WO2021132201A1 - 脱髄疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

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WO2021132201A1
WO2021132201A1 PCT/JP2020/047800 JP2020047800W WO2021132201A1 WO 2021132201 A1 WO2021132201 A1 WO 2021132201A1 JP 2020047800 W JP2020047800 W JP 2020047800W WO 2021132201 A1 WO2021132201 A1 WO 2021132201A1
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WO
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amino acid
acid sequence
oligopeptide
prophylactic
seq
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PCT/JP2020/047800
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French (fr)
Inventor
宗尚 島村
啓徳 中神
森下　竜一
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国立大学法人大阪大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for demyelinating diseases.
  • Multiple sclerosis is one of the demyelinating diseases of the central nervous system, and is a disease showing a wide range of symptoms such as sensory disorders, movement disorders, eye disorders, and cognitive dysfunction.
  • the majority of multiple sclerosis is the relapsing-remitting type (RRMS), which repeats relapsing-remitting remission.
  • RRMS relapsing-remitting type
  • SPMS secondary progressive sclerosis
  • glatiramer acetate which is also on the market, is a polypeptide preparation and therefore has excellent safety, and is used as a first-line therapeutic agent (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 glatiramer acetate requires subcutaneous injection every day, which imposes a heavy burden on the patient, and the recurrence rate is 32% lower than that of placebo, which is insufficiently effective.
  • An object of the present invention is to provide a prophylactic or therapeutic agent for demyelinating disease, which contains an oligopeptide as an active ingredient.
  • the present inventor has obtained an oligopeptide consisting of a RANKL protein DE loop sequence and an amino acid sequence containing the RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence.
  • the present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.
  • the DE loop sequence is as follows (a) or (b): It is an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted, added or inserted into (a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or (b) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the ⁇ -strand D sequence is as follows (c) or (d): 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence shown in any of (c) SEQ ID NOs: 2 to 5 or (d) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • a prophylactic or therapeutic agent for demyelinating diseases which comprises an oligopeptide having an inserted amino acid sequence.
  • Item 2. The prophylactic or therapeutic agent according to Item 1, wherein the DE loop sequence is the amino acid sequence of (a).
  • Item 3. The prophylactic or therapeutic agent according to Item 2, wherein the 1 to 3 amino acids are 1 or 2 amino acids.
  • Item 5 The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 4, wherein the amino acid sequence of the oligopeptide contains the RANKL protein ⁇ -strand E sequence arranged adjacent to the C-terminal side of the DE loop sequence.
  • the ⁇ -strand E sequence is as follows (e) or (f): 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence shown in any of (e) SEQ ID NOs: 6 to 9 or (f) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 9. Or the prophylactic or therapeutic agent according to Item 5, which is an inserted amino acid sequence.
  • Item 7. The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 6, wherein the amino acid sequence of the oligopeptide does not include the RANKL protein CD loop sequence.
  • the amino acid sequence of the oligopeptide is as follows (i) or (j): 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence shown in any of (i) SEQ ID NOs: 12 to 22 or (j) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 12 to 22.
  • the prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 7, which is an inserted amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the oligopeptide is as follows (i') or (j'): 1-3 for the amino acid sequence set forth in (i') SEQ ID NO: 12, 17, 20, 21, or 22 or the amino acid sequence set forth in (j') SEQ ID NO: 12, 17, 20, 21, or 22.
  • Item 4 The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 7, wherein the amino acid sequence is an amino acid sequence in which the amino acids are substituted, deleted, added or inserted.
  • Item 10 The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 9, wherein the oligopeptide is an oligopeptide in which the C-terminal is amidated and the N-terminal is acetylated.
  • Item 11 The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 10, wherein the oligopeptide has a length of 50 amino acids or less.
  • Item 12. The prophylactic or therapeutic agent according to Item 11, wherein the oligopeptide has a length of 40 amino acids or less.
  • Item 13 The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 12, which is used to be administered once every 2 to 6 days.
  • Item 14 The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 13, wherein the demyelinating disease is a central nervous system demyelinating disease.
  • the burden on the patient can be reduced by being able to exert a preventive or therapeutic effect with a smaller number of administrations than the conventional drug, and / or a higher preventive or therapeutic effect can be exerted. It is possible to provide the drug.
  • the changes in neurological symptoms in Example 1 are shown.
  • the vertical axis shows the nerve score ((0) normal, (1) complete tail ptosis, (2) complete tail ptosis and weakness of hind limbs, (3) complete paralysis of hind limbs, (4) complete paralysis of hind limbs and fore limbs.
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed when the administration start date of RANKL peptide (MHP1-7) is Day 2 (Day 0 is MOG 35-55 / CFA subcutaneous injection).
  • Saline shows the case (control) when physiological saline is administered instead of the RANKL peptide.
  • the calculation result of the survival rate in Example 1 is shown.
  • the vertical axis shows the survival rate.
  • the P value indicates the P value by the Log-rank (Mantel-Cox) test test. Others are the same as in FIG.
  • the neurological symptoms on Day 12 of Example 2 are shown.
  • the vertical axis shows the nerve score, and the horizontal axis shows the administered drug and dose ( ⁇ g / day).
  • the rate of demyelination on Day 28 of Example 2 is shown.
  • the vertical axis shows the ratio of the demyelinated area to the whole, and the horizontal axis shows the dose ( ⁇ g / day) of the administered drug (MHP1-7).
  • the mRNA expression level measurement result of the immunostimulatory factor (CD4, Clce4, TLR8, IL1b) in Example 3 is shown.
  • the vertical axis shows the relative value of the mRNA expression level of the factors shown in the upper part of each graph.
  • M MHP1-7 administration group
  • S saline administration group
  • N normal group.
  • M MHP1-7 administration group
  • S saline administration group
  • N normal group.
  • M MHP1-7 administration group
  • S saline administration group
  • N normal group.
  • M MHP1-7 administration group
  • S saline administration group
  • N normal group.
  • M MHP1-7 administration group
  • S saline administration group
  • N normal group.
  • M: n 5
  • N normal group.
  • the changes in neurological symptoms in Example 4 are shown.
  • the vertical axis, the horizontal axis, and the like are the same as those in FIG.
  • the neurological symptoms on Day 12 of Example 5 are shown.
  • the vertical axis shows the nerve score
  • the horizontal axis shows the type of drug administered (GA is glatiramer hydrochloride).
  • the vertical axis shows the nerve score
  • the horizontal axis shows the type of drug administered.
  • the changes in neurological symptoms in Example 7 are shown.
  • the vertical axis shows the nerve score
  • the horizontal axis shows the number of days elapsed when the day of subcutaneous injection of the antigen PLP 139-151 is set to Day 0. * Indicates that the P value for the control by the Two Way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test is less than 0.05.
