JPH10502738A

JPH10502738A - 粘性ポリマー溶液中の温度勾配でのキャピラリー電気泳動による核酸の分離

Info

Publication number: JPH10502738A
Application number: JP8509892A
Authority: JP
Inventors: リゲッティ，ピエール・ジオルジオ; ジェルフィ，セシリア
Original assignee: リゲッティ，ピエール・ジオルジオ; ジェルフィ，セシリア
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1995-09-11
Publication date: 1998-03-10
Anticipated expiration: 2015-09-11
Also published as: AU3565295A; ITMI941864A1; WO1996008715A1; IT1271005B; JP3015106B2; ITMI941864A0; EP0781411A1; AU689648B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、粘性ポリマー溶液の存在下のキャピラリーゾーン電気泳動により、ＰＣＲにより増幅した、正常および点変異を含有するもの両方の、ＤＮＡ断片を分離するための経時的温度勾配の使用に関する。この系においてキャピラリー内の温度制御は、専用ソフトウェアにより行い、断片はこれらの２５４nmでの天然のＵＶ吸光度またはレーザー誘起蛍光のいずれかにより顕在化させる。ポリアクリルアミド、特にＮ−置換モノマー（例えば、Ｎ−メチルアクリルアミドおよびＮ−アクリロイルアミノエトキシエタノール）を含有するポリアクリルアミドの粘性溶液により実施することもできる。各泳動後に置換することができる、低粘度の短鎖ポリアクリルアミドを製造する方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】粘性ポリマー溶液中の温度勾配でのキャピラリー電気泳動による核酸の分離本発明は、粘性ポリマー溶液（線状または分枝状）の存在下のキャピラリーゾーン電気泳動（capillary zone electrophoresis）による、正常または点変異を含むものの両方のＰＣＲ−増幅したＤＮＡ断片の分離のための、（必要であれば、化学変性剤と組合せた）経時的な温度勾配（空間的な温度勾配と対立するものとして）の使用に関する。本発明はまた、＞１℃の精度でキャピラリーの内側の実際の温度を計算する専用のソフトウェアの使用による、内側から温度を制御するための手段を含む。本発明はまた、分離するＤＮＡの型により異なる温度勾配下で実施することができるように、必要であれば各キャピラリーの電位の個別の制御が可能な、キャピラリーの束（battery）の使用を含む。本発明は更に、レーザー誘起蛍光によるＤＮＡ検出を含む。本発明はまた、単独または混合物として、ＤＮＡ分画に典型的に使用されるような、種々のポリマー溶液（ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、グルコマンナンを含むが、これらに限定されない）、および／または加水分解−抵抗性モノマー（典型的には、Ｎ−メチルアクリルアミドおよびＮ−アクリロイルアミノエトキシエタノールのようなＮ−置換のもの）から作られるポリアクリルアミドにより実施することができる。更には本発明には、２つの異なる方法：ａ）超音波処理による長鎖ポリアクリルアミドのキャビテーションおよびｂ）阻害剤（例えば、イソプロパノール）の存在下の高温の重合による、（ＤＮＡ断片分離に最適化された）短鎖ポリアクリルアミドの合成を記載する。後者の方法では、粘度および分子量が非常に低下したポリアクリルアミドを得ることができ、１００〜１，０００bpの間隔、即ち、遺伝子変異の解析および検出にとって最も重要な間隔で大いに性能を発揮する。キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）のＤＮＡ解析に関する多くの特許が既に公開されている。例えば、C．Fujimoto（日本特許第９２２０８３８２号および第９３８３７４７号）は、ＤＮＡおよびタンパク質の分離用の２つの同軸（co -axial）キャピラリーの系を記載している。