MIA PaCa-2 및 AsPC-1 세포에서 EphA10이 녹다운되었다(EphA10-KD-341 및 -387). EphA10-KD-341 및 -387에 의한 EphA10 녹다운은 MIA PaCa-2 세포에서의 EphA10 발현을 각각 30% 및 10%, 및 AsPC-1 세포에서 각각 20% 및 5%로 감소시켰다 (도 2A 및 B). EphA10-KD-341 및 -387에 의한 EphA10 녹다운은 배양 3 일째의 대조군 벡터와 비교하여 MIA PaCa-2 세포에서 세포 증식을 각각 78% 및 56%로 그리고 AsPC-1 세포에서 75% 및 65%로 감소시켰다(도 2C 및 D). 또한, EphA10 녹다운은 콜라겐으로 코팅된 표면에 대한 세포 접착성을 대조군 세포와 비교하여 MIA PaCa-2 세포에서 67-78%로 그리고 AsPC-1 세포에서 70-80%로 감소시켰다(도 2E, F). 대조군 벡터와 비교하여, EphA10 녹다운은 젤라틴으로 코팅된 보이든 챔버를 사용하여 측정된 세포 이동을 MIA PaCa-2 세포에서 70-81%로 그리고 AsPC-1 세포에서 55-81%로 감소시켰다(도 2G 및 H). 따라서, EphA10 녹다운은 MIA PaCa-2 및 AsPC-1 세포의 증식, 이동 및 접착을 감소시켜 췌장암 세포의 종양원성 잠재력을 실질적으로 감소시켰다.
[실시예 3]
췌장암 세포에서 증식, 이동 및 접착에 EphA10의 과발현의 영향
EphA10 녹다운은 췌장암 세포의 발암성 표현형을 손상시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 췌장암 세포(MIA PaCa-2 세포)의 발암 특성에 대한 EphA10 상향 조절의 영향을 조사하기 위해 인간 EphA10 폴리펩티드를 과발현하는 췌장 암종 세포를 구축하고자 하였다.
EphA10를 발현하는 포유 동물 발현 벡터를 구축하기 위해, EphA10 폴리펩티드를 코딩하는 EphA10 cDNA 및 C-말단 FLAG-태그를 PCR에 의해 증폭시켰다. 유방암 MDA-MB-436 세포의 올리고(dT)15-프라임 cDNA 혼합물을 주형으로 사용하고 PrimeSTAR GXL DNA 중합 효소(TaKaRa, Kusatsu, Japan)를 사용하여 DNA 생성물을 합성하였다. 이에 사용한 상류 프라이머(5'-CCCAAGCTTGCCACCATGGAGACCTGCGCCGG-3', 서열번호 5)는 HindⅢ부위(밑줄) 및 EphA10 cDNA의 시작 코돈(굵게) 주위에 있는 20 개의 뉴클레오티드(NM_001099439.1의 84-103)를 포함한다. 하류 프라이머(5'-CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCACCTGCACCCCGGGGCCC-3', 서열번호 6)는 EphA10 cDNA의 정지 코돈 앞의 19 개 뉴클레오티드(NM_001099439.1의 3110-3092), FLAG- 태그 코딩 서열(기울기), 종결 코돈(굵게) 및 XhoI 부위(밑줄)를 포함한다. PCR 생성물을 HindⅢ및 XhoI 제한효소로 절단시키고, 포유 동물 발현 벡터인 pcDNA3.1의 HindⅢ부위 사이에 삽입하였다. 생성물인 pcDNA3.1-EphA10-FLAG는 PCR 오류를 피하기 위해 양방향으로 시퀀싱되었다.
EphA10 발현을 위한 렌티 바이러스 전달 벡터를 구축하기 위해, 주형으로서 pcDNA3.1-EphA10-FLAG 벡터 및 PrimeSTAR GXL DNA 폴리머라제를 사용하여 EphA10-FLAG-코딩 서열을 포함하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 상류 프라이머(5'-GATCTCGACGCGGCCGCTACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCT-3', 서열번호 7)는 pHRST-IRES-eGFP (nt. 2839-2855)에서 NotI 부위(밑줄)를 포함하는 17 개 뉴클레오티드 및 pcDNA3.1 (nt. 866-893; 기울기)의 28 개 뉴클레오티드를 포함한다. 하류 프라이머(5'-GGGCGGAATTGGATCCGAAGGCACAGTCGAGGCTGATCAG-3', 서열번호 8)는 pHRST-IRES-eGFP (nt. 2871-2856)에서 BamHI 부위(밑줄)를 포함하는 16개 뉴클레오타이드 및 pcDNA3.1의 24 개 뉴클레오티드(nt. 1037-1014; 기울기)를 포함한다. PCR 생성물을 In-fusion HD 클로닝 키트(Takara)를 사용하여 pHRST-IRES-eGFP 벡터의 NotI 및 BamHI 부위에 결찰시켰다. 생성물인 pHRST-EphA10-FLAG-IRES-eGFP는 PCR 오류를 피하기 위해 양방향으로 시퀀싱되었다.
