WO2021132661A1 - ライブラリーの製造方法、環状ペプチド、ＦＸＩＩａ結合剤、及びＩＦＮＧＲ１結合剤 - Google Patents

ライブラリーの製造方法、環状ペプチド、ＦＸＩＩａ結合剤、及びＩＦＮＧＲ１結合剤 Download PDF

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amino acid
xaa
peptide
caa
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裕明 菅
敬行 加藤
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国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a library, a cyclic peptide, an FXIIa binder, an IFNGR1 binder, and the like.
  • Non-natural amino acids such as ⁇ and ⁇ other than ⁇ -amino acids are present in natural products, and these are known to contribute to biological activity, peptidase resistance, target specificity, and membrane permeability. There is.
  • the reason for the low uptake efficiency is thought to be mainly due to the slow rate of ⁇ -aminoacyl-tRNA being introduced into the ribosome A site by EF-Tu and the slow rate of peptidyl transfer between ⁇ -amino acids. There is. In addition, slow peptidyl transfer is thought to cause ribosome arrest and shedding of peptidyl tRNA from the ribosome.
  • Patent Document 1 proposes a method of applying the translation factor EF-P and the recombinant tRNA Pro1E2 to ribosome synthesis. According to the method of Patent Document 1, by using tRNA Pro1E2 , the uptake efficiency of specific D-amino acids and acyclic ⁇ -amino acids is improved, and uptake into peptides is possible seven times in a row.
  • a cyclic peptide containing ⁇ , ⁇ , and ⁇ -cyclic amino acids can be expressed using a cell-free translation system, and the present invention has been found. Has been completed.
  • ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids may be referred to as cAA.
  • the present invention is as follows.
  • a cyclic peptide comprising at least one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA) within the cyclic structure.
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof
  • At least one of Xaa is one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA).
  • n1 is an integer from 2 to 28.
  • a method for producing a library containing two or more cyclic peptides At least one of the cyclic peptides contained in the library It has a cyclic structure composed of 4 to 30 amino acids or derivatives thereof, and has a cyclic structure.
  • a cyclic peptide comprising at least one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA) within the cyclic structure.
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof At least one of Xaa is one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA).
  • n1 is an integer from 2 to 28.
  • a step of preparing an mRNA library encoding a peptide containing A step of binding puromycin to the 3'end of each mRNA of the mRNA library to produce a puromycin-bound mRNA library; A step of expressing the peptide by a cell-free translation system using the puromycin-binding mRNA library to produce a peptide-mRNA complex library; including, How to make a library.
  • the cell-free translation system contains a tRNA charged with one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA), and the tRNA has a D-arm structure that interacts with EF-P. Or a tRNA that does not have a D-arm structure that interacts with EF-P, The method for producing a library according to [1] or [2].
  • the cell-free translation system comprises a tRNA charged with one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA), wherein the tRNA is at least one selected from tRNA Pro1E2 and tRNA GluE2. is there, The method for producing a library according to any one of [1] to [3].
  • the peptide containing the sequence represented by the formula (1) is represented by the formula (2); Xaa1- (Xaa) n1- Xaa2- (Xaa x ) m (2)
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof At least one of Xaa is one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA).
  • Xaa1 and Xaa2 are amino acids or derivatives thereof that form a ring of a cyclic peptide.
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof n1 is an integer from 2 to 28, m represents an integer from 0 to 10.
  • Equation (I-1) (In equation (I-1), p1 is an integer from 1 to 4.) Equation (I-2); (In equation (I-2), p2 is an integer from 1 to 4.) Equation (I-3); (In equation (I-3), p3 is an integer of 1 or 2.) Equation (I-4); H 2 N-Ar-COOH (I-4) (In formula (I-4), Ar is a divalent aromatic group, and the aromatic ring in the aromatic group may be substituted with one or more substituents.) Represented by, The method for producing a library according to any one of [1] to [5].
  • cAA At least one ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (i) selected from, and / or At least one ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (ii) selected from Cell-free translation system, A tRNA with a D-arm structure that interacts with EF-P, charged with ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (i), and / or A tRNA that is charged with ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (ii) and does not have a D-arm structure that interacts with EF-P.
  • the method for producing a library according to any one of [1] to [8].
  • the tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P, charged with ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (i), is tRNA Pro1E2.
  • a tRNA that is charged with a ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (ii) and does not have a D-arm structure that interacts with EF-P is tRNA GluE2 .
  • Two of the 4 to 30 amino acids having a cyclic structure or derivatives thereof, Xaa1 and Xaa2, which are derivatives thereof, include a structure for forming a cyclic structure.
  • the Xaa1 and the Xaa2 have a structure in which they are linked via an amino acid sequence composed of 2 to 28 amino acids or derivatives thereof.
  • the amino acid sequence composed of the amino acids 2 to 28 or a derivative thereof is composed of at least one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA), and any amino acid or a derivative thereof.
  • Ru, Cyclic peptide or pharmaceutically acceptable salt thereof is
  • the cyclic peptide is represented by the formula (3); Xaa1- (Xaa) n1- Xaa2- (Xaa x ) m (3)
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof
  • At least one of Xaa is a ⁇ -cyclic amino acid (c ⁇ AA)
  • Xaa1 and Xaa2 are amino acids or derivatives thereof that form a ring of a cyclic peptide.
  • n1 is an integer from 10 to 16
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof
  • m represents an integer from 0 to 10.
  • Xaa is a basic amino acid or a derivative thereof
  • n1 in Eq. (3) is one of the following f1 to f4.
  • cAA is a ⁇ -cyclic amino acid.
  • the cyclic peptide is represented by the formula (3-1); [In equation (3-1), Xaa is any amino acid or derivative thereof cAA is a ⁇ -cyclic amino acid, n1a is an integer of 3 to 7, n1b is an integer of 2 to 8 (where the sum of n1a and n1b is an integer of 9 to 15). Xaa x is any amino acid or derivative thereof Xaa1 is Phe or Tyr m represents an integer from 0 to 10. However, (Xaa) n1a does not include cAA. ] Represented by, [13] The cyclic peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • At least one of Xaa is a basic amino acid or a derivative thereof.
  • the difference (absolute value) between n1a and n1b is 4 or less, The cyclic peptide according to [16] or [17] or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the cyclic peptide is one of the following F1 to F4.
  • cAA is a ⁇ -cyclic amino acid independently and Xaa x is any amino acid or derivative thereof m represents an integer from 0 to 10.
  • Equation (I-1) [20] ⁇ -Cyclic amino acids Equation (I-1); (In equation (I-1), p1 is an integer from 1 to 4.) Represented by The cyclic peptide according to any one of [13] to [19] or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the cyclic peptide is represented by the formula (4); Xaa1- (Xaa) n1- Xaa2- (Xaa x ) m (4)
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof
  • At least one of Xaa is a ⁇ -cyclic amino acid (cAA)
  • Xaa1 and Xaa2 are amino acids or derivatives thereof that form a ring of a cyclic peptide.
  • n1 is an integer from 9 to 15
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof
  • m represents an integer from 0 to 10.
  • n1 in Eq. (4) is one of the following i1-1 to i1-6.
  • cAA is a ⁇ -cyclic amino acid.
  • the cyclic peptide is represented by the formula (4-1); [In equation (4-1), Xaa is any amino acid or derivative thereof cAA is a ⁇ -cyclic amino acid, n1a is an integer of 3 to 6, n1b is an integer of 5 to 8 (where the sum of n1a and n1b is an integer of 8 to 14).
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof
  • Xaa1 is Phe or Tyr m represents an integer from 0 to 10.
  • (Xaa) n1a does not include cAA.
  • the cyclic peptide is one of the following I1-1 to I1-6.
  • cAA is a ⁇ -cyclic amino acid independently and Xaa x is any amino acid or derivative thereof m represents an integer from 0 to 10.
  • An activated blood coagulation factor XII (FXIIa) binder comprising the cyclic peptide according to any one of [13] to [20], or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a type II interferon receptor complex (IFNGR1) binder comprising the cyclic peptide according to any one of [21] to [25], or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a is the secondary structure of tRNA Pro1E2 CGG.
  • the D arm motif for binding to EF-P contains a 9-base D-loop closed by a stable 4-base pair stem. It also has an EF-Tu-bound T-stem motif.
  • b is the secondary structure of tRNA GluE2 GAU. It has a T-stem motif with EF-Tu binding, which is identical to tRNA Pro1E2.
  • c is the tRNA fMet CAU used for the uptake of ClAc D-Phe by the start codon AUG.
  • I, II, III, and IV are (1R, 2R) -2-ACPC, (1R, 2S) -2-ACPC, (1S, 2R) -2-ACPC and (1S, 2S) -2-ACPC, respectively. It is a figure which shows the result of the expression level of the peptide when the peptide was introduced into the peptides rP1 to rP10.
  • 2-ACPC was assigned to the CCG codon using a precharged 2-ACPC-tRNA Pro1E2 CGG.
  • the black bar is the translation done in the presence of EF-P (EF-P (+)), and the white bar is the translation done in the absence of EF-P (EF-P (-)).
  • the numbers on the bar graph indicate the ratio of the expression level in the absence of EF-P to the expression level in the presence of EF-P (EF-P (+) / EF-P (-)).
  • the concentration of EF-P when performed in the presence of EF-P was 5 ⁇ M.
  • the reaction time was 30 minutes. ND indicates that it was not detected.
  • a, b, c, d, and e are (1R, 2R) -2-ACPC, (1R, 2S) -2-ACPC, (1S, 2R) -2-ACPC, (1S, 2S)-, respectively. It is a figure which shows the analysis result of tricine SDS-PAGE when 2-ACPC and 2-ACHC were introduced into a peptide.
  • the black bar is the translation done in the presence of EF-P (EF-P (+)), and the white bar is the translation done in the absence of EF-P (EF-P (-)).
  • the numbers on the bar graph indicate the ratio of the expression level in the absence of EF-P to the expression level in the presence of EF-P (EF-P (+) / EF-P (-)).
  • the concentration of EF-P when performed in the presence of EF-P was 5 ⁇ M.
  • the reaction time was 30 minutes. ND indicates that it was not detected.
  • e, f, g, and h are (1R, 2R) -2-ACHC, (1R, 2S) -2-ACHC, (1S, 2R) -2-ACPC, and (1S, 2S) -2, respectively.
  • the arrows, "Calcd.”, “Obsd.”, And * in the spectrum are synonymous with those in FIG.
  • FIG. It is a figure which shows the MALDI-TOF MS spectrum of peptides rP11, rP12, and rP13.
  • the arrows, "Calcd.”, “Obsd.”, "N.D.”, and * in the spectrum are synonymous with those in FIG.
  • Hydrogen bonds are shown by broken lines.
  • the local turn structure is the point indicated by the arrow.
  • b is the overall structure of the complex of FXIIa and F3.
  • the S1 pocket containing the Arg residue (Arg6) of the substrate is shown by the dotted line.
  • c indicates the binding of the Asp5-ACHC8 segment to FXIIa.
  • d indicates the binding of F3 to FXIIa in the central part of the molecule.
  • a indicates the sequence of the peptide (rP1) corresponding to mRNA (mR1).
  • the Abz derivative is assigned to the CCG codon using a precharged aminoacyl-tRNA Pro1E2 CGG.
  • the flag is GACUACAAGGACGACGACGACAAG in mR1 and Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys in rP1 (same in FIGS. 13 and 14).
  • b is a diagram showing the MALDI-TOF MS spectrum of a peptide containing an Abz derivative. The arrows, "Calcd.”, "Obsd.”, * In the spectrum are synonymous with those in FIG.
  • c is a diagram showing the expression level of the rP1 peptide estimated by autoradiography.
  • the black bar is the translation done in the presence of EF-P (EF-P (+)), and the white bar is the translation done in the absence of EF-P (EF-P (-)).
  • the numbers on the bar graph indicate the ratio of the expression level in the absence of EF-P to the expression level in the presence of EF-P (EF-P (+) / EF-P (-)).
  • a indicates the sequence of the peptide (rP2-rP4) corresponding to mRNA (mR2-mR4).
  • b indicates the expression level of peptides (rP1 to rP4) estimated by autoradiography. N.D. indicates that it was not detected.
  • c is a diagram showing the MALDI-TOF MS spectrum of the rP4 peptide containing Abz. Arrows indicate monovalent ions of the desired peptide. "Calcd.” And “Obsd.” Are synonymous with those in FIG. It is a figure which shows the ribosome uptake into a cyclic peptide (rP5 to rP10) of an Abz derivative.
  • a indicates the sequence of the cyclic peptide (rP5 to rP10) corresponding to mRNA (mR5 to mR10).
  • b is a diagram showing the MALDI-TOF MS spectrum of the peptide (rP5-rP10).
  • the arrows, "Calcd.”, "Obsd.”, * In the spectrum are synonymous with those in FIG.
  • It is a figure which shows the structure of the rP8 peptide containing Abz or Abz 5OMe.
  • a is the secondary structure of ⁇ hRNA.
  • b is the secondary structure of tRNA Pro1E2 CGG.
  • the D arm motif for binding to EF-P contains a 9-base D-loop closed by a stable 4-base pair stem. It also has an EF-Tu-bound T-stem motif.
  • the sequence of the anticodon loop is modified as appropriate to decode another codon as described in Table 14.
  • c is the tRNA fMet CAU used for the uptake of ClAc D-Tyr and ClAc D-Phe by the start codon AUG.
  • d is the tRNA GluE2 CGG used for the uptake of (1S, 2S) -2-ACPC by the CCG codon.
  • a, b, c, and d are diagrams showing the analysis results of acid denaturation PAGE when ⁇ hRNA was aminoacylated with anhydrides of Abz, Abz 5OH , Abz 5OMe , and Abz 5F, respectively. Each band was detected by ethidium bromide staining.
  • the middle arrow indicates the desired monoaminoacyl ⁇ hRNA, and the upper and lower arrows indicate the positions of the multiaminoacyl ⁇ hRNA and the unreacted ⁇ hRNA, respectively.
  • a, b, c, and d are diagrams showing MALDI-TOF MS spectra of aminoacyl ⁇ hRNA when aminoacylated with Abz, Abz 5OH , Abz 5OMe , and Abz 5F, respectively.
  • the arrow pointing to the second largest peak from the left indicates the desired monoaminoacyl ⁇ hRNA peak.
  • Arrows on the higher molecular weight side (high m / z side) indicate multiaminoacyl ⁇ hRNA, and arrows on the lower molecular weight side (low m / z side) indicate unreacted ⁇ hRNA.
  • “Calcd.” And "Obsd.” are synonymous with those in FIG. ⁇ indicates potassium adduct.
  • a, b, c, and d are the analysis results of acid-denatured PAGE when ⁇ hRNA was aminoacylated using cyanomethyl ester (CME) and flexizyme (eFx) of Apy, Atp, Atz, and 3N Abz, respectively. It is a figure which shows. The upper and lower arrows indicate the positions of the desired aminoacyl ⁇ hRNA and unreacted ⁇ hRNA, respectively.
  • a, b, c, and d are diagrams showing MALDI-TOF MS spectra of aminoacyl ⁇ hRNA when aminoacylated with Apy, Atp, Atz, and 3N Abz, respectively.
  • the arrows on the high molecular weight side indicate the desired monoaminoacyl ⁇ hRNA. Arrows on the low molecular weight side (low m / z side) indicate unreacted ⁇ h RNA.
  • "Calcd.” And “Obsd.” are synonymous with those in FIG. * And ⁇ indicate sodium adduct and potassium adduct, respectively.
  • the results of tricine SDS-PAGE analysis of the rP1 peptide containing the Abz derivative in FIG. 12c are shown.
  • the results of tricine SDS-PAGE analysis of the peptides containing Abz (rP1 to rP4) in FIG. 13b are shown.
  • the present invention is a method for producing a library containing two or more cyclic peptides. At least one of the cyclic peptides contained in the library in the present invention It has a cyclic structure composed of 4 to 30 amino acids or derivatives thereof, and has a cyclic structure. A cyclic peptide containing at least one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA) in the cyclic structure.
  • cAA ⁇ -cyclic amino acids
  • One of the methods for producing the library of the present invention is Array represented by equation (1); -(Xaa) n1- (1)
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof At least one of Xaa is one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA).
  • n1 is an integer from 2 to 28.
  • step of preparing an mRNA library encoding a peptide containing A step of expressing the peptide by a cell-free translation system using the mRNA library to produce the library; including.
  • one of the methods for producing the library of the present invention is Array represented by equation (1); -(Xaa) n1- (1)
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof
  • At least one of Xaa is one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA).
  • n1 is an integer from 2 to 28.
  • step of preparing an mRNA library encoding a peptide containing A step of binding puromycin to the 3'end of each mRNA of the mRNA library to produce a puromycin-bound mRNA library; A step of expressing the precursor peptide by a cell-free translation system using the puromycin-binding mRNA library to produce a peptide-mRNA complex library; including.
  • ⁇ -amino acid residues or ⁇ -amino acid residues are present in the peptide chain, their stable helical properties allow them to form a unique folding structure.
  • ⁇ -amino acids can also induce the turn structure of peptides such as ⁇ -turns and ⁇ -turns.
  • cyclic ⁇ - and ⁇ -amino acids (also referred to as c ⁇ AA and c ⁇ AA) act as particularly strong helix / turn inducers. Therefore, if cyclic ⁇ - and ⁇ -amino acids can be introduced into a cyclic peptide, the peptide may exhibit rigidity.
  • a cyclic peptide containing a cyclic amino acid such as a cyclic ⁇ - or ⁇ -amino acid can be obtained.
  • the present inventors have newly found that ribosome synthesis can be applied to cyclic amino acids which are non-natural ⁇ - or ⁇ -amino acids and also have a bulky and rigid structure.
  • cyclic peptide means a peptide having at least a cyclic structure formed by four or more amino acids in the molecule.
  • the molecular structure of the cyclic peptide in addition to the cyclic structure, it may have a chain structure in which amino acids are linked by peptide bonds, or it may have a structure other than the peptide structure.
  • cyclic structure means a ring-closed structure formed in a molecule by two amino acids separated by two or more amino acid residues in a linear peptide.
  • separated by two or more amino acid residues means that at least two amino acids are present between the two amino acids.
  • library refers to a group of cyclic peptides containing two or more types of cyclic peptides.
  • the cyclic peptide in the present invention contains at least one cAA of ⁇ -cyclic amino acid (c ⁇ AA), ⁇ -cyclic amino acid (c ⁇ AA), and ⁇ -cyclic amino acid (c ⁇ AA).
  • the cyclic peptide in the present invention is an artificial amino acid variant and / or a derivative (also referred to as an “amino acid derivative” in the present specification) in addition to a natural amino acid (also simply referred to as “amino acid” in the present specification). May include.
  • Examples of the amino acids constituting the cyclic peptide in the present invention include natural proteinaceous L-amino acids, unnatural amino acids, and chemically synthesized compounds having characteristics known in the art that are characteristic of amino acids. ..
  • Proteinogenic amino acids are represented by the three-letter notation well known in the art, Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, and Val.
  • proteinaceous amino acids are represented by one-letter notation well known in the art, R, H, K, D, E, S, T, N, Q, C, G, P, A, I, L, M. , F, W, Y, and V.
  • the non-proteinogenic amino acids mean natural or non-natural amino acids other than proteinogenic amino acids.
  • unnatural amino acids examples include ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids ( ⁇ -methylalanine, etc.), N-alkyl amino acids, D-amino acids, and ⁇ -amino acids ( ⁇ here), which have different main chain structures from the natural type.
  • -Amino acids are amino acids other than c ⁇ AA), ⁇ -hydroxyic acid, amino acids with different side chain structures (norleucine, homohistidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (“homo” amino acids) , Homophenylalanine, homohistidine, etc.), and amino acids (cysteine acid, etc.) in which the carboxylic acid functional group in the side chain is replaced with a sulfonic acid group.
  • Specific examples of unnatural amino acids include the amino acids described in International Publication No. 2015/030014.
  • amino acid derivative in the present invention are N-alkyl- ⁇ -amino acids, which are amino acids in which an alkyl group is bonded to an amino group at the ⁇ -position.
  • the number of amino acid residues forming a cyclic structure is not particularly limited as long as it is 4 or more. Good.
  • the number of amino acid residues forming the cyclic structure is not particularly limited as long as it is 30 or less, but may be 25 or less, 20 or less, 18 or less, 17 or less, 16 or less, and 15 or less.
  • the number of amino acids forming a cyclic structure is usually 5 or more and 30 or less, and the number of amino acids forming a cyclic structure is 6 or more, 8 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more within the range of 5 or more and 30 or less. It may be 30 or less, 25 or less, 20 or less, 18 or less, 17 or less, 15 or less.
  • the number of amino acids forming the cyclic structure may be 8 or more and 20 or less, 8 or more and 17 or less, 9 or more and 17 or less, 10 or more and 15 or less, or 10 or more and 13 or less.
  • the number of amino acids forming the cyclic structure is preferably 9 or more and 25 or less, more preferably 10 or more and 20 or less, still more preferably 10 or more and 18 or less, from the viewpoint of functionality such as expression of the folded structure of the cyclic peptide.
  • the number of amino acids forming the cyclic structure may be 11 or more and 17 or less, 12 or more and 18 or less, 12 or more and 18 or less, and 11 or more and 16 or less.
  • the cyclic peptide may be modified such as phosphorylation, methylation, acetylation, adenylylation, ADP ribosylation, glycosylation, and addition of polyethylene glycol, and other peptides. And / or may be fused with a protein.
  • the cyclic peptide may also be biotinylated or labeled via a suitable linker.
  • the cyclic peptide may be a dimer having two cyclic structures in a molecule in which two cyclic peptides having one cyclic structure are bound via a linker structure, and in the molecule. It may have an intramolecular lactam bridge structure forming a lactam structure.
  • the linker structure connecting the two cyclic peptides is not particularly limited, and a linker having a well-known structure as a linker connecting the peptides in the field of peptide synthesis can be adopted.
  • the intramolecular lactam bridge structure may be formed by binding the side chains of amino acids constituting the cyclic peptide, for example, the amino group of the side chain of Lys and the carboxyl group of the side chain of Asp or Glu are bonded. By forming a peptide bond, an intramolecular lactam structure is formed, and the cyclic peptide has another ring structure as a bridge structure in the molecule.
  • Lys for example, DAP, DAB, and Orn may be bound to Asp or Glu.
  • the cAA in the present invention can be expressed by, for example, the formula (I).
  • ring C may be a saturated or unsaturated alicyclic hydrocarbon ring or a heterocycle. Further, the ring C may be an aromatic ring. Further, the ring C may have a crosslinked structure. q is an integer of 0, 1 or 2. When q is 0, the carbon to which the carboxylic acid group is bonded and the carbon to which the amino group is bonded form a single bond. In order to facilitate the introduction into the cyclic peptide by ribosome synthesis, the ring C is preferably a saturated or unsaturated alicyclic hydrocarbon ring or an aromatic ring, and the saturated or unsaturated alicyclic hydrocarbon. It is more preferably a ring.
  • C ⁇ AA in the present invention is preferably represented by the formula (I-1).
  • p1 is an integer of 1 to 4, preferably an integer of 1 to 3.
  • C ⁇ AA in the present invention is preferably represented by the formula (I-2).
  • p2 is an integer of 1 to 4, preferably an integer of 1 to 3.
  • C ⁇ AA in the present invention is preferably represented by the formula (I-3).
  • p3 is an integer of 1 or 2, preferably 1.
  • CAA such as c ⁇ AA, c ⁇ AA, or c ⁇ AA in the present invention is preferably represented by the formula (I-4).
