WO2021201260A1 - 間葉系幹細胞の動員活性を有するペプチド - Google Patents

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acid sequence
peptide
seq
mesenchymal stem
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克人 玉井
敬史 新保
尊彦 山崎
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株式会社ステムリム
国立大学法人大阪大学
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Definitions

  • the present application relates to a peptide having mesenchymal stem cell mobilization activity, a composition for mobilizing mesenchymal stem cells, and a drug for treating a disease based on the mobilization of mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells contained in bone marrow fluid and the like have the ability to differentiate into various tissues such as bone, cartilage, fat, muscle, nerve, and epithelium (pluripotency), and have been cultured in recent years. Attempts have been made to perform regenerative medicine (cell transplantation therapy) using bone marrow-derived mesenchymal stem cells proliferated in the above. However, the collection of bone marrow blood containing mesenchymal stem cells is performed by an invasive method in which a thick needle is inserted into the ilium many times, which imposes a heavy burden on the donor. In addition, mesenchymal stem cells gradually lose their proliferative ability and pluripotency when subculture is continued in vitro.
  • the purpose of this application is to develop a new regenerative medicine technology that can overcome the problems of cell transplantation therapy.
  • the present inventors have previously found an artificial sequence peptide "1r10” having an activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood based on the results of their own research, and have filed a patent application for the peptide (PCT). / JP2019 / 039232).
  • the present inventors synthesize a plurality of peptides consisting of a partial sequence of the artificial sequence peptide "1r10” (hereinafter, also referred to as "1r10 fragment peptide”), and have the activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood.
  • 1r10 fragment peptide As a result of investigating, it was found that a 1r10 fragment peptide having a specific amino acid sequence exhibits the activity. Based on this finding, the present application provides peptides that are considered to have therapeutic effects on various diseases through the recruitment of mesenchymal stem cells to peripheral blood.
  • compositions for use in recruiting mesenchymal stem cells into peripheral blood containing peptides selected from the following: (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19.
  • compositions according to [2], wherein the treatment of the disease or morbidity is selected from anti-inflammatory treatment, immunomodulatory treatment, tissue regeneration-inducing treatment, and tissue fibrosis-suppressing treatment.
  • the disease or pathological condition is selected from inflammatory diseases, autoimmune diseases, diseases associated with tissue damage, ischemia or necrosis, and fibrotic diseases.
  • the disease or pathological condition is inflammatory bowel disease.
  • the disease or pathological condition is ulcerative colitis.
  • the composition according to [2], wherein the disease or pathological condition is atopic dermatitis.
  • compositions containing peptides selected from the following for use in the treatment of diseases selected from inflammatory bowel disease, atopic dermatitis and cerebral infarction (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19.
  • Peptides containing. [10] Peptides selected from: (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19. Peptides containing.
  • a method of recruiting mesenchymal stem cells into peripheral blood including the step of administering to a subject an effective amount of a peptide selected from the following: (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19.
  • a method of treating a disease or pathological condition in a subject by mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood including the step of administering to the subject an effective amount of a peptide selected from the following: (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19.
  • a method of treating a disease in a subject selected from inflammatory bowel disease, atopic dermatitis and cerebral infarction which comprises the step of administering to the subject an effective amount of a peptide selected from: (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an
  • C1 Use of peptides selected from the following in the manufacture of drugs or reagents for the recruitment of mesenchymal stem cells into peripheral blood: (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19.
  • Peptides containing. [C2] Use of peptides selected from: (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19. Peptides containing.
  • the disease or pathological condition is selected from inflammatory diseases, autoimmune diseases, tissue damage, diseases associated with ischemia or necrosis, and fibrotic diseases.
  • the disease or pathological condition is inflammatory bowel disease.
  • the disease or pathological condition is ulcerative colitis.
  • [C9] Use of peptides selected from the following in the manufacture of pharmaceuticals for the treatment of diseases selected from inflammatory bowel disease, atopic dermatitis and cerebral infarction: (A) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (B) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (c) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19. Peptides containing.
  • FIG. 5 is a graph plotting the number of colonies obtained by culturing peripheral blood 16 hours after administration of saline, 1% DMSO, or peptide.
  • “Saline” and “DMSO” indicate the control group, and the others indicate the peptide administration group.
  • the number of colonies was shown as a value per peripheral blood volume (800 ⁇ L) collected from one mouse.
  • the long horizontal bar represents the mean value and the short horizontal bar represents the standard deviation.
  • the dotted line represents a threshold value (number of colonies: 10) for determining the presence or absence of activity.
  • It is a graph which plotted the number of colonies obtained by culturing peripheral blood 16 hours after administration of physiological saline or a peptide.
  • the horizontal axis shows the number of days after the start of drinking the aqueous solution of dextran sulfate (DSS). It is a graph which shows the stool score of a mouse (mean ⁇ standard error (SEM)). In the graph, “saline” indicates a control group, and “1r10” indicates a peptide 1r10 administration group.
  • the horizontal axis shows the number of days after the start of drinking the aqueous solution of dextran sulfate (DSS). It is a graph showing the DAI score of a mouse (mean ⁇ standard error (SEM); * p ⁇ 0.05 (Mann Whitney U test)).
  • saline indicates a control group
  • “1r10” indicates a peptide 1r10 administration group.
  • the horizontal axis shows the number of days after the start of drinking the aqueous solution of dextran sulfate (DSS). It is a graph which shows the colon length 10 days after the start of drinking of the dextran sodium sulfate (DSS) aqueous solution (mean ⁇ standard error (SEM)).
  • SEM standard error
  • saline indicates a control group
  • “1r10” indicates a peptide 1r10 administration group. It is a photograph which shows the auricle part of a mouse 4 days after the start of administration of a peptide.
  • Arrows indicate the margin of the pinna where desquamation is easily seen. It is a graph which shows the transition of auricle thickness during a peptide administration period (the vertical axis is a relative value with the peptide administration start date as 100%). Each point indicates the mean value and standard error (* p ⁇ 0.05; Repeated one way ANOVA test; post hoc Tukey-Kramer test). It is a representative photograph which shows the H.E. staining image of the skin section of the auricle 4 days after the start of peptide administration. The arrows in the photo show an example of the measured dermis thickness.
  • Laminin was used to label tissue internal structures (blood vessels, basement membranes, nerves), and DAPI was used as a counterstain for the DNA of each cell.
  • the present inventors have previously found a substance having an action of activating stem cells in a living body or mobilizing to injured tissue via peripheral circulation, and the substance is a new type that can overcome the weaknesses of cell therapy. We believe that it is promising as a medicine. Specifically, the present inventors have Platelet-derived growth factor receptor ⁇ (PDGFR ⁇ ) -positive cells in which High mobility group box 1 (HMGB1) released from necrotic tissue plays a role in inducing tissue regeneration in vivo. It has been found that by mobilizing mesenchymal stem cells (MSCs) to necrotic tissue via peripheral circulation, inflammation of necrotic tissue is suppressed and tissue regeneration is promoted.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the present inventors have also found that a fragment peptide of HMGB1 exhibits peripheral blood mobilization activity and tissue regeneration-inducing activity of mesenchymal stem cells.
  • the present inventors have synthesized a plurality of peptides consisting of a partial sequence of the artificial sequence peptide "1r10" found above (hereinafter, also referred to as "1r10 fragment peptide"), and investigated the presence or absence of MSC blood mobilization activity.
  • the 1r10 fragment peptide containing a specific amino acid sequence showed the activity, and that there was one core region showing the MSC blood mobilization activity on the N-terminal side and the C-terminal side of the peptide 1r10. ..
  • mesenchymal stem cells exert anti-inflammatory, immunomodulatory, and antifibrotic effects.
  • mesenchymal stem cells also have pluripotency that allows them to differentiate into various tissues, it is well known to those skilled in the art that they exert an action of promoting regeneration of injured tissues. Therefore, a 1r10 fragment peptide having an activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood or a peptide having an activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood containing the amino acid sequence of the fragment peptide is administered to a subject.
  • the mesenchymal stem cells are mobilized in the peripheral blood, and the mesenchymal stem cells have an anti-inflammatory action, an immunomodulatory action, an antifibrotic action, and a tissue regeneration promoting action (differentiation and / or anti-inflammatory action of the mesenchymal stem cells). It is thought that (according to) will bring about therapeutic effects on various diseases.
  • the artificial sequence peptide 1r10 previously found by the present inventors has a therapeutic effect on inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, and cerebral infarction, which is the recruitment of mesenchymal stem cells into the peripheral blood. It is considered that the effect is brought about through. Therefore, a 1r10 fragment peptide having an activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood, or a peptide having an activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood containing an amino acid sequence of the fragment peptide is an artificial sequence. Similar to peptide 1r10, it is thought to have a therapeutic effect on inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, and cerebral infarction.
  • the "artificial sequence peptide” refers to a peptide having an amino acid sequence that does not exist in nature. Further, in the present application, the “artificial sequence peptide” is also simply referred to as an “artificial peptide”.
  • the "1r10 fragment peptide” refers to a peptide consisting of a part of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the artificial sequence peptide 1r10.
  • the present application provides a composition for use in recruiting mesenchymal stem cells into peripheral blood, which contains a specific 1r10 fragment peptide or a peptide containing the amino acid sequence of the fragment peptide.
  • composition for use in mobilizing mesenchymal stem cells into the peripheral blood of the present application can be used as a pharmaceutical composition or a reagent composition.
  • pharmaceutical composition is used interchangeably with “pharmaceutical”, “drug” or “pharmaceutical composition”
  • reagent composition is used interchangeably with “reagent”. Be done.
  • composition for use in mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood of the present application can be used for treating a disease or pathological condition in a subject by, for example, mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood.
  • the mesenchymal stem cells mobilized in the peripheral blood using the composition for mobilizing the mesenchymal stem cells into the peripheral blood of the present application are collected from the body and then concentrated to concentrate the disease or pathological condition in the subject. It can also be used for the treatment of.
  • the present application also provides the use of a particular 1r10 fragment peptide or a peptide containing the amino acid sequence of the fragment peptide in the manufacture of a medicament or reagent for recovering mesenchymal stem cells from the body.
  • composition for use in mobilizing mesenchymal stem cells into the peripheral blood of the present application can also be used in, for example, basic research, clinical research, and the like.
  • Basic research and clinical research include, but are not limited to, mesenchymal stem cell mobilization research in vitro and mesenchymal stem cell mobilization research in experimental animals.
  • the present application also includes the use of a specific 1r10 fragment peptide or a peptide containing the amino acid sequence of the fragment peptide (these peptides are also hereinafter simply referred to as "peptides") in the manufacture of a drug or reagent for basic research or clinical research. Also provide.
  • composition for use in mobilizing mesenchymal stem cells into the peripheral blood of the present application may contain one or more peptides.
  • mesenchymal stem cells are cells having the ability to differentiate into mesenchymal tissues / cells such as bone, cartilage, fat, and muscle, and the ability to self-renew.
  • mesenchymal stem cells also have the ability to differentiate into epithelial and neural tissues.
  • Mesenchymal stem cells having self-renewal ability can be discriminated using, for example, having colony forming ability as an index.
  • mesenchymal stem cells are cells capable of colonizing.
  • Mesenchymal stem cells can be collected from bone marrow or other tissues (blood, such as umbilical cord blood, and skin, fat, pulp, etc.) and can be cultured and proliferated as cells attached to a solid phase, for example, a culture dish.
  • the mesenchymal stem cells in the present application may exist as a heterogeneous cell population including not only stem cells in a narrow sense (cells having self-renewal ability and differentiation ability) but also progenitor cells, and under culture conditions, stem cells in a narrow sense, Alternatively, it may include differentiated cells in addition to stem cells and progenitor cells in the narrow sense. In one embodiment, the mesenchymal stem cells may be composed only of stem cells in the narrow sense.
  • a progenitor cell is defined as a cell having a unidirectional differentiation ability into a specific tissue cell other than the blood system, and has a differentiation ability into a mesenchymal tissue, an epithelial tissue, a nerve tissue, a parenchymal organ, and a vascular endothelium. Contains cells that have.
  • the mesenchymal stem cells include, but are not limited to, bone marrow mesenchymal stem cells and bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • bone marrow mesenchymal stem cells are mesenchymal stem cells existing in the bone marrow.
  • bone marrow mesenchymal stem cells also have the ability to differentiate into epithelial and neural tissues.
  • bone marrow mesenchymal stem cells are cells capable of colonizing.
  • bone marrow mesenchymal stem cell is used interchangeably with “bone marrow mesenchymal stromal cell”, “bone marrow pluripotent stem cell” or “bone marrow pluripotent stromal cell”.
