WO2021124565A1 - 電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法 - Google Patents

電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021124565A1
WO2021124565A1 PCT/JP2019/050152 JP2019050152W WO2021124565A1 WO 2021124565 A1 WO2021124565 A1 WO 2021124565A1 JP 2019050152 W JP2019050152 W JP 2019050152W WO 2021124565 A1 WO2021124565 A1 WO 2021124565A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
electrophoresis
molecular weight
nucleic acid
weight marker
polymer electrolyte
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/050152
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
未真 小川
崇秀 横井
Original Assignee
株式会社日立ハイテク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社日立ハイテク filed Critical 株式会社日立ハイテク
Priority to US17/782,194 priority Critical patent/US20230012343A1/en
Priority to JP2021565300A priority patent/JP7273996B2/ja
Priority to PCT/JP2019/050152 priority patent/WO2021124565A1/ja
Publication of WO2021124565A1 publication Critical patent/WO2021124565A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means

Definitions

  • the present disclosure relates to a molecular weight marker for electrophoresis, a nucleic acid fractionation method, and a nucleic acid size analysis method.
  • the gel electrophoresis method is a method for analyzing biological substances such as nucleic acids and proteins by utilizing the phenomenon that when an electric field is applied to a charged substance, the substance moves in the direction of an electrode having opposite polarity.
  • an electrophoresis gel such as an agarose gel or an acrylamide gel is used as a support for a biological substance. Since the moving speed in the electrophoresis gel differs depending on the molecular weight of the biological substance, the biological substance is separated as a different band for each molecular weight. Since the gel electrophoresis method has high resolution regarding the separation of biological substances, it is also adopted for separating (fractionating) a biological substance having a target molecular weight from other biological substances having a molecular weight (patented). Documents 1 and 2).
  • a biological substance of a known size has been used as a ladder marker in order to estimate the moving position of the target biological substance.
  • ladder markers are generally run in parallel in adjacent lanes (Patent Document 3 and Non-Patent Document 1).
  • the present disclosure provides a molecular weight marker for electrophoresis that can be electrophoresed simultaneously in the same lane as the sample and can accurately predict the electrophoresis position of the sample.
  • the molecular weight marker for electrophoresis of the present disclosure is characterized by containing a polymer electrolyte that is negatively charged in an aqueous solution and does not serve as a template for a DNA polymerase reaction.
  • the electrophoresis can be performed simultaneously in the same lane as the sample, and the electrophoresis position of the sample can be accurately predicted. Issues, configurations and effects other than the above will be clarified by the following description of the embodiments.
  • nucleic acid means DNA and RNA, and includes those derived from biological samples and those artificially synthesized.
  • nucleic acid in the present disclosure shall include single-stranded, double-stranded, and other modified nucleic acids.
  • the molecular weight marker for electrophoresis (nucleic acid molecular weight marker reagent) according to the first embodiment contains a polymer electrolyte that is negatively charged in an aqueous solution and does not serve as a template for a DNA polymerase reaction. That is, the properties are different from those of nucleic acid samples (DNA, RNA).
  • does not serve as a template for the DNA polymerase reaction means that when the DNA polymerase reaction is carried out with the molecular weight marker for electrophoresis mixed in the sample, the DNA amplification product derived from the molecular weight marker for electrophoresis is less than 10 pg / ⁇ L. (It does not exceed 10 pg / ⁇ L).
  • the reason for setting "10 pg / ⁇ L” is that it is the detection limit of Qubit (manufactured by Thermo Fisher Scientific, Qubit is a registered trademark) which is generally used as a DNA quantifying device.
  • the molecular weight marker for electrophoresis (hereinafter, may be simply referred to as "molecular weight marker”) can be a substance that does not inhibit the DNA polymerase reaction.
  • “does not inhibit the DNA polymerase reaction” means that the amount of amplification of the nucleic acid when the DNA polymerase reaction is carried out in a state where the molecular weight marker for electrophoresis is mixed with the nucleic acid is the case where the molecular weight marker for electrophoresis is not mixed. It means that it is 95% or more compared to.
  • the molecular weight of the polymer electrolyte is adjusted to a molecular weight that exhibits the same migration rate as that of a nucleic acid having a target base length.
  • the molecular weight marker for electrophoresis may contain a plurality of molecular weight polymer electrolytes having the same migration rate as that of nucleic acid having a plurality of base lengths. That is, it may be provided to the user as a molecular weight marker set for electrophoresis.
  • it may contain a polymer electrolyte having a molecular weight that exhibits the same migration rate as that of nucleic acids of 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, and 1000 bp, respectively.
  • the target base length combination is not limited to the above, and any combination can be adopted.
  • the polymer electrolyte Since the polymer electrolyte is negatively charged in the aqueous solution, it can be electrophoresed in the same direction as the nucleic acid. In addition, since the polymer electrolyte is a substance that does not serve as a template for the DNA polymerase reaction, even if it is mixed with the nucleic acid recovered after electrophoresis, it has little effect on the next step, so it is possible to perform electrophoresis in the same lane as the nucleic acid. It is possible to accurately estimate the molecular weight of nucleic acid.
  • a homopolymer can be used as the above-mentioned polymer electrolyte.
  • examples of homopolymers that can be used as molecular weight markers for electrophoresis in this embodiment include polyphosphoric acid, high molecular carboxylic acid, high molecular sulfonic acid, and salts or derivatives thereof. Further, as long as it exhibits the same behavior as these substances, it can be used in the same manner.
  • Examples of high molecular weight carboxylic acids include polyacrylic acid, carboxymethyl cellulose, poly (3-hydroxymethyl-hexamethylene-1,3,5-tricarboxylic acid), poly (4-methoxy-tetramethylene-1,2-dicarboxylic acid). Acid), poly (tetramethylene-1,2-dicarboxylic acid) and the like.
  • Examples of the high molecular weight sulfonic acid include polystyrene sulfonic acid and polyvinyl sulfonic acid.
  • polyphosphoric acid in particular has the same migration rate as DNA of a specific length regardless of the concentration of the electrophoresis gel, so the length of the DNA fragment can be accurately estimated when used as a molecular weight marker. can do.
  • polyphosphoric acid can be used without any special treatment, there are many dyeing methods, and it is inexpensive, so that the production cost as a molecular weight marker is low.
  • a copolymer can also be used as the above-mentioned polymer electrolyte.
  • copolymers that can be used as molecular weight markers for electrophoresis in this embodiment include mucopolysaccharides and salts or derivatives thereof.
  • mucopolysaccharides include hyaluronic acid, chondroitin sulfate, heparin, glycosaminoglycan, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, keratan polysulfate, chitin and the like.
  • Examples of the salt of the polymer electrolyte include sodium salt, potassium salt and the like, and can be a salt of a negatively charged polymer electrolyte and an arbitrary cation.
  • a molecular weight marker having an arbitrary migration rate can be obtained by simply adjusting the number of monomers to be polymerized.
  • the polymer electrolyte may be in the form of branched chains.
