WO2021149964A1 - 아데노바이러스 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 E2B 영역 중 특정 부분 염기가 결실됨으로써, 외래 유전자 탑재 용량이 커서 크기가 큰 외래 유전자도 담지할 수 있고, 복제 가능 아데노바이러스 생성 확률이 낮으며, 유전적 안정성이 우수한 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다.

Description

아데노바이러스 벡터

본 발명은 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다.

인간 아데노바이러스는 60 ~ 90 nM 크기의 외막이 없는 20면체 입자이다. 지금까지 60개 이상의 혈청형이 동정되었고 이들은 혈구응집 특성 및 서열 상동관계를 기준으로 7개의 서브그룹(A,B,C,D,E,F 및 G)으로 세분된다. 유전체 (게놈)은 34 ~ 36kb의 길이를 가지며 역방향 말단반복서열(ITR)에 의해 양쪽 부위에서 측화된다. 바이러스 감염 사이클은 초기 및 후기로 나누어지며, 각 시기에 따라 특정 유전자가 발현되어 사이클이 진행된다.

상기 초기 유전자 영역과 관련하여, 이들 중 일부 영역을 결실시킨 아데노바이러스 벡터에 대해 알려져 있다. 아데노바이러스 벡터는 다양한 세포로의 유전자 전달 효율이 높고, 많은 임상 경험이 있으며, 생산이 용이하기 때문에 유전자 전달체로 많이 사용된다. 그 종류로는 바이러스 유전자 중 E1과 E3를 제거한 1세대 아데노바이러스, E1과 E3외에 추가로 E2A나 E2B 유전자를 제거한 2세대 아데노바이러스, 그리고 ITR만 남기고 최대한의 바이러스 유전자를 제거한 helper-dependent 아데노바이러스 벡터 등이 있다.

유전자 치료제의 효능을 증가시키기 위해 전달체에 여러 가지 유전자를 동시에 탑재하는 경우나 혹은 프로모터의 발현 세기를 증가시키거나 항원으로 사용하기 위해서 DNA의 비코딩 부위를 전달체에 탑재하는 경우, 벡터의 DNA 탑재 한계가 부족하면 원하는 DNA 부분을 넣지 못할 수 있다. 유전자 전달체에 최대 어느 정도 크기의 유전자를 탑재할 수 있는지는 바이러스의 고유 특성인 유전체의 크기 및 해당 전달체를 제작할 때 얼마나 많은 바이러스의 유전자를 제거하였는지에 의해서 결정된다. 2세대 아데노바이러스 벡터의 경우 E2B 유전자를 더 많이 제거하여 일반적인 E1/E3 제거 벡터보다 외래 유전자 탑재 용량이 더 큰 벡터를 제작할 수 있다. 그러나 E2B 유전자에서 이론적으로는 별다른 기능을 하지 않는 부분의 DNA를 무조건 제거한다고 해서 온전한 아데노바이러스 벡터를 얻을 수 있는 것은 아니며, 유전적으로 불안정하여 아데노바이러스가 만들어지지 않거나 생산성이 떨어지는 등의 문제가 발생할 수 있다.

본 발명은 외래 유전자 탑재 용량이 크며 복제 가능 아데노바이러스 (Replication-Competent Adenovirus)가 생성될 위험이 낮은 아데노바이러스 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 유전적 안정성이 우수하며 외래 유전자 탑재 용량이 증가된 아데노바이러스 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 서열번호 1의 E2B 영역 서열 중 7275 내지 7881번 및 8583 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 아데노바이러스 벡터.

2. 상기 1에 있어서, 상기 결실로 DNA 폴리머라아제 유전자(DNA polymerase gene, pol) 및 프리터미널 단백질 유전자(preterminal protein gene, pTP)가 불활성화된, 아데노바이러스 벡터.

3. 상기 1에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1의 서열에서 7274 내지 7881번 및 8583 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 아데노바이러스 벡터.

4. 상기 1에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1의 서열에서 7275 내지 9632번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된, 아데노바이러스 벡터.

5. 상기 1에 있어서, 상기 결실 부위의 적어도 일부에 외래 유전자가 도입된, 아데노바이러스 벡터.

6. 상기 1 내지 5 중 어느 하나의 아데노바이러스 벡터를 패키징 세포주에 감염시키는 단계를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 제조 방법.

7. 상기 6에 있어서, 상기 패키징 세포주는 HEK-293 (Human embryonic kidney 293), HEK-293 유래의 세포, 911, PER.C6, A549 (carcinomic human alveolar basal epithelial cell), HER (Human Embryonic Retinoblast), HEL 299 (Human lung fibroblast), HeLa (Human cervical cancer cell), CHO (Chinese hamster ovary cell), BHK (Baby hamster kidney cell), 3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell), WS1 (Human dermal fibroblast), MRC5 (Human Lung Fibroblast), WI38 (Human lung fibroblast cell), AE1-2a (Human lung adenocarcinoma), PC12 (Rat Pheochromocytoma cell), Primary human amniocytes, 아프리카 녹색원숭이 신장세포, 및 코커스패니얼 신장세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 아데노바이러스 벡터의 제조 방법.

8. 상기 7에 있어서, 상기 패키징 세포주는 DNA 폴리머라아제 유전자(DNA polymerase gene, pol) 및 프리터미널 단백질 유전자(preterminal protein gene, pTP)를 발현하는 것인, 제조 방법.

9. 상기 1 내지 5 중 어느 하나의 아데노바이러스 벡터로 형질전환된 세포.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 종래에 비해 유전자 탑재 공간이 증가되어, 크기가 큰 외래 유전자도 담지할 수 있다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 유전적 안정성이 우수하다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 생산 시 복제 가능 아데노바이러스가 발생할 가능성이 매우 낮다.

도 1은 제조예 1~5의 E2B 구조를 가지며 외래 유전자 (transgene)를 탑재하지 않은 아데노바이러스 플라스미드 DNA의 제한효소 맵핑 결과이다.

도 2는 제조예 1~5의 E2B 구조를 가지며 외래 유전자를 탑재한 아데노바이러스 플라스미드 DNA의 제한효소 맵핑 결과이다.

도 3 및 도 4는 아데노바이러스 벡터를 패키징 세포주 (293세포 및 E2B 유전자를 발현하는 293세포)에 감염시킨 후 아데노바이러스 후기 단백질의 발현 양상을 분석한 결과이다.

도 5은 외래 유전자를 탑재하지 않은 각 벡터에서 추출한 DNA의 E2B 영역의 PCR 결과이다.

도 6는 제조예 2의 E2B 구조를 가지면서 외래 유전자가 탑재되지 않은 아데노바이러스 벡터를 1회 계대 배양한 후 DNA를 얻어 E2B 영역을 PCR 분석한 결과이다.

도 7는 외래 유전자(HER2)가 탑재된 각 벡터에서 DNA를 얻어 E2B 영역을 PCR 분석한 결과이다.

도 8은 제조예 1의 E2B 구조를 가지면서 외래 유전자가 탑재된 벡터 분석 시 관찰되었던 E2B 영역의 PCR 산물의 시퀀싱 결과이다.

도 9은 제조예 1의 E2B 구조를 가지면서 외래 유전자가 탑재된 벡터에서 DNA를 얻어 제한효소 맵핑한 결과이다.

도 10은 제조예 3~5의 E2B 구조를 가지면서 외래 유전자가 탑재된 벡터에서 DNA를 얻어 제한효소 맵핑한 결과이다.

도 11는 제조예 3~5의 E2B 구조를 가지면서 외래 유전자를 탑재된 벡터의 정제 후 밴드 사진이다.

도 12는 제조예 3~5의 E2B 구조를 가지면서 외래 유전자를 탑재된 정제 아데노바이러스 벡터에서 DNA를 얻어 E2B 영역 및 외래 유전자 영역을 PCR 분석한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 아데노바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터라고도 하며, 일반적으로 자연계에 존재하는 바이러스에서 유래하였지만 목적에 따라 일부 유전자가 제거된 아데노바이러스를 의미한다. 아데노바이러스 벡터의 경우 일반적으로 바이러스가 특정한 경우에만 복제되도록 하기 위해서 복제에 필수적인 E1 유전자가 제거되어 있으며, 그 외 추가적인 바이러스의 유전자 부분이 제거될 수 있다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1의 서열에서 7275 내지 7881번 및 8583 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것이다.

서열번호 1의 서열은 Human adenovirus 5 complete genome(NCBI Reference Sequence: AY339865, 35934bp)이고, 그 중 상기 염기들은 E2B 영역(pTP 유전자의 서열 및 Pol 유전자의 서열이 포함된 부분)의 일부에 해당하는 것이고, 구체적으로, 7275 내지 7881번 염기는 E2B 영역 중 DNA 폴리머라아제 유전자(DNA polymerase gene, pol, 서열번호 2)의 일부, 8583 내지 9630번 염기는 프리터미널 단백질 유전자(preterminal protein gene, pTP, 서열번호 3)의 일부이다. 해당 유전자는 바이러스의 DNA가 복제되는데 필수적인 역할을 하며, 상기 염기들이 결실됨으로써 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 E2B 유전자의 기능이 불활성화되어 바이러스의 DNA를 복제하는 능력을 상실하게 된다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 상기 특정 부위가 결실됨으로써, E2B의 기능은 완전히 차단되어 RCA의 생성 가능성이 낮으면서, 유전적 안정성이 우수하며, 결실된 부위가 굉장히 크므로, 벡터에 크기가 큰 유전자, 여러 종의 유전자를 담거나 또는 목적에 따라 단백질을 암호화하지 않는 DNA를 담는 등 보다 제한없이 다양한 목적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1의 서열에서 7275 내지 7881번 및 8583 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것이고, 보다 우수한 생산성 및 탑재 용량을 증가시킨다는 측면에서 바람직하게는 서열번호 1의 서열에서 7275 내지 9632번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것일 수 있다.