  • Ar is a divalent aromatic group, and the aromatic ring in the aromatic group may be substituted with one or more substituents.
  • Ar is a divalent aromatic group when ring C is an aromatic ring, and one of the two binding hands of the aromatic ring is bonded to an amino group (NH 2) and two. It means that the other end of the bond is bonded to the carboxyl group (COOH).
  • the two bonds of the aromatic ring are bonded to at least NH 2 and COOH, but the remaining bonds may be bonded to a hydrogen atom or to one or more substituents.
  • the aromatic ring may be benzene, naphthalene or the like, or may be an aromatic heterocycle composed of one or more nitrogen atoms, oxygen atoms and / or sulfur atoms and carbon atoms.
  • aromatic heterocycle 5 to 6 containing one or more nitrogen atoms, oxygen atoms and / or sulfur atoms such as pyridine, pyrimidine, imidazole, oxazole, thiazole, furan, pyran and thiophene.
  • It may be a member aromatic heterocyclic compound, or may be a fused ring compound such as indol, quinoline, isoquinolin, benzothiophene, and benzofuran.
  • the number of substituents may be 1, 2, 3, or 4, may be 1-3, and may be 1 or 2. It may be 1.
  • the substituent is not particularly limited, but for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group or an alkynyl group, a hydroxyl group, an amino group, a halogen (fluorine, chlorine, bromine, iodine), and Examples thereof include a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group, an alkynyl group and the like.
  • the aromatic ring is not particularly limited, but may be, for example, a 5-membered or 6-membered ring.
  • NH 2 and COOH are c ⁇ AA when they are in the ortho position, c ⁇ AA when they are in the meta position, and c ⁇ AA when they are in the para position.
  • NH 2 and COOH are at the 1st and 2nd positions, it is c ⁇ AA, and if it is at the 1st and 3rd positions, it is c ⁇ AA, and it is the 1st and 4th positions. If it is, it is c ⁇ AA.
  • NH 2 and COOH are c ⁇ AA when they are at the 1st and 2nd positions, and c ⁇ AA when they are at the 1st and 3rd positions.
  • the cyclic peptide in the production method of the present invention contains the sequence represented by the formula (1). -(Xaa) n1- (1)
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof At least one of Xaa is one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA). n1 is an integer from 2 to 28.
  • the cAA in the present invention is more preferably represented by the following structure.
  • the ring-closing structure of the cyclic peptide in the present invention is not particularly limited, but is formed by covalent bonding of two amino acids.
  • a peptide bond forms a ring closure structure.
  • the covalent bond between the two amino acids may be formed by the side chains of the two amino acids, the bond between the side chains of the two amino acids and the main chain, and the like.
  • the cyclic structure is not limited to the bond between the N-terminal and C-terminal amino acids of the linear peptide, and may be formed by the bond between the terminal amino acid and the amino acid other than the terminal, or the bond between the amino acids other than the terminal.
  • one of the amino acids bound to form a cyclic structure is a terminal amino acid and the other is a non-terminal amino acid
  • the cyclic peptide has a structure in which a linear peptide is attached to the cyclic structure like a tail.
  • an amino acid having the following functional group 1 and an amino acid having the corresponding functional group 2 are included as ring-forming amino acids to cyclize the peptide translated and synthesized by a spontaneous reaction. can do.
  • Either of the functional groups 1 and 2 may be arranged on the N-terminal side, or may be arranged on the N-terminal side and the C-terminal side. Further, as the arrangement of the functional groups 1 and 2, one may be a terminal amino acid, the other may be a non-terminal amino acid, and both may be non-terminal amino acids.
  • the cyclic peptide in the present invention is preferably represented by the formula (2). Therefore, in the production method of the present invention, it is preferable to use an mRNA library encoding the peptide represented by the formula (2).
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof At least one of Xaa is one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA).
  • Xaa1 and Xaa2 are amino acids or derivatives thereof that form a ring of a cyclic peptide.
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof n1 is an integer from 2 to 28, m represents an integer from 0 to 10.
  • the above-mentioned disulfide bond, peptide bond, alkyl bond, alkenyl bond, ester bond, thioester bond, ether bond, thioether bond, phosphonate ether bond, azo bond, CSC bond, It is preferable that covalent bonds such as CNC bond, C NC bond, amide bond, lactam bridge, carbamoyl bond, urea bond, thiourea bond, amine bond, and thioamide bond are formed. Among these bonds, the thioether bond is more preferable.
  • Xaa1 is preferably N-chloroacetylphenylalanine (ClAc Phe) or N-chloroacetyl tyrosine (ClAc Tyr), preferably N-chloroacetyl-D-. More preferably, it is phenylalanine ( ClAc D-Phe) or N-chloroacetyl-D-tyrosine ( ClAc D-Tyr).
  • Xaa2 is preferably cysteine, more preferably D-cysteine (D-Cys).
  • the cyclic peptide in the present invention is preferably represented by the following formula (2').
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof, and at least one of Xaa is one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA).
  • Xaa1 is preferably phenylalanine or tyrosine
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof
  • n1 is an integer from 2 to 28
  • m represents an integer from 0 to 10.
  • a peptide containing the sequence represented by the formula (1) is expressed from an mRNA library encoding the peptide containing the sequence represented by the formula (1) using a cell-free translation system.
  • the mRNA library may be prepared by obtaining it from a commercially available product or the like, or may be prepared by preparing it.
  • the mRNA library may be prepared by transcribing the DNA library in vitro.
  • the mRNA library contains mRNA having multiple N1N2N3 as codons.
  • N1N2N3 means a codon that specifies an arbitrary amino acid, for example, N1, N2 and N3 are independently adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and uracil (, respectively). Selected from U).
  • N1, N2 and N3 are independently adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and uracil (, respectively). Selected from U).
  • one mRNA contains a plurality of N1N2N3, each N1, N2 and N3 are independently selected.
  • the two N1, N2 and N3, respectively may be the same or different from each other.
  • the sequence represented by the formula (1) - for the use of mRNA libraries encoding peptides comprising at least - - (Xaa) n1 preferably includes the mRNA expressed - (N1N2N3) n1 ..
  • any amino acid is reassigned to N1N2N3, but cAA is reassigned to at least one N1N2N3.
  • a codon-amino acid relationship that is different from the codon-amino acid relationship in the natural genetic code table can be assigned, or the same relationship can be assigned.
  • the term "natural genetic code table" refers to a table showing amino acids represented by a genetic code consisting of triplets of mRNA in a living body.
  • N1N2N3 indicates the following amino acids.
  • the mRNA library contains mRNA containing multiple N1N2N3, for example, multiple N1N2K, multiple N1N2S, multiple N1N2M, multiple N1N2W, multiple N1N2A, multiple N1N2U, multiple N1N2C, and multiple N1N2G. It may include.
  • N1 and N2 are synonymous with the above, K is independently one of uracil (U) and guanine (G), and S is independently of cytosine (C) and guanine (G), respectively.
  • M is either adenine (A) or cytosine (C) independently, and W is independently either adenine (A) or uracil (U), respectively.
  • the present invention will be described by taking as an example the case where the mRNA library contains mRNA containing a plurality of N1N2K, that is, the case where the mRNA library contains a plurality of N1N2K codons as N1N2N3. Even when the mRNA library of the above is used, it can be carried out in the same manner as long as the peptides contained in the translated peptide library are prenylated.
  • N1N2K indicates 20 kinds of amino acids when the right column of the above table is G or U.
  • Leu may be assigned to UUG according to the natural genetic code table, or amino acids other than Leu may be assigned by suballocating codons. Any amino acid can be assigned to the "N1N2K" codon.
  • “Assigning an amino acid to a codon” means rewriting the genetic code table so that a codon encodes that amino acid.
  • "assigning an amino acid to a codon” and “reassigning a codon” are used interchangeably.
  • the assignment of amino acids to each codon, which is different from the natural genetic code table, is realized, for example, by codon reallocation using an artificial aminoacyl-tylated RNA-catalyzed Flexizyme.
  • binding an amino acid to a tRNA may mean charging the tRNA with the amino acid, aminoacylating the tRNA, or acylating the tRNA with the amino acid.
  • cAA is assigned to "N1N2K", and non-proteinogenic amino acids other than cAA can also be assigned.
  • mRNA contains 2 or more "N1N2K”, all may be assigned to cAA or non-proteinogenic amino acids, and some may be assigned to cAA or non-proteinogenic amino acids.
  • the cell-free translation system in the present invention refers to a cell-free translation system, and more specifically, a system for synthesizing a target peptide or protein in vitro by utilizing a protein synthesis function extracted from cells.
  • a cell-free translation system for example, Escherichia coli extract, wheat germ extract, rabbit red blood cell extract, insect cell extract and the like can be used.
  • RNA polymerase may be used as a cell-free translation system.
  • a system containing RNA polymerase may be used to perform transcription from DNA at the same time.
  • cell-free translation systems include RTS-100 (registered trademark) from Roche Diagnostics as a system derived from Escherichia coli, and PURESYSTEM (registered trademark) from PGI as a reconstituted translation system.
  • BioLabs' PUR ExpressR In Vitro Protein Synthesis Kit and other systems using wheat germ extract can be those of Zoegene or Cell-Free Science.
  • Escherichia coli ribosomes for example, the techniques described in the following documents are known: HF Kung et al., 1977. The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894; MC Gonza et al., 1985, Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America Vol.
  • the expression product can be obtained in a highly pure form without purification.
  • the cell-free translation system of the present invention may be used not only for translation but also for transcription by adding a factor necessary for transcription.
  • expression of peptides by a cell-free translation system can be described, for example, by Goto, Y., Katoh, T. & Suga, H. Flexizymes for genetic code reprogramming. Nat Protoc 6, 779-790, (2011). It can be performed by the Flexible In vitro Translation System (FIT System) according to the method described in.
  • FIT System Flexible In vitro Translation System
  • the cell-free translation system in the present invention preferably contains a cAA-charged tRNA in order to include cAA in the obtained cyclic peptide.
  • a tRNA to be charged according to the type of cAA and used the cAA-charged tRNA to contain cAA.
  • cyclic peptides can be obtained efficiently.
  • a tRNA having a D-arm structure that interacts with the translation factor EF-P or a tRNA having no D-arm structure that interacts with EF-P can be used.
  • the cell-free translation system in the present invention is a tRNA or EF having a D-arm structure that interacts with EF-P, charged with one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA).
  • cAA ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids
  • tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P for example, the tRNA described in International Publication No. 2019/077887 can be used.
  • Specific examples of tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P include N 1 N 2 GCN 3 N 4 N 5 N 6 N 7 N 8 N 9 N 10 N 11 GCN 12 N 13 (SEQ ID NO: Examples thereof include tRNA containing the base sequence of 1).
  • N 1 to N 13 indicate arbitrary bases, N 3 to N 11 form a D loop, and N 1 N 2 GC forms a base pair with N 13 N 12 CG.
  • N 1 N 2 and N 12 N 13 form a base pair, but N 1 is preferably G and N 13 is preferably C. Further, it is preferable that N 2 is C and N 12 is G.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a D-arm consisting of a D-loop and a D-stem, and by introducing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 into tRNA, there is a tendency to promote peptidyl transfer by the EF-P peptide. is there.
  • the base sequence of the acceptor stem, anticodon stem, anticodon loop, variable loop, and T-arm in the tRNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is arbitrary.
  • the anticodon loop may appropriately have a base sequence corresponding to the codon to which cAA is assigned.
  • the 3'end of the tRNA has a CCA sequence and binds to cAA.
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 is preferably the base sequence shown by SEQ ID NO: 3.
  • N 3 to N 11 are synonymous with the above, and GCGC forms a base pair with CGCG.
  • the base sequences of N 3 to N 11 in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 are preferably the base sequences shown in SEQ ID NO: 4.
  • AGCCUGGUA SEQ ID NO: 4
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 forms a D-loop in the tRNA.
  • one or more bases may be substituted. When multiple bases are substituted, two, three, four, five, six, seven, eight, and nine bases are substituted in the nine bases forming the D loop. It means that 1 to 4 bases may be substituted, 1 to 3 bases may be substituted, or 1 to 2 bases may be substituted. The bases may be substituted.
  • the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 is preferably the base sequence shown by SEQ ID NO: 5, and preferably the base sequence shown by SEQ ID NO: 6.
  • N 1 N 2 GCGCAGCCUGGUAGCGCN 12 N 13 (SEQ ID NO: 5)
  • N 1 , N 2 , N 12 and N 13 are synonymous with the above, and N 1 N 2 GC forms a base pair with N 13 N 12 CG.
  • GCGCGCAGCCUGGUAGCGCGC SEQ ID NO: 6
  • one or more bases may be substituted.
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 Multiple base substitutions in SEQ ID NOs: 5 and 6 mean 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 in SEQ ID NO: 4, which indicates 9 bases forming a D-loop. It means that 9 or 9 bases may be substituted, 1 to 4 bases may be substituted, 1 to 3 bases may be substituted, or 1 to 2 bases may be substituted. The base may be substituted, or one base may be substituted.
  • the tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P and the tRNA that does not have a D-arm structure that interacts with EF-P may both contain the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • AGGGG (N 14 ) m CCCCU (SEQ ID NO: 2) In SEQ ID NO: 2, N 14 indicates an arbitrary base, m is an integer of 1 or more, (N 14 ) m forms a T loop, and AGGGG forms a base pair with UCCCC.
  • the T-stem of aminoacyl-tRNA regulates the interaction with the EF-Tu protein and enhances the uptake of non-protein amino acids.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a T-arm consisting of a T-loop and a T-stem, and EF-Tu is used to introduce cAA into a cyclic peptide by introducing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 into a tRNA. Protein accommodation tends to be promoted.
  • m is not particularly limited as long as (N 14 ) m forms a T loop, but may be an integer of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, and may be an integer of 6 to 8. It is preferable to have.
  • (N 14 ) m is preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 derived from the T loop of tRNA GluE2.
  • UUCGAAU SEQ ID NO: 7
  • one or more bases may be substituted.
  • the fact that a plurality of bases are substituted means that 2, 3, 4, 5, 6, and 7 bases may be substituted in the 7 bases forming the T loop.
  • One to three bases may be substituted, one to two bases may be substituted, and one base may be substituted.
  • AGGGG and UCCCC forming a base pair form a T-stem.
  • one or more bases may be substituted as long as a base pair is formed.
  • Multiple base substitutions in the T-stem of SEQ ID NO: 2 means that the 10 bases forming the T-stem have 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9 bases. It means that 10 bases may be substituted, 2 bases may be substituted, 4 bases may be substituted, and 6 bases may be substituted. Alternatively, 1, 3, or 5 bases may be substituted as long as they form a base pair.
  • tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P when used, suitable tRNAs exert an action of promoting peptidyl transfer by the EF-P protein and an action of promoting accommodation by the EF-Tu protein. Therefore, it contains both the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and the base sequence shown by SEQ ID NO: 2.
  • a tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P is preferably a chimera of tRNA Pro1 and tRNA GluE2 , and such tRNA is referred to herein as tRNA Pro1E2.
  • tRNA Pro1E2 For a tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P, specifically, it is preferable that the T stem of tRNA GluE2 is introduced into tRNA Pro1.
  • a suitable tRNA is the base represented by SEQ ID NO: 2 in order to exert the effect of promoting accommodation by the EF-Tu protein. Contains the sequence.
  • the tRNA that does not have a D-arm structure that interacts with EF-P is preferably tRNA GluE2 .
  • one preferred embodiment of the cell-free translation system in the method for producing a library of the present invention comprises a tRNA charged with one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA). It is an embodiment in which the tRNA is at least one selected from tRNA Pro1E2 and tRNA GluE2. When cAA is an aromatic amino acid, it is preferable that the tRNA is tRNA Pro1E2.
  • base sequences other than SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2 are referred to as wild-type tRNAs. It may be a sequence derived from it, a sequence derived from wild-type tRNA derived from Escherichia coli, or an artificial tRNA prepared by in vitro transcription.
  • the sequence represented by the formula (1) in the method for producing a library of the present invention may contain at least one cAA selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids.
  • two or more cAAs may be randomly contained in the sequence represented by the formula (1), and two or more consecutive cAAs may be contained in the sequence represented by the formula (1). May be included.
  • the fact that two or more cAAs are randomly contained in the sequence represented by the formula (1) means that at least two cAAs are contained at arbitrary positions in the sequence of the formula (1) and are included. Refers to a mode in which two or more cAAs are not adjacent to each other. Therefore, when two or more cAAs are randomly contained, an amino acid or a derivative thereof other than cAA is bound adjacent to each of the two or more cAAs.
  • the type of cAA is not particularly limited, but is preferably the formula (I-1), the formula (I-2), and the formula (I-3).
  • the type of cAA is not particularly limited, but the formulas (I-1), formulas (I-2), and formulas are preferable.
  • two or more cAAs can be any combination of cAAs of any of the formulas (I-1), formulas (I-2), formulas (I-3), and formulas (I-4).
  • it may be a combination of two or more of the formula (I-1) only, a combination of two or more of the formula (I-2) only, and two or more of the formula (I-3) only. It may be a combination, or may be a combination of two or more of the formula (I-4) only.
  • the type of the two consecutive cAAs is not particularly limited, but the formulas (I-1) and the formula (I-2) are preferable. ), Formula (I-3), and formula (I-4), preferably any of formula (I-1), formula (I-2), and formula (I-4).
  • the cAA is more preferable, the cAA of the formula (I-1) is more preferable, the cAA of the formula (I-4) is further preferable, and it is further expressed by the following structure. preferable.
  • cAA-cAA- when two or more cAAs are continuously contained in the sequence represented by the formula (1), at least one unit represented by -cAA-cAA- is included in the sequence represented by the formula (1). It may contain cAA as long as it is contained.
  • the cAA to be contained is not particularly limited, but a preferred embodiment similar to that of cAA in the case where two or more cAAs are randomly contained in the sequence represented by the formula (1) can be mentioned. Further, here, when two or more cAAs are continuously contained in the sequence represented by the formula (1), the number of consecutive cAAs is preferably 2.
  • the cAA is preferably the cAA of the formula (I-1), and more preferably (1S, 2S) -2-ACPC. Is.
  • (1S, 2S) -2-ACPC As cAA, there is a tendency that continuous uptake of cAA into peptides can be performed more efficiently.
  • (1S, 2S) -2-ACPC folding is expressed in about 4 residues (Kwon, S., Jeon, A., Yoo, SH, Chung, IS & Lee, HS Unprecedented molecular architectures by the controlled) self-assembly of a ⁇ -peptide foldamer. Angew. Chem. Int. Ed.
  • the folding molecule can be biochemically synthesized.
  • the folding molecule can be biochemically synthesized.
  • the unit represented by -cAA-cAA-cAA- is included in the sequence represented by the formula (1).
  • cAA may be contained in the other.
  • the cAA to be contained is not particularly limited, but a preferred embodiment similar to that of cAA in the case where two or more cAAs are randomly contained in the sequence represented by the formula (1) can be mentioned.
  • the upper limit of the number of introductions is not particularly limited, but is preferably 15 or less, more preferably 12 or less, and further preferably 10 or less. Is.
  • cAA As described above, from the viewpoint of efficiently introducing cAA into the cyclic peptide, it is preferable to select the tRNA to be charged according to the type of cAA.
  • the cAA shown below (collectively referred to as ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (i)) is preferably charged to a tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P, and is preferably charged to tRNA Pro1E2. Is more preferable.
  • cAA of formula (I-4) is charged to a tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P. It is preferable, and it is more preferable to charge tRNA Pro1E2.
  • ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acids (ii) are preferably charged to tRNAs that do not have a D-arm structure that interacts with EF-P, and are charged to tRNA GluE2 . Is more preferable.
  • the type and concentration of the constituent components may be appropriately adjusted.
  • a tRNA having a D-arm structure that interacts with EF-P specifically, with EF-P charged with ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (i) or cAA of formula (I-4).
  • the concentration of EF-P may be adjusted to be higher than that when the tRNA is not used.
  • tRNA Pro1E2 or tRNA GluE2 when used, specifically, tRNA Pro1E2 charged with ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (i) or tRNA GluE2 charged with ⁇ - or ⁇ -cyclic amino acid (ii) is used .
  • concentration of EF-Tu may be adjusted to be higher than when the tRNA is not used.
  • tRNA Pro1E2 or tRNA GluE2 specifically, beta-or ⁇ - cyclic amino acid (i) the case of using the charge was tRNA Pro1E2 or beta-or ⁇ - cyclic amino acid (ii) tRNA GluE2 which was charged with the .
  • the concentration of EF-G may be adjusted to be lower than that when the tRNA is not used. By controlling the concentrations of EF-Tu and EF-G as described above, it tends to be possible to prevent the peptidyl-tRNA during translation from being shed from the ribosome.
  • the tRNA charged with the amino acid can be suitably used for the synthesis of a peptide containing the amino acid, and also contains the amino acid.
  • the peptide can be suitably produced using tRNA charged with the amino acid.
  • the method for producing the library of the present invention can be used to obtain the cyclic peptide of the present invention described in detail below, and the sequence represented by the above formula (1) can be represented by the formula (3) or the formula (3) described later.
  • cAAA is not limited to c ⁇ AA and may be c ⁇ AA or c ⁇ AA, but c ⁇ AA and / or c ⁇ AA is preferable, and c ⁇ AA is more preferable). There may be.
  • the present invention is a cyclic peptide having a cyclic structure composed of 4 to 30 amino acids or derivatives thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and 2 of 4 to 30 amino acids having a cyclic structure or derivatives thereof.
  • One amino acid or its derivatives Xaa1 and Xaa2, Xaa1 and Xaa contain a structure for forming a cyclic structure, and Xaa1 and Xaa2 are linked via an amino acid sequence composed of 2 to 28 amino acids or their derivatives.
  • the amino acid sequence having the above-mentioned structure and composed of the amino acids 2 to 28 or a derivative thereof is at least one selected from ⁇ -, ⁇ -, and ⁇ -cyclic amino acids (cAA), and any amino acid.
  • cAA ⁇ -cyclic amino acids
  • a cyclic peptide composed of a derivative thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof is collectively referred to as a cyclic peptide.
  • the cyclic peptide of the present invention can form a folding structure and may develop rigidity in the cyclic amino acid.
  • the peptide of the present invention is highly stable against serum and the like, and its degradation in vivo is suppressed. Therefore, it is considered that the peptide of the present invention is suppressed from being decomposed before acting on the target protein.
  • the cyclic peptide of the present invention can be obtained by the above-mentioned ⁇ method for producing a library>.
  • the cyclic peptide selected and identified from the library can be produced by a general solid-phase synthesis method.
  • cyclic peptide with affinity for FXIIa> is a cyclic peptide represented by the formula (3). Xaa1- (Xaa) n1- Xaa2- (Xaa x ) m (3)
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof At least one of Xaa is a ⁇ -cyclic amino acid (c ⁇ AA), Xaa1 and Xaa2 are amino acids or derivatives thereof that form a ring of a cyclic peptide.
  • n1 is an integer from 10 to 16
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof
  • m represents an integer from 0 to 10.
  • Xaa1 is the first amino acid, at least one cAA exists at the 5th to 9th positions.
  • the cyclic peptide represented by the formula (3) has an affinity for activated blood coagulation factor XII (also referred to as FXIIa).
  • FXIIa activated blood coagulation factor XII
  • One of the present invention is an FXIIa binder comprising a cyclic peptide represented by the formula (3) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • FXIIa is a serine protease involved in the kallikreinin system that contributes to coagulation and inflammation. Inhibitors against FXIIa are useful as antithrombotic agents.