Demorest、Werner、Wiktorowicz、O aksおよびWenz（米国特許第５０１５３５０号；第５１８１９９９号；第５２６４１０１号）は、キャピラリーが、少量（０．０１〜１％）の荷電した親水性ポリマーと混合した０．０５〜３０％の２０〜５０，０００kDa の分子量を有する架橋していない中性の親水性ポリマーを含む緩衝液で充填されている電気泳動系を記載している。この系により、ＣＺＥによる生体高分子（例えば、タンパク質、核酸およびオリゴ糖類）の分離が可能である。好適な（コ）ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリオキシド、ポリエーテル、ビニルポリマー、アクリル酸ポリマー、セルロースポリマー、多糖類および植物性ゴムである。Huang、Mathies およびQuesada（米国特許第５２７４２４０号）は、適切な波長のレーザー光線による励起による蛍光標識を有するＤＮＡ断片を含有する最少２０個の試料の同時解析を行うことができる、可動式プラットフォームにマウントしたキャピラリーの束の特許を取得している。分離は、ポリアクリルアミドゲル中またはポリアクリルアミドの粘性溶液中で起こり、主な応用としては、ＤＮＡ配列決定がある。Lux、McManigillおよびYoung（米国特許第５１８０４７５号）は、被検体分離に利用される軸方向の電位勾配に垂直の第２の電位勾配を放射方向に作ることよりなる、キャピラリー中の電気浸透流動（electros motic flux）（ＥＥＯ）を制御するための新規な方法を提案している。この放射状勾配により、ＥＥＯ流動を制御すること（および排除することさえ）ができ、このため、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡの分離を改善することができる。別の出願において、Jamkbara（米国特許第５２７７７８０号）は、ＤＮＡ分離および蛍光検出のためのゲル−充填したキャピラリーの束を提案した。Chin（米国特許第５１１０４２４号）は、キャピラリーを、ＥＥＯ流動によりＤＮＡの移動と反対方向に移動する５，０００Daポリマーで充填することよりなる、ＤＮＡ分画方法を提案した。選択性は、ＥＥＯ流動の速度とＤＮＡ断片の速度との差を低下させることにより、こうして調節することができた。２つの特許出願は、特にＣＺＥ内の温度勾配による実施の可能性に言及している。「緩衝液勾配および温度勾配キャピラリー電気泳動」という名称の１つ目の出願（WeinbergerおよびGassmann、米国特許第５０４７１３４号）では、分離キャピラリーへの混合チャンバーにより結合されている２つの緩衝液リザーバーにより、緩衝液勾配の作成が可能であることが提案されている。更にキャピラリー温度を制御するための方法も提案されている。「キャピラリー電気泳動装置のための温度制御」という名称の２番目の特許において、WeinbergerおよびMills（米国特許第５０６６３８２号）は、キャピラリーと接触させて外側に置いたサーミスターによる温度制御を提案している。所定の温度を得るための最終的な手段は、キャピラリーの温度を下げるか上げるために、目的の温度で外側の空気を再循環させることによるものである。温度制御のためのこのような手段は、更にペルチエ素子を含む。更に、予め決めた電位でのキャピラリーチャンバーの電気抵抗の測定によりキャピラリー内温度を決定することが提案されている。先天性遺伝子疾患の解析において、および遺伝子変異の大量スクリーニングのためには、１回の電気泳動で、単一または複数のＤＮＡ点変異を分離できることが基本的に重要である。現在までのところ、最も一般的な方法は、Fischer およびLerman（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80，1983，1579-1583）により報告された方法で、変性勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrohoresis）（ＤＧＧＥ）である。ＤＧＧＥは、部分的に融解した二本鎖ＤＮＡの移動度が、完全なｄｓ−ＤＮＡの移動度に比較して著しく低下しているという原理に基づく。分離しやすい配列は、低い融点（Ｔ_m）と高い融点を有する２つのドメインからなる。これにより、変性剤（化学物質であろうと温度であろうと）の狭い濃度範囲内で、一本鎖および二本鎖ＤＮＡを含有する融合中間体を得ることができる。