WO2021164717A1 - 抗TNF-α的抗体制剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Definitions
- the surfactant is polysorbate; in some embodiments, the surfactant is polysorbate 20 and/or polysorbate 80; in some embodiments, the surfactant is The agent is polysorbate 80; in some embodiments, the concentration of the surfactant is 0.05-0.5 mg/ml; in some embodiments, the concentration of the surfactant is 0.1-0.5 mg/ml; In some embodiments, the concentration of the surfactant is 0.1-0.3 mg/ml; in some embodiments, the concentration of the surfactant is 0.2 mg/ml. In some embodiments, the surfactant is polysorbate 80 at 0.2 mg/ml.
- a method of preparing a liquid anti-TNF- ⁇ antibody formulation as described above comprising:
- the present invention provides an antibody preparation comprising the anti-TNF- ⁇ antibody as described above.
- the antibody preparation further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
- Figure 5 shows the antibody A preparation of the present invention and the relative binding ability of Simpuny to TNF- ⁇ .
- Figure 7A shows the effect of antibody A of the present invention on the arthritis score of Tg197 transgenic spontaneous arthritis mouse model.
- the concentration of the stabilizer is about 60-100 mg/ml; in some embodiments, the concentration of the stabilizer is about 80-90 mg/ml; in some embodiments, the concentration of the stabilizer is about 85 mg/ml. ml. In some embodiments, the stabilizer is about 85 mg/ml trehalose dihydrate. In some embodiments, the anti-stabilizer is trehalose dihydrate or sucrose, and the concentration of the stabilizer is about 60 mg/ml, about 70 mg/ml, about 75 mg/ml, about 80 mg/ml, about 85 mg/ml. ml, about 90 mg/ml, about 95 mg/ml, about 100 mg/ml, or a range between any two concentrations, including endpoints.
- Example 7 Stability study of the antibody A preparation of the present invention under high temperature (40°C) conditions
- the pharmacodynamics of the antibody A preparation prepared as above was studied in vitro and in vivo animal models.
- the in vitro test mainly carried out the following pharmacodynamic tests: the binding ability to TNF- ⁇ , the affinity to TNF- ⁇ , and the inhibitory effect on the biological activity of TNF- ⁇ .
- standard product S is 110.4mg/ml protein content, 1.980 ⁇ 10 5 U/mg active antibody A
- Simpuny use the same method as above to measure its affinity, and further Calculate the relative affinity of the antibody A of the present invention and the commercial Simpuny antibody to the standard S.
- the results show that the relative affinities of antibody A and Simpuny of the present invention for binding to TNF- ⁇ are basically the same, as shown in FIG. 4.
- Fc ⁇ RIIIa Fc ⁇ RIIIa
- F158 Fc ⁇ RIIIa
- V158 Fc ⁇ RIIIa
- the absorbance of the antibody A standard product S of the present invention and the concentration of the standard sample are fitted to a standard curve with four parameters, and the obtained standard curve is used to quantify the antibody concentration of the test sample measured on the same plate.
- the WinNonLin6.4 non-compartmental model (NCA) was used to calculate the pharmacokinetic parameters of the drug, and the average plasma drug concentration-time curve was made. The results are shown in Figure 12.
Abstract
一种抗TNF-α的抗体制剂及其制备方法和应用，包含抗TNF-α抗体和药学上可接受的载体，抗TNF-α抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链，药学上可接受的载体包含稳定剂、表面活性剂、缓冲剂。
Description
本发明属于制药领域，具体涉及抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)的抗体制剂、其制备方法和用途。
肿瘤坏死因子α(TNF-α，tumor necrosis factor α)，主要由巨噬细胞和单核细胞所分泌，是重要的促炎因子和免疫调节因子，调节多种生理过程，如诱导黏附分子表达，调控淋巴细胞形成淋巴组织，调节机体免疫防御。研究发现，当TNF-α处在低浓度时，被认为对人有益，比如增强免疫反应；当TNF-α处在高浓度时，会导致炎症反应和器官损伤，比如败血症患者体内TNF-α在短期内大量产生，可导致患者休克。研究发现TNF-α通过与下游效应细胞表面的肿瘤坏死因子受体(TNFR)结合，诱导黏附分子表达，如细胞间黏附分子(ICAM-1)、血管细胞黏附分子(VCAM-1)，使中性粒细胞聚集，调节中性粒细胞和巨噬细胞增生、成熟和活化，进一步刺激单核细胞、血管内皮细胞等释放其他细胞因子，如促炎因子白细胞介素因子1(IL-1)和白细胞介素因子8(IL-8)，引发级联反应，最终导致组织的炎症损伤(Paul A T,Gohil V M,Bhutani K K.Modulating TNF-alpha signaling with natural products.Drug Discovery Today,2006,11(11):725-32.)。在多个慢性炎症疾病比如银屑病关节炎、类风湿关节炎和强直性脊柱炎等患者的血液和关节滑膜发现TNF-α浓度升高，表明TNF-α与这些疾病密切相关。近年来许多新研发的生物制剂可通过阻断或下调TNF-α的活性而控制病情的进展，如TNF-α抑制剂。TNF-α抑制剂的主要作用机制是：特异性结合到分泌型肿瘤坏死因子α(sTNF-α)后，能够阻断其与TNFR的结合，抑制其生物活性；并能与TNF-α合成细胞上的跨膜型肿瘤坏死因子α(tmTNF-α)结合，激活反向信号传导(reverse signaling)通路使TNF-α合成量减少，甚至引起TNF-α合成细胞凋亡，从而缓解病人炎症症状。
目前，市场上的TNF-α抑制剂药物主要有英夫利西单抗(Infliximab，商品名
)、依那西普(Etanercept，商品名
)、阿达木单抗(Adalimumab，商品名
)、戈利木单抗(Golimumab，商品名欣普尼
)和赛妥珠单抗(Certolizumab pegol，商品名