상기 대응되는 위치는 서열을 정렬(alignment)하였을 때의 대응되는 위치를 의미하는 것일 수 있다. 서열번호 1의 서열 외에도 다른 서열을 갖는 아데노바이러스 혹은 아데노바이러스 벡터의 DNA가 존재할 수 있는데, 다른 서열의 아데노바이러스 서열을 서열번호 1의 서열과 정렬하는 경우에 서열번호 1의 서열과 대응되는 위치를 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1의 서열에서 상기 위치의 염기가 결실된 것뿐만 아니라, 다른 서열의 아데노바이러스 벡터에서 서열번호 1의 상기 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것일 수 있다.

또한, 상기 대응되는 위치는 서열을 정렬하지 않고도, 주변 서열의 유사도를 기준으로 확인될 수도 있다. 예를 들어, AC_000008(서열번호 34), AY601635(서열번호 35), KX868466(서열번호 36)의 아데노바이러스 DNA 서열은 서열번호 1을 기준으로 상기 유전자 결실 부분의 양쪽의 30bp의 서열과 90% 이상 일치하는 부분을 찾을 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 1의 7275 내지 9632번 염기가 결실된 부분의 양쪽에는 (7245-7274) 및 (9633-9662) 부분에 해당하는 염기가 있다. 이 염기와 90% 이상 일치하는 서열은 KX868466 서열의 (7236-7265) 및 (9621-9650)에서 찾을 수 있다. 이를 바탕으로 KX868466 서열의 (7266-9620)을 결실시킴으로써 서열번호 1의 서열에서 7275 내지 9632번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 아데노바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 그 외 AC_000008 또는 AY601635 서열 등에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 서열번호 1의 서열에서 7275 내지 9632번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 아데노바이러스 벡터를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1의 서열에서 7274 내지 7881번 및 8583 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것이거나, 7274 내지 9632번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것이거나, 7274 내지 7881번 및 8583 내지 9632번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것이거나, 7275 내지 7881번 및 8583 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것이거나, 7275 내지 7881번 및 8583 내지 9632번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것이거나, 7274 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 것일 수 있다.

아데노바이러스의 DNA를 조작하여 벡터로 만들 때에는 유전자 조작을 쉽게 하기 위하여 바이러스의 DNA가 포함된 플라스미드를 사용한다. 예를 들어, 바이러스의 E2B 영역의 특정 부분이 제거된 벡터를 제작하고자 하는 경우, 유전자 재조합 기술을 이용해서 바이러스 DNA가 포함된 플라스미드 DNA 상에서 해당 부분을 제거한다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 실시예에서 사용한 Agilent사의 pAdEasy-1 플라스미드를 이용해서 제작되었는데, 다른 kit에 포함된 아데노바이러스 플라스미드를 기반으로 해서도 제작할 수 있다. 예를 들어, cosmid 방식을 이용한 Adenovirus Expression Vector Kit (Takara)나 AdenoZAP Kit (OD 260), ViraPower Adenoviral Gateway Expression Kit (Thermo) 등에 포함된 아데노바이러스의 플라스미드 DNA를 이용해서도 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 제작할 수 있다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 E2B 유전자의 기능이 완전히 차단되어 RCA의 생성 가능성이 낮다. 일반적인 아데노바이러스 벡터의 경우 다른 바이러스 유전자가 발현되는데 필수적인 역할을 하는 E1 유전자가 제거되어 있으므로 세포에 감염했을 때 바이러스의 복제가 일어나지 않는다. 하지만, 생산 시 유전자 재조합의 결과로 벡터의 유전체에 E1 유전자가 탑재된 복제 가능 아데노바이러스 (RCA)가 일부 생성되는 것이 알려져 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 벡터 유전체에 E1이 탑재되는 경우에도 E2B 유전자가 없으므로 체내에서 복제가 일어나지 않는다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 유전체에 E1 외에 pTP와 Pol 유전자가 모두 탑재되면 이론상 체내에서 복제가 가능할 수 있으나, 이러한 벡터가 생기기 위해서는 여러 번의 유전자 재조합을 거쳐야 하므로 실제 이러한 벡터가 생성될 가능성은 매우 낮다.

또한, 일반적인 E1 제거 아데노바이러스 벡터는 벡터가 감염된 일부 세포에서 E1 유전자가 없음에도 불구하고 바이러스의 DNA 복제가 일어나고 그 결과 다른 바이러스 유전자가 발현되는 leaky gene expression이라는 현상이 발생하는 것이 알려져 있다. 하지만 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 DNA 복제에 직접 관여하는 유전자가 불활성화 되어 있으므로 leaky gene expression이 발생하지 않는다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 상기와 같이 굉장히 많은 염기가 결실되어 보다 큰 외래 유전자를 담지할 수 있으며, 결실 부위의 유전적 안정성이 우수하다. 벡터의 유전적 안정성은 벡터에서 얻은 DNA가 플라스미드 DNA와 동일한 구조를 가지고 있는지를 평가해서 알 수 있다. 주로 바이러스 DNA 중 변형한 부분을 PCR로 증폭하여 PCR 산물의 크기 및 서열을 확인하고, 제한 효소로 처리한 후 예상 결과와 비교하여 바이러스 DNA의 전체적인 구조를 확인한다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 상기 외에 E1 영역, E3 영역 또는 E4 영역 중 적어도 일부가 더 결실된 것일 수 있다. 결실 영역 및 길이는 상기 영역의 유전자의 기능이 상실되면서 생산성, 유전적 안정성 등에 문제가 없도록 적절히 선택될 수 있다. 혹은 해당 영역이 포함된 것 일수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 E2B 제거 방법은 E1, E3, E4 영역이 제거되지 않은 벡터에 적용될 수도 있다. 포함된 영역에 따라 해당 벡터는 다양한 특성을 가질 수 있으며, 공통적으로 E2B 영역이 제거되어 있으므로 패키징 세포주 이외의 세포에서는 복제가 불가능한 특성을 가지게 된다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 유전자 발현을 위한 프로모터를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 상기 "프로모터"는 적당한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 다른 DNA 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 본 명세서에서 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 DNA 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. DNA 구조체 또는 벡터 내에서 프로모터의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T5 프로모터, T7 프로모터, PBAD 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 아데노바이러스 플라스미드에 포함되는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터 제작에 사용된 플라스미드 DNA는 항생제 저항성 영역, 또는 복제원점을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 상기 염기 결실 부위에 외래 유전자가 도입된 것일 수 있다.

본 명세서에서 "외래 유전자"는 본 발명의 아데노바이러스와는 다른 기원의 유전자, 본 발명의 아데노바이러스에 대해 이질적인 유전자, 적절한 숙주에 도입하는 경우 숙주에 이질적인 유전자를 모두 포함할 수 있다.

상기 외래 유전자는, 예를 들어 단백질을 코드하는 DNA, 안티센스 RNA 를 코드하는 DNA, 리보자임을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다. 이와 같은 외래유전자의 기원은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 세균류, 효모류, 방사균류, 사상균류, 자낭균류, 담자균류 등의 미생물; 식물; 곤충; 동물 등을 들 수 있고, 또한 목적에 따라 인공적으로 합성한 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 유전자의 발현을 조절하거나 항원으로 사용할 목적으로 단백질을 코드하지 않는 DNA의 부분이 포함될 수도 있다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터는 벡터의 복제가 가능한 패키징 세포주를 이용하여 생산 할 수 있다.

패키징 세포주로는 당 분야에 공지된 HEK-293 (Human embryonic kidney 293), HEK-293 유래의 세포, 911, PER.C6 ^TM, A549 (carcinomic human alveolar basal epithelial cell), HER (Human Embryonic Retinoblast), HEL 299 (Human lung fibroblast), HeLa (Human cervical cancer cell), CHO (Chinese hamster ovary cell), BHK (Baby hamster kidney cell), 3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell), WS1 (Human dermal fibroblast), MRC5 (Human Lung Fibroblast), WI38 (Human lung fibroblast cell), AE1-2a (Human lung adenocarcinoma), PC12 (Rat Pheochromocytoma cell), Primary human amniocytes, 아프리카 녹색원숭이 신장세포, 또는 코커스패니얼 신장세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 HEK-293 유래의 세포는 GP2-293, 293 T 세포 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

패키징 세포주는 아데노바이러스 벡터에서 결실된 영역의 유전자를 발현하도록 변이된 것일 수 있다.

상기 유전자를 세포에 형질도입 시키는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 상기 유전자를 발현하도록 세포를 형질전환 시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 아데노바이러스 벡터의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 전술한 아데노바이러스 벡터의 DNA를 포함하는 플라스미드 DNA를 PacI 등의 제한효소로 잘라서 ITR(Inverted Terminal Repeat) 부분이 노출된 선형 (linear)의 바이러스 DNA를 얻은 후 패키징 세포주에 이를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 제한효소 처리된 DNA를 도입하는 방법으로는 앞서 예시한 방법을 사용할 수 있다. 이 과정을 레스큐(rescue) 라고 하며, 도입된 선형의 바이러스 DNA로부터 바이러스 벡터가 생산될 수 있다. 한번 생산된 바이러스 벡터는 패키징 세포주에서 자가 복제가 가능하므로 세포 배양을 지속하면 점차 그 양이 많아진다.