  • the result of Example 8 is shown.
  • the left side shows the measurement result of IL-17, and the right side shows the measurement result of IFN ⁇ .
  • MOG0 indicates a control without MOG administration
  • MOG10 indicates an example in which MOG was administered
  • MHP1 indicates an example in which MHP1-7 was administered as a RANKL peptide
  • Saline indicates a saline solution instead of the RANKL peptide.
  • Example 9 Indicates that the P value for the saline-administered group by the One-way ANOVA with Dunnett's test is less than 0.05.
  • the result of Example 9 is shown.
  • the vertical axis indicates the neurite length.
  • the horizontal axis indicates the type of drug added (LY: PI3-K inhibitor LY294002, MEKI: MEK inhibitor, PKA: PKA inhibitor, PKCI: PKC inhibitor) and the amount added (final concentration in the medium).
  • the vertical axis shows the measured concentration of TNF ⁇
  • the vertical axis shows the measured concentration of IL-6.
  • Normal indicates the case of no drug treatment
  • LPS indicates the case of LPS treatment
  • MHP24 indicates the case of treatment with LPS and MHP24h-AcN.
  • the vertical axis shows the measured concentration of TNF ⁇
  • the vertical axis shows the measured concentration of IL-6
  • Normal indicates the case of no drug treatment
  • LPS indicates the case of LPS treatment
  • MHP24 indicates the case of treatment with LPS and MHP24h-AcN.
  • the vertical axis shows the measured concentration of IL-6.
  • the horizontal axis shows the presence or absence (+/-) of the treated drug.
  • ** indicates that the P value for the LPS group by the One-way ANOVA with Tukey test is less than 0.01.
  • # Indicates that the P value for the normal group by the One-way ANOVA with Tukey test is less than 0.05.
  • the changes in neurological symptoms in Example 12 are shown.
  • the vertical axis shows the nerve score, and the horizontal axis shows the number of days elapsed when the day when MOG 35-55 / CFA was subcutaneously injected was set to Day 0. Arrows indicate the date of administration of MHP1-7.
  • Identity of amino acid sequences refers to the degree of agreement between two or more contrastable amino acid sequences with respect to each other. Therefore, the higher the match between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters.
  • FASTA a sequence analysis tool
  • the algorithm BLAST by Karlin and Altschul Karlin and Altschul (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes” Proc Natl Acad Sci USA. 87: 2264-2268) It can be determined using “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.” Proc Natl Acad Sci USA.
  • BLASTX based on such a BLAST algorithm has been developed. Specific methods for these analysis methods are known, and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) can be referred to. In addition, the "identity" of the base sequence is also defined according to the above.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. For example, substitution between amino acid residues having a basic side chain such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution.
  • amino acid residues with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues with non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine and tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan and histidine Substitution between amino acid residues is also a conservative substitution.
  • Oligopeptide An oligopeptide consisting of a RANKL protein DE loop sequence and an amino acid sequence containing a RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence (in the present specification, "the present invention”. It may be referred to as "oligopeptide of").
  • Non-Patent Documents 2 and 3 Specific examples of the ⁇ -strand D sequence of the RANKL protein include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (a part of the ⁇ -strand D sequence of the mouse-derived RANKL protein) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (mouse-derived RANKL).
  • Protein ⁇ -strand D sequence Protein ⁇ -strand D sequence), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (part of ⁇ -strand D sequence of human-derived RANKL protein), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 ( ⁇ -strand D sequence of human-derived RANKL protein) And so on.
  • the ⁇ -strand D sequence may be mutated as long as the oligopeptide of the present invention can exert a preventive or therapeutic effect on demyelinating disease.
  • the N-terminal leucine residues of SEQ ID NOs: 2 and 4 and the leucine residue, which is the fourth amino acid from the N-terminal of SEQ ID NOs: 3 and 5, have preventive and therapeutic effects on demyelinating diseases. It is important for the demonstration of. In the ⁇ -strand D sequence, it is desirable that this leucine residue is not mutated.
  • the number of amino acids mutated is preferably 1 or 2, and more preferably 1.
  • amino acid sequence of (d) preferably the amino acid sequence of (d') below is mentioned: (d') N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5 (preferably). Is an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are added to the C-terminal).
  • the amino acid sequence of the oligopeptide of the present invention may include a sequence other than the above-mentioned sequence as long as the oligopeptide of the present invention can exert a preventive or therapeutic effect on demyelinating disease.
  • Other sequences are not particularly limited, but it is desirable to determine them from the viewpoint of having a longer intracellular half-life. Whether or not it is hydrophilic and the intracellular half-life can be predicted on various websites (for example, Expasy (http://web.expasy.org/protparam/)). When using expancy, it is preferable to design the sequence so that "Grand average of hydropathicity" shows a negative value for hydrophilicity.
  • ⁇ -strand E sequence of RANKL protein is particularly preferable from the viewpoint of prevention or therapeutic effect of demyelinating disease.
  • the ⁇ -strand E sequence is preferably located adjacent to the C-terminal side of the DE loop sequence.
  • adjacent to the C-terminal side indicates that the amino acid at the C-terminal of the DE loop sequence and the amino acid at the N-terminal of the ⁇ -strand E sequence are linked by a peptide bond.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 Specific examples of the ⁇ -strand E sequence of the RANKL protein include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 ( ⁇ -strand E sequence of mouse-derived RANKL protein) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 ( ⁇ of mouse-derived RANKL protein). (Part of strand E sequence), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 ( ⁇ -strand E sequence of human-derived RANKL protein), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (part of ⁇ -strand E sequence of human-derived RANKL protein) And so on.
  • the ⁇ -strand E sequence may be mutated as long as the oligopeptide of the present invention can exert a preventive or therapeutic effect on demyelinating disease.
  • the ⁇ -strand E sequence of the RANKL protein preferably includes the following amino acid sequence (e) or (f): 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence shown in any of (e) SEQ ID NOs: 6 to 9 or (f) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 9. Or the inserted amino acid sequence.
  • the number of amino acids mutated is preferably 1 or 2, and more preferably 1.
  • the amino acid sequence of the oligopeptide of the present invention preferably does not include the CD loop sequence of the RANKL protein.
  • the CD loop sequence of the RANKL protein is an amino acid sequence that forms a CD loop in the amino acid sequence of the RANKL protein.
  • the CD loop sequence of each species is known, and for example, in the case of mice and rats, it is described in Non-Patent Documents 2 and 3.
  • Specific examples of the CD loop sequence of the RANKL protein include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (CD loop sequence of mouse-derived RANKL protein) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (CD loop sequence of human-derived RANKL protein). ) And so on.
  • the length of the oligopeptide of the present invention is not particularly limited as long as it is a general length as an oligopeptide.