全て同じ長さを有するが点変異により異なっているこのような分子の混合物が、変性勾配の存在下でゲル内を移動するとき、未変性、融解および部分融解種の間の異なる平衡による電気泳動の経路に沿って分離が起こる。一般に、部分融解種は、完全に未変性（二本鎖）型よりも移動が遅く、これは、前者のらせんの半径が後者の半径よりも大きく、そのため、部分融解型では移動に対する摩擦抵抗が大きくなるためである。この方法の変法では、変異したＤＮＡ鎖を正常な（野生型）ＤＮＡ鎖と混合し、この混合物を最も高い温度で融解するドメインのＴ_m 以上で融解し、続いて冷却により再アニーリングすることによりヘテロ−二本鎖を形成する。これらのヘテロ−二本鎖は一般に、変異領域の塩基がカップリングしないため、ホモ−二本鎖のＴ_mよりも低いＴ_m値を有する。ヘテロ−およびホモ −二本鎖の混合物を温度勾配で移動させるとき、異なるＴ_m値により分離が起こる。実際、化学変性剤の勾配のみが使用される（典型的には尿素およびホルムアミド）Fischer およびLerman法の古典的な変法は、温度勾配中の電気泳動である。この方法（Riesner，Henco & Steger，Advan．Electr．4 ，1991，171-250）では、電気泳動は、末端に、移動方向に対して垂直または平行に温度勾配（例えば３０〜９０℃）をつけたゲルスラブ内で行われる。本発明において、本発明者らは、ＣＺＥにおいてＤＮＡ断片中のこのような点変異を分離するための、経時的な温度勾配（Riesner らの、空間にのみ存在する勾配とは対立するものとして）を作ることが可能であることを証明する。本発明はまた、以下を包含する：（ａ）未変性および部分融解ＤＮＡ分子のらせんの半径の違いに基づいて核酸を篩い分ける、粘性ポリマー溶液の使用；（ｂ）多重解析のため、キャピラリーの束の使用を可能にすること；（ｃ）レーザー誘起蛍光によるＤＮＡ断片の顕在化を可能にすること；（ｄ）次にＣＺＥにより解析されるＤＮＡ断片のin situ 増幅のため、ＣＺＥユニットに熱循環器を含めることを可能にすること；このような増幅は、必要であれば、マイクロタイタープレートまたはキャピラリーの内側の特定領域で直接行われる；（ｅ）ＣＺＥ法で通常使用されるような溶融シリカキャピラリーだけでなく、マイクロエッチングしたチャネル（microetched channels）を含有するチップでも、このような解析の実施を可能にすること。また本発明には、各キャピラリーの温度を調節するための電位勾配の個別の制御を可能にすること、およびキャピラリーの内側の温度を測定するための専用コンピュータプログラムの使用も含まれる。また本発明には、化学変性剤（例えば尿素およびホルムアミドであるがこれらに限らない）と温度変性との同時使用のような、変性勾配の組合せ使用も含まれる。この組合せ使用により、実際キャピラリーの内側の温度は、溶媒（一般に水であるが、これに限定されない）の沸点以下に到達する。本発明は、幾つかの基本的な点において、WeinbergerおよびGassmann並びにWe inbergerおよびMillsの上記特許に報告されるようなキャピラリーの温度制御とは異なる：（ａ）まず最初に、上記特許に報告される温度制御方法は、「外的方法」であり、これは、キャピラリーの外側の温度を測定し、次に冷たいかまたは暖かい空気を再循環させることによりその温度を調節することからなる。しかし、キャピラリーの内側の定常状態温度は、厚いシリカ壁とポリイミドコーティングからの散逸熱の慣性により、外側の温度とは実質的に異なることは証明されている（M.S ．Bello，P．de Besi & P.G.Righetti，J．Chromatogr．652，1993，329-336）。この差は、４０〜５０℃ほどに高いこともあり、電気泳動の間の温度制御が± １℃より良くなければならない、核酸の点変異の再現性ある分離とは両立しない。本発明においては、この温度制御は、粘性緩衝液の温度に対する電流の一次従属性（linear dependence）を仮定することにより、そして緩衝液の比導電率、その熱係数（α）、かける電位勾配、熱散逸の係数（ビオ数(Biot number)）および正確なキャピラリーの直径と長さが既知であれば、キャピラリーの内側の温度を±１℃より正確に予測することができる専用コンピュータプログラムにより、キャピラリー「内」に由来する。したがって、試験する変異体の融点によりキャピラリーの内側を所望の温度に変化させるためには、バックグラウンド緩衝液の導電率および／またはかける電位（および必要であれば、キャピラリーの直径も）を変化させることで足りる。