  • the molecular weight marker for electrophoresis may be provided in the form of an aqueous solution of a polymer electrolyte.
  • the pH of the aqueous solution is not limited, but can be, for example, pH 2 or higher from the viewpoint of preventing decomposition of nucleic acids that are electrophoresed together.
  • the molecular weight marker for electrophoresis may contain substances other than the polymer electrolyte, such as a dye capable of dyeing the polymer electrolyte, a solvent such as water, a buffer, a specific gravity adjusting agent, and salts.
  • substances other than the polymer electrolyte such as a dye capable of dyeing the polymer electrolyte, a solvent such as water, a buffer, a specific gravity adjusting agent, and salts.
  • Ladder markers generally contain nucleic acids of multiple known base lengths.
  • the ladder marker lane and the polymer electrolyte lane are adjacent to each other.
  • the voltage and the voltage application time during electrophoresis can be appropriately set according to the concentration of the gel to be used, the type of ladder marker, and the like.
  • the nucleic acid of the ladder marker is stained by immersing the gel after electrophoresis in an aqueous solution of the nucleic acid staining dye. As a result, the migration rate of the nucleic acid of each base length in the ladder marker can be visually recognized as a band.
  • the polymer electrolyte is precipitated by ethanol precipitation and recovered, and the recovered polymer electrolyte is used as an aqueous solution and used as a molecular weight marker.
  • the electrophoresis rate of the DNA having the target base length and the polymer electrolyte can be obtained. make sure that the migration rate is the same.
  • the polymer electrolytes recovered from the positions of a plurality of bands may be collectively referred to as one aqueous solution, or the polymer electrolyte recovered from the positions of one band may be used as one aqueous solution. .. That is, it may be a molecular weight marker in which a plurality of chain length polymer electrolytes corresponding to a plurality of bands are set, or a molecular weight marker containing only a chain length polymer electrolyte corresponding to a certain band. ..
  • the method for producing a molecular weight marker for electrophoresis is not limited to the above, and other methods can also be adopted. For example, it is also possible to mass-produce by measuring the molecular weight of the polymer electrolyte having the same migration rate as the nucleic acid having a specific base length obtained as described above and synthesizing the polymer electrolyte having the molecular weight.
  • the molecular weight marker for electrophoresis according to the first embodiment contains a polymer electrolyte that is negatively charged in an aqueous solution and does not serve as a template for a DNA polymerase reaction.
  • the nucleic acid can be electrophoresed in the same lane as the nucleic acid sample, so that the migration position of the nucleic acid can be accurately estimated. That is, the nucleic acid sample can be accurately fractionated for each target base length. It also eliminates the need to use lanes for molecular weight markers, which can improve analytical throughput.
  • the molecular weight marker for electrophoresis (nucleic acid molecular weight marker reagent) according to the second embodiment is any one of polyphosphate, polymer carboxylic acid, polymer sulfonic acid, anion exchange resin, mucopolysaccharide and salts or derivatives thereof. Contains one or more polymeric electrolytes.
  • Examples of high molecular weight carboxylic acids include polyacrylic acid, carboxymethyl cellulose, poly (3-hydroxymethyl-hexamethylene-1,3,5-tricarboxylic acid), poly (4-methoxy-tetramethylene-1,2-dicarboxylic acid). Acid), poly (tetramethylene-1,2-dicarboxylic acid) and the like.
  • Examples of the high molecular weight sulfonic acid include polystyrene sulfonic acid and polyvinyl sulfonic acid.
  • Examples of anion exchange resins include cholestyramine and the like.
  • mucopolysaccharides examples include hyaluronic acid, chondroitin sulfate, heparin, glycosaminoglycan, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, keratan polysulfate, chitin and the like.
  • the molecular weight of the polymer electrolytes listed above is adjusted to a molecular weight that exhibits the same migration rate as that of a nucleic acid having a target base length.
  • these polymer electrolytes do not serve as templates for DNA polymerase reactions. Therefore, even if it is mixed with the nucleic acid recovered after electrophoresis, the influence on the next step is small, so that the electrophoresis can be performed in the same lane as the nucleic acid sample, and the molecular weight of the nucleic acid can be estimated accurately.
  • a method for size fractionating a nucleic acid sample containing nucleic acid fragments having various base lengths will be described using the above-mentioned molecular weight marker for electrophoresis.
  • the nucleic acid size fractionation method according to the present embodiment a general method can be mainly adopted, but the above-mentioned molecular weight marker for electrophoresis and the nucleic acid sample to be fractionated are electrophoresed in the same lane. Is a feature.
  • a molecular weight marker for electrophoresis containing a polymer electrolyte having a chain length corresponding to the base length of the nucleic acid fragment to be recovered is mixed with the nucleic acid sample to be fractionated.
  • nucleic acid sample to be fractionated and the molecular weight marker for electrophoresis may be injected into the slits in the same lane of the electrophoresis gel without being mixed in advance.
  • the gel after electrophoresis is stained with a dye that can stain the polymer electrolyte. This visualizes the position of the band of the molecular weight marker.
  • a gel is cut out from the position of the band of the stained polymer electrolyte, and a nucleic acid fragment is extracted from each of the cut out gels.
  • the nucleic acid fractionation method of the present embodiment is not limited to the following, but can be carried out, for example, in the pretreatment stage of analysis by a next-generation DNA sequencer.
  • the nucleic acid fractionation method of the present embodiment includes preparing a molecular weight marker for electrophoresis containing a polymer electrolyte that is negatively charged in an aqueous solution and does not serve as a template for a DNA polymerase reaction, and for electrophoresis. It includes electrophoresing a molecular weight marker and a nucleic acid sample in the same lane, and obtaining a nucleic acid fragment having a desired base length based on the electrophoresis position of the molecular weight marker for electrophoresis. This makes it possible to accurately fractionate a nucleic acid fragment having a desired base length from a nucleic acid sample.
  • the fourth embodiment a method of analyzing the size of nucleic acid using the above-mentioned molecular weight marker for electrophoresis will be described.
  • the procedure of the nucleic acid size analysis method according to the present embodiment is almost the same as the nucleic acid fractionation method described in the third embodiment. That is, the nucleic acid contained in the nucleic acid sample is obtained by mixing and electrophoresis a molecular weight marker for electrophoresis containing polymer electrolytes having a plurality of chain lengths corresponding to a plurality of base lengths with respect to the nucleic acid sample whose size is to be analyzed. The base length of the fragment can be estimated.
  • the method for analyzing the size of nucleic acid of the present embodiment includes preparing a molecular weight marker for electrophoresis containing a polymer electrolyte that is negatively charged in an aqueous solution and does not serve as a template for a DNA polymerase reaction, and electrophoresis. It includes electrophoresis of a molecular weight marker for nucleic acid and a nucleic acid in the same lane, and estimating the base length of a nucleic acid fragment contained in the nucleic acid based on the migration position of the molecular weight marker for electrophoresis. This makes it possible to accurately estimate the base length of the fragment contained in the nucleic acid sample.