  • the length is, for example, 50 amino acid residue length or less, preferably 40 amino acid residue length or less, more preferably 35 amino acid residue or less, more preferably 30 amino acid residue or less, still more preferably 25 amino acid residue length or less. is there.
  • the length is, for example, 11 amino acid residue length or more, preferably 13 amino acid residue length or more, more preferably 15 amino acid residue length or more, still more preferably 20 amino acid residue length or more, still more preferably 25 amino acid. It is greater than or equal to the residue length.
  • the range of the length is, for example, 11 to 50 amino acid residue lengths, preferably 15 to 40 amino acid residue lengths, more preferably 20 to 35 amino acid residues, and even more preferably 25 to 30 amino acid residue lengths.
  • a more preferable amino acid sequence of the oligopeptide of the present invention includes an oligopeptide consisting of the following (i') or (j') amino acid sequence: 1-3 for the amino acid sequence set forth in (i') SEQ ID NO: 12, 17, 20, 21, or 22 or the amino acid sequence set forth in (j') SEQ ID NO: 12, 17, 20, 21, or 22. Amino acid sequence in which individual amino acids have been substituted, deleted, added or inserted.
  • the number of amino acids mutated is preferably 1 or 2, and more preferably 1.
  • the substitutions in the amino acid sequences (j) and (j') are conservative substitutions.
  • the oligopeptide of the present invention may be chemically modified as long as it can exert a preventive or therapeutic effect on demyelinating disease.
  • Oligopeptides of the present invention C-terminal, carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO -), may be any of an amide (-CONH 2) or an ester (-COOR).
  • amidation at the C-terminal and protection with an acetyl group at the N-terminal are preferable.
  • an oligopeptide having an acetylated N-terminal has excellent activity and is mentioned as a preferable oligopeptide.
  • oligopeptides having an amidated C-terminal are excellent, and more preferable oligopeptides include oligopeptides having an amidated C-terminal and an acetylated N-terminal.
  • Particularly preferable oligopeptides are MHP1-7 in which the C-terminal of MHP1 is amidated and the N-terminal is acetylated, MHP6-AcN in which the C-terminal of MHP6 is amidated and the N-terminal is acetylated, and the C-terminal of MHP24.
  • MHP24-AcN in which the N-terminal is acetylated
  • MHP24h-AcN in which the C-terminal of MHP24h is amidated and the N-terminal is acetylated.
  • oligopeptide of the present invention may be supplemented with a known modification used for the purpose of improving drug stability, pharmacokinetics, bioavailability and the like.
  • a modified product include polyethylene glycol chains and the like.
  • the oligopeptide of the present invention includes various forms such as linear, branched, and cyclic, but it is preferably linear.
  • the oligopeptide of the present invention may be crosslinked according to or according to known means as long as it can exert a preventive or therapeutic effect on demyelinating disease.
  • the oligopeptide of the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method according to its amino acid sequence.
  • the oligopeptide of the present invention has a preventive or therapeutic effect on demyelinating disease, it can be used as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for demyelinating disease. Moreover, although not limited interpretation is desired, the oligopeptide of the present invention has an inhibitory effect on the expression of immunostimulatory factors (for example, CD4, Clce4, TLR8, IL1b, etc.), demyelination inhibitory effect, and T cell priming inhibitory effect. , It is possible to exert one or more kinds of various actions such as neurite outgrowth promoting action, and it is considered that the preventive or therapeutic effect of demyelinating disease is exerted based on these actions. The oligopeptide of the present invention can also be used as an active ingredient of an immunostimulatory factor expression inhibitor, a demyelination inhibitor, a T cell priming inhibitor, a neurite outgrowth promoter and the like.
  • immunostimulatory factors for example, CD4, Clce4, TLR8, IL
  • the above-mentioned agents may be collectively referred to as "the agent of the present invention".
  • the agent of the present invention can be an agent used in various fields such as pharmaceuticals.
  • the agent of the present invention can be applied to animals and humans (for example, administration, ingestion, inoculation, etc.) as it is or in various compositions with conventional ingredients.
  • the oligopeptide of the present invention may be used alone or in combination of two or more.
  • Dosage forms for parenteral administration include injectable preparations (eg, drip injections, intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections), external preparations (eg ointments, paps, lotions). Agents, creams, gels), suppositories, inhalants, eye agents, eye ointments, nasal drops, ear drops, liposomes and the like.
  • an injectable preparation is prepared by dissolving the oligopeptide of the present invention in distilled water for injection, and if necessary, a lysis aid, a buffer, a pH adjuster, an isotonic agent, a soothing agent, and a preservative. , And stabilizers and the like can be added.
  • the agent of the present invention can also be a lyophilized preparation for preparation of errands.
  • the carrier used for the formulation of the agent of the present invention includes excipients, binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring agents, and if necessary, stabilizers and emulsifiers, which are usually used in the art. Uses absorption enhancers, surfactants, pH adjusters, preservatives, antioxidants, bulking agents, wetting agents, surface activators, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, soothing agents, etc. be able to.
  • the dose of the agent of the present invention is, for example, a pharmacological finding such as a route of administration, a type of disease, a degree of symptoms, a patient's age, sex, weight, severity of disease, pharmacokinetics and toxicological characteristics. It can be determined based on various factors such as the use of a drug delivery system and whether it is administered as part of a combination of other drugs.
  • the dose of the agent of the present invention can be, for example, about 1 ⁇ g / kg (body weight) to 10 g / kg (body weight) per day.
  • the administration schedule of the agent of the present invention can also be determined in consideration of the same factors as the dose thereof.
  • the above daily dose can be administered 1 to 4 times from 1 day to January. From the viewpoint of patient burden and effect, it is preferably used once every 2 to 6 days, and more preferably once every 3 to 4 days.
  • Reference example 1 Oligopeptide synthesis 1
  • the oligopeptides having the amino acid sequences shown in Table 1 were synthesized by outsourcing to ILS Corporation. Except for MHP24-AcN and MHP24h-AcN, there is no modification of the N-terminal and C-terminal, the N-terminal is an amino group, and the C-terminal is a carboxy group.
  • MHP24-AcN and MHP24h-AcN are oligopeptides in which the N-terminal is acetylated and the C-terminal is amidated. The amino acid residues in these peptides are all L-form.
  • Example 1 Neurological symptoms of a demyelinating disease model (RANKL peptide 100 ⁇ g)
  • a demyelinating disease model (experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model) was created and examined whether its symptoms were ameliorated by the RANKL peptide. Specifically, it was done as follows.
  • Example 3 Effect of Demyelinating Disease Model on Immune Activators The test was conducted in the same manner as in Example 1 except that the daily dose of RANKL peptide was changed (250 ⁇ g). The spinal cord was collected on Day 10 and the expression of immunostimulatory factor (CD4, Clce4, TLR8, IL1b) mRNA was confirmed by real-time RT-PCR.