（ｂ）このような変異体（一般に、１００〜５００塩基対（bp）位の典型的な長さの増幅ＤＮＡ断片）の最適な分離のためには、この長さの領域における最適な分離を与える液体ポリマーが必要である。上記特許では、極端な長さの線状ポリマーが典型的には使用されている（例えば、数百万Da位の典型的なサイズを有する、ポリアクリルアミド、メチルセルロース）。本発明で本発明者らは、最適な分離が大いに長さを縮めたポリマー、典型的にはＭ_rが１００，０００〜２００，０００Daのポリアクリルアミドによってのみか、あるいは異なるタイプのポリマー（例えば、３５，０００〜１００，０００Daの、短鎖ポリアクリルアミドおよびポリエチレングリコール）を混合することによっても、得られることを証明する。更には、本明細書で、このような「短鎖」ポリアクリルアミドの合成のための異なる方法を報告する。これらの１つは、ラジカルスカベンジャー（ radical scavenger）の存在下で、超音波処理により、長鎖ポリアクリルアミドを目的の鎖長に砕くことよりなる。別の方法では、ポリアクリルアミドを「鎖転移（chain-trasfer）」剤（例えば、イソプロパノール）の存在下高温（例えば、７０℃）で重合して、低粘度であると考えられる「短鎖」ポリマーを生成させる。これらのポリアクリルアミドは、粘度が非常に低いため、キャピラリーからの押し出しの容易さと共に優れた篩い分ける特性を合わせ持つという利点を有する。また本発明には、新規なモノマーのＮ−アクリロイルアミノエトキシエタノール（M．Chiari，C．Micheletti，M．Nesi，M．Fazio & P.G．Righetti，Elect rophoresis 15，1994，177-186）のような、加水分解−安定性モノマーから作られるポリアクリルアミドマトリックスの使用が含まれる。現在利用可能な系と比較した、変性勾配および上記で引用した新規な篩い分け液体ポリマーの利点は、以下に説明される。混合した物理−化学変性剤中のＤＮＡ点変異の分離図１は、温度変性勾配の非存在下（下の記録計トレース）および存在下（上のプロフィール）の、増幅ＤＮＡ断片（健常人からの嚢胞性繊維症（ＣＦ）遺伝子）の分離を示す。下のトレースでは、分離は一定温度（４５℃）で化学変性剤（６Ｍ尿素）の存在下で起こる。２７〜３５分の間に溶出するピークはオリゴヌクレオチドプライマーを表す。正常な増幅ＤＮＡは、単一ピーク（Ｗ_t／Ｗ_tと標識した）として５８〜６０分の間に溶出する。上のトレースでは、６Ｍ尿素の存在下（ＤＮＡの部分変性剤）ではあるが更に０．１５℃／分の傾きの温度勾配（その結果電気泳動の３０分後には最高４９．５℃に達する）の存在下で同じ分離を行う。温度勾配の形は、基線の湾曲（base-line ramp）から可視化され、これは恐らく温度傾斜により誘導される屈折率の変動によるものである。オリゴヌクレオチド鎖に変異が存在しないため、増幅ＤＮＡ断片（Ｗ_t／Ｗ_t）は非常に早期（わずか２４分）に溶出し、単一ピークのままであると理解することができる。図２は、嚢胞性繊維症に罹患している患者から増幅した、正常な鎖とエクソン１４ａに２つの多形（Ｖ８６８ＶおよびＴ８５４Ｔ）を含有する鎖よりなる、「ヘテローポリマー」の分離を示す。下のトレースでは再度、一定温度（Ｔ＝４５ ℃）で６M 尿素の存在下で分離が行われる。２５〜３５分の間に溶出するピークは、オリゴヌクレオチドプライマーを表す。３８分で出現するピークも、長鎖プライマー（５５bp）を表すが、一方４７分に中心のある移動時間のピークは、正常および変異鎖よりなるヘテローポリマー（Ｗ_t／Ｍ）を表す。再度６M 尿素中ではあるが、０．１５℃／分の傾きを有する温度勾配（その結果電気泳動の３０分後には最高４９．５℃に達する）の存在下で同じ分離を行うとき、試料中に存在する異なるホモ−およびヘテロ−ポリマーの部分融解が起こる。この結果として、図２の上のトレースでは、一定温度の測定で得られた単一ピークが４つのピーク（これらは、１：変異したホモ−ポリマー（Ｍ／Ｍ）；２：正常なホモ−ポリマー（Ｗ_t／Ｗ_t）；３：正常／変異体型のヘテロ−ポリマー（Ｗ_t／Ｍ）および４：変異体／正常型のヘテロ−ポリマー（Ｗ_t／Ｍ）を表す）に分離されていることに気付く。４つのピークの面積の和は、下のトレースの単一ピークの面積に相当する。本方法は、４５℃の温度プラトーで開始する低温融解物（図１および２のような）を分離するのみでなく、中間温および高温融解物も分離することができる。