WO2021145793A1 - Генотерапевтический днк-вектор - Google Patents

Генотерапевтический днк-вектор Download PDF

Info

Publication number
WO2021145793A1
WO2021145793A1 PCT/RU2021/000015 RU2021000015W WO2021145793A1 WO 2021145793 A1 WO2021145793 A1 WO 2021145793A1 RU 2021000015 W RU2021000015 W RU 2021000015W WO 2021145793 A1 WO2021145793 A1 WO 2021145793A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
dna vector
gene therapy
therapy dna
disease
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/000015
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Антон ГАМОЛСКИ
Original Assignee
Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд
Общество, С Ограниченной Ответственностью "Рекомбитех"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд, Общество, С Ограниченной Ответственностью "Рекомбитех" filed Critical Генетик Диагностикс Энд Терапи 21 Лтд
Publication of WO2021145793A1 publication Critical patent/WO2021145793A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Definitions

  • the invention relates to genetic engineering and can be used in biotechnology, medicine and agriculture to create gene therapy drugs.
  • Gene therapy is a modern medical approach aimed at treating hereditary and acquired diseases by introducing new genetic material into the patient's cells in order to compensate or suppress the function of the mutant gene and / or correct the genetic defect.
  • the end product of gene expression can be an RNA or protein molecule.
  • RNA molecules are either an intermediate product in protein synthesis, or carry out regulatory functions.
  • the goal of gene therapy is, in most cases, the introduction into the body of genes that provide transcription and subsequent translation of the protein molecules encoded by these genes.
  • the expression of a gene means the production of a protein molecule, the amino acid sequence of which is encoded by this gene.
  • the relationship between low / insufficient concentrations of proteins encoded by these genes with various unfavorable human conditions, which, in some cases, is confirmed by abnormalities in the normal expression of genes encoding these proteins, has been shown.
  • a gene therapy increase in the expression of a gene selected from the group of genes DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 has the potential to correct various conditions in humans and animals.
  • the DCC gene (Dopa decarboxylase, Gene ID: 1644) encodes the enzyme aromatic L-amino acid decarboxylase (AADA), which catalyzes the decarboxylation reaction, providing the biosynthesis of dopamine from L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), serotonin from L-5- hydroxytryptophan and tryptamine from L-tryptophan.
  • AADA aromatic L-amino acid decarboxylase
  • L-DOPA is obtained from tyrosine in a reaction catalyzed by the enzyme tyrosine hydroxylase.
  • L-DOPA is used as a pharmacological drug to compensate for dopamine deficiency in patients with Parkinson's disease, thus relieving the symptoms of Parkinson's disease.
  • the use of L-DOPA gives a noticeable positive effect only in the initial stages of the development of Parkinson's disease. This is due to the fact that, despite a significant decrease in the number of dopaminergic terminals in the striatum, they still contain a sufficient amount of DAA to maintain the required level of dopamine (Marsden and Parkes, 1977).
  • the results obtained confirmed the expression of the target gene for at least 6 years after injection and showed the restoration of the ability of cells in the striatum to convert L-DOPA to dopamine. This led to the fact that the desired therapeutic effects in animals that were administered the transgene were achieved at significantly lower doses of L-DOPA. Reducing the dose of L-DOPA also reduced the side effects of its use. In a similar study, the positive effects of DCC gene delivery in a monkey model of Parkinson's disease were observed for 15 years (Sehara et al., 2017).
  • Interleukin 10 (IL-10) (Gene ID: 3586). Interleukin 10 belongs to immunomodulatory cytokines and is produced mainly by monocytes and to a lesser extent by lymphocytes. It has a variety of effects on the regulation of immunity and inflammation.
  • EEM experimental encephalomyelitis
  • MOG1-125 rat myelin glycoprotein
  • Interleukin 13 (IL-13) (Gene ID: 3596). Interleukin 13 belongs to immunomodulatory cytokines and is produced mainly by activated type 2 T-helper cells.
  • IL-13 As recent studies show, plays a role in the pathogenesis of autoimmune diseases, in including multiple sclerosis (Mao et al., 2018). In a model of cuprizone-induced demyelination, the gene encoding IL-13 was delivered using a lentiviral vector to the thickening of the corpus callosum in the brain (Guglielmetti et al., 2016).
  • IL-13 changes the phenotype of microglia and macrophages infiltrating brain tissue, the microenvironment that promotes the development of an inflammatory response.
  • Gene therapy using a construct encoding IL-13 thus ameliorates the effects of cuprizone-induced demyelination.
  • Interferon beta 1 (Gene ID: 3456). This gene encodes a cytokine that belongs to the family of interferons, which take part in the activation of the innate immune response to the penetration of the pathogen into the body.
  • IFNB1 is important for protection primarily against viral infections. In the case of multiple sclerosis, recombinant IFNB1 is used as a first-line drug to relieve symptoms of chronic inflammation and demyelination in relapsing disease (Moreno et al., 2010).
  • TNF receptor superfamily member 4 (TNFRSF4, 0X40) (Gene ID: lo 7293) and TNF superfamily member 10 (TNFSF10, TRAIL) (Gene ID: 8743).
  • the 0X40 gene encodes one of the proteins belonging to the tumor necrosis factor receptor superfamily. Knockout of this gene suppresses apoptosis in transformed and tumor cells. The protein encoded by this gene is involved in the regulation of proliferation and differentiation of B cells.
  • the TRAIL gene encodes a cytokine that belongs to the family of tumor necrosis factor-dependent apoptosis-inducing ligands.
  • Hepatocyte growth factor (Gene ID: 3082). Hepatocyte growth factor is a plasminogen-dependent pleotropic growth factor derived from mesenchymal cells (Nakamura et al., 2011). It regulates cell growth, cell motility and is morphogenesis of various cell types, including epithelial and endothelial. In addition, it plays a role in angiogenesis, regeneration of several organs and tissues, inflammatory responses, and increased growth of nerve cell processes in the dorsal root ganglia (Maina and Klein, 1999). It also performs several functions in the central (CNS) and peripheral (PNS) nervous systems: it protects damaged neurons from death and ensures the regeneration of nerve processes in the CNS and PNS.
  • CNS central
  • PNS peripheral
  • Plasmid vectors encoding HGF were injected either intramuscularly 25 (Tsuchihara et al., 2009) or intrathecally (Hu et al., 2017) in a model of ligation of the sciatic nerve or its branches.
  • the results of the mechanosensitivity test showed a restoration of the threshold at which animals withdraw their paws after gene therapy.
  • the main mechanism the effect of HGF in chronic pain models, as in the case of interleukin 10, is considered to suppress the activation of astrocytes and microglia cells in the spinal cord.
  • Interleukin 2 (Gene ID: 3558). Interleukin 2 is a 5 cytokine that enhances the proliferation of T and B lymphocytes after antigen stimulation. In addition to immunomodulation, IL-2 also acts as a regulatory molecule in the central nervous system. It and its receptor are produced in various regions of the brain, including the hippocampus, hypothalamus, cerebellum, neostriatum, and dorsal root ganglia (Hanisch and Quirion, 1995). Accumulated data show that IL-2 plays an important role in the nervous and neuroendocrine regulation of the body. Also, one of the manifestations of IL-2 in the nervous system is its antinociceptive function, both in the peripheral nerves and in the central nervous system.
  • the prior art indicates that the genes DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 have the potential to correct a number of deviations and conditions of the body, 5 characterized by progressive pathological changes in the structure of nervous tissue and neuronal function, including their death associated with genetic factors, including mutations in genes encoding proteins critical for the normal functioning of u neurons, including Huntington's disease, inherited forms of amyotrophic lateral sclerosis, as well as impaired folding of the tertiary structure of proteins, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, with injuries of the central nervous system, with impaired oxygen supply to the brain or spinal cord, with abnormalities in the energy metabolism of neurons and axonal transport, or with autoimmune demyelinating processes, including multiple sclerosis.
  • these data indicate that insufficient expression of proteins encoded by DDC genes, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, included in the group of genes, is associated not only with pathological conditions, but also with a predisposition to their development. Also, the given data indicate that insufficient expression of these proteins may not manifest itself explicitly in the form of pathology, which can be unambiguously described within the existing standards of clinical practice (for example, using the ICD code), but at the same time cause conditions that are unfavorable for humans and animals and are associated with a deterioration in the quality of life.
  • Gene therapy vectors are divided into viral, cellular and DNA vectors (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA / CAT / 801 83/2014). Recently, in gene therapy, more and more attention is paid to the development of non-viral systems for the delivery of genetic material, among which plasmid vectors are in the lead. Plasmid vectors are free from the disadvantages inherent in cellular and viral vectors.
  • plasmid vectors for gene therapy are: 1) the presence of antibiotic resistance genes for production in bacterial strains, 2) the presence of various regulatory elements represented by the sequences of viral genomes 3) the size of the therapeutic plasmid vector, which determines the efficiency of vector penetration into the target cage.
  • antibiotic resistance genes 5 also make a fundamental contribution to the method of obtaining DNA vectors.
  • strains for the production of DNA vectors are usually cultivated in a medium containing a selective antibiotic, which creates the risk of the presence of trace amounts of the antibiotic in insufficient purified preparations of DNA vectors.
  • obtaining DNA vectors for gene therapy that lack antibiotic resistance genes is associated with obtaining strains with such a distinctive feature as the ability to stably amplify target DNA vectors in a medium without antibiotics.
  • the European Medical Agency recommends avoiding the presence of regulatory elements in the composition of therapeutic plasmid vectors to increase the expression of target genes (promoters, enhancers, post-translational regulatory elements), which are the nucleotide sequences of the genomes of various viruses (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/ Scientific_guideline / 2015/05 / WC500187020.pdf). Although these sequences can increase the level of expression of the target transgene, they pose a risk of recombination with the genetic material of wild-type viruses and integration into the genome of a eukaryotic cell. Moreover, the feasibility of overexpression of a particular gene for therapy purposes remains an unresolved issue.
  • the size of the therapeutic vector is essential. It is known that modern plasmid vectors are often overloaded with non-functional regions, which seriously increase the size of the vector (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. 2008.39 (2): 97-104).
  • the ampicillin resistance gene in vectors of the pBR322 series as a rule, consists of at least 1000 bp, which is more than 20% of the size of the vector itself.
  • an inverse relationship is observed between the size of the vector and its ability to penetrate into eukaryotic cells - DNA vectors with a small size more efficiently penetrate into human and animal cells.
  • the vector is a supercoiled plasmid DNA vector and is intended for the expression of cloned genes in animal and human cells.
  • the vector consists of the origin of replication, regulatory elements including the promoter and enhancer of human cytomegalovirus, regulatory elements from the human T-lymphotropic virus.
  • the accumulation of the vector is carried out in a special strain of E. coli without the use of antibiotics due to antisense complementation of the sacB gene introduced into the strain by means of a bacteriophage.
  • the disadvantage of this invention is the presence of regulatory elements in the DNA vector, which are sequences of viral genomes.
  • the prototypes of the proposed solution namely, the use of gene therapy approaches to increase the level of expression of genes from the group DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, are the following patents and patent applications:
  • Patent for invention US 4808523A which describes a plasmid vector carrying a gene encoding IFNB1.
  • This vector allows you to increase the expression of IFNB1 in mammalian cells.
  • the disadvantage of this invention is the method of use, limited to the production of IFNB1 protein in vitro and different from the gene therapy use of this vector. Also, the disadvantage of this invention is the presence in the vector of sequences of viral origin.
  • Patent for invention RU 2678756 which describes a gene therapy DNA vector VTvaf17, a method for its production, a Escherichia coli SCS110-AF strain, a method for its production, an Escherichia coli SCSI 10-AF / VTvaf17 strain carrying a gene therapeutic DNA vector VTvaf17, a method for its production.
  • the disadvantage of this invention is the significant size of the vector part, which can negatively affect the efficiency of delivery of the DNA vector into cells.
  • Patent for invention US 8647618 which describes a method for delivering a gene therapeutic vector carrying the IL2 gene sequence in the cells of an attenuated Salmonella typhimurium strain for the treatment of oncological diseases.
  • the disadvantage of this method is induction the immune response to repeated introduction of bacterial cells, and, accordingly, a critical decrease in the therapeutic effect, as well as the uncertainty of the requirements for the safety of the vector used.
  • Patent for invention US 8389492 which describes an expression plasmid vector, which contains a gene encoding a hepatocyte growth factor (HGF) for the treatment of ischemic diseases and liver diseases.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the patent describes methods for introducing a vector, including in the form of "naked" DNA, as well as in the composition of liposomal complexes.
  • the disadvantage of this invention is the presence in the vector of the gene for resistance to the antibiotic kanamycin. is Disclosure of invention
  • the objective of the invention is to design gene therapy DNA vectors to increase the level of expression of a group of genes DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 in humans and animals, combining the following properties:
  • Items II and III are provided for in this technical solution in accordance with the recommendations of state regulators for drugs for gene therapy, in particular, the European Medicines Agency regarding the refusal to introduce antibiotic resistance markers into plasmid vectors for gene therapy being developed (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011, EMA / CAT / GTWP / 44236/2009 Committee for advanced therapies) and regarding the refusal to introduce elements of viral genomes into plasmid vectors for gene therapy under development (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA / CAT / 80 183/2014, Committee for Advanced Therapies).
  • the object of the invention is also the design of strains carrying these gene therapy DNA vectors for the development and production on an industrial scale of gene therapy DNA vectors.
  • a gene therapy DNA vector based on the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 has been created for the treatment diseases characterized by progressive pathological changes in the structure of the nervous tissue and the function of neurons, including their death, associated with genetic factors, including mutations in genes encoding proteins that are critical for the normal functioning of neurons, including Huntington's disease, inherited forms of amyotrophic lateral sclerosis, as well as impaired folding of the tertiary structure of proteins, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, with injuries of the central nervous system, with impaired oxygen supply to the brain or spinal cord, with abnormalities in the energy metabolism of neurons and axonal transport, or with autoimmune demyelinating processes, including multiple sclerosis, while the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC contains the coding portion of the target DDC gene, cloned into the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, with the nucleotide sequence SEQ ID N ° 1, the gene therapy DNA vector GDT T1.8NAS
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 contains the coding portion of the target IL13 gene cloned into the gene therapy DNA vector
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 contains the coding portion of the target IFNB1 gene cloned into the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, with the nucleotide sequence SEQ ID N ° 4
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 contains the coding portion of the target TNFRSF4 gene cloned into the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, with the nucleotide sequence SEQ ID Ns5
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 contains the coding portion of the target TNFSF10 gene, cloned into a gene therapy DNA vector
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-BCL2 contains the coding portion of the target BCL2 gene, cloned into the gene therapy DNA vector
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF contains the coding portion of the target HGF gene, cloned into the gene therapy DNA vector
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 contains the coding portion of the target IL2 gene, cloned into the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, with the nucleotide sequence SEQ ID N 9.
  • Each of the generated gene therapy DNA vectors GDTT1.8NAS12-DDC or GDTT1 .8NAS12-IL10 or
  • GDTT1.8NAS12-IL2 due to the limited size of the vector part of GDTT1.8NAS12, not exceeding 2600 bp, has the ability to effectively penetrate human cells and animals and express the target gene DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 cloned into it.
  • GDTT1.8NAS12-DDC GDTT1.8NAS12-IL10 or GDTT1.8NAS12-IL13 or GDTT1.8NAS12-IFNB1 or GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 or GDTT1.8FNAS12-TNDFS -BCL2 or GDTT 1.8NAS12-HGF or
  • GDTT1.8NAS12-IL2 nucleotide sequences that are not genes for antibiotic resistance, viral genes and regulatory elements of viral genomes are used as structural elements, ensuring the possibility of its safe use for genetic therapy in humans and animals.
  • GDTT1.8NAS12 is carried out at the restriction sites Sail and Hindlll, or Sail and Kpnl, or BamHI and Sail, and the selection is carried out without antibiotics, while obtaining a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC, SEQ ID No. transcription and PCR amplification, oligonucleotides are used as oligonucleotides created for this:
  • DDC-F ATCGTCGACCACCATGAACGCAAGTGAGTTCCGA, DDC-R ACCAAGCTTCTACTCCCTCTCTG, and cleavage of the amplification product and cloning of the coding portion of the DDC gene into the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 is carried out using Sail1 and Hindi-DNA restriction enzyme ILT12 SEQ ID No. 2 FOR REACTION reverse transcription and PCR amplification, oligonucleotides are used as oligonucleotides created for this:
  • oligonucleotides are used as the oligonucleotides created for this: IL13-F AGG ATCCASSAT GC AT CCGCTCCT CAAT C,
  • oligonucleotides are used as the oligonucleotides created for this:
  • TTT GTCG ACT WITH AGTTTCGG AGGT AASST GT AAGT CT G and cleavage of the amplification product and cloning of the coding part of the IFNB1 gene into the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 is carried out using restriction endonucleases BamHI and Sail, and when obtaining the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, SEQ ID N ° 5 for carrying out the reverse transcription reaction and PCR amplification, oligonucleotides are used as oligonucleotides created for this:
  • oligonucleotides are used as the oligonucleotides created for this:
  • TNFSF10-F AGGAT CCACC ATGGCT AT G AT GGAGGT CCA, TNFSF10-R T GTCG ACT CAGCC AAST AAAAAGGCCCCGA, and cleavage of the amplification product and cloning of the coding part of the TNFSF10 gene into the gene therapy DNA vector BDTT1.8 when receiving gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-BCL2, SEQ ID N ° 7 for carrying out the reaction of reverse transcription and PCR amplification, as oligonucleotides created for this use oligonucleotides:
  • oligonucleotides are used as oligonucleotides created for this:
  • HGF_F TTT GGATCC ACC AT GT GGGT GACCAAACT CCTGCC ⁇ , HGF_R
  • cleavage of the amplification product and cloning of the coding part of the HGF gene into the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 is carried out using restriction endonucleases BamHI and Sail, and when obtaining the gene therapeutic DNA vector.
  • -IL2 SEQ ID N ° 9 for carrying out the reaction of reverse transcription and PCR amplification, oligonucleotides are used as the oligonucleotides created for this:
  • a cleavage of the amplification product and cloning of the coding part of the IL2 gene into a gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 is carried out using restriction endonucleases BamHI and Sail.
  • the claimed strain Escherichiacoli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-DDC carrying the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC, for its development with the possibility selection without the use of antibiotics when obtaining a gene therapeutic DNA vector or the Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10, for its development with the possibility of selection without using antibiotics when obtaining gene therapy DNA vector or strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL13, carrying the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13, for its production with the possibility of selection without the use of antibiotics when obtaining gene therapy DNA vector or strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1 .8NAS12-IFNB1 carrying the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 for its production with the possibility of selection without the use of antibiotics when obtaining a gene therapy DNA
  • DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 or gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-BCL2 or gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF or gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 are obtained by inoculating with prepared medium, a seed culture selected from Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-DDC strain or Escherichia coli J M 110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL10 strain or Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL10 strain or Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL10 strain or Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL strain coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL strain coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL strain coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS
  • Figure 1 shows a diagram of a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, which is a circular double-stranded DNA molecule capable of to autonomous replication in the cells of the bacterium Escherichia coli.
  • Figure 1 shows the diagrams corresponding to:
  • FIG. 1A gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC
  • FIG. 1B gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10
  • FIG. 1C gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13
  • FIG. 1D gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1
  • FIG. 1E gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12- TNFRSF4
  • FIG. 1F gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10
  • Fig. 1G gene therapy DNA vector GDTT1. 8NAS 12- ⁇ L2
  • FIG. 1 H - gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF
  • FIG. II gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2.
  • EF1a pr is the promoter region of the human elongation factor EF1 A gene with its own enhancer contained in the first intron of the gene. Serves to ensure a high level of transcription of the recombinant gene in most human tissues;
  • Reading frame of the target gene corresponding to the coding part of the DDC gene (Fig. 1A), or IL10 (Fig. 1B), or IL13 (Fig. 1C), or IFNB1 (Fig. 10), or TNFRSF4 (Fig. 1E), or TNFSF10 (Fig. 1F), or BCL2 (Fig. 1G), or HGF (Fig. 1H), or IL2 (Fig. 11), respectively; hGH TA - transcription terminator; pUCori - origin of replication, which serves for autonomous replication with a single nucleotide substitution to increase the copy number of the plasmid in the cells of most Escherichia coli strains;
  • RNA out is a regulatory element of the PHK-out transposon ⁇ 10, which provides the possibility of positive selection without the use of antibiotics when using the Eshcerichia coli J 110-NAS strain.
  • Figure 2 shows graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely, the DDC gene, in the culture of human cortical neurons HCN-2 (ATCC CRL-10742) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.
  • 8NAS12-DDC in order to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 2 shows the curves of accumulation of amplicons during the reaction, corresponding to:
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • Fig. 3 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IL10 gene, in the culture of human neuroblastoma IMR-32 (ATCC CCL-127) cells before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 for the purpose of assessing the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 3 shows the accumulation curves of amplicons during the reaction, corresponding to: 1 - cDNA of the IL10 gene in the culture of IMR-32 before transfection with the DNA vector GDTT 1.8NAS12-IL10;
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • Figure 4 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IL13 gene in the culture of human glioblastoma cells U-118 MG (ATCC HTB-15) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 in order to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 4 shows the accumulation curves of amplicons during the reaction, corresponding to:
  • FIG. 5 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IFNB1 gene, in the culture of human neuroblastoma SH-SY5Y cells (ATCC CRL-2266) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector go GDTT1.8NAS12 -IFNB1 to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 5 shows the accumulation curves of amplicons in the course of the reaction, corresponding to:
  • the B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • Figure 6 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the TNFRSF4 gene, in the culture of human astroglia SVG p12 cells (ATCC CRL-8621) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 in order to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • the target gene namely the TNFRSF4 gene
  • Figure 6 shows the curves of accumulation of amplicons in the course of the reaction, corresponding to:
  • FIG. 7 shows graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the TNFSF10 gene, in the culture of neuroectodermal cells of a human brain tumor PFSK-1 (ATCC number CRL-2060) of a person before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with a DNA vector GDTT1.8NAS12- TNFSF10 to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 7 shows the curves of accumulation of amplicons during the reaction, corresponding to:
  • Figure 8 shows the graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the BCL2 gene in the culture of human medulloblastoma cells D341 Med (ATCC HTB-187) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-BCL2 for the purpose of assessing the ability to penetrate eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 8 shows the curves of accumulation of amplicons during the reaction, corresponding to:
  • the B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • Figure 9 shows graphs of accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the HGF gene, in the culture of human astrocytoma cells A-172 (ATCC CRL-1620) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the GDTT1 DNA vector.
  • 8NAS12-HGF to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • Figure 9 shows the accumulation curves of amplicons in the course of the reaction, corresponding to:
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • Figure 10 shows graphs of the accumulation of cDNA amplicons of the target gene, namely the IL2 gene, in the culture of human neuronal progenitor cells ATCC-BXS0117 (ATCC ACS-15 5003) before their transfection and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12 -IL2 in order to assess the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity, that is, the expression of the target gene at the mRNA level.
  • the curves of accumulation of amplicons during the reaction are marked, corresponding to:
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • FIG 11 shows a diagram of the concentration of DDC protein in the cell lysate of human cortical neurons HCN-2 (ATCC CRL-10742) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene on protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapy DNA vector based on the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target DDC gene.
  • Fig.11 marked the following elements: culture A - culture HCN-2, transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control); culture B - culture of HCN-2 transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12; th culture C is a culture of HCN-2 transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC.
  • FIG. 12 shows a diagram of the IL10 protein concentration in lysate 25 of human neuroblastoma cell culture IMR-32 (ATCC CCL-127), after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using gene therapy DNA vector based on gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target IL10 gene.