)。其中戈利木单抗是全人源单克隆抗体，获批上市的是皮下注射制剂，是国际第一个上市的可4周皮下给药一次的TNF-α抑制剂药物。
从最初的鼠源性抗体到目前广泛应用的全人源抗体，抗体的免疫原性大幅降低。然而，哺乳动物细胞可合成对人类具有免疫原性的Neu5Gc唾液酸(NGNA)，比如采用Sp2/0细胞进行抗体生产时，抗体被NGNA糖基化修饰的水平较高，这样可能存在引起人体免疫反应的风险。
因此，本领域对于具有改善的性能的抗TNF-α抗体及其制剂仍存在需要。
发明内容
在一个方面，本发明提供了抗TNF-α的抗体产品，在一些实施方案中，抗TNF-α的抗体产品为抗TNF-α的抗体制剂。所述制剂具有改善的性能，在高浓度抗体蛋白下具有出色的抗体蛋白稳定性和制剂稳定性(特别是在高温、光照变化、反复冻融等条件下仍保持出色的抗体蛋白稳定性)，从而降低不良反应风险，不易生长微生物等。所述制剂包含抗TNF-α抗体和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含稳定剂；在一些实施方案中，所述稳定剂为糖、盐酸精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或其组合；在一些实施方案中，所述稳定剂为海藻糖或蔗糖；在一些实施方案中，稳定剂为海藻糖。在一些实施方式中，抗体制剂不包含糖醇。
在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体的浓度为5-130mg/ml；在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体的浓度为50-130mg/ml；在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体的浓度为90-110mg/ml；在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体的浓度为100mg/ml。
在一些实施方案中，所述稳定剂的浓度为160-265mM；在一些实施方案中，稳定剂的浓度为210-240mM；在一些实施方案中，稳定剂的浓度为225mM。在一些实施方案中，稳定剂为225mM的海藻糖。
在一些实施方案中，所述抗体制剂可以为液体形式、粉末形式或其他任何合适的形式。根据施用途径、储存条件等需要，粉末形式可以在使用前重悬为溶液形式使用。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体还包含表面活性剂和/或缓冲剂。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯；在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯20和/或聚山梨酯80；在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80；在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.05-0.5mg/ml；在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.1-0.5mg/ml；在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.1-0.3mg/ml；在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.2mg/ml。在一些实施方案中，所述表面活性剂为0.2mg/ml的聚山梨酯80。
在一些实施方案中，所述抗体制剂的pH为4.5-6.5；在一些实施方案中，pH为4.5-6.0；在一些实施方案中，pH为5.0-6.0；在一些实施方案中，pH为5.0-5.8；在一些实施方案中，pH为5.2-5.8；在一些实施方案中，pH为5.5。
在一些实施方案中，所述抗体制剂包含溶剂。在一些实施方案中，所述溶剂为如水，如注射用水。
在一些实施方案中，所述抗体制剂的缓冲剂为组氨酸缓冲剂、谷氨酸缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、琥珀酸缓冲剂和枸橼酸缓冲剂中的一种或多种；在一些实施方案中，缓冲剂为组氨酸缓冲剂、谷氨酸缓冲剂、醋酸钠缓冲剂；在一些实施方案中，缓冲剂为组氨酸缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为5-30mM；在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为10-20mM；在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为10mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂为10mM的组氨酸缓冲剂。
所述抗体制剂的各种药学上可接受的载体可以与抗体混合在一起提供，也可以分开提供，并在使用前进行混合。
在一些实施方案中，提供了抗TNF-α的抗体制剂，所述抗体制剂包含溶剂水、抗TNF-α抗体、表面活性剂、稳定剂和缓冲剂；所述抗TNF-α抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链，且抗体制剂包含5-130mg/ml所述抗TNF-α抗体、160-265mM所述稳定剂、0.05-0.5mg/ml所述表面活性剂、5-30mM所述缓冲剂，所述抗体制剂的pH为4.5-6.5。在一些实施方案中，抗体制剂包含90-110mg/ml所述抗TNF-α抗体、210-240mM所述稳定剂、0.1-0.3mg/ml所述表面活性剂、10-20mM所述缓冲剂，所述抗体制剂的pH为4.5-6.0。在一些实施方案中，抗体制剂包含90-110mg/ml所述抗TNF-α抗体、210-240mM海藻糖、0.1-0.3mg/ml聚山梨酯80、10-20mM组氨酸缓冲剂，所述抗体制剂的pH为4.5-6.0。在一些实施方案中，抗体制剂包含100mg/ml所述抗TNF-α抗体、225mM海藻糖、0.2mg/ml聚山梨酯80、10mM组氨酸缓冲剂，所述抗体制剂的pH为5.0-5.8。
在一些实施方案中，提供了抗TNF-α的抗体制剂，所述抗体制剂包含溶剂水、抗TNF-α抗体、表面活性剂、稳定剂和缓冲剂；所述抗TNF-α抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链，且所述抗TNF-α抗体的浓度为100mg/ml，所述稳定剂为85mg/ml海藻糖二水合物，所述表面活性剂为0.2mg/ml聚山梨酯80，所述抗体制剂具有pH5.5的酸碱度，且所述酸碱度是通过向所述抗体制剂的液体组分加入1.72mg/ml盐酸组氨酸及0.28mg/ml组氨酸维持。
在第二个方面，本发明提供了制备如前文所述的抗TNF-α抗体制剂的方法。
在一种实施方案中，提供了制备如前文所述的液体抗TNF-α抗体制剂的方法，所述方法包括：
称量稳定剂、表面活性剂和缓冲剂，
将称好的各成分分散在注射用液体溶剂中，从而制备得到溶剂体系，
在搅拌状态下将所述溶剂体系与抗TNF-α抗体混合。
在一些实施方案中，所述方法中，所述缓冲剂可以是组氨酸缓冲剂、谷氨酸缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、琥珀酸缓冲剂和枸橼酸缓冲剂中的一种或多种；所述稳定剂可以是糖、盐酸精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或其组合；所述表面活性剂可以是聚山梨酯。
在一些实施方案中，提供了一种制备抗TNF-α抗体制剂的方法，所述方法包括：
称取海藻糖、聚山梨酯80、组氨酸、盐酸组氨酸；
将称好的各成分溶解在注射用水中，从而制备得到溶剂体系；
在搅拌状态下将所述溶剂体系与抗TNF-α抗体混合；
使得各成分的最终浓度分别为90-110mg/ml抗TNF-α抗体、80-90mg/ml海藻糖、0.1-0.3mg/ml聚山梨酯80、1-3mg/ml盐酸组氨酸及0.2-0.5mg/ml组氨酸，且所述抗体制剂的最终pH为5.0-6.0。
在一些实施方案中，各成分的最终浓度为100mg/ml抗TNF-α抗体、85mg/ml海藻糖、0.2mg/ml聚山梨酯80；1.72mg/ml盐酸组氨酸及0.28mg/ml组氨酸。
所述方法还可以包括制备抗TNF-α抗体制剂和/或对所述抗体制剂除菌和包装的步骤。例如使制备的抗体制剂通过0.22μm孔径的亲水性聚偏氟乙烯或聚醚砜的过滤膜进行除菌。
在第三个方面，本发明提供了一种治疗TNF-α相关疾病的方法，包括向有相应需要的患者施用如前文所述的本发明的抗TNF-α抗体制剂。所述TNF-α相关疾病包括但不限于慢性炎症疾病，比如银屑病关节炎、类风湿关节炎和强直性脊柱炎等。
在一些实施方案中，所述方法包括通过皮下注射施用本发明的抗体制剂，在一些实施方案中，每4周给药一次；在一些实施方案中，每次施用50mg/次。
在第四个方面，本发明提供了一种治疗TNF-α相关疾病的抗体药物制品，包括如前文所述的本发明的抗TNF-α抗体制剂以及用于保存所述制剂的容器。所述药物制品还可以包括使用说明书。所述容器可以是本领域常规使用的用于保存药品的任何容器，如预灌封容器、预填充注射器、小瓶、安瓿、小袋等。
在第五个方面，本发明提供了如前文所述的本发明的抗TNF-α抗体制剂或抗体药物制品在制备用于治疗TNF-α相关疾病的药物中的用途。所述TNF-α相关疾病包括但不限于慢性炎症疾病，比如银屑病关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎等。
第六个方面，本发明提供了一种含低Neu5Gc唾液酸(NGNA)水平的抗TNF-α抗体，在保证抗体活性不受影响的条件下，降低不良反应风险，所述抗TNF-α抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体的Neu5Gc唾液酸(NGNA)水平与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.1。在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体由含有编码所述抗TNF-α抗体的核酸或载体的CHO细胞表达。在一些实施方案中，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。在一些实施方式中，CHO-K1细胞被驯化为适应悬浮培养的CHO-K1细胞。
