WO2021107747A1 - 8-옥소구아닌을 포함하는 rna 간섭 유도 핵산, 8-옥소구아닌을 포함하는 마이크로rna와 결합하는 변형 핵산 및 이들의 이용 - Google Patents

8-옥소구아닌을 포함하는 rna 간섭 유도 핵산, 8-옥소구아닌을 포함하는 마이크로rna와 결합하는 변형 핵산 및 이들의 이용 Download PDF

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microrna
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지성욱
석희영
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to an RNA interference-inducing nucleic acid containing 8-oxoguanine, a modified nucleic acid that specifically binds to microRNA containing 8-oxoguanine, a pharmaceutical composition using the same, a recombinant animal model, a drug screening method, and a diagnosis of a disease It relates to methods and methods for controlling pathophysiological phenomena, and the like.
  • RNA is the most easily modified among them.
  • the most easily occurring among the oxidatively modified RNA bases is that the guanine (G) base is oxidatively modified and transformed into 8-oxoguanine (o 8 G).
  • heart disease is one of the three major causes of death among adults in Korea, including cancer, and it starts with various pathological stresses in the onset process causing changes in the size of the heart tissue and causing cardiac hypertrophy.
  • Hypertrophy is characterized by an increase in the size of cardiomyocytes and an increase in the rate of protein synthesis. Cardiac hypertrophy gradually induces myocardial fibrosis and heart failure, eventually resulting in heart failure (or heart failure).
  • heart failure in particular, since the mortality rate is very high around 50%, studies to ultimately prevent or develop a treatment for myocardial hypertrophy are in progress, and therefore it is necessary to establish a disease model for this.
  • the present inventors found that when oxidative transformation of guanine (G) base to 8-oxoguanine (o 8 G) occurs in the seed region of microRNA due to oxidative stress, o 8 G:A
  • the binding to the target sequence was confirmed through the alignment, and the position where the oxidative modification to 8-oxoguanine occurred was confirmed by identifying the position where the G>T modification occurred in the cDNA prepared through reverse transcription of the microRNA. Therefore, Based on this, it was confirmed that various pathophysiological phenomena were induced when an RNA interference-inducing nucleic acid in which guanine (G) was substituted with 8- oxoguanine (o 8 G) in microRNA was prepared and administered to cells or mice. Based on the present invention was completed.
  • the 1st to 9th nucleotides from the 5' end include at least one 8-oxoguanine (8-oxoguanine; o 8 G)
  • RNA interference inducing nucleic acids provided are RNA interference inducing nucleic acids.
  • the present invention provides a method for position identification of 8-oxoguanine (o 8 G).
  • one or more guanine (G) among the 1st to 9th nucleotides from the 5' end is modified to specifically bind to a microRNA modified with 8-oxoguanine (o 8 G) It provides a recombinant vector comprising a nucleic acid and a gene encoding the modified nucleic acid.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cardiomegaly comprising the modified nucleic acid or the recombinant vector, and a pharmaceutical composition for treating liver cancer or glioblastoma comprising the RNA interference-inducing nucleic acid.
  • Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiomegaly comprising an antioxidant as an active ingredient, and an information providing method for diagnosing cardiomegaly.
  • Another embodiment provides a method for producing an animal model resistant to cardiomegaly and an animal model resistant to cardiac hypertrophy.
  • Another embodiment provides a method for screening a candidate for the treatment of cardiomegaly.
  • the present invention provides an RNA interference inducing nucleic acid comprising at least one 8-oxoguanine (o 8 G) in at least one single strand of the double strand of the nucleic acid, wherein the 1st to 9th nucleotides from the 5' end .
  • the first to ninth nucleotides from the 5' end provide a RNA interference-inducing nucleic acid comprising a sequence of microRNA.
  • the microRNA may be one or more of the following group 1 microRNAs:
  • the RNA interference-inducing nucleic acid can recognize the target site where the o 8 G:A sequence occurs at the position of 8-oxoguanine (o 8 G).
  • At least one single strand of the double strands of the nucleic acid may include at least one of the following group 2 polynucleotides.
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (5'p-Uo 8 GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3');
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (5'p-UGo 8 GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3');
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (5'p-UGGAAUo 8 GUAAAGAAGUAUGUAU-3');
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65 (5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3');
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 66 (5' p-UGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3'); and
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 (5' p-UAAo 8 GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3').
  • RNA interference-inducing nucleic acid according to the present invention When the RNA interference-inducing nucleic acid according to the present invention is injected into cells or animals, myocardial hypertrophy, inhibition of migration of liver cancer cells, or apoptosis may be induced.
  • the present invention provides a composition comprising the above-described RNA interference-inducing nucleic acid and an antioxidant.
  • the present invention provides a method for localization of 8-oxoguanine (o 8 G) comprising the steps of:
  • the present invention is a modified nucleic acid that specifically binds to a microRNA in which one or more guanine (G) of the 1st to 9th nucleotides from the 5' end is modified with 8-oxoguanine (o 8 G),
  • the modified nucleic acid comprises a polynucleotide complementary to 6 or more consecutive polynucleotides starting from any one of the second and third nucleotides from the 5' end of the modified microRNA,
  • It provides a modified nucleic acid comprising adenine (A) as a nucleotide at a position binding with at least one 8-oxoguanine (o 8 G) among the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of the microRNA.
  • At least one guanine (G) of the 2nd, 3rd, or 7th nucleotide from the 5' end is 8-oxoguanine (o 8 G) ) is transformed into
  • the modified nucleic acid comprises a polynucleotide complementary to 6 or more consecutive polynucleotides starting from either the 2nd or 3rd nucleotide from the 5' end of the microRNA,
  • Adenine (A) may be included as a nucleotide at a position binding with at least one 8-oxoguanine among the 2nd, 3rd, or 7th nucleotides from the 5' end of the microRNA.
  • the modified nucleic acid is 5'-ACAUUC A -3' (SEQ ID NO: 4), 5'-ACAUU A C-3' (SEQ ID NO: 5), or 5'-A A AUUCC-3 ' (SEQ ID NO: 6).
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene encoding the above-described modified nucleic acid.
  • the present invention provides a modified nucleic acid that specifically binds to a microRNA in which at least one guanine (G) of the 1st to 9th nucleotides from the 5' end is modified with 8-oxoguanine (o 8 G),
  • the modified nucleic acid comprises a polynucleotide complementary to 6 or more consecutive polynucleotides starting from any one of the second and third from the 5' end of the microRNA,
  • a modified nucleic acid comprising adenine (A) as a nucleotide at a position binding with at least one 8-oxoguanine (o 8 G) among the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of the microRNA; or
  • compositions for the treatment of cardiomegaly comprising a recombinant vector comprising a gene encoding the modified nucleic acid.
  • the microRNA may be miR-1, miR-184, let-7f-5p or miR-1-3p.
  • the pharmaceutical composition for the treatment of cardiomegaly may further include an antioxidant.
  • the present invention provides an RNA interference-inducing nucleic acid comprising at least one 8-oxoguanine (o 8 G) in one or more single strands of the double-stranded nucleic acid, wherein the 1st to 9th nucleotides from the 5' end include, liver cancer It provides a pharmaceutical composition for treatment or treatment of glioblastoma.
  • the microRNA in the pharmaceutical composition for treating liver cancer, may be miR-122.
  • the microRNA in the pharmaceutical composition for treating glioblastoma, may be let-7 or miR-124.
  • the pharmaceutical composition for the treatment of liver cancer or glioblastoma may further include an antioxidant.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiomegaly comprising an antioxidant as an active ingredient
  • the antioxidant provides a pharmaceutical composition, characterized in that it inhibits the oxidative transformation of one or more guanine (G) to 8-oxoguanine (o 8 G) among the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of RNA.
  • the antioxidant may be N-acetylcysteine (N-acetylcysteine, NAC) or butyl hydroxyanisole (Butylated hydroxyanisole, BHA).
  • the RNA may be miR-1, miR-184, let-7f-5p or miR-1-3p.
  • the present invention comprises the steps of determining whether at least one guanine (G) among the nucleotides of microRNA expressed in cardiomyocytes of an animal is modified with 8-oxoguanine (o 8 G); and
  • It provides an information providing method for diagnosing cardiomegaly, including the step of classifying as cardiomega when at least one guanine (G) of the nucleotides of the microRNA is modified with 8-oxoguanine (o 8 G).
  • the nucleotide may be the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of the microRNA.
  • the nucleotide may be the 2nd, 3rd or 7th nucleotide from the 5' end of the microRNA.
  • the microRNA may be miR-1, miR-184, let-7f-5p or miR-1-3p.
  • the present invention comprises the steps of (a) operably linking a gene encoding the modified nucleic acid to a promoter to construct a recombinant vector;
  • the present invention comprises the steps of (a) treating a candidate substance in cardiomyocytes of an animal model of cardiac hypertrophy;
  • the screening of a candidate substance for the treatment of cardiomegaly comprising the step of selecting the candidate substance as a therapeutic agent for cardiomegaly provide a way
  • the candidate material may be an antioxidant.
  • the microRNA may be miR-1.
  • the present invention provides a method for inhibiting cardiomegaly comprising administering the modified nucleic acid to a subject.
  • the present invention provides a method for inhibiting liver cancer metastasis or treating glioblastoma comprising administering the RNA interference-inducing nucleic acid to an individual.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cardiomegaly, comprising administering to an individual a composition comprising an antioxidant as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of the modified nucleic acid for inhibiting cardiomegaly.
  • the present invention provides the use of the RNA interference-inducing nucleic acid for inhibiting liver cancer metastasis and treating liver cancer or glioblastoma.
  • the present invention provides a use for preventing or treating cardiomegaly of a composition comprising an antioxidant as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of an antioxidant for the production of a medicament for use in the treatment of cardiomegaly.
  • RNA interference-inducing nucleic acid according to the present invention and a microRNA nucleic acid in which at least one guanine (G) of the 1st to 9th nucleotides from the 5' end is modified with 8-oxoguanine (o 8 G) and specific
  • G guanine
  • o 8 G 8-oxoguanine
  • glioblastoma can be used for diagnosis and development of therapeutic agents for cardiomegaly, liver cancer, or glioblastoma.
  • IP intraperitoneal
  • ISO isoproterenol
  • Figure 1b is a view confirming the mouse heart size change by ISO and NAC treatment.
  • Figure 1c is a view confirming the RNA oxidation action of ROS generated by ISO treatment.
  • Figure 1d is a view showing the result of confirming that the o 8 G modification of microRNA according to PE or ISO treatment in rCMC cells appeared together in Ago2 and o 8 G immunofluorescence staining.
  • Figure 1e is a view showing the immunofluorescence staining results of o 8 G and Ago2 according to PE or ISO treatment in H9c2.
  • 1f is a diagram showing the results of dot blot analysis using o 8 G specific antibody in H9c2 and rCMC cells.
  • FIG. 1G is a diagram showing the results of northwestern analysis in PE-treated H9c2 cells (top of FIG. 1G) and ISO-treated mouse hearts (bottom of FIG. 1G).
  • 1h is a diagram showing the results of dot blot analysis using ⁇ 20nt miRNA gel-extracted for ISO-treated mouse heart.
  • Figure 2a shows a schematic diagram of the o 8 G sequencing method (o 8 G-miSeq).
  • Figure 2b is a diagram showing the immunoprecipitation (Immunoprecipitation, IP) optimization process for o 8 G.
  • Figure 2c is a diagram showing the amount of o 8 G by the optimized IP process.
  • FIG. 2D is a diagram confirming the G>T mutation in cDNA of oxidized miRNA indirectly (top of FIG. 2d) by sequence-specific cleavage of restriction enzyme sites and directly (middle and bottom of FIG. 2d) by sequencing. .
  • Figure 2e is a diagram showing the results of o 8 G-miSeq of oxidized miRNA in H9c2 cells.
  • Figure 2f is a diagram showing the results of Volcano plot analysis in H9c2 cells.