  • Figure 13 shows a diagram of the concentration of IL13 protein in the lysate of human glioblastoma cell culture U-118 MG (ATCC HTB-15) after transfection of these cells with a DNA vector
  • GDTT1.8NAS12-IL13 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene IL13.
  • Figure 13 shows the following elements: culture A - culture of U-118 MG cells transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control); culture B - culture of U-118 MG cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12; culture C - culture of U-118 MG cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13.
  • FIG. 13 shows the following elements: culture A - culture of U-118 MG cells transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control); culture B - culture of U-118 MG cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12; culture C - culture of U-118 MG cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13.
  • FIG. 14 shows a diagram of the concentration of the IFNB1 protein in the lysate of the culture of human neuroblastoma cells SH-SY5Y (ATCC CRL-2266) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target IFNB1 gene.
  • Figure 14 shows the following elements: culture A - culture of SH-SY5Y cells transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control); culture B - culture of SH-SY5Y cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12; culture C - culture of SH-SY5Y cells transfected with the DNA vector GDTT 1.8NAS12-IFNB1.
  • FIG. 15 shows a diagram of the TNFRSF4 protein concentration in the lysate of human astroglia SVG p12 cells (ATCC CRL-8621 after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the expression level protein using a gene therapy DNA vector based on gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target TNFRSF4 gene.
  • FIG. 16 shows a diagram of the concentration of TNFSF10 protein in the lysate of neuroectodermal cells of a human brain tumor PFSK-1 (ATCC number CRL-2060) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target TNFSF10 gene.
  • Figure 17 shows a diagram of the BCL2 protein concentration in the lysate of a culture of human medulloblastoma cells D341 Med (ATCC HTB-187) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-BCL2 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene BCL2.
  • Figure 18 shows a diagram of the concentration of the HGF protein in the lysate of the culture of human brain astrocytoma cells A-172 (ATCC CRL-1620) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene on protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapy DNA vector based on the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target HGF gene.
  • FIG. 1 On Fig marked the following elements: culture A - culture of cells A-172, transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control); culture B - culture of A-172 cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12; culture C - culture of A-172 cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF.
  • FIG. 1 On Fig marked the following elements: culture A - culture of cells A-172, transfected with an aqueous solution of dendrimers without plasmid DNA (control); culture B - culture of A-172 cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12; culture C - culture of A-172 cells transfected with the DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF.
  • FIG. 19 shows a diagram of the IL2 protein concentration in the lysate of the culture of human neuronal progenitor cells ATCC-BXS0117 (ATCC ACS-5003) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapeutic DNA vector based on the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target IL2 gene.
  • FIG. twenty shows a diagram of the concentration of IFNB1 protein in skin biopsies of three patients after the introduction of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 into the skin of these patients in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using gene therapeutic DNA - a vector based on the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target IFNB1 gene.
  • P2III biopsy of patient P2's skin from an intact area
  • P3I biopsy of the patient's skin PZ in the area of injection of gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1;
  • FIG. 21 shows a diagram of the IL13 protein concentration in gastrocnemius muscle biopsies of three patients after gene therapy was injected into the gastrocnemius muscle of these patients.
  • DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using a gene therapy DNA vector based on 5 gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene IL13.
  • P1III - biopsy specimen of the intact part of the gastrocnemius muscle is of patient P1;
  • P3II biopsy specimen of the gastrocnemius muscle of the patient PZ in the area of injection of gene therapy DNA of the vector GDTT1.8NAS12 (placebo); P3III - biopsy specimen of the intact area of the gastrocnemius muscle of the patient's PZ.
  • FIG. 5 shows a diagram of the IL2 protein concentration in skin biopsies of three patients after the introduction of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 into the skin of these patients in order to assess the functional activity, that is, the expression of the target gene at the protein level, and the possibility of increasing the level of protein expression using gene therapy DNA vector based on gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene-11_2.
  • P1I - biopsy of the patient's skin P1 in the injection zone is of the gene therapy DNA vector GDTT 1.8NAS12-IL2;
  • FIG. 23 shows a diagram of the IL10 protein concentration in human skin biopsies after the introduction into the skin of a culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 in order to demonstrate the method of application by introducing autologous cells transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10
  • FIG. 23 the following elements are marked: P1C - biopsy of the patient's skin P1 in the zone of administration of the culture of autologous fibroblasts of the patient transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10;
  • FIG. 24 shows a diagram of the concentration of proteins: human DDC protein, human BCL2 protein, human HGF protein, human TNFSF10 protein, human TNFRSF4 protein in the muscle tissue of three groups of Wistar rats after injection of a mixture of gene therapy vectors: gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC, gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-BCL2, gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF, gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10, gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 with the purpose of demonstrating a method of using a mixture of gene therapy DNA vectors.
  • FIG. 24 the following items are marked:
  • K1I - a fragment of the muscle tissue of a K1 group I rat in the injection zone of a mixture of gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT1 .8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT1.8NAS12-TNFSF10 and GDTT1.8NAS12-TNFRSF10;
  • K1II - a fragment of the muscle tissue of a K1 group II rat in the injection zone of a mixture of gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT1.8NAS12-TNFSF10 and GDTT1.8NAS12-TNFRSF4;
  • K1III - a fragment of the muscle tissue of a K1 group III rat in the injection zone of a mixture of gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT 1.8NAS12-TNFSF1 0 and GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4;
  • K1 IV a fragment of the muscle tissue of a rat of group K1 in the zone of injection of a mixture of gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT 1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT1.8NAS12-TNFSF10 and GDTT 1.8NAS1 2-TNFRSF4;
  • K1V a fragment of the muscle tissue of a K1 group V rat in the injection zone of a mixture of gene therapy DNA vectors: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT 1.8NAS12-TNFSF10 and GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4;
  • K2I - a fragment of the muscle tissue of a K2 group I rat in the zone of administration of gene therapy DNA of the GDTT1.8NAS12 vector (placebo);
  • K2II a fragment of the muscle tissue of a K2 group II rat in the zone of administration of gene therapy DNA of the GDTT1.8NAS12 vector (placebo);
  • K2III a fragment of the muscle tissue of a rat of group K2 in the area of administration of gene therapy DNA of the vector GDTT1.8NAS12 (placebo);
  • K2IV - a fragment of the muscle tissue of a rat of group IV K2 in the area of administration of gene therapy DNA of the vector GDTT1.8NAS12 (placebo);
  • K2V - a fragment of the muscle tissue of a K2 group V rat in the zone of administration of gene therapy DNA of the GDTT1.8NAS12 vector (placebo);
  • K3I - a fragment of muscle tissue of the control intact area of the rat of the I group of KZ;
  • K3II - a fragment of muscle tissue of the control intact area of the rat of the II group of KZ;
  • K3III - a fragment of muscle tissue from a control intact area of a rat of the III group of KZ;
  • K3IV - a fragment of the muscle tissue of the control intact area of a rat of the IV group of KZ;
  • K3V - a fragment of the muscle tissue of the control intact area of the rat of the V group of KZ.
  • FIG. 25 shows graphs of accumulation of cDNA amplicons of the target IL13 gene in bovine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) before and 48 hours after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 in order to demonstrate the method of application by introducing the gene therapeutic DNA vector to animals
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Figure 25 shows the accumulation curves of amplicons during the reaction, corresponding to: 1 - cDNA of the IL13 gene in bovine PBMC cells before transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13;
  • bovine actin (bovine actin) gene listed in the GenBank database under the number AH001 130.2 was used as a reference gene.
  • each gene therapy DNA vector carrying the target genes is that the protein-coding sequence of the target gene selected from the group of genes is cloned into the polylinker of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12: the DDC gene (encodes the DDC protein), the gene IL10 (encodes IL10 protein), IL13 gene (encodes IL13 protein), IFNB1 gene (encodes IFNB1 protein), TNFRSF4 gene (encodes TNFRSF4 protein), TNFSF10 gene (encodes TNFSF10 protein), 25 BCL2 gene (encodes BCL2 protein), HGF gene (encodes HGF protein), IL2 gene (encodes IL2 protein) human.
  • the DDC gene encodes the DDC protein
  • the gene IL10 encodes IL10 protein
  • IL13 gene encodes IL13 protein
  • IFNB1 gene encodes IFNB1 protein
  • TNFRSF4 gene encodes TNFRSF4 protein
  • TNFSF10 gene encodes T
  • DNA vectors it is known that the ability of DNA vectors to penetrate into eukaryotic cells is mainly determined by the size of the vector. Wherein The smallest DNA vectors have a higher penetrating power. Thus, it is preferable that the vector contains no elements that do not carry a functional load, but at the same time increase the size of the DNA vector.
  • DNA vectors were taken into account when obtaining a gene therapy DNA vector based on a gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, due to the absence of large non-functional sequences and antibiotic resistance genes in the vector, which, in addition to technological advantages and advantages in terms of safety of use, significantly reduced the size of the resulting gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene selected from the group of genes: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2.
  • the ability to penetrate into eukaryotic cells of the obtained gene therapy DNA vector is due to its small size.
  • Each of the gene therapy DNA vectors DNA vector GDTT 1.8NAS12-DDC, or GDTT1.8NAS12-IL10, or GDTT 1.8NAS12-IL13, or GDTT1.8NAS12-IFNB1, or
  • GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, or GDTT 1.8NAS12-TNFSF 10, or GDTT1.8NAS12-BCL2, or GDTT1.8NAS12-HGF, or GDTT1.8NAS12-IL2 was obtained as follows: the coding portion of the target gene DDC, or IL10, or IL13, or IFNB1, or TNFRSF4, or TNFSF10, or BCL2, or HGF, or IL2 cloned into the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 and received gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC, SEQ ID N21, or GDTT1.8NAS12-IL10, SEQ ID Ns2 or GDTT 1.8NAS12-IL13, SEQ ID N23, or GDTT 1.8NAS12-IFNB1, SEQ ID N24, OR GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, SEQ ID Ns5, or GDTT1.8NAS12-TNFSF10, SEQ ID N26, or GDTT1.8NAS12- BCL2,
  • a reverse transcription reaction was used to obtain the first cDNA strand of human DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 genes.
  • Amplification was carried out using oligonucleotides created for this by the method of chemical synthesis.
  • Cleavage of the amplification product with specific restriction endonucleases was carried out taking into account the optimal procedure for further cloning, and cloning into the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 was performed at the restriction sites BamHI, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Sail located in the polylinker of the GDTT1.8NAS12 vector.
  • oligonucleotide sequences can be used to amplify the DDC gene, or IL10, or IL13, or IFNB1, or TNFRSF4, or TNFSF10, or BCL2, or HGF, or IL2, various restriction endonucleases, or laboratory techniques such as ligase-free gene cloning ...
  • GDTT1.8NAS12-IFNB1 or GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, or GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or GDTT 1.8NAS1 2-BCL2, or GDTT1.8NAS12-HGF, or GDTT1.8NAS12-ILQ OR SEQ ID N21 N22 or SEQ ID Ns3 or SEQ ID Ns4 or SEQ ID Ns5 or SEQ ID N26 or SEQ ID N27 or SEQ ID N28 or SEQ ID N29, respectively.
  • the scope of the present invention also includes variants of the nucleotide sequences of genes from the group of genes: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, which at the same time, various variants of the amino acid sequences of proteins DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 are encoded, which do not differ from those given in their functional activity under physiological conditions.
  • the ability to penetrate into eukaryotic cells and functional activity that is, the ability to express the target gene of the resulting gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC, or GDTT 1.8NAS12-IL10, or GDTT1.8NAS12-IL13, or GDTT 1.8NAS12-IFNB1, or GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, or GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or GDTT1 .8NAS12-BCL2, or GDTT1.8NAS12-HGF, or GDTT1.8NAS12-IL2 is confirmed by introducing the resulting vector into eukaryotic cells and subsequent analysis of the expression and / or specific mRNA product of the target gene.
  • the presence of the mRNA of the gene is a prerequisite, but not proof of translation of the protein encoded by the target gene. Therefore, to confirm the properties of the gene therapy DNA vector GDTT 1.8NAS12-DDC, or GDTT1.8NAS12-IL10, or GDTT1.8NAS12-IL13, or GDTT 1.8NAS12-IFNB1, or
  • GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, or GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or GDTT1.8NAS12-BCL2, or GDTT1.8NAS12-HGF, or GDTT1.8NAS12-IL2 Express the target gene at the protein level in eukaryotic cells into which DNA has been introduced vector, the concentration of proteins encoded by the target genes is analyzed using immunological methods. The presence of the protein DDC, or IL10, or IL13, or IFNB1, or TNFRSF4, or TNFSF10, or BCL2, or HGF, or IL2 confirms the efficiency of expression of target genes in eukaryotic cells and the possibility of increasing the level of protein concentration using a gene therapy DNA vector based on gene therapy.
  • DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene selected from the group of genes: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2.
  • DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC carrying the target gene, namely, the DDC gene
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the target gene, namely the IL10 gene
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the target gene, namely the IL13 gene
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the target gene, namely, the IFNB1 gene 5
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12- TNFRSF4 carrying the target gene, namely TNFRSF4 gene
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 carrying the target gene, namely TNFSF10 gene
  • gene therapy DNA vector GDTT 1.8NAS12-BCL2 carrying the target gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC carrying the target gene namely the DDC gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the target gene namely the IL10 gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the target gene namely the IL13 gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the target gene namely the IFNB1 gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 carrying the target gene, namely, the TNFRSF4 gene
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 carrying the target gene namely the TNFSF10 gene
  • the gene therapy DNA vector GDTT1 .8NAS12-BCL2 carrying the target gene namely the BCL2 gene
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF carrying the target gene namely the HGF gene
  • antibiotic resistance genes in gene therapy DNA vectors are used to obtain these vectors in preparative amounts by increasing bacterial biomass in a nutrient medium containing a selective antibiotic.
  • GDTT1.8NAS12 carrying the target gene DDC, or IL10, or IL13, or IFNB1, or TNFRSF4, or TNFSF10, or BCL2, or HGF, or IL2
  • the use of selective 5 culture media containing an antibiotic is not considered possible.
  • GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 for the possibility of scaling up to an industrial scale for obtaining gene therapy vectors a method of obtaining strains for the production of these gene therapy vectors based on the bacterium Escherichia coli JM110-NAS is proposed.
  • a method of obtaining a strain of Escherichia coli is JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-DDC or a strain of Escherichia coli JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL10, or a strain of Escherichia coli JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL13, or a strain of Escher JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1 or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or coli Escherichia coli strain Escherichia-NASD1.8NAS12-TNFSF10 .8NAS12-BCL2, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-HGF, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12
  • the resulting Escherichia coli strain J M 110- NAS / GDTT1.8NAS12-DDC, or Escherichia coli strain JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL10, or Escherichia coli strain JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL13, coli- Escher1 strain NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1, or Escherichia coli strain JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or Escherichia coli strain NAS.8 / JM110-BCL JM110-BCL , or the Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-HGF, or the Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL2 is used to develop the gene therapy DNA vector GDTT
  • Escherichia coli JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-DDC strain or Escherichia coli JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL10 strain, or Escherichia coli JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL13 strain, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL13 strain, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IL13 coli JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1, or strain Escherichia coli JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, or strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or strain JM1 .8NAS12-BCL2, or strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-HGF, or Escherichia coli strain JM110
  • GDTT1.8NAS12-DDC carrying the target gene, namely the DDC gene
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the target gene, namely the IL10 gene
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the target gene, namely, gene IL13
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the target gene, namely, gene IFNB1
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 carrying the target gene, namely gene TNFRSF4
  • gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 carrying the target gene, namely the TNFSF10 gene
  • the method for scaling the production of bacterial mass u to an industrial scale for the isolation of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 carrying the target gene selected from the group of genes DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 is that the seed culture of Escherichia coli JM 110-15 NAS / GDTT1.8NAS12-DDC strain, or Escherichia coli JM110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL10 strain, or Escherichia coli J M 110- NAS / GDTT1.8NAS12-IL13 strain, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or JM110 coli / Escherichi
  • the cultivation conditions of the strains, the composition of the nutrient media (excluding the content of antibiotics), the equipment used, the DNA purification methods may vary within the framework of standard operating procedures, depending on the individual production line, but known approaches to scaling , industrial production and purification of DNA vectors using the Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-DDC, or the Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL10, or the Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8 , or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1, or Escherichia coli strain JM 110-NAS / GDTT 1.8NAS 12-TNFRSF4, or Escherichia coli strain JM 110-NAS / GDTT 1.8NAS12-TNFSF1 0 strain, or Escherichia coli strain JM 110
  • GDTT1.8NAS12-DDC carrying the target gene, namely the DDC gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC was constructed by cloning the coding part of the DDC gene with a size of 1447 bp. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. the restriction sites Sall-Hindlll.
  • the coding part of the DDC gene is 1447 bp in size.
  • RNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed by combining six DNA fragments obtained from different sources:
  • the hGH-TA transcription terminator was obtained by PCR amplification of a region of human genomic DNA with the use of oligonucleotides hGH-F and hGH-R (sequence listing of oligonucleotides, (3) and (4));
  • a kanamycin resistance gene was obtained by PCR amplification of a portion of the commercial human plasmid pET-28 using oligonucleotides Kan-F and Kan-R (sequence listing of oligonucleotides, (10) and (11));
  • a polylinker was obtained by kininating and annealing four synthetic oligonucleotides MCS1, MCS2, MCS3 and MCS4 (list of oligonucleotide sequences, (12) - (15));
  • PCR amplification was performed using a commercial Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase kit (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions. Fragments (b), (c), and (d) had overlapping regions for the possibility of combining them with subsequent PCR amplification. Fragments (b), (c) and (d) were combined using the hGH-F and Kan-R oligonucleotides
  • the resulting vector was digested with restriction endonucleases at the Sail and BamHI sites, followed by ligation with fragment (e).
  • a vector of 3608 bp was obtained, carrying the kanamycin resistance gene and the promoter-regulatory region of the gene for the elongation factor EF1a with its own enhancer.
  • the kanamycin resistance gene was cut at the Spel restriction sites, after which the remaining fragment was ligated onto itself.
  • a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp was obtained, which is recombinant, with the possibility of selection without antibiotics and the possibility of expression of target genes cloned into it in most types of human and animal tissues.
  • GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the target gene, namely the IL10 gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 was constructed by cloning the 540 bp coding portion of the IL10 gene. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites BamHI and Sail.
  • the coding part of the IL10 gene is 540 bp. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen, Russia) and PCR amplification using oligonucleotides: IL10-F AGGATCCACCATGCACAGCTCAGCACTGC,
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • Example 3 Preparation of a DNA vector GDTT1.8NAS12-IL 3 carrying the target gene, namely the human IL13 gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 was constructed by cloning the 444 bp coding portion of the IL13 gene. into DNA vector GDTT1.8NAS12 size 2591 p.n. by restriction sites BamHI and Sail.
  • the 444 bp coding part of the IL13 gene. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen, Russia) and PCR amplification using oligonucleotides: IL13-F AGG ATCCASSAT GC ATCCGCT CCT CAAT C,
  • IL13-R CTT GT CG ACT WITH AGTT G AAST GTCCCTCG and a commercial kit Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, USA), the amplification product and DNA vector GDTT1.8NAS12 were cleaved with restriction endonucleases BamHI and Sail.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the target gene, namely the IFNB1 gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 was constructed by cloning the 567 bp coding portion of the IFNB1 gene. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites BamHI and Sail.
  • the 567 bp coding part of the IFNB1 gene. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction with using a commercial kit Mint-2 (Evrogen) and PCR amplification using oligonucleotides:
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 carrying the target gene, namely the TNFRSF4 gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 was constructed by cloning the 837 bp coding part of the TNFRSF4 gene. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites BamHI and Sail.
  • the coding part of the TNFRSF4 gene is 837 bp. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Eurogen) and PCR amplification using oligonucleotides:
  • TNFRSF4-F AGGATCCACCATGTGCGTGGGGGCTCGG,
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.s Example 6.
  • GDTT1.8NAS12-TNFSF10 carrying the target gene, namely the TNFSF10 gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10o was constructed by cloning the 849 bp coding part of the TNFSF10 gene. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. restriction sites BamHI, Hindlll.
  • the coding part of the TNFSF10 gene is 849 bp. was obtained by isolating total RNA from a biological sample5 of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen) and PCR amplification using oligonucleotides:
  • DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 with a size of 3402 bp was obtained.
  • SEQ ID N26 the nucleotide sequence SEQ ID N26 and the general structure depicted in FIG-IF
  • this gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • GDTT1.8NAS12- BCL2 carrying the target gene, namely the BCL2 gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-BCL2 was constructed by cloning the 724 bp coding portion of the BCL2 gene. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites Sail and Kpnl.
  • the 724 bp coding part of the BCL2 gene. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen) and PCR amplification using oligonucleotides: BCL-F ATCGTCGACCACCATGGCGCACGCTGGGAGA,
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF was constructed by cloning the coding part of the HGF 15 gene with a size of 2190 bp. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites BamHI and Sail.
  • the coding part of the HGF gene is 2190 bp. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen) and PCR amplification using oligonucleotides:
  • DNA vector GDTT1.8NAS12 was constructed according to Example 1.
  • GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the target gene, namely the IL2 gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 was constructed by cloning the 465 bp IL2 gene coding region. into the DNA vector GDTT1.8NAS12 with a size of 2591 bp. by restriction sites BamHI and Sail.
  • the coding part of the IL2 gene is 465 bp. was obtained by isolating total RNA from a biological sample of human tissue, followed by a reverse transcription reaction using a commercial kit Mint-2 (Evrogen) and PCR amplification using oligonucleotides:
  • Cell culture HCN-2 was grown under standard conditions (37 ° C, 5% CO 2 ) in DMEM culture medium supplemented with 10% bovine embryo serum (Gibco). During the cultivation process, the growth medium was changed every 48 h.
  • HCN-2 cells transfected with the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, which did not contain the insert of the target gene were used (cDNA of the DDC gene before and after transfection with the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, which did not contain the insert of the target gene was not shown in the figures).
  • the preparation of the control vector GDTT1.8NAS12 for transfection was performed as described above.
  • RNA from HCN-2 cells was isolated using Trizol Reagent (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's recommendations. 1 ml of Trizol Reagent was added to a well with cells and homogenized, followed by heating for 5 min at 65 ° C. Then the sample was centrifuged at 14000g for 10 min and again warmed up for 10 min at 65 ° C. Then, 200 ⁇ L of chloroform was added, smoothly mixed, and centrifuged at 14,000 g for 10 min. Then the aqueous phase was taken, 1/10 volume of 3M sodium acetate, pH 5.2 and an equal volume of isopropyl alcohol were added to it.
  • oligonucleotides DDC_SF and DDC_SR were used: DDC_SF GGAG AAGGGGGAGG AGT GAT,
  • Amplification product length - 186 bp The reverse transcription reaction and PCR amplification were performed using the SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, USA) for real-time PCR. The reaction was carried out in a volume of 20 ⁇ l containing: 25 ⁇ l of QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2.5 mM magnesium chloride, 0.5 ⁇ M of each primer, 5 ⁇ l of RNA.
  • the reaction was carried out on a CFX96 amplifier (Bio-Rad, USA) under the following conditions: 1 cycle of reverse transcription at 42 ° C for 30 minutes, denaturation at 98 ° C for 15 min, then 40 cycles including denaturation at 94 ° C for 15 sec, annealing primers 60 ° ⁇ - 30 sec and elongation 72 ° ⁇ - 30 sec.
  • the B2M gene (Beta-2-microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • As a positive control we used amplicons obtained by PCR on matrices that were plasmids in known concentrations containing the cDNA sequences of the DDC and B2M genes.