  • bone marrow-derived mesenchymal stem cells refers to mesenchymal stem cells mobilized from the bone marrow to the outside of the bone marrow.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells can be obtained by collecting peripheral blood, and also from mesenchymal tissues such as fat, epithelial tissues such as skin, and nerve tissues such as brain.
  • mesenchymal tissues such as fat, epithelial tissues such as skin, and nerve tissues such as brain.
  • the term “bone marrow-derived mesenchymal stem cell” is used interchangeably with “bone marrow-derived mesenchymal cell", “bone marrow-derived pluripotent stem cell” or “bone marrow-derived pluripotent stromal cell”. Be done.
  • the bone marrow mesenchymal stem cells and the bone marrow-derived mesenchymal stem cells are prepared, for example, by administering the cells directly after collection or once attached to the culture dish to the injured part of the living body, for example, keratinocytes constituting the skin. It may also have the ability to differentiate into epithelial tissues and tissues of the nervous system that constitutes the brain.
  • Mesenchymal stem cells derived from bone marrow and mesenchymal stem cells derived from bone marrow are osteoblasts (identifiable by recognizing calcium deposition when inducing differentiation), cartilage cells (positive for alcian blue staining, positive for safranin-O staining, etc.) In addition to fat cells (identifiable by Zudan III staining positive, etc.), mesenchymal cells such as fibroblasts, smooth muscle cells, skeletal muscle cells, stromal cells, and tendon cells, nerve cells, and pigment cells.
  • Epidermal cells Epidermal cells, hair follicle cells (expressing cytokeratin family, hair keratin family, etc.), epithelial cells (for example, epidermal keratinized cells, intestinal epithelial cells express cytokeratin family, etc.), endothelial cells, and liver, It may have the ability to differentiate into parenchymal organ cells such as kidney and pancreas, but the differentiated cells are not limited to the above cells.
  • PDGFR ⁇ positive, PDGFR ⁇ positive, Lin negative, CD45 negative, CD44 positive, CD90 positive, CD29 positive, Flk-1 negative, CD105 positive, CD73 positive, CD90 positive, CD71 positive, Stro- All or part of 1-positive, CD106-positive, CD166-positive, CD31-negative, CD271-positive, and CD11b-negative can be exemplified, but are not limited thereto.
  • Markers for mouse mesenchymal stem cells include CD44 positive, PDGFR ⁇ positive, PDGFR ⁇ positive, CD45 negative, Lin negative, Sca-1 positive, c-kit negative, CD90 positive, CD105 positive, CD29 positive, Flk-1 negative, CD271. All or part of positive and CD11b negative can be exemplified, but not limited thereto.
  • markers for rat mesenchymal stem cells include PDGFR ⁇ positive, CD44 positive, CD54 positive, CD73 positive, CD90 positive, CD105 positive, CD29 positive, CD271 positive, CD31 negative, and CD45 negative, all or part of these. It is not limited to.
  • the mesenchymal stem cells are PDGFR ⁇ -positive mesenchymal stem cells, PDGFR ⁇ -positive bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and PDGFR ⁇ -positive bone marrow-derived cells, which are obtained by bone marrow collection (bone marrow cell collection) or peripheral blood collection. By culturing mononuclear cell fractions in the obtained blood, cells obtained as adherent cells can be exemplified, but the cells are not limited thereto. Examples of PDGFR ⁇ -positive mesenchymal stem cells include PDGFR ⁇ and CD44-positive cells, PDGFR ⁇ and CD90-positive cells, PDGFR ⁇ and CD105-positive cells, PDGFR ⁇ and CD29-positive cells, and the like. Be done. In one embodiment, PDGFR ⁇ -positive mesenchymal stem cells may be CD44-negative cells.
  • compositions for use in the treatment of a disease or pathological condition in a subject by recruiting mesenchymal stem cells into peripheral blood which comprises a particular 1r10 fragment peptide or a peptide comprising the amino acid sequence of the fragment peptide. offer.
  • composition for use in the treatment of a disease or pathological condition in a subject by mobilizing mesenchymal stem cells into the peripheral blood of the present application can be used as a pharmaceutical composition.
  • the target in the present application is not particularly limited, and includes mammals, birds, fish, and the like.
  • mammals include humans and non-human animals, and examples thereof include, but are limited to, humans, mice, rats, monkeys, pigs, dogs, rabbits, hamsters, guinea pigs, horses, sheep, and whales. is not it.
  • the term "subject” is used interchangeably with "patient,” “individual,” or "animal.”
  • composition for use in the treatment of a disease or pathological condition in a subject by mobilizing mesenchymal stem cells into the peripheral blood of the present application may include one or more peptides.
  • the treatment of a disease or pathological condition is selected from, for example, anti-inflammatory treatment, immunomodulatory treatment, tissue regeneration-inducing treatment, and tissue fibrosis-suppressing treatment, but is not limited thereto.
  • the disease or pathological condition is selected from, for example, inflammatory disease, autoimmune disease, tissue damage, ischemic or necrotic disease, and fibrous disease, but is not limited thereto.
  • examples of inflammatory diseases include, but are not limited to, inflammatory bowel disease and atopic dermatitis.
  • autoimmune diseases include, but are not limited to, inflammatory bowel disease.
  • Fibrotic diseases include, but are not limited to, pulmonary fibrosis, for example.
  • Diseases associated with tissue damage, ischemia or necrosis include, but are not limited to, inflammatory bowel disease and cerebral infarction, for example.
  • Inflammatory bowel disease includes, but is not limited to, ulcerative colitis and Crohn's disease.
  • the term "activity to mobilize mesenchymal stem cells into peripheral blood” is compatible with “activity to increase the abundance of mesenchymal stem cells in peripheral blood” and “MSC blood mobilization activity”. Used.
  • the MSC blood mobilization activity of the peptide in the present application is, for example, i) Collecting peripheral blood from an individual to which the peptide has been administered and an individual to which the peptide has not been administered, and seeding and culturing in a culture dish (several days to 10). Day), counting the number of colonies formed, and ii) the cells that formed the colonies have adherence to the solid phase and differentiate into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes. It can be evaluated by confirming that it has the ability.
  • red blood cells may be removed from the peripheral blood by a desired method before seeding the collected peripheral blood in the culture dish.
  • surface marker analysis, transcriptome analysis, etc. are performed on the cells that have formed colonies, and the cells have properties characteristic of mesenchymal stem cells. May be confirmed.
  • the peptide in the present application can be obtained as a recombinant by incorporating the DNA encoding it into an appropriate expression system, or can be artificially synthesized. Therefore, the peptides in the present application include peptides produced using cells and artificially synthesized peptides (so-called synthetic peptides).
  • the DNA encoding the peptide may be incorporated into an appropriate expression system and expressed.
  • Hosts applicable to the present application include, but are not limited to, prokaryotic cells and eukaryotic cells. Further, examples of hosts applicable to the present application include bacteria (for example, Escherichia coli), yeast, animal cells (for example, mammalian cells such as HEK293 cells and CHO cells, insect cells such as silkworm cells), and plant cells. , Not limited to these.
  • the expression vector pGEX and Escherichia coli can be shown. Since pGEX can express a foreign gene as a fusion protein with glutathione S-transferase (GST) (Gene, 67: 31-40, 1988), pGEX incorporating the DNA encoding the peptide of the present application is heat-shocked. It is introduced into an Escherichia coli strain such as BL21, and after an appropriate culture time, isopropylthio- ⁇ -D-galactoside (IPTG) is added to induce the expression of the GST fusion peptide. Since GST in the present application is adsorbed on glutathione sepharose 4B, the expression product can be easily separated and purified by affinity chromatography.
  • GST glutathione S-transferase
  • the following can be applied as a host / vector system for obtaining a genetically modified product of the peptide of the present application.
  • a host when a bacterium is used as a host, a vector for expressing a fusion protein using a tag or the like is commercially available.
  • the genetically modified product of the present application includes a state in which a tag or a part of a peptide thereof is added.
  • the tags added to the peptides of the present application are not particularly limited as long as they do not affect the activity of the peptides of the present application, and are, for example, histidine tags (for example, 6 ⁇ His, 10 ⁇ His), HA tags, FLAG tags, GST tags, etc. Examples include T7-tag, HSV-tag, E-tag, lck tag, and B-tag.
  • Pichia yeast is effective for the expression of proteins having sugar chains.
  • an expression system using an insect cell-hosted baculovirus vector is also useful (Bio / Technology, 6: 47-55, 1988).
  • mammalian cells are used to transfect vectors using promoters such as CMV, RSV, or SV40, and these host / vector systems are all used as expression systems for the peptides of the present application. It can be used.
  • genes can be introduced using virus vectors such as plasmid vector, retrovirus vector, lentivirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector Sendaivirus vector, Sendaivirus envelope vector, and papillomavirus vector. It is not limited to these.
  • the vector may contain a promoter DNA sequence that effectively induces gene expression, factors that control gene expression, and molecules necessary to maintain the stability of the DNA.
  • the obtained peptide of the present application can be isolated from the intracellular or extracellular (medium, etc.) of the host cell and purified as a substantially pure and uniform peptide. Separation and purification of the peptide may be performed by using the separation and purification method used in the usual purification of the peptide, and is not limited in any way. For example, chromatographic column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected. When combined, peptides can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography and the like (Marshak et al., Strategies for Protein Purification and characterization: A Laboratory). Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographies can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC or FPLC.
  • the peptide of the present application is preferably a substantially purified peptide.
  • substantially purified means that the degree of purification of the peptide of the present application (the ratio of the peptide of the present application to the total protein component) is 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90%. Above, it means that it is 95% or more, 100% or close to 100%. The upper limit close to 100% depends on the purification technology and analysis technology of those skilled in the art, and is, for example, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99%.
  • any peptide having the above-mentioned degree of purification which has been purified by any purification method, is included in the substantially purified peptide.
  • the above-mentioned chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization and the like are appropriately used.
  • substantially purified peptides can be exemplified, but are not limited thereto.
  • the peptide of the present application can also be artificially synthesized.
  • peptides can be chemically synthesized by methods such as a peptide liquid phase synthesis method and a peptide solid phase synthesis method.
  • the peptide solid-phase synthesis method is one of the methods generally used when chemically synthesizing a peptide. Beads of polystyrene polymer gel with a diameter of about 0.1 mm whose surface is modified with an amino group are used as a solid phase, and amino acid chains are extended one by one by a dehydration reaction from here. When the sequence of the target peptide is completed, it is excised from the solid phase surface to obtain the target substance.
  • body eg, seleno amino acids such as selenomethionine
  • modify peptides and protein backbones and the like.
  • the peptide of the present application may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt of the peptide.
  • Examples of pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, hydrochlorides, acetates, trifluoroacetates and the like.
  • the peptide of the present application may be in the form of a solvate of the peptide or a solvate of a pharmaceutically acceptable salt of the peptide.
  • the solvate refers to a solute molecule in which an arbitrary number of solvent molecules are coordinated, and examples thereof include, but are not limited to, hydrates.
  • amino acid length of the 1r10 fragment peptide in the present application is in the range of, for example, 11 to 29 amino acids, for example, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. , 27, 28, or 29 amino acids.
  • examples of the 1r10 fragment peptide include peptides selected from the following: (1) A peptide consisting of a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19; (2) Peptide consisting of the 1st to 27th amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 (1r10_N03; SEQ ID NO: 2); (3) Peptide consisting of the 1st to 26th amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 (1r10_N04; SEQ ID NO: 3); (4) Peptide consisting of the 1st to 25th amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 (1r10_N05; SEQ ID NO: 4); (5) Peptide consisting of the 1st to 24th amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 (1r10_N06; SEQ ID NO: 5); (6) Peptide consisting of the 1st to 23rd amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 (1r10_N
  • amino acid sequences described in (1) to (17) above the "18th to 30th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1" (amino acid sequence of SEQ ID NO: 17) and the above (Amino acid sequence of SEQ ID NO: 17) described in (16) above. 17), "SEQ ID NO: 1: 6th to 16th amino acid sequence” (SEQ ID NO: 19 amino acid sequence) is a core region in which the 1r10 fragment peptide is important for maintaining MSC blood mobilization activity. be. MSC blood mobilization activity is retained if the 1r10 fragment peptide contains at least one of the two core regions.
  • Peptides of the present application also include peptides selected from the following: (I) A peptide consisting of all or part of the amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A peptide containing an amino acid sequence; and (ii) a peptide consisting of all or part of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or 19. Peptides containing. Such peptides can be produced by methods well known to those of skill in the art.
  • the peptides selected from the above (i) and (ii) are, for example, 30 or less, 29 or less, 28 or less, 27 or less, 26 or less, 25 or less, 24 or less, 23 or less, 22. Consists of 21 or less, 20 or less, 19 or less, 18 or less, 17 or less, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, or 11 or less amino acids. It can be a peptide.