  • Figure 2g is a diagram showing the results of o 8 G-miSeq of oxidized miRNA in rCMC cells.
  • 2h and 2i are diagrams showing the results of o 8 G-miSeq analysis after exposing rCMC and H9c2 cells to serum deficiency.
  • Figure 2j shows the results of o 8 G-miSeq of miRNA oxidized in H 2 O 2 treated H9c2 cells by Wang JX, 2015 (Wang, JX et al. Oxidative Modification of miR-184 Enables It to Target Bcl-xL and Bcl-w. Mol Cell 59, 50-61) is a diagram showing comparison.
  • Figure 3a is a diagram showing the relative amount of o 8 G of miRNA oxidatively induced by PE treatment in rCMC cells.
  • Figure 3b is a diagram showing the relative amount of oxidatively-induced miR-1 and the amount of miR-1 in o 8 G IP in the mouse heart by ISO treatment.
  • 3c and 3d are diagrams confirming the target silencing effect through the o 8 G:A nucleotide sequence of oxidized miR-1.
  • Figure 3e is a view showing the analysis result of the luciferase reporter having a miR-1 oxo site in PE or H 2 O 2 AC16 treated.
  • FIG. 3f is a diagram showing the results of analyzing a double fluorescent protein (dFP) reporter having a miR-1 7oxo site in GFP using flow cytometry in H9c2 cells.
  • dFP double fluorescent protein
  • 3G is a diagram showing the results of analyzing a double fluorescent protein (dFP) reporter having a miR-1 seed site in GFP using flow cytometry in H9c2 cells.
  • dFP double fluorescent protein
  • Figure 3h is a diagram showing miR-1 expression in AC16, H9c2, rCMC, and mouse heart.
  • 3I is a diagram showing the results of analyzing a double fluorescent protein (dFP) reporter having miR-1 7oxo, 3oxo, and 2oxo sites in GFP using flow cytometry in H9c2 cells.
  • dFP double fluorescent protein
  • 3j is a diagram showing the distribution of the size (log 10 (FSC)) and GFP values (log 10 (GFP)) of GFP including the miR-1 7oxo site in H9c2 cells.
  • Figure 3k is a diagram showing the results of dFP reporter quantification using flow cytometry in H9c2 cells.
  • Figure 3l is a view confirming the activity of miR-1:7o 8 G (RFP:GFP-7oxo vs. RFP:GFP, NT) using the dFP reporter assay in H9c2 cells.
  • Figure 3m is a diagram showing the dFP reporter analysis results according to the NAC treatment in H9c2 cells.
  • Figure 3n is a diagram showing the results of analyzing the dFP reporter having a miR-1 7oxo site in RFP using flow cytometry in H9c2 cells.
  • Figure 3o is a diagram showing the dFP reporter analysis results when considering only the limited cell population with the lowest reporter value (RFP) of 25% in H9c2 cells.
  • Figure 3p is a diagram showing the results of luciferase reporter assay having a miR-1 seed site in the presence of 2o 8 G, 3o 8 G, 7o 8 G, and miR-1 in H9c2 cells.
  • Figure 4a is a view confirming the effect of miR-1 expression in PE or NAC-treated rCMC cells.
  • Figure 4b shows miR-1:o 8 G (miR-1:2o 8 G, miR-1:3o 8 G, miR-1:7o 8 G) or miR-1:2U according to an embodiment of the present invention; A diagram confirming the cell size in rCMC cells transfected with miR-1:3U and miR-1:7U.
  • Figure 4c shows oxidized miR-1 (miR-1:2o 8 G, miR-1:3o 8 G, miR-1:7o 8 G) or miR-1:U (miR- 1:2U, miR-1:3U, miR-1:7U) is a diagram showing the results of microscopic observation of transfected H9c2 (scale bar, 50 ⁇ m).
  • Figure 4d is a view confirming the increase in the expression of the cardiac hypertrophy marker ANP by PE and NAC treatment according to an embodiment of the present invention.
  • 4E is a diagram showing the size distribution of H9c2 cells transfected with miR-1:7U.
  • 4f is a time-lapse image of rCMC cells (top of FIG. 4f) and H9c2 cells (bottom of FIG. 4f) transfected with miR-1:7o 8 G or miR-1:7U according to an embodiment of the present invention. the drawing shown.
  • Figure 4g is miR-1, according to one embodiment of the invention: the heart tissue via the effects (FIG top of 4h) and qPCR quantification on cardiac hypertrophy in vivo when injected into the mouse through 7o 8 G tail vein It is a view showing the result of confirming the delivery (bottom of FIG. 4h).
  • Figure 4h is a diagram showing a mouse heart through in vivo delivery of miR-1:7o 8 G according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4i is a view confirming the immunostaining results of the ventricular septum (IS) and expression of cardiomyocytes and ANPs when miR-1:7o 8 G according to an embodiment of the present invention is injected into mice.
  • Figure 5a shows the results of performing a luciferase reporter for a target site that can be recognized when o 8 G modification of miR-122 occurs at the 2nd and 3rd bases in Huh7, a liver cancer cell. It is a figure showing comparison with cells (Huh7:miR-122 KO).
  • Figure 5b shows the result of confirming the presence of the modified let-7 using a luciferase reporter for the 4oxo site that can be recognized when the 4th base of let-7 is modified to o 8 G in glioma cells, HS683. the drawing shown.
  • Figure 5c is when oxidative stress is given by removing fetal bovine serum from glioma cells, HS683, using a luciferase reporter for the 4oxo site that can be recognized when the 4th base of miR-124 is transformed into o 8 G, It is a diagram showing the result of confirming the presence of the modified miR-124.
  • Figure 5d shows that when miR-122 is oxidatively modified with o 8 G in Huh7, a liver cancer cell, cell migration is changed and when miR-122:2,3o 8 G is treated with antioxidant, it is more It is a figure showing the result of observation that exhibits an efficient effect.
  • FIG. 5e is a view showing the results of confirming the function of apoptosis when let-7a:4o 8 G in which the 4th base of let-7 is modified into o 8 G in HS683, a glioma cell, is introduced.
  • FIG. 5f is a view showing the result of confirming the function of apoptosis when mir-124:4o 8 G in which the 4th base of miR-124 is modified into o 8 G in HS683, a glioma cell, is introduced.
  • Figure 6a is a diagram showing the results of Ago HITS-CLIP derived from the left ventricle of the heart of a human cardiomyopathy patient.
  • Figure 6b is a view confirming the frequency of o 8 G:A binding in the Ago-mRNA cluster.
  • FIG. 6c is a view showing the nucleotide sequences of anti-seed and anti-7oxo (top of FIG. 6c) and the result of luciferase reporter analysis (bottom of FIG. 6c) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6d is a diagram showing the miR-1 7oxo target inhibitory activity of anti-7oxo (9x) according to an embodiment.
  • Figure 6e is a view confirming the cardiac hypertrophy inhibitory effect that appears when anti-7oxo (4x) according to an embodiment is introduced into rCMC.
  • 6f is a view confirming the cardiac hypertrophy inhibitory effect that appears when anti-7oxo (4x) RNA or ⁇ -MHC 13x according to an embodiment is injected into ISO-treated mice.
  • Figures confirm the 7o 8 G targeted inhibitory effect (lower end in FIG. 6g):
  • Figure 6g is anti-7oxo ( ⁇ -MHC 13x ) ( upper part of FIG. 6g) myocardial cell size according to the administration of and miR-1 in accordance with one embodiment to be.
  • 6h is a view confirming the effect of administration of anti-7oxo (4x or 13x) according to one embodiment on the rise of ROS in ISO-treated mouse heart.
  • 6i is a view showing a recombinant vector designed to generate a transgenic mouse expressing anti-7oxo ( ⁇ -MHC 13x) according to an embodiment.
  • Figure 6j is a view confirming the expression of anti-7oxo (13x) in mice transformed with the recombinant vector of Figure 5i.
  • Figure 6k is a view confirming the size of the heart in mice transformed with anti-7oxo (13x) according to an embodiment.
  • Figure 6l is a view confirming the overall inhibition of miR-1:7o 8 G target in mice transfected with anti-7oxo (13x) according to an embodiment.
  • 6m is a view confirming the reduction in the size of cardiomyocytes in the ventricular septum (IS) of mice transfected with anti-7oxo (13x) according to an embodiment.
  • Figure 6n shows a schematic diagram of the site-specific oxidation of miR-1:7o 8 G induced by ROS and its cardiac hypertrophy induction process.
  • FIG. 7A is a view confirming that cardiomegaly was successfully induced in an animal model of cardiomegaly according to an embodiment for obtaining a plasma sample.
  • FIG. 7B is a diagram illustrating a process of conducting an experiment after securing a plasma sample in FIG. 6A .
  • 7c is a diagram showing the results of miRNA-1 measurement in plasma samples of cardiomegaly and its control group.
  • FIG. 7d is a view confirming that oxidatively modified microRNA-1 (miR-1:o 8 G) is increased in cardiomegaly as a result of measurement through o 8 G immunoprecipitation in plasma samples of cardiomegaly and its control group.
  • FIG. 8a is a view confirming the reduction of PE-induced cardiac hypertrophy in H9c2 cells following treatment with an antioxidant (N-acetylcysteine, hereinafter NAC) by immunostaining.
  • NAC N-acetylcysteine
  • Figure 8b is a view showing the results of mouse echocardiography by ISO and NAC treatment.
  • Figure 8c is a view showing the results of immunofluorescence staining of o 8 G according to PE and NAC treatment in rCMC and H9c2 cells.
  • FIG. 8d is a view showing the results of suppressing cardiomyocyte hypertrophy by treating H9c2 cells treated with PE or ISO to induce cardiomyocyte hypertrophy by treatment with BHA and Sigma-Aldrich's cell culture antioxidant.
  • Figure 8e is when the anti-miR-1-7oxo according to an embodiment that inhibits miR-1:7o 8 G was introduced into H9c2 cells induced by cardiomyocyte hypertrophy with PE, when treated with NAC, an antioxidant, cardiomyocytes It is a figure confirming that hypertrophy is completely suppressed.
  • nucleotide includes a nitrogen-containing heterocyclic base, a sugar and one or more phosphate groups. These are the monomer units of a nucleic acid sequence.
  • RNA the sugar is ribose
  • DNA it is deoxyribose, a sugar that lacks the hydroxyl group present on ribose.
  • the nitrogen-containing heterocyclic base may be a purine or pyrimidine base.
  • Purine bases include Adenine (A) and Guanine (G), and modified derivatives or analogs thereof.
  • Pyrimidine bases include Cytosine (C), Thymine (T) and Uracil (U), and modified derivatives or analogs thereof.
  • the sugar of the nucleotide is ribose
  • the base includes adenine (A), guanine (G), cytosine (C), or uracil (U).
  • target site refers to a target nucleotide sequence that binds to the second to eighth nucleotide sequences based on the 5' end of the microRNA.
  • seed region refers to a nucleotide sequence between the 1st and 9th positions based on the 5' end of the microRNA.
  • the type of the "cell” includes vertebrates, such as mammals including humans (humans, monkeys, mice, rats, hamsters, cattle, etc.), birds (chickens, ostriches, etc.), amphibians (frogs, etc.), and fish, or invertebrates, such as insects (such as silkworms, moths, fruit flies, etc.), plants, microorganisms such as yeast, and the like, preferably mammals including humans, but are not limited thereto.
  • vertebrates such as mammals including humans (humans, monkeys, mice, rats, hamsters, cattle, etc.), birds (chickens, ostriches, etc.), amphibians (frogs, etc.), and fish, or invertebrates, such as insects (such as silkworms, moths, fruit flies, etc.), plants, microorganisms such as yeast, and the like, preferably mammals including humans, but are not limited thereto.