패키징 세포주로는 앞서 예시한 것을 사용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 아데노바이러스 벡터는 DNA 폴리머라아제 유전자(DNA polymerase gene, pol, 서열번호 2), 프리터미널 단백질 유전자(preterminal protein gene, pTP, 서열번호 3)의 기능이 상실되어 불활성화된 것으로서, 상기 벡터는 상기 2개 유전자를 발현하는 패키징 세포주에 감염하여 복제될 수 있다.

아데노바이러스 벡터가 상기 외에 E1 영역, E3 영역 또는 E4 영역 중 적어도 일부가 더 결실된 경우, 패키징 세포주는 해당 영역의 유전자를 더 발현하는 것일 수 있다.

상기 패키징 세포주는 내재적으로 또는 외래 유전자 도입으로 상기 유전자들을 발현하는 것일 수 있다.

상기 유전자들을 발현하는 패키징 세포주에 상기 아데노바이러스 벡터의 정보가 담긴 DNA가 도입되면, 패키징 세포주가 아데노바이러스 벡터를 생산할 수 있다.

도입 방법으로는 앞서 예시한 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

나아가, 본 발명은 전술한 제조 방법으로부터 생산된 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다.

전술한 아데노바이러스 벡터를 코딩하는 DNA를 패키징 세포주에 도입하면 패키징 세포주가 아데노바이러스 벡터를 생산하고, 이를 분리하여 얻을 수 있다.

전술한 아데노바이러스 벡터는 복제불능 바이러스로서, 구조 이상 없이 아데노바이러스 유래 구조(특히, E2B 부분)를 플라스미드 DNA 상에서 제작한 것과 동일한 구조로 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 아데노바이러스 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.

아데노바이러스 벡터는 전술한 결실된 영역에 외래 유전자가 도입된 것일 수 있고, 아데노바이러스는 이를 패키징 세포에 형질전환시켜 제조되는 것으로서, 그 외래 유전자를 가질 수 있다. 따라서, 상기 아데노바이러스로 형질전환된 세포는 그 외래 유전자를 발현할 수 있다.

그 숙주가 되는 세포는 형질전환 시키고자 하는 모든 종류의 세포가 제한없이 적용될 수 있다.

형질전환은 당 분야에 공지된 방법으로 수행된 것일 수 있으며, 앞서 예시한 도입 방법에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

1. 아데노바이러스 플라스미드의 제조

(1) 제조예 1

본 특허의 아데노바이러스 벡터 제작에 사용된 모든 아데노바이러스 플라스미드는 상용 아데노바이러스 플라스미드 제작 시스템인 AdEasy ^TM XL Adenoviral vector system (Agilent, Cat#240010)를 이용하였다. 이 system은 E1이 제거된 아데노바이러스 유전체가 포함된 pAdEasy-1이라는 플라스미드 (서열번호 37)와 E1 부분에 삽입될 수 있는 pShuttle이라는 플라스미드 (서열번호 38) 및 E1 부분에 삽입되면서 외부 유전자를 발현할 수 있는 프로모터를 탑재한 pShuttle-CMV라는 플라스미드 (서열번호 39)로 구성되어 있다. 본 특허에서는 pShuttle 플라스미드에 일부가 잘린 E2B의 서열을 탑재한 후, pAdEasy-1과 변형된 shuttle 플라스미드 간의 상동 재조합을 유도해서 pAdEasy-1을 기반으로 E2B 부분이 제거된 플라스미드를 만들었다. 추후 아데노바이러스 벡터 제작 시 세포에 도입되는 플라스미드는 shuttle 플라스미드가 아닌 pAdEasy-1 기반의 플라스미드이며 이 플라스미드를 특별히 아데노바이러스 플라스미드라고 부른다. 서로 다른 제조예의 벡터 제작 시 사용된 아데노바이러스 플라스미드는 E2B 서열이 탑재된 각각의 shuttle 플라스미드로부터 제작되며 shuttle 플라스미드를 pAdEasy-1에 삽입하는 절차는 AdEasy ^TM XL system의 매뉴얼에 잘 제시되어 있으며, 간략하게 설명하면 아래와 같다.

Shuttle 플라스미드를 PmeI으로 자른 후 PmeI enzyme 활성을 완전히 없애기 위하여 열 처리를 하거나 (65℃, 20분), 혹은 PmeI으로 자른 부분이 다시 붙는 것을 방지하기 위해 CIP (Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal)를 처리하였다. 얻어진 반응액 자체 혹은 phenol/chloroform 방법으로 정제를 거친 반응액 중에서 1 μg의 DNA를 pAdEasy-1이 포함되어 있는 E.coli인 BJ5183-AD1을 heat shock 방법 (42℃, 90초)으로 형질 전환하였다. 후보 clone을 각 제조예의 구조에 적합한 효소로 절단하여 구조를 확인한 후 맞는 clone만 XL-10G로 옮겨서 증폭하고 추가 구조 확인을 하였다. 구조 확인을 위해 자주 사용되었던 제한 효소로는 PacI, BstXI 및 DraI이 있다. DNA의 최종 확보를 위해서는 NucleoBond Xtra Midi Plasmid DNA purification kit (MN, Cat# 740410.100)을 사용하였다.

제조예 1의 벡터는 pol 유전자의 (7186..7891), pTP 유전자의 (9198.. 9639) 부분이 제거된 벡터이다. 제조예들에서 제거되는 위치는 서열번호 1의 서열에서의 위치를 기준으로 기재된 것으로서, pAdEasy-1 벡터는 E1 영역이 제거된 것이므로, pAdEasy-1 벡터를 기준으로 한다면 그 위치는 E1 영역의 길이만큼 앞으로 당겨지게 된다. 예를 들어, (7186..7891), (9198..9639) 부분의 경우, pAdEasy-1 벡터 기준으로는 (7367..8072), (9379..9820) 부분이 된다.

우선, 아데노바이러스 유전체를 포함한 다른 플라스미드인 pAxCAwtit2 (Takara)를 주형으로 [5'-CCC GTA TAC AGA CTT GAG AGG CCT GTC CTC GAG C-3', 서열번호 4] 및 [5'-GCC GTT TAA ACA TCG ATA CCG TTC GGA GGC CGA CG-3', 서열번호 5]로 PCR 하였다. 서열번호 4는 바이러스 상보적인 서열 바로 앞에 클로닝을 위한 BstZ17I 제한효소 자리 (GTATAC)를 포함하고 있으며 그 바로 앞에 CCC가 붙은 형태이다. 서열번호 5는 바이러스와 상보적인 서열 바로 앞에 클로닝을 위한 ClaI 제한 효소 자리 (ATCGAT) 및 PmeI 제한 효소 자리 (GTTTAAAC)가 붙어 있으며, 그 앞에는 GCC가 추가되어 있다. 해당 PCR 산물을 pGEM®-T Easy (Promega)에 클로닝하였다. 이렇게 얻어진 PCR 증폭 산물은 서열 번호 1의 (5764-7185)에 해당하며 편의상 A region이라 한다.

그 후 pAxCAwtit2 (Takara)를 [5'-GCA TTC GAA ACT CCG CCG CCG AGG GAC CTG-3', 서열번호 6] 및 [5'-GCA CAT ATG GTT TAA ACG AAA AGC AAA AAA GGG GC-3', 서열번호 7]로 PCR하였다. 서열번호 6에는 바이러스 상보적인 서열 바로 앞에 클로닝에 사용되는 BstBI 제한효소 자리 (TTCGAA)가 있으며 그 바로 앞에 GCA가 추가로 붙어 있는 형태이다. 서열번호 7에는 바이러스 상보적인 서열 바로 앞에 클로닝에 사용되는 PmeI 제한효소 자리 (GTTTAAAC)가 있으며, 그 바로 앞에 NdeI 제한효소 자리 (CATATG)가 있고, 그 앞에 GCA가 추가로 붙어 있는 형태이다. 이렇게 얻어진 PCR 증폭 산물은 서열 번호 1의 (9646-11045)에 해당하며 편의상 B region이라 한다. 얻어진 PCR 산물은 pGEM®-T Easy에 클로닝하였다.

B region을 탑재한 플라스미드 BstBI 및 PmeI으로 잘라서 insert를 얻고, A region을 탑재한 플라스미드를 ClaI 및 PmeI으로 자른 후 둘을 클로닝하여 T-vector에 A와 B region이 모두 탑재된 플라스미드를 제작하였다. A와 B가 합쳐진 결과, 둘 사이의 (7186-9645)에 해당하는 부분이 결손된다. A와 B를 모두 포함한 플라스미드를 BstZ17I 및 PmeI으로 잘라서 A-B region을 얻고 AdEasy ^TM XL Adenoviral vector system에 포함된 pShuttle 플라스미드를 동일하게 BstXI 및 PmeI으로 자른 후 둘을 ligation하여 E2B 부분에 결손을 유발하는 shuttle 플라스미드를 제작하였다. 이 과정은 Takara 사의 In-Fusion® HD Cloning Kit을 이용하였으며, 다음의 primer를 이용해서 진행되었다: [5'- GTC CGT GTC CCC GTA TAC AGA CTT GAG AGG CCT GTC CT -3', 서열번호 8] 및 [5'-CTA TTG AAT TCG TTT AAA CGA AAA GCA AAA AAG GGG C-3', 서열번호 9].