  • CD4, Clce4, TLR8, IL1b immunostimulatory factor

Abstract

オリゴペプチドを有効成分とする、脱髄疾患の予防又は治療剤を提供することを課題とし、該課題を、RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを含有する、脱髄疾患の予防又は治療剤、により解決する。

Description

脱髄疾患の予防又は治療剤
　本発明は、脱髄疾患の予防又は治療剤等に関する。
　多発性硬化症は中枢神経系の脱髄疾患の1つであり、感覚障害、運動障害、眼障害、認知機能障害等の多岐に亘る症状を呈する疾患である。多発性硬化症は、再発寛解を繰り返す再発寛解型（RRMS）が大多数を占める。一方で、多発性硬化症の50％は、複数回の再発寛解サイクルを繰返した後、2次性進行型（SPMS）へと進行する。
　再発や進行を抑制する薬剤として、ナタリズマブ等の効果が比較的高い薬剤が上市されているものの、ナタリズマブは進行性多巣性白質脳症等の重篤な副作用を引き起こすことが報告されている。一方、同じく上市されているグラチラマー酢酸塩は、ポリペプチド製剤であるので安全性に優れており、ファーストライン治療薬として利用されている（非特許文献１）。しかしながら、グラチラマー酢酸塩は、連日皮下注が必要であるので患者への負担が大きく、またプラセボと比較すると再発率は32％の低下で効果は不十分である。
グラチラマー酢酸塩注射液（総称名：コパキソン）添付文書（2018年7月改訂（第4版）） The Journal of Clinical Investigation, No.7, Vol.108, 2001, pages 971-979. Mol Endocrinol, January 2009, 23(1):35-46.
　本発明は、オリゴペプチドを有効成分とする、脱髄疾患の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが、脱髄疾患の予防及び治療効果を有することを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であり、
前記βストランドD配列が下記（c）又は（d）：
（c）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチドを含有する、脱髄疾患の予防又は治療剤。
　項２．　前記DEループ配列が前記（a）のアミノ酸配列である、項１に記載の予防又は治療剤。
　項３．　前記1～3個のアミノ酸が1又は2個のアミノ酸である、項２に記載の予防または治療剤。
　項４．　前記（d）のアミノ酸配列において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基並びに配列番号3及び5のN末端から4番目のアミノ酸残基であるロイシン残基は置換又は欠失されていない、項１～３のいずれかに記載のオリゴペプチド。
　項５．　前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、前記DEループ配列のC末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドE配列を含む、項１～４のいずれかに記載の予防又は治療剤。
　項６．　前記βストランドE配列が下記（e）又は（f）：
（e）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項５に記載の予防又は治療剤。
　項７．　前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、RANKLタンパク質CDループ配列を含まない、項１～６のいずれかに記載の予防又は治療剤。
　項８．　前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i）又は（j）：
（i）配列番号12～22のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（j）配列番号12～22のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項１～７のいずれかに記載の予防又は治療剤。
　項９．　前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i’）又は（j’）：
（i’）配列番号12、17、20、21、又は22に示されるアミノ酸配列、又は
（j’）配列番号12、17、20、 21、又は22に示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項１～７のいずれかに記載の予防又は治療剤。
　項１０．　前記オリゴペプチドが、C末端がアミド化されかつN末端がアセチル化されたオリゴペプチドである、項１～９のいずれかに記載の予防又は治療剤。
　項１１．　前記オリゴペプチドの長さが50アミノ酸残基長以下である、項１～１０のいずれかに記載の予防又は治療剤。
　項１２．　前記オリゴペプチドの長さが40アミノ酸残基長以下である、項１１に記載の予防又は治療剤。
　項１３．　2～6日に1回投与するように用いられる、項１～１２のいずれかに記載の予防又は治療剤。
　項１４．　前記脱髄疾患が中枢神経系脱髄疾患である、項１～１３のいずれかに記載の予防又は治療剤。
　項１５．　前記中枢神経系脱髄疾患が多発性硬化症である、項１４に記載の予防又は治療剤。
　本発明によれば、オリゴペプチドを有効成分とする、脱髄疾患の予防又は治療剤を提供することができる。本発明によれば、従来の薬剤より少ない投与回数で予防又は治療効果を発揮することができることより患者の負担を軽減することができる、及び／又はより高い予防又は治療効果を発揮することができる薬剤を提供することが可能である。
実施例1における、神経症状の変化を示す。縦軸は神経スコアを示し（（0）正常、（1）尾の完全下垂、（2）尾の完全下垂および後肢の脱力、（3）後肢の完全麻痺、（4）後肢の完全麻痺および前肢の部分麻痺、（5）死亡）、横軸はRANKLペプチド（MHP1-7）の投与開始日をDay2とした場合（Day0はMOG35-55/CFAを皮下注）の経過日数を示す。Salineは、RANKLペプチドに代えて生理食塩水を投与した場合（コントロール）を示す。各プロットは平均値（Saline：n＝5、MHP1-7：n＝5）であり、標準誤差を各プロット上のバーで示す。*は、Two Way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons検定によるコントロールに対するP値が0.05未満であることを示す。 実施例1における、生存率の算出結果を示す。縦軸は生存率を示す。P値はLog-rank (Mantel-Cox) test検定によるP値を示す。その他は、図１と同じである。 実施例2のDay12における、神経症状を示す。縦軸は神経スコアを示し、横軸は投与した薬剤及び投与量（μg/day）を示す。Salineはn＝3、その他はそれぞれn＝4である。**は、 One-way ANOVA with Dunnett検定によるコントロールに対するP値が0.01未満であることを示し、***は同P値が0.001未満であることを示す。 実施例2 のDay28における、脱髄の割合を示す。縦軸は、脱髄された面積の全体に対する割合を示し、横軸は、投与した薬剤（MHP1-7）の投与量（μg/day）を示す。Salineはn＝3、その他はそれぞれn＝4である。 実施例3における、免疫活性化因子（CD4, Clce4, TLR8, IL1b）のmRNA発現量測定結果を示す。縦軸は、各グラフ上方に示される因子のmRNA発現量の相対値を示す。横軸中、M：MHP1-7投与群、S：生食投与群、N：正常群である。各カラムは平均値（M：n＝5、S：n＝5、N：n＝2）であり、標準偏差を各カラム上のバーで示す。 実施例4における、神経症状の変化を示す。縦軸、横軸等は図１と同様である。 実施例5 のDay12における、神経症状を示す。縦軸は神経スコアを示し、横軸は投与した薬剤の種類を示す（GAはグラチラマー塩酸塩）。Salineはn＝5、MHP1-7はn＝5、GAはn＝4である。 実施例6の Day14における、神経症状を示す。縦軸は神経スコアを示し、横軸は投与した薬剤の種類を示す。Salineはn＝3、MHP1-7はn＝4である。 実施例7における、神経症状の変化を示す。縦軸は神経スコアを示し、横軸等は抗原PLP139-151を皮下注射した日をDay0とした場合の経過日数を示す。*は、Two Way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons 検定によるコントロールに対するP値が0.05未満であることを示す。 実施例8の結果を示す。左側は、IL-17の測定結果を示し、右側は、IFNγの測定結果を示す。横軸中、MOG0はMOG投与していないコントロールを示し、MOG10はMOG投与を行った例を示し、MHP1はRANKLペプチドとしてMHP1-7を投与した例を示し、SalineはRANKLペプチドに代えて生理食塩水を投与した例を示す。各カラムは平均値（Saline MOG0：n＝5、MHP1 MOG0：n＝5、Saline MOG10：n＝5、MHP1 MOG10：n＝5）であり、標準偏差を各カラム上のバーで示す。*は、One-way ANOVA with Dunnett検定検定による生食投与群に対するP値が0.05未満であることを示す。 実施例9の結果を示す。縦軸は、神経突起長を示す。横軸は、添加した薬剤の種類（LY：PI3-K inhibitor LY294002、MEKI：MEK inhibitor、PKA：PKA inhibitor、PKCI：PKC inhibitor）、添加量（培地中終濃度）を示す。