  • cardiac hypertrophy refers to a condition in which myocardial fibers are enlarged, cardiac weight increases, and ventricular walls are thickened, and cardiac hypertrophy, heart failure, cardiac fibrosis (cardiac fibrosis), mitral valve atresia, Aortic valve atresia, dilated cardiomyopathy, ischemic heart disease, ventricular septal defect, tricuspid valve insufficiency, pulmonary valve atresia, pulmonary arterial hypertension, right ventricular myocardial infarction, cardiomyopathy involving right ventricle, atrial septal defect, atrial fibrillation, hypertrophic It may be an initial symptom of cardiomyopathy or infiltrative cardiomyopathy, but if it is a cardiomegaly related disease in addition to the above diseases, the type is not limited.
  • the term "recombinant" refers to a cell in which the cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide, or a protein encoded by the heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene segments not found in the native form of the cell, either in sense or antisense form.
  • the recombinant cell may express a gene found in a cell in a natural state, but the gene is a modified one and is re-introduced into the cell by artificial means.
  • the term "vector” refers to a DNA construct containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of effecting expression of the DNA in a suitable host.
  • Suitable regulatory sequences include promoters for effecting transcription, optional operator sequences for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate within a cell, and any vector known in the art may be used, for example, a plasmid, a cosmid, a phage particle, or a viral vector.
  • the term "recombinant vector” is used as an expression vector of a target polypeptide capable of expressing the target polypeptide with high efficiency in an appropriate host cell when the coding gene of the target polypeptide to be expressed is operably linked.
  • the recombinant vector may be expressible in a host cell.
  • the host cell may preferably be a eukaryotic cell, and an expression control sequence such as a promoter, terminator, enhancer, etc., a sequence for membrane targeting or secretion, etc. is appropriately selected according to the type of host cell. and can be combined in various ways depending on the purpose.
  • the term "promoter” refers to a nucleic acid sequence that regulates gene expression as a DNA nucleotide sequence site to which transcriptional regulators bind, and is intended to induce overexpression of a target gene.
  • the recombinant vector of the present invention may include an alphaMHC ( ⁇ MHC) promoter, a beta MHC ( ⁇ MHC) promoter, an Nkx2.5 promoter, a cardiac troponin T (TNNT2) promoter, and a muscle creatine kinase (MCK).
  • ⁇ MHC alpha MHC
  • cardiomyocyte-specific refers to a characteristic that is not expressed or expressed to a low degree in cells other than cardiomyocytes, but is expressed to a very high degree in cardiomyocytes.
  • expression refers to a process by which a polypeptide is produced from a structural gene, which process includes transcription of the gene into mRNA and translation of such mRNA into polypeptide(s).
  • the term "transformation” refers to a change in the genetic properties of an organism by directly introducing vector-form DNA into cells physically and chemically or by infecting a host cell with a virus to express a foreign gene, that is, transferring the gene into the host cell. It means to be introduced so that it can be expressed in the host cell.
  • antioxidant serves to prevent oxidative stress in cells and tissues as a substance that prevents excessive production of active oxygen.
  • the antioxidant neutralizes free radicals that cause harmful reactions in cells before they attack DNA or oxidize lipids.
  • antioxidants have high reactivity and react with harmful substances in the body to prevent chain reactions caused by active oxygen, thereby protecting cells.
  • prevention means any action that suppresses or delays the onset of a targeted pathophysiological phenomenon by administration of the composition according to the present invention.
  • treatment means any action in which the symptoms of a target disease are improved or advantageously changed by administration of the composition according to the present invention.
  • MicroRNA is a small RNA composed of ⁇ 21 bases, and functions to induce RNA interference that suppresses gene expression in the post-transcriptional stage of the target gene.
  • MicroRNA recognizes hundreds of target mRNAs through the nucleotide sequence of the seed region (positions 1-8) mainly located at the 5' end, sequencing the nucleotide, and controls biological function by suppressing the expression. Therefore, when the modification of guanine (G) to 8-oxoguanine (o 8 G) occurs at the start region of the microRNA, it is possible through the o 8 G:A nucleotide sequence Due to the nucleotide sequence with the mRNA, it can inhibit new targets, thereby regulating other pathophysiological functions.
  • the oxidative modification occurring in the origin region can be a mechanism regulating the target recognition of naturally or pathologically occurring microRNAs, and based on this, it is possible to develop a technology that can artificially induce or inhibit pathophysiological functions.
  • 8-oxoguanine modification in RNA occurs mainly in degenerative diseases of the human body, and heart disease is also deeply related to this. Therefore, a nucleic acid body based on 8-oxoguanine modification has the potential to control various diseases.
  • the present invention provides an RNA interference inducing nucleic acid comprising at least one 8-oxoguanine (o 8 G) in at least one single strand of the double strand of the nucleic acid, wherein the 1st to 9th nucleotides from the 5' end .
  • the 1st to 9th nucleotides from the 5' end may comprise one or more 8-oxoguanines, both of the double strands of the nucleic acid, i.e., both single strands are the 5' end may include one or more 8-oxoguanines within the 1st to 9th nucleotides from
  • RNA interference inducing nucleic acid is microRNA, small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA, and the group consisting of asiRNA It may be selected from, but is not limited to the above type as long as it is a nucleic acid that induces RNA interference.
  • the 1st to 9th nucleotides from the 5' end may include a sequence of microRNA.
  • microRNA may be one or more of the following group 1 microRNAs:
  • the microRNA may be miR-1, miR-122, let-7 or miR-124.
  • the 8-oxoguanine may be present at a position corresponding to the 2nd, 3rd, 4th, 7th, or a combination thereof from the 5' end of the microRNA.
  • At least one single strand of the double strands of the nucleic acid includes the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of miR-1, of which at least one guanine (G) is 8-oxoguanine (o 8 G) may be substituted, for example, the 8-oxoguanine (o 8 G) is at the position corresponding to the 2nd, 3rd, 7th, or a combination thereof from the 5' end of miR-1 may exist.
  • At least one single strand of the double strands of the nucleic acid includes the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of miR-122, of which at least one guanine (G) is 8-oxoguanine (o 8 G) may be substituted, for example, the 8-oxoguanine (o 8 G) may be present at a position corresponding to the second, third, or combination thereof from the 5' end of miR-122. .
  • At least one single strand of the double strands of the nucleic acid includes the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of let-7 or miR-124, of which at least one guanine (G) is It may be substituted with 8- oxoguanine (o 8 G), for example, the 8-oxoguanine (o 8 G) may be present at the position 4 from the 5' end of let-7 or miR-124. have.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid may recognize a target site by having an o 8 G:A arrangement at the position of 8-oxoguanine (o 8 G).
  • RNA interference inducing nucleic acid may include one or more of the following group 2 polynucleotides:
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (5'p-Uo 8 GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3');
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (5'p-UGo 8 GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3');
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (5'p-UGGAAUo 8 GUAAAGAAGUAUGUAU-3');
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 65 (5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3');
  • Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 66 (5'p-UGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3');
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 (5'p-UAAo 8 GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3').
  • RNA interference-inducing nucleic acid When the above-described RNA interference-inducing nucleic acid is injected into cells or animals, various pathophysiological phenomena can be controlled, for example, myocardial hypertrophy, inhibition of migration of liver cancer cells, or apoptosis can be induced.
  • the RNA interference-inducing nucleic acid comprising the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of miR-1, wherein at least one guanine (G) is substituted with 8-oxoguanine (o 8 G) is a cell or When injected into animals, myocardial hypertrophy may be induced.
  • RNA interference-inducing nucleic acid containing the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of miR-122 and wherein one or more guanine (G) is substituted with 8-oxoguanine (o 8 G) is
  • G guanine
  • o 8 G 8-oxoguanine
  • RNA interference-inducing nucleic acid comprising the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of let-7 or miR-124, wherein at least one guanine (G) is substituted with 8-oxoguanine (o 8 G) , apoptosis can be induced when injected into glioma cells.
  • the present invention provides a composition comprising the above-described RNA interference-inducing nucleic acid and an antioxidant.
  • the antioxidant prevents further oxidation of RNA interference-inducing nucleic acids, that is, further oxidation of guanine (G) to 8-oxoguanine (o 8 G), so that RNA interference-inducing nucleic acids can more effectively control pathophysiological phenomena.
  • G guanine
  • o 8 G 8-oxoguanine
  • the present invention provides a method for position identification of 8-oxoguanine (o 8 G), comprising the following steps:
  • guanine (G) is transformed into 8- oxoguanine (o 8 G) more accurately than the existing position identification method by reverse transcription of RNA to prepare Cdna and sequencing it. location can be identified.
  • the present invention provides a modified nucleic acid that specifically binds to a microRNA in which at least one guanine (G) of the 1st to 9th nucleotides from the 5' end is modified with 8-oxoguanine (o 8 G).
  • the modified nucleic acid is complementary to 6 or more, for example 6, 7 or 8 consecutive polynucleotides starting from any one of the 2nd and 3rd nucleotides from the 5' end of the modified microRNA. comprising a polynucleotide;
  • one or more of the 1st to 9th nucleotides may include adenine (A) as a nucleotide at a position binding with 8-oxoguanine (o 8 G).
  • A adenine
  • o 8 G 8-oxoguanine
  • the modified nucleic acid may specifically bind to microRNA in which at least one guanine (G) of the 2nd, 3rd, or 7th nucleotide from the 5' end is modified with 8-oxoguanine (o 8 G). .
  • G guanine
  • o 8 G 8-oxoguanine
  • the modified nucleic acid comprises a polynucleotide complementary to 6 or more consecutive polynucleotides starting from either the 2nd or 3rd nucleotide from the 5' end of the modified microRNA,
  • It may include adenine (A) as a nucleotide at a position that binds to at least one 8-oxoguanine (o 8 G) among the 2nd, 3rd, or 7th nucleotides from the 5' end of the modified microRNA.
  • A adenine
  • o 8 G 8-oxoguanine
  • the modified nucleic acid may include one or more nucleotide sequences among 5'-ACAUUC A -3', 5'-ACAUU A C-3', and 5'-A A AUUCC-3', but is not limited thereto. .
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a gene encoding the above-described modified nucleic acid.
  • the recombinant vector may include DNA, and the DNA includes a polynucleotide complementary to the polynucleotide of the modified nucleic acid for inhibiting cardiac hypertrophy of the present invention.
  • the base of the modified nucleic acid for inhibiting cardiac hypertrophy is adenine (A), thymine (T) base
  • T thymine
  • T base
  • G guanine
  • C cytosine
  • cardiac hypertrophy inhibition When the base of the modified nucleic acid for cytosine (C) is a guanine (G) base, when the base of the modified nucleic acid for inhibiting cardiac hypertrophy is uracil (U), it may include an adenine (A) base.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cardiomegaly comprising the above-described modified nucleic acid or the recombinant vector.
  • the pharmaceutical composition for the treatment of cardiomegaly is a modification in which one or more guanine (G) of the 1st to 9th nucleotides from the 5' end binds specifically to a microRNA modified with 8-oxoguanine (o 8 G) may contain nucleic acids.
  • the modified microRNA to which the modified nucleic acid specifically binds may be one in which any one of miR-1, miR-184, let-7f-5p, or miR-1-3p is modified.
  • the modified microRNA may be, for example, a modified miR-1, for example, a guanine (G) modified position corresponding to the 2nd, 3rd, 7th, or a combination thereof from the 5' end of miR-1 can be one
  • the pharmaceutical composition for treating cardiomegaly may further include an antioxidant.
  • an antioxidant all antioxidants commonly used in the field may be used, for example, NAC, BAH, or an antioxidant for cell culture (A1345; Sigma-Aldrich) may be further used, but is not limited thereto.
  • the present invention may provide a pharmaceutical composition for the treatment of liver cancer or glioblastoma comprising the above-described RNA interference-inducing nucleic acid.
  • At least one single strand of the double strands of the nucleic acid includes the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of miR-122, of which at least one guanine (G) is 8-oxo It may contain an RNA interference inducing nucleic acid substituted with guanine (o 8 G).
  • guanine (G) located at the 2nd, 3rd or a combination thereof from the 5' end of the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of miR-122 is 8-oxoguanine (o It may include a single strand comprising a nucleotide sequence substituted with 8 G).