이렇게 제작된 shuttle 플라스미드는 pAdEasy-1과 상동 재조합 시에 E2B 부분에 결손을 유도할 수 있지만, E2B 부분 외에 기능이 있는 부분인 i-Leader (서열번호 1의 7952-8391) 및 아데노바이러스 RNA의 스플라이싱에 관여하는 부분 (서열번호 1의 9640-9645)이 결손되어 있다. 이 부분을 탑재하기 위해서, 앞서 제작한 A와 B 부분을 동시에 가진 pGEM®-T Easy 를 [5'- GCG GCG GAG TAT CGA TAC CGT TCG GAG GC -3', 서열번호 10] 및 [5'- GCC TCC GAA CGG TAT CGA TAC TCC GCC GC -3', 서열번호 11]로 site-directed mutagenesis 하여 A 와 B 부분 사이에 ClaI 제한효소 자리를 삽입하였다. 그 후 AdEasy-1 플라스미드를 template로 [5'- ATG AAG GGC ACG AGC TGC TT -3', 서열번호 12] 및 [5'- ATC AAC GAA TCC ACG TTG CGA C -3', 서열번호 13]로 PCR 하여 서열 번호 1의 (7892 - 9197)에 해당하는 부분을 얻고 TOPO 플라스미드 (Doctor protein, Cat #DR02202)에 클로닝하였다. 그 후 [5'- GCA TTA ATC GAT ATG AAG GGC ACG AGC TGC TT -3', 서열번호 14] 및 [5'- GCA TTA ATC GAT ACC TAC ATC AAC GAA TCC ACG TTG CGA C -3', 서열번호 15] primer를 이용해 상기 TOPO 플라스미드를 다시 PCR 하였다. 이 primer에는 ClaI 제한효소 자리 및 (9640-9645) 위치의 GTAGGT (서열번호 16)가 추가되어 있다. 해당 PCR 산물을 ClaI으로 자른 후 앞서 site-directed mutagenesis한 pGEM®-T Easy 에 클로닝하여 A와 B 부분 사이에 i-Leader 및 아데노바이러스 RNA의 스플라이싱에 관여하는 부분을 삽입하였다. 그 후 클로닝에 사용된 ClaI 제한효소 자리를 제거하기 위해 해당 플라스미드를 [5'- gtg gat tcg ttg atg tag gta ctc cgc cgc c-3', 서열번호 17] 및 [5'- ggc ggc gga gta cct aca tca acg aat cca c-3', 서열번호 18]로 site-directed mutagenesis 하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 BstXI과 PmeI 및 XmnI으로 잘라서 insert를 얻고 AdEasy-1 system에 포함된 기본 pShuttle 플라스미드를 BstXI과 PmeI으로 절단한 후 절단된 두 물질을 각각 T4 ligase로 붙여서 클로닝하여 shuttle 플라스미드를 제작하였다.

(2) 제조예 2

제조예 2의 벡터는 제조예 1의 벡터와 유전자 제거 위치는 (7186..7891) 및 (9198..9639) 동일하다. 하지만 8299 위치의 C가 T로 바뀌어 있다. 이로 인해 E2B 에 속하는 i-Leader가 만드는 단백질에 종결 코돈이 생기게 되고 단백질의 구조가 변하게 된다.

제조예 2의 벡터 제작에 필요한 shuttle 플라스미드를 제작하기 위해서는 합성된 서열 (서열번호 19)이 포함된 플라스미드를 BstZ17I 및 PmeI으로 절단하고, AdEasy-1 system에 포함된 기본 pShuttle 플라스미드를 동일한 효소로 절단하였다. 절단된 두 물질을 각각 T4 ligase로 붙여서 클로닝하여 shuttle 플라스미드를 얻었고 해당 shuttle 플라스미드와 pAdEasy-1과의 상동 재조합을 유도하여, E2B 부분이 변형된 아데노바이러스 플라스미드를 얻었다.

(3) 제조예 3

제조예 3의 벡터는 (7274..7881) 및 (9198..9630)가 제거되어 있는 벡터이다. 제조예 3의 벡터 제작에 필요한 shuttle 플라스미드를 제작하기 위해서는 지정된 부분이 제거된 E2B 유전자 (서열번호 20)를 인위적으로 합성한 후, 이 유전자를 제조예 2의 제작 과정에 언급한 것과 동일한 방식으로 클로닝하였다. 그 후, shuttle 플라스미드와 pAdEasy-1과의 상동 재조합을 유도하여, E2B 부분이 변형된 아데노바이러스 플라스미드를 얻었다.

(4) 제조예 4

제조예 4의 벡터는 (7274..7881) 및 (8583..9630)가 제거되어 있는 벡터로 3과 비교해서 제거 부위의 맨 처음과 끝은 동일하지만 내부가 추가적으로 제거되어 있는 형태이다. 제조예 4를 제작하기 위해 사용된 shuttle 플라스미드는 서열번호 21의 서열을 합성한 후 제조예 2와 동일한 방법을 이용해서 제작하였다. 그 후, pAdEasy-1과의 상동 재조합을 유도하여, E2B 부분이 변형된 아데노바이러스 플라스미드를 얻었다.

(5) 제조예 5

제조예 5의 벡터는 (7275..9632)가 제거되어 있는 벡터로 4와 비교해서도 더 많은 부분이 제거되어 있다. 단, 제조예 5의 벡터는 제거 부위의 왼쪽 끝 부분이 7274가 아니라 7275이고 오른쪽 끝 부분이 제조예 3나 제조예 4처럼 9630이 아니라 9632이다. 이렇게 변경한 이유는 pTP 유전자에서부터 시작되는 유전자 합성의 frame이 망가지지 않아서 Pol 유전자의 합성이 이어서 진행되는 것을 막기 위함이다. 제조예 5을 제작하기 위해 사용된 shuttle 플라스미드는 서열번호 22의 서열을 합성한 후 제조예 2과 동일한 방법을 이용해서 제작하였다. 그 후, pAdEasy-1과의 상동 재조합을 유도하여, E2B 부분이 변형된 아데노바이러스 플라스미드를 얻었다.

(6) HER2가 탑재된 아데노바이러스 플라스미드의 제작

지금까지 pAdEasy-1 플라스미드를 기반으로 E2B 유전자의 일부가 제거된 새로운 아데노바이러스 플라스미드를 제작하는 방법을 서술하였다. pAdEasy-1을 포함한 대부분의 아데노바이러스 플라스미드는 E1 부분에 원하는 외부 유전자를 탑재할 수 있도록 제작되어 있다. 여기서는 AdEasyTM XL Adenoviral vector system (Agilent, Cat#240010)에 포함된 pShuttle-CMV 플라스미드를 이용해 앞서 제작된 E2B 유전자의 일부가 변형된 아데노바이러스 플라스미드의 E1 부분에 HER2 유전자를 탑재하는 방법을 서술하였다.

사람의 HER2 유전자를 얻기 위해서 유방암 세포주인 T47D (ATCC)에서 Trizol (Invitrogen) 시약을 이용해서 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 주형으로 SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에서 [Forward: 5'- CGATCG GGTACC GCCACC ATGGAGCTGGCGGCCTTGTG -3', 서열번호 23] 및 [Reverse: 5'- CGATCG AAGCTT TTACTA GATCCCAAAGACCACCCCCAAGA -3', 서열번호 24]를 이용해서 HER2 부분을 증폭하였다. 증폭된 HER2의 부분은 HER2 유전자 전체가 아니라 세포 밖에 노출된 부분 (extracellular region) 및 세포막에 박힌 부분 (transmembrane region)으로 HER2의 신호전달을 담당하는 세포 내 부분 (intracellular region)은 없는 형태이다 (HER2 ECD-TM). Forward primer에는 클로닝에 사용될 PvuI 및 KpnI 제한효소 자리 이외에 유전자 발현을 증가시킨다고 알려진 코작 서열 (Kozak sequence, GCCACC, 서열번호 25)이 있으며, reverse primer에는 클로닝에 사용될 PvuI 및 HindIII 제한효소 자리 이외에 유전자 합성 과정을 종료하기 위한 종결 코돈 (TTACTA, 서열번호 26)이 포함되어 있다. 증폭된 HER2의 ECD-TM 부분을 Kpn I 및 Hind Ⅲ 제한효소를 이용해서 중간단계 플라스미드인 pSP72 에 클로닝하여 pSP72-HER2를 제작하고, 동일한 Kpn I와 Hind Ⅲ 효소를 이용해서 pSP72-HER2에서 HER2를 분리하여 pShuttle-CMV-HER2를 제작하였다. pShuttle-CMV-HER2를 이용해서 아데노바이러스 플라스미드에 HER2를 탑재하는 과정은 AdEasy ^TM XL Adenoviral vector system의 매뉴얼을 따라서 진행하였다.