  • ultra-long chain polyphosphoric acid solution (manufactured by Bioenex) was prepared.
  • This ultra-long chain polyphosphoric acid solution contains polyphosphoric acid having a chain length of about 200 to 1000, and its typical concentration is 100 mg / mL.
  • Such ultra-long-chain polyphosphates having a plurality of molecular weights and DNA ladder markers having a known migration rate are subjected to agarose gel electrophoresis, and the positions of each band of the DNA ladder markers are the same from the lanes of the ultra-long-chain polyphosphates. By cutting out the gel at the position, polyphosphate having a chain length corresponding to the target base length as a DNA molecular weight marker can be obtained.
  • the agarose gel was prepared by pouring 3% SeaKem (registered trademark) GTG-TAE (manufactured by Lonza) into a plastic container and molding it. A slit is provided on the upper part of the agarose gel for injecting a sample or a molecular weight marker.
  • the prepared agarose gel was placed horizontally on an electrophoresis apparatus (trade name: Mupit (registered trademark), manufactured by Mupit), and a 1 ⁇ TAE buffer (Tris Actate EDTA Buffer) was filled in the electrophoresis tank.
  • a sample was prepared by mixing 1 ⁇ L of very long chain polyphosphoric acid with 1 ⁇ L of 6 ⁇ DNA Loading Dye (manufactured by Thermo Fisher Scientific). The sample and a commercially available DNA ladder marker (trade name: 1 kb plus DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific) for confirming the migration position of DNA are injected into the slits of the agarose gel and electrophoresed at 100 V for 30 minutes. did.
  • nucleic acid was stained by immersing the agarose gel in a 10,000-fold diluted SYBR Green I aqueous solution.
  • polyphosphoric acid aqueous solutions For the gel at the same position as the DNA of 300 bp, 20 ⁇ L was obtained as a 1 mg / mL polyphosphoric acid aqueous solution by the same procedure. Then, 300 bp DNA prepared in advance by PCR amplification was mixed and gel-electrophoresed, and it was confirmed that the electrophoresis rate of polyphosphoric acid and the electrophoresis rate of 300 bp DNA were the same. Therefore, these polyphosphoric acid aqueous solutions can be used as a 200 bp DNA molecular weight marker and a 300 bp DNA molecular weight marker, respectively.
  • FIG. 1 is an electrophoretic image of samples 1 to 4 obtained by DNA polymerase reaction of polyphosphoric acid.
  • the two lanes LM are lanes on which a commercially available DNA ladder marker (product name: 1 kb Plus DNA Ladder, manufactured by Thermo Fisher Scientific) is electrophoresed.
  • Lane 1 is a lane in which sample 1 having no electrophoretic sample was electrophoresed, and lanes 2 to 4 electrophoresed samples 2 to 4 obtained by mixing and reacting 0.5 ng, 5 ng or 50 ng of polyphosphoric acid, respectively. It is a lane. As shown in FIG. 1, no DNA band could be confirmed in any of lanes 1 to 4.
  • FIG. 2 is an electrophoretic image of DNA samples A to D.
  • the two lanes LM are lanes in which a DNA ladder marker (product name: 1 kb Plus DNA Ladder, manufactured by Thermo Fisher Scientific) is electrophoresed.
  • Lane 1 is a lane in which DNA sample A obtained by PCR-amplifying a DNA template without polyphosphoric acid was electrophoresed.
  • Lanes 2 to 4 are lanes in which 0.5 ng, 5 ng, and 50 ng of polyphosphoric acid were mixed with a DNA template and PCR-amplified DNA samples B to D were electrophoresed. As shown in FIG. 2, DNA bands were confirmed in all of lanes 1 to 4.
  • the amplification amount of the DNA samples B to D was the amplification of the DNA sample A (without polyphosphoric acid). It was more than 95% of the amount. From the above, it was confirmed that polyphosphoric acid does not inhibit the DNA polymerase reaction.
  • the agarose gel was prepared by pouring 3% SeaKem (registered trademark) GTG-TAE (manufactured by Lonza) into a plastic container and molding it. A slit is provided on the upper part of the agarose gel for injecting a sample or a molecular weight marker.
  • the prepared agarose gel was placed horizontally on an electrophoresis apparatus (trade name: Mupit (registered trademark), manufactured by Mupit), and a 1 ⁇ TAE buffer (Tris Actate EDTA Buffer) was filled in the electrophoresis tank.
  • the agarose gel was immersed in a 0.5% aqueous solution of toluidine blue for 20 minutes for staining, and then decontaminated with Milli-Q water (Milli-Q is a registered trademark) for 2 hours.
  • FIG. 3 is an image of an agarose gel decontaminated after staining observed under white light.
  • the lane LM is a lane in which a DNA ladder marker (product name: 1 kb Plus DNA Ladder, manufactured by Thermo Fisher Scientific) is electrophoresed.
  • Lane 1 is a lane in which a sample mixed with polyphosphoric acid equivalent to 200 bp is electrophoresed
  • lane 2 is a lane in which a sample mixed with polyphosphoric acid equivalent to 300 bp is electrophoresed.
  • the bands of lanes 1 and 2 are stained polyphosphoric acid.
  • DNA fragment 200 the DNA fragment obtained from the band position in lane 1
  • DNA fragment 300 the DNA fragment obtained from the band position in lane 2
  • FIG. 4 is a graph showing the distribution of fragment lengths of DNA samples containing fragments of 50 bp to 1500 bp.
  • the horizontal axis is the base length [bp] and the vertical axis is the fluorescence intensity [FU].
  • Peak 1 indicates the peak of the lower marker for analysis, and peak 3 indicates the peak of the upper marker for analysis.
  • Peak 2 indicates the peak of the DNA sample. As shown in FIG. 4, it was confirmed that the DNA sample contained a DNA fragment of 50 bp to 1500 bp.
  • FIG. 5 is a graph showing the distribution of the fragment length of the extracted DNA fragment 200. Peaks 1 and 3 are the same as in FIG. In FIG. 4, a peak ranging from 50 bp to 1500 bp appears, whereas in FIG. 5, a narrow peak 2 appears at 200 bp. From this, it was confirmed that a DNA fragment of 200 bp could be recovered by using a molecular weight marker of polyphosphoric acid showing a migration rate equivalent to 200 bp.
  • FIG. 6 is a graph showing the distribution of the fragment length of the extracted DNA fragment 300. Peaks 1 and 3 are the same as in FIG. In FIG. 4, a peak ranging from 50 bp to 1500 bp appears, whereas in FIG. 6, a narrow peak 2 appears at 300 bp. From this, it was confirmed that a DNA fragment of 300 bp could be recovered by using a molecular weight marker of polyphosphoric acid showing a mobility equivalent to 300 bp.