  • the pharmaceutical composition for treating glioblastoma includes at least one single strand of the double strands of the nucleic acid including the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of let-7 or miR-124, of which at least one guanine (G ) may include an RNA interference inducing nucleic acid substituted with 8- oxoguanine (o 8 G).
  • guanine (G) positioned at the 4th position from the 5' end of the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of let-7 or miR-124 is 8-oxoguanine (o 8 G) It may include a single strand comprising a nucleotide sequence substituted with .
  • the pharmaceutical composition for the treatment of liver cancer may further include an antioxidant in addition to the RNA interference-inducing nucleic acid
  • the pharmaceutical composition for the treatment of glioblastoma may further include an antioxidant in addition to the RNA interference-inducing nucleic acid.
  • the antioxidant means an antioxidant generally used, for example, NAC, BAH, or an antioxidant for cell culture (A1345; Sigma-Aldrich) may be used, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition for the treatment of liver cancer or glioblastoma further includes an antioxidant, thereby maximizing its function by preventing further oxidation of other guanine (G) in the RNA interference-inducing nucleic acid by active oxygen in the cell.
  • G guanine
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in various forms according to a conventional method and used.
  • it can be formulated in oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, etc., creams, gels, patches, sprays, ointments, warnings, lotions, liniments, pastas, or It can be formulated and used in the form of external preparations for skin such as cataplasma, suppositories, and sterile injection solutions.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the extract, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ) or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate talc are also used.
  • Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to a desired method, and the dosage may vary depending on the patient's condition and weight, and the degree of disease. , depending on the drug form, administration route and time, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, drug activity, and type of the patient's disease; Sensitivity to the drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs and other factors well known in the medical field may be determined.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiomegaly comprising an antioxidant as an active ingredient, wherein the antioxidant is an 8- of at least one guanine (G) among the 1st to 9th nucleotides based on the 5' end of the microRNA.
  • an antioxidant is an 8- of at least one guanine (G) among the 1st to 9th nucleotides based on the 5' end of the microRNA.
  • G guanine
  • a pharmaceutical composition for inhibiting oxidative transformation to oxoguanine (o 8 G) is provided.
  • the antioxidant serves to inhibit the oxidative transformation of the guanine (G) base to 8-oxoguanine (o 8 G), for example, N-acetylcysteine (N-acetylcysteine, NAC), butylhydride Butylated hydroxyanisole (BHA), ascorbic acid (Vitamin C), glutathione, urate, bilirubin, vitamin E, carotenoids, ubiquinone (ubizuinol, Co) -Q10), flavonoids, antioxidant enzyme SOD (superoxide dismutase), catalase, glutathione peroxidase (GSH-PX), glutathione reductase, glutathione transferase transferase), SOD mimetics (CuDIOS), ebselen, lazaroids (21-aminosteroids), captodative olefins, ⁇ -lipoic acid and dihydrolipoic acid
  • NAC N
  • the microRNA may be miR-1, miR-184, let-7f-5p or miR-1-3p.
  • the present invention comprises the steps of determining whether at least one guanine (G) among nucleotides of microRNA isolated from cardiomyocytes of an animal is modified with 8-oxoguanine (o 8 G); and
  • guanine (G) of the nucleotides of the microRNA is modified to 8- oxoguanine (o 8 G), including the step of classifying as cardiomegaly,
  • a method of providing information for diagnosing cardiomegaly is provided.
  • diagnosis means identifying the presence or characteristics of a pathological condition. For the purposes of the present invention, diagnosis is to determine whether or not cardiomegaly has developed.
  • the nucleotide may be the 1st to 9th nucleotides from the 5' end of the microRNA.
  • the nucleotide may be the 2nd, 3rd, or 7th nucleotide from the 5' end of the microRNA.
  • the microRNA may be miR-1, miR-184, let-7f-5p or miR-1-3p.
  • the present invention comprises the steps of (a) operably linking a gene encoding a modified nucleic acid for the inhibition of cardiomegaly to a promoter to construct a recombinant vector;
  • the microRNA may be miR-1, miR-184, let-7f-5p or miR-1-3p, for example, miR-1.
  • the animal may be a non-human primate, a mouse, a dog, a cat, a rabbit, a horse, or a cow.
  • the animal may be a mouse, but if it is a mammal other than a human, the type is not particularly limited.
  • the method of introducing vector-form DNA into cells for example, nucleofection, transient transfection, cell fusion, liposome-mediated transfection (liposem-mediated). transfection), polybrene-mediated transfection, transfection with calcium phosphate (Graham, FL et al., Virology, 52:456(1973)), transfection with DEAE dextran, microinjection Transfection with cationic lipids (Capecchi, MR, Cell, 22:479(1980)), transfection with cationic lipids (Wong, TK et al., Gene, 10:87(1980)), electroporation (Neumann E et al., EMBO) J, 1:841 (1982)), transduction or transfection, as described in Basic methods in molecular biology, Davis et al., 1986 and Molecular cloning: A laboratory manual, Davis et al., 1986). It may be performed according to methods well known to those
  • the present invention comprises the steps of (a) treating a candidate substance in cardiomyocytes of an animal model of cardiac hypertrophy;
  • the screening of a candidate substance for the treatment of cardiomegaly comprising the step of selecting the candidate substance as a therapeutic agent for cardiomegaly provide a way
  • the candidate substance is an unknown substance used for screening in order to examine whether it affects the binding frequency of the polynucleotide with the o 8 G:A sequence target site in cardiomyocytes of an animal model of cardiomegaly.
  • the candidate material may be an antioxidant, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for inhibiting cardiomegaly comprising administering the modified nucleic acid to a subject.
  • the present invention provides a method for inhibiting liver cancer metastasis or treating glioblastoma, comprising administering the RNA interference-inducing nucleic acid to a subject.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cardiomegaly, comprising administering to an individual a composition comprising an antioxidant as an active ingredient.
  • “individual” refers to a subject requiring administration of a composition comprising a modified nucleic acid for inhibiting cardiomegaly or an RNA interference-inducing nucleic acid or an antioxidant for the treatment of liver cancer or glioblastoma, and more specifically refers to mammals such as human or non-human primates, mice, dogs, cats, horses and cattle.
  • administration means a composition comprising a predetermined modified nucleic acid for inhibiting cardiomegaly of the present invention or an RNA interference inducing nucleic acid for the treatment of liver cancer or glioblastoma or an antioxidant by any suitable method. means to do
  • the present invention provides the use of the modified nucleic acid for inhibiting cardiomegaly.
  • the present invention provides the use of the RAN interference-inducing nucleic acid for inhibiting liver cancer metastasis and treating liver cancer or glioblastoma.
  • the present invention provides a use for preventing or treating cardiomegaly of a composition comprising an antioxidant as an active ingredient.
  • rat cardiomyocyte line H9c2 H9c2(2-1), ATCC CRL-1446; H9c2, Korea Cell Line Bank
  • human ventricular cardiomyocyte line AC16 provided by J. Han, H.-W. Lee, and WJPark
  • human cervical adenocarcinoma cell line HeLa ATCC CCL-2
  • FBS fetal bovine serum
  • Welgene 100 U/ml penicillin
  • Welgene 100 ⁇ g/ml streptomycin
  • H9c2 maintained at two different facilities (ATCC and Korea Cell Line Bank) were used, and AC16 was obtained from Dr. M.M. They were obtained from different groups derived from Davidson (scc109, Millipore).
  • rCMC rat neonatal cardiomyocytes
  • ventricular tissue derived from Sprague Dawley rat heart was collected on postnatal day 1 (P1), washed and cut into 3 to 4 mm pieces, stirred at 37° C. in a 50 ml flask, and cells derived from ventricular pieces were subjected to repeated enzymatic reactions (solution provided by the Neomyt kit). Undigested tissue was removed from the obtained supernatant using a strainer, and then plated for 2 hours to remove easily adherent non-cardiomyocytes.
  • non-adherent rCMC was recovered and treated with 10% FBS (Gibco), 5% horse serum (HS; Welgene), 2% L-glutamine (Welgene), and 0.1 mM 5-Bromo-2'-deoxyuridine (Sigma-Aldrich). ), 100 U ml ⁇ 1 penicillin, and a 4:1 mixture of DMEM:M199 (Welgene) supplemented with 100 ⁇ g ml ⁇ 1 streptomycin (Welgene) in SureCoat (sc-9035; Cellutron) culture plates.
  • FBS Gibco
  • HS horse serum
  • Welgene 2% L-glutamine
  • 0.1 mM 5-Bromo-2'-deoxyuridine Sigma-Aldrich
  • rCMC, H9c2 or AC16 are usually treated with 200 ⁇ M phenylephrine (PE) or 10 ⁇ M isoproterenol (ISO) and tested 48 hours after treatment. did. Since serum deficiency is also used as a pretreatment condition for myocardial hypertrophy, the same medium without FBS and HS was replaced 24 hours before treatment. For treatment with antioxidants, 2 mM N-acetylcysteine (NAC) was applied during treatment with PE or ISO.
  • PE phenylephrine
  • ISO isoproterenol
  • transfection or cotransfection of vectors with double miRNA into H9c2, AC16, rCMC or HeLa cells is performed using Lipofectamine 2000 or 3000 (Invitrogen), whereas miRNA or miRNA inhibitors (50 nM) transfection was performed using RNAiMAX (Invitrogen) or Lipofectamine 3000 (Invitrogen) according to the general protocol provided by the manufacturer. To achieve maximum efficiency, the correct number of cells was counted using a Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) and aliquoted into plates prior to transfection.
  • FSC Forward-Scattered Light
  • CM-H 2 DCFDA (Invitrogen) was used. Qubit homogenized lysates prepared in 1x RIPA lysis buffer (DyneBio) supplemented with protease inhibitors (cOmplete, Mini, EDTA-free; Roche) and 2.5 mM deferoxamine mesylate (DFOM; Sigma-Aldrich) Proteins were quantified using the Protein Assay Kit (Invitrogen). 100 ⁇ g of the lysate was incubated with 2 ⁇ M CM-H 2 DCFDA in the dark at 37° C. for 30 minutes. Fluorescence signals were detected by a Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen).
  • DHE Invitrogen
  • H9c2 cells were serum-starved for 24 h and treated with 100 ⁇ M PE until indicated time points. Then, the recovered cells were washed with serum-free DMEM and incubated with 10 ⁇ M DHE at 37° C. for 10 minutes while avoiding light. After incubation, the cells were washed again with serum-free DMEM. ROS images were obtained using an inverted fluorescence microscope (Leica DMi8).
  • H9c2 or rCMC were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA; Biosesang) for 15 min at room temperature. After washing twice with PBS (Biosesang) containing 0.1% NP-40 (Sigma-aldrich), the sample was incubated for 1 hour at room temperature with the addition of 5% bovine serum albumin (BSA; Bovogen). Then, it was washed twice, and the primary antibody was incubated under the following conditions; overnight at 4° C. in PBS with 0.1% NP-40 and 3% BSA; MF20 (1:1000, Developmental hybridoma), o 8 G (15A3, 1:1000, QED Bioscience) and Ago2 (ab5072, 1:200, Abcam).
  • PFA paraformaldehyde
  • BSA bovine serum albumin
  • DAPI 1.5 ⁇ g/ml, Vector lab
  • MF20 was used to stain cardiomyocytes.
  • RNase treatment 10 ⁇ g/ml of RNaseA (Invitrogen) was used at room temperature for 15 minutes before incubating the primary antibody, Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (1:1000, Abcam) and Alexa Fluor 594 donkey anti -rabbit IgG (1:1000, Abcam) was used as a secondary antibody for 1 hour at room temperature in PBS containing 0.1% NP-40. Stained cells were examined with an inverted fluorescence microscope (Leica DMi8), analyzed with Leica Application Suite (LAS), and quantified with ImageJ ( ⁇ 100 cells, https://imagej.nih.gov/).