  • the c ⁇ AA in the formula (3) is preferably represented by the formula (I-1), more preferably (1S, 2S) -2-ACHC and / or (1R, 2R) -2-ACPC. ..
  • At least one of Xaa in the formula (3) is preferably a basic amino acid or a derivative thereof.
  • the basic amino acid or a derivative thereof is not particularly limited as long as it has an amino group in the side chain, and examples thereof include lysine, arginine, histidine, and derivatives thereof.
  • the interaction of the cyclic peptide of the present invention with the binding site in FXIIa can be further enhanced, and the binding tends to be stronger. is there. It is considered that this is because the basic amino acid or a derivative thereof fits in the S1 pocket (see FIG. 10b) in FXIIa.
  • (Xaa) n1 in the equation (3) is one selected from the following f1 to f4.
  • cAA is a ⁇ -cyclic amino acid.
  • the cyclic peptide represented by the formula (3) is preferably represented by the formula (3-1).
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof cAA is a ⁇ -cyclic amino acid
  • n1a is an integer of 3 to 7
  • n1b is an integer of 2 to 8 (where the sum of n1a and n1b is an integer of 9 to 15).
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof
  • Xaa1 is Phe or Tyr m represents an integer from 0 to 10.
  • (Xaa) n1a does not include cAA.
  • the difference (absolute value) between n1a and n1b is preferably 4 or less.
  • n1a may be an integer of 3 to 6
  • n1b may be an integer of 4 to 8 (however, in this case, the sum of n1a and n1b is an integer of 9 to 14).
  • the cyclic peptide represented by the formula (3-1) is preferably any of the following F1 to F4.
  • CAA, Xaa x , m in Eqs. F1 to F4 are synonymous with cAA, Xaa x , m in Eqs. (3-1).
  • cyclic peptide having affinity for IFNGR1> is a cyclic peptide represented by the formula (4). Xaa1- (Xaa) n1- Xaa2- (Xaa x ) m (4)
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof At least one of Xaa is a ⁇ -cyclic amino acid (c ⁇ AA), Xaa1 and Xaa2 are amino acids or derivatives thereof that form a ring of a cyclic peptide.
  • n1 is an integer from 9 to 15
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof
  • m represents an integer from 0 to 10.
  • Xaa1 is the first amino acid, at least one cAA exists at the 4th to 8th positions.
  • the cyclic peptide represented by the formula (4) has a binding affinity for the type II interferon receptor complex (also referred to as IFNGR1).
  • IFNGR1 is a receptor for interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), an pro-inflammatory cytokine that plays an important role in inflammation and autoimmune diseases.
  • IFNGR1 is useful in the treatment of autoimmune diseases.
  • C ⁇ AA in the formula (4) is preferably represented by the formula (I-1), (1S, 2S) -2-ACHC, (1R, 2R) -2-ACPC, (1S, 2S) -2.
  • -It is more preferable that any one or more selected from ACPC.
  • (Xaa) n1 in the equation (4) is one selected from the following i1-1 to i1-6.
  • cAA is a ⁇ -cyclic amino acid.
  • the cyclic peptide represented by the formula (4) is preferably represented by the formula (4-1).
  • Xaa is any amino acid or derivative thereof cAA is a ⁇ -cyclic amino acid
  • n1a is an integer of 3 to 7
  • n1b is an integer of 5 to 7 (where the sum of n1a and n1b is an integer of 8 to 14).
  • Xaa x is any amino acid or derivative thereof
  • Xaa1 is Phe or Tyr m represents an integer from 0 to 10.
  • (Xaa) n1a does not include cAA.
  • the difference (absolute value) between n1a and n1b is preferably 4 or less.
  • n1a may be an integer of 3 to 5
  • n1b may be an integer of 5 to 8 (however, in this case, the sum of n1a and n1b is an integer of 8 to 13).
  • the cyclic peptide represented by the formula (4-1) is preferably any of the following I1-1 to I1-6.
  • CAA, Xaa x , m in equations I1-1 to I1-6 are synonymous with cAA, Xaa x , m in equation (4-1).
  • the cyclic peptide of the present invention can bind to FXIIa or IFNGR1 and inhibit its action. Therefore, one of the present inventions is an inhibitor of FXIIa or IFNGR1, which comprises the cyclic peptide of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Specifically, one of the present inventions is an FXIIa inhibitor comprising a compound represented by the formula (3) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Moreover, one of the present invention is an IFNGR1 inhibitor containing a compound represented by the formula (4) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the binder or inhibitor of the present invention can be used as a pharmaceutical composition containing the binder or inhibitor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment or prevention of thrombus-related diseases with respect to FXIIa inhibitors.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment or prevention of diseases related to autoimmune diseases with respect to IFNGR1 inhibitors.
  • the administration form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be oral administration or parenteral administration.
  • parenteral administration include injection administration such as intramuscular injection, intravenous injection, and subcutaneous injection, transdermal administration, and transmucosal administration.
  • Examples of the administration route of transmucosal administration include nasal administration, eye, lung, vagina, and rectum.
  • Various modifications may be made to the cyclic peptide in the pharmaceutical composition from the viewpoint of pharmacokinetics such as metabolism and / or excretion.
  • PEG polyethylene glycol
  • / or a sugar chain can be added to the cyclic peptide to prolong the residence time in blood and reduce the antigenicity.
  • sustained-release bases include biodegradable polymer compounds such as polylactic acid / glycol (PLGA), porous hydroxyapatite, liposomes, surface-modified liposomes, emulsions prepared with unsaturated fatty acids, nanoparticles, and nanospheres. These may contain cyclic peptides.
  • PLGA polylactic acid / glycol
  • the cyclic peptide may be used as it is as an active ingredient in the pharmaceutical composition, or may be formulated by adding a pharmaceutically acceptable additive or the like.
  • Dosage forms of pharmaceutical preparations include, for example, liquid preparations (for example, injections), dispersants, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, etc. Examples thereof include troches, inhalants, ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, and poultices.
  • Formulations include, for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, solubilizers, colorants, flavoring agents, stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, pH adjustments. It can be carried out by a conventional method by appropriately using additives such as an agent, a preservative, a wetting agent, a dispersant, and an antioxidant.
  • the additives used for formulation are not particularly limited, but are, for example, pharmaceutically acceptable organic solvents such as purified water, saline solution, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, and animal and vegetable oils. , Lactose, mannitol, glucose, sorbitol, crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, starch, corn starch, silicic anhydride, magnesium aluminum silicate, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, sodium polyacrylate, Sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl cellulose, pectin, methyl cellulose, ethyl cellulose, xanthan gum, gum arabic, tragant, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, vaseline, paraffin, octyldodecyl myristate
  • Surfactants such as polyoxyethylene lauryl ethers, sodium lauryl sulfate, and saponin; bile acids such as glycocholic acid, deoxycholic acid, and taurocholic acid; EDTA and salicylic acids, etc. Chelating agents; fatty acids such as caproic acid, capric acid, lauric acid, oleic acid, linoleic acid, and mixed micelles; enamin derivatives, N-acyl collagen peptides, N-acyl amino acids, cyclodextrins, chitosans, and one. A nitrogen oxide donor or the like may be used.
  • the tablet or pill may be a coated tablet or the like coated with a sugar coating, a gastric soluble substance, an enteric substance or the like.
  • the liquid preparation may contain distilled water for injection, physiological saline, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil, alcohols and the like.
  • a wetting agent, an emulsifier, a dispersant, a stabilizer, a dissolving agent, a solubilizing agent, a preservative and the like may be added.
  • the present invention also provides a method of administering an FXIIa inhibitor or an IFNGR1 inhibitor to a patient in need thereof to treat or prevent a disease in the patient.
  • the dose of the HGF inhibitor of the present invention is appropriately determined by those skilled in the art according to the symptoms, age, sex, body weight, sensitivity difference, administration method, administration interval, type of preparation, etc. of the patient who needs it. can do.
  • the patient is a mammal, preferably a human.
  • the method for preparing the tRNA used in this example was as follows.
  • RNA from PCR products Transcription of RNA from PCR products is performed by 500 ⁇ L reaction mixture (40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 22.5 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.01% Triton X-100, 0.12 ⁇ M T7 RNA polymerase, 0.04 U / ⁇ L. RNasin RNase inhibitor (Promega) and 3.75 mM NTP mixture) at 37 ° C. for 16 hours.
  • 5 mM GMP or CMP was added to the above solution to initiate transcription from G or C.
  • the resulting RNA transcript was DNase-treated at 37 ° C. for 30 minutes with RQ1 DNase (Promega), followed by an 8% (for tRNA) or 12% (for flexizyme) polyacrylamide gel containing 6M urea. Purified with.
  • Aminoacylation with flexizyme was applied to 50 mM buffer (Bicine-KOH (pH 8.7) for 2-ACPC and 2-ACHC, HEPES-KOH (pH) for D-Cys, ClAc D-Phe and ClAc D-Tyr). 7.5)), 600 mM MgCl 2 , 20% DMSO, 25 ⁇ M dFx or eFx, 25 ⁇ M tRNA, and 5 mM activated amino acids at 0 ° C. The resulting aminoacyl-tRNA was then subjected to ethanol precipitation to remove activated amino acids, and then the pellet was washed twice with 70% ethanol containing 0.1 M sodium acetate (pH 5.2).
  • Example 1 2-ACPC uptake test into peptide
  • 2-ACPC uptake test into peptide To examine the ability of the ribosome to incorporate one or more c ⁇ AAs into the peptide chain, first four 2-ACPC isomers: (1R, 2R) -2-ACPC, (1R, 2S) -2- The elongation of the peptide sequence when using ACPC, (1S, 2R) -2-ACPC, and (1S, 2S) -2-ACPC was examined.
  • each precharged tRNA was added to the FIT (Flexible In vitro Translation) system, which is a reconstituted E. coli translation system, to express the peptide rP1-rP10.
  • the peptides rP1-rP10 are shown in Table 4. The flags in each sequence were GACUACAAGGACGACGACGACAAG for mR1 to mR13 and Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys for rP1 to rP13.
  • the peptide was translated according to the following procedure.
  • the FIT system used in this example was 5 ⁇ M EF-P, 3 ⁇ M IF2, 20 ⁇ M EF-Tu, and 0.1 ⁇ M EF-G, as well as minimal amino acid and aminoacyl-tRNA synthetase (ARS), ie. It contained only Met, Lys, Gly, Tyr, Asp, and their corresponding ARS.
  • ARS aminoacyl-tRNA synthetase
  • Template DNA for peptide translation was prepared by extension with forward and reverse extension primer pairs followed by PCR with forward and reverse PCR primer pairs. See Table 3 for primer sequences.
  • the obtained PCR product was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the template DNA was transcribed into mRNA by T7 RNA polymerase included in the FIT system and translated into peptides.
  • T7 RNA polymerase included in the FIT system and translated into peptides.
  • the peptides rP1-rP11 and rP13 are Tyr-Lys-Lys-Tyr-Lys-Lys- before the c ⁇ AA uptake site. It contained a Tyr-Lys sequence.
  • the translation reaction was performed in 2.5 ⁇ L of solution at 37 ° C. and stopped by adding 2.5 ⁇ L of stopping solution (0.9M Tris-HCl (pH 8.45), 8% SDS, 30% glycerol and 0.001% xylene cyanol). , 95 ° C. for 3 minutes.
  • the sample was then subjected to 15% tricine SDS-PAGE and analyzed by autoradiography using Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare).
  • Typhoon FLA 7000 GE Healthcare
  • the expression level of the radioisotope-labeled peptide was normalized by the intensity of the [14 C] -Asp band.
  • the translation peptide MALDI-TOF MS was performed according to the following procedure.
  • the peptide was then desalted with SPE C-chips (Nikkyo Technos) and co-crystallized with ⁇ -cyano-4-hydroxysilicic acid.
  • MALDI-TOF MS was performed using UltrafleXtreme (Bruker Daltonics).
  • Peptide Calibration Standard II (Bruker Daltonics) was used for external mass calibration.
  • FIG. 3 The expression level of the peptide when four kinds of 2-ACPC isomers were used is shown in FIG.
  • the results of SDS-PAGE analysis of translation products obtained using four 2-ACPC isomers are shown in FIGS. 3 to d.
  • the results of MALDI-TOF MS of the translation product obtained using the four 2-ACPC isomers are shown in FIGS. 4 and 5.
  • tRNA Pro1E2 generally improves the efficiency of continuous uptake of D-amino acids and ⁇ 3 -amino acids
  • EF-P only enhances rP2 expression in (1R, 2S) -2-ACPC. It showed a negative effect on the expression of peptides containing the other three stereoisomers.
  • the expression level of the peptide when four kinds of 2-ACHC isomers were used is shown in FIG.
  • the results of SDS-PAGE analysis of the translation products obtained using the four 2-ACHC isomers are shown in E of FIG.
  • the results of MALDI-TOF MS of the translation product obtained using four 2-ACHC isomers are shown in FIG.
  • a single uptake into rP1 introduced four 2-ACHCs, with no significant difference in expression levels between the presence and absence of EF-P.
  • no rP2 product was observed in the absence of EF-P.
  • the expression of rP2 containing (1R, 2R) -2-ACHC or (1S, 2S) -2-ACHC is observed in the presence of EF-P, and EF-P can promote their continuous uptake. showed that.
  • Example 1 the presence of EF-P inhibits the uptake of (1S, 2S) -2-ACPC (ie, a tRNA with a D-arm structure that interacts with EF-P is (1S, 2S) -2.
  • the T-stem can induce EF-Tu for the uptake of (1S, 2S) -2-ACPC, but the D-arm.
  • Selected tRNA GluE2 GAU which does not interact with EF-P, as the tRNA.
  • tRNA Pro1E2 GUG which induces both EF-Tu and EF-P, was selected for the uptake of (1S, 2S) -2-ACHC.
  • Translation of rP11 in the presence of EF-P produced the desired full-length rP11 peak in MALDI-TOF MS.
  • ClAc D-Phe N-chloroacetyl-D-phenylalanine
  • rP12 having cysteine (D-Cys) (see Table 6) and confirmed that the desired thioether cyclic skeleton was obtained in MALDI-TOF MS. Furthermore, rP13 (see Table 6) containing 4 (1S, 2S) -2-ACPC was expressed for every 3 amino acid residues, and it was confirmed that the desired peptide was obtained.
  • the results of MALDI-TOF MS of rP11, rP12, and rP13 are shown in FIG. This type of peptide, including (1S, 2S) -2-ACPC, is known to induce 10/11 / 11-helix (Schmitt, MA, Choi, SH, Guzei, IA & Gellman, SH New spiral).
  • Example 4-1 Preparation of library
  • the cyclic peptide library consists of three types of c ⁇ AA, (1S, 2S) -2-ACHC, (1R, 2R) -2-, sandwiched between cyclized ClAc D-Tyr and D-Cys, as shown below.
  • the library was prepared according to the following procedure.
  • the FIT system used to prepare the cyclic peptide library is shown in Table 8 below.
  • the peptide library is in a 150 ⁇ L (for the first selection) or 10 ⁇ L (for the second to fourth selection) or 5 ⁇ L (for the fifth to seventh selection) FIT system at 37 ° C. for 30 minutes. Translated. The reaction mixture was then incubated for 12 minutes at room temperature, 0.04 fold of 500 mM EDTA (pH 8.0) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to induce dissociation of ribosomes from the mRNA-peptide complex. Reverse transcription was performed at 42 ° C.
  • the supernatant of the negative selection is collected and mixed with 0.48 times the translation volume of FXIIa-immobilized Dynabeads streptavidin or 0.24 times the translation volume of IFNGR1-immobilized Dynabeads Protein G at 4 ° C. for 15 minutes to 100 ⁇ L.
  • the beads were washed 3 times with chilled TBS-T buffer (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 0.05% Tween 20).
  • Recombinant biotin-labeled human FXIIa was purchased from Molecular Innovations.
  • Recombinant human IgG1 Fc and Fc-labeled human IFNG R1 were purchased from R & D systems and AcroBiosystems, respectively.
  • PCR buffer (10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100 , 0.25 mM dNTP, 2.5 mM MgCl 2 , 0.25 ⁇ M T7.F52 primer 5'-GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTGAACTTTAAGTAGGAGATATATCCAT-3' , And 0.25 ⁇ M NUAUG-GT3.R38 primer
  • 1 ⁇ L of eluate was mixed with 19 ⁇ L of PCR buffer containing SYBR Green I and Taq DNA polymerase, and the amount of cDNA was quantified by real-time PCR.
  • Example 4-2 New discovery of cyclic foldamer peptide
  • the library was first subjected to a negative selection to remove bead-bound species as described above and then contacted with the target protein immobilized on the magnetic beads as a positive selection.
  • 7 rounds of affinity selection were performed and the cDNA recovery rate of each round was measured by the qPCR method, a significant increase in the recovery rate was observed after the 4th round in the affinity selection of FXIIa and IFNGR1.
  • Deep sequencing of the cDNA revealed that the fourth round library was rich in peptide sequences with one or more c ⁇ AAs.
  • the peptides present in the library are shown in Table 9 (for FXIIa) and Table 10 (for IFNGR1).
  • the binding affinity was analyzed by SPR at 25 ° C. using a Biacore T200 device (GE Healthcare).
  • the rate constants were measured by the 1-cycle kinetics method by injecting 5 different concentrations of each peptide at a flow rate of 30 ⁇ L / min.
  • the resulting coupling sensorgram was analyzed using Biacore evaluation software and fitted to a standard 1: 1 interaction model.
  • the Ki value of FXIIa was evaluated by cleavage of the substrate peptide HD-Pro-Phe-Arg-pNA (S-2302 reagent). The release of pNA chromophores from the cleavage reaction was monitored by absorbance at 405 nm using a plate reader Infinite M1000PRO (TECAN). The structure of the synthesized peptide, the result of surface plasmon resonance measurement, and the measurement result of Ki value are shown in Tables 11 and 12.
  • Example 5 Serum stability of FXIIa and IFNGR1-binding peptides
  • FXIIa use F1, F2, F3, and F4, and Ala variants F1A, F3A, and F4A, and for IFNGR1
  • I1-6 a variant of I1-1A, for peptide serum stability.
  • the above peptide and the following peptidase-resistant internal standard peptide were co-incubated in human serum at 37 ° C.
  • Example 6 Co-crystal structure of F3 bound to FXIIa
  • the co-crystal structure of F3 bound to FXIIa was analyzed by X-ray crystallography. The analysis result is shown in FIG. From the diffraction data, F3 is folded into an antiparallel ⁇ -sheet, in which the 8-position (1S, 2S) -2-ACHC (ACHC8) is located near the active center of FXIIa, which is the rotating end of the ⁇ -sheet. It became clear that there was.
  • ACHC13 Another 13th place (1S, 2S) -2-ACHC (ACHC13) was involved in the ⁇ -turn in which ACHC13, Arg14, Asn15, and Tyr16 occupy positions i to i + 3.
  • the amide group of ACHC13 also formed an intramolecular ⁇ -sheet-like hydrogen bond with Ala3, but its cyclic side chain formed an intramolecular hydrophobic interaction with Ala3 and Tyr16.
  • the two (1S, 2S) -2-ACHC residues induced the turn structure and contributed to the overall folding by forming an intramolecular interaction.
  • F3 binds to the active site of FXIIa like a substrate, so-called standard mechanism inhibitors (Farady, CJ & Craik, CS Mechanisms of macromolecular protease inhibitors. ChemBioChem 11, 2341-2346 (2010) and Laskowski, M. & It acted as Kato, I. Protein inhibitors of proteinases. Annu. Rev. Biochem. 49, 593-626 (1980)).
  • the peptide bond between Arg6 and Arg7 was close to FXIIa's catalytic Ser563.
  • the Arg6 side chain formed a salt bridge with Asp557 of FXIIa and was housed in the S1 pocket of the enzyme.
  • Arg6 is widely conserved among the natural substrates of FXIIa, as well as previously reported inhibitors such as PPACK, Infestin-4, EcTI (E. contortisiliquum trypsin inhibitor), CTI, FXII618, and FXII801. It is an amino acid.
  • the Arg7 side chain also formed hydrogen bonds with Ser395 and Cys413, while the ACHC8 side chain bound to the shallow hydrophobic pockets formed by FXIIa's Tyr515 and His507.
  • F3 also formed an intermolecular ⁇ -sheet-like hydrogen bond with FXIIa Gly587 via its Tyr4, and its conformation was stabilized by the formation of an intramolecular ⁇ -sheet with Asn11-ACHC13.
  • Example 7 Incorporation test of ⁇ -amino acid into peptide
  • the following ⁇ -amino acid uptake test was performed according to the method of Example 1.
  • mR1 was used as a template mRNA and translated into the peptide rP1.
  • ⁇ -amino acids were charged into tRNA Pro1E2 CGG.
  • Example 8 Incorporation test of aromatic amino acids into peptides
  • the following aromatic amino acid uptake tests were performed.
  • aromatic amino acids having substituents the ⁇ value in p-hydroxy, p-methoxy, and p-fluoro substitutions is shown.
  • Aminoacylation with these anhydrides is performed in 25 ⁇ L containing 80 ⁇ M ⁇ hRNA or tRNA containing 50 mM Bicine-KOH (pH 9.0), CHES-KOH (pH 9.5 or 10.0), or CAPS-KOH (pH 10.5). In the reaction mixture, it was carried out at 25 ° C. for 1 to 3 hours. The concentration of anhydride was 10 mM except for 5-fluoroisatoic anhydride (8 mM).
  • Me Ser, (1S, 2S) -2-ACPC, and D-Cys are preactivated in the form of 3,5-dinitrobenzyl ester (DBE), and Apy, Atp, Atz, 3N Abz, and ClaAc D-Phe are cyano.
  • DBE 3,5-dinitrobenzyl ester
  • Apy, Atp, Atz, 3N Abz, and ClaAc D-Phe are cyano.
  • CME methyl ester
  • reaction mixture containing 600 mM MgCl 2 , 20% DMSO, 25 ⁇ M eFx, 25 ⁇ M ⁇ hRNA or tRNA, and 20 mM activated amino acids. ..
  • the pH of the mixture was adjusted with 50 mM Bicine-KOH (pH 9.0), CHES-KOH (pH 9.5 or 10.0), or CAPS-KOH (pH 10.5).
  • the reaction time was 2 hours for ClAc D-Phe, 6 hours for Me Ser and D-Cys, and 16 hours for (1S, 2S) -2-ACPC.
  • the resulting aminoacyl-tRNA was then subjected to ethanol precipitation and the pellet was washed twice with 70% ethanol.
  • ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 20 pmol of aminoacyl- ⁇ hRNA was analyzed on a 20% polyacrylamide gel containing 6M urea. The pH was adjusted to 5.2 with 50 mM sodium acetate (pH 5.2), except for the analysis of Atp- ⁇ h RNA and Atz- ⁇ h RNA (pH 3.5). Electrophoresis was performed at 120 V for 2.5 hours, followed by ethidium bromide staining, and detection was performed using Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare).
  • MALDI-TOF MS of peptides and aminoacyl- ⁇ hRNA For MALDI-TOF MS, a translation reaction was performed for 60 minutes in the presence of 0.5 mM non-radioactive Asp instead of [14 C] -Asp. For translation of the cyclic peptides (rP5-rP10, see FIG. 14), MetRS, Met, and 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid were omitted from the reaction mixture above.
  • the translation reaction mixture was added twice with equal volume of HBS buffer (100 mM HEPES-KOH (pH 7.6), 300 mM NaCl), mixed with 5 ⁇ L ANTI-FLAG M2 affinity gel (Sigma) and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • the affinity gel was washed twice with 25 ⁇ L of HBS buffer (50 mM HEPES-KOH (pH 7.6), 150 mM NaCl) and the bound peptide was eluted from the gel by adding 20 ⁇ L of 0.2% trifluoroacetic acid.