  • Changes in the accumulation of mRNA of the target gene IL10 were evaluated in the culture of human neuroblastoma cells IMR-32 (ATCC CCL-25 127) 48 hours after their transfection with gene therapy.
  • DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the human IL10 gene carrying the human IL10 gene.
  • the amount of mRNA was determined by the dynamics of accumulation of cDNA amplicons in the real-time PCR reaction.
  • Cell culture IMR-32 was grown under standard conditions (37 ° C, 5% CO 2 ) in EMEM culture medium supplemented with 10% bovine embryo serum (Gibco). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at 5x10 4 cells / well. The Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with a gene therapy DNA vector
  • GDTT1.8NAS12-IL10 expressing the human IL10 gene was carried out as described in example 10.
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • As a control we used a culture of human neuroblastoma cells IMR-32 transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not carry the target gene (cDNA of the IL10 gene before and after transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not contain the insert of the target gene. ).
  • Isolation of RNA, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 10, with the exception of oligonucleotides with different sequences from example 10.
  • oligonucleotides IL10_SF and IL10_SR were used: I L 10 S F AAGACCCAGACATCAAGGCG,
  • the length of the amplification product is 135 bp.
  • Amplicons obtained by PCR on matrices were used as a positive control. which are plasmids in known concentrations containing the cDNA sequences of the IL10 and B2M genes. Deionized water was used as a negative control. The amount of PCR products, the cDNA of the IL10 and B2M genes, obtained as a result of amplification, was estimated in real time using the software of the Bio-RadCFXManager 2.1 amplifier (Bio-Rad, USA). The analysis plots are shown in FIG. 3.
  • Cell culture U-118 MG was grown under standard conditions (37 ° C, 5% CO 2 ) in MEM culture medium supplemented with 10% bovine embryo serum (Gibco). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at a rate of 5x1 0 4 pots / well. The Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 expressing the human IL13 gene was performed as described in example 10. The B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene.
  • IL13_SR AGCT GT C AGGTT GAT GCTCC.
  • the length of the amplification product is 181 bp.
  • amplicons obtained by PCR on matrices were used, which were plasmids in known concentrations containing the cDNA sequences of the IL13 and B2M genes. Deionized water was used as a negative control.
  • the amount of PCR products - cDNA of IL13 and B2M genes obtained as a result of amplification was estimated in real time using the software of the Bio-RadCFXManager 2.1 amplifier (Bio-Rad, USA). The analysis plots are shown in FIG. 4.
  • Example 13 Confirmation of the ability of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the target gene, namely, the IFNB1 gene, to penetrate into eukaryotic cells and confirmation of its functional activity at the level of mRNA expression of the target gene.
  • This example also demonstrates the feasibility of a method for using a gene therapy DNA vector carrying the target gene.
  • Cell culture SH-SY5Y was grown under standard conditions (37 ° C, 5% CO 2 ) in culture medium DMEM: F12 (Gibco) 1: 1 supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at a rate of 5x10 4 kpets / well. The Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 expressing the human IFNB1 gene was performed as described in Example 10.
  • RNA cDNA of the IFNB1 gene before and after transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not contain an insert of the target gene is not shown in the figures.
  • Isolation of RNA, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 10, with the exception of oligonucleotides with different sequences from example 10.
  • oligonucleotides IFNB1_SF and IFNB1_SR were used: IFNB1_SF GTGGCAATTGAATGGGAGGC,
  • IFNB1 SR ATAGATGGTCAATGCGGCGT.
  • Amplification product length - 118 bp As a positive control, amplicons obtained by PCR on matrices were used, which were plasmids in known concentrations containing the cDNA sequences of the IFNB1 and B2M genes.
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene. Deionized water was used as a negative control.
  • GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 expressing the human TNFRSF4 gene was performed as described in Example 10.
  • a culture of human astroglia SVG p12 transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not carry the target gene cDNA of the TNFRSF4 gene before and after transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not contain the insert of the target gene in the figures is not shown.
  • Isolation of RNA, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 10, with the exception of oligonucleotides with different sequences from example 10.
  • the TNFRSF4_SF and TNFRSF4_SR oligonucleotides were used:
  • TNFRSF4_SR CCT GT CCT C AC AG ATTGCGT.
  • the length of the amplification product is 162 bp.
  • amplicons obtained by PCR on matrices were used, which were plasmids in known concentrations containing the cDNA sequences of the TNFRSF4 and B2M genes.
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene. Deionized water was used as a negative control.
  • Changes in the accumulation of mRNA of the target TNFSF10 gene were evaluated in the culture of neuroectodermal cells of human brain tumor PFSK-1 (ATCC number CRL-2060) 48 hours after their transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 carrying the human TNFSF10 gene.
  • the amount of mRNA was determined by the dynamics of accumulation of cDNA amplicons in the real-time PCR reaction.
  • Cell culture PFSK-1 was grown under standard conditions (37 ° C, 5% CO 2 ) in RPMI-1640 culture medium supplemented with 10% bovine embryo serum (Gibco).
  • the cells were seeded in a 24-well plate at a rate of 5x10 4 cells / well.
  • the Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with a gene therapy DNA vector
  • GDTT1.8NAS12-TNFSF10 expressing the human TNFSF1010 gene was performed as described in Example 10.
  • GDTT1.8NAS12 lacking the target gene insert is not shown in the figures).
  • RNA isolation, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 10, with the exception of oligonucleotides with different sequences from example 10.
  • oligonucleotides TNFSF10_SF and TNFSF10_SR were used: TNFSF10_SF CCTGCAGTCTCTCTGTGTGG,
  • TNFSF10_SR ACGG AGTT GCCACTT GACTT.
  • amplicons obtained by PCR on matrices which are plasmids in known concentrations containing the cDNA sequences of the TNFSF10 and B2M genes.
  • the B2M gene (Beta-2 microglobulin) listed in the GenBank database under the number NM 004048.2 was used as a reference gene. Deionized water was used as a negative control.
  • Figure 7 shows that as a result of transfection of a culture of neuroectodermal cells of a human brain tumor with PFSK-1 gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10, the level of specific mRNA of the human TNFSF10 gene increased many times, which confirms the ability of the vector is to penetrate into eukaryotic cells and express the TNFSF10 gene at the mRNA level.
  • the presented results also confirm the feasibility of using the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 to increase the expression level of the TNFSF10 gene in eukaryotic cells.
  • D341 Med cell culture was grown under standard conditions (37 ° C, 5% 002) in MEM culture medium supplemented with 10% bovine embryo serum (Gibco). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at 5x10 4 cells / well.
  • the reagent Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection is Transfection with a gene therapy DNA vector
  • GDTT1.8NAS12-BCL2 expressing the human BCL2 gene was performed as described in example 10.
  • a control we used a culture of human medulloblastoma cells D341 Med transfected with the gene therapeutic DNA vector go GDTT1.8NAS12, which does not carry the target gene (cDNA of the BCL2 gene before and after transfection with gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not contain the insert of the target gene is not shown in the figures).
  • Isolation of RNA, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 10, except for oligonucleotides with different sequences from example 10.
  • oligonucleotides BCL2_SF and BCL2_SR were used:
  • the length of the amplification product is 164 bp.
  • Cell culture A-172 was grown under standard conditions (37 ° C, 5% C0 2 in culture medium DMEM with is supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco). For 90% confluency, 24 hours prior to formulation of transfection, cells were plated in 24 -well plate at the rate of 5x1 0 4 cells / well Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection.
  • GDTT1.8NAS12-HGF expressing the human HGF gene was carried out as described in Example 10.
  • a control we used a culture of A-172 human astrocytoma cells transfected with the 25 DNA gene therapy vector GDTT1.8NAS12, which did not carry the target gene (cDNA of the gene HGF before and after transfection with the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, which does not contain the insert of the target gene, not shown in the figures).
  • RNA isolation, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 10, except for oligonucleotides with different sequences from example 10.
  • oligonucleotides HGF_SF and HGF_SR were used: HGF_SF ACCCT GGT GTTT CACAAGC A,
  • the length of the amplification product is 182 bp.
  • Example 18 Confirmation of the ability of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the target gene, namely the IL2 gene, to penetrate into eukaryotic cells and confirmation of its functional activity at the level of mRNA expression of the target gene.
  • This example also demonstrates the feasibility of a method for using a gene therapy DNA vector carrying the target gene.
  • GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the human IL2 gene.
  • the amount of mRNA was determined by the dynamics of accumulation of cDNA amplicons in the real-time PCR reaction.
  • Cell culture ATCC-BXS0117 was grown under standard conditions (37 ° C, 5% 002) in DMEM.F12 culture medium (Gibco) 1: 1 supplemented with 10% bovine embryo serum (Gibco) and using the Growth Kit for Neural Progenitor Cell Expansion (ATCC ACS-3003). To obtain 90% confluence, 24 hours prior to transfection, cells were seeded in a 24-well plate at a rate of 5x10 4 kpets / well. The Lipofectamine 3000 reagent (ThermoFisher Scientific, USA) was used for transfection. Transfection with a gene therapy DNA vector
  • GDTT1.8NAS12-IL2 expressing the human IL2 gene was carried out as described in example 10.
  • Isolation of RNA, reverse transcription reaction and real-time PCR were performed as described in example 10, with the exception of oligonucleotides with different sequences from example 10.
  • To amplify the cDNA specific for the human IL2 gene we used the IL2_SF and IL2_SR oligonucleotides:
  • IL2 _ SF ACAGGATGCAACTCCTGTCT IL2_SR GCATCCTGGT GAGTTTGGGA.
  • the length of the amplification product is 192 bp.
  • culture medium was added to 1 ⁇ g of DNA vector dissolved in TE buffer to a final volume of 60 ⁇ l, then 5 ⁇ l of SuperFect Transfection Reagent was added and gently mixed by pipetting five times. The complex was incubated at room temperature for 10-15 minutes. Next, the culture medium was taken from the wells, the wells were washed with 1 ml of PBS buffer. To the resulting complex was added 350 ⁇ l of medium containing 10 ⁇ g / ml of gentamicin, gently mixed and added to the cells. The cells were incubated with the complex for 2-3 hours at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 .
  • the medium was carefully removed, the cell monolayer was washed with 1 ml of PBS buffer. Then added a medium containing 10 ⁇ g / ml gentamicin, and incubated for 24-48 hours at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 .
  • DDC protein was quantified by solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ELISA Kit for Dopa Decarboxylase (DDC) (SEG474Hu Cloud-Clone Corp., USA) according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of DDC protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was no less than 0.61 ng / ml, the measurement range was from 1.56 ng / ml to 100 ng / ml.
  • Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. 11.
  • Example 20 Confirmation of the efficiency and feasibility of the method of using the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the IL10 gene to increase the expression of the IL10 protein in mammalian cells.
  • the change in the amount of protein in the culture of human neuroblastoma cells IMR-32 (ATCC CCL-127) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the human IL10 gene was evaluated.
  • the cells were isolated and grown as described in example 11. For transfection, a 6th generation SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Germany) was used.
  • IL10 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ELISA Kit for Interleukin 10 (IL10) (SEA056Hu, Cloud-Clone Corp., USA), according to the manufacturer's method with optical detection. density using an automatic biochemical and enzyme immunoassay analyzer ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IL10 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was at least 2.8 pg / ml, the measurement range was from 7.8 pg / ml to 500 pg / ml.
  • Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. 12.
  • Transfection Reagent 6th generation (Qiagen, Germany).
  • a control we used an aqueous solution of dendrimers without a DNA vector (A), a DNA vector GDTT1.8NAS12 that does not contain the IL13 gene cDNA (B), as transfected agents, a DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the human IL13 gene ( WITH).
  • Preparation of the DNA-dendrimer complex and transfection of human glioblastoma cell culture U-118 MG was performed as described in example 19. After transfection, 0.1 ml of 1N HCl was added to 0.5 ml of culture fluid, mixed thoroughly and incubated for 10 minutes at room temperature.
  • the quantitative determination of the IL13 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ELISA Kit for Interleukin 13 (IL13) (SEA060Hu, Cloud-Clone Corp., USA), according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell (Awareness Technology Inc., USA). The numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IL13 protein included in the kit.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the sensitivity of the method was at least 6.7 5 pg / ml, the measurement range was from 15.6 pg / ml to 1000 pg / ml.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The plots obtained as a result of the analysis are presented in Fig. 13.
  • the change in the amount of IFNB1 protein in the lysate of the culture of human neuroblastoma cells SH-SY5Y (ATCC CRL-2266) after transfection of these cells with a DNA vector was evaluated GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the human IFNB1 gene.
  • the cells were cultured as described in Example 13.
  • the 6th generation SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Germany) was used for transfection.
  • As a control we used an aqueous solution of dendrimers without a DNA vector (A), a DNA vector GDTT1.8NAS12 without cDNA of the IFNB1 gene (B), as transfected agents, a DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the human IFNB1 gene ( WITH).
  • Preparation of the DNA-dendrimer complex and transfection of the culture of human neuroblastoma cells SH-SY5Y was performed as described in example 19.
  • IFNB1 protein The quantitative determination of IFNB1 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ELISA Kit for Interferon Beta (IFNb) (SEA222Hu, Cloud-Clone Corp., USA) according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • IFNb Interferon Beta
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IFNB1 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was at least 2.7 pg / ml, measurement range - from 7.8 pg / ml to 500 pg / ml.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. fourteen.
  • the change in the amount of TNFRSF4 protein in the lysate of the culture of human astroglia SVG p12 cells (ATCC CRL-8621) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 carrying the human TNFRSF4 gene was evaluated.
  • the cells were cultured as described in Example 14.
  • TNFRSF4 protein Quantitative determination of TNFRSF4 protein was carried out by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human 0X40 ELISA Kit (ab231926, Abeam, USA) according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell (Awareness Technology Inc., USA) ...
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of TNFRSF4 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was at least 23 pg / ml, the measurement range was from 46.9 pg / ml to 3000 pg / ml.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for Statistical Processing and Data Visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. fifteen.
  • TNFSF10 protein in the lysate of neuroectodermal human brain tumor cells PFSK-1 (ATCC number CRL-2060) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 carrying the human TNFSF10 gene 25 was evaluated.
  • the cells were cultured as described in Example 15.
  • the 6th generation SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Germany) was used for transfection.
  • An aqueous solution of dendrimers was used as a control.
  • DNA vector (A) DNA vector GDTT1.8NAS12, not containing TNFSF10 gene cDNA (B), as transfected agents - DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10 carrying the human TNFSF10 gene (C).
  • Preparation of the DNA-dendrimer complex and transfection of neuroectodermal human brain tumor cells with PFSK-1 was performed as described in Example 19.
  • TNFSF10 protein Quantitative determination of the TNFSF10 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human TRAIL / TNFSF10 Quantikine ELISA Kit (DTRL00, R&D Systems, Inc., USA) according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of TNFSF10 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was at least 7.87 pg / ml, the measurement range was from 15.6 pg / ml to 1000 pg / ml.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version according to 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. sixteen.
  • Transfection Reagent 6th generation (Qiagen, Germany).
  • A a DNA vector GDTT1.8NAS12 without cDNA of the BCL2 gene
  • B a DNA vector GDTT1.8NAS12 without cDNA of the BCL2 gene
  • C transfected agents - DNA vector GDTT1 .8NAS12-BCL2 carrying the human BCL2 gene
  • Preparation of the DNA-dendrimer complex and transfection of human medulloblastoma cell culture D341 Med was performed as described in example 19. After transfection, 0.1 ml of 1N HCl was added to 0.5 ml of culture fluid, mixed thoroughly and incubated for 10 minutes at room temperature. Then the mixture was neutralized by adding 0.1 ml of 1.2M NaOH / 0.5M HEPES (pH 7-7.6) and mixed thoroughly. The supernatant was taken and used to quantify the target protein.
  • BCL2 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ELISA Kit for ⁇ -Cell Leukemia / Lymphoma 2 (Bcl2) (SEA778Hu, Cloud-Clone Corp., USA) according to the manufacturer's procedure with optical density detection using an automatic biochemical and a ChemWell enzyme immunoassay analyzer (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of BCL2 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was not less than 0.061 ng / ml, the measurement range was from 0.156 ng / ml to 10 ng / ml.
  • Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. 17.
  • the change in the amount of HGF protein in the culture lysate of human brain astrocytoma cells A-172 (ATCC CRL-1620) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF carrying the human HGF gene was evaluated.
  • the cells were cultured as described in Example 17.
  • the 6th generation SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Germany) was used for transfection.
  • As a control we used an aqueous solution of dendrimers without a DNA vector (A), a DNA vector GDTT1.8NAS12 without cDNA of the HGF gene (B), as transfected agents, a DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF carrying the human HGF gene ( WITH).
  • A a DNA vector
  • B DNA vector GDTT1.8NAS12 without cDNA of the HGF gene
  • a DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF carrying the human HGF gene
  • HGF protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the Human HGF ELISA Kit (ab100534, Abeam, USA) according to the manufacturer's procedure with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell (Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of HGF protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was at least 3 pg / ml, the measurement range was from 2.74 pg / ml to 2000 pg / ml.
  • Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. 18.
  • Example 27 Confirmation of the efficiency and feasibility of the method of using the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the IL2 gene to increase the expression of the IL2 protein in mammalian cells.
  • the change in the amount of IL2 protein in the lysate of the culture of human neuronal progenitor cells ATCC-BXS0117 (ATCC ACS-5003) after transfection of these cells with the DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the human IL2 gene was evaluated.
  • the cells were cultured as described in Example 18.
  • the 6th generation SuperFect Transfection Reagent (Qiagen, Germany) was used for transfection.
  • As a control we used an aqueous solution of dendrimers without a DNA vector (A), a DNA vector GDTT1.8NAS12 that does not contain the IL2 gene cDNA (B), as transfected agents, a DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the human IL2 gene ( WITH).
  • A DNA vector
  • B DNA vector GDTT1.8NAS12 that does not contain the IL2 gene cDNA
  • a DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the human IL2 gene WITH.
  • the preparation of the DNA-dendrimer complex and the transfection of human neuronal progenitor cells ATCC-BXS0117 were performed as described in Example 19.
  • the quantitative determination of the IL2 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ELISA Kit for Interleukin 2 (IL2) (SEA073Hu, Cloud-Clone Corp., USA) according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme-linked immunosorbent assay ChemWell ( Awareness Technology Inc., USA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • IL2 Interleukin 2
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IL2 protein included in the kit.
  • the sensitivity of the method was at least 5.9 pg / ml, the measurement range was from 15.6 pg / ml to 1000 pg / ml.
  • Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. nineteen.
  • IFNB1 protein In order to analyze the change in the amount of IFNB1 protein, three patients were injected into the skin of the forearm with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the IFNB1 gene and in parallel were injected with placebo, which was a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12, which did not contain the cDNA of the IFNB1 gene.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the IFNB1 gene were injected in an amount of 1 mg for each genetic construct by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 3 mm.
  • the volume of the injected solution of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the IFNB1 gene is 0.5 ml for each genetic construct.
  • the foci of injection of each genetic construct were located on the forearm at a distance of 8-10 cm from each other.
  • Biopsy samples were taken on the 2nd day after the introduction of genetic constructs of gene therapy DNA vectors. Biopsies were taken from the skin areas of patients in the area of injection of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1 carrying the IFNB1 gene (I), the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) (II), as well as from intact skin areas (III), using a device for taking a biopsy Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Italy). The skin of patients in the biopsy sampling area was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution. The biopsy sample size was about 10 cubic meters. mm, weight - about 11 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized until a uniform suspension was obtained.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 min at 14000g.
  • the supernatant was taken and used for the quantitative determination of the target protein by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IFNB1 protein included in the kit.
  • Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). according to the manufacturer's method with optical density detection using an automatic biochemical and enzyme immunoassay analyzer ChemWell (Awareness Technology Inc., USA). The analysis plots are shown in FIG. twenty.
  • GDTT1.8NAS12-IFNB1 confirms the feasibility of the method its use, in particular with the intradermal administration of a gene therapy DNA vector into human tissue.
  • Example 29 Confirmation of the efficiency and feasibility of the method of using the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the IL13 gene to increase the expression of the IL13 protein in human tissues.
  • the change in the amount of IL13 protein in human muscle tissue was assessed upon the introduction of the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the target gene, namely, human IL13 gene
  • the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the target gene namely, human IL13 gene
  • three patients were injected into the gastrocnemius muscle tissue with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the IL13 gene with a transport molecule, and in parallel were injected with placebo, which was a gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, not containing cDNA of the IL13 gene with a transport molecule.
  • Gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the IL13 gene was injected in an amount of 1 mg for each genetic construct by the tunnel method with a 30G needle to a depth of about 10 -12 mm.
  • the volume of the injected solution of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the IL13 gene is 1 ml for each genetic construct.
  • the foci of injection of each genetic construct were located medially at a distance of 8-10 cm from each other.
  • Biopsy samples were taken on the 2nd day after the introduction of genetic constructs of gene therapy DNA vectors. Biopsies were taken from areas of the muscle tissue of patients in the area of injection of gene therapy DNA vector GDTT 1.8NAS12-IL1 3 carrying the IL13 gene (I), gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) (II), as well as from an intact area of the gastrocnemius muscle ( III) using a MAGNUM biopsy device (BARD, USA). The skin of patients in the biopsy sampling area was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution. The biopsy sample size was about 20 cc. mm, weight - about 22 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized until a homogeneous suspension was obtained.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 min at 14000g. The supernatant was taken and used to quantify the target protein.
  • the quantitative determination of the IL13 protein was carried out by the method of enzyme-linked immunosorbent assay, as described in example 21.
  • the numerical value of the concentration was determined using a calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IL13 protein included in the kit.
  • Statistical processing of the results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https: // www. R-proiect.org/). The analysis plots are shown in Figs. 21.
  • the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the IL2 gene were injected in an amount of 1 mg for each genetic construct by the tunnel method with a 30G needle to a depth of 3 mm.
  • the volume of the injected solution of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) and the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the IL2 gene is 0.5 ml for each genetic construct.
  • the foci of injection of each genetic construct were located on the forearm at a distance of 8-10 cm from each other.
  • Biopsy samples were taken on the 2nd day after injection of 5 genetic constructs of gene therapy DNA vectors. Biopsies were taken from the skin areas of patients in the area of injection of the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the IL2 gene (I), the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12 (placebo) (II), as well as from intact skin areas (III) using a device for taking a biopsy Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Italy). The skin of patients in the biopsy sampling area was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution. The biopsy sample size was about 10 is cubic meters. mm, weight - about 11 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized until a homogeneous suspension was obtained.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 min at 14000g. The supernatant was taken and used for the quantitative determination of the target protein by enzyme-linked immunosorbent assay, as described in example 27.
  • the numerical value of the concentration was determined using a 25 calibration curve constructed from standard samples with a known concentration of IL2 protein included in the kit. Statistical processing of the obtained results was carried out using software for statistical processing and data visualization R, version 3.0.2 (https://www.r-project.org/). The analysis plots are shown in FIG. 22.
  • GDTT1.8NAS12-I2 confirms the feasibility of the method of its use, in particular, with the intradermal injection of a gene therapy DNA vector into human tissue.
  • the primary culture of human fibroblasts was isolated from biopsies of the patient's skin. Using an Epitheasy 3.5 skin biopsy device (Medax SRL, Italy), a skin biopsy sample was taken from an area protected from ultraviolet radiation, namely behind the auricle or from the lateral inner surface in the elbow joint area, about 10 sq. mm, weighing about 11 mg. The patient's skin was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution. Primary cell culture cultivation was performed at 37 ° C in an atmosphere containing 5% C0 2 in DMEM medium with 10% fetal calf serum and ampicillin, 100 U / ml. Subculture of culture and change of culture medium was carried out every 2 days.