図３は、ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１１の異なる変異（１７１７−１Ｇ→Ａ（パネルＡ）；Ｇ５４２Ｘ（１７５６のＧ→Ｔ；パネルＣ）および１７８４ｄｅ１Ｇ（パネルＤ）、並びに各々の正常コントロール（パネルＥ））についてヘテロ接合であるＣＦ患者から増幅した、１セットの中間温融解断片の解析を示す。全ての変異体は、コントロールの単一バンドに対して、特徴的な４ピークのプロフィールを示す。パネルＢの温度プロフィールに示されるように、これらの変異体は、５６．５〜５７．８℃の範囲にＴ_mのある中間温融解物である。図４は、ＭＩＶ変異（ＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１の１３３位のＡ→Ｇトランスバージョン）に関してホモ接合であるＣＦ患者から増幅した、高温融解断片のために設定された最適条件を示す。このパネルは、一定温度プラトー（６５℃）、一定の変性緩衝液であるが、温度勾配の非存在下で注入された試料の電気泳動図を示す。ホモ−およびヘテロ−二本鎖の間の分離は観察されるが、それぞれの中では分離は見られない。３５〜４８分に溶出する一群のピークは、ＧＣ−クランプ有りおよび無しの未精製プライマーに相当する。挿入図は、０．１℃／分の傾きの６５〜６７℃勾配の最適分離を示す：ここで４つのバンドの正確なスペクトルが得られる。この温度は、真にキャピラリーの内側の温度であり、本発明者らが開発したコンピュータプログラムにより正確に決定される（M.S．Bello、E.I．Levine & P. G．Righetti，「キャピラリーゾーン電気泳動のための内部温度およびピークの修正のコンピュータ支援測定（Computer assisteddetermination of the inner temperature and peak correction for capillary zone electrophoresis)」，J ．Chromatogr．652，1993，329-336）。砕いた「鎖−転移」ポリアクリルアミドの使用砕いたポリアクリルアミドの製造により、ポリアクリルアミドポリマーの平均の鎖のサイズの著しい減少（＞２百万Daから約５５０，０００Daに低下する）のため、劇的に粘度の低下した鎖の合成が可能になる。図５は、超音波処理で砕く過程のポリアクリルアミドの粘度および平均分子量の漸進的減少を示す。粘度は、ボーリン（Bohlin）ＶＯＲレオメーター（Bohlin Rheology，Lund，Sweden）により測定し、一方Ｍ_rは、ゲル濾過［２つのウォーターズウルトラヒドロゲルカラム（Waters Ultrahydrogel columns）および示差屈折検出器Ｒ４０１を取付けた、ＨＰＬＣウォーターズ５９０溶媒送達システム（HPLC Waters’590 Solvent Delivery System）］により、ポリエチレングリコール標準物質に対して測定した。このように低下した粘度により、ポリアクリルアミドの更に濃縮した（１０％まで）溶液をキャピラリーに注入することが可能になり、また、増幅ＤＮＡ断片の解析による遺伝子変異のスクリーニングについて最も興味深いＤＮＡサイズの間隔（典型的には１００〜５００bp）で分離が最適化される。高温と組合せた鎖−転移剤（例えば、３％イソプロパノール）の存在下の重合により（この工程で、更に短くて粘度の低下した鎖が生成する）、更に良好な分離さえ達成することができる。図６は、３５℃および７０℃で「鎖転移」剤の存在下の重合により得られるポリマー濃度の関数としての粘度測定を示す。粘度は、ボーリン（Bohlin）ＶＯＲレオメーター（BohlinRheology，Lund，Sweden）で測定した。高温での劇的な粘度低下は、短鎖の形成による（３５℃で重合するときの４５０，０００DaのＭ_r とは対照的に、７０℃ではわずか１８０，０００DaのＭ_r）。図６に示されるように、３５℃または７０℃で重合したポリアクリルアミドの粘度は著しく異なる。後者の場合、粘度は大きく減衰する（例えば、８％ポリマー溶液で、粘度は４５０mPa.s からわずか１２０mPa.s に減少する）。粘度のこの大きな減少は、平均鎖長の著しい低下によるが、これは、４３０，０００Da（３５℃の重合のとき）から７０℃ではわずか１８０，０００Daに減少する。