各カラムは平均値（（左図　Normal：n＝4、RAKL：n＝4、MHP1-7：n＝4）（右図　Normal：n＝4、MHP1-7：n＝4、MHP1-7+LY：n＝4、MHP1-7+MEKI：n＝4、MHP1-7+PKA：n＝4、MHP1-7+PKCI：n＝4））であり、標準偏差を各カラム上のバーで示す。*は、One-way ANOVA with Dunnett検定によるコントロールに対するP値が0.05未満であることを示し、**は同P値が0.01未満であることを示す。 実施例10の結果を示す。左側の図において縦軸はTNFαの測定濃度を示し、右側の図において縦軸はIL-6の測定濃度を示す。横軸中、Normalは薬剤処理していない場合を示し、LPSはLPS処理した場合を示し、MHP24はLPS及びMHP24h-AcNで処理した場合を示す。各カラムは平均値（Normal：n＝5、LPS：n＝5、MHP24：n＝5）であり、標準偏差を各カラム上のバーで示す。**は、One-way ANOVA with Dunnett検定検定によるLPS群に対するP値が0.01未満であることを示す。 実施例11のMHP24h-AcNの結果を示す。左側の図において縦軸はTNFαの測定濃度を示し、右側の図において縦軸はIL-6の測定濃度を示す。横軸中、Normalは薬剤処理していない場合を示し、LPSはLPS処理した場合を示し、MHP24はLPS及びMHP24h-AcNで処理した場合を示す。各カラムは平均値（Normal：n＝4、LPS：n＝4、MHP24：n＝4）であり、標準偏差を各カラム上のバーで示す。**は、One-way ANOVA with Dunnett検定検定によるLPS群に対するP値が0.01未満であることを示す。 実施例11のMHP4の結果を示す。縦軸はIL-6の測定濃度を示す。横軸に処理した薬剤の有無（+/-）を示す。各カラムは平均値（- -：n＝3、+ -：n＝3、+ 100：n＝3）であり、標準偏差を各カラム上のバーで示す。**は、One-way ANOVA with Tukey検定によるLPS群に対するP値が0.01未満であることを示す。#は、One-way ANOVA with Tukey検定検定によるnormal群に対するP値が0.05未満であることを示す。 実施例12における、神経症状の変化を示す。縦軸は神経スコアを示し、横軸はMOG35-55/CFAを皮下注した日をDay0とした場合の経過日数を示す。矢印はMHP1-7投与日を示す。
　1．定義
　本明細書において、アミノ酸配列の表記は全て一文字表記で表わす。
　本明細書において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes ”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　2．オリゴペプチド
　以下に、RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（本明細書において、「本発明のオリゴペプチド」と示すこともある。）について説明する。
　RANKLタンパク質のDEループ配列としては、下記（a）又は（b）のアミノ酸配列が挙げられる：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
好ましくは(b)のアミノ酸配列における置換は保存的置換である。また、 好ましくは(b)のアミノ酸配列における付加は、N末端またはC末端における付加である。
　RANKLタンパク質のβストランドD配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、βストランドDを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該βストランドD配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラットなど、より好ましくはヒト、マウスなど、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のβストランドD配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献２、３などに記載されている。また、ある生物種由来のβストランドD配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献２、３など）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のβストランドD配列として、具体的には、例えば配列番号2に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドD配列の一部）、配列番号3に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドD配列）、配列番号4に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドD配列の一部）、配列番号5に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドD配列）などが挙げられる。βストランドD配列は、本発明のオリゴペプチドが脱髄疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、変異したものであってもよい。
　なお、配列番号2～5において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基、及び配列番号3及び5のN末端から4番目アミノ酸であるロイシン残基は、脱髄疾患の予防及び治療効果の発揮に重要である。βストランドD配列においては、このロイシン残基は変異していないことが望ましい。
　RANKLタンパク質のβストランドD配列として、好ましくは下記（c）又は（d）のアミノ酸配列が挙げられる：
（c）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　上記（d）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1又は2個であり、より好ましくは1個である。
　また、上記（d）において、好ましい変異として保存的置換が挙げられる。また、上記（d）のアミノ酸配列として、好ましくは下記（d’）のアミノ酸配列が挙げられる：（d’）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列のN末端又はC末端（好ましくはC末端）に対して1～3個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
　上記（d’）において、付加しているアミノ酸の数は、好ましくは1又は2個であり、より好ましくは1個である。
　「N末端側に隣接して配置された」とは、上記DEループ配列のN末端のアミノ酸と上記βストランドD配列のC末端のアミノ酸とがペプチド結合により連結していることを示す。
　本発明のオリゴペプチドのアミノ酸配列は、本発明のオリゴペプチドが脱髄疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、上記した配列以外の他の配列を含んでいてもよい。他の配列は特に限定されないが、細胞内半減期がより長いという観点などから決定することが望ましい。なお、親水性か否か、及び細胞内半減期については、各種ウェブサイト（例えばエクスパシー（http://web.expasy.org/protparam/））上で予測することができる。エクスパシーを利用する場合、親水性については、「Grand average of hydropathicity」がマイナスの値を示すように配列を設計することが好ましい。
　他の配列としては、脱髄疾患の予防又は治療効果の観点から特に好ましくはRANKLタンパク質のβストランドE配列が挙げられる。βストランドE配列は、DEループ配列のC末端側に隣接して配置されていることが好ましい。なお、「C末端側に隣接して」とは、上記DEループ配列のC末端のアミノ酸と上記βストランドE配列のN末端のアミノ酸とがペプチド結合により連結していることを示す。
　RANKLタンパク質のβストランドE配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、βストランドEを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該βストランドE配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラットなど、より好ましくはヒト、マウスなど、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のβストランドE配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献２、３などに記載されている。また、ある生物種由来のβストランドE配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献２、３など）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のβストランドE配列として、具体的には、例えば配列番号6に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドE配列）、配列番号7に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドE配列の一部）、配列番号8に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドE配列）、配列番号9に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドE配列の一部）などが挙げられる。βストランドE配列は、本発明のオリゴペプチドが脱髄疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、変異していてもよい。