  • the peptide was then desalted with SPE C-chips (Nikkyo Technos) and co-crystallized with ⁇ -cyano-4-hydroxysilicic acid using Peptide Calibration Standard II (Bruker Daltonics) for external mass calibration. ..
  • MALDI-TOF MS was analyzed in reflector / positive mode using UltrafleXtreme (Bruker Daltonics).
  • Aminoacyl- ⁇ hRNA was desalted on SPE C-chips (Nikkyo Technos), co-crystallized with 3-hydroxypicolinic acid, and then analyzed by UltrafleXtreme (Bruker Daltonics) in linear / positive mode.
  • Each aminoacyl-tRNA Pro1E2 CGG (Abz, Abz 5OH , Abz 5OMe , Abz 5F , Apy, Atp, Atz) was introduced into the CCG codon of mRNA (mR1) to synthesize rP1 peptide (Fig. 12a).
  • the translation reaction includes 6 amino acids (Met, Tyr, Lys, Phe, Asp, and Gly) and the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase (ARS), but omits the other 14 amino acids and their aminoacyl-tRNA synthetase. This was performed using the flexible in vitro translation (FIT) system that had been used.
  • each peptide was confirmed by MALDI-TOF MS, and the desired m / z values of [M + H] + and [M + 2H] 2+ ions without by-products were obtained (Fig. 12b).
  • the same peptide was translated in the presence of [14 C] labeled Asp, subjected to tricine SDS-PAGE, and subsequently quantified by autoradiography (Fig. 20).
  • rP1 expression levels were increased from 1.5-fold to 7-fold as compared to the absence of EF-P (Fig. 12c).
  • mRNA to express peptides (rP2-rP4, FIG. 13a) in the presence of Abz-tRNA Pro1E2 CGG and EF-P. (MR2-mR4) were prepared.
  • the rP2 peptide has two consecutive Abz residues, while the rP3 and rP4 peptides have one or two Phe residues inserted between the two Abz residues.
  • the expression of each of the Asp-labeled peptides (rP2-rP4) was analyzed by tricine SDS-PAGE. Discrete bands in rP4 expression at levels comparable to rP1 (0.065 vs. 0.072 pmol / ⁇ L) were observed (FIGS. 13b and 21), and the identity of rP4 peptides with predicted molecular weights was confirmed by MALDI-TOF MS spectra. (Fig. 13c).
  • a cyclic peptide containing a plurality of foreign amino acids including an Abz derivative was expressed.
  • Template mRNAs (mR5-mR10) were designed to express peptides (rP5-rP10) under the reprogrammed genetic code (FIG. 14a).
  • the ClAc group and sulfhydryl group on the D-amino acid are automatically cyclized via a thioether bond when the entire peptide is synthesized (Fig. 14a).
  • amino acids bound to the tRNA Pro1E2 NNN (where NNN is the corresponding anticodon) were introduced into the amino acid sequence of the peptide (rP5, rP6, or rP7), respectively (FIG. 14a).
  • the MALDI-TOF MS spectrum of each peptide (rP5-rP7) confirmed that the correct cyclic peptide was expressed.

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Abstract

本発明は、２種以上の環状ペプチドを含むライブラリーの製造方法であって、前記ライブラリーに含まれる環状ペプチドの少なくとも一つが、４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有し、前記環状構造内に、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つを含む、環状ペプチドであり、式(1)で表される配列；－(Xaa)n1－　(1)［式(1)中、Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、n1は、２～２８の整数である。］を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーを準備する工程と；前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記ペプチドを発現させ、ライブラリーを製造する工程と；を含む、ライブラリーの製造方法に関する。

Description

ライブラリーの製造方法、環状ペプチド、ＦＸＩＩａ結合剤、及びＩＦＮＧＲ１結合剤
　本発明は、ライブラリーの製造方法、環状ペプチド、FXIIa結合剤、及びIFNGR1結合剤等に関する。
　天然産物にはα－アミノ酸以外のβ、γ等の非天然型アミノ酸が存在しており、これらは、生物活性、ペプチダーゼ耐性、標的特異性、さらには膜透過性に寄与することが知られている。
　リボソーム翻訳系を用いるペプチド合成においては一般に20個の天然型α－アミノ酸を利用するため、β、γ－アミノ酸等の非天然型のアミノ酸を含む天然に存在するペプチドの製造には、通常、翻訳後修飾又は非リボソームペプチド合成によって得ることが一般的である。
　ペプチド鎖へのβ、γ－アミノ酸等のリボソーム取り込みに向けた遺伝暗号操作による手法が検討されてきているが、非天然型のアミノ酸の取り込み効率は本質的に低く、連続的な伸長は不可能と考えられている。
　取り込み効率が低い理由としては、β－アミノアシル－tRNAがEF-TuによりリボソームＡ部位に導入される速度が遅いこと、およびβ－アミノ酸間のペプチジル転移速度が遅いことに主に起因すると考えられている。さらに、遅いペプチジル転移はリボソームの停止及びリボソームからのペプチジルtRNAの脱落を引き起こすと考えられている。
　非天然型のアミノ酸の取り込み効率を向上させる方法として、例えば、特許文献１には、翻訳因子EF-Pと組み換えられたtRNAPro1E2とをリボソーム合成に適用する方法が提案されている。特許文献１の方法によると、tRNAPro1E2を用いることにより、特定のD-アミノ酸及び非環状β-アミノ酸の取り込み効率が改善され、ペプチドへの取り込みが7回連続して可能となる。
国際公開第２０１９／０７７８８７号
　構造多様性や化合物の物性の改善の観点等から、非天然型アミノ酸を含む多様なペプチドを効率的に製造する方法が求められている。
　特許文献１のtRNAを用いる方法によると、D－アミノ酸及び非環状β－アミノ酸といった非天然型アミノ酸の取り込み効率を向上できるとされている。しかしながら、特許文献１においては、上記非天然型アミノ酸以外の非天然型アミノ酸を含むペプチドのリボソーム合成は検討されていない。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、β、γ、及びδ－環状アミノ酸を含む環状ペプチドを、無細胞翻訳系を用いて発現させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、本明細書において、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸をcAAと記載する場合もある。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
　２種以上の環状ペプチドを含むライブラリーの製造方法であって、
　前記ライブラリーに含まれる環状ペプチドの少なくとも一つが、
　　４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有し、
　　前記環状構造内に、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つを含む、環状ペプチドであり、
　式(1)で表される配列；
　－(Xaa)n1－　　　　　(1)
［式(1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
　n1は、２～２８の整数である。］
を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーを準備する工程と；
　前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記ペプチドを発現させ、ライブラリーを製造する工程と；
を含む、
ライブラリーの製造方法。
［２］
　２種以上の環状ペプチドを含むライブラリーの製造方法であって、
　前記ライブラリーに含まれる環状ペプチドの少なくとも一つが、
　　４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有し、
　　前記環状構造内に、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つを含む、環状ペプチドであり、
　式(1)で表される配列；
　－(Xaa)n1－　　　　　(1)
［式(1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
　n1は、２～２８の整数である。］
を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーを準備する工程と；
　前記mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
　前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記ペプチドを発現させ、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
を含む、
ライブラリーの製造方法。
［３］
　無細胞翻訳系が、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種をチャージしたtRNAを含み、前記tRNAが、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNA又はEF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAである、
［１］又は［２］に記載のライブラリーの製造方法。
［４］
　無細胞翻訳系が、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種をチャージしたtRNAを含み、前記tRNAが、tRNAPro1E2及びtRNAGluE2から選択される少なくとも一つである、
［１］～［３］のいずれかに記載のライブラリーの製造方法。
［５］
　式(1)で表される配列を含むペプチドが、式(2)；
　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(2)
［式(2)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　n1は、２～２８の整数であり、
　mは、０～１０の整数を表す。］
で表される、
［１］～［４］のいずれかに記載のライブラリーの製造方法。
［６］
　β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸が、それぞれ、
式（I-1）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式（I-1）中、p1は、１～４のいずれかの整数である。）
式（I-2）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式（I-2）中、p2は、１～４のいずれかの整数である。）
式（I-3）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式（I-3）中、p3は、１又は２の整数である。）
式（I-4）；
　　H2N-Ar-COOH                                    （I-4）
（式（I-4）中、Arは、２価の芳香族基であり、芳香族基における芳香環は１又は複数の置換基により置換されていてもよい。）
により表される、
［１］～［５］のいずれかに記載のライブラリーの製造方法。
［７］
　cAAが、式(1)で表される配列中に２個以上ランダムに含まれる、
［１］～［６］のいずれかに記載のライブラリーの製造方法。
［８］
　cAAが、式(1)で表される配列中に２個以上連続して含まれる、
［１］～［７］のいずれかに記載のライブラリーの製造方法。
［９］
　cAAが、
　式(1)で表される配列中に３個以上１５個以下連続して含まれ、
　(1S,2S)-2-ACPC：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 で表されるβ－環状アミノ酸である、
［１］～［８］のいずれかに記載のライブラリーの製造方法。
［１０］
　cAAが、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 から選択される少なくとも１種のβ－又はγ－環状アミノ酸（i）、及び／又は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 から選択される少なくとも１種のβ－又はγ－環状アミノ酸（ii）であり、
　無細胞翻訳系が、
　β－又はγ－環状アミノ酸（i）をチャージした、EF-Pと相互作用するD-アーム構造を有するtRNA、及び／又は、
　β－又はγ－環状アミノ酸（ii）をチャージした、EF-Pと相互作用するD-アーム構造を有しないtRNA
を含む、
［１］～［８］のいずれかに記載のライブラリーの製造方法。
［１１］
　β－又はγ－環状アミノ酸（i）をチャージした、EF-Pと相互作用するD-アーム構造を有するtRNAが、tRNAPro1E2であり、
　β－又はγ－環状アミノ酸（ii）をチャージした、EF-Pと相互作用するD-アーム構造を有しないtRNAが、tRNAGluE2である、
［１０］に記載のライブラリーの製造方法。
［１２］
　４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩であって、
　前記環状構造の４～３０のアミノ酸又はその誘導体のうち２つのアミノ酸又はその誘導体Xaa1及びXaa2は、環状構造を形成するための構造を含み、
　前記Xaa1と前記Xaa2とは、２～２８のアミノ酸又はその誘導体から構成されるアミノ酸配列を介して連結した構造を有し、
　前記２～２８のアミノ酸又はその誘導体から構成されるアミノ酸配列が、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つ、並びに、任意のアミノ酸又はその誘導体で構成される、
　環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［１３］
　前記環状ペプチドが、式(3)；
　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(3)
［式(3)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－環状アミノ酸（cβAA）であり、
　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
　n1が、１０～１６の整数であり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　mは、０～１０の整数を表す。］
により表され、
　Xaa1を１番目のアミノ酸とするとき、少なくとも１つのcAAは、５～９番目に存在する、
［１２］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［１４］
　Xaaの少なくとも１つが、塩基性アミノ酸又はその誘導体である、
［１３］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［１５］
　式(3)中の(Xaa)n1が、以下のf1～f4から選択されるいずれかである、
［１３］又は［１４］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 ［式中、cAAは、β－環状アミノ酸である。］
［１６］
　前記環状ペプチドが、式(3-1)；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 ［式(3-1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　cAAは、β－環状アミノ酸であり、
　n1aは、３～７の整数であり、n1bは、２～８の整数であり（ただしn1aとn1bの合計が、９～１５の整数である）、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaa1は、Phe又はTyrであり、
　mは、０～１０の整数を表す。ただし、(Xaa)n1aには、cAAを含まない。］
により表される、
［１３］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［１７］
　Xaaのうち少なくとも１つが、塩基性アミノ酸又はその誘導体である、
［１６］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［１８］
　n1aとn1bとの差（絶対値）が、４以下である、
［１６］又は［１７］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［１９］
　前記環状ペプチドが、以下のF1～F4のいずれかである、
　［１３］～［１８］のいずれかに記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 ［式中、
　cAAは、それぞれ独立してβ－環状アミノ酸であり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　mは、０～１０の整数を表す。］
［２０］
　β－環状アミノ酸が、
式（I-1）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （式（I-1）中、p1は、１～４のいずれかの整数である。）
で表される、
［１３］～［１９］のいずれかに記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［２１］
　前記環状ペプチドが、式(4)；
　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(4)
［式(4)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－環状アミノ酸（cAA）であり、
　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
　n1が、９～１５の整数であり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　mは、０～１０の整数を表す。］
により表され、
　Xaa1を１番目のアミノ酸としたとき、少なくとも１つのcAAが、５～８番目に存在する、
［１２］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［２２］
　式(4)中の(Xaa)n1が、以下のi1-1～i1-6から選択されるいずれかである、
［２１］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 ［式中、cAAは、β－環状アミノ酸である。］
［２３］
　前記環状ペプチドが、式(4-1)；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 ［式(4-1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　cAAは、β－環状アミノ酸であり、
　n1aは、３～６の整数であり、n1bは、５～８の整数であり（ただしn1aとn1bの合計が、８～１４の整数である）、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaa1は、Phe又はTyrであり、
　mは、０～１０の整数を表す。ただし、(Xaa)n1aには、cAAを含まない。］
により表される、
［２１］に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［２４］
　前記環状ペプチドが、以下のI1-1～I1-6のいずれかである、
［２１］～［２３］のいずれかに記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ［式中、
　cAAは、それぞれ独立してβ－環状アミノ酸であり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　mは、０～１０の整数を表す。］
［２５］
　β－環状アミノ酸が、
式（I-1）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （式（I-1）中、p1は、１～４のいずれかの整数である。）
で表される、
［２１］～［２４］のいずれかに記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
［２６］
　［１３］～［２０］のいずれかに記載の環状ペプチド、又はその医薬的に許容可能な塩を含む、活性化した血液凝固第XII因子（FXIIa）結合剤。
［２７］
　［２１］～［２５］のいずれかに記載の環状ペプチド、又はその医薬的に許容可能な塩を含む、II型インターフェロン受容体複合体（IFNGR1）結合剤。
　本発明によれば、β、γ、及びδ－環状アミノ酸を含む環状ペプチドを含むライブラリーの製造方法を提供することができる。
実施例における、cAAの取込みに用いたtRNAの二次構造を示す図である。aは、tRNAPro1E2 CGGの二次構造である。EF-Pとの結合のためのDアーム構造（D arm motif）は、安定な4塩基対のステムによって閉じられた9塩基のDループを含む。また、EF-Tu結合のT-ステム（T-stem motif）を有する。bは、tRNAGluE2 GAUの二次構造である。EF-Tu結合のT-ステム（T-stem motif）を有し、これはtRNAPro1E2と同一である。cは、開始コドンAUGによるClAcD-Pheの取り込みに用いられたtRNAfMet CAUである。 I、II、III、及びIVは、それぞれ(1R,2R)-2-ACPC、(1R,2S)-2-ACPC、(1S,2R)-2-ACPC及び(1S,2S)-2-ACPCをペプチドrP1～rP10に導入した際のペプチドの発現レベルの結果を示す図である。予めチャージした2-ACPC-tRNAPro1E2 CGGを用いてCCGコドンに2-ACPCを割り当てた。黒いバーはEF-P存在下（EF-P(+)）で行った翻訳であり、白いバーはEF-P非存在下（EF-P(-)）で行った翻訳である。棒グラフ上の数字は、EF-P非存在下の発現レベルに対するEF-P存在下の比（EF-P(+)/EF-P(-)）を示す。EF-P存在下で行った際のEF-Pの濃度は5μMであった。反応時間は30分とした。N.D.は、検出されなかったことを表す。 a、b、c、d、及びeは、それぞれ、(1R,2R)-2-ACPC、(1R,2S)-2-ACPC、(1S,2R)-2-ACPC、(1S,2S)-2-ACPC、及び2-ACHCをペプチドへ導入した際のトリシンSDS-PAGEの解析結果を示す図である。+は、ペプチジルtRNAのドロップオフに由来する不純物である。*は、翻訳系に由来する鋳型非依存的な不純物のピークである。 a、b、及びcは、それぞれ、(1R,2R)-2-ACPC、(1R,2S)-2-ACPC、(1S,2R)-2-ACPCを含むペプチドのMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。EF-P存在下での翻訳におけるEF-Pの濃度は5μMであった。矢印は、所望のペプチドのピークを示す。高分子量側（高m/z側）の矢印は一価のイオン、低分子量側（低m/z側）の矢印は二価のイオンを示す。「Calcd.」は計算値を、「Obsd.」は観測値をそれぞれ表す。N.D.は、検出されなかったことを表す。*は、翻訳系に由来する鋳型非依存的な不純物のピークである。 (1S,2S)-2-ACPCを含むペプチドのMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。EF-P存在下での翻訳におけるEF-Pの濃度は5μMであった。矢印は、所望のペプチドのピークを示す。スペクトル中の矢印、「Calcd.」、及び「Obsd.」は、図４中のそれらと同義である。N.D.は、検出されなかったことを表す。 (1R,2R)-2-ACHC、(1R,2S)-2-ACHC、(1S,2R)-2-ACHC、及び(1S,2S)-2-ACHCをペプチドrP1又はrP2に導入した際のペプチドの発現レベルの結果を示す図である。予めチャージした2-ACHC-tRNAPro1E2 CGGを用いてCCGコドンに2-ACHCを割り当てた。黒いバーはEF-P存在下（EF-P(+)）で行った翻訳であり、白いバーはEF-P非存在下（EF-P(-)）で行った翻訳である。棒グラフ上の数字は、EF-P非存在下の発現レベルに対するEF-P存在下の比（EF-P(+)/EF-P(-)）を示す。EF-P存在下で行った際のEF-Pの濃度は5μMであった。反応時間は30分とした。N.D.は、検出されなかったことを表す。 e、f、g、及びhは、それぞれ、(1R,2R)-2-ACHC、(1R,2S)-2-ACHC、(1S,2R)-2-ACPC、及び(1S,2S)-2-ACHCを含むペプチドのMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。スペクトル中の矢印、「Calcd.」、「Obsd.」、及び*は、図４中のそれらと同義である。 ペプチドrP11、rP12、及びrP13のMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。スペクトル中の矢印、「Calcd.」、「Obsd.」、「N.D.」、及び*は、図４中のそれらと同義である。 FXIIa結合ペプチド及びIFNGR1結合ペプチドの血清安定性アッセイの結果を示す図である。F1、F2、F3、F4、I1-6、F1A、F3A、F4A、及びI1-1Aの各々を、ヒト血清中の内部標準ペプチドと37℃で一緒にインキュベートした。0、1、3、9、24、72、144、及び240時間で、標準ペプチドに対する各ペプチドの相対強度をLC/MSによって推定した。0時間での相対強度を100%と定義した。 FXIIaに結合したF3の構造をX線結晶解析で解析した結果を示す図である。aは、スティックモデルで示したF3の全体構造である。水素結合を破線で示した。局所的なターン構造は矢印で示した箇所である。bは、FXIIaとF3との複合体の全体構造である。基質のArg残基(Arg6)を収容するS1ポケットは点線で示した。cは、Asp5-ACHC8セグメントのFXIIaへの結合を示す。dは、F3の分子中央部のFXIIaへの結合を示す。 cis-3-ACBC, trans-3-ACBC, (1R,3S)-3-ACPC, (1R,3S)-3-ACPC, (1S,3R)-3-ACPC), (1S,3S)-3-ACPC, (1R,3R)-3-ACHC、及び(1R,3S)-3-ACHCを含むペプチドのMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。スペクトル中の矢印、「Calcd.」、「Obsd.」、及び*は、図４中のそれらと同義である。 Abz誘導体のペプチドrP1へのリボソーム取り込みを示す図である。aは、mRNA (mR1)と対応するペプチド(rP1)の配列を示す。予めチャージしたアミノアシル-tRNAPro1E2 CGGを用いて、Abz誘導体をCCGコドンに割り当てている。flagは、mR1においてはGACUACAAGGACGACGACGACAAGであり、rP1においてはAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysである（図１３及び図１４において同様）。bは、Abz誘導体を含むペプチドのMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。スペクトル中の矢印、「Calcd.」、「Obsd.」、*は、図４中のそれらと同義である。ｃは、オートラジオグラフィーにより推定したrP1ペプチドの発現レベルを示す図である。黒いバーはEF-P存在下（EF-P(+)）で行った翻訳であり、白いバーはEF-P非存在下（EF-P(-)）で行った翻訳である。棒グラフ上の数字は、EF-P非存在下の発現レベルに対するEF-P存在下の比（EF-P(+)/EF-P(-)）を示す。 複数のAbzのペプチド（rP2～rP4）へのリボソーム取り込みを示す図である。aは、mRNA（mR2～mR4）と対応するペプチド（rP2～rP4）の配列を示す。bは、オートラジオグラフィーにより推定したペプチド（rP1～rP4）の発現レベルを示す。N.D.は、検出されなかったことを表す。cは、Abzを含むrP4ペプチドのMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。矢印は、所望のペプチドの一価のイオンを示す。「Calcd.」及び「Obsd.」は、図４中のそれらと同義である。 Abz誘導体の環状ペプチド（rP5～rP10）へのリボソーム取り込みを示す図である。aは、mRNA（mR5～mR10）と対応する環状ペプチド（rP5～rP10）の配列を示す。D-Cysのチオール基はN末端のクロロアセチル基とチオエーテル結合を形成する。bは、ペプチド（rP5-rP10）のMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。スペクトル中の矢印、「Calcd.」、「Obsd.」、*は、図４中のそれらと同義である。 Abz又はAbz5OMeを含むrP8ペプチドの構造を示す図である。 実施例における、cAAの取込みに用いたμhRNA及びtRNAの二次構造を示す図である。aは、μhRNAの二次構造である。bは、tRNAPro1E2 CGGの二次構造である。EF-Pとの結合のためのDアーム構造（D arm motif）は、安定な4塩基対のステムによって閉じられた9塩基のDループを含む。また、EF-Tu結合のT-ステム（T-stem motif）を有する。アンチコドンループの配列は、表１４に記載するように別のコドンをデコードするために適宜変更される。cは、開始コドンAUGによるClAcD-Tyr及びClAcD-Pheの取り込みに用いられたtRNAfMet CAUである。dは、CCGコドンによる(1S,2S)-2-ACPCの取り込みに用いられたtRNAGluE2 CGGである。 a、b、c、及びdは、それぞれ、Abz、Abz5OH、Abz5OMe、及びAbz5Fの無水物を用いてμhRNAをアミノアシル化した際の酸変性PAGEの解析結果を示す図である。各バンドは、エチジウムブロマイド染色によって検出された。中央の矢印は、所望のモノアミノアシルμhRNAを、上方と下方の矢印は、それぞれ、マルチアミノアシルμhRNA及び未反応のμhRNAの位置を示す。 a、b、c、及びdは、それぞれ、Abz、Abz5OH、Abz5OMe、及びAbz5Fを用いてアミノアシル化した際のアミノアシルμhRNAのMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。左から２番目の最大ピークを指す矢印は、所望のモノアミノアシルμhRNAのピークを示す。より高分子量側（高m/z側）の矢印は、マルチアミノアシルμhRNAを示し、より低分子量側（低m/z側）の矢印は未反応のμhRNAを示す。「Calcd.」及び「Obsd.」は、図４中のそれらと同義である。†は、カリウム付加物を示す。 a、b、c、及びdは、それぞれ、Apy、Atp、Atz、及び3NAbzのシアノメチルエステル（CME）とフレキシザイム（eFx）を用いてμhRNAをアミノアシル化した際の酸変性PAGEの解析結果を示す図である。上方と下方の矢印は、それぞれ、所望のアミノアシルμhRNA及び未反応のμhRNAの位置を示す。 a、b、c、及びdは、それぞれ、Apy、Atp、Atz、及び3NAbzを用いてアミノアシル化した際のアミノアシルμhRNAのMALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。高分子量側（高m/z側）の矢印は所望のモノアミノアシルμhRNAを示す。低分子量側（低m/z側）の矢印は未反応のμhRNAを示す。「Calcd.」及び「Obsd.」は、図４中のそれらと同義である。*及び†は、それぞれ、ナトリウム付加物及びカリウム付加物を示す。 図１２cにおけるAbz誘導体を含むrP1ペプチドのトリシンSDS-PAGE分析の結果を示す。 図１３ｂにおけるAbzを含むペプチド（rP1～rP4）のトリシンSDS-PAGE分析の結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施形態に制限されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