図７Ａは、Waters’Quanta 4000-E における筋ジストロフィー遺伝子の異なるエクソンのスクリーニングのための一連の増幅ＤＮＡ断片の多重鎖（multiplex ）の分離を示す。試料注入る：６kVで１０ｓ。電気泳動緩衝液：８９mMトリス− ホウ酸、２mMＥＤＴＡ、pH８．３。２５４nmで検出。Ａ；６％Ｔで線状ポリアクリルアミド中の分離（平均Ｍ_r：＞２百万Da）；Ｂ：７０℃の「鎖転移」合成により得られた１０％Ｔ線状ポリアクリルアミド中の分離（平均Ｍ_r：１８０，０００_Da）。分離の著しい増進に注意されたい：Ａの１１ピークからＢの１８ピーク（この混合物は１８の異なる増幅断片を含有する）。Ｂの上のトレースは、改変された欠失したチェンバレン（Chamberlains'）およびベッグ（Beggs'）の混合多重鎖の１４のエクソンの分離を表す。Ｂの下の電気泳動図は、改変された欠失していないチェンバレンおよびベッグの多重鎖の１８のエクソンの分離を示す。標準的マトリックス（架橋剤の非存在下、６％ポリアクリルアミドを含有する）では、１１個のＤＮＡピークより多くを分離することはできない（多重鎖が、全部で１８個の異なる断片を含有していても）。高濃度では粘度が高くてキャピラリー内への注入がもはや実行可能ではないため、液体ポリマーの濃度を上昇させることにより解析を改善することさえできない。分離の性能が非常に悪いため、このように種々のピークを同定することは不可能であった。これに反して、砕いた鎖、または更に良好には「鎖−転移」ポリアクリルアミド（７０℃で３％イソプロパノールの存在下で得られるような）をキャピラリーに充填するとき、１８断片全てを分離することができた（図７Ｂ）。

【手続補正書】【提出日】１９９７年７月１６日【補正内容】請求の範囲１．電気泳動分離媒体中で非ミセル電気泳動により二本鎖核酸断片を分離する方法であって、分離媒体に経時的に変化する温度をかけて、異なる融点および移動速度に及ぼす融解の作用により該二本鎖核酸断片の分離を引き起こすことを特徴とする方法。２．緩衝液の比導電率の、粘性ポリマー溶液の熱係数の、熱伝達係数の、キャピラリーの長さおよび直径の、関数として電位勾配をかけることによりキャピラリーの内側の温度を経時的に変化させること、並びに単独または他のポリマーと混合した、１００，０００〜２００，０００DaのＭ_r 値を有するポリアクリルアミド（Ｎ−置換および非置換の両方）の低粘度溶液を使用することを特徴とする、請求項１記載の経時的温度勾配中でＣＺＥによりＤＮＡ断片を分離する方法。３．前記ポリアクリルアミドが、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール型または他のＮ−置換アクリルアミドのモノマーにより構成されることを特徴とする、請求項１および２記載の方法。４．粘性の篩い分けポリマー溶液が、更にＤＮＡ変性剤を含有することを特徴とする、請求項１、２および３記載の方法。５．ＤＮＡ分離のための粘性の篩い分けポリマー溶液が、ＤＮＡ分画に典型的に使用されるような、種々のポリマー溶液（アガロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、グルコマンナンを含むが、これらに限定されない）を単独または混合物として含むことを特徴とする、請求項１および２記載の方法。６．ＤＮＡ断片の多様なスクリーニングのためのキャピラリーの束の使用を特徴とする、請求項２または４記載の方法。７．個々のキャピラリー内の温度が、専用ソフトウェアおよびかける電位の個別の制御により制御されて、異なる傾きの経時的温度勾配を生成する、請求項６記載の方法。８．温度制御のための専用ソフトウェアが、緩衝液の比導電率に、その熱係数に、かける電位勾配に、熱散逸の係数に、正確なキャピラリーの直径および長さに基づき、そして±１℃よりも良好に正確な内部温度を予測できることを特徴とする、請求項２および５記載の方法。９．ＤＮＡの点変異の分離のための、上記請求項のいずれか１項記載の方法。１０．ＤＮＡが、蛍光標識、並びにＵＶ／可視および／またはレーザー光線による励起で顕在化される、上記請求項のいずれか１項記載の方法。１１．キャピラリーの束で組み立て、温度勾配を展開することができ、ＵＶ／可視および／またはレーザーで励起される蛍光検出を装備している、キャピラリー電気泳動装置が、更に、続いてキャピラリー電気泳動により解析されるＤＮＡ断片のin situ 増幅（このような増幅は、必要であれば、分離キャピラリーの内側の特定のゾーンで直接起こる）のために、熱循環器を含むように作られている、請求項１、２、６および１０記載の方法。