  • the total duration of culture growth did not exceed 25-30 days. An aliquot containing 5x10 4 cells was taken from the cell culture. The patient's fibroblast culture was transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the IL10 gene or placebo - the vector GDTT1.8NAS12 not carrying the target IL10 gene.
  • Transfection was carried out using a cationic polyethyleneimine polymer JETPEI (Polyplus Transfection, France) according to the manufacturer's instructions. Cells cultured for 72 hours and then administered to the patient. The introduction to the patient of a culture of autologous fibroblasts of this patient, transfected with the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10, and a placebo, representing a culture of autologous fibroblasts of the patient, transfected with the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12, was carried out by tunneling method into the forearm region 13 mm long with a 30G needle to a depth of about 3 mm.
  • JETPEI Polyplus Transfection, France
  • the concentration of modified autologous fibroblasts 10 in the injected suspension was approximately 5 million cells per 1 ml of suspension, the number of injected cells did not exceed 15 million.
  • the foci of autologous fibroblast culture injection were located at a distance of 8-10 cm from each other.
  • Biopsy samples were taken on the 4th day after the injection of is culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the target gene, namely, the IL10 gene and placebo. Biopsies were taken from the patient's skin areas in the zone of administration of the culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL10 carrying the target gene, namely, the IL10 (C) gene, of the culture of autologous fibroblasts transfected with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.
  • 8NAS12 not carrying the target IL10 gene (placebo) (B), and 25 also from intact skin areas (A), using an Epitheasy 3.5 biopsy device (Medax SRL, Italy).
  • the skin in the biopsy sampling area of patients was preliminarily washed with sterile saline and anesthetized with lidocaine solution.
  • the size of the biopsy sample was about 10 cubic meters mm, weight - about 11 mg.
  • the sample was placed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and homogenized until a homogeneous suspension was obtained.
  • the resulting suspension was centrifuged for 10 min at 14000g. The supernatant was collected and used to quantify the target protein as described in Example 12.
  • Polyethyleneimine Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI Polyplus Transfection, France
  • GDTT1.8NAS12-DDC Equimolar mixture of gene therapy DNA vectors GDTT1.8NAS12-DDC, GDTT1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12-HGF, GDTT1.8NAS12- TNFSF10, GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 in a proportion of 30 ⁇ g each vector was dissolved in sterile Nuclease-Free grade water.
  • DNA-cGMP grade in-vivo-jetPEI complexes were prepared in accordance with the manufacturer's recommendations.
  • the volume of the intramuscularly injected solution was 0.15 ml with a total amount of DNA of 150 ⁇ g.
  • the solution was injected using an insulin syringe. 2 days after the procedure, the rats were decapitated.
  • Samples were taken on day 2 after the introduction of 10 gene therapy DNA vectors.
  • the biopsy material was taken from the areas of the right thigh muscle of all animals: in the area of administration of a mixture of five gene therapy DNA vectors carrying the DDC, BCL2, HGF, TNFSF10, TNFRSF4 genes (group 1), in the area of placebo is administration (group 2), and from areas of muscle tissue of the right thigh muscle of animals that were not subjected to any manipulations (group 3).
  • Example 19 Quantification of DDC Protein
  • Example 25 Quantification of BCL2 Protein
  • Example 26 Quantification of HGF Protein
  • Example 24 Quantification of TNFSF10 Protein
  • example 23 Quantification of TNFRSF4 protein
  • DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the IL13 gene was assessed by the change in the accumulation of mRNA of the target IL13 gene in mononuclear cells of bovine peripheral blood after 48 hours after their transfection with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13 carrying the human IL13 gene.
  • Bovine peripheral blood mononuclear cells were isolated from 50 ml of venous blood by centrifugation in a gradient of 1.077 Ficoll solution (Paneko, P052n) and cultured in RPMI Media 1640 medium (GIBCO®, 11875-085) supplemented with 10% Horse Serum (ATCC® 30 -2040 TM) under standard conditions.
  • the amount of PCR products - cDNA of the IL13 and ACT genes obtained as a result of amplification was estimated in real time using the Bio-RadCFXManager 2.1 thermocycler software. (Bio-Rad, USA). The analysis plots are shown in FIG. 25.
  • Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-DDC or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL10, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL13, or NASi strain / Escherichia-G13 .8NAS12-IFNB1, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, or Escherichia coli strain JM1 10-NAS / GDTT1.8NAS12- TNFSF10, or Escherichia coli strain JM110-
  • NAS / GDTT1.8NAS12-BCL2 or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-HGF, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL2, carrying a gene therapy DNA vector, and a method for its preparation.
  • GDTT1.8NAS12 carrying a target gene selected from the group of genes: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, namely strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-DDC, or strain
  • Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1 or strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-BCL2 8NAS12-HGF, or Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1: 8NAS12-IL2 carrying a gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC or GDTT1 .8NAS12-IL10 or GDTT1 .8NAS12-IL13 or GDTT 1.8NAS or GDTT1.8NAS or GDTT1.8NAS or GDTT1.8NAS -TNFRSF4 or GDTT1.8NAS12-TNFSF10 or GDTT1.8NAS12-BCL2 or GDTT1.8NAS12-HGF or GDTT1.8NAS
  • GDTT1.8NAS12-IL10 or DNA vector GDTT1.8NAS12-IL13, or DNA vector GDTT1.8NAS12-IFNB1, or DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, or DNA vector GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or DNA vector GDTT1.8NAS12-BCL2, or DNA vector GDTT1.8NAS12-HGF, or DNA vector
  • GDTT1.8NAS12-IL2 after which the cells are plated on Petri dishes with agar selective medium containing yeast extract, peptone, 6% sucrose, and 10 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • Escherichia coli JM110-NAS strain for the development of a gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12 or gene therapy DNA vectors based on it with the possibility of positive selection without the use of antibiotics was obtained by constructing a linear DNA fragment containing a regulatory element 64 bp RNA-in transposon TPU for selection without antibiotics, sacB levansacharase gene, the product of which provides selection on a sucrose-containing medium with a size of 1422 bp, chloramphenicol resistance gene catR, required for selection of strain clones, in which underwent homologous recombination of 763 bp.
  • NCIMB 43543 deposit date 01/06/2020; strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL10 - registration Ns VKPM B- _, date of deposit
  • NCIMB 43540 deposit date 01/06/2020; strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IL13 - registration Ns VKPM B- _, date of deposit
  • NCIMB 43542 deposit date 01/06/2020; strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-IFNB1 - registration Ns VKPM B-13534, date of deposition 11/27/2019; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns NCIMB 43525, deposit date 11/28/2019; strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 - registration Ns VKPM B- _, date of deposit
  • NCIMB 43539 deposit date 01/06/2020; strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-BCL2 - registration Ns VKPM B- _, date of deposition 01/14/2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns
  • NCIMB 43546 deposit date 01/06/2020; strain Escherichia coli JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-HGF - registration Ns VKPM B- _, date of deposit
  • NCIMB 43544 deposit date 01/06/2020. Example 35.
  • GDTT1.8NAS12-DDC SEQ ID N21
  • GDTT 1.8NAS12-IL10 SEQ ID Ns2
  • GDTT1 .8NAS12-IL13 SEQ ID Ns3
  • GDTT1.8NAS12-IFNB1 SEQ ID N ° 4
  • GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4 SEQ ID N ° 5
  • GDTT1.8NAS12-TNFSF10 SEQ ID N ° 6
  • GDTT1.8NAS12- BCL2 SEQ ID N27
  • G DTT 1.8NAS12-HGF SEQ ID N28
  • GDTT1.8NAS12-IL2 SEQ ID N29
  • NAS / GDTT1.8NAS12-IL2 was obtained on the basis of the Escherichia coli JM110-NAS strain (Genetic Diagnostics and Therapy 21 Ltd, Great Britain) according to example 34 by electroporation of the competent cells of this strain with the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC, or GDTT1.8NAS12 -IL10, or GDTT 1.8NAS1 2-IL13, or GDTT1 .8NAS12-IFNB1, or GDTT 1.8NAS1 2-TNFRSF4, or GDTT1.8NAS12-TNFSF10, or GDTT 1.8NAS12-BCL2, or GDTT 1.8NAS12-HGF, or
  • GDTT1.8NAS12-IL2 carrying the target gene, namely DDC, or IL10, or IL13, or IFNB1, or TNFRSF4, or TNFSF10, or BCL2, or HGF, or IL2, followed by plating the transformed cells on Petri dishes with agar selective medium, containing yeast extract, peptone, 6% sucrose and selection of individual clones.
  • Fermentation of the obtained Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-DDC carrying the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC was carried out in a 10 L fermenter, followed by isolation of the gene therapeutic DNA vector GDTT1 .8NAS12-DDC.
  • a medium was prepared containing, per 10 L: 100 g tryptone, 50 g yeast extract (Becton Dickinson, USA), brought to 8800 ml with water and autoclaved at 121 ° C for 20 min, then added 1200 ml of 50% (w / v) sucrose. Then, a seed culture of the Escherichia coli strain JM110-NAS / GDTT1.8NAS12-DDC in a volume of 100 ml. Incubated in an incubator shaker for 16 h at 30 ° C.
  • the seed culture was transferred to a Techfors S fermenter (Infors HT, Switzerland), grown until the stationary phase was reached.
  • the control was carried out by measuring the optical density of the culture at a wavelength of 600 nm.
  • the cells were pelleted by centrifugation for 30 min at 5000-10,000 days. The supernatant was removed, the cell mass was resuspended in 10% by volume of phosphate-buffered saline. They were re-centrifuged for 30 min at 5000-1 OOOOd.
  • the solution was centrifuged for 20-30 min at 15000 g, then filtered through a membrane filter with pores of 0.45 ⁇ m (Millipore, United States). Then ultrafiltration was carried out through a membrane with a cutoff size of YOkDa (Millipore, USA) and diluted to the initial volume buffer 25 mM TrisCI, pH 7.0. The operation was repeated three to four times. The solution was applied to a column with 250 ml DEAE sepharose HP sorbent (GE, USA) equilibrated with a solution of 25 mM TrisCI, pH 7.0.
  • the column was washed with three volumes of the same solution, and then the gene therapy DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC was eluted with a linear gradient from a 25 mM TrisCI solution, pH 7.0 to a 25 mM TrisCI solution, pH 7.0, 1 M NaCI in a volume of five column volumes. ... Elution was monitored by the optical density of the descending solution at 260 nm. Chromatographic fractions containing the gene therapeutic DNA vector GDTT1.8NAS12-DDC were pooled and gel filtration was performed on a Superdex 200 sorbent (GE, USA). The column was equilibrated with PBS.
  • the created gene therapeutic DNA vector with the target gene can be used for introduction into the cells of animals and humans, characterized by reduced or insufficient expression of the protein encoded by this gene, thus providing a therapeutic effect.
  • the problem posed in this invention is solved, namely: the design of gene therapy DNA vectors to increase the level of expression of genes DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, combining the following properties:
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CNS central nervous system
  • EEM experimental encephalomyelitis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Создан генотерапевтический ДНК -вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз. Каждый из созданных генотерапевтических ДНК -векторов за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п. н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген.

Description

ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ДНК-ВЕКТОР
Область техники
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии.
Уровень техники Генная терапия — это современный медицинский подход, направленный на лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения нового генетического материала в клетки пациента с целью компенсации или подавления функции мутантного гена и/или исправления генетического дефекта. Конечным продуктом экспрессии гена может являться молекула РНК или белка. Однако осуществление большей части физиологических процессов в организме связано с функциональной активностью белковых молекул, тогда как молекулы РНК являются либо промежуточным продуктом в синтезе белков, либо осуществляют регуляторные функции. Таким образом, целью генной терапии является, в большинстве случаев, введение в организм генов, обеспечивающих транскрипцию и последующую трансляцию белковых молекул, кодируемых этими генами. В рамках описания настоящего изобретения под экспрессией гена подразумевается продукция белковой молекулы, аминокислотная последовательность которой кодируется этим геном.
Гены DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, входящие в группу генов, играют ключевую роль в ряде процессов в организме человека и животных. Показана связь низких/недостаточных концентраций белков, кодируемых этими генами с различными неблагоприятными состояниями человека, которая, в ряде случаев, подтверждена нарушениями в нормальной экспрессии генов, кодирующих эти белки. Таким образом, генотерапевтическое повышение экспрессии гена, выбранного из группы генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, обладает потенциалом для коррекции различных состояний человека и животных. Ген DCC (Dopa decarboxylase, Gene ID: 1644) кодирует фермент декарбоксилазу ароматических L-аминокислот (ДАА), который катализирует реакцию декарбоксилирования, обеспечивая биосинтез дофамина из L-3,4- дигидроксифенилаланина (L-DOPA), серотонина из L-5- гидрокситриптофана и триптамина из L-триптофана. L-DOPA получается из тирозина в реакции, катализируемой ферментом тирозин гидроксилазой. Поскольку дофамин не проникает сквозь гематоэнцефалический барьер L-DOPA применяется как фармакологический препарат для компенсации дефицита дофамина у пациентов с Болезнью Паркинсона, купируя, таким образом, симптомы Болезни Паркинсона. Применение L-DOPA дает заметный положительный эффект только на начальных стадиях развития Болезни Паркинсона. Это связано с тем, что, несмотря на значительное снижение числа дофаминергических окончаний в стриатуме, в них все еще содержится достаточное количество ДАА для поддержания необходимого уровня дофамина (Marsden and Parkes, 1977). Однако по мере прогрессирования болезни уровень ДАА падает, поэтому необходимо увеличивать дозу и частоту применения L-DOPA для достижения желаемого клинического эффекта (Nagatsu et al., 1979). В этой связи, генная терапия путем доставки гена, кодирующего ДАА, в стриатум рассматривается как подход для улучшения клинического ответа на терапию L-DOPA при прогрессировании Болезни Паркинсона. Так на модели БП, вызванной введением МРТР, у обезьян была проведена комплексная терапия, включающая доставку рекомбинантного гена DCC человека в стриатум с помощью адено- ассоциированного вируса и систематическое применение L- DOPA (Bankiewicz et al., 2000, 2006). Полученные результаты подтвердили экспрессию целевого гена в течение по крайней мере 6-ти лет после введения и показали восстановление способности клеток в стриатуме превращать L-DOPA в дофамин. Это приводило к тому, что желаемые терапевтические эффекты у животных, которым был введен трансген достигались при существенно меньших дозах L-DOPA. Уменьшение дозы L-DOPA также снижало побочные эффекты его применения. В похожем исследовании положительные эффекты доставки гена DCC на модели Болезни Паркинсона у обезьян удалось наблюдать на протяжении 15 лет (Sehara et al., 2017). В настоящее время несколько исследовательских центров проводят клинические испытания генной терапии конструкцией, кодирующей ген DCC, на основе адено- ассоциированного вируса серотипа 2 (Eberling et al., 2008; Muramatsu et al., 2010; Mittermeyer et al., 2012; Valles et al., 2010).
Interleukin 10 (IL-10) (Gene ID: 3586). Интерлейкин 10 относится к иммуномодулирующим цитокинам и продуцируется преимущественно моноцитами и в меньшей степени лимфоцитами. Он оказывает разнообразные воздействия на регуляцию иммунитета и воспаления. На модели экспериментального энцефаломиелита (ЭЭМ), вызванного введением крысиного гликопротеина миелина (MOG1-125), конструкцию с геном интерлейкина 10 с точечной мутацией IL- 10F129S вводили интратекально (Sloane et al., 2008). Результаты анализа экспериментальных и контрольных животных показали торможение развития паралича, замедление потери массы тела, снижение проникновения клеток воспалительного ряда в паренхиму мозга, подавление активации астроцитов ЦНС и подавление аллодении (болевой чувствительности к неболевым стимулам). Помимо экспериментального энцефаломиелита, генная терапия с использованием гена, кодирующего IL-10, была использована на моделях хронической боли, вызванной перевязкой седалищного нерва (Dengler et al., 2014; Milligan et al., 2006) или введением таксола (Ledeboer et al., 2007). При этом в этих работах доставка осуществлялась интратекально с помощью плазмидного вектора. Анализ эффекта генной терапии на индукцию хронической боли проводили с помощью теста на механическую аллодению. Во всех исследованных случаях, доставка гена, кодирующего IL-10, приводила пороговые значения чувствительности к механическому раздражению к уровню нормальных животных. В качестве основного механизма действия такой генной терапии на моделях хронической боли рассматривается подавление интерлейкином 10 активации астроцитов и клеток микроглии в спинном мозге (Lau et al., 2012). Interleukin 13 (IL-13) (Gene ID: 3596). Интерлейкин 13 относится к иммуномодулирующим цитокинам и продуцируется преимущественно активированными Т-хелперными клетками 2- го типа. Он регулирует некоторые стадии созревания и дифференцировки антителопродуцирующих В-клеток, обеспечивает переключение В-клеток на продукцию антител IgE изотипа и подавляет активность макрофагов, ингибируя синтез провоспалительных цитокинов и хемокинов (Мао et al., 2018). IL- 13, как показывают последние исследования, играет определенную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, в том числе и рассеянного склероза (Мао et al. , 2018). На модели индуцированной купризоном демиелинизации ген, кодирующий IL-13, доставляли с помощью лентивирусного вектора в утолщение мозолистого тела в головном мозге (Guglielmetti et al., 2016). Это приводило к изменению ответа микроглии и макрофагов на демиелинизирующее повреждение. В частности, IL-13 меняет фенотип микроглии и инфильтрующих ткани мозга макрофагов, микроокружение, способствующее развитию воспалительной реакции. Генная терапия с использованием конструкции, кодирующей IL-13, таким образом, способствует уменьшению последствий демиелинизации, вызванной купризоном.
Interferon beta 1 (INFB1) (Gene ID: 3456). Этот ген кодирует цитокин, который принадлежит к семейству интерферонов, принимающих участите в активации ответа врожденного иммунитета на проникновение внутрь организма патогена. IFNB1 важен для защиты преимущественно от вирусных инфекций. В случае с рассеянным склерозом рекомбинантный IFNB1 применяется как препарат первой линии для облегчения симптомов хронического воспаления и демиелинизации при рецидивирующей форме заболевания (Moreno et al., 2010). На модели экспериментального энцефаломиелита (ЭЭМ), вызванного введением пептида гликопротеина миелина (MOG35-55) (Hamana et al., 2017), через 7 дней после индукции вводили плазмидный вектор, кодирующий мышиный INFB, в хвостовую вену экспериментальных животных. Введение конструкции приводило к существенному снижению выраженности симптомов ЭЭМ спустя месяц. Кроме того, анализ проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) показал, что введение конструкции подавляет нарушения ГЭБа характерные для модели ЭЭМ. Гистологический анализ позволил установить, что в спинной мозг мышей, подвергнутых генной терапии, проникает гораздо меньше клеток 5 воспалительного ряда чем в контрольных животных. Авторы работы пришли к заключению, что однократного введения конструкции, кодирующей IFNB, достаточно для долгосрочного противовоспалительного эффекта в модели ЭЭМ.
TNF receptor superfamily member 4 (TNFRSF4, 0X40) (Gene ID: lo 7293) и TNF superfamily member 10 (TNFSF10, TRAIL) (Gene ID: 8743). Ген 0X40 кодирует один из белков, относящихся к суперсемейству рецепторов к факторам некроза опухоли. Нокаут этого гена подавляет апоптоз в трансформированных и опухолевых клетках. Белок, кодируемый этим геном принимает is участие в регуляции пролиферации и дифференцировки В клеток. Ген TRAIL кодирует цитокин, который принадлежит к семейству апоптоз-индуцирующих лигандов, зависимых от фактора некроза опухоли. Он индуцирует апоптоз в трансформированных и опухолевых клетках, связываясь со го своими рецепторами и активируя MAPK8/JNK, каспазы 8 и 3. На модели экспериментального энцефаломиелита (ЭЭМ), вызванного введением гликопротеина миелина (MOG) (Yellayi et al., 2011), на 8-ой день после индукции (т.е. до появления симптомов) интратекально (в большую цистерну) вводили 25 плазмиду в составе ДНК-липидного комплекса (lipoplex). Генетическая конструкция кодировала слитый белок 0X40- TRAIL. Экспрессия генетической конструкции приводила к синтезу слитого белка, который обладает иммуномодулирующим свойством. Анализ животных, в котором оценивали формирование симптомов (слабость хвоста, слабость и паралич задних конечностей и т.д.), проводили в течение 30 дней после введения плазмиды. Результаты анализа показали достоверное снижение клинических 5 проявлений ЭЭМ, а гистологический анализ подтвердил экспрессию самой конструкции в субэпиндимальной области 3- го желудочка и заметное снижение числа клеток воспалительного ряда, инфильтрующих белое вещество спинного мозга. ю В-Cell Lymphoma protein-2 (BCL2 apoptosis regulator, BCL-2) (Gene ID: 596). Ген BCL-2 кодирует белок, встраивающийся во внешнюю мембрану митохондрий и блокирующий апоптоз в некоторых типах клеток. Он регулирует клеточную гибель в условиях низкого содержания кислорода (Snyder and Chandel, is 2009). Так, крысам с церебральной ишемией, вызванной временной (1.5 часа) перевязкой срединной церебральной артерии, интратекально (в большую цистерну) сразу после индукции повреждения вводили плазмиды pCMV-bcl2 или pHRE-bcl2 в составе ДНК-липосомного комплекса (lipoplex) (Сао го et al., 2002). Белок BCL-2 локализуется во внешней мембране митохондрий, где он ингибирует действие различных проапоптотических факторов, обеспечивая, таким образом, выживание клетки. В данном случае генная терапия с использованием гена BCL-2 была направлена на повышение 5 выживаемости нейронов в области мозга, подвергнутой ишемии. В работе было проведено сравнение векторов с промотерами CMV (цитомегаловирусный промотер) и HRE (индуцируемый гипоксией промотер фактора роста эндотелия человека). В первом случае трансген должен экспрессироваться повсеместно в мозге, а во-втором - преимущественно в области затронутой ишемией. Результаты морфологического анализа показали, что обе конструкции приводили к значительному снижению числа апоптотических клеток, причем в случае с CMV 5 промотером это снижение было более существенным. Объем же инфарктной зоны достоверно снижался только в случае с CMV промотером. Полученные результаты позволили авторам заключить, что интратекальная доставка векторов с генами антиапоптотических факторов оказывает нейропротекторное ю действие при ишемическом повреждении.
Hepatocyte growth factor (HGF) (Gene ID: 3082). Фактор роста гепатоцитов - плазминогензависимый плеотропный ростовой фактор, происходящий из мезенхимных клеток (Nakamura et al., 2011). Он регулирует рост клеток, клеточную подвижность и is морфогенез различных типов клеток, включая эпителиальные и эндотелиальные. Помимо этого, он играет роль в ангиогенезе, регенерации некоторых органов и тканей, воспалительных реакциях и усилении роста отростков нервных клеток ганглиев дорзальных корешков (Maina and Klein, 1999). Также он го выполняет несколько функций в центральной (ЦНС) и периферической (ПНС) нервных системах: защищает от гибели затронутые повреждением нейроны и обеспечивает регенерацию нервных отростков в ЦНС и ПНС. Плазмидные векторы, кодирующие HGF, вводили либо внутримышечно 25 (Tsuchihara et al., 2009), либо интратекально (Hu et al., 2017) на модели перевязки седалищного нерва или его ветвей. Результаты теста на механочувствительность показали восстановление порога, при котором животные отдергивают лапу, после проведения генной терапии. Основным механизмом действия HGF на моделях хронической боли, как и в случае с интерлейкином 10, рассматривается подавление активации астроцитов и клеток микроглии в спинном мозге.