  • the peptide selected from the above (i) and (ii) can be a peptide excluding the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • “1 to 5" includes, for example, 5, 4, 3, 2, 1, 1 to 5, 1 to 4, and 1 piece. ⁇ 3, or 1 or 2 can be mentioned.
  • “90% or more” can be expressed as “90% or more and less than 100%", and "90% or more” means, for example, 90% or more, 91% or more, 92%. Above, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more can be mentioned.
  • the 1r10 fragment peptide selected from the above (1) to (17) is a 1r10 fragment peptide having an activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood.
  • the peptide selected from the above (i) and (ii) is also a peptide having an activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood. Therefore, these peptides have the effect of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood, as well as the therapeutic effect of inflammatory diseases, autoimmune diseases, tissue damage, diseases associated with ischemia or necrosis, and fibrotic diseases. Conceivable.
  • the present application also provides peptides disclosed herein, for example, 1r10 fragment peptides selected from (1) to (17) above, and peptides selected from (i) and (ii) above.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the artificial sequence peptide 1r10 of the present application.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 19 are the amino acid sequences of the 1r10 fragment peptides of the present application.
  • the regions corresponding to the amino acid sequences of the 1r10 fragment peptides in the amino acid sequence (1r10 amino acid sequence) shown in SEQ ID NO: 1 are shown in Table 1 below.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 is an example of the base sequence of the DNA encoding the artificial sequence peptide 1r10 of the present application.
  • the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 21 and 22 are examples of the nucleotide sequences of DNAs encoding the 1r10 fragment peptides of the present application, 1r10_C17 and 1r10_MF5, respectively.
  • the region corresponding to the base sequence of the DNA encoding the 1r10 fragment peptide in the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 (exemplified base sequence of 1r10) is shown in Table 1 below.
  • the DNA can be prepared by a method (reverse translation) of converting an amino acid residue of an artificial sequence peptide 1r10 or 1r10 fragment peptide into a corresponding codon using a codon table known to those skilled in the art. Reverse translation can optionally be performed using a variety of software (including programs, algorithms, etc.) developed for the analysis of amino acid and nucleic acid sequences.
  • composition an effective amount of the peptide of the present application or a pharmaceutical composition containing the same (hereinafter referred to as "pharmaceutical composition, etc.") is administered to a subject for the treatment of the diseases and symptoms described in the present specification.
  • the effective amount in the present application means an amount sufficient for the treatment of the diseases or pathological conditions described in the present specification.
  • Treatments in the present application include, but are not limited to, alleviation, delay, inhibition, amelioration, remission, cure, complete cure, and the like.
  • the administration site of the pharmaceutical composition of the present application there is no limitation on the administration site of the pharmaceutical composition of the present application, and the site where the symptoms of the disease or pathological condition appear or its vicinity, the site different from them (sites other than them), and the site where the symptoms of the disease or pathological condition appear.
  • the site where the symptoms of the disease or pathological condition appear or its vicinity the site different from them (sites other than them), and the site where the symptoms of the disease or pathological condition appear.
  • any part such as a part away from, a part distal to the part where the symptoms of the disease or pathological condition appear, or a part which is distal and ectopic to the part where the symptoms of the disease or the pathological condition appear.
  • the pharmaceutical composition of the present application and the like can exert its effect.
  • the pharmaceutical composition and the like of the present application are derived from a tissue different from the tissue in which the symptoms of the disease or the pathological condition appear, a tissue distant from the tissue in which the symptoms of the disease or the pathological condition appear, or a tissue in which the symptoms of the disease or the pathological condition appear. It can exert its effect when administered to any tissue, such as tissue that is distal or tissue that is distal and ectopic to tissue that manifests symptoms of a disease or pathological condition.
  • parenteral administration methods include intravascular administration (arterial administration, intravenous administration, etc.), intramuscular administration, and subcutaneous administration.
  • Intradermal administration, intraperitoneal administration, nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration, and the like are included, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present application is administered by injection, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc., systemically or locally (for example, subcutaneous, intradermal, skin surface, eyeball, or palpebral condyle).
  • Nasal mucosa, oral and gastrointestinal mucosa, vaginal / intrauterine mucosa, or injured site for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc.
  • a cell secreting the peptide a gene therapy vector into which a DNA encoding the peptide is inserted, and a pharmaceutical composition containing these can also be used.
  • the administration method can be appropriately selected according to the patient's age and symptoms.
  • the dose can be selected in the range of 0.0000001 mg to 1000 mg per 1 kg of body weight per administration.
  • the dose can be selected in the range of 0.00001 to 100000 mg / body per patient.
  • the pharmaceutical compositions in the present application are not limited to these doses.
  • the pharmaceutical composition of the present application can be formulated according to a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA) and contains both pharmaceutically acceptable carriers and additives. There may be.
  • a conventional method for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA
  • pharmaceutically acceptable carriers and additives There may be.
  • the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used.
  • the present invention is further exemplified by the following examples, but is not limited thereto.
  • peripheral blood 800 ⁇ L of peripheral blood was collected from the heart from the heart under general anesthesia 16 hours after administration of saline or 1% DMSO or peptide (using a 1 mL syringe containing heparin). ).
  • peripheral blood collected from 3 mice was pooled, and an equivalent amount of Hetasep (STEMCELL Technologies, Cat No. ST-07906) was used to remove red blood cells.
  • the supernatant was collected after centrifuging at 100 G for 2 minutes and incubating at room temperature for 15 minutes. The supernatant was used in the next experiment as a sample containing nucleated cells in peripheral blood.
  • the cells were cultured for 10 days under the conditions of 37 ° C., 5% CO 2 , and 5% O 2 using a medium containing streptomycin (Nakalitesk) (all numerical values are final concentrations).
  • the medium was replaced with fresh medium twice a week during the culture period.
  • cells on the plate were stained with a Differential Quik Stain Kit (Sysmex Corporation, Cat No. 16920), and the number of colonies containing 50 or more cells was counted.
  • HMGB1 peptide 1-44 peripheral blood after administration of a peptide consisting of amino acid residues 1-44 of human HMGB1 protein having the activity of mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood (hereinafter referred to as HMGB1 peptide 1-44) is administered on a solid phase. All the colonies obtained as a result of culturing also have adhesion to the solid phase and self-renewal ability, and it has been confirmed that they are PDGFR ⁇ positive, and the transcriptome analysis data is clustered to perform gene ontology analysis. From the results of the test, it was confirmed that the gene expression profile was characteristic of mesenchymal stem cells.
  • the colonies obtained as a result of culturing peripheral blood on a solid phase are mesenchymal stem cells, and an increase in the number of colonies detected in a solid phase culture of peripheral blood indicates an increase in the number of mesenchymal stem cells in peripheral blood. it is conceivable that.
  • mesenchymal stem cells are usually rarely present in peripheral blood, it is considered that the increased amount of mesenchymal stem cells was mobilized into peripheral blood from tissues other than peripheral blood (for example, bone marrow).
  • the number of colonies detected in the solid-phase culture of peripheral blood after administration of the test substance can be used as an index of the activity of the test substance to mobilize mesenchymal stem cells into the peripheral blood.
  • the timing (peak time) at which the number of mesenchymal stem cells in the peripheral blood reaches the maximum after administration of the test substance is considered to vary from individual to individual, and in the above peripheral blood colony assay, the timing of blood sampling (1r10 and fragments thereof) In the case of peptides, it often happens that the peak times of the number of mesenchymal stem cells in the peripheral blood do not match (16 hours after administration of the test substance). Therefore, instead of averaging the results of multiple assays, it was decided that the test substance that produced a number of colonies exceeding a predetermined threshold even once was evaluated as having MSC blood mobilization activity.
  • the number of colonies formed in the negative control is "10" no matter how many times the assay is performed. It has been confirmed that it is less than. Therefore, in this example, the number of colonies as a threshold value is set to "10", and the test substance that has produced "10 or more" colonies even once out of 4 to 6 times of the assay is used. It was determined to be a substance with MSC blood mobilization activity.
  • DSS Drug Dextran sodium sulfate
  • peptide 1r10 TAA salt
  • IBD inflammatory bowel disease
  • Peptide was administered in an amount of 10 mL / kg of a solution of peptide 1r10 adjusted to a concentration of 0.5 mg / mL using physiological saline as a solvent on the 1, 4, 7, 8 and 9 days after the start of drinking the DSS aqueous solution.
  • Peptide dose was 5 mg / kg) by injection into the tail vein.
  • the control group was infused with saline at a dose of 10 mL / kg into the tail vein on days 1, 4, 7, 8 and 9 after the start of drinking the DSS aqueous solution.
  • Results Figure 3 shows the changes in mouse body weight during the test period (see “saline” for the control group and "1r10" for the peptide-administered group).
  • the body weight decreased over time after the start of drinking DSS, but the degree of decrease was slower in the peptide-administered group than in the control group, and 10 days after the start of drinking the DSS aqueous solution, the peptide-administered group lost weight. Body weight showed a tendency to recover.
  • the stool score (the sum of the "stool condition” score and the “bleeding” score scored as shown in Table 3 above) and the DAI score 8 to 10 days after the start of drinking the DSS aqueous solution are shown in FIGS. 4 and 5, respectively. (See “saline” for the control group and “1r10" for the peptide-administered group). Both the stool score and the DAI score were lower in the peptide-administered group than in the control group.
  • IBD In IBD, inflammation occurs in the mucous membrane of the intestinal tract, erosions and ulcers are formed, and symptoms such as narrowing and shortening of the intestinal tract may occur.
  • weight loss occurs as another symptom of IBD, and the cause is considered to be deterioration of nutritional status due to inflammation and tissue damage (ulcer, etc.) occurring in the mucous membrane of the intestinal tract.
  • intravenous injection of mesenchymal stem cells in an animal IBD model improves various symptoms including weight loss, epithelial damage in the intestinal tract, and infiltration of inflammatory cells. The improvement of such symptoms is due to the suppression of inflammation of the intestinal mucosa by the anti-inflammatory action of mesenchymal stem cells, and the promotion of regeneration of mucosal tissue as a result.
  • Drugs MC903 (generic name: Calcipotriol) was used to induce atopic dermatitis (hereinafter, also referred to as “AD”) in mice.
  • AD atopic dermatitis
  • the peptide 1r10 (TFA salt) described in Reference Example 1 was used as a test substance.
  • atopic dermatitis model mice C57BL / 6 mice (C57BL / 6JJcl, 7-8 weeks old, male, microbial grade SPF) were obtained from Japan Claire Co., Ltd. and acclimated in the animal breeding room for 5 days or more. Later, it was subjected to the following experiments. An ethanol-adjusted MC903 solution was applied to the skin of the auricle of the mouse at a dose of 2.25 nmol MC903 / ear / once / day 5 times a week for 2 weeks (10 times in total) to achieve atopic dermatitis. Induced dermatitis (AD).
  • AD Induced dermatitis
  • Such an MC903-induced AD model induces a series of type 2 immune response cascades by artificially inducing TSLP secretion from epithelial cells actually seen in AD patients, resulting in a short-term (1-1) AD-like pathology. It is a model that can be reproduced in 2 weeks) (Li M et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 11736-41.).
  • the appearance and tissue of the epidermis of normal mice and AD-induced mice were observed by MC903.
  • Epidermis Acanthosis thickening of the epidermis due to spinous cell proliferation), disruption of local barriers, infiltration of immune cells into the dermis, increased dermis thickness, and spongiosis in parts of the epidermis. has also been confirmed.
  • the solution of peptide 1r10 was injected into the tail vein at a volume of 5 mL / kg (1.5 mg / kg as the dose of peptide).
  • the control group was adjusted to 0.3 mg / mL with saline twice, once on the grouping day (Day 15) and once during the following 4 days (Day 16 to Day 19).
  • a solution of bovine serum albumin (BSA) was injected into the tail vein in a volume of 5 mL / kg (1.5 mg / kg as the dose of BSA).
  • mice were placed under the influence of isoflurane anesthesia, cervical spine dislocation was performed and euthanized, and while preventing protein denaturation of the sample on ice, the auricular inflammation site and The skin in the surrounding area was cut and collected. After removing excess hair and skin with tweezers, the collected auricular skin was immersed in 10% Formalin and fixed overnight at 4 ° C. with shaking on ice using a shaker.
  • hematoxylin and eosin (HE) staining was performed on the paraffin slice (5 ⁇ m thickness) of the skin tissue prepared as described above, and the dermis thickness was measured.
  • three sections were prepared for each individual, and each section was imaged with a microscope (Keyence BZ-X710) at the center of inflammation (center), cranial side (Head), and caudal side (Tail). (That is, a total of 9 shots were taken per individual).