EphA10 발현 렌티 바이러스는 13 ㎍의 EphA10 과발현 벡터(pHRST-EphA10-FLAG-IRES-eGFP) 또는 10 ㎍의 과발현 제어 벡터(pHRST-IRES-eGFP)와 7.4 ㎍의 패키징 벡터(psPAX2)(Addgene, Cambridge, MA, USA) 및 2.6 ㎍의 엔벨로프 벡터(pMD2.G)(Addgene)의 공동 형질 감염에 의해 HEK293T 세포에서 생성되었다. EphA10-과발현 렌티 바이러스로 감염된 췌장암 세포를 발암성 분석에 사용하였다.
세포의 증식, 접착 및 이동 분석은 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, MIA PaCa-2 세포에 EphA10-FLAG 렌티 바이러스의 감염은 EphA10 수준을 200%로 증가시켰다(도 3A). EphA10의 과발현은 대조군 벡터와 비교하여, 배양 1 일 및 2 일에 각각 세포 성장을 152% 및 176%로 증가시켰다(도 3B). 대조군 벡터와 비교하여, EphA10 과발현은 또한 MIA PaCa-2 세포의 접착 및 이동을 각각 148% 및 234% 증가시켰다(도 3C, D). 이들 결과는 EphA10의 녹다운 및 과발현에 따라 췌장암 세포의 종양 형성 가능성이 각각 감소 또는 증가하는 효과를 가진다는 것을 증명하며, EphA10이 췌장암 세포의 증식, 이동 및 접착을 증가시켜 종양 유전자로 작용한다는 것을 입증한다.
[실시예 4]
생체 내 췌장암 세포의 종양 형성에 EphA10의 영향
<4-1> 생체 내 췌장암 세포의 종양 형성에 EphA10의 과발현 및 녹다운의 영향 분석
구체적으로, 모의, EphA10-FLAG, EphA10-KD-341, 또는 EphA10-KD-387 MIA PaCa-2 세포를 성장-인자-감소 마트리겔(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 재현탁시키고 4-5 주령 수컷 면역 결핍 무 흉선 누드(Balb/c nu/nu; Orient Bio Inc; Gyeonggi, Republic of Korea) 마우스의 등에 이식(1 × 106 세포/사이트)하였다. 캘리퍼를 사용하여 매주 종양 부피를 측정하였다(길이×폭×깊이/2). 모든 동물 실험은 국립암센터 실험동물실 운영 지침에 따라 진행되었다.
그 결과, 이종 이식 후 관찰 기간 동안, 종양 부피는 모의 대조군과 비교하여 EphA10 과발현에 의해 유의하게 증가하고 EphA10 녹다운에 의해 유의적으로 감소하였다(도 4A). 이식 6 주 후, 동물을 희생시키고 종양 중량을 기록하였다. 종양 질량의 무게는 모의 대조군과 비교하여 EphA10 과발현 세포를 이식한 종양에서 260%로 증가하였고 EphA10 침묵 세포를 이식한 종양에서 4-36%로 감소되었다(도 4B).
<4-2>　세포 형태 및 증식 평가
상기 실시예 <4-1>의 MIA PaCa-2 세포를 이식한 마우스에서 6주 후 이종 이식 종양을 회수하여 종양 중량을 측정하고 파라핀 조직 블록을 제조하였다. 구체적으로, 종양 조직을 15 시간 동안 10% 중성 완충 포르말린(Sigma-Aldrich)에 고정시키고 HistoCore Pearl 조직 프로세서(Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)에서 70% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올, 자일렌 및 파라핀으로 처리하였다. 종양 조직을 파라핀에 포매하고, 회전식 마이크로톰 마이크롬 HM355S(Thermo Scientific, Walldorf, Germany)에 의해 4 ㎛ 섹션으로 절단하고, 실란-코팅된 유리 슬라이드(MUTO PURE CHEMICALS, Tokyo, Japan)에 장착하였다.
본 발명자들은 종양 섹션에서 EphA10 및 Ki-67에 대한 면역 조직 화학(IHC) 염색과 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색을 수행하였다. 면역 조직 화학 염색은 파라핀 제거 및 탈수 후, 조직 섹션을 메탄올 중 3% H2O2로 20 분 동안 켄칭하고 10 분 동안 따뜻한 10mM 시트레이트(citrate) 완충 용액(pH 6)으로 배양했다. PBS로 세척한 후, 섹션을 1 시간 동안 실온에서 습한 챔버에서 1 차 항체(항-EphA10(GeneTex; Hsinchu City, Taiwan), 항-Ki-67(Abcam; Cambridge, UK), 항-MMP-9(Cell Signaling Technology; Danvers, MA, USA))와 함께 배양하였다. 이어서, 섹션을 PBS로 세척하고, 실온에서 15 분 동안 HRP 중합체 접합체와 함께 배양하고, 실온에서 5 분 동안 DAB Chromogen (ScyTek Laboratory, West Logan, USA)으로 염색하였다. 이종 이식편 종양 조직에서 세포 형태를 검출하기 위해, 탈 파라핀한 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하였다.