  • the duplex of miR-1 containing the oxidized derivative is synthesized miR-1 passenger strand (5'p-ACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUA-3' (SEQ ID NO: 8), when confirming delivery, fluorescein isothiocyanate (FITC) is It was produced in vitro under the following conditions by annealing to the 5'end; 90° C. for 2 minutes, 30° C. for 1 hour, and 4° C. for 5 minutes.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • 8 -oxoguanine (o 8 G) in the ribonucleotides was mixed with miR-122 (5'p-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3'; SEQ ID NO: 68), let-7 (5'-pUGAGUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3'; SEQ ID NO: 69) and miR-124 (5'-p UAAGGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3'; SEQ ID NO: 70) was introduced as follows; miR-122:2,3o 8 G, 5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3' (SEQ ID NO: 65); let-74o 8 G: 5'p-UGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3' (SEQ ID NO: 66); miR-124:4o 8 G, 5'-p UAAo 8 GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3' (SEQ ID NO: 67).
  • Duplexes of miR-122, let-7 and miR-124 containing oxidized derivatives were prepared in the same manner as the duplex of miR-1.
  • miR-1 containing a substitution of G>U at the indicated positions was also synthesized (miR-1:2GU, 5'p-UUGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3' (SEQ ID NO: 9); miR-1:3GU, 5'p-UGUAAUGUAAAGAAGUAUGUAU- 3' (SEQ ID NO: 10); miR-1:7GU, 5'p-UGGAAUUUAAAAGAAGUAUGUAU-3' (SEQ ID NO: 11)) was duplexed with the passenger strand of miR-1.
  • NT non-target miRNA
  • C cel-miR-67
  • elegans-specific miRNA provided as a negative control by D. Dharmacon
  • siRNA and duplex guide strand: 5'p-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAdTdT-3' (SEQ ID NO: 13)
  • passenger strand 5'p-UACUCUUUCUAGGAGGUUGUGAdTdT-3' (SEQ ID NO: 14)
  • 'dT' represents thymidine deoxynucleotide
  • NT included a dSpacer (abasic deoxynucleotide; ⁇ ) at position 6 in both the guide and passenger strands as previously reported or 2' at positions 1 and 2 It was further modified to include -O-methyl.
  • o 8 G spike-in (5'p-Uo 8 Go 8 GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'; SEQ ID NO: 17), G spike-in (5'p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'; SEQ ID NO: 18), and miRNA:o 8 G spike-in (5'p-UAAGo 8 GCACGCGGUGAAUGCCAA-3'; SEQ ID NO: 19) was synthesized.
  • anti-seed (2x: 5'-dTdT ⁇ ACAUUCC A ⁇ ACAUUCC A ⁇ dTdT-3'(5'-ACAUUCC-3' is the miR-1 seed site; sequence No.
  • anti-7oxo 2x: 5'-dTdT ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ dTdT-3 ', 4x: 5'- dTAAAUUCC AAAUUCC AG AAAUUCC AC AAAUUCC AdT-3', 9x: 5'-dNdN ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ AAAUUCC A ⁇ dNdN-3';'dN' represents a deoxynucleotide, A, T, C or G (5'-AAAUUCC-3' is the miR-1 7oxo site; No.
  • RNA fractions were isolated using the miRNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the protocol provided by the manufacturer.
  • Minilys Personal Homogenizer (Bertin) or free Homogenizer was used in the presence of 700 ⁇ l Qiazol Lysis Reagent (Qiagen), supplemented with 2.5 mM DFOM (Sigma-aldrich) to prevent oxidation in vitro as previously reported. did.
  • RNA purification For total RNA purification, only Qiazol Lysis Reagent with 2.5 mM DFOM was used after addition of 20% chloroform (Merck), followed by RNA precipitation with isopropyl alcohol and RQ1 RNase free DNase (30 min at 37°C; heat inactivation) solution stop, 65 °C for 10 min; Promega).
  • a spectrophotometer Denovix
  • Qubit fluorescence quantitation Invitrogen
  • RNA denatured in gel loading buffer II (2 min at 90°C; Ambion) was separated by 15% Urea-PAGE gel with the marking of a ⁇ 20nt miRNA marker (synthesized miR-1), the size of which was 14- Cross-confirmed with 30 ssRNA Ladder marker (Takara). Then, after staining with SYBR Gold, ⁇ 20nt size was cut from the gel, and the gel extraction buffer (0.5M ammonium acetate, 10mM magnesium acetate, 0.1% SDS, 1mM EDTA, pH 8.0) was combined with a thermomixer (Thriller) overnight at 65°C. , Peqlab), and further purified with Oligo Clean & Concentrator kit (Zymo).
  • o Colorimetric detection and quantification of 8 G was performed using the OxiSelect Oxidative RNA Damage ELISA kit (Cell Biolabs) according to the manufacturer's protocol.
  • sample preparation purified small RNA or large RNA (0.4-5 ⁇ g) was treated with Nuclease P1 (Wako) at 37° C. for 1 hour, extracted through ethanol precipitation, and for binding of anti-o 8 G antibody , o 8 G/BSA conjugate was added to compete, pre-coated onto plates and then reacted with HRP-conjugated secondary antibody provided in the kit for detection.
  • the absorbance of the sample is a spectrophotometer; was measured by (450nm, GloMax-Multi Detection System Promega), the concentration of the G o 8 was estimated by comparison with a predetermined standard curve G o 8 are shown as relative amounts.
  • HW heart weight
  • BW body weight
  • TL tibia length
  • HW/BW or HW/TL were used as standardized heart sizes. All samples were stored at -80°C until analyzed for ROS measurement, CLEAR-CLIP and RNA extraction followed by o 8 G ELISA, dot blot, Northwestern, IP and qPCR.
  • paraquat Sigma-Aldrich
  • 10 mg/kg paraquat was administered to mice via IP weekly for a total of 4 weeks. Then, RNA was extracted and used for ELISA.
  • Echocardiograms were monitored and recorded under the control of the Animal Imaging Core Facility at Samsung Medical Center. Specifically, mice were initially exposed to 2-5% isoflurane to induce anesthesia and 1% isoflurane while measuring echocardiography (Visual Sonics Vevo 2100 Imaging System) for ⁇ 5 min. was maintained as Under M-mode tracing, a 2-D short-axis was applied to fix individual recording positions, the papillary region of the mouse. Heart rate, including diastolic and systolic wall thickness, left ventricular (LV) dimensions, and LV end-diastolic and end-systolic chamber dimensions were measured.
  • LV left ventricular
  • RNA size-specific RNA (80-300 ng) or gel-purified miRNA (50 ng) were plotted on a Zeta-Probe blotting membrane (Bio-Rad) and optimal cross-linking ( Spectrolinker XL-1000 (Spectroline)) 120 mJ/cm 2 ) were optionally crosslinked by UV irradiation.
  • optimal cross-linking Spectrolinker XL-1000 (Spectroline)
  • UV irradiation 120 mJ/cm 2
  • total RNA was denatured in Gel Loading Buffer II (2 min at 90°C; Ambion) and 15% Novex TBE-Urea gel (Invitrogen) using 22nt miRNA size marker (synthesized miR-1).
  • IP immunoprecipitation
  • o 8 G spike-in a synthetic 20nt-length RNA containing two o 8 G bases (5'p-Uo 8 Go 8 GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3') was compared with G spike-in without o 8 G (5'p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3').
  • beads with anti-o 8 G antibody attached 2.5 ⁇ g of anti-o 8 G antibody (15A3, QED Bioscience) was mixed with 25 ⁇ l of Dynabeads Protein G (Invitrogen) with 200 ⁇ l of anti-o 8 G antibody (15A3, QED Bioscience) for 1 hour at room temperature.
  • wash buffer High detergent, IP buffer (2 times)> PXL (4 times)> PBS (2 times); Add salt, PBS supplemented with 100 mM NaCl (3 times) > PBS (5 times); Serial wash with high salt, TE (15 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA) > TE with high detergent (1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS, and 2.5 mM EGTA) and high salt (1M NaCl)> TE with high detergent and salt (120 mM NaCl)> wash buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl, 150 mM NaCl, 0.05% NP-40); Serial wash with extreme salt, TE> TE with high detergent and high salt> TE with high detergent and extreme salt (2M NaCl)> TE with high detergent and salt> wash buffer.
  • RNA in the beads was purified with 700 ⁇ l of Qiazol Lysis Reagent supplemented with 2.5 mM DFOM and 20% chloroform, and then RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo) was used. Since the size of the spike-in control was 22 nt, the amounts of o 8 G spike-in and G spike-in were measured by quantitative RT-PCR (qPCR) for miRNA, and their relative ratio was signal: noise in the IP process. was used to estimate
  • miRNA qPCR method or TaqMan MicroRNA assay was used. Specifically, 1 ⁇ g of small RNA or IP purified RNA purified by miRNeasy Mini Kit (Qiagen) was polyadenylated in a total volume of 10 ⁇ l using Poly(A) Polymerase (Ambion). Subsequently, the polyadenylated RNA was reverse transcribed using SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen) together with 2 ⁇ M of oligo (dT) adapter primer (5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTVN-3′; SEQ ID NO: 22).
  • qPCR reactions were performed in SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) with forward (same sequence as target miRNA) and reverse primers (5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3'; SEQ ID NO:23); Cycling conditions (95° C. for 5 min; 45 cycles of 95° C. for 15 sec, 55° C. for 15 sec, and 72° C. for 20 sec; and 72° C. for 5 min).
  • U6 snRNA is o 8 G or G spike-in (forward: 5′-TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT-3' (SEQ ID NO: 24), reverse: 5′- GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3′ (SEQ ID NO: 25)) or miRNA:o 8 G spike- in (forward: 5′-TAAGGCACGCGGTGAATGCCAA-3′ (SEQ ID NO: 26), reverse: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC -3′ (SEQ ID NO: 27)), generally a reference control (control, forward: 5′ -CGCTTCGGCAGCACATATAC-3' (SEQ ID NO: 28), reverse: 5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3' (SEQ ID NO: 29)).
  • the protocol provided by the manufacturer was performed. That is, 100ng of small RNA was reverse transcribed using a MicroRNA reverse transcription kit (Applied biosystems) together with a specific RT probe that recognizes each miRNA sequence. With the RT product, qPCR reactions were performed with specific qPCR primers and TaqMan Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG; Invitrogen).
  • RT probes and qPCR primers used to detect specific miRNAs were supplied by the following kits; miR-1b, hsa-miR-1 (ID: 002222) in rCMC; miR-1-3p, rno-miR-1 (ID: 002064) in rCMC; miR-184, has-miR-184 (ID: 000485) in rCMC; let-7f, hsa-let-7f (ID: 000382) in rCMC; miR-1, hsa-miR-1 (ID: 00222) in H9c2, AC16, rCMC and mouse hearts; U6, U6 snRNA (ID: 001973); o 8 G or G spike-in, hsa-miR-1 (ID: 002222); miRNA:o 8 G spike-in, mmu-miR-124a (ID: 001182); NT, cel-miR-67-3p (ID: 000224). All
  • cDNA was prepared by primers (forward: 5'-CCTGGTCCCAGACTAAAGAAT-3') in a PCR reaction (10 sec at 98°C; 30 cycles of 98°C for 10 sec, 40°C for 30 sec, 72°C for 20 sec; and 72°C for 10 min).
  • SEQ ID NO: 31 reverse: 5'-ACTTCAAAGCTCACGGTTCCG-3' (SEQ ID NO: 32); Bioneer) and amplified with Ex Taq (Takara).
  • RT-PCR products were digested with EcoRI (NEB) and separated on a 12% PAGE gel in TBE.
  • RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo
  • a sequencing method (o 8 G-miSeq) was developed to identify oxidized miRNAs and their o 8 G positions.
  • 12.5 ⁇ g of anti-o 8 G antibody (15A3) alternating with 125 ⁇ l of Dynabeads Protein G (Invitrogen) in PBS (total volume 500 ⁇ l) supplemented with 1.2 mg deoxyguanosine (Sigma) at room temperature for 1 hour , QED Bioscience) to prepare an antibody-attached magnetic bead (bead).