  • nucleic acid fragment having a target base length can be accurately obtained.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

試料と同じレーンで同時に泳動可能であり、試料の電気泳動位置を正確に予想可能な電気泳動用分子量マーカーを提供するために、本開示の電気泳動用分子量マーカーは、水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含むことを特徴とする。

Description

電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法
　本開示は、電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法に関する。
　ゲル電気泳動方法は、電荷を持った物質に電場を印加すると物質が逆極性の電極の方向へ移動する現象を利用して、核酸やタンパク質などの生体物質を分析する手法である。一般に、生体物質の支持体として、アガロースゲルやアクリルアミドゲルなどの電気泳動ゲルが用いられる。生体物質の分子量によって電気泳動ゲル中の移動速度が異なるため、分子量毎に異なるバンドとして生体物質が分離される。ゲル電気泳動方法は、生体物質の分離に関し高い分解能を持つため、目的とする分子量の生体物質を他の分子量の生体物質から分離し、回収する（分画する）ためにも採用される（特許文献１及び２）。
　従来、目的生体物質の移動位置を見積もるために、既知サイズの生体物質がラダーマーカーとして利用されている。電気泳動の際、コンタミネーションを避けるために、ラダーマーカーは隣接するレーンで平行して泳動する方法が一般的である（特許文献３及び非特許文献１）。
特開２００４－２９０１０９号公報 特表２０１０－５０２９６２号公報 米国特許第９，７１９，９６１号明細書
Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (CSHL Pr., 2001).
　しかしながら、電気泳動のレーンが異なると同じ分子量の試料であっても泳動度が異なる場合があることが、当該領域の実施者の間では広く認められている。したがって、特許文献３及び非特許文献１のように、生体試料のレーンと隣接するレーンでラダーマーカーを泳動する方法では、目的生体試料の位置を正確に予想することが困難な場合がある。
　また、１回の電気泳動で処理できる試料数をマーカーレーンの数だけ減らすことになってしまい、スループットの点でも課題がある。
　そこで、本開示は、試料と同じレーンで同時に泳動可能であり、試料の電気泳動位置を正確に予想可能な電気泳動用分子量マーカーを提供する。
　上記課題を解決するため、本開示の電気泳動用分子量マーカーは、水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含むことを特徴とする。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される請求の範囲の様態により達成され実現される。
　本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。
　本開示の電気泳動用分子量マーカーによれば、試料と同じレーンで同時に泳動可能であり、試料の電気泳動位置を正確に予想することができる。
　上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
ポリリン酸をＤＮＡポリメラーゼ反応させたサンプル１～４の電気泳動像である。 ＤＮＡサンプルＡ～Ｄの電気泳動像である。 染色後脱染したアガロースゲルを白色光の下で観察した像である。 ＤＮＡサンプルの断片長の分布を示すグラフである。 抽出したＤＮＡ断片の断片長の分布を示すグラフである。 抽出したＤＮＡ断片の断片長の分布を示すグラフである。
　本開示は、以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。本開示の思想ないし趣旨から逸脱しない範囲で、その具体的構成を変更し得ることは当業者であれば容易に理解される。
　本明細書において単数形で表される構成要素は、特段文脈で明らかに示されない限り、複数形を含むものとする。
　本開示において、「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡを意味し、生体試料由来のもの及び人工的に合成したものを含む。また、本開示における「核酸」は、一本鎖、二本鎖、その他修飾された核酸も含むものとする。
［第１の実施形態］
＜電気泳動用分子量マーカー＞
　第１の実施形態に係る電気泳動用分子量マーカー（核酸分子量マーカー試薬）は、水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含む。すなわち、核酸試料（ＤＮＡ、ＲＮＡ）とは性質が異なっている。ここで、「ＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない」とは、電気泳動用分子量マーカーが試料に混入した状態でＤＮＡポリメラーゼ反応を実施した際に電気泳動用分子量マーカー由来のＤＮＡ増幅物が１０ｐｇ／μＬ未満となる（１０ｐｇ／μＬ以上にならない）ことを指す。なお、「１０ｐｇ／μＬ」としたのは、ＤＮＡの定量装置として一般的に使用されているＱｕｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｑｕｂｉｔは登録商標）の検出限界であるためである。
　電気泳動用分子量マーカー（以下、単に「分子量マーカー」という場合がある）は、ＤＮＡポリメラーゼ反応を阻害しない物質とすることができる。ここで、「ＤＮＡポリメラーゼ反応を阻害しない」とは、核酸に電気泳動用分子量マーカーが混入した状態でＤＮＡポリメラーゼ反応を実施した際の核酸の増幅量が、電気泳動用分子量マーカーの混入がない場合に比べて９５％以上であることを指す。
　高分子電解質が分子量マーカーとして機能するために、高分子電解質の分子量は、目的とする塩基長を有する核酸の泳動度と同じ泳動度を示す分子量に調整される。電気泳動用分子量マーカーは、複数の塩基長の核酸の泳動度とそれぞれ同じ泳動度を示す複数の分子量の高分子電解質を含んでいてもよい。すなわち、電気泳動用分子量マーカーセットとしてユーザに提供されてもよい。具体的には、例えば５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、１０００ｂｐの核酸の泳動度とそれぞれ同じ泳動度を示す分子量の高分子電解質を含んでいてもよい。目的とする塩基長の組み合わせは、上記に限定されるものではなく、あらゆる組み合わせを採用できる。
　高分子電解質が水溶液中で負に帯電するものであることにより、核酸と同じ方向に電気泳動することができる。また、高分子電解質がＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない物質であることにより、電気泳動後に回収した核酸に混入していても次工程への影響が小さいため、核酸と同じレーンで電気泳動することができ、核酸の分子量を正確に推定することができる。
　電気泳動用分子量マーカーは、上記高分子電解質としてホモポリマーを用いることができる。本実施形態の電気泳動用分子量マーカーとして使用できるホモポリマーの例としては、ポリリン酸、高分子カルボン酸、高分子スルホン酸及びこれらの塩若しくは誘導体が挙げられる。また、これらの物質と同様の挙動を示すものであれば、同様に使用可能である。
　高分子カルボン酸の例としては、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ（３－ヒドロキシメチル－ヘキサメチレン－１，３，５－トリカルボン酸）、ポリ（４－メトキシ－テトラメチレン－１，２－ジカルボン酸）、ポリ（テトラメチレン－１，２－ジカルボン酸）などが挙げられる。高分子スルホン酸の例としては、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸などが挙げられる。
　上記ホモポリマーの中でも、特にポリリン酸は、電気泳動ゲルの濃度によらず特定の長さのＤＮＡと泳動度が同じであるため、分子量マーカーとして用いた場合に正確にＤＮＡ断片の長さを推定することができる。また、ポリリン酸は特別な処理をせずに使用できること、染色方法も多数あること、安価であることから、分子量マーカーとしての製造コストが低い。
　電気泳動用分子量マーカーは、上記高分子電解質としてコポリマーを用いることもできる。本実施形態の電気泳動用分子量マーカーとして使用できるコポリマーの例としては、ムコ多糖類及びこれらの塩若しくは誘導体が挙げられる。ムコ多糖類の例としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸、キチンなどが挙げられる。
　高分子電解質の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられ、負に帯電した高分子電解質と任意の陽イオンの塩とすることができる。
　上記高分子電解質の中でも、直鎖状の高分子電解質を用いることにより、単にモノマーの重合数を調整するだけで任意の泳動度の分子量マーカーを得ることができる。もちろん、高分子電解質は分岐鎖状であってもよい。