第七个方面，本发明提供了制备本发明的抗TNF-α抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法使用CHO细胞系作为宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法包括培养含编码所述抗TNF-α抗体的核酸或载体的CHO细胞，使所述CHO细胞表达所述抗TNF-α抗体。在一些实施方案中，所述方法包含以下步骤：1)将编码所述抗TNF-α抗体的核酸或载体转染CHO细胞；2)培养所述CHO细胞，使所述CHO细胞表达所述抗TNF-α抗体；在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体包含重链和轻链，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在一些实施方案中，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
在一些实施方案中，方法还包含如下步骤：停止培养后，收获培养液。在一些实施方案中，方法还包含在收获培养液之后，纯化抗TNF-α抗体。
第七个方面，本发明提供了通过如上方法制备的抗TNF-α抗体，所述抗体具有降低的脱酰胺水平和/或降低的NGNA糖基化水平。在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体中的Neu5Gc唾液酸(NGNA)与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.1；在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体中的NGNA与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.01；在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体中的NGNA与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.005。
在一些实施方案中，所述CHO细胞表达的抗TNF-α抗体包含如SEQ ID NO.1所示的 重链氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示的轻链氨基酸序列，并在与TNF-α结合的相对亲和力、与TNF-α的结合能力，对TNF-α生物学活性的抑制作用、与FcRn结合的相对亲和力、与FcγRIIIa(F158)结合的相对亲和力、与FcγRIIIa(V158)结合的相对亲和力、在食蟹猴体内的药代动力学特征(如血浆药物浓度)中的一项或多项与欣普尼基本一致(差别不超过±20％，或±10％，或±5％，或不超过标准偏差的3倍、2倍或1倍)。在一些实施方案中，所述CHO细胞表达的抗TNF-α抗体为抗体A。
第八个方面，本发明提供了包含如上所述的抗TNF-α抗体的抗体制剂。在一些实施方案中，所述抗体制剂还包含药学上可接受的载体。
本发明所开发的抗TNF-α抗体在保证抗体活性的条件下，NGNA糖基化水平低，从而使抗体的活性较高且免疫原性较低。本发明所开发的抗TNF-α抗体制剂，包含高浓度的本发明的抗TNF-α抗体蛋白，抗体的活性较高且免疫原性较低，且其中所含的高浓度抗体蛋白稳定，特别是耐受高温、光照、反复冻融引起的蛋白聚集反应，且不支持微生物生长。因此，本发明的抗TNF-α抗体制剂满足了本领域对于具有改进的性能的抗TNF-α抗体药物制剂的需要。
图1显示了实施例3中检测的抗TNF-α抗体制剂的缓冲剂筛选试验的尺寸排阻色谱检测结果图。
图2显示了本发明的抗TNF-α抗体制剂的高温(40℃)条件下稳定性研究的毛细管电泳检测结果图。
图3显示了本发明的抗TNF-α抗体制剂的冻融稳定性研究的尺寸排阻色谱检测结果图。
图4显示了本发明的抗体A制剂和欣普尼与TNF-α结合的相对亲和力。
图5显示了本发明的抗体A制剂和欣普尼与TNF-α的相对结合能力。
图6显示了本发明的抗体A制剂和欣普尼对TNF-α生物学活性的抑制作用。
图7A显示了本发明的抗体A对Tg197转基因自发关节炎小鼠模型的关节炎评分的影响。
图7B显示了本发明的抗体A对Tg197转基因自发关节炎小鼠模型的组织病理学评分的影响。
图8A和图8B显示了本发明的抗体A和欣普尼的抗体的分子量比较(图8A：完整分子量；图8B：脱糖分子量)。
图9显示了本发明的抗体A和欣普尼的抗体与FcRn结合的相对亲和力。
图10显示了本发明的抗体A和欣普尼的抗体与FcγRIIIa(F158)结合的相对亲和力。
图11显示了本发明的抗体A和欣普尼的抗体与FcγRIIIa(V158)结合的相对亲和力。
图12A显示了本发明的抗体A和欣普尼的抗体低剂量组均为3mg/kg在食蟹猴体内的药代动力学比较。
图12B显示了本发明的抗体A和欣普尼的抗体高剂量组均为10mg/kg在食蟹猴体内的药代动力学比较。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员能知晓或仅通过常规实验就能确定本发明的具体实施方案的各种等同方案。这些等同方案也包括在本发明的范围内。本发明引用的所有文献及专利均通过引用并入本文。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
技术人员可以理解的是，本文所提到的重量和/或重量与体积比可以利用相应成分的公知的分子量换算成摩尔和/或摩尔浓度。实施例中所列举的重量是用于相应体积的。技术人员可以理解的是，在需要不同的制剂体积时，可以成比例地调整所述重量。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义
如本文所用，本发明中，涉及到组分的“％”，具体指重量体积(w/v)百分比，其中，重量单位可以为g，体积单位可以为ml。比如溶液中含1％稳定剂表示100ml溶液中含有1g稳定剂，或稳定剂含量为0.01g/ml。
“约”或“大约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到的“约”或“大约”指所描述的数值以及其±10％、±5％、±1％或±0.1％的范围。
“包括”或“包含”指组合物和方法等等包括所列举的元素(如组合物中的组分，方法中的步骤等)，但不排除其它。当“基本上由……组成”用于定义组合物和方法时，指排除对用于预期用途的组合有根本影响的其它元素，但不排除不会本质上影响组合物或方法的特征的元素。“由……组成”指排除未特别列举的元素。由这些过渡术语中的每一者定义的实施方案均在本发明的范围内。举例来说，当组合物被描述为包括成分A、B以及C时，基本上由A、B以及C组成的组合物和由A、B以及C组成的组合物独立地在本发明的范围内。
如本文所用，“抗体”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整的抗体及其任何抗原结合片段或单链。因此，术语“抗体”包括包含如下分子的任何蛋白质或肽，该分子包含免疫球蛋白分子中具有与抗原结合的生物活性的至少一部分。这样的实例包括但不限于重链或轻链或其配体结合部分的互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架(FR)区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。
如本文所使用的，术语“治疗”指的是治疗性处理和预防性措施二者，其目的是预防或减缓(减少)不希望的生理变化或病症，如TNF-α相关疾病的进展。有益或期望的临床结 果包括但不限于缓解症状、减少疾病程度、稳定病情(即不恶化)、延缓或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态、缓解(部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗的人包括那些已经患有病况或病症的患者，以及那些容易发生病况或病症的患者，或那些需要预防病况或病症的患者。
如本文使用的“患者”指的是需要对其进行治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人类、家畜、牲畜、动物园动物、运动用动物或宠物动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛等。
如本文所使用的“有相应需要的患者”包括会受益于施用本发明的抗体或制剂的患者，如哺乳类患者。
如本文所使用的术语“药学上可接受的”是指由公认药典中列出的可以在动物中，尤其是在人类中使用的药物。“药学上可接受的载体”通常是无毒固体、半固体或液体填料、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。
术语“缓冲剂”，在一些文献中，也被称为缓冲系统或缓冲体系，其包括但不限于有机酸盐，如琥珀酸、醋酸、柠檬酸，抗坏血酸，葡糖酸，碳酸，酒石酸或苯二甲酸及其盐；Tris，thomethamine盐酸盐，或磷酸盐缓冲剂。此外，氨基酸及其盐也可以用作缓冲剂。这样的氨基酸组分包括但不限于甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。在一些实施方式中，缓冲剂为组氨酸盐缓冲剂。
本发明中缓冲剂的量，是指组成缓冲剂的缓冲体系中缓冲对的总量。在一些实施方式中，采用摩尔浓度作为缓冲剂(或缓冲液)的量的单位，其数值指缓冲剂(或缓冲液)的缓冲体系中缓冲对的摩尔浓度。如，由组氨酸和盐酸组氨酸组成的组氨酸缓冲剂作为缓冲剂时，给定浓度的组氨酸盐缓冲剂(如10mM)是组氨酸和盐酸组氨酸的组合浓度(如组氨酸为5mM，盐酸组氨酸为5mM；或者组氨酸为1.8mM，盐酸组氨酸为8.2mM)。
术语“稳定剂”包括但不限于单糖，例如果糖，麦芽糖，半乳糖，葡萄糖，山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；离子稳定剂，它们包括盐，如NaCl或氨基酸组分如精氨酸-HCl、脯氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸。