１２．温度勾配中での分離が、マイクロエッチングしたチャネルを含有するチップ（再使用可能または使い捨て）で行われる、請求項１および２記載の方法。１３．分離を、例えば、分離の最適化に応じて、加熱傾斜に続いて冷却周期、必要であれば、続いて新規な温度傾斜および別の温度周期のある、不連続または周期的な温度勾配で行うことができる、請求項１および２記載の方法。１４．所定の温度プラトーに達するための「外部」温度制御、および電位、または導電率傾斜によるオーム熱により生成するような「内部」温度変化の組合せによる経時的な温度勾配を達成するための手段および方法を含むことを特徴とする、上記請求項のいずれか１項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．電気泳動分離媒体中で非ミセル電気泳動により二本鎖核酸断片を分離する方法であって、分離媒体に経時的に変化する温度をかけて、異なる融点および移動速度に及ぼす融解の作用により該二本鎖核酸断片の分離を引き起こすことを特徴とする方法。２．緩衝液の比導電率の、粘性ポリマー溶液の熱係数の、熱伝達係数の、キャピラリーの長さおよび直径の、関数として電位勾配をかけることによりキャピラリーの内側の温度を経時的に変化させること、並びに単独または他のポリマーと混合した、ポリアクリルアミド（Ｎ−置換および非置換の両方）の低粘度溶液を使用することおよび１００，０００〜２００，０００DaのＭ_r値を有することを特徴とする、請求項１記載の経時的温度勾配中でＣＺＥによりＤＮＡ断片を分離する方法。３．前記ポリアクリルアミドが、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール型または他のＮ−置換アクリルアミドのモノマーにより構成されることを特徴とする、請求項１および２記載の方法。４．粘性の篩い分けポリマー溶液が、更にＤＮＡ変性剤を含有することを特徴とする、請求項１、２および３記載の方法。５．ＤＮＡ分離のための粘性の篩い分けポリマー溶液が、ＤＮＡ分画に典型的に使用されるような、種々のポリマー溶液（アガロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、グルコマンナンを含むが、これらに限定されない）を単独または混合物として含むことを特徴とする、請求項１および２記載の方法。６．ＤＮＡ断片の多様なスクリーニングのためのキャピラリーの束の使用を特徴とする、請求項２または４記載の方法。７．個々のキャピラリー内の温度が、専用ソフトウェアおよびかける電位の個別の制御により制御されて、異なる傾きの経時的温度勾配を生成する、請求項６記載の方法。８．温度制御のための専用ソフトウェアが、緩衝液の比導電率に、その熱係数に、かける電位勾配に、熱散逸の係数に、正確なキャピラリーの直径および長さに基づき、そして±１℃よりも良好に正確な内部温度を予測できることを特徴とする、請求項２および５記載の方法。９．ＤＮＡの点変異の分離のための、上記請求項のいずれか１項記載の方法。１０．ＤＮＡが、蛍光標識、並びにＵＶ／可視および／またはレーザー光線による励起で顕在化される、上記請求項のいずれか１項記載の方法。１１．キャピラリーの束で組み立て、温度勾配を展開することができ、ＵＶ／可視および／またはレーザーで励起される蛍光検出を装備している、キャピラリー電気泳動装置が、更に、続いてキャピラリー電気泳動により解析されるＤＮＡ断片のin situ 増幅（このような増幅は、必要であれば、分離キャピラリーの内側の特定のゾーンで直接起こる）のために、熱循環器を含むように作られている、請求項１、２、６および１０記載の方法。１２．温度勾配中での分離が、マイクロエッチングしたチャネルを含有するチップ（再使用可能または使い捨て）で行われる、請求項１および２記載の方法。１３．分離を、例えば、分離の最適化に応じて、加熱傾斜に続いて冷却周期、必要であれば、続いて新規な温度傾斜および別の温度周期のある、不連続または周期的な温度勾配で行うことができる、請求項１および２記載の方法。１４．所定の温度プラトーに達するための「外部」温度制御、および電位、または導電率傾斜によるオーム熱により生成するような「内部」温度変化の組合せによる経時的な温度勾配を達成するための手段および方法を含むことを特徴とする、上記請求項のいずれか１項記載の方法。