　RANKLタンパク質のβストランドE配列として、好ましくは下記（e）又は（f）のアミノ酸配列が挙げられる：
（e）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　上記（f）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1又は2個であり、より好ましくは1個である。
　また、上記（f）において、好ましい変異として保存的置換が挙げられる。また、上記（f）のアミノ酸配列として、好ましくは下記（f’）のアミノ酸配列が挙げられる：（f’）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列のN末端又はC末端（好ましくはN末端）に対して1～3個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
　上記（f’）において、付加しているアミノ酸の数は、好ましくは1又は2個であり、より好ましくは1個である。
　本発明のオリゴペプチドのアミノ酸配列は、RANKLタンパク質のCDループ配列を含まないことが好ましい。
　RANKLタンパク質のCDループ配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、CDループを形成するアミノ酸配列である。各生物種のCDループ配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献２、３などに記載されている。RANKLタンパク質のCDループ配列として、具体的には、例えば配列番号10に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のCDループ配列）、配列番号11に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のCDループ配列）などが挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドの長さとしては、オリゴペプチドとして一般的な長さである限り特に限定されない。該長さは、例えば50アミノ酸残基長以下、好ましくは40アミノ酸残基長以下、より好ましくは35アミノ酸残基以下、より好ましくは30アミノ酸残基以下、さらに好ましくは25アミノ酸残基長以下である。また、該長さは、例えば11アミノ酸残基長以上、好ましくは13アミノ酸残基長以上、より好ましくは15アミノ酸残基長以上、さらに好ましくは20アミノ酸残基長以上、よりさらに好ましくは25アミノ酸残基長以上である。該長さの範囲は、例えば11～50アミノ酸残基長、好ましくは15～40アミノ酸残基長、より好ましくは20～35アミノ酸残基、さらに好ましくは25～30アミノ酸残基長である。
　本発明のオリゴペプチドの好ましいアミノ酸配列としては、下記（i）又は（j）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが挙げられる：
（i）配列番号12～22のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（j）配列番号12～22のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　本発明のオリゴペプチドのより好ましいアミノ酸配列としては、下記（i’）又は（j’）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが挙げられる：
（i’）配列番号12、17、20、21、又は22に示されるアミノ酸配列、又は
（j’）配列番号12、17、20、21、又は22に示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　上記（j）及び（j’）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1又は2個であり、より好ましくは1個である。
好ましくは（j）及び（j’）のアミノ酸配列における置換は保存的置換である。
　本発明のオリゴペプチドは、脱髄疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
　本発明のオリゴペプチドは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO‐）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　また、本発明のオリゴペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、なども包含される。
　上記化学修飾の中でも、C末端のアミド化、N末端のアセチル基による保護などが好ましく挙げられる。特に、N末端がアセチル化されたオリゴペプチドは活性が優れており好ましいオリゴペプチドとして挙げられる。安定性の観点からは、C末端がアミド化されたオリゴペプチドが優れており、さらに好ましいオリゴペプチドとして、C末端がアミド化されかつN末端がアセチル化されたオリゴペプチドが挙げられる。特に好ましいオリゴペプチドとして、MHP1のC末端がアミド化されかつN末端がアセチル化されたMHP1-7、MHP6のC末端がアミド化されかつN末端がアセチル化されたMHP6-AcN、MHP24のC末端がアミド化されかつN末端がアセチル化されたMHP24-AcN、及びMHP24hのC末端がアミド化されかつN末端がアセチル化されたMHP24h-AcNが挙げられる。
　さらに、本発明のオリゴペプチドには、薬物の安定性、薬物動態、生物学的利用能などを改善する目的で用いられる公知の修飾物が付加されていてもよい。このような修飾物としては、例えばポリエチレングリコール鎖などが挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、直鎖状、分枝状、環状などの種々の形態のものを包含するが、直鎖状であることが好ましい。また、本発明のオリゴペプチドは、脱髄疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、公知の手段に従って又は準じて架橋されていてもよい。
　本発明のオリゴペプチドは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸塩などが挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸などが挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。
　3．用途
　本発明のオリゴペプチドは、脱髄疾患の予防又は治療効果を有することから、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として利用することができる。また、限定的な解釈を望むものではないが、本発明のオリゴペプチドは、免疫活性化因子（例えばCD4, Clce4, TLR8, IL1b等）の発現抑制作用、脱髄抑制作用、T細胞プライミング抑制作用、神経突起伸長促進作用等の各種作用の1種又は2種以上を発揮することが可能であり、これらの作用に基づいて、脱髄疾患の予防又は治療効果を発揮すると考えられる。本発明のオリゴペプチドは、免疫活性化因子発現抑制剤、脱髄抑制剤、T細胞プライミング抑制剤、神経突起伸長促進剤等の有効成分として利用することもできる。
　本明細書において、上記した薬剤をまとめて、「本発明の剤」と示すこともある。本発明の剤は、例えば医薬などの種々の分野で用いられる剤とすることができる。本発明の剤は、これをそのまま、あるいは慣用の成分とともに各種組成物となし、動物およびヒトに適用（例えば、投与、摂取、接種など）することができる。
　本発明の剤において、本発明のオリゴペプチドは、1種単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
　脱髄疾患としては、例えば多発性硬化症、視神経脊髄炎、同心円硬化症、急性散在性脳脊髄炎、炎症性広汎性硬化症、亜急性硬化症全脳炎、進行性多巣性白質脳症等の中枢神経系脱髄疾患；　ギラン・バレー症候群、フィッシャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎等の末梢神経系脱髄疾患等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは中枢神経系脱髄疾患が挙げられ、さらに好ましくは中枢神経系の炎症性脱髄疾患が挙げられ、特に好ましくは多発性硬化症が挙げられる。多発性硬化症としては、再発寛解型、一次性進行型、二次性進行型、進行再発型等が挙げられる。
　本発明の剤中の有効成分の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重などを考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の剤中の有効成分の含量は、本発明の剤全体を100重量部として0.0001重量部～100重量部程度をすることができる。
　本発明の剤の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与である。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体などと混合などすることにより、常法に従って製造することができる。