　電気泳動用分子量マーカーは、高分子電解質の水溶液の形態で提供されてもよい。当該水溶液のｐＨは限定されないが、共に電気泳動される核酸の分解を防止するという観点からは、例えばｐＨ２以上とすることができる。
　電気泳動用分子量マーカーは、高分子電解質を染色可能な色素、水などの溶媒、緩衝剤、比重調整剤、塩類等、高分子電解質以外の物質を含んでいてもよい。
＜電気泳動用分子量マーカーの製造方法＞
　本実施形態の電気泳動用分子量マーカーの製造方法の一例を説明する。本製造方法においては、電気泳動度が未知の複数の分子量の高分子電解質を材料として用いる。
　本実施形態に係る電気泳動用分子量マーカーとしての目的の塩基長を有する核酸を含むラダーマーカーを準備する。ラダーマーカーは、一般に、既知の複数の塩基長の核酸を含んでいる。
　電気泳動装置に電気泳動ゲルをセットし、電気泳動ゲルのスリットに、ラダーマーカーと、複数の分子量の高分子電解質とをそれぞれ注入し、電気泳動する。ラダーマーカーのレーンと高分子電解質のレーンとは、隣接させる。このとき、電気泳動時の電圧や電圧印加時間は、使用するゲルの濃度やラダーマーカーの種類などに応じて適宜設定できる。
　電気泳動後のゲルを、核酸染色色素の水溶液に浸漬させることにより、ラダーマーカーの核酸を染色する。これにより、ラダーマーカー中の各塩基長の核酸の泳動度をバンドとして視認することができる。
　次に、高分子電解質のレーンから、ラダーマーカーのバンドと同じ位置のゲルをそれぞれ切り出す。次に、例えばエタノール沈殿により高分子電解質を沈殿させて回収し、回収した高分子電解質を水溶液として、これを分子量マーカーとする。このとき、高分子電解質の水溶液（例えばその一部）に対し、目的の塩基長を有するＤＮＡを混合してゲル電気泳動することにより、目的の塩基長を有するＤＮＡの泳動度と、高分子電解質の泳動度とが同じであることを確認する。高分子電解質の水溶液の作製に際し、複数のバンドの位置からそれぞれ回収した高分子電解質をまとめて１つの水溶液としてもよいし、１つのバンドの位置から回収した高分子電解質を１つの水溶液としてもよい。すなわち、複数のバンドにそれぞれ対応する複数の鎖長の高分子電解質がセットになった分子量マーカーとしてもよいし、ある１つのバンドに対応する鎖長の高分子電解質のみを含む分子量マーカーとしてもよい。
　電気泳動用分子量マーカーの製造方法は上記のものに限定されず、その他の方法も採用できる。例えば、上記のようにして取得した、特定の塩基長の核酸と泳動度が等しい高分子電解質の分子量を測定し、当該分子量の高分子電解質を合成することにより量産することもできる。
＜技術的効果＞
　以上のように、第１の実施形態に係る電気泳動用分子量マーカーは、水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含む。これにより、核酸試料と同じレーンで電気泳動できるため、核酸の泳動位置を正確に推定することができる。すなわち、核酸試料を目的の塩基長ごとに正確に分画することができる。また、分子量マーカーのためのレーンを使用する必要がなくなるため、分析スループットを向上できる。
［第２の実施形態］
＜電気泳動用分子量マーカー＞
　第２の実施形態に係る電気泳動用分子量マーカー（核酸分子量マーカー試薬）は、ポリリン酸、高分子カルボン酸、高分子スルホン酸、陰イオン交換樹脂、ムコ多糖類及びこれらの塩若しくは誘導体のいずれか１以上の高分子電解質を含む。
　高分子カルボン酸の例としては、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ（３－ヒドロキシメチル－ヘキサメチレン－１，３，５－トリカルボン酸）、ポリ（４－メトキシ－テトラメチレン－１，２－ジカルボン酸）、ポリ（テトラメチレン－１，２－ジカルボン酸）などが挙げられる。高分子スルホン酸の例としては、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸などが挙げられる。陰イオン交換樹脂の例としては、コレスチラミンなどが挙げられる。ムコ多糖類の例としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸、キチンなどが挙げられる。
　分子量マーカーとして機能するために、上記に列挙した高分子電解質の分子量は、目的とする塩基長を有する核酸の泳動度と同じ泳動度を示すような分子量に調整される。
　また、これらの高分子電解質は、ＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない。したがって、電気泳動後に回収した核酸に混入していても次工程への影響が小さいため、核酸試料と同じレーンで電気泳動することができ、核酸の分子量を正確に推定することができる。
　本実施形態に係る電気泳動用分子量マーカーのその他の点については第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。
[第３の実施形態］
　第３の実施形態においては、上述の電気泳動用分子量マーカーを用いて、さまざまな塩基長の核酸断片を含む核酸試料をサイズ分画する方法について説明する。本実施形態に係る核酸のサイズ分画方法は、主に一般的な手法を採用可能であるが、上述の電気泳動用分子量マーカーと、分画対象の核酸試料とを同じレーンで電気泳動する点が特徴である。
　まず、分画対象の核酸試料に対し、回収目的の核酸断片の塩基長に対応する鎖長の高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを混合する。
　次に、核酸試料と電気泳動用分子量マーカーの混合物をゲル電気泳動装置に注入する。電気泳動の手法としては一般的な手法を採用できるので、ここでは格別説明しない。なお、分画対象の核酸試料と電気泳動用分子量マーカーとは、予め混合せずに電気泳動ゲルの同じレーンのスリットに注入してもよい。
　次に、高分子電解質を染色可能な色素を用いて、電気泳動後のゲルを染色する。これにより、分子量マーカーのバンドの位置を可視化する。染色された高分子電解質のバンドの位置からゲルを切り出し、切り出したゲルからそれぞれ核酸断片を抽出する。
　本実施形態の核酸の分画方法は、以下に限定されるものではないが、例えば次世代ＤＮＡシーケンサによる分析の前処理段階に実施することができる。
　以上のように、本実施形態の核酸分画方法は、水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、電気泳動用分子量マーカーと核酸試料とを同じレーンで電気泳動することと、電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、目的の塩基長の核酸断片を取得することと、を含んでいる。これにより、核酸試料から、目的の塩基長の核酸断片を正確に分画することができる。
[第４の実施形態］
　第４の実施形態においては、上述の電気泳動用分子量マーカーを用いて核酸のサイズを分析する方法について説明する。本実施形態に係る核酸のサイズ分析方法の手順は、第３の実施形態で説明した核酸分画方法とほぼ同様である。すなわち、サイズの分析対象の核酸試料に対し、複数の塩基長に対応する複数の鎖長の高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを混合して電気泳動することにより、核酸試料に含まれる核酸断片の塩基長を見積もることができる。
　以上のように、本実施形態の核酸のサイズ分析方法は、水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、電気泳動用分子量マーカーと核酸とを同じレーンで電気泳動することと、電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、核酸に含まれる核酸断片の塩基長を推定することと、を含んでいる。これにより、核酸試料に含まれる断片の塩基長を正確に推定することができる。
　以下、本開示の実施例を説明するが、実施例はあくまでも例示的なものであって、本開示の技術的範囲を限定するものではない。
＜電気泳動用分子量マーカーの作製＞
　２００ｂｐのＤＮＡ及び３００ｂｐのＤＮＡと泳動度が等しいポリリン酸の電気泳動用分子量マーカーをそれぞれ以下の手順で作製した。
　まず、市販の超長鎖ポリリン酸溶液（バイオエネックス社製）を準備した。この超長鎖ポリリン酸溶液には、鎖長２００～１０００程度のポリリン酸が含まれており、代表的な濃度は１００ｍｇ／ｍＬである。このような複数の分子量の超長鎖ポリリン酸と、泳動度が既知のＤＮＡラダーマーカーとをそれぞれアガロースゲル電気泳動し、超長鎖ポリリン酸のレーンから、ＤＮＡラダーマーカーの各バンドの位置と同じ位置のゲルを切り出すことにより、ＤＮＡ分子量マーカーとしての目的の塩基長に相当する鎖長のポリリン酸を取得することができる。
　アガロースゲルは、３％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ－ＴＡＥ（Ｌｏｎｚａ社製）をプラスチック容器に流し入れて成型することにより作製した。このアガロースゲルの上部には、試料や分子量マーカーを注入するためのスリットが設けられている。作製したアガロースゲルを電気泳動装置（商品名：ミューピット（登録商標）、ミューピット社製）に水平に設置し、１×ＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ　Ａｃｅｔａｔｅ　ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ）を電気泳動槽に満たした。