그 결과, EphA10 염색은 모의 대조군과 비교하여 EphA10 수준이 EphA10-FLAG 종양에서 상승되었고 EphA10-KD-341 및 -387 종양에서 감소되었음을 확인하였다(도 5). 중요하게도, 본 발명자들은 증식 마커인 Ki-67 염색이 EphA10-과발현 종양에서 더 강하고 대조군 종양과 비교하여 EphA10-녹다운 종양에서 약하다는 것을 확인하였다(도 5). 이러한 결과는 EphA10이 세포 배양 수준뿐만 아니라 생체 내에서도 췌장암과 관련된 중요한 종양 유전자임을 확인시켜 준다.
[실시예 5]
MIA PaCa-2 세포에서 침습 증가 및 MMP-9 분비 유도에 EphA10의 연관성
EphA10이 췌장암 세포의 침습성에 관여하는지 여부, EphA10 의존성 세포 침습에 젤라틴 융해성 효소가 관련되는지 여부 및 EphA10-매개 젤라틴 분해에 관여하는 젤라티나제를 분석하기 위해, EphA10을 과발현 또는 녹다운시킨 MIA PaCa-2 세포에서 화학 주성 침습 분석 및 형광 젤라틴 분해 분석을 수행하였다.
화학 주성(chemotactic) 침습 분석은 트랜스 웰의 상부 표면에 25 ㎍의 성장 인자-감소된 마트리겔(Corning)을 코팅하고 48 시간 동안 배양한다는 점을 제외하고, 상기 <실시예 2>의 화학 주성 이동 분석과 동일하게 수행하였다.
형광 젤라틴 분해 분석을 위하여, 산-세척된 유리 커버 슬립을 37 ℃에서 2 시간 동안 20 ㎍/㎖ FITC-젤라틴으로 코팅하였다. 커버 슬립을 PBS로 세척하고, 0.5% 글루타르알데히드로 15 분 동안 가교시킨 다음, 25 ℃에서 3 분 동안 5 mg/㎖ 소듐 보로하이드라이드로 켄칭(quenching)하였다. 커버 슬립을 24-웰 플레이트에 놓고, PBS로 세척하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 5% FBS가 포함된 DMEM에서 배양하였다. 분리된 세포(4×104 세포 /0.5 ㎖)를 24-웰 플레이트에 로딩하고 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 커버 슬립상의 세포를 3.7% 파라포름 알데히드를 포함하는 PBS로 고정시키고 0.5% Triton X-100으로 투과시켰다. 액틴 필라멘트 및 핵은 각각 로다민-팔로이딘(500 ng/㎖) 및 DAPI (250 ng/㎖)로 염색하였다. 면역 형광 염색은 Axio 형광 현미경(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다. FITC-젤라틴이 분해된 영역을 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 측정하고, 젤라틴 분해의 정량화를 위해 DAPI 강도로 정규화하였다.
젤라틴 지모그래피(zymography)를 수행하기 위하여, 충만 상태로 배양된 세포를 무 혈청 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양한 배지를 2,000 g에서 5 분 동안 원심분리하여 수집하고, 상층액에 차가운 트리클로로 아세트산(TCA; Sigma-Aldrich)을 가하여 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질을 0.1% 젤라틴을 함유하는 7.5% SDS 겔에 로딩하였다. 전기영동 후, 겔을 리폴딩 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2.5% Triton X-100)에서 1 시간 동안 실온에서 배양한 후, 반응 버퍼(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM CaCl2)에서 37 ℃에서 16 시간 동안 배양 하였다. 이어서, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색하였다.