　非経口投与のための剤形は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤、クリーム、ゲル剤）、坐剤、吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤などが挙げられる。例えば、注射用製剤は、本発明のオリゴペプチドを注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤などを添加することができる。本発明の剤は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
　本発明の剤は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の剤は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸などの成分を配合することもできる。
　本発明の剤の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤などを用いることができる。
　本発明の剤の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴などの薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、決定することができる。本発明の剤の投与量は、例えば、一日当たりで、1μg/kg（体重）～10g/kg（体重）程度とすることができる。本発明の剤の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の1日当たりの投与量で、1日～1月に1～4回投与することできる。患者負担及び効果の観点から、2～6日に1回投与するように用いられることが好ましく、3～4日に1回投与するように用いられることがより好ましい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　参考例1：オリゴペプチドの合成1
　表１に示すアミノ酸配列のオリゴペプチドをILS株式会社に委託して合成した。MHP24-AcN及びMHP24h-AcN以外は、N末端及びC末端の修飾は無く、N末端がアミノ基であり、C末端がカルボキシ基である。MHP24-AcN及びMHP24h-AcNは、N末端がアセチル化され且つC末端がアミド化されてなるオリゴペプチドである。なお、これらのペプチドにおけるアミノ酸残基は、全てL体である。
　さらに、MHP1のメチオニン残基がD体に置換されてなるオリゴペプチド（MHP1-3）、MHP1のN末端がアセチル化されてなるオリゴペプチド（MHP1-6）、MHP1のN末端がアセチル化され且つC末端がアミド化されてなるオリゴペプチド（MHP1-7）、及びMHP1のC末端がアミド化されてなるオリゴペプチド（MHP1-8）をILS株式会社に委託して合成した。
　またさらに、ヒト配列のMHP1の配列（配列番号17）の1アミノ酸をマウスMHP1配列（配列番号12）のアミノ酸に置換してなる配列（LMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKNWSGN（配列番号22））の、N末端がアセチル化され且つC末端がアミド化されてなるオリゴペプチド（MHP1-AcN-ph2）をILS株式会社に委託して合成した。
　HPLC及びMSにより、所望の配列のオリゴペプチドが高純度で合成できたことを確認した。以下、これらのペプチドを総称して「RANKLペプチド」と総称することもある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例1：脱髄疾患モデルの神経症状（RANKLペプチド100μg）
　脱髄疾患モデル（実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデル）を作製し、その症状が、RANKLペプチドによって改善されるかどうかを調べた。具体的には次のように行った。
　被検動物として、C57BL6/Jマウス（雌）を準備した。脱髄疾患モデル作製は、EAEモデル作製キット（Hooke Kit for EAE Induction in C57BL/6 Mice）を用いて行った。具体的には、完全フロイントアジュバントと混和した抗原myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55（MOG35-55/CFA）を皮下注し（Day0）、同日に百日咳毒素（PTX）を投与し、その翌日に再度PTXを投与して（Day1）、脱髄疾患モデルを作製した。その翌日（Day2）から、RANKLペプチド100μgを1日1回、連日皮下注した。Day8から、マウスの神経症状を観察し6段階で評価し数値化して、神経スコア（「Neurological score」又は単に「Score」と示す）とした。症状に対する神経スコアは次の通りである。神経スコアを括弧内に示す。（（0）正常、（1）尾の完全下垂、（2）尾の完全下垂および後肢の脱力、（3）後肢の完全麻痺、（4）後肢の完全麻痺および前肢の部分麻痺、（5）死亡。さらに、生存率も算出した。結果を図１及び図２に示す。
　RANKLペプチドにより、脱髄疾患の症状が改善され、また生存率も向上することが分かった。
　実施例2：脱髄疾患モデルの神経症状及び脱髄抑制（RANKLペプチド100μg、250μg、500μg ）
　RANKLペプチドの1日投与量を変える（100μg、250μg、又は500μg）以外は、実施例1と同様にして試験した。Day12における神経スコアを図３に示す。1日投与量が250μgの場合が改善効果が最も高いことが分かった。
　また、Day28において脊髄を採取し、Fluoromyelin（Thermofisher）で髄鞘を染色した。染色された面積を計測し、脱髄された面積の全体に対する割合を算出した。結果を図４に示す。RANKLペプチドにより脱髄が抑制されることが分かった。
　実施例3：脱髄疾患モデルの免疫活性化因子に対する影響
　RANKLペプチドの1日投与量を変える（250μg）以外は、実施例1と同様にして試験した。Day10において脊髄を採取して、realtime RT-PCRで免疫活性化因子（CD4, Clce4, TLR8, IL1b）mRNAの発現を確認した。
　結果を図５に示す。RANKLペプチドにより、免疫活性化因子の発現が抑制されることが分かった。
　実施例4：脱髄疾患モデルの神経症状（RANKLペプチド250μg、3日に1回 ）
　RANKLペプチドの1日投与量を変え（250μg）、且つ投与を3日に1回（Day2、Day5、Day8、・・・）とする以外は、実施例1と同様にして試験した。神経スコアを図６に示す。RANKLペプチドは3日に1回の投与であっても改善効果を発揮できることが分かった。
　実施例5：脱髄疾患モデルの神経症状（RANKLペプチド250μg、3日に1回、他剤との比較）
　RANKLペプチドの1日投与量を変え（250μg）、且つ投与を3日に1回（Day2、Day5、Day8、・・・）とし、さらに比較対象としてグラチラマー酢酸塩投与群（2mg/day、3日に1回の投与）を設ける以外は、実施例1と同様にして試験した。Day12における神経スコアを図７に示す。グラチラマー塩酸塩投与では、コントロールに対して有意差が無かったのに対して、RANKLペプチド投与により、有意に発症を抑制することができることが分かった。
　実施例6：脱髄疾患モデルの神経症状（RANKLペプチド250μg、4日に1回 ）
　RANKLペプチドの1日投与量を変え（250μg）、且つ投与を4日に1回（Day2、Day6、Day10、・・・）とする以外は、実施例1と同様にして試験した。Day14における神経スコアを図８に示す。RANKLペプチドは4日に1回の投与であっても改善効果を発揮できることが分かった。
　実施例7：脱髄疾患モデルの神経症状（RANKLペプチド250μg、発症後投与）
　RANKLペプチドの投与開始が発症後であっても改善効果を示すか否かを調べた。具体的には、次のようにして行った。
　被検動物として、SJLマウス（雌）を準備した。脱髄疾患モデル作製は、EAEモデル作製キット（Hooke KitsTM for EAE Induction in SJL Mice）を用いて行った。具体的には、完全フロイントアジュバントと混和した抗原myelin proteolipid protein 139-151（PLP139-151/CFA）を皮下注して（Day0）、脱髄疾患モデルを作製した。神経スコアが上昇したDay15から、Day38まで、RANKLペプチド250μgを2日に1回、皮下注した。
　神経スコアを図９に示す。RANKLペプチドの投与開始が発症後であっても改善効果を示すことが分かった。
　実施例8：脱髄疾患モデルにおけるT細胞プライミング抑制
　C57BL6/Jマウスの足底部にMOG35-55/CFA（10μg）を皮下注し、2日目より、RANKLペプチドを連日皮下注した（250μg/day）。6日目に膝窩のリンパ節を採取し、MOG35-55を含む培地で3日間培養し、培養上清中のIL-17及びIFNγの量をELISAで測定した。
　結果を図１０に示す。RANKLペプチドはT細胞プライミングを抑制することが分かった。
　実施例9：神経突起伸長に対する影響