　１μＬの超長鎖ポリリン酸に、１μＬの６×ＤＮＡ　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を混合して、サンプルを調製した。当該サンプルと、ＤＮＡの泳動位置を確認するための市販のＤＮＡラダーマーカー（商品名：１ｋｂ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とをそれぞれアガロースゲルのスリットに注入し、１００Ｖで３０分間電気泳動した。
　その後、１万倍希釈したＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ水溶液にアガロースゲルを浸して核酸を染色した。
　ＤＮＡラダーマーカーのバンドの位置に基づき、超長鎖ポリリン酸のレーンから、２００ｂｐのＤＮＡと同じ位置のゲルを切り出した。その後エタノール沈殿してポリリン酸を回収し、１ｍｇ／ｍＬのポリリン酸水溶液として２０μＬ取得した。このポリリン酸水溶液に対し、予めＰＣＲ増幅により作製した２００ｂｐのＤＮＡを混合して、上記と同様の手順で作製したアガロースゲルを用いてゲル電気泳動した。これにより、ポリリン酸の泳動度と、２００ｂｐのＤＮＡの泳動度が同じであることを確認した。３００ｂｐのＤＮＡと同じ位置のゲルについても同様の手順で、１ｍｇ／ｍＬのポリリン酸水溶液として２０μＬ取得した。その後、予めＰＣＲ増幅により作製した３００ｂｐのＤＮＡを混合してゲル電気泳動し、ポリリン酸の泳動度と、３００ｂｐのＤＮＡの泳動度が同じであることを確認した。したがって、これらのポリリン酸水溶液は、それぞれ、２００ｂｐのＤＮＡ分子量マーカー、３００ｂｐのＤＮＡ分子量マーカーとして使用可能である。
＜ポリリン酸を用いたＤＮＡポリメラーゼ反応＞
　以下の手順で、ポリリン酸がＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならないことを確認した。具体的には、Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて、ＤＮＡ鋳型なし、０．５ｎｇ、５ｎｇ又は５０ｎｇのポリリン酸を混合した状態でそれぞれＰＣＲ増幅し、４つのサンプル１～４を調製した。得られたサンプル１～４をゲル電気泳動してＤＮＡ増幅物を確認した。
　図１は、ポリリン酸をＤＮＡポリメラーゼ反応させたサンプル１～４の電気泳動像である。図１において、２つのレーンＬＭは、市販のＤＮＡラダーマーカー（製品名：１ｋｂ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を電気泳動したレーンである。レーン１は、泳動サンプルがないサンプル１を電気泳動したレーンであり、レーン２～４は、それぞれ０．５ｎｇ、５ｎｇ又は５０ｎｇのポリリン酸を混合して反応させたサンプル２～４を電気泳動したレーンである。図１に示すように、レーン１～４のいずれもＤＮＡのバンドが確認できなかった。
　次に、ＤＮＡ定量装置（商品名：Ｑｕｂｉｔ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてサンプル１～４に含まれるＤＮＡの定量を行ったところ、いずれも１０ｐｇ／μＬ未満であった。以上より、ポリリン酸はＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならないことが確認できた。
＜ポリリン酸によるＤＮＡポリメラーゼ反応の阻害の検証＞
　以下の手順で、ポリリン酸がＤＮＡポリメラーゼ反応を阻害しないことを確認した。具体的には、Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用い、λファージのＤＮＡを鋳型とし、ポリリン酸を混入させずにＰＣＲ増幅して、ＤＮＡサンプルＡとした。また、０．５ｎｇ、５ｎｇ又は５０ｎｇのポリリン酸をそれぞれＤＮＡ鋳型に混合してＰＣＲ増幅し、ＤＮＡサンプルＢ～Ｄとした。得られたＤＮＡサンプルＡ～Ｄをゲル電気泳動してＤＮＡ増幅物を確認した。
　図２は、ＤＮＡサンプルＡ～Ｄの電気泳動像である。図２において、２つのレーンＬＭはＤＮＡラダーマーカー（製品名：１ｋｂ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を電気泳動したレーンである。レーン１は、ポリリン酸なしでＤＮＡ鋳型をＰＣＲ増幅したＤＮＡサンプルＡを電気泳動したレーンである。レーン２～４は、それぞれ０．５ｎｇ、５ｎｇ、５０ｎｇのポリリン酸をＤＮＡ鋳型に混合してＰＣＲ増幅させたＤＮＡサンプルＢ～Ｄを電気泳動したレーンである。図２に示すように、レーン１～４のいずれもＤＮＡのバンドが確認できた。
　次に、ＤＮＡ定量装置（Ｑｕｂｉｔ）を用いて、ＤＮＡサンプルＡ～Ｄに含まれるＤＮＡの定量を行ったところ、ＤＮＡサンプルＢ～Ｄの増幅量がＤＮＡサンプルＡ（ポリリン酸なしの場合）の増幅量の９５％以上であった。以上より、ポリリン酸がＤＮＡポリメラーゼ反応を阻害しないことが確認できた。
＜ポリリン酸の電気泳動用分子量マーカーを用いたＤＮＡ断片の回収＞
　上記のように作製した２００ｂｐ相当のポリリン酸の分子量マーカーと、３００ｂｐ相当のポリリン酸の分子量マーカーを用いて、５０ｂｐ～１５００ｂｐの断片が含まれるＤＮＡサンプルをアガロースゲル電気泳動し、２００ｂｐのＤＮＡ断片と３００ｂｐのＤＮＡ断片とを回収した。具体的には、以下の手順で各ＤＮＡ断片を回収した。
　アガロースゲルは、３％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ－ＴＡＥ（Ｌｏｎｚａ社製）をプラスチック容器に流し入れて成型することにより作製した。このアガロースゲルの上部には、試料や分子量マーカーを注入するためのスリットが設けられている。作製したアガロースゲルを電気泳動装置（商品名：ミューピット（登録商標）、ミューピット社製）に水平に設置し、１×ＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ　Ａｃｅｔａｔｅ　ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ）を電気泳動槽に満たした。
　１μＬのＤＮＡサンプル（５００ｎｇ／μＬ）に対し、１μＬの６×ＤＮＡ　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と、２００ｂｐ相当のポリリン酸電気泳動用分子量マーカー（１ｍｇ／ｍＬ）を１μＬ混合し、混合溶液を得た。３００ｂｐ相当のポリリン酸の分子量マーカーについても同様にして、混合溶液を得た。これらの混合溶液をアガロースゲルのスリットに注入し、１００Ｖで３０分間電気泳動した。
　電気泳動後、アガロースゲルを０．５％トルイジンブルー水溶液に２０分間浸して染色し、その後Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑは登録商標）を用いて２時間脱染した。
　図３は、染色後脱染したアガロースゲルを白色光の下で観察した像である。図３において、レーンＬＭはＤＮＡラダーマーカー（製品名：１ｋｂ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を電気泳動したレーンである。レーン１は、２００ｂｐ相当のポリリン酸を混合したサンプルを電気泳動したレーンであり、レーン２は３００ｂｐ相当のポリリン酸を混合したサンプルを電気泳動したレーンである。なお、レーン１及び２のバンドは染色されたポリリン酸である。
　次に、ポリリン酸の分子量マーカーの各バンドの位置のゲルを切り出し、それぞれＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ断片を抽出した。以下において、レーン１のバンドの位置から取得したＤＮＡ断片を「ＤＮＡ断片２００」とし、レーン２のバンドの位置から取得したＤＮＡ断片を「ＤＮＡ断片３００」とする。
　最後に、ＤＮＡ定性装置であるＴａｐｅ　Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、抽出したＤＮＡ断片２００及び３００と、元のＤＮＡサンプルに含まれるＤＮＡ断片の長さ分布をそれぞれ定性した。結果を図４～図６に示す。
　図４は、５０ｂｐ～１５００ｂｐの断片が含まれるＤＮＡサンプルの断片長の分布を示すグラフである。図４において、横軸は塩基長［ｂｐ］であり、縦軸は蛍光強度［ＦＵ］である。ピーク１は解析のためのｌｏｗｅｒマーカーのピークを示し、ピーク３は解析のためのｕｐｐｅｒマーカーのピークを示す。ピーク２は、ＤＮＡサンプルのピークを示す。図４に示すように、ＤＮＡサンプルには５０ｂｐ～１５００ｂｐのＤＮＡ断片が含まれることが確認された。
　図５は、抽出したＤＮＡ断片２００の断片長の分布を示すグラフである。ピーク１及び３については図４と同様である。図４においては５０ｂｐ～１５００ｂｐに及ぶピークが現れていたのに対し、図５においては、２００ｂｐに狭いピーク２が現れている。このことから、２００ｂｐ相当の泳動度を示すポリリン酸の分子量マーカーを用いることにより、２００ｂｐのＤＮＡ断片を回収できていることが確認された。