그 결과, EphA10의 과다 발현은 MIA PaCa-2 세포의 침습을 대조군의 306%로 유의하게 증가시켰다; 반면, EphA10의 녹다운은 침습을 대조군의 71-81%로 현저히 감소시켰다(도 6A). 또한, EphA10 과발현은 FITC-표지된 젤라틴의 분해를 대조군의 171%로 증가시켰고, EphA10 녹다운은 젤라틴 분해를 대조군의 23-53%로 감소시켰다(도 6B). EphA10-매개 젤라틴 분해에 관여하는 젤라티나제를 확인하기 위해, EphA10을 과발현 또는 녹다운시킨 MIA PaCa-2 세포의 배양 배지를 수득하여 젤라틴 지모그래피로 분석하였다. MMP-9 분비는 EphA10 과발현에 의해 유의하게 증가하고 EphA10 녹다운에 의해 감소된 반면, MMP-2 분비는 MIA PaCa-2 세포의 배양 배지에서 검출되지 않았다(도 6C). 더욱이, MIA PaCa-2 이종 이식편 종양의 IHC 분석에서 MMP-9 염색이 모의 대조군보다 EphA10-과발현 이종 이식 종양에서 더 강하고 EphA10-녹다운 이종 이식 종양에서 약하다는 것을 밝혀냈다(도 5). 이 결과는 EphA10이 MIA PaCa-2 세포의 침습을 향상시키며, MMP-9 발현 유도가 침습에 관여한다는 것을 입증한다.
[실시예 6]
세포의 발암 관련 신호 전달 단백질의 활성화에 EphA10의 역할
발암 표현형의 중요 지표인 세포 증식, 생존, 이동, 접착 및 침습에는 MAP 키나제, PI3-키나제/AKT 및 FAK 경로를 포함한 다양한 신호 전달 경로의 활성화를 동반한다. 또한, MMP-9 발현의 전사 활성화는 전사 인자 NF-κ및 AP-1의 활성화가 필요하며, NF-κERK 및 JNK의 인산화에 의해 쉽게 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 EphA10이 과발현 또는 침묵된 MIA PaCa-2 세포에서 상기 신호 단백질의 인산화를 조사 하였다. 사용된 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)의 항-포스포-ERK, 항-NF-κp65, 항-FAK 및 항-β액틴; Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)의 항-포스포-AKT(Ser473), 항-AKT, 항-포스포-JNK, 항-JNK 및 항-포스포-NF-κp65(Ser536); Merck Millipore(Burlington, MA, USA)의 항-포스포-티로신(클론 4G10) 및 항-포스포-FAK(Tyr397); Bioss (Boston, MA, USA)의 항-ERK2; 및 KOMA Biotech(Seoul, Korea)의 겨자 과산화효소-접합 염소 항-마우스 IgG 및 토끼 IgG이다.
그 결과, 세포 단백질들의 티로신 잔기의 총 인산화 수준과 ERK, JNK, AKT, FAK 및 NF-κ의 인산화 수준은 EphA10 과발현에 의해 명확하게 증가하고 EphA10 녹다운에 의해 감소되었다(도 7). 이는 EphA10이 세포 증식, 생존, 이동, 접착 및 침입에 대한 신호 전달 경로를 활성화시켜 췌장암 등 EphA10 양성 세포의 종양 형성을 증가시킴을 의미한다.
[통계 분석]
통계 분석은 공개 데이터베이스 분석을 위해 Graphpad Prism 5(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하고 다른 모든 분석을 위해서는 Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행했다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다. 모든 시험에서, 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
EphA10은 췌장암 세포의 종양 형성 가능성과 양성적으로 관련이 있으므로 췌장암 진단에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 EphA10 억제제를 포함하는 조성물의 경우 췌장암 세포의 증식, 이동, 접착 또는 침습을 유의적으로 감소시킬 수 있어 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 효과적으로 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 크다.
서열번호 1 은 인간 EphA10 cDNA에 대한 정방향 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호 2 는 인간 EphA10 cDNA에 대한 역방향 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호 3 은 인간 GAPDH cDNA에 대한 정방향 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호 4 는 인간 GAPDH cDNA에 대한 역방향 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호 5 는 발현 벡터의 상류 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호 6 은 발현 벡터의 하류 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호 7 은 발현 벡터의 상류 프라이머 서열을 나타낸다.
서열번호 8 은 발현 벡터의 하류 프라이머 서열을 나타낸다.

Claims (15)

  1. EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 EphA10 억제제는 EphA10의 발현 또는 기능 억제제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 EphA10의 발현 억제제는 EphA10을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, siRNA 및 shRNA 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 EphA10의 기능 억제제는 EphA10 폴리펩티드에 특이적을 결합하여 암화 기능을 억제하는 EphA10 폴리펩티드의 중화항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 유방암, 담관암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 암은 침습성 암(invasive carcinoma)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10)을 검출하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물.
  8. 제7항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
  9. 개체로부터 분리된 시료에서 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보 제공 방법.
  10. 암 환자에 EphA10(erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma receptor A10) 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 EphA10 억제제는 EphA10의 발현 또는 기능 억제제인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 EphA10의 발현 억제제는 EphA10을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, siRNA 및 shRNA 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 EphA10의 기능 억제제는 EphA10 폴리펩티드에 특이적을 결합하여 암화 기능을 억제하는 EphA10 폴리펩티드의 중화항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 암은 유방암, 담관암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 위암 및 갑상선암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 암은 침습성 암(invasive carcinoma)인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료방법.
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