  • Dynabeads Protein G was isolated using a DynaMag-2 magnet (Invitrogen).
  • RNA sample purified from miRNeasy Mini Kit (Qiagen) was mixed with beads prepared in 200 ⁇ l of PXL containing 2.5 mM DFOM (Sigma) and 40U recombinant RNase inhibitor (Takara). .
  • TE 15 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA
  • TE with high detergent 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS, and 2.5 mM EGTA
  • high salt 1M NaCl
  • TE with high detergent and extreme salts 2M NaCl
  • TE with high detergent and salt 120 mM NaCl
  • Wash buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl, 150 mM NaCl, 0.05% NP-40. Purified oxidized small RNA on the beads was further processed as it is or after extraction.
  • RNA of the beads was washed twice with PNK buffer (50 mM Tris-Cl pH 7.4, 10 mM MgCl 2 , 0.5% NP-40) and supplemented with 1 mg/ml BSA and 40U recombinant RNase inhibitor (Takara).
  • PNK buffer 50 mM Tris-Cl pH 7.4, 10 mM MgCl 2 , 0.5% NP-40
  • 5'adaptor 5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN (2'-methoxy-C)-3' (SEQ ID NO: 35); Trilink
  • 5'adaptor 5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN (2'-methoxy-C)-3' (SEQ ID NO: 35); Trilink
  • RNA for 1 hour at 28°C in a thermal mixer (Thriller, Peqlab) on beads of a total of 80 ⁇ l of T4 RNA ligase buffer consisting of 8 ⁇ l of T4 RNA ligase (Thermo), 1 mg/ml BSA and 40U recombinant RNase inhibitor.
  • T4 RNA ligase buffer consisting of 8 ⁇ l of T4 RNA ligase (Thermo), 1 mg/ml BSA and 40U recombinant RNase inhibitor.
  • RNA on the beads was reverse transcribed as follows; 1 ⁇ l SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen), 0.72 ⁇ M RT primer (5′-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′; SEQ ID NO: 36), 375 ⁇ M dNTP, 7.25 mM DTT and 4U recombinant RNase inhibitor in a total of 40 ⁇ l 1x first-strand buffer; Incubate for 1 hour at 55°C in a thermal mixer (Thriller, Peqlab). The obtained cDNA was further amplified by PCR to construct a sequencing library.
  • the cDNA sequencing library was also purified from the beads with either input samll RNA (0.4-1 ⁇ g; small RNA-Seq) or o 8 G IP (2.5 mM DFOM and 700 ⁇ l of Qiazol Lysis Reagent supplemented with 20% chloroform), followed by RNA Clean & Concentrator-5 kit) from the extracted product.
  • T4 RNA ligase buffer containing 0.25 ⁇ M 5'adaptor 2 ⁇ l of T4 RNA Ligase (ThermoFisher), 40U recombinant RNase inhibitor, and 1 mg/ml BSA were added to ligate the 5'adaptor, which was 28 Incubated for 60 min at °C and inactivated for 20 min at 65 °C. Ligated total RNA samples were denatured with 1 ⁇ l of 10 ⁇ M RT primer at 70° C.
  • the prepared cDNA was further processed to include the Truseq index adapter sequence (Illumina).
  • cDNA was amplified via PCR using Q5 high-accuracy 2x master mix (NEB) with 100 nM universal forward primer (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'; SEQ ID NO: 37) and 100 nM RT primer; 30 seconds at 98°C; 5 cycles of 10 seconds at 98°C, 30 seconds at 60°C, and 15 seconds at 72°C; and at 72° C. for 10 minutes.
  • NEB high-accuracy 2x master mix
  • the multiplexing barcode 250nM universal forward primer, 250nM barcode primer: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-6mer barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; SEQ ID NO: 38
  • Q5 high-accuracy 2x master mix with the primer set Secondary PCR was performed on the remaining purified primary PCR product to generate.
  • the expected size of the PCR product containing ⁇ 20nt insert was further purified using Pippin Prep (Sage Science) with 15% Urea-PAGE gel extraction (see Example 6) or 3% agarose gel cassette, cross-check together with Qubit RNA HS assay kit (Invitrogen) and Fragment Analyzer (Advanced analytical). Finally, the prepared library was sequenced as 50 single-ended reads by the HiSeq 2500 system (Illumina) and demultiplexed using CASAVA (Illumina).
  • RNA-Seq analysis was performed using the Tuxedo Suite; TopHat2 (http://ccb.jhu.edu/software/tophat), Cufflinks and Cuffdiff (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/). Mapping of sequencing reads to miRNAs was performed using Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net).
  • Demultiplexed sequencing reads were aligned using Bowtie allowing two mismatches (Bowtie --norc -l 7 -n 2 -a -f), and reduced sequencing reads were indexed ( Using bowtie-build indexer with basic parameters), mapped by mature miRNA sequences of the same species in miRBase (http://www.mirbase.org/). The results were further parsed by filtering out reads with mismatch errors, resulting in a quality score of less than 20. The number of reads per miRNA was normalized to total reads (reads per million total reads; RPM) and used as log 2 values (eg log 2 (input) and log 2 (o 8 G IP)).
  • miRNAs sorted by G-content in the sequence number of Gs
  • the relative o 8 G abundance value was compared to PE treatment vs. PE treatment. Calculated from the o 8 G abundance ratio between mocks (untreated). Considering only the cases of mismatches with the highest quality score in base calling, the percentage of mismatches occurring at each position in the miRNA sequence was calculated relative to the total match frequency; Inconsistency (%).
  • Example 17 o Quantification of oxidized miRNA by 8 G IP and qPCR
  • RNA was prepared using miRNeasy Mini Kit (Qiagen). was used for extraction. Then, as cross-confirmation, the same amount of small RNA (2 ⁇ g, PE treated vs. no treatment) measured accurately by both spectrophotometer (Denovix) and Qubit fluorescence quantification (Invitrogen) was mixed with 10 pg miRNA:o 8 G spike- in the presence of o 8 G immunoprecipitation was used.
  • psiCheck-2 Promega
  • pmirGLO vector Promega
  • the miR-1 control site has a mismatch at position 6 (pivot) of the miR-1 seed site by having the same base, where a damaged pivot is reported to lose seed-mediated target inhibition, and thus negative It was constructed to be used as a control.
  • miR-122, let-7 o 8 G variant sequences that can be recognized when generating o 8 G strain on the rim portion of miR-124 in the sequence complementary to the eighth to the 5 'end reference It was prepared by substituting A for the site where this occurred,
  • the psiCheck-2 vector was modified and subcloned to contain 2 or 3 repeats of the target site as follows. First, the firefly gene (hluc+) containing the predicted offset 7oxo site (3:8) was replaced with a different firefly gene (Luc2) that lacks the 7oxo site and is located in the pmirGLO vector (Promega) via the ApaI and XbaI sites.
  • luciferase reporter vectors pmirGLO, psiCheck-2 or modified plasmids thereof containing the desired site
  • synthetic duplex miRNAs 50-75 nM, otherwise specified
  • different concentrations of miRNA (0-100 nM) were transfected into HeLa.
  • Scipy scipy.optimize.curve_fit
  • nonlinear least squares fitting was performed on the sigmoid function to calculate IC 50 .
  • An approximate IC 50 was calculated from the regression line if the least squares did not fit the function.
  • a double fluorescent protein (dFP) reporter vector was constructed based on psiCheck-2 (Promega), and the luciferase gene was replaced with a fluorescent protein gene.
  • the eGFP gene was amplified in pUlta (Addgene; provided by Malcolm Moore) and replaced with hRLuc via NheI and XhoI sites; Forward primer: 5'-TAGGCTAGC CACCATGGTGAGCAAGGGCGA -3' (SEQ ID NO: 49), reverse primer: 5'-GGGCTCGAG CGATCGCCTAGAATTACTTGTACAGCTCGTCCATGC -3' (SEQ ID NO: 50).
  • PCR reactions were performed using PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase (Agilent Technologies) according to the manufacturer's protocol.
  • a converted dFP vector (p.UTA.3.0 Empty provided by Jens Gruber; Addgene plasmid #82447) was used, which was derived from the psiCheck-2 vector, but acGFP substituted hluc+ and RFP substituted hRLuc; As if the reporter and control fluorescent genes were exchanged in dFP.
  • miR-1 seed site, 7oxo site, 2oxo site and 3oxo site were inserted into the dFP or converted dFP vector (p.UTA.3.0) according to the same subcloning method used for psiCheck-2.
  • a fluorescent protein reporter vector was used to measure miRNA-mediated gene repression at the single cell level using flow cytometry.
  • dFP dFP
  • converted dFP dFP
  • a cognate miRNA 50 nM
  • 50 nM miR-1 specific inhibitor obtained from miRIDIAN microRNA hairpin inhibitor (Dharmacon) was also cotransfected.
  • NT neurotrophic factor
  • 200 ⁇ M PE serum-depleted H9c2
  • 2 mM NAC was treated starting at the time of transfection for 24 hours.
  • Cells were harvested in PBS (Biosesang) with 4% BSA (Bovogen) and 5 mM EDTA (Sigma) and analyzed by flow cytometry.
  • PE treatment vs. Cell distribution according to GFP intensity (log 2 (GFP)) or relative GFP ratio (log 2 (GFP/RFP) was shown by comparing no treatment, using cumulative fraction analysis (Scipy, scypy.stats.ks_2samp). KS test performed) was further statistically analyzed.
  • GFP and GFP and Full excitation of all RFPs was achieved.
  • the ranges of GFP and RFP signals were initially selected in scatterplot analysis and estimated by a similar range of vector expression (log 10 for dFP (RFP) and log 10 for converted dFP (GFP); Reporter values (log 10 for dFP (GFP) and log 10 for converted dFP (RFP)) derived from the same entry) were averaged and quantified in relative proportions.
  • the relative fold change was calculated by normalizing the relative proportions to values derived from the same reporter without sites (e.g., the average of the GFP values in each bin of dFP, RFP values is expressed as the value from the site-free control group). To narrow the analysis to only the lowest 25% in reporter expression, the relative fold change was recalculated by using only the cells with the lowest 25% of the reporter value in the bin of each vector expression value.
  • Example 22 Induction of cardiac cell hypertrophy using miR-1:o 8 G
  • NT-6 ⁇ , miR-1, miR-1:7o 8 G, miR-1:2o 8 G, miR-1:3o 8 G, miR-1:7U, miR-1:2U, miR-1:3U H9c2 or rCMC cells were transfected with RNAiMax or Lipofectamine 3000 (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol, and to obtain still images, an inverted microscope (Leica DMi8) was used and ImageJ ( ⁇ 100 cells, https://imagej .nih.gov/). To generate time-lapse images, a Lumascope 400 (Etaluma) was used at 20 min intervals between 0 and 50 h after transfection with miR-1:7o 8 G or miR-1:7U.
  • IV intravenous injection
  • miR-1:7o 8 G (4mg kg -1 ) or miR-1:7U (4mg kg -1 ) was injected
  • NT (1mg kg -1 ) was also injected to confirm delivery to the mouse heart.
  • the cut heart tissue was immediately used for RNA extraction (small RNA and large RNA; miRNeasy Mini Kit, Qiagen), and the amount of transferred NT was measured by qPCR (see detailed method of qPCR for miRNA section) followed by RNA-Seq and qPCR was investigated by analysis. Portions of the amputated hearts were also prepared as tissue sections on slides for immunohistochemical analysis.
  • Dissected mouse heart tissue was fixed (4% paraformaldehyde, 4°C overnight), stored (70% ethanol), embedded in paraffin, cut (cross-section, serial section; 5 ⁇ m width) with haematoxylin and eosin (H&E). dyed.
  • Paraffin-embedded section preparation, H&E staining, and Masson's trichrome staining were performed by the Cardiovascular Product Evaluation Center (Yonsei University College of Medicine, Korea) or the pathology core facility (Seoul National University College of Medicine, Korea) through service subscription. Then, immunofluorescence staining was performed on the prepared slides.