　図６は、抽出したＤＮＡ断片３００の断片長の分布を示すグラフである。ピーク１及び３については図４と同様である。図４においては５０ｂｐ～１５００ｂｐに及ぶピークが現れていたのに対し、図６においては、３００ｂｐに狭いピーク２が現れている。このことから、３００ｂｐ相当の泳動度を示すポリリン酸の分子量マーカーを用いることにより、３００ｂｐのＤＮＡ断片を回収できていることが確認された。
　以上のように、ポリリン酸の分子量マーカーを用いることにより、目的の塩基長の核酸断片を正確に取得することができる。

Claims (15)

  1. 　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカー。
  2. 　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない直鎖状の高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカー。
  3. 　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならないホモポリマーの高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカー。
  4. 　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならないコポリマーの高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカー。
  5. 　ポリリン酸、高分子カルボン酸、高分子スルホン酸、陰イオン交換樹脂、ムコ多糖類及びこれらの塩若しくは誘導体のいずれか１以上の高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカー。
  6. 　電気泳動により核酸をサイズ分画する方法であって、
    　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、目的の塩基長の核酸を取得することと、を含む、核酸分画方法。
  7. 　電気泳動により核酸をサイズ分画する方法であって、
    　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない直鎖状の高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、目的の塩基長の核酸を取得することと、を含む、核酸分画方法。
  8. 　電気泳動により核酸をサイズ分画する方法であって、
    　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならないホモポリマーの高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、目的の塩基長の核酸を取得することと、を含む、核酸分画方法。
  9. 　電気泳動により核酸をサイズ分画する方法であって、
    　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならないコポリマーの高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、目的の塩基長の核酸を取得することと、を含む、核酸分画方法。
  10. 　電気泳動により核酸をサイズ分画する方法であって、
    　ポリリン酸、高分子カルボン酸、高分子スルホン酸、陰イオン交換樹脂、ムコ多糖類及びこれらの塩若しくは誘導体のいずれか１以上の高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、目的の塩基長の核酸を取得することと、を含む、核酸分画方法。
  11. 　電気泳動により核酸のサイズを分析する方法であって、
    　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、前記核酸に含まれる核酸断片の塩基長を推定することと、を含む、核酸のサイズ分析方法。
  12. 　電気泳動により核酸のサイズを分析する方法であって、
    　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならない直鎖状の高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、前記核酸に含まれる核酸断片の塩基長を推定することと、を含む、核酸のサイズ分析方法。
  13. 　電気泳動により核酸のサイズを分析する方法であって、
    　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならないホモポリマーの高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、前記核酸に含まれる核酸断片の塩基長を推定することと、を含む、核酸のサイズ分析方法。
  14. 　電気泳動により核酸のサイズを分析する方法であって、
    　水溶液中で負に帯電し、かつＤＮＡポリメラーゼ反応の鋳型にならないコポリマーの高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、前記核酸に含まれる核酸断片の塩基長を推定することと、を含む、核酸のサイズ分析方法。
  15. 　電気泳動により核酸のサイズを分析する方法であって、
    　ポリリン酸、高分子カルボン酸、高分子スルホン酸、陰イオン交換樹脂、ムコ多糖類及びこれらの塩若しくは誘導体のいずれか１以上の高分子電解質を含む電気泳動用分子量マーカーを準備することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーと前記核酸とを同じレーンで電気泳動することと、
    　前記電気泳動用分子量マーカーの泳動位置に基づいて、前記核酸に含まれる核酸断片の塩基長を推定することと、を含む、核酸のサイズ分析方法。
PCT/JP2019/050152 2019-12-20 2019-12-20 電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法 WO2021124565A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/782,194 US20230012343A1 (en) 2019-12-20 2019-12-20 Molecular weight marker for electrophoresis, nucleic acid fractionation method and nucleic acid size analysis method
JP2021565300A JP7273996B2 (ja) 2019-12-20 2019-12-20 電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法
PCT/JP2019/050152 WO2021124565A1 (ja) 2019-12-20 2019-12-20 電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2019/050152 WO2021124565A1 (ja) 2019-12-20 2019-12-20 電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021124565A1 true WO2021124565A1 (ja) 2021-06-24

Family

ID=76478700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/050152 WO2021124565A1 (ja) 2019-12-20 2019-12-20 電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230012343A1 (ja)
JP (1) JP7273996B2 (ja)
WO (1) WO2021124565A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116858953A (zh) * 2023-06-15 2023-10-10 开平牵牛生化制药有限公司 一种双链核酸分子量测定方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4507233A (en) * 1981-04-22 1985-03-26 Oriental Yeast Co., Ltd. Colored molecular weight marker
US5714326A (en) * 1991-01-24 1998-02-03 Dawson; Elliott P. Method for the multiplexed preparation of nucleic acid molecular weight markers and resultant products
JPH1060005A (ja) * 1996-08-14 1998-03-03 Agency Of Ind Science & Technol 糖鎖分子量マーカーおよびその製造方法
JP2007024610A (ja) * 2005-07-14 2007-02-01 Shimadzu Corp キャピラリー電気泳動方法