术语“表面活性剂”包括但不限于聚山梨酯(如聚山梨酯20和聚山梨酯80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；辛基配糖物钠盐；月桂基磺基甜菜碱、肉豆蔻基磺基甜菜碱、亚油烯基磺基甜菜碱或硬脂基磺基甜菜碱；月桂基肌氨酸、肉豆蔻基肌氨酸、亚油烯基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亚油烯基甜菜碱、肉豆蔻基甜菜碱或鲸蜡基甜菜碱；月桂酰胺基丙基甜菜碱、椰油酰胺基丙基甜菜碱、亚油酰胺基丙基甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基甜菜碱、棕榈酰胺基丙基甜菜碱或异硬脂酰胺基丙基甜菜碱(例如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基二甲胺、棕榈酰胺基丙基二甲胺或者异硬脂酰胺基丙基二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；聚乙二醇，聚丙二醇，和乙烯与丙烯二醇的共聚物(例如Pluronics，PF68等)等等。在一些实施方式中，表面活性剂为聚山梨酯80。
术语“药学上可接受的”是指由国家的监管机构批准的或在国家颁布的药典或其他公 认的药典中列出的用于动物，特别是用于人类的物料。此外，“药学上可接受的载体”通常将是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。
抗TNF-α抗体
本发明提供了对TNF-α蛋白具有高亲和力的抗TNF-α抗体。本发明公开的抗TNF-α抗体，包含重链和轻链，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与序列SEQ ID NO:1具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与序列SEQ ID NO:2具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
SEQ ID NO:1的序列为：
SEQ ID NO:2的序列为：
在一些实施方式中，抗TNF-α抗体为golimumab(
或其生物类似物(如BOW100、ONS-3035或抗体A))。
在一些实施方式中，抗TNF-α抗体通过以下方法制备得到：培养被转染编码抗TNF-α抗体的核酸或载体的CHO细胞，使CHO细胞表达抗TNF-α抗体。在一些实施方式中，CHO细胞为CHO-K1细胞。在一些实施方式中，CHO-K1细胞为适应悬浮培养的CHO-K1细胞。在一些实施方式中，载体可以是质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、非病毒载体或者微环DNA。在一些实施方式中，培养CHO细胞包括：在合适的条件和培养基下，使CHO细胞表达抗TNF-α抗体。
在一些实施方案中，培养CHO细胞步骤包括：在合适的条件和培养基下培养一段时间，使所述CHO细胞表达抗体的重链和轻链并形成抗TNF-α抗体。在一些实施方案中，方法还包含如下步骤：停止培养，收获培养液。在一些实施方案中，方法还包含在收获培养液之后，纯化抗TNF-α抗体。
在一些实施方式中，在收获培养液之后，通过离心培养液，分离得到抗TNF-α抗体。在一些实施方式中，通过常规手段对分离得到的抗TNF-α抗体进行纯化，如通过亲和层析、阴离子交换层析和/或阳离子交换层析等方法对离心得到的抗TNF-α抗体进行纯化；在一些 实施方式中，经过纯化后的抗TNF-α抗体，纯度可以达到约90％以上、约92％以上、约94％以上、约96％以上、98％以上、或约99％以上。
糖基化是抗体的关键质量属性之一。单抗药物功能的实现与其糖基化密切相关，糖基化修饰会影响蛋白的性能，如构象、稳定性、溶解度、药物代谢动力学、活性及免疫原性。根据糖基化的修饰位点可将糖基化分为N位糖基化和O位糖基化。动物细胞分泌的免疫球蛋白中N位的糖基化是最普遍的糖基化，而抗体糖基化也主要是N位糖基化，对于戈利木单抗而言，糖基化多发生在Asn-306。根据糖基化末端精细结构(长度、分支及单糖排列)的不同又可分为复合型、杂合型和高甘露糖型，这些与细胞种属、细胞培养条件都密切相关。
从最初的鼠源性抗体到目前广泛应用的全人源抗体，抗体的免疫原性大幅降低。然而，哺乳动物细胞可合成对人类具有免疫原性的Neu5Gc唾液酸(NGNA)，比如采用Sp2/0细胞进行抗体生产时，糖基化修饰的NGNA水平较高，这样可能存在引起人体免疫反应的风险。
本发明提供了一种低NGNA水平的抗TNF-α抗体，所述抗TNF-α抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体的Neu5Gc唾液酸(NGNA)水平与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.1。在一些实施方式中，所述抗TNF-α抗体中的Neu5Gc唾液酸(NGNA)与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过约0.1、约0.09、约0.08、约0.07、约0.06、约0.05、约0.04、约0.03或约0.02。在一些实施方式中，所述抗TNF-α抗体中的NGNA与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过约0.01、不超过约0.009、不超过约0.008、不超过约0.007、不超过约0.006、不超过约0.005或不超过约0.0045。在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体由含有编码所述抗TNF-α抗体的核酸或载体的CHO细胞表达。
本发明提供一种生产本发明的抗TNF-α抗体的方法，包含以下步骤：制备编码抗TNF-α抗体的核酸或载体；将编码抗TNF-α抗体的核酸或载体转染CHO-K1细胞；在合适的条件和培养基下，使CHO-K1细胞表达抗TNF-α抗体；停止培养；收获培养液；通过离心培养液，分离得到抗TNF-α抗体；通过亲和层析对离心得到的抗TNF-α抗体进行初步纯化；通过阴离子及阳离子交换层析对初步纯化的抗TNF-α抗体作进一步纯化，得到纯化后的抗TNF-α抗体。在一些实施方式中，本发明提供了抗体A；抗体A为抗TNF-α抗体，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；并且抗体A通过上述方法生产得到。
本发明提供了通过如上方法制备的抗TNF-α抗体，所述抗体具有较低的NGNA糖基化水平。在一些实施方式中，所述抗TNF-α抗体中的Neu5Gc唾液酸(NGNA)与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过约0.1、约0.09、约0.08、约0.07、约0.06、约0.05、约0.04、约0.03或约0.02。在一些实施方式中，所述抗TNF-α抗体中的NGNA与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过约0.01、不超过约0.009、不超过约0.008、不超过约0.007、不超过约0.006、不超过约0.005或不超过约0.0045。
剂型
本发明的抗体制剂可以是液体溶液剂(例如可注射、可输注、可灌注溶液剂)、或粉末剂。形式取决于需要的施用方式和治疗应用。制剂是可注射、可输注或可灌注的溶液剂形式。施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内施用)。在一些实施方式中，通过静脉内灌注或注射施用抗体。在另一些实施方式中，通过肌内或皮下注射施用抗体。
药物制剂中还可以掺入补充的活性化合物。在一些实施方式中，将本发明的抗体或其抗原结合部分与一种或多种另外的治疗药物共同配制和/或共同施用。例如，另外的治疗药物可以是DMARD、NSAID、能结合其他靶物的其他抗体(例如能结合其他细胞因子或者能结合细胞表面分子的抗体)、细胞因子、可溶性TNF-α受体、能抑制TNF-α产生和活性的化学物质或者其任何组合。此外，可将本发明的抗体与上述治疗物质联合使用。这种联合治疗可以有利地采用较低剂量的所施用的治疗药物，从而避免与各种单一治疗有关的可能副作用、并发症或者低水平患者反应，或者增加疗效。
在一些实施方式中，抗体制剂为抗TNF-α的抗体制剂。在一些实施方式中，抗TNF-α抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链。在一些实施方式中，抗TNF-α抗体的浓度为约5-130mg/ml；在一些实施方式中，抗TNF-α抗体的浓度为约50-130mg/ml；在一些实施方式中，抗TNF-α抗体的浓度为约90-110mg/ml；在一些实施方式中，抗TNF-α抗体的浓度约为100mg/ml。在一些实施方式中，抗TNF-α抗体的浓度为约5mg/ml、约10mg/ml、约30mg/ml、约50mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml或任意两个浓度之间的范围，包括端点值。
在一些实施方式中，抗TNF-α的抗体制剂中的抗TNF-α抗体为CHO细胞表达的抗TNF-α抗体。在一些实施方式中，表达抗TNF-α抗体的CHO细胞为CHO-K1细胞。
在一些实施方式中，所述制剂中抗TNF-α抗体中的NGNA与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.1；在一些实施方式中，抗TNF-α抗体中的NGNA与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.01；在一些实施方式中，抗TNF-α抗体中的NGNA与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.005。