  • Alex Fluor 594-conjugated WGA 50 ⁇ g/ml; Invitrogen
  • DAPI 1.5 ⁇ g/ml; Vector lab
  • Stained tissues were observed with an inverted fluorescence microscope (Leica DMi8; 20x or 40x magnification), analyzed with Leica Application Suite (LAS) and quantified with ImageJ ( ⁇ 100 cells, https://imagej.nih.gov/).
  • TG cardiomyocyte-specific transgenic mice
  • the anti-7oxo ( ⁇ -MHC 13x) plasmid was digested using BamHI to separate the transgenic cassette.
  • Gel-purified transformation cassettes were injected into the nucleus of mouse fertilized eggs prepared from superovulated C57BL/6 female mice (induced by PMSG and HCG) after mating. Thereafter, mouse embryos (fertilized single-celled fertilized eggs) were transplanted into pseudopregnant female mice (Korea Bio Co. Ltd, Seoul, Korea).
  • both anti-7oxo TG (+) mice had a primer set corresponding to hGH poly (A) (forward: 5'-CCACCAGCCTTGTCCTAATAAA-3' (SEQ ID NO: 55), reverse: 5'-CAGCTTGGTTCCCAATAGA-3' (SEQ ID NO: 56))) by PCR analysis of genomic DNA (purified from the ends).
  • A forward: 5'-CCACCAGCCTTGTCCTAATAAA-3' (SEQ ID NO: 55), reverse: 5'-CAGCTTGGTTCCCAATAGA-3' (SEQ ID NO: 56)
  • RNA-Seq libraries were generated from whole or large RNA using adapter ligation-based methods or strand-displacement stop/ligation methods.
  • adapter ligation-based method 100 ng of total RNA (miRNeasy Mini Kit; purified by Qiagen) was applied to the TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina) using NeoPrep (Illumina) according to the manufacturer's protocol; Sample Names: H9C2-NT-N1, H9C2-miR-1-2o 8 G-N1, H9C2-miR-1-3o 8 G-N1.
  • TruSeq Stranded mRNA Libraries were constructed, sequenced and demultiplexed by Omega Bioservices (Norcross, GA, USA); Sample names: H9C2-NT-O1, H9C2-NT-O2, H9C2-miR-1-7o 8 G-O1, H9C2-miR-1-7o 8 G-O2.
  • RNA-Seq library was prepared for 10 ng of purified mRNA using the SENSE Total RNA-Seq library kit (Lexogen) according to the manufacturer's instructions.
  • the libraries were amplified by PCR with the lowest optimal cycle, which was determined by comparing the results of different cycles or by performing qPCR as described in the method of o 8 G-miSeq in Example 14 above.
  • the quality of the amplified library was confirmed by using a Fragment Analyzer (Advanced analytical) for size distribution and quantity. If necessary, urea-PAGE gel extraction or Pippin Prep (Sage Science) was further used for size selection.
  • the prepared multiplexed library was accurately quantified using the Qubit RNA HS analysis kit (Thermo Fisher) and the Fragment Analyzer and applied to be sequenced by the HiSeq 2500 system (Illumina) as 50 single-ended reads.
  • mm9 mouse genome
  • rn5 rat genome
  • Cufflinks -Nb Cufflinks
  • the putative miR-1:o 8 G target was selected as a transcript containing the miR-1 oxo site at the 3'UTR (defined by RefSeq downloaded from the UCSC genome browser), where the miR-1:o 8 G All 6mers matching positions 2-8 of o 8 G:A instead of o 8 G:C were normally investigated unless otherwise indicated.
  • No site refers to a transcript that does not contain a miR-1 seed site and an oxo site in the mRNA sequence.
  • Constant site denotes a transcript containing a miR-1 control site in the 3'UTR, and the nucleotide binding o 8 G at the oxo site was substituted with G as used as a negative control in the previous study.
  • KS test was performed using Scipy (scypy.stats.ks_2samp) for total mRNA or cont sites.
  • the Volcano plot was analyzed by calculating the fold change and significance (-log 10 (p-value)). Among them, the differentially expressed gene (DEG) was selected using the cutoff.
  • Ago HITS-CLIP results from left ventricular tissue of cardiomyopathy patients were retrieved from the GEO database (GSE83410).
  • Reads containing miRNA sequences were identified with two mismatch tolerances by 'reverse' mapping from Bowtie (alignment of mature miRNA sequences to sample reads), and positional mismatches of miRNA reads were analyzed for miR-1.
  • miR-1 oxo sites were compared to miR-1 seed sites mediated by G:U binding, as provided by a previous study (Spengler, RM et al., Nucleic Acids Res 44, 7120-7131)
  • Ago2 binding clusters were analyzed.
  • the seed site of miR-124 a brain-specific miRNA, was used as a negative control because it was not present in cardiac tissue.
  • a non-nucleated bulge site of miR-1 was also used as a negative control.
  • raw sequencing data of Ago HITS-CLIP was processed by CLIPIck. Specifically, the FASTQ file was initially filtered and reduced (fastq2collapse.pl) based on the quality score (fastq_filter.pl -f mean:0-24:20). The preprocessed reads were then aligned to the human genome (hg19) using the NovoAlign program (http://www.novocraft.com) with the same parameters.
  • the aligned Ago CLIP reads were generated as BED or BAM files using BedTools and SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/) and human heart ( Derived from RNA-Seq Atlas, http://medicalgenomics.org/rna_seq_atlas) was used for peak analysis with expression profile feed.
  • BedTools and SAMtools http://samtools.sourceforge.net/
  • human heart Derived from RNA-Seq Atlas, http://medicalgenomics.org/rna_seq_atlas
  • UCSC genome browser http://genome.ucsc.edu/
  • Mouse heart tissue ( ⁇ 150 mg) dissected from ISO-treated or PBS-treated mice was crushed and UV irradiated (400 mj/cm 2 , 3 times; Spectrolinker XL-1000) to share in RNA-protein complexes in vivo. Crosslinking was induced.
  • Ago-associated fragment mRNA processed by treatment with 50 ⁇ U/ ⁇ l RNAse A (affymetrix) at 37° C. for 5 minutes, was obtained from two different anti-Ago antibodies (2A8; Diagenode, 2E12) attached to 60 mg of Dynabeads Protein A (Invitrogen); Abnova) was immunoprecipitated with 10 ⁇ g.
  • Ligation to generate miRNA-targeted mRNA chimeras was performed by treatment with 0.625 U/ ⁇ l T4 RNA ligase 1 (NEB) at 16°C overnight, 3% DMSO (Sigma) and 18% PEG8000 (Sigma) at 25°C for 75 min.
  • RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo
  • RNA-Seq Library Prep kit Lexogen
  • HiSeq 2500 system Illumina
  • Sequencing reads were preprocessed and mapped, and after adapter sequences were removed, potential chimeric reads containing miRNA sequences were identified by 'reverse' mapping, where the mature miRNA sequences were reverse aligned to the sample library using Bowtie. The remaining sequences were then mapped to the mouse genome (mm9), further selected for only those overlapping the combined exons from both the 2A8 and 2E12 antibodies, and ultimately focused only on miR-1 containing the chimeric readout.
  • control vector anti-NT was anti-7oxo ( ⁇ -MHC 13x) except that it contained the binding site of a non-targeting siRNA (NT) derived from cel-miR-67 (C. elegans-).
  • NT non-targeting siRNA
  • the pJG/ALPHA MHC vector was provided by Jeffrey Robbins (Addgene plasmid #55594) to Dr. Da-Zhi Wang.
  • Other competitive miRNA inhibitors were synthesized from RNA (see RNA synthesis methods).
  • Serial injections were performed three times on days 1, 2 and 5, and on day 7 all mice were sacrificed and the heart was examined.
  • RT-qPCR of an anti-7oxo transcript comprising hGH poly (A) forward: 5'-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT-3' (SEQ ID NO: 61), reverse: 5'-CCAGCTTGGTTCCCAATAGA-3' (SEQ ID NO: 62)
  • A forward: 5'-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT-3'
  • reverse: 5'-CCAGCTTGGTTCCCAATAGA-3' SEQ ID NO: 62
  • a poly (A) tailing-based miRNA qPCR method was performed using anti-7oxo (4x) (forward, 5'-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT). -3'; SEQ ID NO: 63) with specific primers.
  • o 8 G IP and then miR-1 qPCR were performed as described in the “Quantification of oxidized miRNA by o 8 G IP and qPCR” method, but as follows: There were some variations as well; For bead preparation, 3 ⁇ g of anti-o 8 G antibody (15A3, QED Bioscience), 30 ⁇ l of Dynabeads Protein G (Invitrogen), and 300 ⁇ g of deoxyguanosine (dG, Sigma-Aldrich) in 150 ⁇ l of PXL; In IP culture, 2 ⁇ g of small RNA sample and 1 pg of o 8 dG RNA spike-in (miR-124-3p:4o 8 dG: 5' in 250 ⁇ l of PXL containing 2.5 mM DFOM and 40U recombinant RNase inhibitor (Takara)) p-UAAGo 8 dGCACGCGGUGAAUGCC-3'; SEQ ID NO: 64).
  • PhastCons results for mammals were obtained from the UCSC genome browser (http://genome.ucsc.edu), with a score of 0.9 or greater and a conservation rate (number of conserved motifs/ was used only when calculated as the number of all motifs; %).
  • RNA was specifically isolated through antibody sedimentation (IP) as described in Example 11, and miR-1 was quantified through qPCR.
  • miR-1 o quantitative modified to 8 G's 8:00 immunoprecipitation experiments using antibodies
  • G o G 8 is a DNA form of miR-124-3p in the synthesis of 1pg fifth: 4o 8 dG (UAAGo 8 dGCACGCGGUGAAUGCC -3'; SEQ ID NO: 64) was added together and measured by qPCR and corrected.
  • the H9c2 rat cardiomyocyte cell line was treated with an ⁇ -adrenergic receptor (AR) agonist (phenylephrine; PE), and pathophysiological hypertrophy stimulation by PE treatment, ROS generation, and miRNA oxidation were confirmed.
  • AR ⁇ -adrenergic receptor
  • PE phenylephrine
  • ROS fluorescent dye DHE
  • Serum deprivation an established prerequisite for stimulating adrenergic hypertrophy, also enhances the expanded phenotype with high basal ROS levels.
  • RNA was isolated according to size (based on 200 nucleotides), and 8-oxoguanine (8-oxoguanine, o 8 G) induced by ISO treatment was measured using ELISA with an o 8 G-specific antibody. As a result of the measurement, as shown in FIG. 1c , it was confirmed that about 3.1 times more o 8 G was generated from small RNA than from large RNA. This was shown to be more rapid than large RNA (1.8 fold), even when large RNA was subjected to oxidative stress induced by paraquat (PQ) treatment.
  • PQ paraquat
  • Ago2 Argonaute2
  • o 8 G which are key proteins of the RNA-induced silencing complex
  • cardiac hypertrophy is redox-dependent and enables the generation of ROS, which induces o 8 G modification of miRNA.
  • the IP process for o 8 G was extensively improved by adopting the conditions used for CLIP, as shown in Fig. 2b, and the optimized IP as shown in Fig. 2c compared to the non-specific background (non-oxidized G) ⁇ 3000 times the amount of synthesis o 8 G was shown.
  • 8 G can pair with A, the efficacy of inducing G>T mutations in cDNA was enhanced to reach ⁇ 50-60%, which was obtained as shown in Fig. This was demonstrated indirectly by specific cleavage (top in Fig. 2d) and directly by sequencing (middle and bottom in Fig. 2d).
  • IP was specifically demonstrated to be performed by not observing any bias from the amount and G-content of miRNA, and miR as shown in FIG. 2f showing significance (-log 10 (P-value)) as a Volcano plot.
  • o 8 G was significantly high (P ⁇ 0.01), and it was confirmed that it was significant in the seed region (positions 2, 3 and 7) based on the G>T mutation rate.