  • Auricular thickness (edema) The transition of auricular thickness (edema) during the peptide administration period is shown in FIG. 8 (see “Control” for the control group and “1r10” for the peptide administration group). A statistically significant reduction in auricular thickness was observed in the peptide-administered group as compared with the control group.
  • mice body weight during the period of this study were not significantly different in any of the groups, and were statistically significant between the groups. No change was observed (p> 0.05, Repeated one-way ANOVA).
  • the right common carotid artery, right external carotid artery and right internal carotid artery were exposed, and the right common carotid artery and right external carotid artery were ligated with sutures.
  • a No. 4 nylon thread (embolus) pre-coated with silicon and cut to a length of 19 mm was inserted from the bifurcation of the right external carotid artery and the right internal carotid artery to occlude the right middle cerebral artery (MCA). .. After occlusion of the right MCA, the cervical skin was sutured and released from anesthesia. Thirty minutes after the right MCA occlusion, flexion of the contralateral forelimb on the obstructed side was confirmed.
  • Peptide Peptide is administered in a volume of 2 mL / kg of a solution of peptide 1r10 adjusted to a concentration of 1 mg / mL using physiological saline as a solvent at 105 minutes and 24 hours after occlusion of the right MCA.
  • the dose was 2 mg / kg) by injection into the tail vein.
  • the control group was injected with saline at a volume of 2 mL / kg into the tail vein 105 minutes and 24 hours after right MCA occlusion.
  • TTC 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride
  • V Cerebral infarction volume or total brain volume (mm 3 )
  • a Cerebral infarct area or brain cross-section (mm 2 ) on a 4 mm anterior cross section of Bregma
  • b Cerebral infarct area or brain cross-section (mm 2 ) on Bregma anterior 2 mm cross-section
  • c Cerebral infarct area or brain cross-sectional area on Bregma cross section (mm 2 )
  • d Cerebral infarct area or brain cross-section (mm 2 ) on a 2 mm posterior cross section of Bregma
  • e Cerebral infarct area or brain cross-section (mm 2 ) on a 4 mm posterior cross section of Bregma
  • f Cerebral infarct area or brain cross-section (mm 2 ) on a 6 mm posterior cross section of Bregma
  • the effect of reducing the cerebral infarction lesion was obtained by administering the artificial sequence peptide of the present application to a cerebral infarction model rat.
  • This is a result of the action of the artificial sequence peptide of the present application, which mobilizes mesenchymal stem cells into the peripheral blood, and the cells exert an anti-inflammatory effect, a trophic effect (secretion of nutritional factor), a tissue regeneration effect, and the like. it is conceivable that.
  • the peptides of the present application are compositions for mobilizing mesenchymal stem cells into peripheral blood, and as therapeutic agents for inflammatory diseases, autoimmune diseases, fibrotic diseases, and diseases associated with tissue damage / ischemia / necrosis. Can be used.

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Abstract

本発明者らは、これまでに行った独自の研究から見出した人工配列ペプチド「1r10」の部分配列からなるペプチド（1r10断片ペプチド）を複数合成し、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性の有無を調べた結果、特定のアミノ酸配列を有する1r10断片ペプチドが当該活性を示すことを見出した。かかる知見に基づき、間葉系幹細胞の末梢血への動員を介して種々の疾患に治療効果を示すと考えられるペプチドを提供する。

Description

間葉系幹細胞の動員活性を有するペプチド
　本願は、間葉系幹細胞の動員活性を有するペプチド、間葉系幹細胞の動員用組成物および間葉系幹細胞の動員に基づく疾患治療薬に関する。
　骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、神経、上皮等、種々の組織に分化できる能力（多分化能）を有していることから、近年、培養により増殖させた骨髄由来間葉系幹細胞を用いて再生医療（細胞移植治療）を行う試みが広くなされている。しかし、間葉系幹細胞を含有する骨髄血の採取は、腸骨に太い針を何度も刺入する観血的手法で行われるためドナーへの負担が大きい。また、間葉系幹細胞は体外で継代培養を続けると次第に増殖能力や多分化能を失ってしまう。さらに、生体内移植の安全性を保証する高品質管理に基づいた間葉系幹細胞の培養はCPC（cell processing center）等の特殊培養設備を必要とするため、限られた大学や企業でしか実施できないのが現状である。
PNAS 2011 Apr 19;108(16):6609-14
WO2008/053892 WO2009/133939 WO2012/147470
　本願は、細胞移植治療の問題点を克服できる新たな再生医療の技術を開発することを目的とする。
　本発明者らはこれまでに、独自の研究結果に基づいて間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を有する人工配列ペプチド「1r10」を見出し、当該ペプチドについて特許出願を行っている（PCT/JP2019/039232）。今回、本発明者らは、人工配列ペプチド「1r10」の部分配列からなるペプチド（以下、「1r10断片ペプチド」とも称する）を複数合成し、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性の有無を調べた結果、特定のアミノ酸配列を有する1r10断片ペプチドが当該活性を示すことを見出した。本願は、かかる知見に基づき、間葉系幹細胞の末梢血への動員を介して種々の疾患に治療効果を示すと考えられるペプチドを提供する。
　すなわち、本願は以下を提供する。
〔１〕
　以下から選択されるペプチドを含有する、末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための組成物：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔２〕
　以下から選択されるペプチドを含有する、末梢血への間葉系幹細胞の動員による、対象における疾患または病的状態の治療に用いるための組成物：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔３〕
　疾患または病的状態の治療が、炎症抑制治療、免疫調節治療、組織の再生誘導治療、および組織の線維化抑制治療から選択される、〔２〕に記載の組成物。
〔４〕
　疾患または病的状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織の損傷、虚血もしくは壊死を伴う疾患、および線維性疾患から選択される、〔２〕に記載の組成物。
〔５〕
　疾患または病的状態が、炎症性腸疾患である、〔２〕に記載の組成物。
〔６〕
　疾患または病的状態が、潰瘍性大腸炎である、〔２〕に記載の組成物。
〔７〕
　疾患または病的状態が、アトピー性皮膚炎である、〔２〕に記載の組成物。
〔８〕
　疾患または病的状態が、脳梗塞である、〔２〕に記載の組成物。
〔９〕
　以下から選択されるペプチドを含有する、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎および脳梗塞から選択される疾患の治療に用いるための組成物：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔１０〕
　以下から選択されるペプチド：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ａ１〕
　以下から選択されるペプチドの有効量を対象に投与する工程を含む、末梢血へ間葉系幹細胞を動員する方法：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ａ２〕
　以下から選択されるペプチドの有効量を対象に投与する工程を含む、末梢血への間葉系幹細胞の動員により、対象における疾患または病的状態を治療する方法：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ａ３〕
　疾患または病的状態の治療が、炎症抑制治療、免疫調節治療、組織の再生誘導治療、および組織の線維化抑制治療から選択される、〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ４〕
　疾患または病的状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織の損傷、虚血もしくは壊死を伴う疾患、および線維性疾患から選択される、〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ５〕
　疾患または病的状態が、炎症性腸疾患である、〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ６〕
　疾患または病的状態が、潰瘍性大腸炎である、〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ７〕
　疾患または病的状態が、アトピー性皮膚炎である、〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ８〕
　疾患または病的状態が、脳梗塞である、〔Ａ２〕に記載の方法。
〔Ａ９〕
　以下から選択されるペプチドの有効量を対象に投与する工程を含む、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎および脳梗塞から選択される対象における疾患を治療する方法：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ｂ１〕
　末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための、以下から選択されるペプチド：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ｂ２〕
　末梢血への間葉系幹細胞の動員による、対象における疾患または病的状態の治療に用いるための、以下から選択されるペプチド：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ｂ３〕
　疾患または病的状態の治療が、炎症抑制治療、免疫調節治療、組織の再生誘導治療、および組織の線維化抑制治療から選択される、〔Ｂ２〕に記載のペプチド。
〔Ｂ４〕
　疾患または病的状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織の損傷、虚血もしくは壊死を伴う疾患、および線維性疾患から選択される、〔Ｂ２〕に記載のペプチド。
〔Ｂ５〕
　疾患または病的状態が、炎症性腸疾患である、〔Ｂ２〕に記載のペプチド。
〔Ｂ６〕
　疾患または病的状態が、潰瘍性大腸炎である、〔Ｂ２〕に記載のペプチド。
〔Ｂ７〕
　疾患または病的状態が、アトピー性皮膚炎である、〔Ｂ２〕に記載のペプチド。
〔Ｂ８〕
　疾患または病的状態が、脳梗塞である、〔Ｂ２〕に記載のペプチド。
〔Ｂ９〕
　炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎および脳梗塞から選択される疾患の治療に用いるための、以下から選択されるペプチド：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ｃ１〕
　末梢血への間葉系幹細胞の動員のための医薬または試薬の製造における、以下から選択されるペプチドの使用：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ｃ２〕
　末梢血への間葉系幹細胞の動員による、対象における疾患または病的状態の治療のための医薬の製造における、以下から選択されるペプチドの使用：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
〔Ｃ３〕
　疾患または病的状態の治療が、炎症抑制治療、免疫調節治療、組織の再生誘導治療、および組織の線維化抑制治療から選択される、〔Ｃ２〕に記載の使用。
〔Ｃ４〕
　疾患または病的状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織の損傷、虚血もしくは壊死を伴う疾患、および線維性疾患から選択される、〔Ｃ２〕に記載の使用。
〔Ｃ５〕
　疾患または病的状態が、炎症性腸疾患である、〔Ｃ２〕に記載の使用。
〔Ｃ６〕
　疾患または病的状態が、潰瘍性大腸炎である、〔Ｃ２〕に記載の使用。
〔Ｃ７〕
　疾患または病的状態が、アトピー性皮膚炎である、〔Ｃ２〕に記載の使用。