(7) 제작된 플라스미드 DNA의 구조 확인

아데노바이러스 플라스미드 DNA가 예상과 맞게 제작되었는지 확인하기 위해서 플라스미드 DNA를 BstXI 제한효소로 절단한 후 아가로오즈 젤에 전기영동하여 확인하였다. 도 1은 HER2가 탑재되지 않은 아데노바이러스 플라스미드 DNA의 구조를 BstXI으로 분석한 결과이다. 왼쪽 그림은 SNAPGENE 프로그램을 사용해서 제작된 예상 결과로 1~5가 각각 제조예 1에서 5에 해당한다. MW로 표시된 것은 molecular weight의 준말로 각 DNA의 크기를 대략적으로 가늠하기 위해 사용되는 임의의 DNA이다. 본 실험에서는 1kb plus DNA ladder (Invitrogen)를 사용하였다. 오른쪽 그림은 실제 실험 결과로 예상 결과와 동일한 크기의 DNA 밴드가 존재하는 것을 확인할 수 있다. HER2가 탑재된 플라스미드 DNA에 대해서도 동일한 실험을 수행하였고 예상 결과와 동일한 크기의 DNA 밴드가 존재하는 것을 확인하였다 (도 2). 이를 통해서 바이러스 벡터 제작에 사용된 플라스미드 DNA의 구조에 이상이 없다는 것을 확인하였다.

2. 아데노바이러스 벡터 생산을 위한 패키징 세포주 제작

제조예 1에서 5까지의 아데노바이러스 벡터는 일반적인 아데노바이러스 벡터에 제거된 E1뿐만 아니라 E2B 유전자가 추가로 제거되어 있는 플라스미드로부터 생산된다. 이러한 플라스미드로부터 벡터를 생산하기 위해서는 바이러스 벡터가 자가 복제할 수 있도록 E2B 유전자를 외부에서 보충해 줄 수 있는 세포주가 필요하며, 본 특허에서는 HEK 293 세포에 레트로바이러스 벡터를 이용해서 pTP와 Pol 유전자를 전달함으로써 이러한 생산세포주를 만들었다.

(1) 세포 배양

293 세포는 ATCC에서 확보하였으며, 상용 DMEM 배양액(Welgene, Cat No. LM001-08)에 FBS (Hyclone, Cat No. SH30084.03), L-glutamine (Gibco, Cat No. 25030-081) 그리고 Antibiotic-Antimycotic (Gibco, Cat No. 15240-062) 를 첨가한 배양액에서 배양하였다. 배양액의 최종 조성은 87 % DMEM + 10 % FBS + 4 mM L-glutamine (2 %) + 1 % Antibiotic-Antimycotic이다. 보통 3일에서 4일에 한번 정도 계대 배양을 하였으며, 75-T flask를 기준으로 약 5 x 10 ⁵ 개에서 1 x 10 ⁶ 개의 세포를 넣어주었다. 계대 배양 시에는 세포가 부착된 플라스크를 PBS로 가볍게 세척한 후 Trypsin-EDTA를 처리해서 세포를 떼어주었다. 떨어진 배양액에 세포를 풀어서 trypan blue 방법으로 계수 후 새 플라스크에 넣어주었다. 레트로바이러스 생산 시에 사용한 293T 세포 또한 ATCC에서 확보하였다. 293, 293T, 그리고 293에서 유래한 생산 세포주인 293E2B 5-2 세포는 모두 위와 같은 방법으로 배양하였다.

(2) E2B 유전자를 발현하는 세포 군집의 확보

pTP와 Pol 유전자가 탑재된 레트로바이러스 벡터는 상용 레트로바이러스 플라스미드인 pMSCV system (Clontech)을 기반으로 제작되었다. pTP 유전자는 아데노바이러스 유전체를 가지는 플라스미드인 pAxCAwtit2 (Takara)를 template으로 하여 증폭되었다. 증폭된 서열은 pTP 유전자의 단백질을 만드는 서열 (서열 번호 3) 바로 앞에 단백질을 만들지 않는 비부호화 DNA를 포함하고 있으며 그 서열은 다음과 같다 (5'- ATG GCCTTGAGCG TCAACGATTG CGCGCGCCTG ACCGGCCAGA GCGTCCCGAC C -3', 서열번호 27), 추가로 비부호화 DNA의 바로 앞에 발현양을 증가시키기 위한 Kozak sequence (5'- GCCGCCACC -3', 서열번호 28)를 포함하고 있고 양 말단에는 클로닝에 사용된 제한 효소 자리인 EcoRI과 BamHI 자리가 위치한다. 증폭된 pTP 유전자를 해당 제한효소를 이용해서 pMSCV-Neo 플라스미드에 클로닝하여 pMSCV-pTP-Neo 플라스미드를 완성하였다.

Pol 유전자는 동일한 DNA를 주형으로 증폭되었다. pTP와 동일하게 증폭된 서열은 pol 유전자의 단백질을 만드는 서열 (서열 번호 2) 바로 앞에 단백질을 만들지 않는 비부호화 DNA를 포함하고 있으며 그 서열은 다음과 같다 (5'- ATG GCC TTG GCTCAAGCTC ACCGGGCCCG TCGTCTTCAC GCAGAGGCGC CAGATTCAGG AGATCAACCG CCGCGTCGTC GCGTTCGCCA GCAACCTACG CGCGCAGCAC CAGCTCCTGC CCGCGCGCGG CGCCGACGTG CCCCTGCCCC CTCTCCCGGC GGGTCCGGAG CCCCCCCTAC CTCCGGGGGC TCGCCCGCGT CACCGCTTTT AGATGCATCA TCCAAGGACA CCCCCGCGGC CCACCGCCCG CCGCGCGGTA CCGTAGTCGC GCCGCGGGGA TGCGGCCTCT TGCAAGCCAT CGACGCCGCC ACCAACCAGC CCCTGGAAAT TAGGTATCAC CTGGATCTAG CCCGCGCCCT GACCCGTCT ATGCGAGGTAA ACCTGCAGGA GCTCCCGCCT GACCTGACGC CGCGGGAGCT CCAGACC -3', 서열번호 29), 추가로 비부호화 DNA의 바로 앞에 발현양을 증가시키기 위한 Kozak sequence (5'- GCCGCCACC -3', 서열번호 28과 동일)를 포함하고 있다. 양 말단에는 클로닝에 사용된 제한 효소 자리인 BglII와 HpaI가 위치한다. 증폭된 pTP 유전자를 BglII와 HpaI제한효소를 이용해서 pMSCV-Hyg 플라스미드에 클로닝하여 pMSCV-Pol-Hyg 플라스미드를 완성하였다.

완성된 두 가지의 레트로바이러스 플라스미드와 상용 레트로바이러스 생산 kit인 Retroviral packaging kit Ampho (Takara)의 구성 물품인 pGP 및 pE를 같이 293T 세포에 트랜스펙션하여 레트로바이러스 벡터를 생산하였다. 트랜스펙션 시에는 Mirus사의 TransIT-293 제품을 이용하였다. 트랜스펙션 2일 후에 293T 세포의 배양액을 얻어서 0.45 μm의 크기를 가지는 주사기 필터를 통과해서 정제한 다음 293 세포에 처리하여 세포를 형질 전환하였다. 형질 전환 시에는 Pol 유전자를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 먼저 감염해서 Pol 유전자를 발현하도록 형질 전환한 후, 해당 세포에 pTP를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 감염해서 pTP와 Pol을 모두 발현하는 형질 전환 세포 군집을 얻었다. 형질 전환된 세포만을 선별하기 위해서 MSCV-pTP-Neo 벡터에 감염한 세포는 G418을 600 μg/mL로 처리하였고 MSCV-Pol-Hyg 벡터에 감염한 세포는 Hygromycin을 100 μg/mL로 처리하였다.

(3) 생산세포주 확보

이렇게 확보한 세포 군집에서 하나의 생산세포주 클론을 확보하기 위해서 잘 알려진 limiting dilution 방법을 이용하였다. 96-well plate에 세포가 한 well당 0.5개가 들어가도록 계수해서 뿌려준 다음 2주 정도 후에 현미경으로 관찰했을 때 하나의 세포 덩어리가 확인되는 것들을 선별하였다. 이러한 후보 클론을 약 100개 정도 확보한 후, 다른 클론 대비 생산성이 높은 총 6개의 후보 클론을 확보하였다. 그 후 6개의 클론에 대해서 pTP와 Pol 유전자가 잘 발현되고, 약 3개월 동안 배양하면서 생산성 및 성장 속도가 일정하게 유지되며, pTP와 Pol 및 그 주변 레트로바이러스 벡터의 서열에 돌연변이가 없는 지 분석하였다. 이를 통해 분석 실험을 모두 통과한 최종 세포주인 293E2B 5-2 세포주를 확보하였다. 본 특허에서 이후 아데노바이러스 벡터 생산 시에 사용된 패키징 세포주는 모두 293E2B 5-2이다.

3. 아데노바이러스 벡터의 생화학적 분석

(1) 아데노바이러스 벡터의 제작

아데노바이러스 벡터의 제작은 실시예 1의 아데노바이러스 플라스미드로부터 시작하였다. 우선 아데노바이러스 플라스미드 DNA를 PacⅠ 제한효소를 이용하여 절단하여 양쪽에 ITR 서열을 포함한 선형의 벡터 DNA를 확보한 후 phenol-chloroform을 이용하여 정제하였다. 확보한 digested DNA 중 2.5 ㎍을 TransIT-293 reagent (MirusBio)를 이용하여 패키징 세포주 에 transfection하였다. Cytopathic effect (CPE)가 충분히 보이는 시점 (약 2주 소요)에 세포와 배양액을 모두 수확하여, freezing (-80 ℃, 1시간 이상) 및 thawing (37 ℃ 항온 수조, 20분) 과정을 3회 거친 뒤, 상층액만을 0.22 μm PVDF membrane로 여과한 뒤, 다시 패키징 세포에 감염하여 바이러스 벡터를 증폭하는 과정을 반복하였다. 바이러스 벡터의 증폭은 6-well, T-25, T-75, T-175 수준으로 scale-up하며 진행하였고, 바이러스 벡터 감염 시 배양액은 5 % DMEM solution (92 % DMEM + 5 % FBS + 4 mM L-glutamine (2 %) + 1 % Antibiotic-Antimycotic)을 사용하였다. 생산된 아데노바이러스 벡터의 역가는 잘 알려진 TCID ₅₀ 방법 혹은 QuickTiter ^TM adenovirus titer immunoassay kit (Cell Biolabs)을 이용하여 측정하였다. 이렇게 생산된 아데노바이러스 벡터는 세포 유래 물질과 바이러스 벡터가 섞여 있는 크루드 형태이다.