Interleukin 2 (IL-2) (Gene ID: 3558). Интерлейкин 2 - это 5 цитокин, который усиливает пролиферацию Т и В лимфоцитов после стимулирования антигеном. Помимо иммуномодуляции, IL-2 действует и как регуляторная молекула в ЦНС. Он и его рецептор продуцируется в различных областях мозга, включая гиппокамп, гипоталамус, мозжечок, неостриатум и ганглии ю дорзальных корешков (Hanisch and Quirion, 1995). Накопленные данные показывают, что IL-2 играет важную роль в нервной и нейроэндокринной регуляции организма. Также одним из проявлений IL-2 в нервной системе является его антиноцицептивная функция, как в периферических нервах, так is и в ЦНС. Он способен связываться с опиоидными рецепторами (Wang et al., 1996). На модели перевязки седалищного нерва плазмидный вектор, кодирующий IL-2, вводили интратекально спустя 30 дней после индукции хронической боли крысам (Yao et al., 2002). Анализ чувствительности к нагреванию показал, го что однократное введение конструкции вместе с липофектамином приводило к увеличению латентного периода в ответ на нагревание, и этот эффект длился в течение нескольких дней. Тот факт, что антиноцицептивный эффект трансгена блокировался налаксоном, говорит о прямом 5 действии IL-2 на опиоидные рецепторы. Авторы пришли к заключению, что генная терапия с использованием гена, кодирующего IL-2, может быть использована для облегчения невропатической боли. Таким образом, предшествующий уровень техники свидетельствует о том, гены DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 обладают потенциалом для коррекции ряда отклонений и состояний организма, 5 характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования ю нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением is кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз. го Этим обусловлено объединение генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 в рамках данного патента в группу генов. Генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков, кодируемых генами из группы DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 могут быть 25 использованы для разработки лекарственных препаратов для предотвращения и терапии различных заболеваний и патологических состояний.
Более того, приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, входящими в группу генов, связана не только с патологическими состояниями, но и с предрасположенность к их развитию. Также приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия данных белков может не проявляться в явном виде в форме патологии, которая может быть однозначно описана в рамках существующих стандартов клинической практики (например, с применением кода МКБ), однако при этом вызывать состояния, которые неблагоприятны для человека и животных и связанны с ухудшением качества жизни.
Анализ подходов для повышения экспрессии целевых генов подразумевает возможность использования различных генотерапевтических векторов. Генотерапевтические векторы разделяют на вирусные, клеточные и ДНК-векторы (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/801 83/2014). В последнее время в генной терапии всё большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих клеточным и вирусным векторам. В клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, не интегрируют в геном, производство их достаточно дешево, отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики (ДНК-вакцины) (Li L, Petrovsky N. // Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29). Тем не менее, ограничениями для использования плазмидных векторов для генной терапии являются: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в бактериальных штаммах, 2) наличие различных регуляторных 5 элементов, представленных последовательностями вирусных геномов 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку- мишень.
Известно, что Европейское агентство по лекарственным ю средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 is Committee for advanced therapies). Данная рекомендация связана, в первую очередь, с потенциальной опасностью проникновения ДНК-вектора или горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности в клетки бактерий, представленных в организме в составе нормальной или го оппортунистической микрофлоры. Помимо этого, наличие генов антибиотикорезистентности значительно увеличивает размер ДНК-вектора, что приводит к снижению эффективности его проникновения в эукариотические клетки.
Необходимо отметить, что гены антибиотикорезистентности 5 также вносят принципиальный вклад в способ получения ДНК- векторов. В случае наличия генов антибиотикорезистентности штаммы для наработки ДНК-векторов обычно культивируются в среде, содержащей селективный антибиотик, что создает риск наличия следовых количеств антибиотика в недостаточно очищенных препаратах ДНК-векторов. Таким образом, получение ДНК-векторов для генной терапии, в которых отсутствуют гены антибиотикорезистентности, связано с получением штаммов, обладающих такой отличительной особенностью как способность к стабильной амплификации целевых ДНК-векторов в среде без содержания антибиотиков.
Кроме того, Европейское Медицинское Агентство рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся нуклеотидными последовательностями геномов различных вирусов (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/ Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf). Данные последовательности, хотя и могут увеличивать уровень экспрессии целевого трансгена, однако создают риск рекомбинации с генетическим материалом вирусов дикого типа и интеграции в геном эукариотической клетки. Более того, целесообразность гиперэкспрессии того или иного гена в целях терапии остается нерешенным вопросом.
Также, существенным моментом является размер терапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104). Например, ген устойчивости к ампициллину в векторах серии pBR322, как правило, состоит из не менее чем 1000 п.н., что составляет более 20% от размера самого вектора. При этом наблюдается обратная зависимость между размером вектора и его способностью проникать в эукариотические клетки - ДНК-векторы с небольшим размером эффективней проникают в клетки человека и животных. Так, например, в серии экспериментов по трансфекции клеток HELA ДНК-векторами с размером от 383 до 4548 п.н. было показано, что разница в эффективности проникновения может достигать двух порядков (отличаться в 100 раз) (Hornstein BD et al. // PLoS ONE. 2016;11(12): e0167537.).
Таким образом, при выборе ДНК-вектора в целях безопасности и наибольшей эффективности следует отдавать предпочтение тем конструкциям, в которых не содержатся гены устойчивости к антибиотикам, последовательности вирусного происхождения и размер которых позволяет эффективно проникать в эукариотические клетки., Штамм для получения такого ДНК-вектора в количествах, достаточных для целей генной терапии, должен обеспечивать возможность стабильной амплификации ДНК-вектора с использованием питательных сред, не содержащих антибиотики.
Примером использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии является способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации по патенту US 9550998 В2. Вектор представляет собой суперскрученный плазмидный ДНК-вектор и предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из ориджина репликации, регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека. Накопление вектора проводят в специальном штамме Е. coli без использования антибиотиков за счет антисенс- комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.
Известен патент на изобретение US 10316074, описывающий способ получения белка IL2 для использования в медицинских целях. Ген, кодирующий IL2, был включен в состав рекомбинантной конструкции для экспрессии в дрожжах. Недостатком данного изобретения является использование белка IL2 вместо генотерапевтического вектора, экспрессирующего ген, кодирующий белок IL2.
Известен патент на изобретение US 6090791, в котором описывается способ повышения концентрации терапевтического белка, в частности, IL10, путем введения в целевые клетки плазмидного вектора, содержащего последовательность с неметелированными нуклеотидами цитозином и гуанином. Недостатком данного метода является ограниченное число клеток, способных индуцировать выработку целевого белка и неопределенность требований к безопасности используемого вектора.
Известен патент на изобретение US 7598058, где описаны способы получения модифицированного белка IL13, включая синтез полипептида, последовательностей ДНК, кодирующих этот ген, а также клонирование этих последовательностей в плазмидные векторы. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов, а также наличие последовательностей генов антибиотикорезистентности.
Прототипами предлагаемого решения, а именно, использования генотерапевтических подходов для повышения уровня экспрессии генов из группы DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, являются следующие патенты и заявки на получение патента:
Патент на изобретение US 4808523А, где описан плазмидный вектор, несущий ген, кодирующий IFNB1. Данный вектор позволяет повышать экспрессию IFNB1 в клетках млекопитающих. Недостатком данного изобретения является способ использования, ограниченный продукцией белка IFNB1 в условиях in vitro и отличный от генотерапевтического использования данного вектора. Также недостатком данного изобретения является наличие в составе вектора последовательностей вирусного происхождения.
Патент на изобретение RU 2678756, где описан генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCSI 10-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения. Недостатком данного изобретения является значительный размер векторной части, что может негативно отразиться на эффективности доставки ДНК-вектора в клетки. Патент на изобретение US 8647618, где описан способ доставки генотерапевтического вектора, несущего последовательность гена IL2 в составе клеток атгенутрованного штамма Salmonella typhimurium для лечения онкологических заболеваний. Недостатком данного способа является индукция иммунного ответа на повторные введения бактериальных клеток, и, соответственно, критическое снижение терапевтического эффекта, а также неопределенность требований к безопасности используемого вектора.
5 Патент на изобретение US 8389492, где описан экспрессирующий плазмидный вектор, в составе которого находится ген, кодирующий фактор роста гепатоцитов (HGF) для лечения ишемических заболеваний и заболеваний печени. В патенте описаны способы введения вектора, в том числе, в 10 виде «голой» ДНК, а также в составе липосомальных комплексов. Недостатком данного изобретения является наличие в составе вектора гена резистентности к антибиотику канамицину. is Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии группы генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 в организме человека и животных, го сочетающих в себе следующие свойства:
I) Эффективность генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках.
II) Возможность безопасного применения для генетической 25 терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов. III) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности. IV) Технологичность получения и возможность наработки генотерапевтического ДНК-вектора в промышленных масштабах.
Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011, EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80 183/2014, Committee for Advanced Therapies).
Задачей изобретения также является конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора, для наработки и производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов.
Поставленная задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC содержит кодирующую часть целевого гена DDC, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°1, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL10 содержит кодирующую часть целевого гена IL10, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NQ2, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL13 содержит кодирующую часть целевого гена IL13, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1 .8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID Ns3, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 содержит кодирующую часть целевого гена IFNB1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°4, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 содержит кодирующую часть целевого гена TNFRSF4, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID Ns5, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFSF10 содержит кодирующую часть целевого гена TNFSF10, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N26, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-BCL2 содержит кодирующую часть целевого гена BCL2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°7, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HGF содержит кодирующую часть целевого гена HGF, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N28, генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL2 содержит кодирующую часть целевого гена IL2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N 9.
Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT1 .8NAS12-IL10 или
GDTT1.8NAS12-IL13 или GDTT1.8NAS12-IFNB1 или GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4 или GDTT1 .8NAS12-TNFSF10 или GDTT1.8NAS12-BCL2 или GDTT1.8NAS12-HGF или
GDTT1.8NAS12-IL2 за счет ограниченного размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2.
В составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК- векторов: GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT1.8NAS12-IL10 или GDTT1.8NAS12-IL13 или GDTT1.8NAS12-IFNB1 или GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или GDTT 1.8NAS1 2-BCL2 или GDTT 1.8NAS12-HGF или
GDTT1.8NAS12-IL2 в качестве структурных элементов используются нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.
Создан также способ получения генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1, или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2, заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT1 .8NAS12-IL10 или GDTT1.8NAS12-IL13 или GDTT1.8NAS12-IFNB1 или GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4 или GDTT 1.8NAS12-TNFSF1 0 или GDTT1.8NAS12-BCL2 или GDTT1.8NAS12-HGF или GDTT1.8NAS12-IL2 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена DDC или IL10 или IL13 или IFNB1 или TNFRSF4 или TNFSF10 или BCL2 или HGF или IL2 клонируют в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-DDC, SEQ ID N°1, или GDTT1.8NAS12- IL10, SEQ ID NQ2 ИЛИ GDTT1.8NAS12-IL13, SEQ ID Ns3, или GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , SEQ ID N°4, или GDTT1.8NAS12- TNFRSF4, SEQ ID N°5 или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, SEQ ID N°6 или G DTT 1.8 NAS 12-BC L2 , SEQ ID N°7, или GDTT1.8NAS12- HGF, SEQ ID NQ8, или GDTT1.8NAS12-IL2, SEQ ID NQ9 соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена DDC или IL10 или IL13 или IFNB1 или TNFRSF4 или TNFSF10 или BCL2 или HGF или IL2 получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции Sail и Hindlll, или Sail и Kpnl, или BamHI и Sail, причем селекцию проводят без антибиотиков, при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, SEQ ID N°1 ДЛЯ проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
DDC-F ATCGTCGACCACCATGAACGCAAGTGAGTTCCGA, DDC-R ACCAAGCTTCTACTCCCTCTCTG, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена DDC в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и Hindlll, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL10, SEQ ID N°2 ДЛЯ проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IL10-F AGGATCCACCATGCACAGCTCAGCACTGC, IL10-R СТТ GT CG ACT С AGTTTCGT АТ СТТ С ATT GT С , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL10 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, SEQ ID N°3 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды: IL13-F AGG АТССАССАТ GC AT CCGCTCCT СААТ С ,
IL13-R СТТ GT CGACT С AGTT G ААСТ GTCCCTCG, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL13 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, SEQ ID N°4 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IFNB1-F
AAAGGATCCACCATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAA,
IFNB1-R
ТТТ GTCG ACT С AGTTTCGG AGGT ААССТ GT AAGT СТ G , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IFNB1 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, SEQ ID N°5 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
TNFRSF4-F AGGATCCACCATGTGCGTGGGGGCTCGG, TNFRSF4-R CTTGTCGACTCAGATCTTGGCCAGGGTG, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена TNFRSF4 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, SEQ ID N°6 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
TNFSF10-F AGGAT ССАСС ATGGCT AT G AT GGAGGT ССА, TNFSF10-R Т GTCG ACT CAGCC ААСТ AAAAAGGCCCCGA, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена TNFSF10 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, SEQ ID N°7 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
BCL-F ATCGTCGACCACCATGGCGCACGCTGGGAGA,
BCL-R TTCGGT АССТ САСТТ GTGGCCCA, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена BCL2 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и Kpnl, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, SEQ ID NQ8 ДЛЯ проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
HGF_F ТТТ GGATCC ACC AT GT GGGT GACCAAACT CCTGCC А, HGF_R
ААТ GTCG АССТ AT G ACT GTGGT АССТТ AT AT GTT ААААТ, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена HGF в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2, SEQ ID N°9 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IL2-F AGG АТ СС ACC AT GT АС AGG AT GC ААСТ ССТ,
IL2-R Т GTCG ACT С AAGT С AGT GTT GAG AT G AT G , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL2 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail.
Создан способ использования генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, заключающийся в трансфекции выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК- векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК- вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК- векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12 или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или в сочетании обозначенных способов. Создан способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT1.8NAS12-IL10 или GDTT1.8NAS12-IL13 или GDTT1.8NAS12-IFNB1 или GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4 или GDTT1 .8NAS12-TNFSF10 или GDTT1.8NAS12-BCL2 или GDTT1 .8NAS12-HGF или GDTT1.8NAS12-IL2, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC или штамма
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10 или штамма
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13 или штамма
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или штамма
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF или штамма Escherichia coli J 110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2.
Заявлен штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- DDC, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL10, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL13, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNB1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК- вектора, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- TNFSF10, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFSF10, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора, или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-BCL2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HGF, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК- вектора, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- IL2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
Создан способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1, или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-DDC или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IL10 или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IL13 или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 или генотерапевтический ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-BCL2 или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HGF или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IL2 получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-DDC или штамма Escherichia coli J М 110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL10 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL13 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, затем инкубируют затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 приведена схема генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli.
На фиг.1 приведены схемы, соответствующие:
Фиг. 1А - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- DDC,
Фиг. 1В - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL10,
Фиг. 1C - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL13,
Фиг. 1D - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IFNB1, Фиг. 1E - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- TNFRSF4,
Фиг. 1F - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- TNFSF10, Фиг. 1G - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1. 8NAS 12- ВС L2,
Фиг. 1 Н - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- HGF,
Фиг. II - генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL2.
На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:
EF1a рг - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1 А с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;
Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена DDC (фиг. 1А), или IL10 (фиг. 1 В), или IL13 (фиг. 1C), или IFNB1 (фиг. Ю) или TNFRSF4 (фиг. 1Е), или TNFSF10 (фиг. 1F), или BCL2 (фиг. 1G), или HGF (фиг. 1 Н), или IL2 (фиг. 11) соответственно; hGH ТА - терминатор транскрипции; pUCori - ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli;
RNA out - регуляторный элемент PHK-out транспозона Тп 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Eshcerichia coli J 110-NAS.
Отмечены уникальные сайты рестрикции. На фиг.2 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена DDC, в культуре клеток кортикальных нейронов человека HCN-2 (АТСС CRL-10742) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.2 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена DDC в культуре клеток HCN-2 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC;
2 - кДНК гена DDC в культуре клеток HCN-2 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC; 3 - кДНК гена В2М в культуре клеток HCN-2 до трансфекции
ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC;
4 - кДНК гена В2М в культуре клеток HCN-2 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.З показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена IL10, в культуре клеток нейробластомы человека IMR-32 (АТСС CCL-127) человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.З отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие: 1 - кДНК гена IL10 в культуре IMR-32 до трансфекции ДНК- вектором GDTT 1.8NAS12-IL10;
2 - кДНК гена IL10 в культуре IMR-32 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10;
3 - кДНК гена В2М в культуре IMR-32 до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL10;
4 - кДНК гена В2М в культуре IMR-32 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.4 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена IL13 в культуре клеток глиобластомы человека U-118 MG (АТСС НТВ-15) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК. На фиг.4 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена IL13 в клетках U-118 MG до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL13;
5 2 - кДНК гена IL13 в клетках U-118 MG после трансфекции
ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13;
3 - кДНК гена В2М в клетках U-118 MG до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL13;
4 - кДНК гена В2М в клетках U-118 MG после трансфекции ю ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. is На фиг.5 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена IFNB1, в культуре клеток нейробластомы человека SH-SY5Y (АТСС CRL-2266) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором го GDTT1.8NAS12-IFNB1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.5 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
25 1 - кДНК гена IFNB1 в культуре клеток SH-SY5Y до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1;
2 - кДНК гена IFNB1 в культуре клеток SH-SY5Y после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1; 3 - кДНК гена В2М в культуре клеток SH-SY5Y до трансфекции
ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1;
4 - кДНК гена В2М в культуре клеток SH-SY5Y после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1.
5 В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.6 ю показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена TNFRSF4, в культуре клеток астроглии человека SVG р12 (АТСС CRL-8621) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 с целью оценки способности is проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.6 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена TNFRSF4 в культуре клеток SVG р12 до го трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4;
2 - кДНК гена TNFRSF4 в культуре клеток SVG р12 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4;
3 - кДНК гена В2М в культуре клеток SVG р12 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4;
25 4 - кДНК гена В2М в культуре клеток SVG р12 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2 - микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. На фиг.7 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена TNFSF10, в культуре нейроэктодермальных клеток опухоли головного мозга человека PFSK-1 (АТСС number CRL-2060) человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- TNFSF10 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК. На фиг.7 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена TNFSF10 в культуре PFSK-1 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFSF10;
2 - кДНК гена TNFSF10 в культуре PFSK-1 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFSF10;
3 - кДНК гена В2М в культуре PFSK-1 до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-TNFSF10;
4 - кДНК гена В2М в культуре PFSK-1 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1 .8NAS1 2-TNFSF1 0. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
На фиг.8 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена BCL2 в культуре клеток медуллобластомы человека D341 Med (АТСС НТВ-187) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-BCL2 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
На фиг.8 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
5 1 - кДНК гена BCL2 в клетках D341 Med до трансфекции ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-BCL2;
2 - кДНК гена BCL2 в клетках D341 Med после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- BCL2;
3 - «ДНК гена В2М в клетках D341 Med до трансфекции ДНК- ю вектором GDTT1.8NAS12-BCL2;
4 - кДНК гена В2М в клетках D341 Med после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- BCL2.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под 15 номером NM 004048.2.
На фиг.9 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена HGF, в культуре клеток астроцитомы го головного мозга человека А-172 (АТСС CRL-1620) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.
25 На фиг.9 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена HGF в культуре клеток А-172 до трансфекции ДНК-вектором GDTT 1.8NAS12-HGF; 2 - кДНК гена HGF в культуре клеток А-172 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF;
3 - кДНК гена В2М в культуре клеток А-172 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF;
5 4 - кДНК гена В2М в культуре клеток А-172 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF.
В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
10
На фиг.10 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена IL2, в культуре нейрональных прогениторных клеток человека ATCC-BXS0117 (АТСС ACS- 15 5003) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL2 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК. го На фиг.10 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:
1 - кДНК гена IL2 в культуре клеток ATCC-BXS0117 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL2;
2 - кДНК гена IL2 в культуре клеток ATCC-BXS0117 после 5 трансфекции ДНК-вектором GDTT 1.8NAS12-IL2;
3 - кДНК гена В2М в культуре клеток ATCC-BXS0117 до трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL2;
4 - кДНК гена В2М в культуре клеток ATCC-BXS0117 после трансфекции ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL2. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.
5 На фиг.11 показана диаграмма концентрации белка DDC в клеточном лизате кортикальных нейронов человека HCN-2 (АТСС CRL- 10742) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC с целью оценки функциональной ю активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген DDC. is На фиг.11 отмечены следующие элементы: культура А - культура HCN-2, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура HCN-2, трансфицированных ДНК- вектором GDTT1.8NAS12; го культура С - культура HCN-2, трансфицированных ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-DDC.
На фиг. 12 показана диаграмма концентрации белка IL10 в лизате 25 культура клеток нейробластомы человека IMR-32 (АТСС CCL- 127), после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IL10.
На фиг.12 отмечены следующие элементы: культура А - культура IMR-32, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура IMR-32, трансфицированная ДНК- вектором GDTT1.8NAS12; культура С - культура IMR-32, трансфицированных ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL10.
На фиг.13 показана диаграмма концентрации белка IL13 в лизате культуры клеток глиобластомы человека U-118 MG (АТСС НТВ- 15) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-IL13 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IL13.
На фиг 13 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток U-118 MG, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура клеток U-118 MG, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12; культура С - культура клеток U-118 MG, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13. На фиг. 14 показана диаграмма концентрации белка IFNB1 в лизате культуры клеток нейробластомы человека SH-SY5Y (АТСС CRL- 2266) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1.
На фиг.14 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток SH-SY5Y, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура клеток SH-SY5Y, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12; культура С - культура клеток SH-SY5Y, трансфицированных ДНК-вектором GDTT 1.8NAS12-IFNB1 .
На фиг. 15 показана диаграмма концентрации белка TNFRSF4 в лизате клеток астроглии человека SVG р12 (АТСС CRL-8621 после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- TNFRSF4 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген TNFRSF4.
На фиг.15 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток SVG р12, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура клеток SVG р12, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12; культура С - культура клеток SVG р12, трансфицированных ДНК-вектором GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4.
На фиг. 16 показана диаграмма концентрации белка TNFSF10 в лизате нейроэктодермальных клеток опухоли головного мозга человека PFSK-1 (АТСС number CRL-2060) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFSF10 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген TNFSF10.
На фиг.16 отмечены следующие элементы: культура А - культура PFSK-1, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура PFSK-1, трансфицированная ДНК- вектором GDTT1.8NAS12; культура С - культура PFSK-1 , трансфицированных ДНК- вектором GDTT 1.8NAS12-TNFSF10. На фиг.17 показана диаграмма концентрации белка BCL2 в лизате культуры клеток медуллобластомы человека D341 Med (АТСС НТВ-187) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-BCL2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген BCL2.
На фиг.17 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток D341 Med, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура клеток D341 Med, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12; культура С - культура клеток D341 Med, трансфицированных ДНК-вектором GDTT 1.8NAS12-BCL2. На фиг.18 показана диаграмма концентрации белка HGF в лизате культуры клеток астроцитомы головного мозга человека А-172 (АТСС CRL-1620) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген HGF. На фиг.18 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток А-172, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура клеток А-172, трансфицированных ДНК- вектором GDTT1.8NAS12; культура С - культура клеток А-172, трансфицированных ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-HGF. На фиг. 19 показана диаграмма концентрации белка IL2 в лизате культуры нейрональных прогениторных клеток человека АТСС- BXS0117 (АТСС ACS-5003) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IL2. На фиг.19 отмечены следующие элементы: культура А - культура клеток ATCC-BXS01 17, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль); культура В - культура клеток ATCC-BXS0117, трансфицированных ДНК-вектором GDTT1.8NAS12; культура С - культура клеток ATCC-BXS0117, трансфицированных ДНК-вектором GDTT 1.8NAS1 2-IL2.