　Neuro2A細胞を1％FBS含有DMEM培地で24時間培養した後、DMED:F12培地に交換し、RANKLペプチド(MHP1-7)、RANKLを添加した。12時間培養後に細胞を顕微鏡にて観察した。観察像から100個の細胞の神経突起長を測定しその平均値を算出した。結果を図１１の左に示す。RANKLペプチドは神経突起伸長を促進することが分かった。また、その作用はRANKLよりも強かった。さらに、RANKLペプチド添加(10μg/ml)1時間前に各種阻害剤（PI3-K inhibitor LY294002 (10μM)、PKA inhibitor (10μM)、PKC inhibitor (10μM)、MEK inhibitor (U2016, 20μM) ）を添加し、同様に試験を行い、細胞を観察した。観察像から、100個の細胞の神経突起長を測定し、その平均値を算出した。結果を図１１右に示す。RANKLペプチドの神経突起伸長作用は、PI3キナーゼ経路、MAPキナーゼ経路、PKAに依存性であった。よって、RANKLペプチドは神経突起伸張に直接作用すると考えられる。
　実施例10：RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制（ミクログリア細胞）　炎症反応を惹起するリポ多糖（LPS）によってミクログリア細胞から分泌される炎症性サイトカインの量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。
　RANKLペプチド（終濃度100μg/ml）、及びLPS（終濃度2 ng/ml）を含むDMEM培地（＋4％　FBS）中で、MG6細胞（マウス由来ミクログリア細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。なお、本願実施例において、ELISA法は、キット（Quantikine ELISA Mouse TNF-α又はQuantikine ELISA Mouse IL-6、R&D Systems社製）を用いて行った。結果を図１２に示す。
　図１２より、LPSによる炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）分泌量増加が、RANKLペプチド（MHP24h-AcN）によって抑制されることが示された。
　実施例11：RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制（マクロファージ細胞）
　LPSによってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカインの量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。
　RANKLペプチド（終濃度100μg/ml）、及びLPS（終濃度2 ng/ml）を含むDMEM培地（＋4％　FBS）中で、RAW264.7細胞（マウス由来マクロファージ細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。結果を図１３及び図１４に示す。
　図１３より、LPSによる炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）分泌量増加が、RANKLペプチド（MHP24h-AcN）によって抑制されることが示された。また、図１４より、LPSによる炎症性サイトカイン（IL-6）分泌量増加が、RANKLペプチド（MHP4）によって抑制されることが示された。
　実施例12：脱髄疾患モデルの神経症状（MHP1-AcN-ph2）
　脱髄疾患モデルを作製し、その症状が、MHP1-AcN-ph2によって改善されるかどうかを調べた。具体的には次のように行った。被検動物として、C57BL6/Jマウス（雌）を準備した。脱髄疾患モデル作製は、EAEモデル作製キット（Hooke Kit for EAE Induction in C57BL/6 Mice）を用いて行った。具体的には、完全フロイントアジュバントと混和した抗原myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55（MOG35-55/CFA）を皮下注し（Day0）、同日に百日咳毒素（PTX）を投与し、その翌日に再度PTXを投与して（Day1）、脱髄疾患モデルを作製した。その翌日（Day2）から、MHP1-AcN-ph2 100μgを2日に1回皮下注した。マウスの神経症状を観察し6段階で評価し数値化して、神経スコア（「Neurological score」又は単に「Score」と示す）とした。症状に対する神経スコアは次の通りである。神経スコアを括弧内に示す。（（0）正常、（1）尾の完全下垂、（2）尾の完全下垂および後肢の脱力、（3）後肢の完全麻痺、（4）後肢の完全麻痺および前肢の部分麻痺、（5）死亡。結果を図１５に示す。
　MHP1-AcN-ph2により、脱髄疾患の症状が改善されることが分かった。

Claims (15)

  1. RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
    前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
    （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
    （b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    であり、
    前記βストランドD配列が下記（c）又は（d）：
    （c）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
    （d）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    であるオリゴペプチドを含有する、脱髄疾患の予防又は治療剤。
  2. 前記DEループ配列が前記（a）のアミノ酸配列である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
  3. 前記1～3個のアミノ酸が1又は2個のアミノ酸である、請求項２に記載の予防または治療剤。
  4. 前記（d）のアミノ酸配列において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基並びに配列番号3及び5のN末端から4番目のアミノ酸残基であるロイシン残基は置換又は欠失されていない、請求項１～３のいずれかに記載のオリゴペプチド。
  5. 前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、前記DEループ配列のC末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドE配列を含む、請求項１～４のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  6. 前記βストランドE配列が下記（e）又は（f）：
    （e）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
    （f）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、請求項５に記載の予防又は治療剤。
  7. 前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、RANKLタンパク質CDループ配列を含まない、請求項１～６のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  8. 前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i）又は（j）：
    （i）配列番号12～22のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
    （j）配列番号12～22のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、請求項１～７のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  9. 前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i’）又は（j’）：
    （i’）配列番号12、17、20、21、又は22に示されるアミノ酸配列、又は
    （j’）配列番号12、17、20、21、又は22に示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、請求項１～７のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  10. 前記オリゴペプチドが、C末端がアミド化されかつN末端がアセチル化されたオリゴペプチドである、請求項１～９のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  11. 前記オリゴペプチドの長さが50アミノ酸残基長以下である、請求項１～１０のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  12. 前記オリゴペプチドの長さが40アミノ酸残基長以下である、請求項１１に記載の予防又は治療剤。
  13. 2～6日に1回投与するように用いられる、請求項１～１２のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  14. 前記脱髄疾患が中枢神経系脱髄疾患である、請求項１～１３のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  15. 前記中枢神経系脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項１４に記載の予防又は治療剤。
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