＜ライブラリーの製造方法＞
　本発明は、２種以上の環状ペプチドを含むライブラリーの製造方法である。
　本発明におけるライブラリーに含まれる環状ペプチドの少なくとも一つは、
　　４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有し、
　　前記環状構造内に、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つを含む、環状ペプチドである。
　本発明のライブラリーの製造方法の一つは、
　式(1)で表される配列；
　－(Xaa)n1－　　　　　(1)
［式(1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
　n1は、２～２８の整数である。］
を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーを準備する工程と；
　前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記ペプチドを発現させ、ライブラリーを製造する工程と；
を含む。
　また、本発明のライブラリーの製造方法の一つは、
　式(1)で表される配列；
　－(Xaa)n1－　　　　　(1)
［式(1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
　n1は、２～２８の整数である。］
を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーを準備する工程と；
　前記mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
　前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
を含む。
　ペプチド鎖中にβ－アミノ酸残基やγ－アミノ酸残基が存在する場合、その安定したらせん状性質のために、独特の折りたたみ構造を形成することができる。さらに、β－アミノ酸は、γ－ターンやβ－ターンのようなペプチドのターン構造を誘導することもできる。特に環状のβ－、γ－アミノ酸（cβAA、cγAAとも記載する）は、特に強いヘリックス／ターンインデューサーとして作用する。したがって、環状のβ－、γ－アミノ酸を環状ペプチドに導入することができれば、ペプチドに剛性を発現させる可能性がある。本発明のライブラリーの製造方法によれば、環状のβ－、γ－アミノ酸等の環状アミノ酸を含む環状ペプチドを取得することができる。
　本発明者らは、今回新たに、非天然型のβ－又はγ－アミノ酸であり、なおかつ、嵩高く、剛直な構造を有する環状アミノ酸においてもリボソーム合成が適用できることを見出した。
　本明細書において、「環状ペプチド」とは、４以上のアミノ酸により形成される環状構造を分子内に少なくとも有するペプチドを意味する。環状ペプチドの分子構造として、環状構造以外に、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造を有していてもよく、また、ペプチド構造以外の構造を有していてもよい。
　本明細書において、「環状構造」とは、直鎖状ペプチドにおいて、２アミノ酸残基以上離れた２つのアミノ酸によって分子内に形成される閉環構造を意味する。
　本明細書において、「２アミノ酸残基以上離れた」とは、２つのアミノ酸の間に少なくとも２残基のアミノ酸が存在することを意味する。
　本明細書において、「ライブラリー」とは、２種以上の環状ペプチドを含む、環状ペプチドの群を指す。
　本発明における環状ペプチドは、β－環状アミノ酸（cβAA）、γ－環状アミノ酸（cγAA）、δ－環状アミノ酸（cδAA）の少なくとも１種のcAAを含む。また、本発明における環状ペプチドは、さらに天然アミノ酸（本明細書において、単に「アミノ酸」ともいう）に加え、人工のアミノ酸変異体及び／又は誘導体（本明細書において「アミノ酸の誘導体」ともいう）を含んでいてもよい。
　本発明における環状ペプチドを構成するアミノ酸としては、例えば、天然タンパク質性Ｌ－アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
　タンパク質性アミノ酸（proteinogenic amino acids）は、当業界に周知の３文字表記により表すと、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。また、タンパク質性アミノ酸は、当業界に周知の１文字表記により表すと、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶである。
　非タンパク質性アミノ酸（non-proteinogenic amino acids）としては、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。
　非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α－二置換アミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｎ－アルキルアミノ酸、D－アミノ酸、β－アミノ酸（ここでいうβ－アミノ酸は、cβAA以外のアミノ酸である。）、α－ヒドロキシ酸、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジン等）、及び、側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
　本発明におけるアミノ酸の誘導体としては、アルキル基がα位のアミノ基に結合したアミノ酸である、Ｎ－アルキル－α－アミノ酸が好適に挙げられる。
　環状構造を形成するアミノ酸残基の数は４以上であれば特に限定されないが、例えば、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上であってもよい。環状構造を形成するアミノ酸残基の数は３０以下であれば特に限定されないが、２５以下、２０以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下であってもよい。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は、通常５以上３０以下であり、５以上３０以下の範囲内で、環状構造を形成するアミノ酸の数を６以上、８以上、１０以上、１１以上、１２以上としてもよく、３０以下、２５以下、２０以下、１８以下、１７以下、１５以下としてもよい。環状構造を形成するアミノ酸の数を５以上３０以下の範囲とすることにより、ライブラリーを構成する環状ペプチドの多様性が担保される傾向にある。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は、８以上２０以下としてもよく、８以上１７以下としてもよく、９以上１７以下としてもよく、１０以上１５以下としてもよく、１０以上１３以下としてもよい。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は、環状ペプチドの折りたたみ構造の発現等の機能性の観点から、好ましくは９以上２５以下、より好ましくは１０以上２０以下、さらに好ましくは１０以上１８以下である。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は、１１以上１７以下であってもよく、１２以上１８以下であってもよく、１２以上１８以下であってもよく、１１以上１６以下であってもよい。
　本発明において、環状ペプチドは、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、糖鎖付加、及びポリエチレングリコールの付加等の修飾が加えられたものであってもよく、他のペプチド及び／又はタンパク質と融合させたものであってもよい。また、環状ペプチドは、適当なリンカーを介して、ビオチン化や標識化されていてもよい。
　また、本発明において、環状ペプチドは、２つの、１つの環状構造を有する環状ペプチドがリンカー構造を介して結合した分子内に２つの環状構造を有する二量体であってもよく、分子内でラクタム構造を形成した分子内ラクタムブリッジ構造を有していてもよい。
　２つの環状ペプチドを繋ぐリンカー構造としては、特に限定されず、ペプチド合成分野においてペプチド同士を繋ぐリンカーとして周知の構造のものを採用することができる。
　分子内ラクタムブリッジ構造は、環状ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖同士が結合することによって形成されてよく、例えば、Ｌｙｓの側鎖のアミノ基と、Ａｓｐ又はＧｌｕの側鎖のカルボキシル基が結合して、ペプチド結合を形成することにより、分子内ラクタム構造が形成され、環状ペプチドは、分子内にブリッジ構造として、もう１つの環構造を有する。Ｌｙｓに代えて、例えば、ＤＡＰ、ＤＡＢ、及びＯｒｎがＡｓｐ又はＧｌｕと結合していてもよい。
　本発明におけるcAAは、例えば、式（I）により表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　式（I）中、環Cは、飽和又は不飽和の脂環式炭化水素環であってもよく、複素環であってもよい。また、環Cは、芳香環であってもよい。さらに、環Cは、架橋構造を有していてもよい。
　qは、０、１又は２のいずれかの整数である。qが０であるとき、カルボン酸基が結合する炭素とアミノ基が結合する炭素とは、単結合を形成する。
　リボソーム合成により環状ペプチドへの導入を円滑に行うために、環Cは、飽和又は不飽和の脂環式炭化水素環、又は芳香環であることが好ましく、飽和又は不飽和の脂環式炭化水素環であることがより好ましい。
　本発明におけるcβAAは、式（I-1）により表されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　式（I-1）中、p1は、１～４のいずれかの整数であり、好ましくは１～３のいずれかの整数である。
　本発明におけるcγAAは、式（I-2）により表されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　式（I-2）中、p2は、１～４のいずれかの整数であり、好ましくは１～３のいずれかの整数である。
　本発明におけるcδAAは、式（I-3）により表されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　式（I-3）中、p3は、１又は２の整数であり、好ましくは１である。
　本発明におけるcβAA、cγAA、又はcδAAといったcAAは、式（I-4）により表されることが好ましい。
　　H2N-Ar-COOH                                    （I-4）
　式（I-4）中、Arは、２価の芳香族基であり、芳香族基における芳香環は１又は複数の置換基により置換されていてもよい。
　ここで、Arが２価の芳香族基であるとは、環Cが芳香環である場合であって、芳香環の２つの結合手の一方がアミノ基（NH2）と結合し、２つの結合手の他方がカルボキシル基（COOH）と結合していることを意味する。
　芳香環の２つの結合手は、少なくともNH2とCOOHと結合しているが、残る結合手は、水素原子と結合していてもよく、１又は複数の置換基と結合していてもよい。
　芳香環としては、ベンゼン、ナフタレン等であってもよく、１又は複数の窒素原子、酸素原子及び／又は硫黄原子等と炭素原子とからなる芳香族ヘテロ環であってもよい。
　芳香環が、芳香族ヘテロ環である場合には、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、フラン、ピラン、チオフェン等の１又は複数の窒素原子、酸素原子及び／又は硫黄原子を含む５～６員の芳香族ヘテロ環化合物であってよく、インドール、キノリン、イソキノリン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン等の縮合環化合物であってもよい。
　芳香環に１又は複数の置換基がある場合には、置換基の数は、１、２、３、又は４であってよく、１～３であってよく、１又は２であってよく、１であってもよい。
　置換基としては、特に限定されないが、例えば、炭素数１～６の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、水酸基、アミノ基、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、及び炭素数１～６の直鎖若しくは分岐鎖のアルコキシ基、アルケニル基又はアルキニル基等が挙げられる。
　芳香環は、特に限定されないが、例えば、５員又は６員の環であってよい。
　芳香環が６員環である場合、NH2とCOOHとがオルト位にある場合、cβAAであり、メタ位にある場合、cγAAであり、パラ位にある場合、cδAAである。言い換えると、芳香環が６員環である場合、NH2とCOOHとが１位と２位にある場合、cβAAであり、１位と３位にある場合、cγAAであり、１位と４位にある場合、cδAAである。
　また、芳香環が５員環である場合、NH2とCOOHとが１位と２位にある場合、cβAAであり、１位と３位にある場合、cγAAである。
　これまで芳香族アミノ酸の一種である２－アミノ安息香酸（Abz）のリボソーム取り込みはペプチドのN末端でのみ達成されていたが、本発明により、芳香族アミノ酸をN末端ではない部位に取り込んだとしてもリボソーム伸長を図ることができる。すなわち、本発明によれば、芳香族アミノ酸を伸長の間の構成単位としてペプチド鎖に取り込むことができる。
　本発明の製造方法における環状ペプチドは、式(1)で表される配列を含む。
　－(Xaa)n1－　　　　　(1)
　式(1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
　n1は、２～２８の整数である。
　本発明におけるcAAは、以下の構造により表されることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　本発明における環状ペプチドの閉環構造は特に限定されないが、２つのアミノ酸が、共有結合することにより形成される。
　２つのアミノ酸間の共有結合としては、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、及びチオアミド結合等が挙げられる。
　２つのアミノ酸がアミノ酸の主鎖において結合する場合、ペプチド結合により閉環構造が形成される。また、２つのアミノ酸間の共有結合は、２つのアミノ酸の側鎖同士、又は、２つのアミノ酸の側鎖と主鎖との結合等により、形成されてもよい。
　環状構造は、直鎖状ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸の結合に限られず、末端のアミノ酸と末端以外のアミノ酸との結合、又は末端以外のアミノ酸同士の結合により形成されてもよい。環状構造を形成のために結合するアミノ酸の一方が末端アミノ酸で、他方が非末端アミノ酸である場合、環状ペプチドは、環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する。
　また、閉環構造としては、例えば、以下の官能基1を有するアミノ酸と、対応する官能基2を有するアミノ酸を、環形成アミノ酸として含めることにより、自発的な反応によって翻訳合成されたペプチドを環状化することができる。官能基1と2はどちらがN末端側に配置してもよく、N末端とC末端に配置してもよい。また、官能基1と2の配置としては、一方を末端アミノ酸、他方を非末端アミノ酸としてもよく、両方を非末端アミノ酸としてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　本発明における環状ペプチドは、式(2)により表されることが好ましい。したがって、本発明の製造方法では、式(2)により表されるペプチドをコードするmRNAライブラリーを用いることが好ましい。
　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(2)
　式(2)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　n1は、２～２８の整数であり、
　mは、０～１０の整数を表す。
　Xaa1とXaa2との間には、上述した、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、及びチオアミド結合等の共有結合が形成されることが好ましい。これらの結合の中でも、チオエーテル結合がより好ましい。
　Xaa1とXaa2との間にチオエーテル結合が形成される場合、Xaa1は、N-クロロアセチルフェニルアラニン（ClAcPhe）又はN-クロロアセチルチロシン（ClAcTyr）であることが好ましく、N-クロロアセチル-D-フェニルアラニン（ClAcD-Phe）又はN-クロロアセチル-D-チロシン（ClAcD-Tyr）であることがより好ましい。また、Xaa2は、システインであることが好ましく、D-システイン（D-Cys）であることがより好ましい。
　Xaa1とXaa2との間にチオエーテル結合が形成される場合、本発明における環状ペプチドは、好ましくは以下の式(2')により表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　式(2')中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
　Xaa1は、好ましくはフェニルアラニン又はチロシンであり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　n1は、２～２８の整数であり、
　mは、０～１０の整数を表す。
　本発明の製造方法においては、式(1)で表される配列を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーから、無細胞翻訳系を用いて、式(1)で表される配列を含むペプチドを発現させる。ここでmRNAライブラリーは、市販品等から入手することにより準備してもよく、調製することにより準備してもよい。例えば、mRNAライブラリーを調製する場合、Chemistry & Biology 18, 1562-1570 (2011)及び／又はChemistry & Biology 21, 766-774 (2014)に記載の方法に準拠してDNAライブラリーを得て、当該DNAライブラリーを試験管内で転写することでmRNAライブラリーを調製すればよい。
　mRNAライブラリーは、コドンとして、複数のN1N2N3を有するmRNAを含む。
　本明細書において、「N1N2N3」は、任意のアミノ酸を指定するコドンを意味し、例えばN1、N2及びN3は、それぞれ独立に、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）及びウラシル（U）から選択される。1つのmRNAには、N1N2N3が複数含まれているが、それぞれのN1、N2及びN3はそれぞれ独立に選択される。したがって、例えば、mRNAに、－N1N2N3－N1N2N3－が含まれる場合、それぞれ2つのN1、N2及びN3は、互いに同一であっても異なってもよい。
　本発明においては、式(1)で表される配列－(Xaa)n1－を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーを用いるため、少なくとも－(N1N2N3)n1－で表されるmRNAを含むことが好ましい。
　本発明においては、N1N2N3には、任意のアミノ酸が再割当されるが、少なくとも１つのN1N2N3にcAAが再割り当てされる。再割当においては、天然の遺伝暗号表におけるコドンとアミノ酸の関係とは異なるものを割り当てることもでき、同一の関係を割り当てることもできる。本明細書において、「天然の遺伝暗号表」とは、生体においてmRNAのトリプレットからなる遺伝暗号が表すアミノ酸を示した表をいう。天然の遺伝暗号表においてN1N2N3は、以下のアミノ酸を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　mRNAライブラリーは、複数のN1N2N3として、例えば、複数のN1N2K、複数のN1N2S、複数のN1N2M、複数のN1N2W、複数のN1N2A、複数のN1N2U、複数のN1N2C、複数のN1N2Gのいずれかを含むmRNAを含むものであってもよい。本明細書において、N1及びN2は前記と同義であり、Kはそれぞれ独立にウラシル（U）、グアニン（G）のいずれかであり、Sはそれぞれ独立にシトシン（C）、グアニン（G）のいずれかであり、Mはそれぞれ独立にアデニン（A）、シトシン（C）のいずれかであり、Wはそれぞれ独立にアデニン（A）、ウラシル（U）のいずれかである。
　以下、便宜的に、mRNAライブラリーが複数のN1N2Kを含むmRNAを含む場合、すなわちmRNAライブラリーがN1N2N3としてN1N2Kをコドンとして複数含むmRNAを含む場合を例に挙げて本発明を説明するが、その他のmRNAライブラリーを用いた場合でも、翻訳されたペプチドライブラリーに含まれるペプチドがプレニル化する限りは同様に実施可能である。天然の遺伝暗号表においてN1N2Kは、上記表の右欄がG又はUである場合の20種のアミノ酸を示す。
　また、本明細書においては、例えば、天然の遺伝暗号表のとおりにUUGにはLeuを割り当ててもよいし、コドンを再割当することによりLeu以外のアミノ酸を割り当ててもよい。「N1N2K」コドンには、あらゆるアミノ酸を割り当てることができる。「コドンにアミノ酸を割り当てる」とは、あるコドンがそのアミノ酸をコードするように遺伝暗号表を書き換えることを意味する。本明細書においては、「コドンにアミノ酸を割り当てる」と「コドンを再割当する」とは同義で用いられる。
　各コドンに対する、天然の遺伝暗号表とは異なるアミノ酸の割り当ては、例えば、人工アミノアシル化RNA触媒フレキシザイム（Flexizyme）を利用したコドン再割当によって実現される。フレキシザイムによれば、任意のアンチコドンを有するtRNAに所望のアミノ酸を結合させることができるため、任意のコドンに任意のアミノ酸を割り当てることが可能となる。フレキシザイムについては後述する。本明細書においては、tRNAにアミノ酸を結合させることを、アミノ酸をtRNAにチャージする、tRNAをアミノアシル化する、又は、アミノ酸でtRNAをアシル化する、という場合もある。
　本発明においては、「N1N2K」に、cAAが割り当てられ、また、cAA以外の非タンパク質性アミノ酸を割り当ることもできる。mRNAに「N1N2K」が2以上含まれる場合、すべてをcAAあるいは非タンパク質性アミノ酸に割り当ててもよく、一部をcAAあるいは非タンパク質性アミノ酸に割り当ててもよい。
　本発明における無細胞翻訳系とは、細胞を含まない翻訳系を指し、より具体的には細胞から抽出したタンパク質合成機能を利用して目的のペプチド又はタンパク質を試験管内で合成する系を指す。無細胞翻訳系としては、例えば、大腸菌抽出液、小麦胚芽抽出液、ウサギ赤血球抽出液、昆虫細胞抽出液等を用いることができる。また、無細胞翻訳系としては、それぞれ精製した、リボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）、リボソームRNA、アミノ酸、rRNA、GTP、ATP、翻訳開始因子（IF）伸長因子（EF）、終結因子（RF）、及びリボソーム再生因子（RRF）、並びに翻訳に必要なその他の因子を再構成することで構築した、再構成型の無細胞翻訳系を用いてもよい。
　DNAからの転写を併せて行うためにRNAポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のRTS-100（登録商標）、再構成型翻訳系としてはPGI社のPURESYSTEM（登録商標）やNew England BioLabs社のPURExpressR In Vitro Protein Synthesis Kit等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
　また、大腸菌のリボソームを用いる系として、例えば次の文献に記載された技術が公知である：H. F. Kung et al., 1977. The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894; M. C. Gonza et al., 1985, Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, 1648-1652; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg, 1996, Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16; Y. Shimizu et al., 2001, Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755; H. Ohashi et al., 2007, Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。なお、本発明の無細胞翻訳系は、転写に必要な因子を加えて、翻訳のみならず転写に用いてもよい。
　本発明において、無細胞翻訳系によりペプチドの発現をさせることは、例えば、Goto, Y., Katoh, T. & Suga, H. Flexizymes for genetic code reprogramming. Nat Protoc 6, 779-790, (2011)に記載の方法に準拠して、Flexible In vitro Translationシステム（FITシステム）により行うことができる。
　本発明における無細胞翻訳系は、得られる環状ペプチド内にcAAを含むものとするために、cAAをチャージしたtRNAを含むことが好ましい。
　本発明者らが、リボソーム合成によって環状ペプチド内へcAAを導入する方法について検討した結果、cAAの種類に応じてチャージするtRNAを選択し、そのcAAをチャージしたtRNAを用いることにより、cAAを含む環状ペプチドを効率的に取得できることを見出した。
　cAAをチャージさせるtRNAは、翻訳因子であるEF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNA又はEF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAを用いることができる。cAAをチャージさせるtRNAとしては、上記tRNAのいずれも用いることができるが、cAAの種類に応じて適宜選択される。したがって、本発明における無細胞翻訳系は、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種をチャージした、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNA又はEF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAを含むことが好ましい。
　EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAとしては、例えば、国際公開第２０１９／０７７８８７号に記載のtRNAを用いることができる。
　EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAとしては、具体的には、N1N2GCN3N4N5N6N7N8N9N10N11GCN12N13（配列番号１）の塩基配列を含有するtRNAが挙げられる。N1～N13は、それぞれ任意の塩基を示し、N3～N11はDループを形成し、N1N2GCが、N13N12CGと塩基対を形成する。N1N2とN12N13が塩基対を形成する限り、任意の塩基を選択し得るが、N1はＧであり、N13はＣであることが好ましい。
また、N2はＣであり、N12はＧであることが好ましい。
　配列番号１で示される塩基配列は、DループとDステムからなるDアームであり、配列番号１で示される塩基配列をtRNAに導入することにより、EF-Pペプチドによるペプチジルトランスファーを促進する傾向にある。
　配列番号１で示される塩基配列を含有するtRNAにおける、他の構造、すなわち、アクセプターステム、アンチコドンステム、アンチコドンループ、バリアブルループ、Ｔアームの塩基配列は、任意である。アンチコドンループは、cAAを割り当てるコドンに対応した塩基配列を適宜有していればよい。tRNAの3'末端は、CCA配列を有し、cAAと結合する。
　配列番号１で示される塩基配列は、配列番号３で示される塩基配列であること好ましい。
GCGCN3N4N5N6N7N8N9N10N11GCGC（配列番号３）
　配列番号３において、N3～N11は、前記と同義であり、GCGCが、CGCGと塩基対を形成する。
　配列番号１及び配列番号３におけるN3～N11の塩基配列は、配列番号４で示される塩基配列であることが好ましい。
AGCCUGGUA（配列番号４）
　配列番号４で示される塩基配列は、ｔＲＮＡにおけるＤループを形成する。
　配列番号４においては、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。
　塩基が複数置換されるとは、Ｄループを形成する９個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