(2) 바이러스의 감염 및 생화학적 분석

생산된 아데노바이러스 벡터를 이용해서 제조예 1에서 도입한 여러 가지 유전적 변형으로 인해 E2B 유전자의 기능이 상실되었는가의 여부를 바이러스의 후기 유전자 발현을 확인하여 검증하였다. 감염 24시간 전, 패키징 세포주를 각각 3 x 10 ⁵ cells/well이 되도록 collagen type Ⅰ-coated 6-well plate에 접종하였다. 하루 후, 3-1에서 생산한 각 벡터를 1 MOI (Ifu/cell)로 세포에 감염시켰다. Control로 E2B 부분이 제거되지 않은 Ad-GFP 벡터를 1 MOI (TCID ₅₀/cell) 로 293 세포에 감염시켰다. Ad-GFP 벡터는 Invitrogen 사의 pAd/CMV/V5-DEST쪠 Gateway쪠 Vector Kit을 이용하여 제작되었다. 감염 후 3일째에 media와 세포를 수확하여 원심분리 후, cell pellet에서 proprep (Invitrogen, Cat No. 17081)으로 단백질을 얻었다. Bradford assay로 단백질 정량 후, 20 μg 단백질을 이용하여 8 % gel에 SDS-PAGE를 진행하였다. Wet transfer method로 membrane에 transfer 후 TBST에 5 %로 희석한 blocking reagent (Bio-Rad)를 이용하여 blocking을 진행하였다. 그 후, 1차 항체를 동일한 blocking solution에 희석 후 4 ℃ inverter에서 16시간 반응시켰다. 이들의 종류 및 희석 비율은 anti-wt Ad5 antibody (Abfrontier)(1:2000), anti-Ad5 Hexon antibody (Abfrontier, Cat No. LF-MA0177)(1:2000), anti-β-actin antibody (Sigma Aldrich, Cat No. A1978)(1:10000)이다. anti-β-actin antibody는 예외적으로 1 % blocking reagent를 사용하여 blocking 및 항체 희석을 진행하였다. 다음날, membrane을 TBST로 3회 씻어준 후 1차 항체에 적합한 2차 항체로 반응시켰다. 사용한 2차 항체는 anti-rabbit secondary antibody (Abcam, Cat# No.ab6721) 와 anti-mouse secondary antibody (Abcam, Cat# No.ab6728)이고, 희석 비율은 1차 항체에 따라 조금씩 달랐지만 1:2000 - 1:5000 사이로 1차 항체를 희석한 것과 동일한 %의 blocking reagent에 희석하였다. 2차 항체와 반응 후 membrane을 TBST로 3회 씻어준 후 Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Cat No. RPN2232)와 반응시켜 결과를 확인하였다.

도 3은 293 세포에 E2B 제거 아데노바이러스 벡터 및 대조군인 Ad-GFP 벡터를 감염시킨 후 바이러스 후기 단백질을 분석한 결과이다. E1만 제거된 Ad-GFP를 E1을 포함한 293 세포에 감염하면 바이러스의 DNA 복제가 정상적으로 일어나게 되어 바이러스 후기 유전자가 발현된다. Lane 2에서 이를 확인할 수 있다. E1 외에 E2B 유전자가 추가적으로 망가지게 되면 293 세포에 감염되어도 바이러스 복제가 일어나지 않으므로 바이러스 후기 유전자는 발현되지 않는다. Lane 3-7에서 이를 확인할 수 있다. 즉, 제조예 1에서 5의 벡터는 E2B 유전자가 제거되었을 뿐만 아니라 E2B 유전자의 기능도 차단되었다는 것을 알 수 있다. E2B 유전자가 제거된 바이러스라 해도 외부에서 E2B 유전자의 기능을 제공해주면 바이러스 복제가 진행될 수 있다. 도 4는 E1 유전자 외에 E2B 유전자까지 발현하는 패키징 세포주에 도 3에서 사용한 것과 동일한 바이러스 벡터를 감염한 것으로 모든 감염 군에서 바이러스 DNA 복제가 일어나서 후기 유전자가 발현되는 것을 확인할 수 있다.

4. 아데노바이러스 벡터의 유전적 안정성 분석

(1) 외래 유전자가 탑재되지 않은 바이러스 벡터의 E2B 부분에 대한 PCR 구조 분석

생산된 아데노바이러스 벡터의 DNA 구조가 플라스미드의 DNA 구조와 일치하는지 확인하기 위해, 제조예 1-5의 E2B 구조를 가지는 아데노바이러스 벡터를 패키징 세포주에 감염하였다. 아데노바이러스 벡터 생산 방법 및 감염 방법은 실시예 2에서 언급된 것과 동일하다.

감염 후 3일차에 감염된 세포를 수확하여, Gentra Puregene Cell kit (Qiagen, Cat No. 158767)을 이용하여 바이러스 벡터의 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 gDNA 1 ㎕를 주형으로 하여 하기에 제시된 primer를 이용해서 (Forward primer: 5'- GCTCGGAAGACTATCTGCCT -3'(서열번호 30), Reverse primer: 5'- TACTCGCGTCTCAGGTACAC -3' (서열번호 31)) E2B 영역을 PCR로 증폭하였다. PCR 시에는 PrimeSTAR Max (TaKaRa, Cat No. R045)를 이용하였고, Biometra TRIO (Analytikjena) 기기로 수행하였으며, cycling parameter는 다음과 같다: 95 ℃ 5 분 1 회 -> [98 ℃ 10 분 -> 57 ℃ 5 초 -> 72 ℃ 30 초] (30회 반복) -> 72 ℃ 5 분 1 회. 이때 양성 대조군으로 사용하기 위해 각 바이러스 벡터를 생산할 때 사용한 아데노바이러스 플라스미드 100 ng를 동일하게 반응시켰다. PCR 실험 시 외부 오염 가능성을 확인하기 위해 플라스미드 DNA나 바이러스 벡터의 genomic DNA가 아닌 물만을 첨가하여 PCR 반응을 수행하였고, 이를 NTC로 표시하였다. 반응물의 10 % volume을 1 % 아가로오즈 젤에 전기영동하여 확인하였다. 각 제조예의 E2B 구조를 가졌을 때 PCR 산물의 예상 크기는 각 2263 bp (제조예1), 2263 bp (제조예2), 2365 bp (제조예3), 1750 bp (제조예4), 1048 bp(제조예5)이다.

도 5의 위의 그림과 아래 그림은 각각 동일한 그림을 세기만 조절해서 다르게 찍은 것이다. NTC에서는 어떠한 증폭도 관찰되지 않으며, 모든 바이러스 벡터에 대해서 플라스미드 DNA와 동일한 크기의 PCR 증폭 산물이 바이러스 벡터의 genomic DNA를 이용한 PCR에서 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 이렇게 얻어진 PCR 증폭 산물이 실제 E2B 부분에 해당하는지 확인하기 위해서 Wizard SV gel and PCR clean up system (Promega)를 사용해서 해당 크기의 밴드를 분리한 다음 시퀀싱을 하여 실제 E2B의 서열이 맞다는 것을 확인하였다. 이는 바이러스 벡터의 DNA의 E2B 부분이 플라스미드와 동일한 구조를 가지고 있다는 것을 보여준다. 하지만 lane 5로 표시한 제조예 2의 바이러스 벡터를 이용한 실험 결과를 보면, 플라스미드를 가지고 PCR을 했을 때는 관찰되지 않던 작은 크기의 PCR 증폭 산물이 바이러스 벡터 유래 DNA를 이용해서 PCR을 했을 때는 확인되는 것을 볼 수 있다 (붉은 화살표로 표시). 생산 초기 물질인 플라스미드에서는 예상 크기와 다른 PCR 산물이 확인되지 않은 것을 보았을 때, 이 결과는 생산 과정에서 의도치 않게 E2B 부분의 구조가 변형된 바이러스 벡터가 만들어졌을 가능성을 암시한다.