在一些实施方式中，药学上可接受的载体包含稳定剂；在一些实施方式中，稳定剂为糖、盐酸精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或其组合；在一些实施方式中，稳定剂为海藻糖或蔗糖；在一些实施方式中，稳定剂为海藻糖。在一些实施方式中，稳定剂的浓度为约160-265mM；在一些实施方式中，稳定剂的浓度为约210-240mM；在一些实施方式中，稳定剂的浓度为约225mM。在一些实施方式中，稳定剂为约225mM的海藻糖。在一些实施方式中，所述抗稳定剂为海藻糖或蔗糖，所述稳定剂的浓度为约160mM、约180mM、约200mM、约210mM、约225mM、约240mM、约250mM、约265mM或任意两个浓度之间的范围，包括端点值。
固体状态下，海藻糖通常以海藻糖二水合物存在的，所以在一些实施方式中，配制制剂时采用海藻糖二水合物，也可以采用相应量的其他形式的海藻糖配制，所得制剂含同样浓度海藻糖。本文中用海藻糖二水合物描述制剂中海藻糖的含量时，制剂中可含所述量的海藻糖二水合物或相应量的海藻糖或其他形式的海藻糖或其组合，反之亦然。
在一些实施方式中，稳定剂的浓度为约60-100mg/ml；在一些实施方式中，稳定剂的浓度为约80-90mg/ml；在一些实施方式中，稳定剂的浓度为约85mg/ml。在一些实施方式中，稳定剂为约85mg/ml的海藻糖二水合物。在一些实施方式中，所述抗稳定剂为海藻糖二水合物或蔗糖，所述稳定剂的浓度为约60mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml或任意两个浓度之间的范围，包括端点值。
在一些实施方式中，药学上可接受的载体还包含表面活性剂和/或缓冲剂。
在一些实施方式中，所述制剂还包括表面活性剂。在一些实施方式中，表面活性剂包括非离子表面活性剂，如聚山梨酯80。表面活性剂减少所述抗体的聚集和/或减少颗粒在所述制剂中的形成和/或减少吸附。在一些实施方式中，表面活性剂为聚山梨酯；在一些实施方式中，表面活性剂为聚山梨酯20和/或聚山梨酯80；在一些实施方式中，表面活性剂为聚山梨酯80；在一些实施方式中，表面活性剂的浓度为约0.05-0.5mg/ml；在一些实施方式中，表面活性剂的浓度为约0.1-0.5mg/ml；在一些实施方式中，表面活性剂的浓度为约0.1-0.3mg/ml；在一些实施方式中，表面活性剂的浓度为约0.2mg/ml。在一些实施方式中，表面活性剂为约0.2mg/ml的聚山梨酯80。在一些实施方式中，聚山梨酯80的浓度为约0.05mg/ml、约0.1mg/ml、约0.15mg/ml、约0.2mg/ml、约0.25mg/ml、约0.3mg/ml、约0.4mg/ml、约0.5mg/ml或任意两个浓度之间的范围，包括端点值。
在一些实施方式中，抗体制剂的pH为约4.5-6.5；在一些实施方式中，pH为约4.5-6.0；在一些实施方式中，pH为约5.0-6.0；在一些实施方式中，pH为约5.2-5.8；在一些实施方式中，pH为约5.5。在一些实施方式中，pH为约4.5、约5.0、约5.2、约5.5、约5.8、约6.0或任意两个酸碱值之间的范围，包括端点值。
在一些实施方式中，抗体制剂的缓冲剂为组氨酸缓冲剂、谷氨酸缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、琥珀酸缓冲剂或枸橼酸缓冲剂；在一些实施方式中，缓冲剂为组氨酸缓冲剂、谷氨酸缓冲剂、醋酸钠缓冲剂；在一些实施方式中，缓冲剂为组氨酸缓冲剂。在一些实施方式中，缓冲剂的浓度为约5-30mM；在一些实施方式中，缓冲剂的浓度为约10-20mM；在一些实施方式中，缓冲剂的浓度为约10mM。在一些实施方式中，缓冲剂为约10mM的组氨酸缓冲剂。在一些实施方式中，组氨酸缓冲剂的浓度为约5mM、约10mM、约20mM、约30mM或任意两个浓度之间的范围，包括端点值。
在一些实施方式中，抗体制剂包含约5-130mg/ml抗TNF-α抗体；约160-265mM稳定剂；约0.05-0.5mg/ml表面活性剂；约5-30mM缓冲剂；抗体制剂的pH为约4.5-6.5。在一些实施方式中，抗体制剂包含约90-110mg/ml抗TNF-α抗体；约210-240mM稳定剂；约0.1-0.3mg/ml表面活性剂；约10-20mM缓冲剂；抗体制剂的pH为约4.5-6.0。在一些实施方式中，抗体制剂包含约90-110mg/ml抗TNF-α抗体；约210-240mM海藻糖；约0.1-0.3mg/ml聚山梨酯80；约10-20mM组氨酸缓冲剂；抗体制剂的pH为约4.5-6.0。在一些实施方式中，抗体制剂包含约100mg/ml抗TNF-α抗体；约225mM海藻糖；约0.2mg/ml聚山梨酯80；约10mM组氨酸缓冲剂；抗体制剂的pH为5.0-5.8。在一些实施方式中，抗体制剂包含约100mg/ml抗TNF-α抗体；约10mM-约142mM盐酸精氨酸；约0.2mg/ml聚山 梨酯80；约10mM组氨酸缓冲剂；抗体制剂的pH为5.0-5.8。在一些实施方式中，抗体制剂包含约100mg/ml抗TNF-α抗体；约333mM甘氨酸；约0.2mg/ml聚山梨酯80；约10mM组氨酸缓冲剂；抗体制剂的pH为5.0-5.8。在一些实施方式中，抗体制剂包含约100mg/ml抗TNF-α抗体；约34mM甲硫氨酸；约0.2mg/ml聚山梨酯80；约10mM组氨酸缓冲剂；抗体制剂的pH为5.0-5.8。在一些实施方式中，抗TNF-α抗体为
(golimumab)或其生物类似物(如BOW100，ONS-3035或抗体A)。
在一些实施方式中，抗体制剂包含：约100mg/ml抗体A，约1.72mg/ml盐酸组氨酸，约0.28mg/ml组氨酸，约85mg/ml海藻糖二水合物，约0.2mg/ml聚山梨酯80，pH为约5.5。
在一些实施方式中，所述抗TNF-α抗体制剂中酸性抗体变体的含量不超过约40％、不超过约35％、不超过约30％。在一些实施方案中，所述抗TNF-α抗体制剂中，酸性抗体变体的含量为约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或约30％或任意两个浓度之间的范围，包括端点值。
在一些实施方式中，本发明提供的抗TNF-α抗体制剂高温(40℃±3℃)放置1周、2周、3周或4周后，抗TNF-α抗体的酸峰含量不超过30％。
本发明提供液体含水药物制剂，包括适合治疗用途的抗体，主要用于治疗由TNF-α引起的病症。这种药物制剂便于施用，并且含有高蛋白浓度，可以皮下注射。在一些实施方式中，所述药物制剂具有增强稳定性的作用，且能使抗体的脱酰胺保持低水平。在另一些实施方式中，本发明的制剂在经过至少5次冻融循环后是稳定的。在另一些实施方式中，本发明的制剂，经过高温(40℃)放置15天后保持稳定。在另一些实施方式中，所述抗体针对人TNF-α。在另一些实施方式中，所述抗体是抗体A。
施用途径
本发明的抗体制剂可通过多种本领域公知的方法施用。在一些实施方式中，通过皮下注射施用。在另一些实施方式中，通过静脉内注射、静脉输注或灌注施用。本领域技术人员知晓，施用途径根据期望的结果的不同而不同。
在一些实施方式中，抗体制剂通过皮下注射施用在患者身上。在一些实施方式中，抗体的给药剂量为20mg/次-100mg/次；在一些实施方式中，给药剂量为约50mg/次。抗体的给药频率为1周/次-6周/次；在一些实施方式中，给药频率4周/次。在一些实施方式中，将抗体制剂通过皮下注射施用在患者身上，每4周或每月给药1次，每次约50mg抗TNF-α抗体。
在一些实施方式中，患者为患有银屑病关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎等的患者。
在一些实施方式中，患者为患有溃疡性结肠炎的患者，给药剂量首次给药约200mg，第2周给药约100mg，之后每4周给药1次，每次约100mg抗TNF-α抗体。
TNF-α相关疾病
本文所用的术语“TNF-α相关疾病”包括如下疾病：已证明TNF-α在患有该病症的受试者中的存在或怀疑TNF-α是造成该病症的病理生理的原因或者是促使该病症恶化的因素。TNF-α相关疾病包括但不限于慢性炎症疾病，比如银屑病关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎等。
实施例
实施例1：抗体A蛋白氨基酸序列及其表达和纯化
1.抗体A蛋白的氨基酸序列
本发明的制剂中采用的抗TNF-α的人抗体(抗体A)为重组抗肿瘤坏死因子α全人源单克隆抗体，属于IgG1抗体，分子量约为150kDa，由2条IgG1重链和2条κ轻链组成。每条重链含有456个氨基酸，分子量为51kDa，其重链氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示；每条轻链含有215个氨基酸，分子量为24kDa，轻链氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示。可以通过重组DNA技术，在CHO细胞中表达，并且通过一系列标准的层析步骤纯化获得。
2.抗体A蛋白的表达和纯化
首先参照分子生物学分子克隆方法(如采用2014年出版的《Molecular Biology of the Gene》中教导的方法)构建含抗体基因的表达载体，再参照Wood等,J Immunol.145:3011(1990)等的方法，以CHO-K1细胞(ATCCCCL61)作为宿主细胞表达抗体A。稳定细胞系的构建过程描述如下：使宿主细胞悬浮生长于CD CHO AGT
TM培养基(Gibco,CA,12490017)，取处于对数生长期的宿主细胞离心，重悬于新鲜的CD CHO AGT
TM培养基，取0.8ml上述细胞悬液加入电击杯，然后加入已双酶切的分别含有轻链和重链编码基因的两种质粒各40μg(预先构建好的含有抗体基因的表达载体，使用的质粒为pFUSE-CLIg和pFUSE-CHIg，Invivogen公司，货号pfuse2-hclk和pfuse-hchg1)，将细胞与质粒混合均匀。用Bio-rad电转仪(Bio-rad，Gene PulserXcell)转化。把电击后的细胞立即重悬于37℃预热的CD CHO AGT
TM培养基，以每孔0.1ml加入96孔板，2-3天后加入等量的筛选培养基(CD CHO AGT