　配列番号１で示される塩基配列は、配列番号５で示される塩基配列であること好ましく、配列番号６で示される塩基配列であることが好ましい。
N1N2GCGCAGCCUGGUAGCGCN12N13（配列番号５）
　配列番号５において、N1、N2、N12及びN13は、前記と同義であり、N1N2GCが、N13N12CGと塩基対を形成する。
GCGCGCAGCCUGGUAGCGCGC（配列番号６）
　配列番号５及び配列番号６においては、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。配列番号５及び６において塩基が複数置換されるとは、Ｄループを形成する９個の塩基を示す配列番号４において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～４個の塩基が置換されていてもよく、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
　EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNA、及び、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAは、共に配列番号２で示される塩基配列を含有していてもよい。
AGGGG(N14)mCCCCU（配列番号２）
　配列番号２において、N14は、任意の塩基を示し、mは、１以上の整数であり、(N14)mはTループを形成し、AGGGGが、UCCCCと塩基対を形成する。
　アミノアシルtRNAのTステムは、EF-Tuタンパク質との相互作用を調節し、非タンパク質性アミノ酸の取り込みを増強する。配列番号２で示される塩基配列は、TループとTステムからなるTアームであり、配列番号２で示される塩基配列をtRNAに導入することにより、cAAを環状ペプチドに導入するにあたり、EF-Tuタンパク質によるアコモデーションが促進される傾向にある。
　mは、(N14)mはTループを形成する限り特に限定されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の整数であればよく、６～８の整数であることが好ましい。
　(N14)mは、tRNAGluE2のTループに由来する配列番号７で示される塩基配列であることが好ましい。
UUCGAAU（配列番号７）
　配列番号７においては、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。塩基が複数置換されるとは、Tループを形成する７個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、１～３個の塩基が置換されていてもよく、１～２個の塩基が置換されていてもよく、１個の塩基が置換されていてもよい。
　配列番号２において、塩基対を形成するAGGGGとUCCCCとは、Tステムを形成する。Tステムを形成する塩基配列において、塩基対を形成する限り、１又は複数の塩基が置換されていてもよい。
　配列番号２のTステムにおいて塩基が複数置換されるとは、Tステムを形成する１０個の塩基において、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の塩基が置換されていてもよいことを意味し、２個の塩基が置換されていてもよく、４個の塩基が置換されていてもよく、６個の塩基が置換されていてもよく、塩基対を形成する限り、１個、３個、５個の塩基が置換されていてもよい。
　本発明において、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAを用いる場合、好適なtRNAとしては、EF-Pタンパク質によるペプチジルトランスファーの促進作用及びEF-Tuタンパク質によるアコモデーションの促進作用を発揮させるために、配列番号１で示される塩基配列と配列番号２で示される塩基配列の双方を含有する。
　EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAは、好適には、tRNAPro1及びtRNAGluE2のキメラであり、かかるtRNAを、本明細書においては、tRNAPro1E2と呼ぶ。
　EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAは、具体的には、tRNAGluE2のTステムがtRNAPro1に導入されていることが好ましい。
　本発明において、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAを用いる場合、好適なtRNAとしては、EF-Tuタンパク質によるアコモデーションの促進作用を発揮させるために、配列番号２で示される塩基配列を含有する。
　EF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAは、好適には、tRNAGluE2である。
　したがって、本発明のライブラリーの製造方法における無細胞翻訳系の好ましい態様の一つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種をチャージしたtRNAを含み、前記tRNAが、tRNAPro1E2及びtRNAGluE2から選択される少なくとも一つである態様である。また、cAAが、芳香族アミノ酸である場合には、前記tRNAが、tRNAPro1E2であることが好ましい態様である。
　EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNA及びEF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAにおいて、配列番号１及び／又は配列番号２以外の塩基配列については、野生型tRNAに由来する配列であってもよく、大腸菌由来野生型tRNAに由来する配列であってもよく、in vitroの転写で調製した人工tRNAであってもよい。
　本発明のライブラリーの製造方法における式(1)で表される配列は、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸から選択される少なくとも１つのcAAを含んでいればよい。
　２個以上のcAAを含むとき、cAAは、式(1)で表される配列中に２個以上ランダムに含まれていてもよく、式(1)で表される配列中に２個以上連続して含まれていてもよい。ここで、本明細書において、cAAが式(1)で表される配列中に２個以上ランダムに含むとは、少なくとも２つのcAAが式(1)の配列の任意の位置に含み、且つ、２個以上のcAAが隣接していない態様を指す。したがって、２個以上のcAAをランダムに含むとき、２個以上のcAAのそれぞれには、cAA以外の、アミノ酸又はその誘導体が隣接して結合する。
　式(1)で表される配列中にcAAを少なくとも１つ含む場合、cAAの種類は特に制限されないが、好ましくは、式（I-1）、式（I-2）、式（I-3）、及び式（I-4）のいずれかのcAAであることが好ましく、式（I-1）、及び式（I-2）のいずれかのcAAであることがより好ましく、式（I-4）のcAAであることがより好ましく、以下の構造により表されることがさらに好ましい。また、式(1)で表される配列中にcAAを２個以上ランダムに含む場合、cAAの種類は特に制限されないが、好ましくは、式（I-1）、式（I-2）、式（I-3）、及び式（I-4）のいずれかのcAAであることが好ましく、式（I-1）、式（I-2）、及び式（I-4）のいずれかのcAAであることがより好ましく、以下の構造により表されることがさらに好ましい。
　cAAを２個以上ランダムに含む場合、式（I-1）、式（I-2）、式（I-3）、及び式（I-4）のいずれかのcAAの任意の組み合わせであり得るが、式（I-1）のみの２個以上の組み合わせであってよく、式（I-2）のみの２個以上の組み合わせであってよく、式（I-3）のみの２個以上の組み合わせであってよく、式（I-4）のみの２個以上の組み合わせであってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　式(1)で表される配列中にcAAを２個以上連続して含む場合、２個連続のcAAの種類は特に制限されないが、好ましくは、式（I-1）、式（I-2）、式（I-3）、及び式（I-4）のいずれかのcAAであることが好ましく、式（I-1）、式（I-2）、及び式（I-4）のいずれかのcAAであることがより好ましく、式（I-1）のcAAであることがさらに好ましく、式（I-4）のcAAであることもさらに好ましく、以下の構造により表されることがさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　ここで、式(1)で表される配列中にcAAを２個以上連続して含むとき、式(1)で表される配列中に－cAA－cAA－で表されるユニットを少なくとも一つ含んでいればよく、その他にもcAAを含んでいてもよい。その他にも含まれるcAAは、特に制限されないが、式(1)で表される配列中にcAAを２個以上ランダムに含む場合のcAAと同様の好ましい態様が挙げられる。
　また、ここで、式(1)で表される配列中にcAAを２個以上連続して含むとき、その連続したcAAの数は２であることが好ましい。
　式(1)で表される配列中にcAAを３個以上連続して含む場合、cAAは、好ましくは式（I-1）のcAAであり、より好ましくは(1S,2S)-2-ACPCである。cAAとして(1S,2S)-2-ACPCを用いることにより、より効率的にペプチド内へのcAAの連続的取込みを行える傾向にある。(1S,2S)-2-ACPCの折りたたみは、４残基程度で発現されるため（Kwon, S., Jeon, A., Yoo, S. H., Chung, I. S. & Lee, H. S. Unprecedented molecular architectures by the controlled self-assembly of a β-peptide foldamer. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 8232-8236 (2010)、及び、Kim, J. et al. Microtubes with rectangular cross-section by self-assembly of a short β-peptide foldamer. J. Am. Chem. Soc. 134, 20573-20576, (2012)参照）、特に４個以上の(1S,2S)-2-ACPCを連続して含むペプチドは、らせん構造に折りたたまれると考えられる。以上のように、本発明によれば、折りたたみ分子を生化学的に合成することができる。
　ここで、式(1)で表される配列中にcAAを３個以上連続して含むとき、式(1)で表される配列中に－cAA－cAA－cAA－で表されるユニットを少なくとも一つ含んでいればよく、その他にもcAAを含んでいてもよい。その他にも含まれるcAAは、特に制限されないが、式(1)で表される配列中にcAAを２個以上ランダムに含む場合のcAAと同様の好ましい態様が挙げられる。
　(1S,2S)-2-ACPCは、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　(1S,2S)-2-ACPCを３個以上連続して含む場合、その導入数の上限は特に制限されないが、好ましくは１５以下であり、より好ましくは１２以下であり、さらに好ましくは１０以下である。
　上述したように、環状ペプチド内へのcAAの導入を効率的に行う観点から、cAAの種類に応じてチャージするtRNAを選択することが好ましい。
　以下に示されるcAA（以下をまとめてβ－又はγ－環状アミノ酸（i）という）は、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAにチャージさせることが好ましく、tRNAPro1E2にチャージさせることがより好ましい。また、式（I-4）のcAA（中でも、特に、Abz, Abz5OH, Abz5OMe, Abz5F, Apy, Atp, Atz）は、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAにチャージさせることが好ましく、tRNAPro1E2にチャージさせることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　以下に示されるcAA（以下をまとめてβ－又はγ－環状アミノ酸（ii）という）は、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAにチャージさせることが好ましく、tRNAGluE2にチャージさせることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　本発明における無細胞翻訳系は、構成する成分の種類や濃度を適宜調整してもよい。
　例えば、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAを用いる場合、具体的には、β－又はγ－環状アミノ酸（i）又は式（I-4）のcAAをチャージしたEF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAを用いる場合、当該tRNAを使用しない場合と比べて、EF-Pの濃度を大きくなるよう調整してもよい。
　また、例えば、tRNAPro1E2あるいはtRNAGluE2を用いる場合、具体的には、β－又はγ－環状アミノ酸（i）をチャージしたtRNAPro1E2あるいはβ－又はγ－環状アミノ酸（ii）をチャージしたtRNAGluE2を用いる場合、当該tRNAを使用しない場合と比べて、EF-Tuの濃度を大きくなるよう調整してもよい。また、tRNAPro1E2あるいはtRNAGluE2を用いる場合、具体的には、β－又はγ－環状アミノ酸（i）をチャージしたtRNAPro1E2あるいはβ－又はγ－環状アミノ酸（ii）をチャージしたtRNAGluE2を用いる場合、当該tRNAを使用しない場合と比べて、EF-Gの濃度を小さくするよう調整してもよい。EF-Tu及びEF-Gの濃度を上記のとおり制御することにより、翻訳途中のペプチジル-tRNAがリボソームから脱落することを防止できる傾向にある。
　なお、上述したtRNAと、当該tRNAにチャージされるアミノ酸との好ましい組み合わせにおいて、当該アミノ酸がチャージされたtRNAは、当該アミノ酸を含むペプチドの合成に好適に用いることができ、また、当該アミノ酸を含むペプチドは、当該アミノ酸がチャージされたtRNAを用いて好適に製造することができる。
　また、本発明のライブラリーの製造方法は、以下に詳述する本発明の環状ペプチドを得るために用いることができ、上記式(1)で表される配列は、後述する式(3)又は式(4)で表される配列（ただし、cAAは、cβAAに限られず、cγAAであってもよく、cδAAであってもよいが、cβAA及び／又はcγAAが好ましく、cβAAがより好ましい。）であってもよい。
＜環状ペプチド＞
　本発明は、４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩であって、前記環状構造の４～３０のアミノ酸又はその誘導体のうち２つのアミノ酸又はその誘導体Xaa1及びXaa2であり、Xaa1及びXaaは環状構造を形成するための構造を含み、Xaa1とXaa2とは、２～２８のアミノ酸又はその誘導体から構成されるアミノ酸配列を介して連結した構造を有し、前記２～２８のアミノ酸又はその誘導体から構成されるアミノ酸配列が、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つ、並びに、任意のアミノ酸又はその誘導体で構成される、環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩である。
　本明細書において、環状ペプチド及びその医薬的に許容可能な塩をまとめて、単純に環状ペプチドともいう。
　本発明の環状ペプチドは、cAAを含むことにより、折りたたみ構造を形成することができ、環状アミノ酸に剛性を発現させる可能性がある。また、本発明のペプチドは、血清等に対する安定性が高く、生体内での分解が抑制される。そのため、本発明のペプチドは、標的タンパク質へ作用する前に分解されることが抑制されると考えられる。
　本発明の環状ペプチドは、上述した＜ライブラリーの製造方法＞によって取得することが可能である。また、ライブラリーの中から選択され、特定された環状ペプチドは、一般的な固相合成法によって製造することができる。
　本発明の環状ペプチドにおける、「アミノ酸又はその誘導体」、「Xaa1」、「Xaa2」、「β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）」の定義、例示及び態様は、上述した＜ライブラリーの製造方法＞にて説明した定義、例示及び態様と同様であり、同様の好ましい態様であることができる。
＜FXIIaへの親和性を有する環状ペプチド＞
　本発明の環状ペプチドの一態様は、式(3)により表される環状ペプチドである。
　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(3)
　式(3)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－環状アミノ酸（cβAA）であり、
　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
　n1が、１０～１６の整数であり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　mは、０～１０の整数を表す。
　ここで、Xaa1を１番目のアミノ酸とするとき、少なくとも１つのcAAは、５～９番目に存在する。
　式(3)により表される環状ペプチドは、活性化した血液凝固第XII因子（FXIIaとも記載する）に親和性を有する。本発明の一つは、式(3)により表される環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む、FXIIa結合剤である。FXIIaは、凝固及び炎症に寄与するカリクレインキニン系に関与するセリンプロテアーゼである。FXIIaに対する阻害剤は、抗血栓薬として有用である。
　式(3)中のcβAAは、式(I-1)で表されることが好ましく、(1S,2S)-2-ACHC及び／又は(1R,2R)-2-ACPCであることがより好ましい。
　式(3)中のXaaの少なくとも１つは、塩基性アミノ酸又はその誘導体であることが好ましい。ここで塩基性アミノ酸又はその誘導体は、側鎖にアミノ基を有するものであれば特に制限されず、例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン、又はこれらの誘導体を挙げることができる。式(3)中のXaaの少なくとも１つが塩基性アミノ酸又はその誘導体であることにより、FXIIaにおける本発明の環状ペプチドの結合部位への相互作用をより高めることができ、結合がより強くなる傾向にある。これは、FXIIaにおけるS1ポケット（図１０ｂ参照）に上記塩基性アミノ酸又はその誘導体が嵌るためであると考えられる。
　式(3)中の(Xaa)n1は、以下のf1～f4から選択されるいずれかであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　式f1～f4中、cAAは、β－環状アミノ酸である。
　式(3)により表される環状ペプチドは、好ましくは式(3-1)により表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　式(3-1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　cAAは、β－環状アミノ酸であり、
　n1aは、３～７の整数であり、n1bは、２～８の整数であり（ただしn1aとn1bの合計が、９～１５の整数である）、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaa1は、Phe又はTyrであり、
　mは、０～１０の整数を表す。ただし、(Xaa)n1aには、cAAを含まない。
　n1aとn1bとの差（絶対値）は、４以下であることが好ましい。
　n1aは、３～６の整数であってもよく、n1bは、４～８の整数であってもよい（ただし、この場合、n1aとn1bの合計が、９～１４の整数である。）。
　式(3-1)により表される環状ペプチドは、以下のF1～F4のいずれかであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　式F1～F4における、cAA、Xaax、mは、式(3-1)におけるcAA、Xaax、mと同義である。
＜IFNGR1への親和性を有する環状ペプチド＞
　本発明の環状ペプチドの一態様は、式(4)により表される環状ペプチドである。
　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(4)
　式(4)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaaの少なくとも１つは、β－環状アミノ酸（cβAA）であり、
　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
　n1が、９～１５の整数であり、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　mは、０～１０の整数を表す。
　ここで、Xaa1を１番目のアミノ酸としたとき、少なくとも１つのcAAが、４～８番目に存在する。
　式(4)により表される環状ペプチドは、II型インターフェロン受容体複合体（IFNGR1とも記載する）に結合親和性を有する。IFNGR1は、炎症及び自己免疫疾患において重要な役割を果たす炎症誘発性サイトカインであるインターフェロン－γ（IFN－γ）の受容体である。IFNGR1の阻害剤は、自己免疫疾患の治療に有用である。
　式(4)中のcβAAは、式(I-1)で表されることが好ましく、(1S,2S)-2-ACHC、(1R,2R)-2-ACPC、(1S,2S)-2-ACPCから選択されるいずれか１種以上であることがより好ましい。
　式(4)中の(Xaa)n1は、以下のi1-1～i1-6から選択されるいずれかであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　式i1-1～i1-6中、cAAは、β－環状アミノ酸である。
　式(4)により表される環状ペプチドは、好ましくは式(4-1)により表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　式(4-1)中、
　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　cAAは、β－環状アミノ酸であり、
　n1aは、３～７の整数であり、n1bは、５～７の整数であり（ただしn1aとn1bの合計が、８～１４の整数である）、
　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
　Xaa1は、Phe又はTyrであり、
　mは、０～１０の整数を表す。ただし、(Xaa)n1aには、cAAを含まない。
　n1aとn1bとの差（絶対値）は、４以下であることが好ましい。
　n1aは、３～５の整数であってもよく、n1bは、５～８の整数であってもよい（ただし、この場合、n1aとn1bの合計が、８～１３の整数である。）。
　式(4-1)により表される環状ペプチドは、以下のI1-1～I1-6のいずれかであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　式I1-1～I1-6における、cAA、Xaax、mは、式(4-1)におけるcAA、Xaax、mと同義である。
　本発明の環状ペプチドは、FXIIa又はIFNGR1に結合してその働きを阻害することができる。したがって、本発明の一つは、本発明の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む、FXIIa又はIFNGR1の阻害剤である。具体的には、本発明の一つは、式(3)で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩を含む、FXIIa阻害剤である。また、本発明の一つは、式(4)で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩を含む、IFNGR1阻害剤である。
　本発明の結合剤又は阻害剤は、それを含む医薬組成物として用いることができる。
　本発明の医薬組成物は、FXIIa阻害剤に関しては血栓に関連する疾患の治療又は予防に用いることができる。本発明の医薬組成物は、IFNGR1阻害剤に関しては自己免疫疾患に関連する疾患の治療又は予防に用いることができる。
　医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、及び皮下注射等の注射投与、経皮投与、並びに経粘膜投与等が挙げられる。経粘膜投与の投与経路としては、例えば、経鼻、経眼、経肺、経膣、及び経直腸等が挙げられる。
　医薬組成物中の環状ペプチドに対し、代謝及び／又は排泄等の薬物動態の観点から、各種の修飾を行ってよい。例えば、環状ペプチドにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又は糖鎖を付加して血中滞留時間を長くし、抗原性を低下させることができる。
　また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）等の生体内分解性の高分子化合物、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これらに環状ペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
　医薬組成物は、有効成分として環状ペプチドをそのまま用いてもよいし、医薬的に許容可能な添加剤等を加えて製剤化してもよい。
　医薬製剤の剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、及びパップ剤等が挙げられる。
　製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、及び抗酸化剤等の添加剤を適宜使用して、常法により行うことができる。
　製剤化に用いられる添加剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の医薬的に許容可能な有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、及びヒト血清アルブミン等が挙げられる。
　経粘膜吸収における吸収促進剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、及びサポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、及びタウロコール酸等の胆汁酸塩；ＥＤＴＡ及びサリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、及び混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、Ｎ－アシルコラーゲンペプチド、Ｎ－アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、並びに一酸化窒素供与体等を用いてもよい。
　錠剤又は丸剤は、糖衣、胃溶性、及び腸溶性物質等で被覆されたコート錠等であってもよい。
　液剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びアルコール類等を含んでもよい。液剤は、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、及び防腐剤等を加えてもよい。
　本発明は、FXIIa阻害剤又はIFNGR1阻害剤を、それ必要とする患者に投与して、患者における疾患を治療又は予防する方法も提供する。
　本発明のＨＧＦ阻害剤の投与量は、当業者が、それを必要とする患者の症状、年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、及び製剤の種類等に応じて、適宜決定することができる。
　患者は、哺乳動物であり、ヒトであることが好ましい。
　本実施例に用いたtRNAの調製方法は以下のとおり行った。
（tRNAの調製）
　フレキシザイム（dFx及びeFx）、並びに、2-ACPC、2-ACHC、ClAcD-Phe、ClAcD-Tyr及びD-CysをチャージするためのtRNAとを、T7 RNAポリメラーゼを用いたin vitroでの転写により調製した。転写のための鋳型DNAは、フォワード及びリバース伸長プライマーペアの伸長により、続くフォワード及びリバースPCRプライマーペアを用いたPCRによって調製した。プライマーの配列については表３を参照のこと。
　得られたPCR産物をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。鋳型DNAは、5'末端のT7プロモーターと、下流のtRNA又はフレキシザイム配列からなる。配列については表３を参照のこと。
　PCR産物からのRNAの転写は、500μL反応混合物（40mM Tris-HCl（pH 8.0）、22.5mM　MgCl2、1mM  DTT、1mM  スペルミジン、0.01%  Triton X-100、0.12μM  T7 RNAポリメラーゼ、0.04 U/μL  RNasin RNase阻害剤（Promega）及び3.75mM　NTP混合物）中で、37℃、16時間行った。tRNAの転写には、G又はCからの転写を開始するために、5mMのGMP又はCMPを上記溶液に添加した。得られたRNA転写物を、RQ1 DNase（Promega）を用いて37℃で30分間DNase処理した後、6M尿素を含む、8%（tRNAの場合）又は12%（フレキシザイムの場合）ポリアクリルアミドゲルで精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
（tRNAのアミノアシル化）
　以前に報告された方法（Murakami, H., Ohta, A., Ashigai, H. & Suga, H. A highly flexible tRNA acylation method for non-natural polypeptide synthesis. Nat. Methods 3, 357-359 (2006)、及びSaito, H., Kourouklis, D. & Suga, H. An in vitro evolved precursor tRNA with aminoacylation activity. EMBO J. 20, 1797-1806 (2001)参照）にしたがって、2-ACPC、2-ACHC及びD-Cysは3,5-ジニトロベンジルエステル（DBE）形態として予備活性化し、ClAcD-Phe及びClAcD-Tyrはシアノメチルエステル（CME）形態として活性化した。これらの活性化アミノ酸は、フレキシザイム（2-ACPC、2-ACHC及びD-Cys-DBEにdFx、又は、ClAcD-Phe-CME及びClAcD-TyrにeFx）を用いて、tRNA上にチャージした。フレキシザイムを用いたアミノアシル化を、50mM緩衝液（2-ACPC及び2-ACHCについてはBicine-KOH（pH 8.7）、D-Cys、ClAcD-Phe及びClAcD-TyrについてはHEPES-KOH（pH 7.5））、600mM  MgCl2、20%  DMSO、25μM  dFx又はeFx、25μM  tRNA、及び5mM活性化アミノ酸中、0℃で行った。次いで、得られたアミノアシルtRNAをエタノール沈殿にかけて活性化アミノ酸を除去し、次いでペレットを0.1M酢酸ナトリウム（pH 5.2）を含む70%エタノールで2回洗浄した。
［実施例１：ペプチドへの2-ACPCの取り込み試験］