위 결과를 확실히 하기 위해, 상기 제조예 2의 E2B 구조를 가지는 아데노바이러스 벡터의 계대 배양을 수행하였다. 이는 앞서 생산한 바이러스 벡터를 패키징 세포주에 추가로 감염시켜 증폭하는 것으로 실제 구조가 다른 바이러스 벡터가 섞여 있다면, 계대 배양 후에도 동일하게 남아있거나 더 증폭될 것으로 예상할 수 있다. 패키징 세포주에 10 Ifu/ml의 제조예 2의 E2B 구조를 가지는 바이러스 벡터를 감염시켜 CPE가 보이는 감염 3일차에 세포와 배양 배지를 수확하여, freezing (-80 ℃, 1시간 이상) 및 thawing (37 ℃ 항온 수조, 20분)을 4회 반복한 뒤, 0.22 μm PVDF membrane으로 여과하여 1차 계대 배양을 완료하였다. 초기 바이러스 벡터는 P0, 1차 계대 배양이 끝난 벡터는 P1으로 표시하였다. 계대 배양시 수확한 세포를 도면 5의 실험과 동일한 방법으로 E2B 부분의 구조를 분석하였다. 바이러스의 gDNA를 얻기 위해서 기존에 사용한 Gentra Puregene Cell kit외에 TAKARA miniBEST viral RNA, DNA extraction kit (TAKARA, Cat No. 9766)를 추가로 사용하였다. 실험 결과, 제조예 2에 해당하는 플라스미드 DNA에서는 PCR 수행 시 2263 bp의 밴드만 관찰되지만, 바이러스 벡터의 DNA에서는 2263 bp의 밴드 외에도, 어떤 방법으로 바이러스 gDNA를 확보했는지에 관계없이 예상보다 크기가 작은 PCR 증폭 산물이 함께 관찰되었다. 이 결과는 제조예 2의 E2B 구조를 가진 바이러스 벡터는 유전적 안전성이 낮아서 생산 시 E2B 부분의 구조가 일부 다른 바이러스 벡터가 생성된다는 것을 보여준다 (도 6).

(2) 외래 유전자(HER2) 탑재 바이러스 벡터의 E2B 부분에 대한 PCR 구조 분석

제조예 1-5의 E2B 구조를 가지면서 E1 부분에 외부 유전자로 HER2를 탑재한 벡터의 유전적 안정성 또한 동일한 방법으로 관찰하였다. 제조예 1-5의 E2B 구조를 가진 아데노바이러스 플라스미드에 HER2를 탑재하는 방법은 실시예 1의 (6)에서 제시하였다. 이렇게 만들어진 아데노바이러스 플라스미드로부터 바이러스 벡터를 생산하였으며, 생산 방법은 실시예 3의 (1)에서 제시하였다. 생산된 바이러스 벡터를 패키징 세포주에 감염시키고 바이러스 벡터의 gDNA를 얻어 PCR 반응을 수행하였다. 상세 분석 방법은 실시예 4의 (1)과 동일하며 결과는 도 7에 제시되어 있다.

실험 결과, NTC에서는 어떠한 증폭도 관찰되지 않으며, 제조예 1를 제외한 나머지 바이러스 벡터에 대해서는 플라스미드 DNA와 동일한 크기의 PCR 증폭 산물이 벡터 DNA를 이용한 PCR 시 관찰되는 것을 확인하였다. 즉. 이 바이러스 벡터들의 DNA는 플라스미드 DNA와 동일한 구조의 E2B 부분을 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 제조예 1의 구조를 가지며 HER2를 탑재한 아데노바이러스 벡터의 경우, 앞서 도 5, 6에서 제조예 2의 E2B 구조에 대해서 관찰되었던 것과 비슷하게 플라스미드 DNA와 일치하는 크기 외에 예상보다 작은 크기의 PCR 증폭 산물이 관찰되었다 (도 7). 제조예 2의 E2B 구조를 가지면서 HER2가 탑재된 바이러스 벡터는 HER2가 없는 벡터와 달리 DNA의 E2B 부분에 구조 이상이 확인되지 않았다.

도 7에서 관찰된 예상보다 작은 크기의 PCR 증폭 산물은 세기가 진하게 확인되는 등 그 양이 앞서 도 5에서 확인되었던 것보다 많아 더 자세한 분석을 진행하였다. 이 부분의 정확한 서열을 확인하기 위해, 작은 크기의 PCR 밴드 부위를 Wizard SV gel and PCR clean-up system을 이용해 추출하여 시퀀싱하였다. 시퀀싱 방법은 PCR 결과물을 T-vector 에 삽입한 다음, M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3', 서열번호 32), M13-R (5'-GCGGATAACAATTTCACACAGG-3', 서열번호 33) primer를 이용하여 서열을 읽는 것이다. 얻어진 서열을 DNA 서열 분석 프로그램인 SNAPGENE을 사용하여 분석하였다. 그 결과, 작은 크기의 PCR 산물은 E2B 부분이 맞았지만, 그 중간의 일부가 절단된 형태임을 알 수 있었다 (도 8).

바이러스 벡터의 DNA 구조를 확인하기 위한 다른 방법으로 DNA를 제한효소로 자른 후 예상 결과가 비교해 보는 방법이 있다. 제조예 1의 E2B 구조를 가지면서 HER2가 탑재된 바이러스 벡터의 DNA를 대상으로 제한효소 분석 방법을 수행하였다. 분석에 사용한 제한효소는 BstXⅠ (NEB, Cat No. R0133S)과 DraⅠ(NEB, Cat No. R0129S)이며, 1 μg의 바이러스 genomic DNA를 제한효소 1 μL와 섞어 37 ℃ 항온 수조에서 2시간 반응시킨 뒤, 0.6 % 및 1 % 아가로오즈 젤에 전기영동하여 결과를 관찰하였다. 두 가지 젤에 전기영동한 결과가 표시되어 있으며, 각 결과의 왼쪽에 해당 바이러스를 BstXI (1) 및 Dra I (2)으로 잘랐을 때 예상되는 결과가 표시되어 있다. 예상 결과는 SNAPGENE 프로그램을 사용해서 제작되었다. MW로 표시된 것은 molecular weight의 준말로 각 DNA의 사이즈를 대략적으로 가늠하기 위해 사용되는 임의의 DNA이다. 본 실험에서는 1kb plus DNA ladder (Invitrogen)를 사용하였다.

실험 결과, BstXⅠ과 반응 시, 약 3 kb 부근에서, DraⅠ 반응 시, 약 7 kb 부근에서 예상하지 못한 밴드가 관찰되었다 (도 9, 붉은색 상자). 이 결과는 앞선 PCR 실험과 동일하게 해당 바이러스 벡터의 구조가 플라스미드에서 예상된 것과 다르게 변형되었음을 보여주는 것이다.

지금까지의 분석 결과를 종합하면, 모든 제조예의 E2B 구조를 가지는 바이러스 벡터는 E2B 유전자의 기능이 망가져 있었지만, 제조예 1과 2에 해당하는 E2B 구조를 가진 경우에는 각각 HER2가 없거나 있는 상태에서 생산했을 때 벡터 DNA의 E2B 부분의 구조가 일부 불안정한 현상이 관찰되었다.

E2B의 기능이 망가져 있으면서도 유전적 안정성이 우수한 제조예 3~5의 E2B 구조를 가진 바이러스 벡터의 구조를 제한 효소 처리 방법으로 추가 분석하였다. HER2를 탑재한 바이러스 벡터를 우선 분석하였고, 분석에 사용한 효소는 BstXⅠ이며, 각 벡터에서 얻은 바이러스 gDNA 를 BstXⅠ과 37 ℃ 항온 수조에서 3 시간 동안 반응시킨 후 1% 아가로오즈 젤에 전기영동해 결과를 확인하였다 (도 10).

도 10에서 가장 왼쪽 그림은 SNAPGENE 프로그램을 이용해서 작성한 예상 결과로 1, 2, 3은 각각 제조예 3~5에 해당한다. 오른쪽 그림은 실제 실험 결과로 동일한 사진을 세기를 조정해서 찍은 세 장이 같이 표시되어 있다. DNA의 크기를 표시하기 위한 size marker를 제외하고 왼쪽부터 각각 제조예 3~5에 해당하는 결과이다. 세 가지 바이러스 벡터의 DNA 모두 BstXI으로 잘랐을 때 예상 결과에서 제시된 크기의 밴드가 확인되는 것을 알 수 있다. 단, 제조예 3, 5의 구조를 가진 바이러스 벡터의 DNA를 잘랐을 때는 전기영동 결과가 깨끗한 반면에, 제조예 4의 구조를 가진 바이러스 벡터 DNA를 전기영동 하였을 때는 전반적으로 양상이 지저분하였고 그 때문에 가장 아래쪽 밴드가 잘 보이지 않았다. 표 1에서 예상 결과에서 제시된 절단된 DNA의 크기를 표시하였고, 도 10의 결과에서 해당 크기의 DNA가 육안으로 확인되는지 여부를 O, X로 표시하였다. 제조예 3~5의 E2B 구조를 가지면서 HER2가 탑재되지 않은 벡터에 대해서도 동일한 방법으로 DNA 구조를 분석하였으며 예상과 동일한 구조를 얻는 것을 확인하였다. 이로써 제조예 3~5의 E2B 구조를 가진 바이러스 벡터는 외래 유전자 탑재 유무와 관계없이 벡터 DNA의 구조적인 이상이 없다는 것을 알 수 있었다.

Expected digested size (bp)
19AD-02 (제조예4)		19AD-06 (제조예5)		19AD-09 (제조예6)
11,920	O	11,920	O	11,920	O
4,254	O	4,254	O	4,254	O
4,210		3,595	O	3,470	O
3,471	O	3,471		3,385
3,385		3,385		2,893	O
2,401	O	2,401	O	2,401	O
1,393	O	1,393	O	1,393	O
960	O	960	?	960	O

5. 아데노바이러스 벡터의 정제 및 분석

지금까지 바이러스 벡터의 생화학적 혹은 DNA 구조 분석에 사용한 바이러스 벡터는 바이러스 벡터와 세포 유래 물질이 섞인 크루드바이러스 형태이다. 동물 실험이나 실제 사람에 적용할 때는 크루드바이러스 벡터를 대량으로 확보한 후 이를 정제해서 사용하게 된다. 본 실시예에서는 제조예 3~5의 E2B 구조를 가진 바이러스 벡터의 크루드바이러스를 대량으로 확보하고 정제를 시도하였다. 초기 물질로는 제조예 3-5의 E2B 구조를 가지면서 HER2가 탑재된 구조의 아데노바이러스 벡터를 이용하였다.