〔Ｃ８〕
　疾患または病的状態が、脳梗塞である、〔Ｃ２〕に記載の使用。
〔Ｃ９〕
　炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎および脳梗塞から選択される疾患の治療のための医薬の製造における、以下から選択されるペプチドの使用：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
生理食塩水、1% DMSO、またはペプチドの投与16時間後の末梢血を培養して得られたコロニーの数をプロットしたグラフである。グラフ中、「Saline」および「DMSO」が対照群、その他がペプチド投与群をそれぞれ示す。コロニー数は、マウス１匹から採取した末梢血量（800μL）あたりの値として示した。エラーバーにおいて、長い横棒が平均値、短い横棒が標準偏差を表す。点線は、活性の有無を判定するための閾値（コロニー数：１０個）を表す。 生理食塩水またはペプチドの投与16時間後の末梢血を培養して得られたコロニーの数をプロットしたグラフである。グラフ中、「Saline」が対照群、その他がペプチド投与群をそれぞれ示す。コロニー数は、マウス１匹から採取した末梢血量（800μL）あたりの値として示した。エラーバーにおいて、長い横棒が平均値、短い横棒が標準偏差を表す。点線は、活性の有無を判定するための閾値（コロニー数：１０個）を表す。 マウスの体重変化を示すグラフである（平均±標準誤差（SEM）； * p<0.05（Student’s t test））。グラフ中、「saline」が対照群、「1r10」がペプチド1r10投与群をそれぞれ示す。横軸はデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）水溶液の飲水開始後の日数を示す。 マウスの便スコアを示すグラフである（平均±標準誤差（SEM））。グラフ中、「saline」が対照群、「1r10」がペプチド1r10投与群をそれぞれ示す。横軸はデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）水溶液の飲水開始後の日数を示す。 マウスのDAIスコアを示すグラフである（平均±標準誤差（SEM）； * p<0.05（Mann Whitney U test））。グラフ中、「saline」が対照群、「1r10」がペプチド1r10投与群をそれぞれ示す。横軸はデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）水溶液の飲水開始後の日数を示す。 デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）水溶液の飲水開始10日後の大腸長を示すグラフである（平均±標準誤差（SEM））。グラフ中、「saline」が対照群、「1r10」がペプチド1r10投与群をそれぞれ示す。 ペプチドの投与開始4日後におけるマウスの耳介部を示す写真である。矢印は落屑の見られやすい耳介辺縁部を示す。 ペプチド投与期間中の耳介厚の推移を示すグラフである（縦軸はペプチド投与開始日を100%とする相対値）。各ポイントは平均値と標準誤差を示す (*p<0.05; Repeated one way ANOVA test; post hoc Tukey-Kramer test)。 ペプチド投与開始後4日目の耳介部皮膚切片のH.E.染色像を示す代表写真である。写真内の矢印は測定した真皮厚の例を示す。 ペプチド投与開始後4日目における各群の真皮厚を示すグラフ（Box-Whisker plot）である。中央のBoxおよびWhiskerは、それぞれ中央値と四分位数および最大値/最小値を示す。Box内のDiamondは平均値を示す。(**p<0.01 Mann Whitney U-test; 各群マウス7匹 x マウスあたり9測定値。) ペプチド投与開始後4日目における耳介部皮膚切片の多重蛍光免疫染色像を示す写真である（Laminin(緑)-CD45(赤)-DAPI(青)）。Lamininは組織内構造(血管・基底膜・神経)を標識するために用い、DAPIは各細胞のDNAに対するcounterstainとして用いた。 ペプチド投与開始後4日目の耳介部皮膚切片における、各群の高倍率視野（HPF:High power field (400x)）単位面積あたりの、CD45陽性細胞（CD45+ immune cells）の数を示すグラフである（Box-Whisker plot）。中央のBoxおよびWhiskerは、それぞれ中央値と四分位数および最大値/最小値を示す。Box内のDiamondは平均値を示す。xは外れ値(outlier)を表す。(**p<0.01 Mann Whitney U-test； 各群マウス7匹 x マウスあたり9測定値。なお、対照群およびペプチド投与群のいずれにおいても、外れ値が全7個体中1個体（約14％）に出現したため、各群について外れ値を有さない他の6個体での平均値を代入する処理を行った。) 右MCA閉塞48時間後における脳梗塞巣体積率を示すグラフである（平均値±標準誤差）。**p<0.01、Mann-WhitneyのU検定。
　本発明者らはこれまでに、生体内の幹細胞を活性化あるいは末梢循環を介して損傷組織へ動員する作用を持った物質を見出しており、当該物質は細胞治療の弱点を克服できる新しいタイプの医薬として有望であると考えている。具体的には、本発明者らは、壊死組織から放出されるHigh mobility group box 1(HMGB1)が、生体内で組織再生を誘導する役割を担うPlatelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)陽性細胞（間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell：MSC）と考えられる）を、末梢循環を介して壊死組織に動員することにより、壊死組織の炎症を抑制し、組織再生を促進することを見出している。また、本発明者らは、HMGB1の断片ペプチドが間葉系幹細胞の末梢血動員活性および組織再生誘導活性を示すことも見出している。今回、本発明者らは、先に見出した人工配列ペプチド「1r10」の部分配列からなるペプチド（以下、「1r10断片ペプチド」とも称する）を複数合成し、MSC血中動員活性の有無を調べた結果、特定のアミノ酸配列を含む1r10断片ペプチドが当該活性を示すこと、および、ペプチド1r10のN末端側およびC末端側に１箇所ずつMSC血中動員活性を示すコア領域が存在することが判明した。
　間葉系幹細胞が、抗炎症作用、免疫調節作用、抗線維化作用を発揮することは当業者には周知である。また、間葉系幹細胞は、種々の組織に分化できる多能性も有していることから、損傷組織の再生促進作用を発揮することもまた当業者には周知である。そのため、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を持つ1r10断片ペプチド、または、該断片ペプチドのアミノ酸配列を含む、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を持つペプチドを対象に投与すると、末梢血中に間葉系幹細胞が動員され、当該間葉系幹細胞の抗炎症作用、免疫調節作用、抗線維化作用、組織再生促進作用（間葉系幹細胞の分化および／または炎症抑制作用による）によって、種々の疾患に対する治療効果がもたらされると考えられる。
　本発明者らが先に見出した人工配列ペプチド1r10は、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、および脳梗塞に対して治療効果を示すが、これは間葉系幹細胞の末梢血中への動員を介してもたらされる効果であると考えられる。したがって、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を持つ1r10断片ペプチド、または、該断片ペプチドのアミノ酸配列を含む、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を持つペプチドは、人工配列ペプチド1r10と同様に炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、および脳梗塞に対して治療効果を示すと考えられる。
　本願において、「人工配列ペプチド」とは、天然には存在しないアミノ酸配列を有するペプチドをいう。また、本願においては「人工配列ペプチド」を単に「人工ペプチド」とも称する。
　本願において、「1r10断片ペプチド」とは、人工配列ペプチド1r10のアミノ酸配列（配列番号：１）の一部からなるペプチドをいう。
　本願は、特定の1r10断片ペプチドまたは該断片ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを含有する、末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための組成物を提供する。
　本願の末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための組成物は、医薬組成物または試薬組成物として利用できる。本願において、「医薬組成物」という用語は、「医薬」、「薬剤」または「薬学的組成物」と互換的に用いられ、「試薬組成物」という用語は、「試薬」と互換的に用いられる。
　本願の末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための組成物は、例えば末梢血への間葉系幹細胞の動員による、対象における疾患または病的状態の治療に用いることができる。
　本願の末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための組成物を利用して末梢血中に動員させた間葉系幹細胞を体外へ回収後、濃縮して、対象における疾患または病的状態の治療に用いることも可能である。本願は、間葉系幹細胞を体外へ回収するための医薬または試薬の製造における、特定の1r10断片ペプチドまたは該断片ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドの使用もまた提供する。
　本願の末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための組成物は、例えば基礎研究、臨床研究等にも用いることができる。基礎研究および臨床研究としては、例えば試験管内での間葉系幹細胞の動員研究、実験動物での間葉系幹細胞の動員研究などが挙げられるが、これらに制限されない。本願は、基礎研究または臨床研究のための医薬または試薬の製造における、特定の1r10断片ペプチドまたは該断片ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチド（これらペプチドを、以下、単に「ペプチド」とも称する）の使用もまた提供する。
　本願の末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための組成物には、1もしくは複数のペプチドを含めることができる。
　本願において、「間葉系幹細胞」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉等の間葉系の組織／細胞への分化能と、自己複製能とを有する細胞である。一つの態様において、間葉系幹細胞は、上皮系組織や神経組織への分化能をも有する。自己複製能を有する間葉系幹細胞は、例えばコロニー形成能を有することを指標として判別することができる。一つの態様において、間葉系幹細胞は、コロニー形成能を有する細胞である。間葉系幹細胞は、骨髄またはその他の組織（血液、例えば臍帯血、および皮膚、脂肪、歯髄等）から採取することができ、固相、例えば培養皿への付着細胞として培養・増殖可能である。本願における間葉系幹細胞は、狭義の幹細胞（自己複製能と分化能を有する細胞）のみならず前駆細胞をも含む不均一な細胞集団として存在してもよく、培養条件下では狭義の幹細胞、または狭義の幹細胞および前駆細胞に加えて分化した細胞をも含み得る。一つの態様において、間葉系幹細胞は狭義の幹細胞のみによって構成されていてもよい。
　本願において、前駆細胞は、血液系以外の特定組織細胞への一方向性分化能を持つ細胞と定義され、間葉系組織、上皮系組織、神経組織、実質臓器、血管内皮への分化能を有する細胞を含む。
　本願において、間葉系幹細胞としては、骨髄間葉系幹細胞および骨髄由来間葉系幹細胞も挙げられるが、これに制限されない。「骨髄間葉系幹細胞」とは、骨髄内に存在する間葉系幹細胞である。一つの態様において、骨髄間葉系幹細胞は、上皮系組織や神経組織への分化能をも有する。一つの態様において、骨髄間葉系幹細胞は、コロニー形成能を有する細胞である。本願において、「骨髄間葉系幹細胞」という用語は、「骨髄間葉系間質細胞」、「骨髄多能性幹細胞」または「骨髄多能性間質細胞」と互換的に用いられる。
　また、「骨髄由来間葉系幹細胞」とは、骨髄から骨髄外に動員された間葉系幹細胞をいう。骨髄由来間葉系幹細胞は、末梢血採血、さらには脂肪などの間葉系組織、皮膚などの上皮組織、脳などの神経組織からの採取によって取得することができる。本願において、「骨髄由来間葉系幹細胞」という用語は、「骨髄由来間葉系間質細胞」、「骨髄由来多能性幹細胞」または「骨髄由来多能性間質細胞」と互換的に用いられる。
　一つの態様において、骨髄間葉系幹細胞および骨髄由来間葉系幹細胞は、採取後直接、あるいは一度培養皿へ付着させた細胞を生体の損傷部に投与することにより、例えば皮膚を構成するケラチノサイトなどの上皮系組織、脳を構成する神経系の組織への分化能をも有し得る。
　骨髄間葉系幹細胞および骨髄由来間葉系幹細胞は、骨芽細胞（分化を誘導するとカルシウムの沈着を認めること等で特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー染色陽性、サフラニン-O染色陽性等で特定可能）、脂肪細胞（ズダンIII染色陽性等で特定可能）の他に、例えば線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞などの間葉系細胞、神経細胞、色素細胞、表皮細胞、毛包細胞(サイトケラチンファミリー、ヘアケラチンファミリー等を発現する)、上皮系細胞（たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリー等を発現する）、内皮細胞、さらに肝臓、腎臓、膵臓等の実質臓器細胞に分化する能力を有し得るが、分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではない。
　ヒト間葉系幹細胞のマーカーとしては、PDGFRα陽性、PDGFRβ陽性、Lin陰性、CD45陰性、CD44陽性、CD90陽性、CD29陽性、Flk-1陰性、CD105陽性、CD73陽性、CD90陽性、CD71陽性、Stro-1陽性、CD106陽性、CD166陽性、CD31陰性、CD271陽性、CD11b陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
　マウス間葉系幹細胞のマーカーとしては、CD44陽性、PDGFRα陽性、PDGFRβ陽性、CD45陰性、Lin陰性、Sca-1陽性、c-kit陰性、CD90陽性、CD105陽性、CD29陽性、Flk-1陰性、CD271陽性、CD11b陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
　ラット間葉系幹細胞のマーカーとしては、PDGFRα陽性、CD44陽性、CD54陽性、CD73陽性、CD90陽性、CD105陽性、CD29陽性、CD271陽性、CD31陰性、CD45陰性の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
　本願において、間葉系幹細胞としては、PDGFRα陽性の間葉系幹細胞、PDGFRα陽性の骨髄由来間葉系幹細胞、PDGFRα陽性の骨髄由来細胞であって、骨髄採取（骨髄細胞採取）または末梢血採血により得られた血液中の単核球分画細胞培養により、付着細胞として得られる細胞などが例示できるが、これらに制限されるものではない。PDGFRα陽性の間葉系幹細胞の例としては、PDGFRαおよびCD44が陽性である細胞、PDGFRαおよびCD90が陽性である細胞、PDGFRαおよびCD105が陽性である細胞、PDGFRαおよびCD29が陽性である細胞等が挙げられる。一つの態様において、PDGFRα陽性の間葉系幹細胞は、CD44が陰性の細胞であってもよい。
　本願は、特定の1r10断片ペプチドまたは該断片ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを含有する、末梢血への間葉系幹細胞の動員による、対象における疾患または病的状態の治療に用いるための組成物を提供する。
　本願の末梢血への間葉系幹細胞の動員による、対象における疾患または病的状態の治療に用いるための組成物は医薬組成物として利用できる。