На фиг. 20 показана диаграмма концентрации белка IFNB1 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IFNB1.
На фиг.20 отмечены следующие элементы: P1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1;
ГНИ - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
P1III - биоптат кожи пациента GΪ1 из интактного участка; P2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1;
P2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
P2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка; P3I - биоптат кожи пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1;
P3II - биоптат кожи пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
P3III — биоптат кожи пациента ПЗ из интактного участка.
На фиг. 21 показана диаграмма концентрации белка IL13 в биоптатах икроножной мышцы трех пациентов после введения в икроножную мышцу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL13, с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе 5 генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген IL13.
На фиг.21 отмечены следующие элементы:
P1I - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- 10 IL13;
ГНИ - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
P1III - биоптат интактного участка икроножной мышцы is пациента П1;
P2I - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- IL13;
P2II - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне го введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
P2III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П2;
P3I - биоптат икроножной мышцы пациента ПЗ в зоне 5 введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- IL13;
P3II - биоптат икроножной мышцы пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо); P3III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента ПЗ.
На фиг.22
5 показана диаграмма концентрации белка IL2 в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения ю уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген-11_2.
На фиг.22 отмечены следующие элементы:
P1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения is генотерапевтического ДНК вектора GDTT 1.8NAS12-IL2;
P1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
P1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;
P2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения го генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL2;
P2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
P2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;
P3I - биоптат кожи пациента ПЗ в зоне введения
25 генотерапевтического ДНК вектора GDTT 1.8NAS12-IL2;
P3II - биоптат кожи пациента ПЗ в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
P3III - биоптат кожи пациента ПЗ из интактного участка. На фиг. 23 показана диаграмма концентрации белка IL10 в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL10 с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10
На фиг. 23 отмечены следующие элементы: П1С - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10;
П1В - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12;
П1А - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.
На фиг. 24 показана диаграмма концентраций белков: белка DDC человека, белка BCL2 человека, белка HGF человека, белка TNFSF10 человека, белка TNFRSF4 человека в мышечной ткани трех групп крыс линии Wistar после инъекционного введения смеси генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 с целью демонстрации способа применения смеси генотерапевтических ДНК-векторов.
На фиг. 24 отмечены следующие элементы:
K1I - фрагмент мышечной ткани крысы I группы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT1 .8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT1.8NAS12-TNFSF10 и GDTT1.8NAS12-TNFRSF4;
K1II - фрагмент мышечной ткани крысы II группы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT1.8NAS12-TNFSF10 и GDTT1.8NAS12-TNFRSF4;
K1III - фрагмент мышечной ткани крысы III группы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT 1.8NAS12-TNFSF1 0 и GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4;
К1 IV - фрагмент мышечной ткани крысы IV группы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT 1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT1.8NAS12-TNFSF10 и GDTT 1.8NAS1 2-TNFRSF4; K1V - фрагмент мышечной ткани крысы V группы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: GDTT1.8NAS12- DDC, GDTT1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12- HGF, GDTT 1.8NAS12-TNFSF10 и GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4;
K2I - фрагмент мышечной ткани крысы I группы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
K2II - фрагмент мышечной ткани крысы II группы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо); K2III - фрагмент мышечной ткани крысы III группы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
K2IV- фрагмент мышечной ткани крысы IV группы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо);
K2V - фрагмент мышечной ткани крысы V группы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо); K3I - фрагмент мышечной ткани контрольного интактного участка крысы I группы КЗ;
K3II - фрагмент мышечной ткани контрольного интактного участка крысы II группы КЗ;
K3III - фрагмент мышечной ткани контрольного интактного участка крысы III группы КЗ;
K3IV - фрагмент мышечной ткани контрольного интактного участка крысы IV группыКЗ;
K3V - фрагмент мышечной ткани контрольного интактного участка крысы V группы КЗ.
На фиг. 25 показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена IL13 в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) быка до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13 с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора животным
На фиг.25 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие: 1 - кДНК гена IL13 в клетках РВМС быка до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13;
2 - кДНК гена IL13 в клетках РВМС быка после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13;
5 3 - кДНК гена ACT в клетках РВМС быка до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12-IL13;
4 - кДНК гена ACT в клетках РВМС быка после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13.
В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ ю коровы (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером АН001 130.2.
Реализация изобретения
На основе ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые is гены человека, предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК- вектора, несущего целевые гены заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 го клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ген DDC (кодирует белок DDC), ген IL10 (кодирует белок IL10), ген IL13 (кодирует белок IL13), ген IFNB1 (кодирует белок IFNB1), ген TNFRSF4 (кодирует белок TNFRSF4), ген TNFSF10 (кодирует белок TNFSF10), ген 25 BCL2 (кодирует белок BCL2), ген HGF (кодирует белок HGF), ген IL2 (кодирует белок IL2) человека. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК-вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами.
Каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: ДНК-вектор GDTT 1.8NAS12-DDC, или GDTT1.8NAS12-IL10, или GDTT 1.8NAS12-IL13, или GDTT1.8NAS12-IFNB1, или
GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или GDTT 1.8NAS12-TNFSF 10, или GDTT1.8NAS12-BCL2, или GDTT1.8NAS12-HGF, или GDTT1.8NAS12-IL2 получали следующим образом: кодирующую часть целевого гена DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1 , или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2 клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 и получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- DDC, SEQ ID N21, или GDTT1.8NAS12-IL10, SEQ ID Ns2 или GDTT 1.8NAS12-IL13, SEQ ID N23, или GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , SEQ ID N24, ИЛИ GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, SEQ ID Ns5, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, SEQ ID N26, или GDTT1.8NAS12- BCL2, SEQ ID N27, или GDTT 1.8NAS12-HGF, SEQ ID N28, или GDTT1.8NAS12-IL2, SEQ ID N29 соответственно. Кодирующую часть гена DDC размером 1447 п.н., или гена IL10 размером 540 п.н., или гена IL13 размером 444 п.н., или гена IFNB1 размером 567 п.н., или гена TNFRSF4 размером 837 п.н., или гена TNFSF10 размером 849 п.н., или гена BCL2 размером 724 п.н., или гена HGF размером 2190 п.н., или гена IL2 размером 465 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека. Для получения первой цепи кДНК генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 человека использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводили с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводили по сайтам рестрикции BamHI, EcoRI, Hindlll, Kpnl, Sail, расположенными в полилинкере вектора GDTT1.8NAS12. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора GDTT1.8NAS12, при этом белок-кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- DDC, или GDTT 1.8NAS12-IL10, или GDTT1.8NAS12-IL13, или GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или GDTT1 .8NAS12-BCL2, или GDTT1.8NAS12-HGF, или GDTT1 .8NAS12-IL2 может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации гена DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1, или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2 различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники, как безлигазное клонирование генов.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC, или GDTT1.8NAS12-IL10, или GDTT1.8NAS12-IL13, или
GDTT1.8NAS12-IFNB1, или GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или GDTT 1.8NAS1 2-BCL2, или GDTT1.8NAS12-HGF, или GDTT1.8NAS12-IL2 обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID N21 ИЛИ SEQ ID N22 или SEQ ID Ns3 или SEQ ID Ns4 или SEQ ID Ns5 или SEQ ID N26 или SEQ ID N27 или SEQ ID N28 или SEQ ID N29 соответственно. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденное™ генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора GDTT1.8NAS12. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.
Способность проникать в эукариотические клетки и функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, или GDTT 1.8NAS12-IL10, или GDTT1.8NAS12-IL13, или GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или GDTT1 .8NAS12-BCL2, или GDTT1.8NAS12-HGF, или GDTT1.8NAS12-IL2 подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC, или GDTT1 .8NAS12-IL10, или GDTT1.8NAS12-IL13, или GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или GDTT1 .8NAS12-BCL2, или GDTT1.8NAS12-HGF, или GDTT1.8NAS12-IL2 свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-DDC, или GDTT1.8NAS12-IL10, или GDTT1.8NAS12-IL13, или GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или
GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или GDTT1.8NAS12-BCL2, или GDTT1.8NAS12-HGF, или GDTT1.8NAS12-IL2 экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами, с использованием иммунологических методов. Наличие белка DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1 , или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2 подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2. Таким образом для подтверждения эффективности экспрессии созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, несущего целевой ген, а именно, ген DDC, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL10, несущего целевой ген, а именно, ген IL10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего целевой ген, а именно, ген IL13, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген 5 IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- TNFRSF4, несущего целевой ген, а именно, ген TNFRSF4, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, несущего целевой ген, а именно, ген TNFSF10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-BCL2, ю несущего целевой ген, а именно, ген BCL2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, несущего целевой ген, а именно, ген HGF, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего целевой ген, а именно, ген IL2 использовали is следующие методы:
А) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевых генов в лизате клеток человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий человека и животного генотерапевтическим ДНК-векторами; го В) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в лизате клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическими ДНК-векторами;
C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного 25 уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов;
D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.
Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- DDC, несущего целевой ген, а именно, ген DDC, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL10, несущего целевой ген, а именно, ген IL10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего целевой ген, а именно, ген IL13, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- TNFRSF4, несущего целевой ген, а именно, ген TNFRSF4, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, несущего целевой ген, а именно, ген TNFSF10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1 .8NAS12-BCL2, несущего целевой ген, а именно, ген BCL2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, несущего целевой ген, а именно, ген HGF, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего целевой ген, а именно, ген IL2 выполняли:
A) трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека и животного;
B) введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;
C) введение в ткани животного смеси генотерапевтических ДНК-векторов;
D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами. Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов, и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL10, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, или генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2 (SEQ ID N°1 или SEQ ID N°2 или SEQ ID N°3 ИЛИ SEQ ID N°4 или SEQ ID Ne5 ИЛИ SEQ ID N26 или SEQ ID Ns7 или SEQ ID N28 или SEQ ID Ne9 соответственно).
Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1, или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2 использование селективных 5 питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 для ю возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli JM110-NAS. Способ получения штамма Escherichia coli is JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или штамма Escherichia го coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2 заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli JM1 IQ- 25 NAS с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-DDC, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL10, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, или ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- TNFRSF4, или ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-TNFSF1 0, или ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, или ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2 соответственно с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli J М 110- NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2 используется для наработки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, или GDTT1.8NAS12-IL10, или GDTT1 .8NAS12-IL13, или GDTT 1.8NAS12-IFNB1 , или GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или GDTT1.8NAS12-BCL2, или GDTT1.8NAS12-HGF, или GDTT1.8NAS12-IL2 соответственно с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.
Для подтверждения получения штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2 проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК. Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-DDC, несущего целевой ген, а именно, ген DDC, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL10, несущего целевой ген, а именно, ген IL10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего целевой ген, а именно, ген IL13, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген IFNB1, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- TNFRSF4, несущего целевой ген, а именно, ген TNFRSF4, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, несущего целевой ген, а именно, ген TNFSF10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-BCL2, несущего целевой ген, а именно, ген BCL2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12-HGF, несущего целевой ген, а именно, ген HGF, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего целевой ген, а именно, ген IL2, выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT 1.8NAS1 2-TNFRSF4, или штамма Escherichia coli JM 110-NAS/GDTT 1.8NAS1 2-TNFSF 10, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, каждый 5 из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, а именно DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1, или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2.
Способ масштабирования получения бактериальной массы ю до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli JM 110- 15 NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамма Escherichia coli J М 110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или штамма Escherichia coli го JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2 инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика 25 обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL10, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL13, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или GDTT1 .8NAS12-BCL2, или GDTT1.8NAS12-HGF, или GDTT1.8NAS12-IL2 многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM 110-NAS/GDTT 1.8NAS 12-TNFRSF4, или штамм Escherichia coli JM 110-NAS/GDTT 1.8NAS12-TNFSF1 0, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2 подпадают под объем настоящего изобретения.
Описанное раскрытие изобретения подтверждается примерами реализации настоящего изобретения. Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-DDC, несущего целевой ген, а именно, ген DDC.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC конструировали клонированием кодирующей части гена DDC размером 1447 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции Sall-Hindlll. Кодирующую часть гена DDC размером 1447 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов: DDC-F ATCGTCG АССАСС AT GAACGC AAGT GAGTTCCGA, DDC-R ACCAAGCTTCTACTCCCTCTCTG и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:
(а) ориджин репликации получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pUC19 с использованием олигонуклеотидов UCori-Bam, UCori-Nco (перечень последовательностей олигонуклеотидов, (1) -(2));
(б) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР- амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов hGH-F и hGH-R (перечень последовательностей олигонуклеотидов, (3) и (4));
(в) регуляторный участок транспозона Tn10 PHK-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов RO-F, RO-R, RO-1, RO-2, RO-3 (перечень последовательностей олигонуклеотидов, (5) -
(9));
(г) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР- амплификации участка коммерческой плазмиды рЕТ-28 человека с использованием олигонуклеотидов Kan-F и Kan-R (перечень последовательностей олигонуклеотидов, (10) и (11));
(д) полилинкер получали кинированием и отжигом четырех синтетических олигонуклеотидов MCS1, MCS2, MCS3 и MCS4 (перечень последовательностей олигонуклеотидов, (12) - (15));
(е) промоторно-регуляторный участок человеческого гена фактора элонгации EF1a с собственным энхансером получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов EF1-Xho и EF1-R (перечень последовательностей олигонуклеотидов, (16) - (17)).
ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты (б), (в) и (г) имели перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (б), (в) и (г) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R
(перечень последовательностей олигонуклеотидов, (3) и (11)). Далее, полученные фрагменты ДНК объединялись путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и Ncol. В результате получали вектор, пока еще не содержащий полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды эндонуклеазами рестрикции по сайтам BamHI и EcoRI с последующим лигированием с фрагментом (д). В результате получали промежуточный вектор размером 2408 п.н, несущий ген устойчивости к канамицину, пока еще не содержащий промоторно-регуляторный участок гена фактора элонгации EF1a с собственным энхансером. Полученный вектор расщепляли эндонуклеазами рестрикции по сайтам Sail и BamHI с последующим лигированием с фрагментом (е). В результате получали вектор размером 3608 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину и промоторно-регуляторный участок гена фактора элонгации EF1a с собственным энхансером. Далее ген устойчивости к канамицину выщепляли по сайтам рестрикции Spel, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом получали генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков и возможностью экспрессии клонированных в него целевых генов в большинстве типов тканей человека и животных.
Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена DDC и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и Hindlll.
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC размером 4006 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N21 и общей структурой изображенной на фиг.1А.
Пример 2. Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IL10, несущего целевой ген, а именно, ген IL10.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL10 конструировали клонированием кодирующей части гена IL10 размером 540 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sail. Кодирующую часть гена IL10 размером 540 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов: IL10-F AGGATCCACCATGCACAGCTCAGCACTGC,
IL10-R СТТ GTCG ACT С AGTTTCGT АТ СТТ С ATT GT С и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail.
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL10 размером 3093 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°2 и общей структурой изображенной на фиг.1В.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 3 Получение ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL 3, несущего целевой ген, а именно, ген IL13 человека.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL13 конструировали клонированием кодирующей части гена IL13 размером 444 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sail. Кодирующую часть гена IL13 размером 444 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов: IL13-F AGG АТССАССАТ GC ATCCGCT ССТ СААТ С ,
IL13-R СТТ GT CG ACT С AGTT G ААСТ GTCCCTCG и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail.
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL13 размером 2997 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°3 и общей структурой изображенной на фиг.1C.
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 4. Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген IFNB1.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 конструировали клонированием кодирующей части гена IFNB1 размером 567 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sail. Кодирующую часть гена IFNB1 размером 567 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР- амплификации с использованием олигонуклеотидов:
IFNB1-F
AAAGG АТ СС АССАТ G ACC AACAAGT GT СТ ССТСС ААА, IFNB1-R
ТТТ GT CG ACT С AGTTT CGG AGGT ААССТ GT AAGT СТ G и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail.
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 размером 3120 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID Ne4 и общей структурой изображенной на фиг. .
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 5.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, несущего целевой ген, а именно, ген TNFRSF4.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 конструировали клонированием кодирующей части гена TNFRSF4 размером 837 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sail. Кодирующую часть гена TNFRSF4 размером 837 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
TNFRSF4-F AGGATCCACCATGTGCGTGGGGGCTCGG,
TNFRSF4-R СТТ GT CG ACT CAGAT СТТ GGCCAGGGT G 5 и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA
Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail.
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 размером 3390 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°5 и общей структурой изображенной на фиг.1Е
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1. s Пример 6.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12- TNFSF10, несущего целевой ген, а именно, ген TNFSF10.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFSF10о конструировали клонированием кодирующей части гена TNFSF10 размером 849 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI, Hindlll. Кодирующую часть гена TNFSF10 размером 849 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца5 ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:
TNFSF10-F AGG АТ ССАСС ATGGCT AT G AT GGAGGT ССА, TNFSF10-R T GTCGACT CAGCC AACT AAAAAGGCCCCG A и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail.
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFSF10 размером 3402 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N26 и общей структурой изображенной на фиг-IF При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 7.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12- BCL2, несущего целевой ген, а именно, ген BCL2.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-BCL2 конструировали клонированием кодирующей части гена BCL2 размером 724 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции Sail и Kpnl. Кодирующую часть гена BCL2 размером 724 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР- амплификации с использованием олигонуклеотидов: BCL-F ATCGTCGACCACCATGGCGCACGCTGGGAGA,
BCL-R ТТ CGGT АССТ С АСТТ GTGGCCC А и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и Kpnl.
В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-BCL2 размером 3277 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ 5 ID Ns 7 и общей структурой изображенной на фиг-IG
При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 8. ю Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12- HGF, несущего целевой ген, а именно, ген HGF.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HGF конструировали клонированием кодирующей части гена HGF 15 размером 2190 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sail. Кодирующую часть гена HGF размером 2190 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с го использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР- амплификации с использованием олигонуклеотидов:
HG F_F TTTGG АТ СС ACC AT GTGGGT GACCAAACT ССТ GCC А,
HGF_R
ААТ GTCGACCT AT GACT GTGGT АССТТ AT AT GTT ААААТ 25 и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail. В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HGF размером 4775 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NQ8 И общей структурой изображенной на фиг.Ш При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1.
Пример 9.
Получение генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12- IL2, несущего целевой ген, а именно, ген IL2. Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL2 конструировали клонированием кодирующей части гена IL2 размером 465 п.н. в ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 размером 2591 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и Sail. Кодирующую часть гена IL2 размером 465 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР- амплификации с использованием олигонуклеотидов:
IL2-F AGG АТССАССАТ GT АС AGGATGC ААСТССТ, I L2-R TGTCG ACTCAAGTC AGTGTTG AG ATGATG и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sail. В результате получали ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL2 размером 3018 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID Ns9 и общей структурой изображенной на фиг.11 При этом генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 конструировали по Примеру 1. Пример 10.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-DDC, несущего целевой ген, а именно, 5 ген DDC, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора, несущего целевой ген. ю Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена DDC, в культуре клеток кортикальных нейронов человека HCN-2 (АТСС CRL-10742) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC, несущим ген DDC человека. Количество мРНК определяли по is динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Клеточную культуру HCN-2 выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02) в культуральной среде DMEM с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). В го процессе культивирования каждые 48 ч происходила смена ростовой среды.
Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Трансфекцию 25 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC, экспрессирующим ген DDC человека, проводили с использованием Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. В пробирке N°1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке Ns2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamin 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки N°1 к содержимому пробирки N22, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.
В качестве контроля использовали клетки HCN-2, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена DDC до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора GDTT1.8NAS12 для трансфекции проводили, как описано выше.
Суммарную РНК из клеток HCN-2 выделяли с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent и гомогенизировали с последующим прогреванием в течение 5 мин при 65 °С. Далее образец центрифугировали при 14 000д в течение 10 мин и снова прогревали в течение 10 мин при 65 ОС. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14 000д в течение 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема ЗМ ацетата натрия, pH 5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20 °С в течение 10 мин с последующим центрифугированием при 14 000д в течение 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Определение уровня экспрессии мРНК гена DDC после трансфекции проводили путем оценки динамики накопления ампликонов кДНК методом ПЦР в режиме реального времени. Для получения и амплификации кДНК, специфичной для гена DDC человека, использовали олигонуклеотиды DDC_SF и DDC_SR: DDC_SF GGAG AAGGGGGAGG AGT GAT,
DDC_SR CCCAGCTCTTTCCACTGAGG.
Длина продукта амплификации - 186 п.н. Реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) для ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащих: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 мМ хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С - 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 30 сек. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов DDC и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество динамику накопления ампликонов кДНК генов DDC и В2М оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 2.
Из фигуры 2 следует, что в результате трансфекции культуры 5 клеток кортикальных нейронов человека HCN-2 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC, уровень специфической мРНК гена DDC человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген DDC на уровне ю мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-DDC для повышения уровня экспрессии гена DDC в эукариотических клетках.
15 Пример 11.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL10, несущего целевой ген, а именно, ген IL10, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК го целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IL10, в культуре клеток нейробластомы человека IMR-32 (АТСС CCL- 25 127) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим
ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10, несущим ген IL10 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени. Клеточную культуру IMR-32 выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02) в культуральной среде ЕМЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-IL10, экспрессирующим ген IL10 человека, проводили, как описано в примере 10. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток нейробластомы человека IMR-32, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена IL10 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили, как описано в примере 10, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 10 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена IL10 человека, использовали олигонуклеотиды IL10_SF и IL10_SR: I L 10 S F AAGACCCAGACATCAAGGCG,
I L 10 _ S R AGGCATTCTTCACCTGCTCC.
Длина продукта амплификации - 135 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IL10 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IL10 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 3. Из фигуры 3 следует, что в результате трансфекции культуры клеток нейробластомы человека IMR-32 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10, уровень специфической мРНК гена IL10 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL10 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL10 для повышения уровня экспрессии гена IL10 в эукариотических клетках.
Пример 12.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего целевой ген, а именно, ген IL13, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора, несущего целевой ген. Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IL13 в культуре клеток глиобластомы человека U-118 MG (АТСС НТВ- 15) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13, несущим ген IL13 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Клеточную культуру U-118 MG выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02) в культуральной среде МЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x1 04 кпеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13, экспрессирующим ген IL13 человека, проводили, как описано в примере 10. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток глиобластомы человека U-118 MG, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген («ДНК гена IL13 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили, как описано в примере 10, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 10 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена IL13 человека, использовали олигонуклеотиды IL13_SF и IL13_SR:
I L 13 _ S F CAT GGCGCTTTT GTT G ACC A,
IL13_SR AGCT GT C AGGTT GAT GCTCC . Длина продукта амплификации - 181 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IL13 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IL13 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 4.
Из фигуры 4 следует, что в результате трансфекции культуры клеток глиобластомы человека U-118 MG генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13, уровень специфической мРНК гена IL13 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL13 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL13 для повышения уровня экспрессии гена IL13 в эукариотических клетках.