　ペプチド鎖への一つ又は複数のcβAAの取り込みに対するリボソームの能力を検証するために、まず４種の2-ACPC異性体：(1R,2R)-2-ACPC、(1R,2S)-2-ACPC、(1S,2R)-2-ACPC、及び(1S,2S)-2-ACPCを用いた際のペプチド配列の伸長を調べた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　Murakami, H., Ohta, A., Ashigai, H. & Suga, H. A highly flexible tRNA acylation method for non-natural polypeptide synthesis. Nat. Methods 3, 357-359 (2006)及びGoto, Y., Katoh, T. & Suga, H. Flexizymes for genetic code reprogramming. Nat Protoc 6, 779-790, (2011)に記載の方法に準拠して、フレキシザイム（flexible tRNA-acylation ribozymes）により、これらのアミノ酸を、EF-P結合に特異的なD-armモチーフ及び改変T-ステムモチーフを有するtRNAPro1E2 CGGにチャージさせた。tRNAPro1E2 CGGを図１に示した。
　次に、それぞれのプレチャージされたtRNAを、再構成されたE. coli翻訳システムであるFIT（Flexible In vitro Translation）システムに加えて、ペプチドrP1-rP10を発現させた。ペプチドrP1-rP10は、表４に示した。なお、それぞれの配列におけるflagは、mR1～mR13においてはGACUACAAGGACGACGACGACAAGであり、rP1～rP13においてはAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
　ペプチドの翻訳は具体的には以下の手順にしたがって行った。
　本実施例で使用したFITシステムは、5μMのEF-P、3μMのIF2、20μMのEF-Tu、及び0.1μMのEF-G、並びに、最小限のアミノ酸及びアミノアシルtRNA合成酵素(ARS)、すなわちMet、Lys、Gly、Tyr、Asp、及びこれらに対応のARSのみを含んでいた。
　cβAAとtRNAとの親和性を向上するために、従来のFITシステム（Katoh, T. & Suga, H. Ribosomal incorporation of consecutive β-amino Acids. J. Am. Chem. Soc. 140, 12159-12167 (2018)、Katoh, T., Tajima, K. & Suga, H. Consecutive elongation of D-amino acids in translation. Cell Chem. Biol. 24, 1-9 (2017)、及びKatoh, T., Iwane, Y. & Suga, H. Logical engineering of D-arm and T-stem of tRNA that enhances D-amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 45, 12601-12610 (2017)参照）から、EF-Tuの濃度を10μMから20μMへ増加させた。同様に、EF-Gの濃度を0.26μMから0.1μMに低下させて、翻訳途中のペプチジル-tRNAがリボソームから脱落することを防止した。
　EF-Pの効果を評価するために、EF-Pの非存在下での翻訳も行った。この特定のFITシステムの詳細な組成は、以下の表５のとおりとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
　ペプチドの翻訳のための鋳型DNAは、フォワード及びリバース伸長プライマーペアを用いた伸長と、続くフォワード及びリバースPCRプライマーペアを用いたPCRによって調製した。プライマーの配列は表３を参照。得られたPCR産物をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。鋳型DNAはFITシステムに含まれるT7 RNAポリメラーゼによってmRNAに転写され、ペプチドに翻訳された。ペプチジルtRNAの脱落（drop-off）を抑え、MALDI-TOF MSでのイオン化を促進するために、ペプチドrP1-rP11及びrP13はcβAA取込み部位の前にTyr-Lys-Lys-Tyr-Lys-Lys-Tyr-Lys配列を含んでいた。翻訳反応は、2.5μLの溶液中37℃で行い、2.5μLの停止溶液（0.9M Tris-HCl (pH 8.45)、8% SDS、30%グリセロール及び0.001%キシレンシアノール）を添加して停止し、95℃で3分間加熱した。次に、サンプルを15%トリシンSDS-PAGEに供し、Typhoon FLA 7000（GE Healthcare）を用いたオートラジオグラフィーにより分析した。放射性同位元素標識ペプチドの発現レベルは、[14C]-Aspバンドの強度によって正規化した。
　翻訳ペプチドのMALDI-TOF MSは以下の手順にしたがって行った。
　放射性[14C]-Aspの代わりに0.5mMの非放射性Aspを含む上記反応混合物中で翻訳を45分間行った。次に、等量の2xHBS緩衝液（100mM  HEPES-KOH（pH 7.6）、300mM  NaCl）を添加し、5μL  ANTI-FLAG M2アフィニティーゲル（Sigma）と混合し、室温で30分間インキュベートした。ゲルビーズを25μLのHBS緩衝液（50mMのHEPES-KOH（pH 7.6）、150mM  NaCl)で1度洗浄し、15μLの0.2%トリフルオロ酢酸を加えることによってペプチドをビーズから溶出させた。次に、ペプチドをSPE C－チップ（Nikkyo Technos）で脱塩し、α－シアノ－4－ヒドロキシけい皮酸と共結晶化した。MALDI-TOF MSは、UltrafleXtreme（Bruker Daltonics）を用いて行った。ペプチドキャリブレーションスタンダードII（Bruker Daltonics）を外部質量キャリブレーションに使用した。
　４種の2-ACPC異性体を用いた際のペプチドの発現レベルを図２に示した。４種の2-ACPC異性体を用いて得られた翻訳生成物のSDS-PAGE分析の結果を図３のa～dに示した。４種の2-ACPC異性体を用いて得られた翻訳生成物のMALDI-TOF MSの結果を図４及び図５に示した。
　tRNAPro1E2は、一般にD-アミノ酸およびβ3-アミノ酸の連続した取込み効率を改善するという事実にもかかわらず、EF-Pは(1R,2S)-2-ACPCでrP2の発現のみを増強し、他の3つの立体異性体を含むペプチドの発現には負の効果を示した。
　(1S,2S)-2-ACPCの二重伸長は単一伸長と同程度に効率的であることが明らかになった。また、より長いペプチド(rP3～rP10)の発現について試験したところ、連続した伸長は10残基まで延長することができた（図２、IV参照）。
［実施例２：ペプチドへの2-ACHCの取り込み試験］
　４種の2-ACHC異性体：(1R,2R)-2-ACHC、(1R,2S)-2-ACHC、(1S,2R)-2-ACHC、および(1S,2S)-2-ACHCを用いて、rP1及びrP2（表４参照）への導入の可能性について試験をした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　４種の2-ACHC異性体を用いた際のペプチドの発現レベルを図６に示した。４種の2-ACHC異性体を用いて得られた翻訳生成物のSDS-PAGE分析の結果を図３のeに示した。４種の2-ACHC異性体を用いて得られた翻訳生成物のMALDI-TOF MSの結果を図７に示した。
　rP1への1回の取り込みでは、4種の2-ACHCが導入され、EF-Pの存在下及び非存在下によって、発現レベルに有意差は見られなかった。
　2-ACHCの2連続取り込みに関して、rP2の生成物はEF-Pの非存在下では観察されなかった。一方、(1R,2R)-2-ACHC又は(1S,2S)-2-ACHCを含むrP2の発現は、EF-Pの存在下において観測され、EF-Pはそれらの連続した取り込みを促進できることを示した。
［実施例３：設計されたフォルダマーペプチドのリボソーム合成］
　多種類のcβAAの連続的な取り込みの可能性について試験した。
　まず、AUU及びCAUコドンにそれぞれ割り当てられた2つの(1S,2S)-2-ACPC及び1つの(1S,2S)-2-ACHCを含むペプチドrP11を設計した。rP11を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　実施例１において、EF-Pの存在が(1S,2S)-2-ACPCの取り込みを阻害すること（すなわち、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNAが(1S,2S)-2-ACPCの導入に最適ではないこと）を示唆する知見が得られたことから、(1S,2S)-2-ACPCの取り込みのために、T－ステムはEF-Tuを誘導できるがD－アームはEF-Pと相互作用しないtRNAGluE2 GAUをtRNAとして選択した。一方、(1S,2S)-2-ACHCの取込みのために、EF-TuとEF-Pの両方を誘導するtRNAPro1E2 GUGを選択した。
　EF-Pの存在下でのrP11の翻訳は、MALDI-TOF MSにおいて所望の完全長rP11のピークを生じた。同様に、(1S,2S)-2-ACPCのN末端にN-クロロアセチル-D-フェニルアラニン（ClAcD-Phe）を有し、且つ、(1S,2S)-2-ACPCの下流にD-システイン（D-Cys）を有するrP12（表６参照）を発現させ、MALDI-TOF MSにおいて所望のチオエーテル環状骨格が得られたことを確認した。さらに、3アミノ酸残基ごとに4つの(1S,2S)-2-ACPCを含むrP13（表６参照）を発現させ、所望のペプチドが得られたことを確認した。rP11、rP12、及びrP13のMALDI-TOF MSの結果を図８に示した。
　(1S,2S)-2-ACPCを含むこのタイプのペプチドは10/11/11-ヘリックスを誘導することが知られている（Schmitt, M. A., Choi, S. H., Guzei, I. A. & Gellman, S. H. New helical foldamers: heterogeneous backbones with 1:2 and 2:1 α:β-amino acid residue patterns. J. Am. Chem. Soc. 128, 4538-4539 (2006)参照）。したがって、これらの結果により、ヘリックスを有する設計されたフォルダマーペプチドのリボソーム合成が可能であることが実証された。
［実施例４－１：ライブラリーの調製］
　cβAAを含む環状フォルダマーペプチドを発現させる方法に基づき、Yamagishi, Y. et al. Natural product-like macrocyclic N-methyl-peptide inhibitors against a ubiquitin ligase uncovered from a ribosome-expressed de novo library. Chem. Biol. 18, 1562-1570 (2011).及びPassioura, T., Katoh, T., Goto, Y. & Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annu. Rev. Biochem. 83, 727-752 (2014).を参照し、RaPID （Random Non-standard Peptides Integrated Discovery）システムを用いて、ヒト因子XIIa (FXIIa)およびインターフェロンγ受容体1（IFNGR1）の2つの標的を選択し、ランダム配列ライブラリーから生理活性分子を新たに発見することを検討した。
　環状ペプチドライブラリーは、以下に示されるとおり、環化ClAcD-Tyr及びD-Cysに挟まれた、3種のcβAA、(1S,2S)-2-ACHC、(1R,2R)-2-ACPC、及び(1S,2S)-2-ACPCを含む6～15個のランダム残基の反復（NNUコドンによりコードされる）を有し、ピューロマイシンリンカーを介してmRNAの3'末端に連結された設計とした。NNUコドンへのアミノ酸の割り当てを表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
　ライブラリーの調製は具体的には以下の手順にしたがって行った。
　環状ペプチドライブラリーの調製に用いたFITシステムは、以下の表８のとおりとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　ペプチドライブラリーは、150μL（1回目の選択のため）又は10μL（2回目から4回目の選択のため）又は5μL（5回目から7回目の選択のため）のFITシステム中、37℃、30分間翻訳された。
　次いで、反応混合物を室温で12分間インキュベートし、500mM  EDTA（pH 8.0）を0.04倍量添加し、37℃で30分間インキュベートして、mRNA-ペプチド複合体からのリボソームの解離を誘導した。
　逆転写は、42℃で15分間、NNUAUG-GT3.R38プライマー（5'-TTTCCGCCCCCCGTCCTAGGTCCCCGTACCCGTGCCCA-3'）及びRNase H活性を欠くM-MLV逆転写酵素（Promega）を用いて行った。
　次いで、cDNA／mRNA／ペプチド複合体を、FXIIaを固定していないDynabeadsストレプトアビジン（Thermo Fisher）、又は、IFNGR1を固定していないDynabeads プロテインG（Thermo Fisher）と混合し、ネガティブセレクションとして、4℃、15分間、3回インキュベートした。なお、ネガティブセレクションは、セレクションの最初のラウンドでは行わなかった。
　ネガティブセレクションの上清を回収し、翻訳体積の0.48倍量のFXIIa固定化Dynabeadsストレプトアビジン、又は、翻訳体積の0.24倍量のIFNGR1固定化Dynabeads プロテインGと、4℃、15分間混合し、100μLの冷やされたTBS-T緩衝液（100mM  Tris-HCl pH7.5、300mM  NaCl、0.05% Tween20）でビーズを3回洗浄した。
　組換えビオチン標識化ヒトFXIIaは、Molecular Innovationsから購入した。組換えヒトIgG1 Fc及びFc標識化ヒトIFNGR1は、それぞれR&D systems及びAcroBiosystemsから購入した。
　次に、100μLのPCR緩衝液（10mM　Tris-HCl（pH 9.0）、50mM　KCl、0.1%　Triton X-100、0.25mM　dNTP、2.5mM  MgCl2、0.25μM  T7.F52プライマー5'-GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTGAACTTTAAGTAGGAGATATATCCAT-3'、及び0.25μM NUAUG-GT3.R38プライマー)をビーズに添加し、95℃で5分間cDNAを溶出させ、PCRによって増幅した。1μLの溶出液を、SYBR Green IおよびTaq DNAポリメラーゼを含むPCR緩衝液19μLと混合し、リアルタイムPCRによってcDNAの量を定量した。
［実施例４－２：環状フォルダマーペプチドの新規発見］
　ライブラリーは、上述のとおりまずビーズ－結合種を除去するためにネガティブセレクションにかけ、次にポジティブセレクションとして磁性ビーズ上に固定化された標的タンパク質に接触させた。
　7ラウンドのアフィニティー選択を行い、各ラウンドのcDNAの回収率をqPCR法で測定したところ、FXIIa及びIFNGR1のアフィニティー選択において、第4ラウンド後に回収率の有意な増加が観察された。cDNAのディープシークエンシングにより、第4ラウンドのライブラリーには、1つ以上のcβAAを有するペプチド配列が豊富に存在することが明らかになった。ライブラリーに存在したペプチドを表９（FXIIaについて）及び表１０（IFNGR1について）に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
　表９及び表１０のうち、4つのFXIIa結合種（表９、F1-F4）と7つのIFNGR1結合種（表１０、I1-1～I1-6及びI2）を化学的（固相合成）に合成し、さらなる解析を行った。なお、C末端TGTGTリンカー配列は、化学合成する際に省略した。また、cβAA残基がアラニンで置換された陰性対照ペプチドを合成した。
　また、FXIIa及びIFNGR1に対するこれらのペプチドの結合動態を表面プラズモン共鳴によって分析した。対照ペプチドは標的への有意に低い親和性を示し、cβAA残基が標的への強固な結合に必須であることが示された。なお、結合親和性は、Biacore T200装置（GEヘルスケア）を用いて25℃でSPRにより分析した。各ペプチドの5つの異なる濃度を30μL/分の流速で注入することにより、1サイクルキネティクス法により速度定数を測定した。
得られた結合センサグラムを、Biacore評価ソフトウェアを用いて分析し、標準的な1:1相互作用モデルに適合させた。
　さらに、FXIIaの酵素活性に対するF1、F2、F3及びF4の阻害活性を分析し、それぞれKi値を測定した。これらの阻害活性は、FXIIaに対する小蛋白質阻害剤であるトウモロコシトリプシン阻害剤（CTI, Ki=24 nM, M.W.=12.5kDa）より有意に強かった。なお、FXIIaのKi値は、基質ペプチドH-D-Pro-Phe-Arg-pNA（S-2302試薬）の切断により評価した。切断反応によるpNA発色団の放出を、プレートリーダーInfinite M1000PRO （TECAN）を用いて、405nmでの吸光度によってモニターした。
　合成したペプチドの構造、表面プラズモン共鳴測定の結果、Ki値の測定結果を表１１及び表１２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
［実施例５：FXIIa及びIFNGR1結合ペプチドの血清安定性］
　FXIIaについては、F1、F2、F3、及びF4、並びに、Ala変異体F1A、F3A及びF4Aを用いて、IFNGR1については、I1-6、その変異体I1-1Aを用いて、ペプチドの血清安定性を分析した。
　上記ペプチド及び下記のペプチダーゼ耐性内部標準ペプチドを、ヒト血清中、37℃で共インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
　0、1、3、9、24、72、144及び240時間において、標準ペプチドに対する試料ペプチドの相対量を液体クロマトグラフィー／質量分析（LC/MS）によって算出した。0、1、3、9、24、72、144及び240時間に対する相対量の変化を図９に示した。
　高い血清抵抗性、及びペプチドの結合／阻害活性が観察されたことから、ClAcD-TyrとD-Cysとの間で発現するcβAAを含む環状ペプチドを含むライブラリーを、ユニークなペプチド薬剤の開発に適用できることが明らかとなった。
［実施例６：FXIIaに結合したF3の共結晶構造］
　cβAA含有ペプチドの作用機序及び折りたたみの傾向を解明するために、FXIIaに結合したF3の共結晶構造をX線結晶解析により解析した。解析結果を図１０に示した。
　回折データより、F3が逆平行βシートに折り畳まれ、その中で、8位の(1S,2S)-2-ACHC（ACHC8）がβシートの回転端であるFXIIaの活性中心付近に位置していることが明らかとなった。AcD-Tyr1とD-Cys17は、酵素の活性部位から遠く離れたβシートのもう一方の端に位置しており、これは、D-Cys17が選択中にペプチド－ピューロマイシンリンカーを介して同族mRNAに結合しているためと予想された。
　一方、Arg7、ACHC8、及びLeu9が、それぞれi、i+1、及びi+2の位置に存在し、配列の中間位置に取り込まれたACHC8は、擬似γターンを誘導することがわかった。
　この結果は、i+1位のβアミノ酸が擬γターンインデューサーであるという以前の報告（Schumann, F., Muller, A., Koksch, M., Muller, G. & Sewald, N. Are β-amino acids γ-turn mimetics? Exploring a new design principle for bioactive cyclopeptides. J. Am. Chem. Soc. 122, 12009-12010 (2000)）と一致した。さらに、ACHC8、Leu9、Ser10（それぞれi、i+1、i+2）によっても逆γターンが形成された。ACHC8と結合したこのような二つの連続したγターンは、このペプチドのユニークな特徴であり、逆平行βシートへのペプチドの折りたたみに寄与することが推測された。
　13位の別の(1S,2S)-2-ACHC（ACHC13）は、ACHC13、Arg14、Asn15、及びTyr16がiからi+3の位置を占めるβターンに関与した。ACHC13のアミド基はまた、Ala3と分子内βシート様水素結合を形成したが、その環状側鎖はAla3及びTyr16と分子内疎水性相互作用を形成した。
　以上のとおり、2つの(1S,2S)-2-ACHC残基はターン構造を誘導し、分子内相互作用を形成することによって全体的な折りたたみに寄与したことが明らかとなった。
　F3は基質様にFXIIaの活性部位に結合し、いわゆる標準的なメカニズムの阻害剤（Farady, C. J. & Craik, C. S. Mechanisms of macromolecular protease inhibitors. ChemBioChem 11, 2341-2346 (2010)及びLaskowski, M. & Kato, I. Protein inhibitors of proteinases. Annu. Rev. Biochem. 49, 593-626 (1980)参照）として作用した。
　Arg6とArg7の間のペプチド結合は、FXIIaの触媒性Ser563に近接していた。
　Arg6側鎖はFXIIaのAsp557と塩橋を形成し、酵素のS1ポケットに収容された。Arg6は、PPACK、インフェスチン-4、EcTI (E. contortisiliquum trypsin inhibitor)、CTI、FXII618、およびFXII801のような以前に報告された阻害剤と同様に、FXIIaの天然基質の中でも広く保存されているアミノ酸である。
　Arg7側鎖はまた、Ser395及びCys413と水素結合を形成し、一方ACHC8側鎖は、FXIIaのTyr515及びHis507によって形成される浅い疎水性ポケットに結合した。F3はまた、そのTyr4を介してFXIIa Gly587と分子間βシート様水素結合を形成し、その立体配座は、Asn11-ACHC13との分子内βシートの形成によって安定化された。さらに、ACHC13の周囲には、F3のAla3及びTyr16、FXIIaのTyr458及びTrp586によって寄与される広範な疎水性相互作用が存在した。
［実施例７：ペプチドへのγアミノ酸の取り込み試験］
　実施例１の方法に準じて、以下のγアミノ酸の取り込み試験を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
　鋳型mRNAとして以下のmR1を用い、ペプチドrP1に翻訳した。γアミノ酸は、tRNAPro1E2 CGGにチャージした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
　その結果、それぞれのMALDI-TOF MSから、8つの環状γアミノ酸、cis-3-ACBC、trans-3-ACBC、(1R,3R)-3-ACPC、(1R,3S)-3-ACPC、(1S,3R)-3-ACPC、(1R,3S)-3-ACPC、(1R,3R)-3-ACHC、及び(1R,3S)-3-ACHCがペプチドrP1に取り込まれたことが確認された（図１１参照）。
　また、実施例１の方法に準じて、γアミノ酸の立体異性体ごとにEF-Pの有無によるペプチドrP1に対する取り込み効率を調べた。
　実施例１及び実施例７を通じて調査された、βあるいはγアミノ酸の立体異性体ごとの取り込み効率の結果を表１３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
［実施例８：ペプチドへの芳香族アミノ酸の取り込み試験］
　以下の芳香族アミノ酸の取り込み試験を行った。置換基を有する芳香族アミノ酸として、ｐ－ヒドロキシ、ｐ－メトキシ、及びｐ－フルオロ置換におけるσ値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
（tRNAの調製）
　芳香族アミノ酸をチャージするためのtRNAの調整は、上述の（tRNAの調製）と同様にして行った。なお、プライマーの配列については表１４を参照のこと。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
（μhRNA及びtRNAのアミノアシル化）
　μhRNA、Isatoic anhydride、5-hydroxyisatoic anhydride、5-methoxyisatoic anhydride、及び5-fluoroisatoic anhydrideは、それぞれEurofin Genomics、東京化成工業、富士フィルム和光純薬、Combi-Blocks、及びBLD Pharmから購入した（実験に用いた無水物の構造は以下のとおりである。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　これらの無水物を用いたアミノアシル化は、50mMのBicine-KOH（pH 9.0）、CHES-KOH（pH 9.5若しくは10.0）、又はCAPS-KOH（pH 10.5）を含む80μMのμhRNA又はtRNAを含む25μLの反応混合物中で、25℃で1～3時間行った。無水物の濃度は、5-fluoroisatoic anhydride（8mM）を除き、10mMとした。
　MeSer、(1S、2S)-2-ACPC、及びD-Cysは3,5-ジニトロベンジルエステル（DBE）形態として予備活性化し、Apy、Atp、Atz、3NAbz、及びClaAcD-Pheはシアノメチルエステル（CME）形態として予備活性化した。これら活性化アミノ酸は、フレキシザイム（DBEにdFx、CMEにeFx）を用いてμhRNA又はtRNA上にチャージした。
　Apy、Atp、Atz、及び3NAbzのアミノアシル化を、600mM MgCl2、20% DMSO、25μM eFx、25μM μhRNA又はtRNA、及び20mM活性化アミノ酸を含む反応混合物中で4℃で24～336時間行った。混合物のpHを50mMのBicine-KOH（pH 9.0）、CHES-KOH（pH 9.5若しくは10.0）、又はCAPS-KOH（pH 10.5）で調整した。
　ClAcD-Phe、MeSer、(1S,2S)-2-ACPC、及びD-Cysのアミノアシル化を、50mM緩衝液（(1S,2S)-2-ACPCについてはBicine-KOH（pH 8.7）、ClAcD-Phe、MeSer、及びD-CysについてはHEPES-KOH（pH 7.5））、600mM MgCl2、20% DMSO、25μM dFx又はeFx、25μM  tRNA、及び5mM活性化アミノ酸中、4℃で行った。反応時間は、ClAcD-Pheでは2時間、MeSer及びD-Cysでは6時間、(1S,2S)-2-ACPCでは16時間であった。次いで、得られたアミノアシルtRNAをエタノール沈殿にかけて、ペレットを70%エタノールで2回洗浄した。
　 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA 20pmolのアミノアシル-μhRNAを、6M尿素を含む20%ポリアクリルアミドゲルで分析した。pHは、Atp-μhRNAとAtz-μhRNA（pH 3.5）の分析を除き、50mM酢酸ナトリウム(pH 5.2)で5.2に調整した。120Vで2.5時間電気泳動を行い、次いでエチジウムブロマイド染色を行い、Typhoon FLA 7000（GE Healthcare）を用いて検出した。
（ペプチドの翻訳と電気泳動）
　ペプチドの翻訳は、表５の組成の大腸菌再構成翻訳系において、0.11μM LysRS、0.68μM PheRS、及び0.5mM Pheを加えた以外は同様にして、37℃で30分間実施した。5μLの停止溶液[0.9M Tris-HCl (pH 8.45)、8% SDS、30%グリセロール、及び0.001% キシレンシアノール]を5μLの反応混合物に添加し、95℃で3分間インキュベートした。次に、サンプルを15%トリシンSDS-PAGEにかけ、Typhoon FLA 7000（GE Healthcare）を用いたオートラジオグラフィーにより分析した。ペプチドの発現レベルは[14C]-Aspバンドの強度によって正規化した。
（ペプチド及びアミノアシル-μhRNAのMALDI-TOF MS）
　MALDI-TOF MSのために、[14C]-Aspの代わりに0.5mM非放射性Aspの存在下で60分間翻訳反応を行った。環状ペプチド（rP5～rP10、図１４参照）の翻訳については、MetRS、Met、及び10-ホルミル-5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸を上記の反応混合物から省略した。rP5～rP7については、PheRS及びPheも省略し、代わりに、以下のアミノアシル-tRNA合成酵素及び対応するアミノ酸を添加した:0.04μM SerRS、0.02μM HisRS、0.16μM ProRS、0.09μM ThrRS、0.03μM ArgRS、0.38μM AsnRS、0.73μM AlaRS、0.02μM ValRS、0.5mM Ser、0.5mM His、0.5mM Pro、0.5mM Thr、0.5mM Arg、0.5mM Asn、0.5mM Ala、及び0.5mM Val。翻訳反応混合物を等量のHBS緩衝液（100mM HEPES-KOH (pH 7.6)、300mM NaCl）を2度添加し、5μL ANTI-FLAG M2アフィニティーゲル(Sigma)と混合し、室温で30分間インキュベートした。アフィニティーゲルを25μLのHBS緩衝液（50mM HEPES-KOH (pH 7.6)、150mM NaCl）で2度洗浄し、20μLの0.2%トリフルオロ酢酸を加えることによって結合したペプチドをゲルから溶出させた。次にペプチドを、SPE C-チップ（Nikkyo Technos）で脱塩し、α－シアノ－4－ヒドロキシけい皮酸と共結晶化したペプチドキャリブレーションスタンダードII（Bruker Daltonics）を外部質量キャリブレーションに使用した。MALDI-TOF MSは、UltrafleXtreme (Bruker Daltonics)を用いてリフレクタ/ポジティブモードで解析を行った。アミノアシル－μhRNAをSPE C－チップ(Nikkyo Technos)で脱塩し、3－ヒドロキシピコリン酸と共結晶化し、次いでUltrafleXtreme (Bruker Daltonics)により線形/ポジティブモードで解析を行った。
　下記表の条件で、アミノアシル-tRNAPro1E2 CGGの調製に適用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000068
　それぞれのアミノアシルtRNAPro1E2 CGG(Abz, Abz5OH, Abz5OMe, Abz5F, Apy, Atp, Atz)をmRNA（mR1）のCCGコドンに導入し、rP1ペプチドを合成した（図１２ａ）。翻訳反応は、6つのアミノ酸（Met、Tyr、Lys、Phe、Asp、及びGly）並びに対応するアミノアシルtRNA合成酵素（ARS）が含まれるが、他の14つのアミノ酸及びそれらのアミノアシルtRNA合成酵素を省いたフレキシブルin vitro翻訳（ＦＩＴ）系を用いて行った。各ペプチドの同一性はMALDI-TOF MSによって確認され、副産物を伴わない[M+H]+および[M+2H]2+イオンの所望のm/z値が得られた（図１２ｂ）。同じペプチドを[14C]標識Aspの存在下で翻訳し、トリシンSDS-PAGEにかけ、続いてオートラジオグラフィーで定量化した(図２０)。EF-Pの存在下では、EF-Pの非存在下と比較して、rP1発現レベルを１．５倍から７倍まで上昇させた（図１２ｃ）。
　次に、Abzを連続的又は多重的に取り込むことができるかどうかを調べるために、Abz-tRNAPro1E2 CGG及びEF-Pの存在下でペプチド（rP2～rP4、図１３a）を発現させるためにmRNA（mR2～mR4）を調製した。rP2ペプチドは2つの連続したAbz残基を有し、一方、rP3ペプチドとrP4ペプチドは2つのAbz残基間に1つ又は2つのPhe残基が挿入されている。[14C]Aspで標識したペプチド（rP2～rP4）のそれぞれの発現をトリシンSDS-PAGEで分析した。rP1と同程度のレベル（0.065 vs. 0.072pmol/μL）のrP4発現における離散バンドを観察し（図１３b及び図２１）、予測分子量を有するrP4ペプチドの同一性をMALDI-TOF MSスペクトルにより確認した（図１３c）。