　本願における対象としては、特に制限はなく、哺乳類、鳥類、魚類等が挙げられる。哺乳類としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ウマ、ヒツジ、クジラなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。本願において、「対象」という用語は、「患者」、「個体」または「動物」と互換的に用いられる。
　本願の末梢血への間葉系幹細胞の動員による、対象における疾患または病的状態の治療に用いるための組成物には、1もしくは複数のペプチドを含めることができる。
　本願において、疾患または病的状態の治療は、例えば炎症抑制治療、免疫調節治療、組織の再生誘導治療、および組織の線維化抑制治療から選択されるが、これらに限定されるものではない。
　本願において、疾患または病的状態は、例えば炎症性疾患、自己免疫疾患、組織の損傷、虚血もしくは壊死を伴う疾患、および線維性疾患から選択されるが、これらに限定されるものではない。
　本願において、炎症性疾患としては、例えば炎症性腸疾患およびアトピー性皮膚炎が挙げられるが、これらに限定されるものではない。自己免疫疾患としては、例えば炎症性腸疾患が挙げられるが、これに限定されるものではない。線維性疾患としては、例えば肺線維症が挙げられるが、これに限定されるものではない。組織の損傷、虚血または壊死を伴う疾患としては、例えば炎症性腸疾患および脳梗塞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎およびクローン病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本願において、「間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性」という用語は、「末梢血中における間葉系幹細胞の存在量を増大させる活性」および「MSC血中動員活性」と互換的に用いられる。
　本願におけるペプチドのMSC血中動員活性は、例えば、i)ペプチドを投与した個体、および、ペプチドを投与していない個体から末梢血を回収し、culture dishに播種して培養し（数日～10日）、形成されたコロニーの数をカウントすること、および、ii)当該コロニーを形成した細胞が、固相への付着性を有し、且つ、骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞への分化能を有することを確認することによって、評価することができる。上記i)においては、回収した末梢血をculture dishに播種する前に、所望の方法により当該末梢血から赤血球を除去してもよい。上記ii)においては、分化能の確認に代えて、コロニーを形成した細胞について表面マーカー解析やトランスクリプトーム解析等を行い、当該細胞が間葉系幹細胞に特徴的な性質を有していることを確認してもよい。
　本願におけるペプチドは、それをコードするDNAを適当な発現系に組み込んで遺伝子組換え体（recombinant）として得ることができるし、または、人工的に合成することもできる。よって、本願におけるペプチドには、細胞を用いて製造されたペプチド、および、人工的に合成されたペプチド（いわゆるsynthetic peptide）も含まれる。
　本願におけるペプチドを遺伝子工学的な手法によって得るためには、該ペプチドをコードするDNAを適当な発現系に組み込んで発現させればよい。
　本願に応用可能なホストとしては、原核生物の細胞、真核生物の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。また、本願に応用可能なホストとしては、細菌（例えば大腸菌）、酵母、動物細胞（例えばHEK293細胞やCHO細胞などの哺乳動物細胞、カイコ細胞などの昆虫細胞）、植物細胞などもまた挙げられるが、これらに制限されない。
　本願に応用可能なホスト／ベクター系としては、例えば、発現ベクターpGEXと大腸菌を示すことができる。pGEXは外来遺伝子をグルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させることができる（Gene, 67:31-40, 1988）ので、本願のペプチドをコードするDNAを組み込んだpGEXをヒートショックでBL21のような大腸菌株に導入し、適当な培養時間の後に isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）を添加してGST融合ペプチドの発現を誘導する。本願におけるGSTはグルタチオンセファロース4Bに吸着するため、発現生成物はアフィニティークロマトグラフィーによって容易に分離・精製することが可能である。
　本願のペプチドの遺伝子組換え体を得るためのホスト／ベクター系としては、この他にも次のようなものを応用することができる。まず細菌をホストに利用する場合には、タグ等を利用した融合タンパク質の発現用ベクターが市販されている。また、本願の遺伝子組換え体には、タグやその一部のペプチドが付加した状態のものも含まれる。
　本願のペプチドに付加されるタグとしては、本願のペプチドの活性に影響しない限り、特に制限はなく、例えば、ヒスチジンタグ（例えば6×His、10×His）、HAタグ、FLAGタグ、GSTタグ、T7-タグ、HSV-タグ、E-タグ、lckタグ、B-タグなどが挙げられる。
　酵母では、Pichia属酵母が糖鎖を備えたタンパク質の発現に有効なことが公知である。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホストとするバキュロウイルスベクターを利用した発現系も有用である（Bio/Technology, 6:47-55, 1988）。更に、哺乳動物の細胞を利用して、CMV、RSV、あるいはSV40等のプロモーターを利用したベクターのトランスフェクションが行われており、これらのホスト／ベクター系は、いずれも本願のペプチドの発現系として利用することができる。また、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターセンダイウイルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、パピローマウイルスベクター等のウイルスベクターを利用して遺伝子を導入することもできるが、これらに限定されるものではない。該ベクターには、遺伝子発現を効果的に誘導するプロモーターDNA配列や、遺伝子発現を制御する因子、DNAの安定性を維持するために必要な分子が含まれてもよい。
　得られた本願のペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なペプチドとして精製することができる。ペプチドの分離、精製は、通常のペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればペプチドを分離、精製することができる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
　また、本願のペプチドは、実質的に精製されたペプチドであることが好ましい。ここで「実質的に精製された」とは、本願のペプチドの精製度（タンパク質成分全体における本願のペプチドの割合）が、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％若しくは100％に近いことを意味する。100％に近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、99.999％、99.99％、99.9％、99％などである。
　また、上記の精製度を有するものであれば、如何なる精製方法によって精製されたものでも、実質的に精製されたペプチドに含まれる。例えば、上述のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、または組み合わせることにより、実質的に精製されたペプチドを例示できるが、これらに限定されるものではない。
　一方、本願のペプチドを人工的に合成することも出来る。本願におけるペプチド合成法では、ペプチド液相合成法およびペプチド固相合成法等の方法によってペプチドを化学合成することができる。ペプチド固相合成法はペプチドを化学的に合成する際に、一般的に用いられる方法のひとつである。表面をアミノ基で修飾した直径0.1mm程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズなどを固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していく。目的とするペプチドの配列が出来上がったら固相表面から切り出し、目的の物質を得る。固相合成法により、バクテリア中で合成させることの難しいリボソームペプチドの合成や、D体や安定同位元素（2H、13C、15N等）置換体などの非天然アミノ酸の導入、重原子置換体（例えばセレノメチオニンなどのセレノアミノ酸）の導入、ペプチド及びタンパク質主鎖の修飾なども可能である。固相法において70から100個を超える長いペプチド鎖を合成する場合、ネイティブケミカルライゲーション法を用いて、2つのペプチド鎖を結合させる事により合成することが可能である。本願のペプチドは、該ペプチドの医薬上許容される塩の形態であってもよい。医薬上許容される塩としては、塩酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本願のペプチドは、該ペプチドの溶媒和物、または、該ペプチドの医薬上許容される塩の溶媒和物の形態であってもよい。溶媒和物とは、溶質分子に任意の数の溶媒分子が配位しているものをいい、例えば水和物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　本願における1r10断片ペプチドのアミノ酸長は、例えば11～29アミノ酸の範囲、例えば11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29アミノ酸であり得る。
　本願において、1r10断片ペプチドとしては、例えば以下から選択されるペプチドが挙げられる：
　（１）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
　（２）配列番号：１の１番目から２７番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_N03； 配列番号：２）；
　（３）配列番号：１の１番目から２６番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_N04； 配列番号：３）；
　（４）配列番号：１の１番目から２５番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_N05； 配列番号：４）；
　（５）配列番号：１の１番目から２４番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_N06； 配列番号：５）；
　（６）配列番号：１の１番目から２３番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_N07； 配列番号：６）；
　（７）配列番号：１の１番目から１９番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_N11； 配列番号：７）；
　（８）配列番号：１の１番目から１８番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_N12； 配列番号：８）；
　（９）配列番号：１の１番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_N14； 配列番号：９）；
　（１０）配列番号：１の６番目から３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_C05； 配列番号：１１）；
　（１１）配列番号：１の１１番目から３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_C10； 配列番号：１２）；
　（１２）配列番号：１の１２番目から３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_C11； 配列番号：１３）；
　（１３）配列番号：１の１３番目から３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_C12； 配列番号：１４）；
　（１４）配列番号：１の１６番目から３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_C15； 配列番号：１５）；
　（１５）配列番号：１の１７番目から３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_C16； 配列番号：１６）； 
　（１６）配列番号：１の１８番目から３０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_C17； 配列番号：１７）；および
　（１７）配列番号：１の６番目から１６番目のアミノ酸配列からなるペプチド（1r10_MF5； 配列番号：１９）。
　上記（１）～（１７）に記載のアミノ酸配列のうち、上記（１６）に記載の「配列番号：１の１８番目から３０番目のアミノ酸配列」（配列番号：１７のアミノ酸配列）および上記（１７）に記載の「配列番号：１の６番目から１６番目のアミノ酸配列」（配列番号：１９のアミノ酸配列）は、1r10断片ペプチドがMSC血中動員活性を保持するために重要なコア領域である。1r10断片ペプチドが当該２つのコア領域の少なくとも一方を含んでいれば、MSC血中動員活性は保持される。
　上記（１）に記載の「配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド」における「配列番号：１のアミノ酸配列の一部」としては、上記（２）～（１５）のいずれかに記載のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本願のペプチドとしては、以下から選択されるペプチドも挙げられる：
（i）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；および
（ii）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
　このようなペプチドは、当業者に周知の方法で製造できる。
　上記（i）および（ii）より選択されるペプチドは、例えば３０個以下、２９個以下、２８個以下、２７個以下、２６個以下、２５個以下、２４個以下、２３個以下、２２個以下、２１個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、または１１個以下のアミノ酸からなるペプチドであり得る。上記（i）および（ii）より選択されるペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列からなるペプチドを除くペプチドであり得る。
　上記（i）に記載のペプチドに関して、「１個～５個」としては、例えば5個、4個、3個、2個、1個、1個～5個、1個～4個、1個～3個、または1個若しくは2個が挙げられる。
　上記（ii）に記載のペプチドに関して、「90％以上」は「90％以上100％未満」として表現することもでき、「90％以上」としては、例えば90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上が挙げられる。
　上記（１）から（１７）より選択される1r10断片ペプチドは、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を有する1r10断片ペプチドである。上記（i）および（ii）より選択されるペプチドもまた間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を有するペプチドである。よって、これらペプチドは、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する効果、ならびに炎症性疾患、自己免疫疾患、組織の損傷、虚血または壊死を伴う疾患、および線維性疾患の治療効果を有すると考えられる。
　本願は、本明細書に開示したペプチド、例えば、上記（１）から（１７）より選択される1r10断片ペプチド、および、上記（i）および（ii）より選択されるペプチドもまた提供する。
　配列番号：１に記載のアミノ酸配列は、本願の人工配列ペプチド1r10のアミノ酸配列である。配列番号：２～１９に記載のアミノ酸配列は、本願の1r10断片ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号：１に記載のアミノ酸配列（1r10のアミノ酸配列）において1r10断片ペプチドのアミノ酸配列に対応する領域を以下の表１に示す。