TM培养基+50μM蛋氨酸亚氨基代砜(MSX，购自Sigma-Aldrich，76078))。使用多功能酶标仪(Molecular Devices，Spectramax M4)测定96孔板细胞培养上清中抗体的表达水平。将表达水平较高的克隆从96孔板转移到含有筛选培养基的24孔板培养，待细胞生长7天后，把细胞转入含有筛选培养基的6孔板培养，测定细胞的抗体产量，将高表达量的克隆转到摇瓶。筛选出5-8个表达量最高的克隆进行亚克隆并重复上述筛选过程，最终获得1株表达量最高的工程细胞。采用生物反应器对细胞进行发酵培养。通过低速离心培养液，使细胞和培养基分离，再通过高速离心把上清液进一步澄清。
使用蛋白纯化液相色谱系统(通用电气医疗，AKTA PR0CESS 10MM)用亲和层析(凝胶介质，MabSelectSuRe LX(GE))进行初步纯化。该纯化步骤能够达到预期目的，在有效捕获目标蛋白同时有效去除了大部分的杂蛋白，使用PowerPac Basic(BIO-RAD)采用《实用分子生物学操作指南》，人民卫生出版社，2003出版中介绍的方法进行SDS-PAGE检 测目标蛋白的纯度，纯度达到90％以上。
初步纯化后，使用蛋白纯化液相色谱系统(同上)采用阴离子(Capto Q介质，GE)及阳离子(Capto S ImpAct介质，GE)交换层析进行进一步的分离纯化，进一步去除内毒素、HCP、DNA等杂质，经尺寸排阻色谱(SEC)检测(同上)，SEC单体含量在99％以上。
实施例2：抗体制剂中表面活性剂浓度筛选研究
使用实施例1制备的抗体A分别制备含不同表面活性剂(聚山梨酯80)水平的抗体A制剂样品：
B1：不含表面活性剂；
B2：含0.1mg/ml聚山梨酯80；
B3：含0.2mg/ml聚山梨酯80；
B4：含0.4mg/ml聚山梨酯80；
抗体A、稳定剂、缓冲剂和溶剂及其浓度如下表1所示(表1中表面活性剂为0.2mg/ml，以此为示例)。
表1抗体A制剂的成份列表
将4种制剂B1-B4按1:200的比例用0.9％氯化钠溶液稀释，轻微振荡充分混匀，放置2h后，使用液体颗粒计数器(Beckman Coulter，HIAC 9703+)按生产商推荐的方法进行不溶性微粒检测。检测结果见表2。
表2含不同表面活性剂浓度的抗体A制剂经稀释后不溶性微粒数的检测结果
如上表所示，不含表面活性剂的抗体制剂(B1)的微粒数与其他制剂(B2-B4)相比显著更高，加有表面活性剂的抗体制剂(B2-B4)的微粒数显著下降。表面活性剂的加入量对微粒数也有影响，在加入不同量的表面活性剂的制剂B2-B4中，含有0.2mg/ml和0.4mg/ml聚山梨酯80的制剂(B3和B4)的微粒数，特别是≥10μm的微粒数显著低于含有0.1mg/ml聚山梨酯80的制剂(B2)，含有0.2mg/ml聚山梨酯80的抗体制剂B3的微粒数最低。
实施例3：缓冲剂筛选试验
由于不同缓冲剂的缓冲能力不同，为了找到适合的制剂缓冲剂，制备了含不同缓冲剂的多种制剂(见表3)。制剂中除缓冲剂之外的其他成分及其含量与表1中所示的相同，各制剂的pH均在5.5。保存温度为40℃，时间周期为4周。放置4周后，使用高效液相色谱仪(Agilent，1260 Infinity)，利用如Zhao J等Characterization of the size variants of a recombinant humanized monoclonal antibody(rhumAb1).Acta PharmaceuticaSinica,2016:1897-1905中公开的方法对各制剂进行尺寸排阻色谱(size-exclusion chromatography,SEC)检测，检测结果见图1。
表3含不同缓冲剂的多种制剂
如图1所示，如表3中所示5种制剂的SEC单体纯度差异明显，His缓冲剂对于抗体的保护作用最佳，Glu、NaAc缓冲剂的保护作用次之。
实施例4：抗体制剂的pH筛选研究
pH是维持抗体稳定性的一个关键因素。特定的抗体需要处于特定的pH条件下，才能保持稳定。因此为研究本发明的抗体在何种pH条件下稳定性较好，进行了pH筛选试验。配制6种不同pH的组氨酸缓冲剂，涵盖pH 4.5～6.5的范围。具体的试验分组为：1号样品，pH 4.5；2号样品，pH 5.0；3号样品，pH 5.5；4号样品，pH 5.8；5号样品，pH 6.0；6号样品，pH 6.5。制剂中除缓冲剂外，其它成分及含量如表1所示。
对上述6组样品，进行高温(40℃)对比试验。取时间点1周、2周、3周、4周的样品，用高效液相色谱仪(Agilent，1260 Infinity)，利用如Harris R J等，Identification of multiple sources of charge heterogeneity in a recombinant antibody.Journal of chromatography.B,Biomedical sciences and applications,2001,752(2):233-245中公开的方法对各制剂进行离子交 换层析(ion exchange chromatography，IEC)检测，以检测各制剂的抗体稳定性，检测结果见下表4所示。
表4不同pH范围样品高温对比试验检测结果
从IEC-HPLC检测数据可以看出，6组样品的IEC-HPLC主峰和酸峰含量差异明显，6号样品最差，5号样品稍好，其他4组样品差异较小，表明抗体A的抗体制剂在pH小于6.0的条件下IEC稳定性较好，其中pH 5.5时，抗体A样品的主峰最高，酸峰最低，表明在pH 5.5时抗体A制剂的稳定性最好。
实施例5：稳定剂筛选试验
为了筛选用于本发明的抗体制剂的稳定剂，制备含不同稳定剂的抗体制剂。所采用的 稳定剂及其含量如表5中所示，制剂中除稳定剂之外的其他成分与表1中所示的相同。将各制剂置于25℃、光照培养箱中照射(光照强度4000lx)条件下保存2周。分别在光照0天、7天、2周后，对各制剂进行离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC)检测，以检测各制剂的抗体稳定性，检测结果见表6。
表5含不同稳定剂的制剂
表6含不同稳定剂的制剂样品的光照稳定性试验数据
本领域技术人员知晓，抗体酸峰会随保存时间延长而逐渐增长，且酸峰过高对抗体活性有不利影响。酸峰和主峰的相互转变表现为酸峰和主峰的变化。
在本实验中，由如上表6的数据显示，从IEC酸峰和主峰含量数据可知，在保存2周后，10号制剂样品的酸峰增长幅度较小，且主峰含量下降幅度最小，表明10号制剂样品保存2周后稳定性良好。说明在光照条件下，10号制剂采用的稳定剂，即海藻糖对制剂样品的稳定性具有良好的保护作用。
此外，在保存2周后，7号制剂样品的主峰含量下降幅度较小，酸峰增长幅度较小，表明7号制剂样品在保存2周后稳定性也较好。即盐酸精氨酸对制剂样品的稳定性也具有较好的保护作用。由8号和9号制剂样品的数据可知，甘氨酸和甲硫氨酸对制剂样品也具有较好的保护作用。
实施例6：抗体A制剂的制备
基于如上实施例2-5中所描述的研究，采用0.2mg/ml聚山梨酯80作为表面活性剂，采用His缓冲剂作为缓冲剂，采用海藻糖作为稳定剂，制备本发明的抗体A制剂，制剂pH为5.5。
本发明的抗体A制剂的材料包括：海藻糖、聚山梨酯80、组氨酸、盐酸组氨酸、抗体A、注射用水。
本发明的药物制剂通过如下方法制备：
(1)按以下重量称量出如下成分：850g海藻糖二水合物、2g聚山梨酯80、2.8g组氨酸、17.2g盐酸组氨酸。并准备10L注射用水备用。
(2)将称好的各成分溶解在大约9L注射用水中(添加海藻糖二水合物、聚山梨酯80、组氨酸、盐酸组氨酸的顺序可随意选择)，从而制备得到溶剂体系。
(3)在搅拌状态下将如上制备的溶剂体系与含1000g总蛋白的抗体A浓缩物混合，并最终用注射用水定量至10L，得到本发明的初始制剂。
(4)将如上制备的初始制剂通过0.22μm孔径的亲水性聚偏氟乙烯或聚醚砜的过滤膜进行除菌，过滤膜可将制剂过滤到无菌容器中。
(5)在消毒之后，对制剂进行包装，以便例如在预先填充的注射器中使用。
如上所制备的制剂体积和采用的材料重量可成比例放大或缩小，例如8L、7L、6L、5L制剂分别包括80％、70％、60％、50％的所列举的重量。
实施例7：本发明的抗体A制剂在高温(40℃)条件下的稳定性研究
进一步检测了如实施例6制备的抗体A制剂在高温下的稳定性。将如上制备的抗体A制剂置于高温(40℃)条件下保存15天，然后使用毛细管电泳仪(Agilent，CE 7100)，利用如Chen G等,Characterization of glycoprotein biopharmaceutical products by Caliper LC90 CE-SDS gel technology.Methods Mol Biol,2013,988(988):199-209中公开的方法进行毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)检测，测定的结果见图2。
由图2所示，抗体A制剂在高温(40℃)条件下保存15天，抗体CE主峰下降趋势较缓慢，从98.11％下降至96.79％，高于95％，表明在抗体A制剂中抗体的稳定性良好，说明本发明的制剂对其中的抗体A具有出色的保护作用。
实施例8：本发明的抗体A制剂的冻融稳定性研究
参照如上实施例6所述方法，分别制备低抗体浓度(LC，5mg/mL)、中抗体浓度(MC，50mg/mL)、高抗体浓度(HC，100mg/mL)的抗体A制剂。将各制剂存放在-80℃冰箱中，然后取出置于25℃恒温条件使其溶解，如此反复冻融5次，考察5次冻融后样品的稳定性。将各制剂冻融5次后，分别稀释1×10
5、1×10
6和1×10
6倍，并使用多功能酶标仪(Molecular Devices，Spectramax M4)，利用如王欲晓等在“抗TNF-α人单链抗体的分离纯化及鉴定”.免疫学杂志,2008(6):700-702中公开的方法进行ELISA检测。每种稀释度的抗体分别加样5个孔，测定的回收率和变异系数(CV)列于表7。
表7具有不同抗体浓度的抗体A制剂的冻融实验结果
此外，使用高效液相色谱仪(Agilent，1260 Infinity)利用Zhao J等(同上)公开的方 法分别对具有不同抗体浓度的制剂的各稀释物进行了SEC检测，结果见图3。
结果表明，本发明的具有高、中、低三个水平的抗体A浓度的抗体制剂经5次冻融后，其浓度回收率范围为101.4％～107.3％，变异系数范围为6.1％～11.9％；SEC纯度均在98％以上。说明本发明的具有不同抗体浓度的抗体制剂在反复冻融5次后，质量稳定，制剂对抗体A的保护作用良好。
实施例9：微生物研究