Пример 13. Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген IFNB1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IFNB1, в культуре клеток нейробластомы человека SH-SY5Y (АТСС CRL-2266) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущим ген IFNB1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Клеточную культуру SH-SY5Y выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02) в культуральной среде DMEM:F12 (Gibco) 1:1 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 кпеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, экспрессирующим ген IFNB1 человека, проводили, как описано в примере 10. В качестве контроля использовали культуру клеток нейробластомы человека SH-SY5Y, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена IFNB1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили, как описано в примере 10, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 10 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена IFNB1 человека, использовали олигонуклеотиды IFNB1_SF и IFNB1_SR: IFNB1_SF GTGGCAATTGAATGGGAGGC,
IFNB1 SR ATAGATGGTCAATGCGGCGT.
Длина продукта амплификации - 118 п.н. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IFNB1 и В2М. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IFNB1 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio- RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 5.
Из фигуры 5 следует, что в результате трансфекции культуры клеток нейробластомы человека SH-SY5Y генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, уровень специфической мРНК гена IFNB1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IFNB1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1 для повышения уровня экспрессии гена IFNB1 в эукариотических клетках. Пример 14.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, несущего целевой ген, а именно, ген TNFRSF4, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена TNFRSF4, в культуре клеток астроглии человека SVG р12 (АТСС CRL-8621) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, несущим ген TNFRSF4 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени. Клеточную культуру SVG р12 выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% 002) в культуральной среде МЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 кпеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, экспрессирующим ген TNFRSF4 человека, проводили, как описано в примере 10. В качестве контроля использовали культуру клеток астроглии человека SVG р12, трансфицированных генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена TNFRSF4 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили, как описано в примере 10, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 10 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена TNFRSF4 человека, использовали олигонуклеотиды TNFRSF4_SF и TNFRSF4_SR:
TNFRSF4_SF CTGG АС AGCT ACAAGCCT GG ,
TNFRSF4_SR CCT GT CCT C AC AG ATTGCGT.
Длина продукта амплификации - 162 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов TNFRSF4 и В2М. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов TNFRSF4 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 6. Из фигуры 6 следует, что в результате трансфекции культуры клеток астроглии человека SVG р12 генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, уровень специфической мРНК гена TNFRSF4 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген TNFRSF4 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 для повышения уровня экспрессии гена TNFRSF4 в эукариотических клетках.
Пример 15.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, несущего целевой ген, а именно, ген TNFSF10, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена TNFSF10, в культуре нейроэктодермальных клеток опухоли головного мозга человека PFSK-1 (АТСС number CRL-2060) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFSF10, несущим ген TNFSF10 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени. Клеточную культуру PFSK-1 выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02) в культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки 5 трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-TNFSF10, экспрессирующим ген TNFSF10 ю человека, проводили, как описано в примере 10. В качестве контроля использовали культуру нейроэктодермальных клеток опухоли головного мозга человека PFSK-1, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена TNFSF10 до и после is трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили, как описано в примере 10, за исключением олигонуклеотидов с го отличающимися от примера 10 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена TNFSF10 человека, использовали олигонуклеотиды TNFSF10_SF и TNFSF10_SR: TNFSF10_SF CCTGCAGTCTCTCTGTGTGG,
TNFSF10_SR ACGG AGTT GCCACTT GACTT.
25 Длина продукта амплификации - 181 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов TNFSF10 и В2М. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР 5 продуктов - кДНК генов TNFSF10 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 7. ю Из фигуры 7 следует, что в результате трансфекции культуры нейроэктодермальных клеток опухоли головного мозга человека PFSK-1 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- TNFSF10, уровень специфической мРНК гена TNFSF10 человека вырос многократно, что подтверждает способность is вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген TNFSF10 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFSF10 для повышения уровня экспрессии гена TNFSF10 в го эукариотических клетках.
Пример 16.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, несущего целевой ген, а именно, 25 ген BCL2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора, несущего целевой ген. Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена BCL2, в культуре клеток медуллобластомы человека D341 Med (АТСС НТВ-187) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-BCL2, 5 несущим ген BCL2 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Клеточную культуру D341 Med выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% 002) в культуральной среде МЕМ с ю добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США) is Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-BCL2, экспрессирующим ген BCL2 человека, проводили, как описано в примере 10. В качестве контроля использовали культуру клеток медуллобластомы человека D341 Med, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором го GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена BCL2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили, как 25 описано в примере 10, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 10 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена BCL2 человека, использовали олигонуклеотиды BCL2_SF и BCL2_SR:
BCL_SF GAACTGGGGGAGGATTGTGG, BCL SR CATCCCAGCCTCCGTTATCC.
Длина продукта амплификации - 164 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, 5 представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов BCL2 и В2М. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля ю использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов BCL2 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio- RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в is результате анализа, представлены на фиг. 8.
Из фигуры 8 следует, что в результате трансфекции культуры клеток медуллобластомы человека D341 Med генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-BCL2, уровень специфической мРНК гена BCL2 человека вырос го многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BCL2 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-BCL2 для повышения уровня 25 экспрессии гена BCL2 в эукариотических клетках.
Пример 17.
Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-HGF, несущего целевой ген, а именно, ген HGF, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- 5 вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена HGF, в культуре клеток астроцитомы головного мозга человека А-172 (АТСС CRL-1620) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF, ю несущим ген HGF человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Клеточную культуру А-172 выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02 в культуральной среде DMEM с is добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x1 04 клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США) го Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-HGF, экспрессирующим ген HGF человека, проводили, как описано в примере 10. В качестве контроля использовали культуру клеток астроцитомы головного мозга человека А-172, трансфицированных генотерапевтическим 25 ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена HGF до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили, как описано в примере 10, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 10 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена HGF человека, использовали олигонуклеотиды HGF_SF и HGF_SR: HGF_SF АСССТ GGT GTTT CACAAGC А,
HGF_FR GCAAG ААТТТ GT GCCGGT GT.
Длина продукта амплификации - 182 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов HGF и В2М. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов HGF и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio- RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 9.
Из фигуры 9 следует, что в результате трансфекции культуры клеток астроцитомы головного мозга человека А-172 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF, уровень специфической мРНК гена HGF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HGF на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-HGF для повышения уровня экспрессии гена HGF в эукариотических клетках.
Пример 18. Подтверждение способности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего целевой ген, а именно, ген IL2, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора, несущего целевой ген.
Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IL2, в культуре нейрональных прогениторных клеток человека АТСС- BXS0117 (АТСС ACS-5003) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-IL2, несущим ген IL2 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.
Клеточную культуру ATCC-BXS0117 выращивали в стандартных условиях (37 °С, 5% 002) в культуральной среде DMEM.F12 (Gibco) 1:1 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (Gibco) и с использованием набора реагентов Growth Kit for Neural Progenitor Cell Expansion (ATCC ACS-3003). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5x104 кпеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-IL2, экспрессирующим ген IL2 человека, проводили, как описано в примере 10. В качестве контроля использовали культуру нейрональных прогениторных клеток человека ATCC-BXS01 17, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген (кДНК гена IL2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили, как описано в примере 10, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 10 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена IL2 человека, использовали олигонуклеотиды IL2_SF и IL2_SR:
IL2 _ SF ACAGGATGCAACTCCTGTCT, IL2_SR GCATCCTGGT GAGTTTGGGA.
Длина продукта амплификации - 192 п.н.
В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IL2 и В2М. В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2- микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IL2 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio- RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 10. Из фигуры 10 следует, что в результате трансфекции культуры нейрональных прогениторных клеток человека АТСС- BXS0117 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- IL2, уровень специфической мРНК гена IL2 человека вырос 5 многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL2 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL2 для повышения уровня экспрессии ю гена IL2 в эукариотических клетках.
Пример 19.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- 15 DDC, несущего ген DDC, для повышения экспрессии белка DDC в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка DDC в лизате культуры клеток кортикальных нейронов человека HCN-2 (АТСС CRL-10742) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором го GDTT1.8NAS12-DDC, несущим ген DDC человека.
Клеточную культуру кортикальных нейронов человека HCN-2 выращивали, как это описано в примере 10.
Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный 25 планшет из расчета 5x104 кпеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена DDC (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC, несущий ген DDC человека (С). Приготовление комплекса ДНК/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24-луночного планшета к 1 мкг ДНК-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли культуральную среду до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкл SuperFect Transfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02.
Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли среду, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% С02.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка DDC проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Dopa Decarboxylase (DDC) (SEG474Hu Cloud-Clone Corp., США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка DDC, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 0,61нг/мл, диапазон измерения - от 1,56 нг/мл до 100 нг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг.11.
Из фигуры 11 следует, что трансфекция кортикальных нейронов человека HCN-2 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC приводит к увеличению количества белка DDC по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген DDC на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-DDC для повышения уровня экспрессии DDC в эукариотических клетках.
Пример 20. Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL10, несущего ген IL10, для повышения экспрессии белка IL10 в клетках млекопитающих. Оценивали изменение количества белка в культуре клеток нейробластомы человека IMR-32 (АТСС CCL-127) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10, несущим ген IL10 человека. Клетки выделяли и выращивали, как описано в примере 11. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IL10 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL10, несущий ген IL10 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию культуры клеток нейробластомы человека IMR-32 проводили, как описано в примере 19.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка IL10 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Interleukin 10 (IL10) (SEA056Hu, Cloud-Clone Corp., США), согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IL10, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 2,8 пг/мл, диапазон измерения - от 7,8 пг/мл до 500 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 12.
Из фигуры 12 следует, что трансфекция культуры клеток нейробластомы человека IMR-32 генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL10 приводит к увеличению количества белка IL10 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL10 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL10 для повышения уровня экспрессии IL10 в эукариотических клетках.
Пример 21.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL13, несущего ген IL13, для повышения экспрессии белка IL13 в клетках млекопитающих. Оценивали изменение количества белка IL13 в лизате культуры клеток глиобластомы человека U-118 MG (АТСС НТВ- 15) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13, несущим ген IL13 человека. Клетки культивировали, как описано в примере 12.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect
Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IL13 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL13, несущий ген IL13 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию культуры клеток глиобластомы человека U-118 MG проводили, как описано в примере 19. После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка IL13 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Interleukin 13 (IL13) (SEA060Hu, Cloud-Clone Corp., США), согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США). Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IL13, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 6,7 5 пг/мл, диапазон измерения - от 15,6 пг/мл до 1000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в ю результате анализа, представлены на фиг. 13.
Из фигуры 13 следует, что трансфекция культуры клеток глиобластомы человека U-118 MG генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL13 приводит к увеличению количества белка IL13 по сравнению с контрольными 15 образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL13 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL13 для повышения уровня экспрессии го IL13 в эукариотических клетках.
Пример 22.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- 25 IFNB1, несущего ген IFNB1, для повышения экспрессии белка IFNB1 в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка IFNB1 в лизате культуры клеток нейробластомы человека SH-SY5Y (АТСС CRL- 2266) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущим ген IFNB1 человека. Клетки культивировали, как описано в примере 13.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-векгор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IFNB1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущий ген IFNB1 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию культуры клеток нейробластомы человека SH- SY5Y проводили, как описано в примере 19.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение белка IFNB1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Interferon Beta (IFNb) (SEA222Hu, Cloud-Clone Corp., США), согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IFNB1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 2,7 пг/мл, диапазон измерения - от 7,8 пг/мл до 500 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 14.
Из фигуры 14 следует, что трансфекция культуры клеток нейробластомы человека SH-SY5Y генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1 приводит к увеличению количества белка IFNB1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IFNB1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1 для повышения уровня экспрессии IFNB1 в эукариотических клетках.
Пример 23.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12- TNFRSF4, несущего ген TNFRSF4, для повышения экспрессии белка TNFRSF4 в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка TNFRSF4 в лизате культуры клеток астроглии человека SVG р12 (АТСС CRL-8621) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- TNFRSF4, несущим ген TNFRSF4 человека. Клетки культивировали, как описано в примере 14.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect
Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена TNFRSF4 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- TNFRSF4, несущий ген TNFRSF4 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию культуры клеток астроглии человека SVG р12 проводили, как описано в примере 19.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение белка TNFRSF4 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human 0X40 ELISA Kit (ab231926, Abeam, США), согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка TNFRSF4, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 23 пг/мл, диапазон измерения - от 46,9 пг/мл до 3000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 15.
Из фигуры 15 следует, что трансфекция культуры клеток 5 астроглии человека SVG р12 генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 приводит к увеличению количества белка TNFRSF4 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген TNFRSF4 на ю уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 для повышения уровня экспрессии TNFRSF4 в эукариотических клетках.
15
Пример 24.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- TNFSF10, несущего ген TNFSF10, для повышения экспрессии го белка TNFSF10 в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка TNFSF10 в лизате нейроэктодермальных клеток опухоли головного мозга человека PFSK-1 (АТСС number CRL-2060) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFSF10, несущим ген 25 TNFSF10 человека. Клетки культивировали, как описано в примере 15.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена TNFSF10 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- TNFSF10, несущий ген TNFSF10 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию нейроэктодермальных клеток опухоли головного мозга человека PFSK-1 проводили, как описано в примере 19.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка TNFSF10 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human TRAIL/TNFSF10 Quantikine ELISA Kit (DTRL00, R&D Systems, Inc., США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка TNFSF10, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 7,87 пг/мл, диапазон измерения - от 15,6 пг/мл до 1000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия по 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 16.
Из фигуры 16 следует, что трансфекция культуры нейроэктодермальных клеток опухоли головного мозга человека PFSK-1 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- TNFSF10 приводит к увеличению количества белка TNFSF10 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген TNFSF10 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10 для повышения уровня экспрессии TNFSF10 в эукариотических клетках. Пример 25.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- BCL2, несущего ген BCL2, для повышения экспрессии белка BCL2 в клетках млекопитающих. Оценивали изменение количества белка BCL2 в лизате культуры клеток медуллобластомы человека D341 Med (АТСС НТВ-187) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-BCL2, несущим ген BCL2 человека. Клетки культивировали, как описано в примере 16. Для трансфекции использовали реагент SuperFect
Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена BCL2 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1 .8NAS12-BCL2, несущий ген BCL2 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию культуры клеток медуллобластомы человека D341 Med проводили, как описано в примере 19. После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение белка BCL2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for В-Cell Leukemia/Lymphoma 2 (Bcl2) (SEA778Hu, Cloud-Clone Corp., США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка BCL2, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 0,061 нг/мл, диапазон измерения - от 0,156 нг/мл до 10 нг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 17. Из фигуры 17 следует, что трансфекция культуры клеток медуллобластомы человека D341 Med генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-BCL2 приводит к увеличению количества белка BCL2 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BCL2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-BCL2 для повышения уровня экспрессии BCL2 в эукариотических клетках.
Пример 26.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- HGF, несущего ген HGF, для повышения экспрессии белка HGF в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка HGF в лизате культуры клеток астроцитомы головного мозга человека А-172 (АТСС CRL-1620) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF, несущим ген HGF человека. Клетки культивировали, как описано в примере 17.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена HGF (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HGF, несущий ген HGF человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и
ИЗ трансфекцию клеток астроцитомы головного мозга человека А- 172 проводили, как описано в примере 19.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка HGF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human HGF ELISA Kit (ab100534, Abeam, США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка HGF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 3 пг/мл, диапазон измерения - от 2,74 пг/мл до 2000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 18.
Из фигуры 18 следует, что трансфекция культуры клеток астроцитомы головного мозга человека А-172 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF приводит к увеличению количества белка HGF по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HGF на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF для повышения уровня экспрессии HGF в эукариотических клетках.
Пример 27. Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL2, несущего ген IL2, для повышения экспрессии белка IL2 в клетках млекопитающих.
Оценивали изменение количества белка IL2 в лизате культуры нейрональных прогениторных клеток человека АТСС- BXS0117 (АТСС ACS-5003) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL2, несущим ген IL2 человека. Клетки культивировали, как описано в примере 18.
Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IL2 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL2, несущий ген IL2 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию нейрональных прогениторных клеток человека ATCC-BXS0117 проводили, как описано в примере 19.
После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCI, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.
Количественное определение белка IL2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ELISA Kit for Interleukin 2 (IL2) (SEA073Hu, Cloud-Clone Corp., США) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IL2, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 5,9 пг/мл, диапазон измерения - от 15,6 пг/мл до 1000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 19.
Из фигуры 19 следует, что трансфекция культуры нейрональных прогениторных клеток человека ATCC-BXS0117 генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL2 приводит к увеличению количества белка IL2 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2 для повышения уровня экспрессии IL2 в эукариотических клетках. Пример 28.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IFNB1, несущего ген IFNB1, для повышения экспрессии белка IFNB1 в тканях человека. Для подтверждения эффективности генотерапевтического
ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего целевой ген, а именно, ген IFNB1 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка IFNB1 в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего ген человека IFNB1.
С целью анализа изменения количества белка IFNB1 трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущий ген IFNB1 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IFNB1.
Пациент 1, женщина 48 лет, (П1); пациент 2, женщина 66 лет, П2); пациент 3, мужчина, 44 года, (ПЗ). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, который содержит кДНК гена IFNB1 и генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена IFNB1, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя. Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущий ген IFNB1 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего ген IFNB1 - 0,5 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, несущего ген IFNB1 (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Количественное определение белка IFNB1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа, как это описано в примере 22.
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IFNB1 , входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 20.
Из фигуры 20 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12- IFNB1, несущего целевой ген IFNB1 человека, произошло увеличение количества белка IFNB1 в сравнении с количеством белка IFNB1 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген IFNB1 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-IFNB1 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.
Пример 29. Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL13, несущего ген IL13, для повышения экспрессии белка IL13 в тканях человека.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего целевой ген IL13 и реализуемости способа его применения оценивали изменение количества белка IL13 в мышечной ткани человека при введении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL13, несущего целевой ген, а именно, ген IL13 человека С целью анализа изменения количества белка IL13 трем пациентам вводили в ткань икроножной мышцы генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- IL13, несущий ген IL13 с транспортной молекулой, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IL13 с транспортной молекулой.
Пациент 1, женщина 49 лет, (П1); пациент 2, мужчина 54 года (П2); пациент 3, мужчина 53 года, (ПЗ). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция), пробоподготовку проводили в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12-IL13, несущий ген IL13 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину около 10 -12 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего ген IL13 - 1мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагали медиально на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT 1.8NAS12-IL1 3, несущего ген IL13 (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактного участка икроножной мышцы (III), используя устройство для взятия биопсии MAGNUM (BARD, США). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 20 куб. мм, масса - около 22 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-НС1 pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка IL13 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа, как это описано в примере 21.
Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IL13, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www. r-proiect.org/). Г рафики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 21.
Из фигуры 21 следует, что в икроножной мышце всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего целевой ген, а именно, ген IL13 человека, произошло увеличение количества белка IL13 в сравнении с количеством белка IL13 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген IL13 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутримышечном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека. Пример 30.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- IL2, несущего ген IL2, для повышения экспрессии белка IL2 в тканях человека. Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего целевой ген, а именно, ген IL2 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка IL2 в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего ген человека IL2.
С целью анализа изменения количества белка IL2 трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL2, несущий ген IL2 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, не содержащий кДНК гена IL2.
Пациент 1, женщина 52 года (П1); пациент 2, мужчина 39 лет (П2); пациент 3, мужчина, 40 лет (ПЗ). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL2, который содержит кДНК гена IL2 и генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена IL2, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
Генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор GDTT1.8NAS12-IL2, несущий ген IL2 вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего ген IL2 - 0,5 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения 5 генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего ген IL2 (I), генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо) (II), а также из интактных ю участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 is куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при го 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа, как это описано в примере 27.
Численное значение концентрации определяли с помощью 25 калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IL2, входящим в состав набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 22.
Из фигуры 22 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора GDTT1.8NAS12-IL2, несущего целевой ген IL2 человека, произошло увеличение количества белка IL2 в сравнении с количеством белка IL2 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо), не содержащего ген IL2 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-I2 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.
Пример 31.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL10, несущего ген IL10 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка IL10 в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12-IL10.
Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL10, несущего ген IL10 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка IL10 в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12-IL10. Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10, несущим ген IL10, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген IL10.
Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5 % С02 в среде DMEM с 10 % фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5x104 клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10, несущим ген IL10 или плацебо - вектор GDTT1.8NAS12, не несущий целевой ген IL10.
Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus Transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL10, и плацебо, представляющее 5 собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутологичных фибробластов 10 в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутологичных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.
Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения is культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10, несущим целевой ген, а именно, ген IL10 и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутологичных фибробластов, го трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10, несущим целевой ген, а именно, ген IL10 (С), культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим целевой ген IL10 (плацебо) (В), а 25 также из участков интактной кожи (А), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу в зоне отбора биоптата пациентов предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCI pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка, как это описано в примере 12.
Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 23.
Из фигуры 23 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL10, несущим ген IL10, произошло увеличение количества белка IL10 в сравнении с количеством белка IL10 в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12, не несущим ген IL10 (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL10 и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии IL10 в тканях человека, в частности при введении аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT 1.8NAS12-IL10.
Пример 32.
Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, несущего ген DDC, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, несущего ген BCL2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, несущего ген HGF, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- TNFSF10, несущего ген TNFSF10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, несущего ген TNFRSF4, для повышения уровня экспрессии белков DDC, BCL2, HGF, TNFSF10 и TNFRSF4 в тканях млекопитающих.
Оценивали изменение количества белков DDC, BCL2, HGF, TNFSF10 и TNFRSF4 в мышечной ткани крысы при сочетанном введении в зону этой ткани смеси генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- DDC, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4. Исследование проводили на 15 лабораторных животных - самцах крысы линии Wistar 8-ми месячного возраста массой 240-290 г., разбитых на три группы: группа К1 (5 животных) - введение смеси пяти генотерапевтических ДНК-векторов, несущих гены DDC, BCL2, HGF, TNFSF10, TNFRSF4; группа К2 (5 животных) - введения генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 (плацебо); группа КЗ (5 животных) - интактные животные. В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Эквимолярную смесь генотерапевтических ДНК-векторов GDTT1.8NAS12-DDC, GDTT1.8NAS12-BCL2, GDTT1.8NAS12-HGF, GDTT1.8NAS12- TNFSF10, GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 в пропорции 30 мкг каждого вектора растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.
5 Объем внутримышечно вводимого раствора составлял 0,15 мл с суммарным количеством ДНК 150 мкг. Введение раствора осуществляли с помощью инсулинового шприца. Через 2 сутки после процедуры крыс декапитировали.
Образцы отбирали на 2 сутки после введения ю генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсийного материала осуществляли из участков правой мышцы бедра всех животных: в зоне введения смеси пяти генотерапевтических ДНК-векторов, несущих гены DDC, BCL2, HGF, TNFSF10, TNFRSF4 (группа 1), в зоне введения плацебо is (группа 2), а также из участков мышечной ткани правой мышцы бедра животных, не подвергавшихся никаким манипуляциям (группа 3). Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-НС1 pH 7.6, 100 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, и гомогенизировали до го получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000д. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков, как это описано в примере 19 (количественное определение белка DDC), примере 25 25 (количественное определение белка BCL2), примере 26 (количественное определение белка HGF), примере 24 (количественное определение белка TNFSF10), примере 23 (количественное определение белка TNFRSF4). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 24. Из фигуры 24 следует, что в зоне мышечной ткани животных группы К1, которым вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12- DDC, несущего целевой ген DDC, генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, несущего целевой ген BCL2, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, несущего целевой ген HGF, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, несущего целевой ген TNFSF10, генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, несущего целевой ген TNFRSF4, произошло увеличение количества белков DDC, BCL2, HGF, TNFSF10 и TNFRSF4 по сравнению с зоной мышечной ткани группы животных К2 (плацебо) и зоной мышечной ткани животных группы КЗ (интактная группа). Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетанного применения генотерапевтических ДНК-векторов и подтверждают реализуемость способа применения для повышения уровня экспрессии целевых белков в тканях млекопитающих. Пример 33.
Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего ген IL13 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка IL13 в клетках млекопитающих. Для подтверждения эффективности генотерапевтического
ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, несущего ген IL13 оценивали изменение накопления мРНК целевого гена IL13 в мононуклеарных клетках периферической крови быка через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12- IL13, несущим ген IL13 человека.
Мононукпеарные клетки периферической крови быка выделяли из 50 мл венозной крови путем центрифугирования в градиенте раствора фиколла 1,077 (Панэко, Р052п) и культивировали в среде RPMI Media 1640 (GIBCO®, 11875-085) с добавлением 10 % лошадиной сыворотки Horse Serum (АТСС® 30-2040™) в стандартных условиях. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13, несущим ген IL13 человека и ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12, не несущим ген IL13 человека (контроль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификации и анализ данных проводили как описано в примере 12. В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером АН001 130.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов IL13 и ACT. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IL13 и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 25.
Из фигуры 25 следует, что в результате трансфекции мононуклеарных клеток периферической крови быка генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13, уровень специфической мРНК гена IL13 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IL13 на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-IL13 для повышения уровня экспрессии гена IL13 в клетках млекопитающих.
Пример 34.
Штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или штамм Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12- TNFSF10, или штамм Escherichia coli JM110-
NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамм Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, несущий генотерапевтический ДНК- вектор, и способ его получения.
Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, а именно штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или штамма
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамма
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамма
Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1:8NAS12-IL2, несущего генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT1 .8NAS12-IL10 или GDTT1 .8NAS12-IL13 или GDTT 1.8NAS12-IFNB1 или GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4 или GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или GDTT1.8NAS12-BCL2 или GDTT1.8NAS12-HGF или GDTT1.8NAS12-IL2 соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli JM110-NAS с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-DDC, или ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-IL10, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12- TNFSF10, или ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-BCL2, или ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-HGF, или ДНК-вектором
GDTT1.8NAS12-IL2, после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli JM110-NAS для наработки генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона ТпЮ для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо- содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена гесА с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.
Полученные штаммы для наработки были внесены в коллекции Национального биоресурсного центра Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов
(НБЦ ВКПМ), РФ и NCIMB Patent Deposit Service, UK с присвоением регистрационных номеров: штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC - регистрационный Ns ВКПМ В- _ , дата депонирования
14.01.2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns
NCIMB 43543, дата депонирования 06.01.2020; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10 - регистрационный Ns ВКПМ В- _ , дата депонирования
14.01.2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns
NCIMB 43540, дата депонирования 06.01.2020; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13 - регистрационный Ns ВКПМ В- _ , дата депонирования
14.01.2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns
NCIMB 43542, дата депонирования 06.01.2020; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 - регистрационный Ns ВКПМ В-13534, дата депонирования 27.11.2019; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns NCIMB 43525, дата депонирования 28.11.2019; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 - регистрационный Ns ВКПМ В- _ , дата депонирования
14.01.2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns NCIMB 43545, дата депонирования 06.01.2020; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10 - регистрационный Ns ВКПМ В- _ , дата депонирования
14.01.2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns
NCIMB 43539, дата депонирования 06.01.2020; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2 - регистрационный Ns ВКПМ В- _ , дата депонирования 14.01.2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns
NCIMB 43546, дата депонирования 06.01.2020; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF - регистрационный Ns ВКПМ В- _ , дата депонирования
14.01.2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns NCIMB 43541 , дата депонирования 06.01.2020; штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2 - регистрационный Ns ВКПМ В- _ , дата депонирования
14.01.2020; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Ns
NCIMB 43544, дата депонирования 06.01.2020. Пример 35.
Способ масштабирования получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 до промышленного масштаба.
Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC (SEQ ID N21), или GDTT 1.8NAS12-IL10 (SEQ ID Ns2), или GDTT1 .8NAS12-IL13 (SEQ ID Ns3), или GDTT1.8NAS12-IFNB1 (SEQ ID N°4), или GDTT 1.8NAS12-TNFRSF4 (SEQ ID N°5), или GDTT1.8NAS12-TNFSF10 (SEQ ID N°6), или GDTT1.8NAS12- BCL2 (SEQ ID N27), или G DTT 1.8NAS12-HGF (SEQ ID N28), или GDTT1.8NAS12-IL2 (SEQ ID N29) проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, а именно DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1, или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2. Каждый штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12- DDC, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4, или Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1 .8NAS12-TNFSF10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или Escherichia coli JM110-
NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, получали на базе штамма Escherichia coli JM110-NAS (Genetic Diagnostics and Therapy 21 Ltd, Великобритания) по примеру 34 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК- вектором GDTT1.8NAS12-DDC, или GDTT1.8NAS12-IL10, или GDTT 1.8NAS1 2-IL13, или GDTT1 .8NAS12-IFNB1 , или GDTT 1.8NAS1 2-TNFRSF4, или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или GDTT 1.8NAS12-BCL2, или GDTT 1.8NAS12-HGF, или
GDTT1.8NAS12-IL2, несущим целевой ген, а именно DDC, или IL10, или IL13, или IFNB1, или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2 с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.
Ферментацию полученного штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, несущего генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-DDC проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1 .8NAS12-DDC.
Для ферментации штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-DDC готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121 ОС 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors НТ, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической 5 плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 д. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-1 ООООд. Супернатант удаляли, к клеточной массе ю добавляли раствор 20 мМ TrisCI, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, pH 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, is добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора ЗМ ацетат натрия, 2М уксусная кислота, pH 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный го образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу A (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при 25 комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000д, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения ЮОкДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCI, pH 7.0. Операцию повторяли три - четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCI, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCI, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCI, pH 7.0, 1М NaCI в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно- солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12- DDC объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli JM110- NAS/GDTT 1.8NAS1 2-IL10, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT 1.8NAS1 2-IFNB1 , или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT 1.8NAS1 2-BCL2, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL2 проводили аналогичным образом.
Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT1.8NAS12-IL10 или
GDTT 1.8NAS1 2-IL13 или GDTT1 .8NAS12-IFNB1 или GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или GDTT 1.8NAS12-BCL2 или GDTT 1.8NAS12-HGF или
GDTT1.8NAS12-IL2.
Таким образом, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией белка, кодируемого данным геном, обеспечивая, таким образом, достижение терапевтического эффекта.
Задача, поставленная в данном изобретении, решена, а именно: конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2, сочетающих в себе следующие свойства:
I) Эффективность повышения экспрессии целевых генов в эукариотических клетках за счет полученных генотерапевтических векторов с минимальным размером;
II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-векгора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и генов а нти б и оти ко резистентности;
III) Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;
IV) Также решена задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производства этих генотерапевтических ДНК-векторов.
Это подтверждается примерами: для п. I - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33; для п. II - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33; для п. Ill и п. IV - пример 34, 35.
Промышленная применимость:
Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген DDC, ген IL10, ген IL13, ген IFNB1, ген TNFRSF4, ген TNFSF10, ген BCL2, ген HGF, ген IL2 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM110- N AS/G DTT 1.8 NAS 12-TN FRS F4 , или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или Escherichia coli JM110- N AS/G DTT 1.8NAS12-BCL2, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT 1.8NAS1 2-HGF, или Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, несущего генотерапевтический ДНК- вектор, способа получения генотерапевтического ДНК-вектора, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.
Перечень сокращений
GDTT1.8NAS12 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vector therapeutic virus- antibiotic-free)
L-DOPA - l-3,4-dihydroxyphenylalanine ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДАА - декарбоксилаза ароматических L-аминокислот кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота п.н. - пар нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция мл - миллилитр, мкп - микролитр куб. мм - кубический миллиметр л - литр мкг - микрограмм мг - миллиграмм г - грамм мкМ - микромоль мМ - миллимоль
МРТР - 1-метил-4-фенил-1, 2, 3,6-тетрагидропиридин мин - минута сек - секунда об/мин - обороты В МИНуту нм - нанометр см - сантиметр мВт - милливатт o.e. ф-относительная единица флуоресценции РВС - фосфатно-солевой буфер
РВМС - мононукпеарные клетки периферической крови ЦНС - центральная нервная система ЭЭМ - экспериментальный энцефаломиелит

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь
Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена DDC, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID Ns1.
2. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах,
146
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной 5 структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными ю демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена IL10, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL10, с is нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°2.
3. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и го функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического 25 склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь
Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов
147
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена IL13, клонированную в 5 генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NQ3.
4. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения ю заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального is функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с го нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит 25 кодирующую часть целевого гена IFNB1, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°4.
148
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
5. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена TNFRSF4, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°5.
6. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь
149
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена TNFSF10, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°6.
7. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT 1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный
150
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена BCL2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-BCL2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N27.
8. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-вектор содержит кодирующую часть целевого гена HGF, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°8.
9. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим
151
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, при этом генотерапевтический ДНК-векгор содержит кодирующую часть целевого гена IL2, клонированную в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12, с получением генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N°9.
10. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 по п.1., п.2., п.З., п.4., п.5., п.6., п.7., п.8., или п.9., отличающийся тем, что каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT1.8NAS12-IL10 или GDTT1 .8NAS12-IL13 или GDTT1.8NAS12-IFNB1 или GDTT1 .8NAS12-TNFRSF4 или GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или GDTT1 .8NAS12-BCL2 или GDTT1.8NAS12-HGF или GDTT1.8NAS12-IL2 по п.1., п.2., п.З., п.4., п.5., п.6., п.7., п.8., или п.9., за счет ограниченного
152
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) размера векторной части GDTT1.8NAS12, не превышающей 2600 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки человека и животных и экспрессировать клонированный в него целевой ген DDC или IL10 или IL13 или IFNB1 или TNFRSF4 или TNFSF10 или BCL2 или HGF или IL2.
11. Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 по п.1., п.2., п.З., п.4., п.5., п.6., п.7., п.8., или п.9., отличающийся тем, что в составе каждого из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT 1.8NAS12-IL10 или GDTT1.8NAS12-IL13 или
GDTT 1.8NAS12-IFNB1 или GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или GDTT1.8NAS12-BCL2 или GDTT 1.8NAS12-HGF или GDTT1.8NAS12-IL2 по п.1., п.2., п.З., п.4., п.5., п.6., п.7., п.8., или п.9., в качестве структурных элементов используются нуклеотидные последовательности, которые не являются генами антибиотикорезистентности, вирусными генами и регуляторными элементами вирусных геномов, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.
12. Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 по п.1., п.2., п.З., п.4„ п.5., п.6., п.7., п.8., или п.9., заключающийся в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: GDTT1.8NAS12-DDC или GDTT1.8NAS12-IL10 или GDTT 1.8NAS12-IL13 или
GDTT1.8NAS12-IFNB1 или GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или
153
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или GDTT1.8NAS12-BCL2 или GDTT1.8NAS12-HGF или GDTT1.8NAS12-IL2 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена DDC или IL10 или IL13 или IFNB1 или TNFRSF4 или TNFSF10 или BCL2 или HGF или IL2 клонируют в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 и получают генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1 .8NAS12-DDC, SEQ ID Ns1 , или GDTT1.8NAS12- IL10, SEQ ID N°2 ИЛИ GDTT1.8NAS12-IL13, SEQ ID N°3, или GDTT1.8NAS12-IFNB1, SEQ ID N24, или GDTT1.8NAS12- TNFRSF4, SEQ ID N25 или GDTT1.8NAS12-TNFSF10, SEQ ID N26, ИЛИ G DTT 1.8 NAS 12-BC L2 , SEQ ID N°7, или
GDTT1.8NAS12-HGF, SEQ ID N28, ИЛИ GDTT1.8NAS12-IL2, SEQ ID N29 соответственно, при этом кодирующую часть целевого гена DDC или IL10 или IL13 или IFNB1 или TNFRSF4 или TNFSF10 или BCL2 или HGF или IL2 получают путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с использованием созданных олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации соответствующими эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12 проводят по сайтам рестрикции Sail и Hindlll, или Sail и Kpnl, или BamHI и Sail, причем селекцию проводят без антибиотиков, при этом при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-DDC, SEQ ID Ns1 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР- амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
DDC-F ATCGTCGACCACCATGAACGCAAGTGAGTTCCGA,
154
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) DDC-R ACCAAGCTT СТ АСТСССТ CTCTG , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена DDC в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и Hindlll, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL10, SEQ ID N°2 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IL10-F AGGATCCACCATGCACAGCTCAGCACTGC,
IL10-R СТТ GTCGACT С AGTTTCGT АТ СТТ С ATT GT С , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL10 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL13, SEQ ID NQ3 ДЛЯ проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IL13-F AGGATCCACCATGCATCCGCTCCTCAATC,
IL13-R СТТ GTCGACT С AGTT G ААСТ GTCCCT CG , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL13 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IFNB1, SEQ ID Ns4 для проведения реакции
155
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IFNB1-F AAAGG АТ СС ACC AT G ACC ААС AAGT GT СТ ССТ СС ААА,
IFNB1-R
ТТТ GT CG ACT С AGTTTCGG AGGT ААССТ GT AAGT СТ G , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IFNB1 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, SEQ ID Ne5 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
TNFRSF4-F AGGATCCACCATGTGCGTGGGGGCTCGG, TNFRSF4-R СТТ GT CGACT CAGAT CTTGGCCAGGGTG, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена TNFRSF4 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-TNFSF10, SEQ ID N°6 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
TNFSF10-F AGG АТ СС ACC AT GGCT AT G AT GGAGGT ССА, TNFSF10-R TGTCGACTCAGCCAACTAAAAAGGCCCCGA,
156
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена TNFSF10 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора
GDTT1.8NAS12-BCL2, SEQ ID NQ7 ДЛЯ проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды: BCL-F ATCGTCGACCACCATGGCGCACGCTGGGAGA,
BCL-R TTCGGTACCTCACTTGTGGCCCA, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена BCL2 в генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и Kpnl, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-HGF, SEQ ID N°8 для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
HG F_F TTTGG АТ СС ACC AT GT GGGT G ACC АААСТ CCTGCC А, HGF_R
ААТ GTCG АССТ AT G ACT GT GGT АССТТ AT AT GTT ААААТ, а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена HGF в генотерапевтический ДНК-вектор
GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail, причем при получении генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12-IL2, SEQ ID N°9 для проведения реакции
157
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, в качестве созданных для этого олигонуклеотидов используют олигонуклеотиды:
IL2-F AGG АТССАСС AT GT АС AGG ATGC ААСТ ССТ,
5 IL2-R Т GT CG ACT С AAGT С AGT GTT GAG AT G AT G , а расщепление продукта амплификации и клонирование кодирующей части гена IL2 в генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12 проводят с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и Sail. ю
13. Способ использования генотерапевтического ДНК- вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1. 8NAS1 2, несущего целевой ген DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 по п.1., п.2., п.З., п.4., п.5., п.6., п.7., п.8., или п.9., для лечения заболеваний,
15 характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования го нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением 25 кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, заключающийся в трансфекции выбранным
158
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) генотерапевтическим ДНК-вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК- векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, клеток органов и тканей пациента или животного, и/или во введении в органы и ткани пациента или животного аутологичных клеток этого пациента или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК- вектором, несущим целевой ген на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК- векторами, несущими целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12 и/или во введении в органы и ткани пациента или животного выбранного генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген на основе генотерапевтического ДНК- вектора GDTT1.8NAS12 или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1 .8NAS12, из созданных генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, или в сочетании обозначенных способов.
14. Способ получения штамма для производства генотерапевтического ДНК-вектора по п.1., п.2., п.З., п.4., п.5.,
159
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) п.6., п.7., п.8., или п.9 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, заключающийся в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichiacoli JM110-NAS с последующим проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-DDC или генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12-IL10 или генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IL13 или генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-IFNB1 или генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-BCL2 или генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1.8NAS12-HGF или генотерапевтическим ДНК-вектором GDTT1 .8NAS12-IL2, после чего клетки высеивают на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон,
160
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола с получением в результате штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-DDC или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL10 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL13 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2.
15. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-DDC, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными
161
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
16. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL10, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
17. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL13, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и
162
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь 5 Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного ю мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
18. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, is полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим го патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь 25 Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь
Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного
163
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
19. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-
TNFRSF4, полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
20. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-
TNFSF10, полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFSF10, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора
164
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
21. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-BCL2, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь
165
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
22. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HGF, для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
23. Штамм Escherichiacoli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, полученный способом по п.14., несущий генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-IL2, для его наработки с
166
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) возможностью селекции без использования антибиотиков при получении генотерапевтического ДНК-вектора для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз.
24. Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущего целевой ген DDC или IL10 или IL13 или IFNB1 или TNFRSF4, или TNFSF10, или BCL2, или HGF, или IL2 по п.1., п.2., п.З., п.4., п.5., п.6., п.7., п.8., или п.9 для лечения заболеваний, характеризующихся прогрессирующим патологическим изменением структуры нервной ткани и функции нейронов, в том числе их гибелью, ассоциированным с генетическими факторами, в том числе, с мутациями в генах, кодирующих критически значимые для нормального функционирования нейронов белки, включая болезнь Гентингтона, наследуемые
167
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) формы бокового амиотрофического склероза, а также с нарушением сворачивания третичной структуры белков, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, с травмами центральной нервной системы, с нарушением кислородного снабжения головного или спинного мозга, с отклонениями в энергетическом метаболизме нейронов и аксональном транспорте, или с аутоиммунными демиелинизирующими процессами, включая рассеянный склероз, заключающийся в том, что генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-DDC или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IL10 или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IL13 или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IFNB1 или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-BCL2 или генотерапевтический ДНК-вектор GDTT1.8NAS12-HGF или генотерапевтический ДНК- вектор GDTT1.8NAS12-IL2 получают путем того, что засевают в колбу с приготовленной средой затравочную культуру, выбранную из штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-DDC или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL10 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IL13 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1 или штамма Escherichia coli JM110- NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4 или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1 .8NAS12-BCL2 или штамма Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF или штамма Escherichia coli JM1 10-NAS/GDTT1 .8NAS12-IL2, затем инкубируют
168
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) затравочную среду в шейкере-инкубаторе и переносят ее в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.
169
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2021/000015 2020-01-15 2021-01-15 Генотерапевтический днк-вектор WO2021145793A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020101299 2020-01-15
RU2020101299A RU2734726C1 (ru) 2020-01-15 2020-01-15 Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, выбранный из группы генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021145793A1 true WO2021145793A1 (ru) 2021-07-22

Family

ID=72948956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/000015 WO2021145793A1 (ru) 2020-01-15 2021-01-15 Генотерапевтический днк-вектор

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2734726C1 (ru)
WO (1) WO2021145793A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4808523A (en) * 1984-11-07 1989-02-28 Yeda Research And Development Co., Ltd. Constitutive production of human IFN-β1 by mammalian cells transformed by the IFN-β1 gene fused to an SV40 early promoter
WO1998006863A1 (en) * 1996-08-14 1998-02-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A vector for polynucleotide vaccines
US7598058B2 (en) * 1998-04-03 2009-10-06 Penn State Research Foundation Nucleic acids encoding IL13 mutants
RU2678756C1 (ru) * 2017-08-25 2019-01-31 Селл энд Джин Терапи Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4808523A (en) * 1984-11-07 1989-02-28 Yeda Research And Development Co., Ltd. Constitutive production of human IFN-β1 by mammalian cells transformed by the IFN-β1 gene fused to an SV40 early promoter
WO1998006863A1 (en) * 1996-08-14 1998-02-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A vector for polynucleotide vaccines
US7598058B2 (en) * 1998-04-03 2009-10-06 Penn State Research Foundation Nucleic acids encoding IL13 mutants
RU2678756C1 (ru) * 2017-08-25 2019-01-31 Селл энд Джин Терапи Лтд Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF, способ его получения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17, несущий генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, способ его получения

Also Published As

Publication number Publication date
RU2734726C1 (ru) 2020-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210198688A1 (en) Circular RNA For Translation In Eukaryotic Cells
CN112266411B (zh) 一种新型冠状病毒疫苗及其应用
CN114787357A (zh) 用于编辑靶标rna的添加了功能性区域的反义型指导rna
JP2001514490A (ja) 異種タンパク質の発現
KR20160144431A (ko) 메토트렉세이트 선택과 연결된 슬리핑 뷰티 트랜스포존에 의한 조작된 t-세포의 생산
KR20140137455A (ko) 인공 핵산 분자
JP6918231B2 (ja) 遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７と生産方法；大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦと生産方法；遺伝子治療ＤＮＡベクターＶＴｖａｆ１７を保持する大腸菌株ＳＣＳ１１０−ＡＦ／ＶＴｖａｆ１７と生産方法
KR20080085074A (ko) 조류 텔로머라아제 역전사효소
KR20180131545A (ko) 트랜스포존 시스템 및 사용 방법
US20210054370A1 (en) Methods and compositions for treating angelman syndrome
KR20190021211A (ko) 인터루킨 10의 항-염증 효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물
WO2018212361A1 (en) Method of treating diseases associated with myd88 pathways using crispr-gndm system
RU2734726C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, выбранный из группы генов DDC, IL10, IL13, IFNB1, TNFRSF4, TNFSF10, BCL2, HGF, IL2 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-DDC, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL13, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFRSF4, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-TNFSF10, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-BCL2, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-HGF, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
WO2021206587A1 (en) Sars-cov-2 dna vaccine based on gene therapy dna vector gdtt1.8nas12
US20240307558A1 (en) Gene therapy DNA vector based on gene therapy DNA vector VTvaf17 carrying the therapeutic gene selected from the group of KRT5, KRT14, LAMB3, and COL7A1 genes for increasing the expression level of these therapeutic genes, method of its production and use, Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-KRT5, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-KRT14, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1 carrying the gene therapy DNA vector, m
RU2741570C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора GDTT1.8NAS12, несущий целевой ген, выбранный из группы генов IFNB1, IFNA14, IFNA2, IL12A, IL12B для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNB1, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA14, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IFNA2, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12A, или Escherichia coli JM110-NAS/GDTT1.8NAS12-IL12B, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
US11352639B2 (en) Gene therapy based on vector VTVAF17
WO2021137742A1 (ru) Генотерапевтический днк-вектор
JP2023532415A (ja) 改変セマフォリン３ａ、それを含む組成物およびその使用
RU2705252C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген CFTR, или NOS1, или AQ1, или AQ3, или AQ5, для лечения заболеваний, связанных с необходимостью повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и использования, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CFTR, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NOS1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-AQ1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-AQ3, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-AQ5, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
US12128112B2 (en) Gene therapy DNA vectors based on VTVAF17
US20240060083A1 (en) Gene therapy DNA vector based on gene therapy DNA vector VTvaf17 carrying the therapeutic gene selected from the group of SHH, CTNNB1, NOG, and WNT7A genes for increasing the expression level of these therapeutic genes, method of its production and use, Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-SHH, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-CTNNB1, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-NOG, or Escherichia coli strain SCS110-AF/VTvaf17-WNT7A carrying the gene therapy DNA vector, method
KR102315736B1 (ko) Apoe4 rna 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도
WO2020130873A1 (en) Gene therapy dna vector vtvaf17
WO2024006955A1 (en) Engineered t cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21740862

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21740862

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1