　配列番号：２０に記載の塩基配列は、本願の人工配列ペプチド1r10をコードするDNAの塩基配列の例である。配列番号：２１および２２に記載の塩基配列は、それぞれ、本願の1r10断片ペプチドである1r10_C17および1r10_MF5をコードするDNAの塩基配列の例である。配列番号：２０に記載の塩基配列（例示された1r10の塩基配列）において1r10断片ペプチドをコードするDNAの塩基配列に対応する領域を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本願の人工配列ペプチド1r10または1r10断片ペプチドをコードするDNAの塩基配列の他の例は、当業者には自明である。当該DNAは、当業者に公知のコドン表を用いて、人工配列ペプチド1r10または1r10断片ペプチドのアミノ酸残基を対応するコドンに変換する方法（逆翻訳）によって作成することができる。逆翻訳は、所望により、アミノ酸および核酸配列の解析用に開発されている種々のソフトウェア（プログラム、アルゴリズム等を含む）を利用して行うことができる。
　本願のペプチド、または、それを含有する医薬組成物（以下、「医薬組成物等」と称する）の有効量が、本明細書に記載の疾患や症状の治療のために対象に投与される。
　本願における有効量とは、本明細書に記載の疾患または病的状態の治療に十分な量をいう。本願における治療には、軽減、遅延、阻止、改善、寛解、治癒、完治などが含まれるが、これらに限定されない。
　本願の医薬組成物等の投与部位に制限はなく、疾患または病的状態の症状が現れる部位もしくはその近傍、それらとは異なる部位（それら以外の部位）、疾患または病的状態の症状が現れる部位から離れた部位、疾患または病的状態の症状が現れる部位から遠位にある部位、または、疾患または病的状態の症状が現れる部位に対して遠位かつ異所である部位など、いかなる部位に投与されても、本願の医薬組成物等は、その効果を発揮することができる。
　また本願の医薬組成物等は、疾患または病的状態の症状が現れる組織とは異なる組織、疾患または病的状態の症状が現れる組織から離れた組織、疾患または病的状態の症状が現れる組織から遠位にある組織、または、疾患または病的状態の症状が現れる組織に対して遠位かつ異所にある組織など、いかなる組織に投与されても、その効果を発揮することができる。
　本願の医薬組成物等の投与方法としては、経口投与または非経口投与が挙げられ、非経口投与方法としては、血管内投与（動脈内投与、静脈内投与等）、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられるが、これらに限定されない。また、本願の医薬組成物等を、注射投与、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって全身または局部的（例えば、皮下、皮内、皮膚表面、眼球あるいは眼瞼結膜、鼻腔粘膜、口腔内および消化管粘膜、膣・子宮内粘膜、または損傷部位など）に投与できる。
　また、本願のペプチドに代えて、該ペプチドを分泌する細胞、該ペプチドをコードするDNAが挿入された遺伝子治療用ベクター、およびこれらを含有する医薬組成物を用いることもできる。
　また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本願の医薬組成物等を投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重1 kgあたり0.0000001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.00001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。本願のペプチドを分泌する細胞や該ペプチドをコードするDNAが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、該ペプチドの量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本願における医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
　本願の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
　なお、本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明は、下記の実施例によってさらに例示されるが、それらに限定されるものではない。
実施例１
1r10断片ペプチドによる間葉系幹細胞の動員
（１）材料および方法
ｉ）ペプチドの製造
　以下の表に示すペプチド（1r10および1r10断片ペプチド）を、固相法により化学的に合成した（得られたペプチドは、いずれもトリフルオロ酢酸（TFA）塩の形態である）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
ｉｉ）ペプチドの投与
　C57BL/6Jマウス（8週齢、雄、体重25g）を用意し、前出の表に記載の各ペプチドを投与する群と対照群に分けた。ペプチドの投与は、生理食塩水または1% DMSOを溶媒として1μg/μLの濃度に調整した各ペプチドの溶液を100μL／匹の量（ペプチドの投与量としては4mg/kg）で尾静脈に注入することにより行った（1r10_N14および1r10_N15の溶媒は1% DMSO、それ以外のペプチドの溶媒は生理食塩水である）。対照群には、生理食塩水または1% DMSOを100μL／匹の量で尾静脈に注入した。
ｉｉｉ）末梢血からの細胞回収
　生理食塩水もしくは1% DMSOまたはペプチドの投与から16時間後に、全身麻酔下で心臓から末梢血をマウス１匹あたり800μL採取した（ヘパリンを含有する1 mLシリンジを使用）。各々のペプチド投与群および対照群につき、３匹のマウスから採取した末梢血をプールし、赤血球を除去するため、採取した血液と等量のHetasep（STEMCELL Technologies社、Cat No. ST-07906）を加え、100Gで2分間遠心し、室温で15分間インキュベートした後、上清を回収した。当該上清を、末梢血中の有核細胞を含むサンプルとして次の実験に供した。
ｉｖ）コロニーアッセイ
　上記の手順によって得た上清（末梢血由来細胞含有サンプル）を、コラーゲンIでコートされた6ウェルプレート（Corning社、Cat No. 356400）に播種し、MesenCult Expansion Kit（STEMCELL Technologies社、Cat No. ST-05513）を利用して当該キットのマニュアル通りに調製したExpansion Mediumに1% L-glutamine（ナカライテスク社）、10μM ROCK inhibitor（Y27632、Tocris Bioscience社）および 1% ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク社）を含有させた培地（数値はいずれも終濃度）を用いて、37℃、5％CO2、5％O2の条件下で10日間培養した。培養期間中は1週間に2回、培地を新鮮なものに交換した。培養10日目に、Differential Quik Stain Kit（シスメックス株式会社、Cat No. 16920）を用いてプレート上の細胞を染色し、50個以上の細胞を含むコロニーの数をカウントした。
　本発明者らがこれまでに行った実験において、末梢血をディッシュやプレート等の固相上で培養した結果得られるコロニーは全て、固相への付着性と自己複製能を有することに加えて、PDGFRα陽性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、および上皮系細胞への分化能を有することが確認できている。
　また、間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を有するヒトHMGB1タンパク質のアミノ酸残基1-44からなるペプチド（以下、HMGB1ペプチド1-44）を投与した後の末梢血を固相上で培養した結果得られるコロニーも全て、固相への付着性と自己複製能を有し、PDGFRα陽性であることが確認できており、かつ、トランスクリプトーム解析のデータをクラスタリングし、gene ontology解析を行った結果から、間葉系幹細胞に特徴的な遺伝子発現プロファイルを有することが確認できている。
　さらに、生理食塩水投与後の末梢血よりも、HMGB1ペプチド1-44を投与した後の末梢血の方が、固相培養で得られるコロニーの数が多いことも確認済みである。
　したがって、末梢血を固相上で培養した結果得られるコロニーは間葉系幹細胞であり、末梢血の固相培養で検出されるコロニー数の増加は、末梢血中の間葉系幹細胞数の増加を示すと考えられる。
　また、通常、間葉系幹細胞は末梢血中にはほとんど存在しないため、増加した分の間葉系幹細胞は末梢血以外の組織（例えば骨髄）から末梢血中に動員されたものと考えられる。
　以上のことから、被験物質投与後の末梢血の固相培養で検出されるコロニーの数は、当該被験物質が間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性の指標として用いることができる。
　被験物質の投与後、末梢血中の間葉系幹細胞数が最大になるタイミング（ピークタイム）は、個体ごとにばらつきがあると考えられ、上記の末梢血コロニーアッセイでは、採血のタイミング（1r10およびその断片ペプチドの場合、被検物質投与後16時間）と末梢血中の間葉系幹細胞数のピークタイムが一致しないケースがしばしば起こり得る。そのため、複数回のアッセイ結果の平均ではなく、１回でも所定の閾値を超える数のコロニー形成をもたらした被検物質はMSC血中動員活性ありと評価することとした。
　また、本発明者らがこれまでに行った多数回のコロニーアッセイの結果から、陰性対照（生理食塩水または1% DMSO投与群）では何度アッセイしても形成されるコロニー数は「１０個未満」であることが確認できている。そこで、本実施例においては、閾値となるコロニー数を「１０個」に設定し、アッセイを４～６回実施したうち１回でも「１０個以上」のコロニー形成をもたらした被検物質を、MSC血中動員活性を有する物質と判定した。
（２）結果
　表２に記載のペプチドについて４～６回アッセイを実施した結果、N末端側の断片ペプチドについては、1r10_N03～N07、N11～12、N14およびMF5を投与した群で10個以上のコロニーが形成され、1r10_N15を投与した群のコロニー形成数は10個未満であった（図１）。また、C末端側の断片ペプチドについては、1r10_C05、C10～12およびC15～C17を投与した群で10個以上のコロニーが形成され、1r10_C18を投与した群のコロニー形成数は10個未満であった（図２）。これらの結果から、1r10_MF5と1r10_C17のアミノ酸配列が、MSC血中動員活性を保持するために重要なコア配列であることが示された。
参考例１
炎症性腸疾患に対する人工配列ペプチド1r10の有効性
（１）材料および方法
ｉ）薬剤
　デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）（分子量36,000～50,000、MP Biomedicals社製、製品番号160110）を精製水に溶解し、2.5％(w/v)のDSS水溶液を調製した。また、配列番号：１のアミノ酸配列からなるペプチド1r10（TFA塩）を固相法により化学合成し、被験物質として用いた。
ｉｉ）炎症性腸疾患（IBD）モデルマウスの作成
　BALB/cマウス（9週齢、オス）に2.5% DSS水溶液を7日間自由飲水させ、大腸炎を誘発した。その後、DSSから水道水の飲水に変更し、3日後（DSS水溶液の飲水開始10日後）に大腸採取を行った。
ｉｉｉ）ペプチドの投与
　上記の通り作成したIBDモデルマウスをペプチド1r10投与群（n=8）および対照群（n=8）に分けた。ペプチドの投与は、DSS水溶液の飲水開始後1、4、7、8および9日目に、生理食塩水を溶媒として0.5mg/mLの濃度に調整したペプチド1r10の溶液を10 mL/kgの量（ペプチドの投与量としては5mg/kg）で尾静脈に注入することにより行った。対照群には、DSS水溶液の飲水開始後1、4、7、8および9日目に、生理食塩水を10 mL/kgの量で尾静脈に注入した。
ｉｖ）ペプチドの投与による効果の評価
　DSS水溶液の飲水開始から10日間、土曜・日曜・祝日を除いて毎日、マウスの体重測定と症状（便の状態、および出血）の観察を行い、DAI（disease activity index）スコアを算出して症状の程度を評価した。DAIスコアは、体重減少率、便の状態、および便出血を下記表の通りにスコア付けし、これら３項目のスコアを合計することにより算出した。スコア付けの基準は、Liらの方法（PLoS One. 2015 Dec 7; 10(12):e0144101）を一部参考にした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、DSSの飲水開始10日後に採取した大腸（結腸から直腸まで）の長さを、デジタルノギスを用いて測定した。
（２）結果
　試験期間中におけるマウスの体重変化を図３に示す（対照群について「saline」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。対照群およびペプチド投与群ともにDSS飲水開始後経時的に体重が減少したが、その減少程度は対照群よりペプチド投与群の方が緩やかであり、DSS水溶液の飲水開始10日後にはペプチド投与群の体重は回復傾向を示した。
　DSS水溶液の飲水開始8～10日後における便スコア（上記表３に記載の通りにスコア付けした「便の状態」スコアおよび「出血」のスコアの合計）およびDAIスコアをそれぞれ図４および５に示す（対照群について「saline」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。便スコアおよびDAIスコアともに、対照群よりペプチド投与群の方が低い値を示した。
　DSS水溶液の飲水開始10日後において、ペプチド投与群の大腸長は対照群より長かった（図６； 対照群について「saline」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。
　IBDにおいては、腸管の粘膜に炎症が起こり、びらんや潰瘍が形成されるほか、腸管の狭小・短縮等の症状が生じ得る。また、IBDの他の症状として体重の減少が起こることが知られており、その原因は腸管の粘膜に生じる炎症や組織損傷（潰瘍等）による栄養状態の悪化にあると考えられている。また、動物のIBDモデルにおいて間葉系幹細胞を静注すると、体重減少ならびに腸管における上皮の損傷および炎症細胞の浸潤等を含む種々の症状が改善することが知られている。かかる症状の改善は、間葉系幹細胞の抗炎症作用によって腸管粘膜の炎症が抑制されること、およびその結果として粘膜組織の再生が促進されること等によるものである。
　本願の人工配列ペプチドをIBDモデルマウスに投与することにより、体重の減少が抑制され、大腸長の短縮が抑制され、DAIスコアが改善された。これは、本願の人工配列ペプチドの作用によって間葉系幹細胞が末梢血中に動員され、当該細胞により炎症抑制効果と組織再生効果が発揮された結果であると考えられる。
参考例２
アトピー性皮膚炎に対する人工配列ペプチド1r10の有効性
（１）材料および方法
ｉ）薬剤
　マウスにアトピー性皮膚炎（Atopic Dermatitis； 以下、「AD」とも称する）を誘導するため、MC903(一般名：Calcipotriol)を用いた。また、参考例１に記載のペプチド1r10（TFA塩）を被験物質として用いた。
ｉｉ）アトピー性皮膚炎モデルマウスの作成
　C57BL/6マウス（C57BL/6JJcl、7-8週齢、雄、微生物グレードSPF）を日本クレア株式会社より入手し、5日以上動物飼育室で馴化させた後、以下の実験に供した。当該マウスの耳介部皮膚に、エタノールで調整したMC903溶液を、2.25nmol MC903/耳/1回/1日の量で週に5回、2週間にわたって塗布（合計10回塗布）し、アトピー性皮膚炎（AD）を誘導した。かかるMC903誘導性のADモデルは、AD患者において実際に見られる上皮細胞からのTSLP分泌を人工的に誘導することにより一連の2型免疫反応カスケードを惹起させ、AD様病態を短期間(1-2週間)で再現させることができるモデルである（Li M et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 ;103 :11736-41.）。また、予備試験として正常マウスとMC903によるAD誘導マウス(誘導開始14日後)の耳介部の外観および組織を観察した結果、AD誘導マウスでは炎症による紅斑、辺縁領域における落屑、角質の苔癬化、表皮のAcanthosis（有棘細胞増殖による表皮肥厚）、局所的なバリアの破壊、真皮への免疫細胞の浸潤、真皮厚の増大、および表皮の一部におけるSpongiosis（海綿状変化）が生じることも確認できている。
ｉｉｉ）ペプチドの投与