　続いて、Abz誘導体を含む複数の外来アミノ酸を含む環状ペプチドを発現させた。再プログラムされた遺伝子コード下でペプチド（rP5～rP10）を発現するように鋳型mRNA（mR5～mR10）を設計した（図１４ａ）。N-クロロアセチル-D-チロシン(ClAcD-Tyr)又はN-クロロアセチル-D-フェニルアラニン(ClAcD-Phe)を開始剤(tRNAfMet CAUにeFx/ClAcD-Tyr-CME又はeFx/ClAcD-Phe-CMEでチャージ)として、またD-Cysを下流の位置に導入(tRNAPro1E2 GUGにdFx/D-Cys-DBEでチャージ; DBEは3,5-ジニトロベンジルエステルである)するように再プログラミングされた。ここで、D-アミノ酸上のClAc基およびスルフヒドリル基は、ペプチド全体が合成されたときにチオエーテル結合を介して自動環化される(図１４a)。これらの環化残基の間には、tRNAPro1E2 NNN(NNNは対応するアンチコドン)に結合したアミノ酸を、それぞれ、ペプチド（rP5、rP6、又はrP7）のアミノ酸配列内に導入した(図１４a)。それぞれのペプチド（rP5-rP7）をMALDI-TOF MSスペクトルにより(図１４b)、正しい環状ペプチドが発現していることを確認した。rP8ペプチドを発現させるために、N-メチル-1-α-Ser (MeSer)、(1S,2S)-2-ACPC、Abz及びAbz5OMeは、MeSer-tRNAPro1E2 GAU、(1S,2S)-2-ACPC-tRNAGluE2 CGG、及びAbz-tRNAPro1E2 GAU又はAbz5OMe-tRNAPro1E2 GGUを用いて導入された。Abz又はAbz5OMeを含むrP8ペプチドのMALDI-TOF MSスペクトルは、望ましいピークを示した(図１４b)。
　最後に、ペプチド（rP9及びrP10）の環状構造への2つのAbz誘導体の取り込みを行って、複数のAbz誘導体の取り込みが可能であることを確認した（図１４b）。
　本実施例により、１又は複数の芳香族アミノ酸をペプチド鎖のN末端ではない伸長過程において、すなわちペプチド配列の中央の主鎖結合に導入することが可能であることを確認できた。化学合成に対するリボソームペプチド合成の最も重要な利点は、本発明により、FITシステムを用いて芳香族アミノ酸含有環状ペプチドを発現させたことができることを確認できるので、生理活性芳香族アミノ酸含有環状ペプチドのRaPID (Random Non-standard Peptides Integrated Discovery)プラットフォームを開発し、生理活性「foldamer様」ペプチドを研究プログラムに送達するための第一歩となる。

Claims (27)

  1. 　２種以上の環状ペプチドを含むライブラリーの製造方法であって、
    　前記ライブラリーに含まれる環状ペプチドの少なくとも一つが、
    　　４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有し、
    　　前記環状構造内に、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つを含む、環状ペプチドであり、
    　式(1)で表される配列；
    　－(Xaa)n1－　　　　　(1)
    ［式(1)中、
    　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
    　n1は、２～２８の整数である。］
    を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーを準備する工程と；
    　前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記ペプチドを発現させ、ライブラリーを製造する工程と；
    を含む、
    ライブラリーの製造方法。
  2. 　２種以上の環状ペプチドを含むライブラリーの製造方法であって、
    　前記ライブラリーに含まれる環状ペプチドの少なくとも一つが、
    　　４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有し、
    　　前記環状構造内に、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つを含む、環状ペプチドであり、
    　式(1)で表される配列；
    　－(Xaa)n1－　　　　　(1)
    ［式(1)中、
    　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
    　n1は、２～２８の整数である。］
    を含むペプチドをコードするmRNAライブラリーを準備する工程と；
    　前記mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
    　前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記ペプチドを発現させ、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
    を含む、
    ライブラリーの製造方法。
  3. 　無細胞翻訳系が、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種をチャージしたtRNAを含み、前記tRNAが、EF-Pと相互作用するDアーム構造を有するtRNA又はEF-Pと相互作用するDアーム構造を有しないtRNAである、
    請求項１又は２に記載のライブラリーの製造方法。
  4. 　無細胞翻訳系が、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種をチャージしたtRNAを含み、前記tRNAが、tRNAPro1E2及びtRNAGluE2から選択される少なくとも一つである、
    請求項１～３のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
  5. 　式(1)で表される配列を含むペプチドが、式(2)；
    　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(2)
    ［式(2)中、
    　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　Xaaの少なくとも１つは、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される１種であり、
    　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
    　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　n1は、２～２８の整数であり、
    　mは、０～１０の整数を表す。］
    で表される、
    請求項１～４のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
  6. 　β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸が、それぞれ、
    式（I-1）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（I-1）中、p1は、１～４のいずれかの整数である。）
    式（I-2）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（I-2）中、p2は、１～４のいずれかの整数である。）
    式（I-3）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（I-3）中、p3は、１又は２の整数である。）
    式（I-4）；
    　　H2N-Ar-COOH                                    （I-4）
    （式（I-4）中、Arは、２価の芳香族基であり、芳香族基における芳香環は１又は複数の置換基により置換されていてもよい。）
    により表される、
    請求項１～５のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
  7. 　cAAが、式(1)で表される配列中に２個以上ランダムに含まれる、
    請求項１～６のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
  8. 　cAAが、式(1)で表される配列中に２個以上連続して含まれる、
    請求項１～６のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
  9. 　cAAが、
    　式(1)で表される配列中に３個以上１５個以下連続して含まれ、
    　(1S,2S)-2-ACPC：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     で表されるβ－環状アミノ酸である、
    請求項１～６のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
  10. 　cAAが、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     から選択される少なくとも１種のβ－又はγ－環状アミノ酸（i）、及び／又は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     から選択される少なくとも１種のβ－又はγ－環状アミノ酸（ii）であり、
    　無細胞翻訳系が、
    　β－又はγ－環状アミノ酸（i）をチャージした、EF-Pと相互作用するD-アーム構造を有するtRNA、及び／又は、
    　β－又はγ－環状アミノ酸（ii）をチャージした、EF-Pと相互作用するD-アーム構造を有しないtRNA
    を含む、
    請求項１～８のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
  11. 　β－又はγ－環状アミノ酸（i）をチャージした、EF-Pと相互作用するD-アーム構造を有するtRNAが、tRNAPro1E2であり、
    　β－又はγ－環状アミノ酸（ii）をチャージした、EF-Pと相互作用するD-アーム構造を有しないtRNAが、tRNAGluE2である、
    請求項１０に記載のライブラリーの製造方法。
  12. 　４～３０のアミノ酸又はその誘導体から構成される環状構造を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩であって、
    　前記環状構造の４～３０のアミノ酸又はその誘導体のうち２つのアミノ酸又はその誘導体Xaa1及びXaa2は、環状構造を形成するための構造を含み、
    　前記Xaa1と前記Xaa2とは、２～２８のアミノ酸又はその誘導体から構成されるアミノ酸配列を介して連結した構造を有し、
    　前記２～２８のアミノ酸又はその誘導体から構成されるアミノ酸配列が、β－、γ－、及びδ－環状アミノ酸（cAA）から選択される少なくとも１つ、並びに、任意のアミノ酸又はその誘導体で構成される、
    　環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  13. 　前記環状ペプチドが、式(3)；
    　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(3)
    ［式(3)中、
    　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　Xaaの少なくとも１つは、β－環状アミノ酸（cβAA）であり、
    　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
    　n1が、１０～１６の整数であり、
    　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　mは、０～１０の整数を表す。］
    により表され、
    　Xaa1を１番目のアミノ酸とするとき、少なくとも１つのcAAは、５～９番目に存在する、
    請求項１２に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  14. 　Xaaの少なくとも１つが、塩基性アミノ酸又はその誘導体である、
    請求項１３に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  15. 　式(3)中の(Xaa)n1が、以下のf1～f4から選択されるいずれかである、
    請求項１３又は１４に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、cAAは、β－環状アミノ酸である。］
  16. 　前記環状ペプチドが、式(3-1)；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式(3-1)中、
    　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　cAAは、β－環状アミノ酸であり、
    　n1aは、３～７の整数であり、n1bは、２～８の整数であり（ただしn1aとn1bの合計が、９～１５の整数である）、
    　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　Xaa1は、Phe又はTyrであり、
    　mは、０～１０の整数を表す。ただし、(Xaa)n1aには、cAAを含まない。］
    により表される、
    請求項１３に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  17. 　Xaaのうち少なくとも１つが、塩基性アミノ酸又はその誘導体である、
    請求項１６に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  18. 　n1aとn1bとの差（絶対値）が、４以下である、
    請求項１６又は１７に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  19. 　前記環状ペプチドが、以下のF1～F4のいずれかである、
    　請求項１３～１８のいずれか一項に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     ［式中、
    　cAAは、それぞれ独立してβ－環状アミノ酸であり、
    　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　mは、０～１０の整数を表す。］
  20. 　β－環状アミノ酸が、
    式（I-1）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     （式（I-1）中、p1は、１～４のいずれかの整数である。）
    で表される、
    請求項１３～１９のいずれか一項に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  21. 　前記環状ペプチドが、式(4)；
    　Xaa1－(Xaa)n1－Xaa2－(Xaax)m　　　　　(4)
    ［式(4)中、
    　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　Xaaの少なくとも１つは、β－環状アミノ酸（cAA）であり、
    　Xaa1及びXaa2は、環状ペプチドの環を形成するアミノ酸又はその誘導体であり、
    　n1が、９～１５の整数であり、
    　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　mは、０～１０の整数を表す。］
    により表され、
    　Xaa1を１番目のアミノ酸としたとき、少なくとも１つのcAAが、５～８番目に存在する、
    請求項１２に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  22. 　式(4)中の(Xaa)n1が、以下のi1-1～i1-6から選択されるいずれかである、
    請求項２１に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［式中、cAAは、β－環状アミノ酸である。］
  23. 　前記環状ペプチドが、式(4-1)；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     ［式(4-1)中、
    　Xaaは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　cAAは、β－環状アミノ酸であり、
    　n1aは、３～６の整数であり、n1bは、５～８の整数であり（ただしn1aとn1bの合計が、８～１４の整数である）、
    　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　Xaa1は、Phe又はTyrであり、
    　mは、０～１０の整数を表す。ただし、(Xaa)n1aには、cAAを含まない。］
    により表される、
    請求項２１に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  24. 　前記環状ペプチドが、以下のI1-1～I1-6のいずれかである、
    請求項２１～２３のいずれか一項に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     ［式中、
    　cAAは、それぞれ独立してβ－環状アミノ酸であり、
    　Xaaxは、任意のアミノ酸又はその誘導体であり、
    　mは、０～１０の整数を表す。］
  25. 　β－環状アミノ酸が、
    式（I-1）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     （式（I-1）中、p1は、１～４のいずれかの整数である。）
    で表される、
    請求項２１～２４のいずれか一項に記載の環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩。
  26. 　請求項１３～２０のいずれか一項に記載の環状ペプチド、又はその医薬的に許容可能な塩を含む、活性化した血液凝固第XII因子（FXIIa）結合剤。
  27. 　請求項２１～２５のいずれか一項に記載の環状ペプチド、又はその医薬的に許容可能な塩を含む、II型インターフェロン受容体複合体（IFNGR1）結合剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024172058A1 (ja) * 2023-02-16 2024-08-22 国立大学法人東京大学 ＥＦ－Ｐ応答性人工開始ｔＲＮＡを用いた外来アミノ酸による翻訳開始

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011523634A (ja) * 2008-05-15 2011-08-18 ファイブレックス メディカル リサーチ アンド デベロップメント ゲーエムベーハー ペプチド、ペプチド模倣物およびそれらの誘導体、それらの製造、ならびに治療および／または予防活性のある医薬組成物を調製するためのそれらの使用
WO2015030014A1 (ja) 2013-08-26 2015-03-05 国立大学法人東京大学 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法
WO2018085921A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Encycle Therapeutics, Inc. CYCLIC PEPTIDES MULTIMERS TARGETING α4β7 INTEGRIN
WO2018128828A1 (en) * 2016-12-23 2018-07-12 Bayer Healthcare Llc Novel hepcidin mimetics and uses thereof
WO2018143145A1 (ja) * 2017-01-31 2018-08-09 中外製薬株式会社 無細胞翻訳系におけるペプチドの合成方法
JP2019503340A (ja) * 2015-11-11 2019-02-07 エンサイクル セラピューティクス インコーポレイテッド α４β７インテグリンを標的とする環状ペプチド
WO2019077887A1 (ja) 2017-10-16 2019-04-25 国立大学法人東京大学 Ｄ－アミノ酸及びβ－アミノ酸の取り込みを増強するｔＲＮＡのＤ及びＴアームの改変

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018521960A (ja) * 2015-04-28 2018-08-09 エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ（ウペエフエル）Ｅｃｏｌｅ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｆｅｄｅｒａｌｅ ｄｅ Ｌａｕｓａｎｎｅ （ＥＰＦＬ） 酵素で活性化された第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）の新規阻害剤

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011523634A (ja) * 2008-05-15 2011-08-18 ファイブレックス メディカル リサーチ アンド デベロップメント ゲーエムベーハー ペプチド、ペプチド模倣物およびそれらの誘導体、それらの製造、ならびに治療および／または予防活性のある医薬組成物を調製するためのそれらの使用
WO2015030014A1 (ja) 2013-08-26 2015-03-05 国立大学法人東京大学 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法
JP2019503340A (ja) * 2015-11-11 2019-02-07 エンサイクル セラピューティクス インコーポレイテッド α４β７インテグリンを標的とする環状ペプチド
WO2018085921A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Encycle Therapeutics, Inc. CYCLIC PEPTIDES MULTIMERS TARGETING α4β7 INTEGRIN
WO2018128828A1 (en) * 2016-12-23 2018-07-12 Bayer Healthcare Llc Novel hepcidin mimetics and uses thereof
WO2018143145A1 (ja) * 2017-01-31 2018-08-09 中外製薬株式会社 無細胞翻訳系におけるペプチドの合成方法
WO2019077887A1 (ja) 2017-10-16 2019-04-25 国立大学法人東京大学 Ｄ－アミノ酸及びβ－アミノ酸の取り込みを増強するｔＲＮＡのＤ及びＴアームの改変

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 18, 2011, pages 1562 - 1570
CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 21, 2014, pages 766 - 774
FARADY, C. J.CRAIK, C. S.: "Mechanisms of macromolecular protease inhibitors", CHEM BIOCHEM, vol. 11, 2010, pages 2341 - 2346, XP009141927
FONTANILLO MIRIAM, ZEMSKOV IVAN, HÄFNER MAXIMILIAN, UHRIG ULRIKE, SALVI FRANCESCA, SIMON BERND, WITTMANN VALENTIN, KÖHN MAJA: "Synthesis of Highly Selective Submicromolar Microcystin-Based Inhibitors of Protein Phosphatase (PP)2A over PP1", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, VERLAG CHEMIE, DE, vol. 55, no. 45, 2 November 2016 (2016-11-02), DE, pages 13985 - 13989, XP055834782, ISSN: 1433-7851, DOI: 10.1002/anie.201606449 *
GOTO, Y.KATOH, TSUGA, H.: "Flexizymes for genetic code reprogramming", NAT PROTOC, vol. 6, 2011, pages 779 - 790, XP009158277, DOI: 10.1038/nprot.2011.331
H. F. KUNG ET AL., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 252, no. 19, 1977, pages 6889 - 6894
H. OHASHI ET AL., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 352, no. 1, 2007, pages 270 - 276
KATOH, T.IWANE, Y.SUGA, H: "Logical engineering of D-arm and T-stem of tRNA that enhances D-amino acid incorporation", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 45, 2017, pages 12601 - 12610, XP055598170, DOI: 10.1093/nar/gkx1129
KATOH, T.SUGA, H.: "Ribosomal incorporation of consecutive β-amino Acids", J. AM. CHEM. SOC., vol. 140, 2018, pages 12159 - 12167, XP055825755, DOI: 10.1021/jacs.8b07247
KATOH, T.TAJIMA, K.SUGA, H: "Consecutive elongation of D-amino acids in translation", CELL CHEM. BIOL., vol. 24, 2017, pages 1 - 9
KIM, J. ET AL.: "Microtubes with rectangular cross-section by self-assembly of a short β-peptide foldamer", J. AM. CHEM. SOC., vol. 134, 2012, pages 20573 - 20576
KWON, S.JEON, A.YOO, S. H.CHUNG, I. S.LEE, H. S.: "Unprecedented molecular architectures by the controlled self-assembly of a β-peptide foldamer", ANGEW. CHEM. INT. ED. ENGL., vol. 49, 2010, pages 8232 - 8236
LASKOWSKI, M.KATO, I: "Protein inhibitors of proteinases", ANNU. REV. BIOCHEM., vol. 49, 1980, pages 593 - 626, XP009025687, DOI: 10.1146/annurev.bi.49.070180.003113
M. C. GONZA ET AL., PROCEEDING OF NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 82, pages 1648 - 1652
M. Y. PAVLOVM. EHRENBERG, ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, vol. 328, no. 1, 1996, pages 9 - 16
MURAKAMI, H.OHTA, A.ASHIGAI, H.SUGA, H: "A highly flexible tRNA acylation method for non-natural polypeptide synthesis", NAT. METHODS, vol. 3, 2006, pages 357 - 359, XP003013897, DOI: 10.1038/nmeth877
PASSIOURA, T.KATOH, T.GOTO, Y.SUGA, H: "Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides", ANNU. REV. BIOCHEM., vol. 83, 2014, pages 727 - 752, XP055561850, DOI: 10.1146/annurev-biochem-060713-035456
SAITO, H.KOUROUKLIS, D.SUGA, H: "An in vitro evolved precursor tRNA with aminoacylation activity", EMBO J., vol. 20, 2001, pages 1797 - 1806, XP002430320, DOI: 10.1093/emboj/20.7.1797
SCHMITT, M. A.CHOI, S. H.GUZEI, I. A.GELLMAN, S. H.: "New helical foldamers: heterogeneous backbones with 1:2 and 2:1 α:β-amino acid residue patterns", J. AM. CHEM. SOC., vol. 128, 2006, pages 4538 - 4539
SCHUMANN, F.MULLER, A.KOKSCH, M.MULLER, G.SEWALD, N.: "Are β-amino acids γ-turn mimetics? Exploring a new design principle for bioactive cyclopeptides", J. AM. CHEM. SOC., vol. 122, 2000, pages 12009 - 12010
See also references of EP4101929A4
Y. SHIMIZU ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 19, no. 8, 2001, pages 751 - 755
YAMAGISHI, Y. ET AL.: "Natural product-like macrocyclic N-methyl-peptide inhibitors against a ubiquitin ligase uncovered from a ribosome-expressed de novo library", CHEM. BIOL., vol. 18, 2011, pages 1562 - 1570, XP028348893, DOI: 10.1016/j.chembiol.2011.09.013

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024172058A1 (ja) * 2023-02-16 2024-08-22 国立大学法人東京大学 ＥＦ－Ｐ応答性人工開始ｔＲＮＡを用いた外来アミノ酸による翻訳開始

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