크루드바이러스 벡터를 대량으로 얻기 위해서 패키징 세포주를 T-175 플라스크로 30장 준비하고, 각 플라스크에 크루드바이러스 벡터를 5 ifu/cell로 감염하였다. 세포는 1.2 X 10 ⁷ cells/T-175 flask로 seeding하였고, seeding 후 1일차에 감염하였으며, 감염 후 3일차에 세포와 배양액을 모두 수확하였다. 그 후, freezing (-80 ℃, 1시간 이상) 및 thawing (37 ℃ 항온 수조, 20 ~ 30분)을 3회 반복하였다. 3회 반복 후, 원심분리하여 상층액만 확보하여 0.45μm membrane에 여과하였다.

아데노바이러스 벡터는 서로 다른 농도의 CsCl (염화 세슘) 수용액을 이용해서 밀도 구배를 만들고, 원심 분리를 하여 밀도 차이에 의해서 분리 및 정제를 할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 간략히 설명하면, CsCl (Sigma Aldrich, Cat No. C6914)의 1.4 g/mL 수용액 4 mL과 1.2 g/mL의 수용액 3.5 mL을 ultracentrifuge tube에 순서대로 넣은 후, 위의 여과한 상층액을 그 위에 약 4.5 mL 정도 넣었다. Tube가 거의 가득 찬 상태에서 4 ℃에서 24000 rpm으로 2 ~ 3시간 ultracentrifuge를 진행하였다. 도면 11의 사진에서처럼 원심분리가 끝나면 2개의 band를 관찰할 수 있는데 이 중, 아래 band를 주사기를 이용하여 얻었다. 제조예 3와 5의 E2B 구조를 가지는 경우 뚜렷한 밴드를 확인할 수 있었고, 제조예 4의 E2B 구조를 가지는 벡터는 진하기는 약했지만 여전히 밴드가 존재하는 것을 볼 수 있었다 (도 11).

한번 더 정제를 진행하기 위해서, 1.35 g/mL CsCl solution 7.5 mL을 ultracentrifuge tube에 넣은 후, 앞서 확보한 아데노바이러스 벡터를 넣었다. 이 tube가 거의 가득 찬 상태에서 4 ℃에서 24000 rpm으로 overnight 동안 ultracentrifuge를 진행하였다. 원심분리 후 관찰되는 하나의 band를 주사기를 이용하여 얻었다. 얻어낸 band는 dialysis buffer에 pre-incubation한 Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes (Thermo Scientific, Cat No. 88251)에 넣어준 후, 중앙을 눌러 기포를 없앤 후 입구를 닫아 dialysis를 진행하였다. 1X dialysis buffer에 2 ~ 3 시간 동안 dialysis를 2회 반복하고, overnight dialysis를 1회 수행하였다. Overnight dialysis시 사용하는 buffer에는 5 % sucrose가 포함되어 있다. Overnight dialysis 후 주사기를 이용하여 아데노바이러스 벡터를 수확하여 10 ~ 20 μl로 aliquot하여 -80 ℃에 보관하였다.

정제가 잘 되었는지 확인하기 위해서 정제된 바이러스의 역가 (virus particle, 바이러스 입자 수)를 기존에 잘 알려진 A ₂₆₀ 측정 방법으로 계산하였다. 이 방법은 바이러스의 capsid 단백질을 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 이용하여 제거한 뒤, DNA가 잘 흡수할 수 있는 260nm 파장의 빛을 조사하여 흡광도인 A ₂₆₀ 값을 측정함으로써 바이러스 DNA의 양을 측정하고 이를 역가로 환산하는 방법이다. 측정 결과, 제조예 3와 5의 E2B 구조를 가지는 정제 아데노바이러스 벡터는 각각 5.40 X 10 ¹¹ VP/mL 및 4.68 X 10 ¹¹ VP/mL의 역가를 가지고 있었다. 제조예 4의 구조를 가지는 바이러스 벡터는 흡광도는 측정되었으나, 그 값이 현재 보유한 측정법의 검출 한계 아래에 있었기 때문에 정확한 역가를 확인할 수는 없었다. 이 결과는 제조예 3, 4, 5의 E2B 구조를 가지며 외부 유전자가 탑재된 바이러스 벡터에 대해서 정제된 벡터를 확보하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.

정제된 바이러스에 대해서도 DNA를 얻어 E2B 영역 및 HER2 영역의 구조를 PCR로 분석하였다. 우선 아데노바이러스 벡터의 DNA를 얻기 위해 바이러스 벡터 5 μL에 DPBS (Welgene) 95 μL를 섞어 희석한 뒤, proteinase K (Qiagen, Material No. 1019499) 5 μL를 첨가하였다. 55 ℃에서 1시간, 94 ℃에서 30분을 순차적으로 반응시켜, 바이러스 벡터의 DNA를 추출하였다. E2B 부분의 PCR 증폭 방법은 4의 (1)에 언급된 것과 동일하다. 탑재된 외래 유전자인 HER2 검출은 하기에 제시된 primer를 이용해서 (Forward primer: 5'-GGTCTATATAAGCAGAGCTG-3' (서열번호 40), Reverse primer: 5'-GTGGTATGGCTGATTATGATCAG-3' (서열번호 41)) 증폭하였다. PCR 시에는 PrimeSTAR Max (TaKaRa, Cat No. R045)를 이용하였고, Biometra TRIO (Analytikjena) 기기로 수행하였으며, cycling parameter는 다음과 같다: 95 ℃ 5 분 1 회 -> [98 ℃ 10 분 -> 55 ℃ 5 초 -> 72 ℃ 13 초] (35회 반복) -> 72 ℃ 10 분 1 회. 이 때, 추출한 바이러스 벡터 DNA 중 1 μL를 주형으로 사용하였으며, 양성 대조군으로 각 바이러스 벡터를 생산할 때 사용한 아데노바이러스 플라스미드 100 ng을 동일하게 반응시켰다. PCR 실험 시 외부 오염 가능성을 확인하기 위해 플라스미드 DNA나 바이러스 DNA가 아닌 물만을 첨가하여 PCR 반응을 수행하였고, 이를 NTC로 표시하였다. 반응물의 20 % volume을 1 % 아가로오즈 젤에 전기영동하여 확인하였다. 각 제조예의 E2B 부분의 PCR 산물의 예상 크기는 각 2365 bp (제조예3), 1750 bp (제조예4), 1048 bp (제조예5)이며, HER2 부분의 PCR 산물 예상 크기는 제조예3, 제조예4, 제조예5 모두에서 2153 bp이다.

도 12를 보면, NTC에서는 어떠한 증폭도 관찰되지 않으며, 모든 제조예의 E2B 구조를 가지는 벡터에 대해서 플라스미드 DNA와 동일한 크기의 PCR 증폭 산물이 벡터 DNA를 이용한 PCR 증폭 시 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 이는 제조예 3-5의 E2B 구조를 가지는 아데노바이러스 벡터는 정제 후에도 유전적 안정성을 유지하고 있다는 것을 보여준다.

Claims (9)

1. 서열번호 1의 서열에서 E2B 영역 중 7275 내지 7881번 및 8583 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 아데노바이러스 벡터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 결실로 DNA 폴리머라아제 유전자(DNA polymerase gene, pol) 및 프리터미널 단백질 유전자(preterminal protein gene, pTP)가 불활성화된, 아데노바이러스 벡터.
3. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1의 서열에서 7274 내지 7881번 및 8583 내지 9630번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된 아데노바이러스 벡터.
4. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 서열번호 1의 서열에서 7275 내지 9632번 위치에 대응되는 위치의 염기가 결실된, 아데노바이러스 벡터.
5. 제 1항에 있어서, 상기 결실 부위의 적어도 일부에 외래 유전자가 도입된, 아데노바이러스 벡터.
6. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 아데노바이러스 벡터를 패키징 세포주에 감염시키는 단계를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 제조 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 패키징 세포주는 HEK-293 (Human embryonic kidney 293), HEK-293 유래의 세포, 911, PER.C6, A549 (carcinomic human alveolar basal epithelial cell), HER (Human Embryonic Retinoblast), HEL 299 (Human lung fibroblast), HeLa (Human cervical cancer cell), CHO (Chinese hamster ovary cell), BHK (Baby hamster kidney cell), 3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell), WS1 (Human dermal fibroblast), MRC5 (Human Lung Fibroblast), WI38 (Human lung fibroblast cell), AE1-2a (Human lung adenocarcinoma), PC12 (Rat Pheochromocytoma cell), Primary human amniocytes, 아프리카 녹색원숭이 신장세포, 및 코커스패니얼 신장세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 제조 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 패키징 세포주는 DNA 폴리머라아제 유전자 (DNA polymerase gene, pol) 및 프리터미널 단백질 유전자 (preterminal protein gene, pTP)를 발현하는 것인, 제조 방법.
9. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 아데노바이러스 벡터로 형질전환된 세포.

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