　MC903の塗布開始（Day 1とする）から2週後（Day 15）に、落屑(Scaling)、紅斑(Erythema)、浮腫(Edema)の主症状から判断し、明らかにADが誘導された個体のみを選抜後、個体間の炎症の重症度の差異を考慮して、耳介厚に基づきグループ間で平均化処置を行い、対照群およびペプチド投与群（各群n=7）に分けた。ペプチドの投与は、群分け日（Day 15）に1回と、その後の4日（Day 16からDay 19）の間に1回の合計2回、生理食塩水を用いて0.3mg/mLに調整したペプチド1r10の溶液を5mL/kgの容量（ペプチドの投与量として1.5mg/kg）で尾静脈に注入することにより行った。対照群には、群分け日（Day 15）に1回と、その後の4日（Day 16からDay 19）の間に1回の合計2回、生理食塩水を用いて0.3mg/mLに調整したウシ血清アルブミン（BSA）の溶液を5mL/kgの容量（BSAの投与量として1.5mg/kg）で尾静脈に注入した。
ｉｖ）ペプチドの投与による効果の評価
浮腫および落屑の評価
　ペプチド投与期間中（Day 15からDay 19）は、浮腫(Edema)の判定のために耳介厚(Ear Swellings)の測定を毎日実施し、ADの主徴である落屑(Scaling)については耳介部から13-14cmの高さの固定台からデジタルカメラ（E-M1 II； Olympus社）を用いて写真撮影(週3回)により判定を行った。
病理解析
　ペプチドの投与開始後4日目（Day 19）にマウスをイソフルラン麻酔影響下に置き、頸椎脱臼を行って安楽死させ、氷上でサンプルのタンパク変性を防ぎつつ、すばやく耳介の炎症部位およびその周辺領域の皮膚を切り取り回収した。採取した耳介部皮膚は、ピンセットで余分な毛や皮膚を除去した後、10% Formalinに浸漬し、shakerを用いて氷上で振盪させながら、4℃で一晩固定させた。固定後の皮膚をリン酸緩衝食塩水（PBS）でよく洗浄し、トリミングした後、皮膚固有の背腹軸/左右軸の組織の極性に留意しながら自動包埋器(Excelsior ES；Thermo Scientific社)によりパラフィンブロックにした。その後、回転式ミクロトーム(HM 325；Thermo Sceintific社)で薄切(5μm厚)してから、スライドグラス上に固定させ、各種染色に供した。病理学的解析として、組織化学染色および蛍光免疫染色法によりそれぞれ皮膚厚および免疫細胞の浸潤について評価を行った。
真皮厚の測定
　炎症部位の治癒状態を定量評価するため、上記の通り作成した皮膚組織のパラフィン薄切(5μm厚)に対してヘマトキシリン・エオジン（H.E.）染色を行い、真皮厚を測定した。その詳細は、1個体につき3枚の切片を用意し、各切片について炎症中心部位(center)、頭側(Head)および尾側(Tail)を1箇所ずつ顕微鏡（Keyence BZ-X710）で撮影した（即ち、1個体につき計9箇所撮影）。次に撮影した画像について表皮真皮接合部（Epidermis-Dermis junction）から皮下脂肪－軟骨接合部（Subcutaneous Fat-Cartilage junction）までの垂線を引いて視野中の最長の垂線のみを選抜し真皮厚の測定値として用いた。
免疫細胞の定量
　炎症部位の免疫細胞数を定量評価するため、上記の通り作成したパラフィン薄切(5μm厚)に対して抗Laminin抗体および抗CD45抗体を用いて蛍光免疫染色を行った（Lamininの検出には、1次抗体としてAnti-Laminin（Sigma Aldrich社； カタログ番号 L9393）、2次抗体としてDonkey anti-Rabbit IgG (H+L) , Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific社； カタログ番号A-21206）を使用した。CD45の検出には、1次抗体としてGoat Anti-mouse CD45 (R&D Systems社; カタログ番号 AF114)、2次抗体として Cy3 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) (Jackson ImmunoReseach社; カタログ番号 805-165-180)を使用した）。定量の詳細としては、1個体につき3枚の切片を用意し、各切片における炎症中心部位(center)、頭側(Head)および尾側(Tail)について1箇所ずつ、顕微鏡（Keyence BZ-X710）で高倍率視野（HPF：400x）を撮影した（即ち、1個体につき計9箇所撮影）。次に撮影した画像について視野中のCD45陽性細胞（Cy3の蛍光で検出）をカウントし、測定値として用いた。
統計処理
　上記解析によって得られた測定値または補正後の算出値は、統計解析ソフト（statcel-3(OMS出版)およびExcel統計(BellCurve))を用いて各統計値を計算後、解析/判定を行った。具体的には、事前検定として(1)正規性の検定(歪度/尖度係数でのダゴスティーノ検定; P>0.05を正規分布とみなす。) (2)棄却検定（Grubbs検定；P<0.05の場合、外れ値（outlier）とみなす）を行い、(1)で得られた結果が正規分布を示す場合には群間でt-testを行った。正規分布を示さない場合には群間の順位によるノンパラメトリック検定としてMann whitney U-testを行い、p<0.05の場合に有意差ありと判定した。また時系列における反復測定を主とする体重変化および耳介厚変化については、Repeated one way ANOVA testを実施し、さらにpost hoc testとしてTukey-Kramer testを行った。外れ値の処理に関しては、(a)Grubbs検定でP<0.05となった群内の個体数が当該群の全個体数（n数）に対して10%以下の場合は当該外れ値を欠損値として取り扱い、(b)P<0.05となった個体数がn数に対して10%を超える場合は外れ値を有さない他の個体での平均値を補完的に代入（imputation）する方法を採用した（所謂Mean substitution）。
（２）結果
落屑
　ADモデル誘導後の対照群マウスの耳介部では、典型的なAD像である湿疹と乾燥に起因する剥離表皮による落屑が辺縁部に高頻度に生じた(図７、左写真の矢印部分)。一方、ペプチド投与群では、耳介部における落屑の軽減が認められた(図７、右写真の矢印部分)。
耳介厚(浮腫) 
　ペプチド投与期間中の耳介厚(浮腫)の推移を図８に示す（対照群について「Control」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。ペプチド投与群では、対照群と比較して統計的に有意な耳介厚の減少が認められた。
真皮厚
　皮膚組織切片に対してH.E.染色を行った結果、対照群においては、AD非誘導マウスでは見られない真皮厚の増大（ADで引き起こされる免疫反応に伴う細胞浸潤と血管透過性の亢進に起因するものと考えられる）が観察された（図９；対照群について「Control」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。一方、ペプチド投与群では、対照群と比較して統計的に有意な真皮厚の減少が認められた（図１０；対照群について「Control」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。また、0.5mg/kgの用量でペプチド1r10を投与した場合にも、対照群と比較して統計的に有意な真皮厚の減少が見られた（データ示さず）。
免疫細胞の浸潤
　皮膚組織切片に対して蛍光免疫染色を行った結果、対照群では、ADで引き起こされる免疫反応に伴うCD45陽性免疫細胞の組織内浸潤が血管周囲（Lamininで標識される）を始めとする皮膚全体に見られた（図１１の矢印部分；対照群について「Control」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。一方、ペプチド投与群では、対照群と比較して統計的に有意なCD45陽性細胞数の減少が認められた（図１２；対照群について「Control」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。
　なお、本試験の実施期間中（投与開始(Day 15)～皮膚回収時(Day 19)）におけるマウスの体重変化は、いずれの群においても目立った差はなく、群間において統計的に有意な変化も認められなかった (p>0.05, Repeated one-way ANOVA)。
　本参考例では、本願の人工配列ペプチドをアトピー性皮膚炎モデルマウスに投与することにより、落屑および浮腫が抑制され、真皮厚の増大が抑制され、且つ、CD45陽性細胞の浸潤が抑制された。これは、本願の人工配列ペプチドの作用によって間葉系幹細胞が末梢血中に動員され、当該細胞により炎症抑制効果が発揮された結果であると考えられる。
参考例３
脳梗塞に対する人工配列ペプチド1r10の有効性
（１）材料および方法
ｉ）薬剤
　参考例１に記載のペプチド1r10（TFA塩）を被験物質として用いた。
ｉｉ）脳梗塞モデルラットの作成
　Crl:CD(SD)ラット（7週齢、雄）を日本チャールス・リバーより入手し、6日間の馴化の後、対照群（n=8）とペプチド投与群（n=8）に分けた。群分けの翌日に、ラットを2%イソフルラン吸入麻酔下（麻酔背景は笑気：酸素 = 7：3）にて仰臥位に固定した。手術中の体温調節を行うためにディジタル温度計に接続した体温計用プローブを直腸内に挿入し、手術前後の直腸温の変化をモニターした。その結果、いずれのラットも直腸温の低下は認められなかったため、加温は実施しなかった。右総頸動脈、右外頸動脈および右内頸動脈を露出し、右総頸動脈および右外頸動脈を縫合糸で結紮した。予めシリコンでコーティングし、19 mmの長さに切断した4号のナイロン糸（栓子）を右外頸動脈と右内頸動脈の分岐部より挿入し、右中大脳動脈（MCA）を閉塞した。右MCA閉塞後、頸部皮膚の縫合を行い、麻酔から解放した。右MCA閉塞後30分に閉塞側の対側前肢の屈曲を確認した。2%イソフルランの吸入麻酔下にて、再び右総頸動脈、右外頸動脈および右内頸動脈を露出し、右MCA閉塞後90分に栓子を抜き、右MCAの血流を再開させた。右MCAの血流再開後に右内頸動脈の結紮および頸部皮膚の縫合を行い、麻酔から解放した。なお、右MCA閉塞手術前にベンジルペニシリンカリウムを20000 units/kgの用量で筋肉内投与した。
ｉｉｉ）ペプチドの投与
　ペプチドの投与は、右MCA閉塞後105分および24時間の時点において、生理食塩水を溶媒として1mg/mLの濃度に調整したペプチド1r10の溶液を2mL/kgの容量（ペプチドの投与量として 2mg/kg）で尾静脈に注入することにより行った。対照群には、右MCA閉塞後105分および24時間の時点において、生理食塩水を2mL/kgの容量で尾静脈に注入した。
ｉｖ）ペプチドの投与による効果の評価
脳梗塞巣体積率の算出
　右MCA閉塞後48時間でペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg、腹腔内投与）による麻酔下で動物を断頭し、全脳を摘出して厚さ2 mmの脳切片を作製した。脳切片はPaxinos and Watson脳図譜（Paxinos G. and Watson C., The rat brain in stereotaxic coordinates, second edition. Academic Press Inc.; 1986）を参考に、Bregma前方4 mm、Bregma前方2 mm、Bregma上、Bregma後方2 mm、Bregma後方4 mmおよびBregma後方6 mmの冠状面が得られる位置とした。脳切片は、1 w/v% の2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride（TTC）溶液に室温で浸漬・染色して写真撮影を行った。得られた写真を画像解析し、脳梗塞巣面積および脳の断面積を実測値で求め、下記計算式によりBregma前方4 mm～Bregma後方6 mmの脳梗塞巣体積および脳の総体積を算出した。また、脳梗塞巣体積および脳の総体積より脳梗塞巣体積率を算出した（脳梗塞巣体積率（％）＝脳梗塞巣体積／脳の総体積×100）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
V：脳梗塞巣体積または脳の総体積（mm3）
a：Bregma前方4 mm断面上の脳梗塞巣面積または脳の断面積（mm2）
b：Bregma前方2 mm断面上の脳梗塞巣面積または脳の断面積（mm2）
c：Bregma断面上の脳梗塞巣面積または脳の断面積（mm2）
d：Bregma後方2 mm断面上の脳梗塞巣面積または脳の断面積（mm2）
e：Bregma後方4 mm断面上の脳梗塞巣面積または脳の断面積（mm2）
f：Bregma後方6 mm断面上の脳梗塞巣面積または脳の断面積（mm2）
（２）結果
　対照群およびペプチド投与群の脳梗塞巣体積率は、それぞれ34.1±1.1%および27.2±1.2%（平均値±標準誤差）であった（図１３；対照群について「Control」、ペプチド投与群について「1r10」参照）。対照群と比較してペプチド投与群の脳梗塞巣体積率は低い値を示し、統計学的に有意差が認められた（Mann-WhitneyのU検定、p<0.01）。
　本参考例では、本願の人工配列ペプチドを脳梗塞モデルラットに投与することにより、脳梗塞巣を縮小させる効果が得られた。これは、本願の人工配列ペプチドの作用によって間葉系幹細胞が末梢血中に動員され、当該細胞により炎症抑制効果、trophic効果（栄養因子の分泌）、組織再生効果等が発揮された結果であると考えられる。
　本願のペプチドは、間葉系幹細胞を末梢血中に動員するための組成物、ならびに炎症性疾患、自己免疫疾患、線維性疾患、および組織の損傷／虚血／壊死を伴う疾患の治療薬として用いることができる。

Claims (10)

  1. 　以下から選択されるペプチドを含有する、末梢血への間葉系幹細胞の動員に用いるための組成物：
    （ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
    （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
    （ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
  2. 　以下から選択されるペプチドを含有する、末梢血への間葉系幹細胞の動員による、対象における疾患または病的状態の治療に用いるための組成物：
    （ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
    （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
    （ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
  3. 　疾患または病的状態の治療が、炎症抑制治療、免疫調節治療、組織の再生誘導治療、および組織の線維化抑制治療から選択される、請求項２に記載の組成物。
  4. 　疾患または病的状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、組織の損傷、虚血もしくは壊死を伴う疾患、および線維性疾患から選択される、請求項２に記載の組成物。
  5. 　疾患または病的状態が、炎症性腸疾患である、請求項２に記載の組成物。
  6. 　疾患または病的状態が、潰瘍性大腸炎である、請求項２に記載の組成物。
  7. 　疾患または病的状態が、アトピー性皮膚炎である、請求項２に記載の組成物。
  8. 　疾患または病的状態が、脳梗塞である、請求項２に記載の組成物。
  9. 　以下から選択されるペプチドを含有する、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎および脳梗塞から選択される疾患の治療に用いるための組成物：
    （ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
    （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
    （ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
  10. 　以下から選択されるペプチド：
    （ａ）配列番号：１のアミノ酸配列の一部からなり、且つ、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド；
    （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１個～５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド； および
    （ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号：１７または１９のアミノ酸配列を含むペプチド。
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