进一步进行了本发明的抗体A制剂的微生物研究。如上实施例6所述制备抗体A制剂，对其进行微生物研究，确定制剂是否能支持微生物生长。分别将微生物(大肠埃希氏菌(CICC-10003)、金黄色葡萄球菌(CICC-10306)、铜绿假单胞菌(CICC-10351)、蜡状芽孢杆菌(CICC-10352))接种到如上无菌制剂，接种量为100cfu/ml，在室温20-25℃条件下保存14天之后，在接种的容器中检测接种过各微生物的制剂的总体微生物生长。评价的指标主要有显微镜(Carl Zeiss，Axiovert 25 662798)下微生物的数目以及浊度的变化(利用浊度仪(HACH，2100AN 4700100))(检测结果如以下表8所示)，其中，浊度不变表明没有微生物生长。如下表8所示数据表明，在室温20-25℃保存14天后，在显微镜下未观察到微生物，并且制剂的浊度未发生变化，因此本发明的制剂不支持微生物生长。
表8抗体A制剂的微生物检测结果
| 测试指标 | 微生物数目cfu/ml | 浊度/NTU |
| 大肠埃希氏菌 | 0 | 浊度不变 |
| 金黄色葡萄球菌 | 0 | 浊度不变 |
| 蜡状芽孢杆菌 | 0 | 浊度不变 |
| 铜绿假单孢菌 | 0 | 浊度不变 |
实施例10：抗体A制剂和欣普尼的药效学比较研究
对如上制备的抗体A制剂进行了体外和体内动物模型的药效学研究。其中体外试验主要进行下面几个方面的药效学检测：与TNF-α的结合能力、与TNF-α的亲和力、对TNF-α生物学活性的抑制作用。
验证了本发明的抗体A与TNF-α的亲和力。具体实验方法如下：首先用PBS将如上实施例6中制备的抗体A制剂稀释成2μg/ml；用PBS将TNF-α(北京义翘神州科技有限公司，10602-HNAE)稀释成20nM，并做2倍梯度稀释，得到20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125nM的TNF-α稀释液。使用BIAcore(GE Healthcare，T200)用Protein A芯片(GE Healthcare，29127556)进行检测，使2μg/ml抗体A制剂以10μl/min的流速通过实验流路(Fc2、Fc4)，捕获10s使捕获量约为200RU；之后流速调为30μl/min，使不同浓度的TNF-α稀释液依次流过，分别经过实验流路(Fc2、Fc4)和参比流路(Fc1、Fc3)表面，结合时间120s，解离时间600s，最后进Glycine 1.5(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A110752)60s对芯片进行再生并进入下一个循环。用数据分析软件Evaluation Software3.1对试验结果进行分析，将样品试验流路采集所得传感信号进行参比流路、样品空白双扣减，并进行1:1模型 进行动力学拟合，得出各批次样品同TNF-α的动力学参数(ka：结合速率；kd：解离速率；kD：结合解离平衡常数)。以市售欣普尼做同样实验进行对照。结果显示，本发明中制备的抗体A制剂与TNF-α结合的亲和常数约为60pM(抗体A制剂为56.6pM～67.4pM，欣普尼为50.9pM～72.1pM)，说明本发明的抗TNF-α抗体制剂对TNF-α有很强的亲和力。
使用抗体A标准品(以下称标准品S，标准品S为110.4mg/ml蛋白含量、1.980×10
5U/mg活性的抗体A)和欣普尼利用如上相同的方法测量其亲和力，并进一步计算本发明的抗体A和市售欣普尼抗体相对于标准品S的相对亲和力。结果显示本发明的抗体A和欣普尼中的抗体与TNF-α结合的相对亲和力基本一致，如图4所示。
此外还验证了本发明制备的抗体A制剂与TNF-α的结合能力(测试方法参见王欲晓等,抗TNF-α人单链抗体的分离纯化及鉴定.免疫学杂志,2008(6):700-702)以及对TNF-α生物学活性的抑制作用(测试方法参见Trost L C等.A cytotoxicity assay for tumor necrosis factor employing a multiwell fluorescence scanner.Analytical Biochemistry,1994,220(1):149-153)。结果表明，本发明制备的抗体A制剂与TNF-α结合的EC50约为8ng/ml，对TNF-α生物学活性的抑制作用的EC50约为6ng/ml。
并进一步计算本发明的抗体A制剂相对于标准品S与TNF-α的相对结合能力和相对活性抑制能力。采用如上相同的方法测量市售欣普尼的抗体相对于标准品S与TNF-α的相对结合能力和相对活性抑制能力。结果示于图5和图6。如图5和图6所示，本发明的抗体A制剂和欣普尼与TNF-α的结合能力，以及本发明的抗体A制剂和欣普尼对TNF-α生物学活性的抑制作用均基本一致。
对本发明制备的抗体A的动物体内药效学评价在人TNF转基因自发性关节炎小鼠模型(Tg197，Biomedcode Hellas SA公司)中进行。采用的注射方式是腹腔注射，转基因小鼠分为5组，每组8只小鼠，分别注射1mg/kg欣普尼(G1)、生理盐水(G2)、1mg/kg抗体A(G3)、5mg/kg抗体A(G4)和5mg/kg欣普尼(G5)。从第三周开始注射，每周注射两次，到第十周为止。另增加一对照组转基因小鼠(4只)，该组在第一次用药前处死，表示初始组织病理学状态。所有实验组动物在第十周都处死，收集踝关节，踝关节用于病理学评估。体内关节炎病变程度采用的评分系统以及踝关节组织病理学评估采用的病理学评分系统如下所示。
体内关节炎病变程度评分系统：
踝关节组织病理学评估系统：
实验结果如图7A、图7B所示，表明本发明的抗体A在1mg/kg和5mg/kg的剂量范围内，均能抑制小鼠的关节炎发病，表明本发明的抗体A在tg197关节炎模型上有治疗效果。
实施例11：本发明的抗体A与市售欣普尼的抗体的分子量和糖基化比较
采用高分辨质谱仪(Waters，Xevo G2-S QTof)，按生产商推荐的方法对本发明的抗体A与欣普尼的完整分子量和脱糖分子量进行了检测。
对本发明的抗体A与欣普尼的抗体进行脱糖处理。用50mM NH
4HCO
3(pH8.0)稀释抗体至约1mg/ml，加N-糖苷酶PNGaseF(Sigma公司，货号P7367-50UN)，37℃反应约20小时。然后对脱糖后的本发明的抗体A与欣普尼抗体进行分子量检测。结果如图8A和图8B所示。
由图8A所示的本发明的抗体A(即图中的抗TNF-α抗体)与欣普尼抗体的完整分子量对比结果表明，与本发明的抗体A不同的是，欣普尼在分子量150178Da处以及更大的几个分子量处存在几个峰，而在脱糖处理之后这几个峰消失(图8B)。可以得出，本发明的抗体A与欣普尼抗体的分子量差异来源于其NGNA糖基化水平的差异。本发明的抗体A与欣普尼的抗体相比NGNA糖基化水平更低，导致二者的分子量存在差异。
检测抗体A与欣普尼中NGNA的含量(Spichtig V,Michaud J,Austin S.Determination of sialic acids in milks and milk-based products[J].Analytical Biochemistry,2010,405(1):28-40.)， 测三批样品取均值，结果如表9所示，单位为mol/mol抗体，即每摩尔抗体中NGNA的摩尔量。
表9抗体A与欣普尼中NGNA的含量
| 样品1 | 样品2 | 样品3 | 均值 | |
| 抗体A | 0.0043 | 0.0043 | 0.0039 | 0.0042 |
| 欣普尼 | 0.29 | 0.35 | 0.29 | 0.31 |
对于本发明的抗体A以及欣普尼抗体的氨基酸序列而言，糖基化修饰主要产生NGNA(N-羟乙酰神经氨酸)，TNF-α的NGNA糖基化修饰会使抗体在进入人体后对人体造成免疫原性，产生不良反应。本发明的抗体A与欣普尼抗体相比NGNA糖基化修饰水平更低，因此因NGNA导致人体不良反应的风险更低。
实施例12：本发明的抗体A与市售TNF-α欣普尼的抗体的Fc端活性比较
抗体的Fc端与细胞表面多种受体的结合活性可以影响抗体的多种属性，比如抗体的Fc端与细胞表面FcRn的结合可以影响抗体在人体内的半衰期，抗体的Fc端与细胞表面FcγRIIIa的结合可以影响抗体的ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)。
本实验验证了本发明的抗体A和欣普尼的抗体与FcRn的亲和力。具体实验方法如下：将FcRn-生物素(ACRO Biosystems，Cat#FCM-H82W4)用PBS稀释至1μg/ml。取SA Biosensor(Fertebio，Cat#18-5019)在FcRn-生物素溶液中固化受体蛋白至信号约为1.2nm。本发明的抗体A和欣普尼的抗体用PBS稀释至200nM，之后做2倍梯度稀释，直至3.125nM。将PBS、药物稀释液、1M MgCl
2(pH 8.3)溶液、PBST依次加入96孔板相应列中，用固化有FcRn的SA Biosensor在Octet Platform仪器(Fertebio，Octet QKe)运行如下步骤：基线：PBS中检测基线60s；缔合：在药物稀释液(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM)及样品空白(PBS)中，结合60s；解离：在PBS中解离60s；再生：在1M MgCl
2(pH 8.3)溶液中再生5s；中和：在PBST中中和5s。其中再生、中和循环进行3次。用Data Analysis 8.2(Fertebio)对数据进行处理分析，样品数据经样品空白(PBS)信号扣减后进行拟合，得到亲和常数KD。结果显示，本发明中制备的抗体A与FcRn结合的亲和常数约为7nM(抗体A为6.35nM～7.63nM，欣普尼为6.09nM～8.67nM)。
并计算本发明的抗体A相对于标准品S与FcRn结合的相对亲和力。使用欣普尼进行如上实验，并计算欣普尼的抗体相对于标准品S与FcRn结合的相对亲和力。本发明的抗体A和欣普尼的抗体与FcRn结合的相对亲和力基本一致，结果见图9。
此外，还验证了本发明的抗体A和欣普尼的抗体与FcγRIIIa的亲和力。FcγRIIIa有FcγRIIIa(F158)和FcγRIIIa(V158)两种形式，均进行了实验检测。