WO2010126044A1 (ja) * 2009-04-28 2010-11-04 和光純薬工業株式会社 内部標準物質を用いた測定方法
JP2013535474A (ja) * 2010-07-29 2013-09-12 ドクター レディズ ラボラトリーズ リミテッド グラチラマー酢酸塩の分子量マーカー
JP2014234369A (ja) * 2013-06-03 2014-12-15 キユーピー株式会社 経口用光老化改善剤
JP2015189716A (ja) * 2014-03-28 2015-11-02 森永乳業株式会社 ヒアルロン酸合成促進剤
JP2019167309A (ja) * 2018-03-23 2019-10-03 燐化学工業株式会社 ポリリン酸塩含有組成物、ポリリン酸塩含有溶液及びその製造方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4507233A (en) * 1981-04-22 1985-03-26 Oriental Yeast Co., Ltd. Colored molecular weight marker
US5714326A (en) * 1991-01-24 1998-02-03 Dawson; Elliott P. Method for the multiplexed preparation of nucleic acid molecular weight markers and resultant products
JPH1060005A (ja) * 1996-08-14 1998-03-03 Agency Of Ind Science & Technol 糖鎖分子量マーカーおよびその製造方法
JP2007024610A (ja) * 2005-07-14 2007-02-01 Shimadzu Corp キャピラリー電気泳動方法
WO2010126044A1 (ja) * 2009-04-28 2010-11-04 和光純薬工業株式会社 内部標準物質を用いた測定方法
JP2013535474A (ja) * 2010-07-29 2013-09-12 ドクター レディズ ラボラトリーズ リミテッド グラチラマー酢酸塩の分子量マーカー
JP2014234369A (ja) * 2013-06-03 2014-12-15 キユーピー株式会社 経口用光老化改善剤
JP2015189716A (ja) * 2014-03-28 2015-11-02 森永乳業株式会社 ヒアルロン酸合成促進剤
JP2019167309A (ja) * 2018-03-23 2019-10-03 燐化学工業株式会社 ポリリン酸塩含有組成物、ポリリン酸塩含有溶液及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP7273996B2 (ja) 2023-05-15
JPWO2021124565A1 (ja) 2021-06-24
US20230012343A1 (en) 2023-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Westermeier Electrophoresis in practice: a guide to methods and applications of DNA and protein separations
Richards et al. Disc electrophoresis of ribonucleic acid in polyacrylamide gels
JPH07506432A (ja) ポリマー含有溶液を使用する生体分子のキャピラリー電気泳動分子量分離
Rill et al. Isolation and characterization of chromatin subunits
Kourkine et al. Technical challenges in applying capillary electrophoresis‐single strand conformation polymorphism for routine genetic analysis
WO2021124565A1 (ja) 電気泳動用分子量マーカー、核酸分画方法及び核酸のサイズ分析方法
Kan et al. A DNA sieving matrix with thermally tunable mesh size
Lin et al. Modification of poly (methyl methacrylate) microchannels for highly efficient and reproducible electrophoretic separations of double-stranded DNA
EP2183583B1 (en) A buffer system for a long-lasting precast electrophoresis gel
Paulus et al. DNA digest analysis with capillary electrophoresis
Wang et al. Study on detection of mutation DNA fragment in gastric cancer by restriction endonuclease fingerprinting with capillary electrophoresis
Xu et al. Synthesis of poly (N, N‐dimethylacrylamide)‐block‐poly (ethylene oxide)‐block‐poly (N, N‐dimethylacrylamide) and its application for separation of proteins by capillary zone electrophoresis
Allan et al. High‐performance capillary electrophoretic separation of double‐stranded oligonucleotides using a poly‐(ethylpyrrolidine methacrylate‐co‐methyl methacrylate)‐coated capillary
Righetti et al. Steady-state two-dimensional maps of very alkaline proteins in an immobilized pH 10–12 gradient, as exemplified by histone types
Gelfi et al. Single‐strand conformation polymorphism analysis by capillary zone electrophoresis in neutral pH buffer
Kan et al. Thermoresponsive N, N‐dialkylacrylamide copolymer blends as DNA sieving matrices with a thermally tunable mesh size
JPH10502738A (ja) 粘性ポリマー溶液中の温度勾配でのキャピラリー電気泳動による核酸の分離
Shin et al. Separation and size determination of circular and linear single-stranded DNAs by alkaline agarose gel electrophoresis
Westermeier et al. Gel electrophoresis
Székely et al. Capillary gel electrophoresis of therapeutic oligonucleotides–Analysis of single‐and double‐stranded forms
WO2013074077A1 (en) Bioimaging nucleic acids, proteins and enzymes
Hrušková et al. 3D-printed device for DNA fragmentation prior liquid biopsy testing
US10151726B2 (en) Bioimaging nucleic acids, proteins and enzymes
GB2531983B (en) Method and apparatus for performing electrophoresis
Madabhushi DNA sequencing in noncovalently coated capillaries using low viscosity polymer solutions

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19956607

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021565300

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19956607

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1