与FcγRIIIa(F158)结合的具体实验方法如下：将FcγRIIIa(F158)-生物素(ACRO Biosystems，Cat#CDA-H82E8)稀释至1μg/ml。将SA Biosensor(Fertebio，Cat#18-5019) 在FcγRIIIa(F158)-生物素稀释液中固化至信号约为0.6nm。本发明的抗体A和欣普尼用PBS稀释至500nM，之后做2倍梯度稀释，直至7.812nM。将PBS、药物稀释液、1M MgCl
2(pH 8.3)溶液、PBST依次加入96孔板相应列中，在Octet Platform仪器(Fertebio，Octet QKe)运行如下步骤：基线：在PBS中检测基线60s；缔合：在药物梯度稀释液(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.62nM、7.812nM)及样品空白(PBS)中，结合60s；解离：在PBS中解离60s；再生：在1M MgCl
2(pH 8.3)溶液中再生5s；中和：在PBST中中和5s。再生、中和循环进行3次。用Data Analysis 8.2对数据进行处理分析，样品数据经样品空白(PBS)信号扣减后进行拟合，得到亲和常数KD。结果显示，本发明中制备的抗体A与FcγRIIIa(F158)结合的亲和常数约为100nM(抗体A为110nM～116nM，欣普尼为93nM～111nM)。
并计算本发明的抗体A相对于标准品S与FcγRIIIa(F158)的相对亲和力。使用欣普尼进行如上实验，并计算欣普尼的抗体相对于标准品S与FcγRIIIa(F158)的相对亲和力本发明的抗体A和欣普尼的抗体与FcγRIIIa(F158)结合的相对亲和力基本一致，结果见图10。
与FcγRIIIa(V158)结合的具体实验方法如下：将FcγR IIIa(V158)-生物素(ACRO Biosystems，Cat#CDA-H82E9)稀释至1μg/ml。将SA Biosensor(Fertebio，Cat#18-5019)在FcγR IIIa(V158)-Biotin稀释液中固化至信号约为0.6nm。本发明的抗体A和欣普尼用PBS稀释至500nM，之后做2倍梯度稀释，直至7.812nM。将PBS、药物稀释液、1M MgCl
2(pH 8.4)、PBST依次加入96孔板相应列中，在Octet Platform仪器(Fertebio，Octet QKe)运行如下步骤：基线：在PBS中检测基线60s；缔合：在药物梯度稀释液(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.62nM、7.812nM)及样品空白(PBS)中，结合60s；缔合：在PBS中解离60s；再生：在1M MgCl
2(pH 8.4)中再生5s；中和：在PBST中中和5s。再生、中和循环进行3次。用Data Analysis 8.2对数据进行处理分析，样品数据经样品空白(PBS)信号扣减后进行拟合，得到亲和常数KD。结果显示，本发明中制备的抗体A与FcγRIIIa(V158)结合的亲和常数约为30nM(抗体A为29.2nM～40.8nM，欣普尼为20.1nM～42.2nM)。
并计算本发明的抗体A相对于标准品S与FcγRIIIa(V158)的相对亲和力。使用欣普尼进行如上实验，并计算欣普尼的抗体相对于标准品S与FcγRIIIa(V158)的相对亲和力本发明的抗体A和欣普尼与FcγRIIIa(V158)结合的相对亲和力基本一致，结果见图11。
实施例13：本发明的抗体A与市售抗TNF-α抗体欣普尼的药代动力学比较
本实施例的目的是研究本发明的抗体A的药代动力学，并为未来临床合理用药提供参考依据。同时进行本发明的抗体A与市售抗TNF-α抗体欣普尼的药代动力学比较。
研究方案如下：
共6组食蟹猴(购自永福县新桂野生动物养殖有限公司，3～4.5岁)：本发明抗体A低剂量组、本发明抗体A高剂量组、欣普尼(欧洲，购自Janssen Biologics B.V.)低剂量组、欣普尼(欧洲)高剂量组、欣普尼(美国，购自Janssen Biologics B.V.)低剂量组、欣普尼 (美国)高剂量组，每组6只动物，雌雄各半，低剂量组均为3mg/kg，高剂量组均为10mg/kg。给药方式采用皮下注射，给药后1h、6h、24h、48h，3d、4d、5d、7d、9d采集全血，分离血浆，分析各样本中药物的浓度。
血浆样品中抗体含量的测定方法：首先用可与抗TNF-α抗体段发生特异性结合的TNF-α蛋白(购自北京义翘神州科技有限公司，货号10602-HNAE)包被酶标板，以捕获生物样品中的抗体，再加入酶标山羊抗人抗体(IgG-HRP，购自SIGMA，货号A 7164)，在室温孵育约1小时，使酶标山羊抗人抗体与捕获的抗TNF-α抗体结合，最后加入显色液(购自BD生物科学公司，货号555214)，在室温下放置15分钟显色，2mol/L硫酸溶液终止反应后，使用Spectramax M4(Molecular Devices)在450nm读取各孔的OD值。将本发明的抗体A标准品S的吸光度和标准样品的浓度经四参数拟合得标准曲线，用所获得的标准曲线对同一块酶标板上测定的待测样品的抗体浓度进行定量。用WinNonLin6.4非房室模型(NCA)计算药物的药代动力学参数，并做血浆药物平均浓度-时间曲线，结果如图12所示。
结果显示，在3mg/kg-10mg/kg剂量下，本发明的抗体A和欣普尼在食蟹猴体内的药代动力学特征相似。
实施例14：本发明的抗体A制剂稳定性考察
进一步考察了如实施例6制备的抗体A制剂在5℃±3℃下的长期稳定性。将如上制备的抗体A制剂置于5℃±3℃条件下避光保存24个月，分别于0月、3月、6月、9月、12月、18月、24月检测抗体A的稳定性，结果如表10所示。
从表10结果看出，抗TNF-α抗体在5±3℃，避光条件下保存24个月，SEC、IEC、CE等质量属性只发生小幅波动，具有良好的稳定性，表明抗TNF-α抗体在本发明的抗TNF-α抗体制剂中，可保持至少24个月稳定。
表10抗体A制剂5℃±3℃下的长期稳定性结果
| 质量属性 | 0月 | 3月 | 6月 | 9月 | 12月 | 18月 | 24月 |
| pH值 | 5.4 | 5.6 | 5.5 | 5.5 | 5.4 | 5.5 | 5.5 |
| SEC-HPLC单体含量(％) | 99.8 | 99.5 | 99.4 | 99.4 | 99.4 | 99.3 | 99.3 |
| SEC-HPLC聚体含量(％) | 0.2 | 0.4 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.6 | 0.6 |
| IEC-HPLC酸峰含量(％) | 23.8 | 23.9 | 21.9 | 19.3 | 18.6 | 18.4 | 19.5 |
| IEC-HPLC主峰含量(％) | 53.8 | 55.1 | 56.8 | 56.9 | 56.2 | 57.1 | 54.4 |
| IEC-HPLC碱峰含量(％) | 22.4 | 21.0 | 21.3 | 23.8 | 25.2 | 24.5 | 26.1 |
| 非还原CE-SDS单体含量(％) | 98.3 | 97.7 | 98.3 | 98.3 | 98.1 | 98.2 | 97.8 |
| 蛋白质含量(mg/ml) | 103.5 | 102.0 | 99.3 | 100.3 | 99.3 | 98.4 | 99.3 |
| 相对生物学活性(％) | 100 | 98 | 101 | 99 | 94 | 93 | 101 |
| 相对结合活性(％) | 99 | 104 | 101 | 102 | 105 | 103 | 92 |
Claims (15)
- 一种抗TNF-α的抗体制剂，其特征在于，所述制剂包含抗TNF-α抗体和药学上可接受的载体，所述抗TNF-α抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链，所述药学上可接受的载体包含稳定剂、表面活性剂、缓冲剂，所述稳定剂为糖、盐酸精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或其组合。
- 如权利要求1所述的抗体制剂，所述抗体制剂的pH为4.5-6.5。
- 如权利要求1或2所述的抗体制剂，其中所述抗TNF-α抗体的浓度为5-130mg/ml。
- 如权利要求1-3中任一项所述的抗体制剂，所述稳定剂的浓度为160-265mM。
- 如权利要求1-4中任一项所述的抗体制剂，所述表面活性剂为聚山梨酯。
- 如权利要求1-5中任一项所述的抗体制剂，所述表面活性剂的浓度为0.05-0.5mg/ml。
- 如权利要求1或2所述抗体制剂，所述缓冲剂为组氨酸缓冲剂、谷氨酸缓冲剂、醋酸钠缓冲剂、琥珀酸缓冲剂和枸橼酸缓冲剂中的一种或多种。
- 如权利要求1-7中任一项所述的抗体制剂，所述缓冲剂的浓度为5-30mM。
- 一种抗体制剂，所述抗体制剂包含：5-130mg/ml抗TNF-α抗体，160-265mM稳定剂，5-30mM缓冲剂，以及0.05-0.5mg/ml表面活性剂，pH为5.0-6.0。
- 一种抗体制剂，所述抗体制剂包含：100mg/ml抗TNF-α抗体，225mM海藻糖，10mM组氨酸缓冲剂，以及0.2mg/ml聚山梨酯80，pH为5.5。
- 一种用于制备如权利要求1-10中任一项所述的抗体制剂的方法，包括:称量稳定剂、表面活性剂和缓冲剂；将称好的各成分分散在注射用液体溶剂中，从而制备得到溶剂体系；将所述溶剂体系与所述抗TNF-α抗体混合。
- 一种抗TNF-α的抗体药物制品，包含根据权利要求1-10任一项所述的抗TNF-α的抗体制剂，优选地所述抗体药物制品还包括预灌封容器。
- 如权利要求1-10中任一项所述的抗体制剂，或权利要求12所述的抗体药物制品，在制备用于治疗TNF-α相关疾病的药物中的用途。
- 一种生产抗TNF-α抗体的方法，所述抗TNF-α抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述方法包含培养含编码所述抗TNF-α抗体的核酸或载体的CHO细胞，使所述CHO细胞表达所述抗TNF-α抗体。
- 一种抗TNF-α抗体，所述抗TNF-α抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述抗TNF-α抗体的Neu5Gc唾液酸(NGNA)水平与抗TNF-α抗体的摩尔比不超过0.1。
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