  • o 8 G IP miRNA according to PE treatment :o 8 G
  • miR-1 showed the most dramatic improvement ( ⁇ 2.5-5 fold), and was also confirmed in ISO-treated hypertrophic mouse heart despite down-regulation after ISO treatment, as shown in FIG. 3b .
  • the synthesized miR-1:2o 8 G, miR-1:3o 8 G and miR-1:7o 8 G oxo sites can be recognized as G;A sequences upon corresponding oxidative transformation. It was confirmed that targets with (2oxo, 3oxo and 7oxo sites) could be silenced, which was not inhibited by miR-1.
  • Detecting miR-1:o 8 G-dependent inhibition at the individual H9c2 cell level, as shown in Figure 3g, despite the low expression level of endogenous miR-1 (probably due to the fate heterogeneity of the cardiomyocyte line shown in Figure 3h) could. All miR-1 oxo sites (7oxo, 3oxo, and 2oxo sites) of the dFP reporter were miR-1:o 8 G positions (2, 3 and 7) observed by o 8 G-miSeq (Fig. 2f). Endogenous inhibition with sensitivity to detect inhibition mediated by a basal level of -1:o 8 G was confirmed in FIG. 3i, and was confirmed by transfecting a miR-1 inhibitor or a cognate miR-1 mutant.
  • the dFP reporter detected significant PE-dependent inhibition of miR-1 7oxo sites in hypertrophic H9c2 as shown in Fig. 3j.
  • Fig. 3l compared to the no site dFP reporter (RFP:GFP, NT) are shown in Fig. 3k. miR by endogenous levels of miR-1:7o 8 G (RFP:GFP-7oxo vs. RFP:GFP, NT) and its activation (RFP:GFP-7oxo, mock vs. NAC) by NAC treatment shown in FIG. 3M
  • the assay was scrutinized by validating inhibition of -1.
  • the hypertrophy induced by miR-1:7o 8 G or miR-1:7U as shown in the qPCR measurement result shown in FIG. 4d was atrial artrial natriuretic peptide (ANP), known as a cardiac hypertrophy marker, as observed in PE treatment. was significantly increased.
  • APP atrial artrial natriuretic peptide
  • miR-1:7o 8 G was injected as a polyethylenimine (PEI) complex with non-targeting control (NT) via tail vein (top of Fig. 4g) and cardiac tissue by quantitative PCR (qPCR). delivery was verified (bottom of FIG. 4G).
  • PI polyethylenimine
  • NT non-targeting control
  • qPCR quantitative PCR
  • interventricular septum interventricular septum, IS
  • MF20 was used for cardiomyocytes
  • DAPI was used for nuclear staining.
  • a liver cancer cell line derived from hepatocytes that specifically express a lot of miR-122, the second (2oxo), third (3oxo), or Whether the 2nd and 3rd is o 8 G modified (2oxo, 3oxo) was confirmed by making a luciferase reporter.
  • the luciferase reporter experiment was performed using a psi-check2 (Promega) vector to include 5 target sites that can be recognized by binding in an o 8 G:A sequence at the tip of miR-122. , were measured after transfection in Huh7.
  • let-7 For let-7, a luciferase report for the 4th o 8 G site (4oxo: 5'-CUAC A UCA-3') was prepared in the same way as before, and the result of measurement in glioblastoma HS683 Although the degree of inhibition was smaller than that of the starting site of let-7 (seed: 5'-CUACCUCA-3'), it was confirmed that it was significantly inhibited (P ⁇ 0.01) compared to the control group, and the results are shown in FIG. 5B .
  • the 2nd, 3rd, or 2nd 3rd is o 8 G modified together, and in glioblastoma, the 4th base of let-7 is o 8 G
  • o 8 G modification of the 4th base occurs, inhibiting the expression of the newly recognized target gene. confirmed that it is possible.
  • miR-122 is the second and third o the 8 G variation in the hepatoma cell line Huh7 (miR-122: 2,3 8 G) hayeoteumeuro observed that it is this, the oxidation miR-122 effects on the movement ability of the liver cells
  • miR-122:2,3o 8 G 5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3', SEQ ID NO: 65
  • miR-122:2,3o 8 G introduced into the cell has a possibility that other guanine is additionally oxidized by the free radicals in the cell, so that its function is somewhat reduced (see FIG. 8e ).
  • the antioxidant Sigma-Aldrich Corp. antioxidant supplement
  • let-7:4o 8 G an o 8 G modified microRNA identified in glioblastoma
  • it was synthesized in the form of siRNA (let-7:4o 8 G: 5'p-UGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT- 3', SEQ ID NO: 66)
  • apoptosis was measured through Attune NxT flow cytometry using eBioscience Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Invitrogen).
  • the oxidized miR-1 target site represented by o 8 G:A binding through positions 2, 3, or 7 was observed significantly more than expected as shown in Fig. 6b (P ⁇ 0.01, chi-square test), G:U binding ( ⁇ 10%), and an average of ⁇ 18% exceeding the control site ( ⁇ 7%).
  • miR-1:7o 8 G loss of function was assessed.
  • Adopting the concept from miRNA sponge, a competitive inhibitor synthesized as RNA to retain seed-mediated tandem repeats of target sites, miR-1 (anti-seed) and miR-1 as in FIG. 6c: 7o 8 G (anti-7oxo) was prepared (top of FIG. 6c) and tested for their specific inhibition (bottom of FIG. 6c).
  • the inhibitory activity of anti-7oxo (9x) was confirmed to completely inhibit the miR-1 7oxo target in serum-deficient H9c2 by performing RNA-Seq (see Table 8) as shown in FIG. 6d .
  • anti-7oxo (4x) was introduced into rCMC and was shown to attenuate PE-induced hypertrophy.
  • Anti-7oxo (4x and ⁇ -) injected into ISO-treated mice also as synthesized anti-7oxo (4x) RNA or as cardiomyocyte-specific expression vector ( ⁇ -MHC 13x) containing 13 target sites MHC 13x) both strongly antagonized adrenergic cardiac hypertrophy, as shown in FIG. 6f, and the degree of delivery of anti-7oxo ( ⁇ -MHC 13x) was confirmed and correlated with their inhibitory activity. .
  • transgenic mice expressing anti-7oxo were generated (TG), and their expression was confirmed as shown in Table 10 and Fig. 6j (RNA-Seq) .
  • FIG. 6n a schematic diagram of the site-specific oxidation of miR-1:7o 8 G according to the present invention induced by ROS and its cardiac hypertrophy induction process is shown in FIG. 6n .
  • o 8 G-IP was performed on small RNA isolated from plasma ( FIG. 7b ).
  • human miR-124-3p synthesized as DNA at position 5 of o 8 G was added to the small RNA sample in an equal amount before immunoprecipitation.
  • microRNA-1 measured by qPCR in plasma did not differ between cardiomegaly and the control group, but oxidatively modified microRNA-1 (miR-1:o 8 G) was measured by o 8 G-IP-qPCR. As a result, it was confirmed that there was a significant increase in cardiac hypertrophy, and through this, it was observed that it was possible to non-invasively diagnose cardiac hypertrophy through blood-based miR-1:o 8 G measurement.
  • results may be caused by the effect of antioxidants acting synergistically with anti-7oxo(4x), and may additionally be caused by active oxygen increased by PE treatment after introducing anti-7oxo(4x) into cells. It may be the effect of blocking the oxidation of o8G in anti-7oxo (4x). In fact, for an additional o 8 G generated up from RNA artificially introduced into the cell see if that is the effect is inhibitory, and this time miR-1 non-PE process that the active oxygen generation: the cardiomyocyte hypertrophy in 7o 8 G introduced In order to induce and simultaneously apply oxidative stress, 100 ⁇ M of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) was treated ( FIG. 8e , lower panel).
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • the antioxidant treatment can inhibit myocardial cell hypertrophy if it can exhibit antioxidant effects such as not only NAC but also BHA and other general antioxidants for cell culture. It was found that the treatment can effectively induce the regulation of cardiomyocyte size through artificial RNA expression by preventing additional oxidative modifications that may occur in the o 8 G-modified microRNA or RNA that inhibits it. In particular, cardiomegaly appears as both physiological and pathological hypertrophy. Physiological hypertrophy is when an athlete or pregnant woman enlarges the heart in order to supply it smoothly when sufficient blood supply is needed. Temporary inductions may be necessary for reinforcement purposes.
  • the induction of cardiac hypertrophy by introduction of miR-1:7o 8 G into cardiomyocytes may act as such physiological hypertrophy, and the antioxidant treatment at this time can effectively induce the effect of cardiomyocyte hypertrophy, and in general, pathological hypertrophy. It may have the effect of inhibiting pathological cardiomegaly by preventing additional oxidative stress that causes adverse events.

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Abstract

본 발명에서는 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5' 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산 및 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산을 제조하여 세포 또는 마우스에 투여하였을 때 다양한 병리생리학적 현상이 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 산화 스트레스로 인해 마이크로RNA의 발단지역 (seed region)에서 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 산화 변형이 일어난 마이크로RNA의 역전사를 통해 제조된 cDNA에서 G>T로 변형이 일어난 위치를 동정하여, 8-옥소구아닌으로 산화 변형이 일어난 위치를 확인하였다.

Description

8-옥소구아닌을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산, 8-옥소구아닌을 포함하는 마이크로RNA와 결합하는 변형 핵산 및 이들의 이용
본 발명은 8-옥소구아닌을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산, 8-옥소구아닌을 포함하는 마이크로RNA에 특이적으로 결합하는 변형 핵산 및 이들을 이용한 약학조성물, 재조합 동물 모델, 약물의 스크리닝 방법, 질병의 진단 방법 및 병리생리학적 현상을 조절하는 방법 등에 관한 것이다.
세포가 병리생리학적 변화를 겪게 되면, 일반적으로 산화스트레스가 발생하고 이로 인하여 활성산소 (reactive oxygen species; ROS)가 발생된다. 발생된 활성산소는 큰 반응성으로 인하여 여러 생물학적 구성체를 변형시키는데, 그 중에서 가장 손쉽게 변형되는 것이 RNA이다. 특히, 산화 변형되는 RNA 염기 중에서 가장 손쉽게 많이 일어나는 것이 구아닌(Guanine; G) 염기가 산화 변형되어 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형되는 것이다.
한편, 심장 질환은 암을 포함하여 우리나라 성인의 3대 사망질환 중 하나로, 그 발병 과정의 여러 병리적 스트레스가 심장 조직의 크기에 변화를 일으켜 심비대증(cardiac hypertrophy)을 유발하는 것으로 시작하며, 심비대증은 심근세포의 크기, 단백질의 합성속도 증가 등의 특징을 나타낸다. 심비대증은 점차적으로 심근섬유화 및 심부전증을 유도하여, 최종적으로는 심장기능상실 (또는 심부전: heart failure)로 나타난다. 특히, 심부전의 경우는 특히 사망률이 50% 전후로 매우 높기 때문에 궁극적으로는 심근비대증을 예방하거나 치료법을 개발하려는 연구들이 진행되고 있으며, 따라서 이에 대한 질환 모델을 구축하는 것이 필요하다.
한국등록특허공보 제1481007호
본 발명자들은 산화 스트레스로 인해 마이크로RNA의 발단지역 (seed region)에서 구아닌 (Guanine; G) 염기가 8-옥소구아닌 (8-oxoguanine; o8G)으로 산화 변형이 일어난 경우, o8G:A 배열을 통해 표적 서열과 결합하는 것을 확인하였으며, 상기 마이크로RNA의 역전사를 통해 제조된 cDNA에서 G>T로 변형이 일어난 위치를 동정함으로써 8-옥소구아닌으로 산화 변형이 일어난 위치를 확인하였다.따라서, 이를 기반으로 마이크로RNA에서 구아닌(G)을 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환한 RNA 간섭 유도 핵산을 제조하여 세포 또는 마우스에 투여하였을 때 다양한 병리생리학적 현상이 유도되는 것을 확인하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서는 RNA 간섭을 유도하는 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 8-옥소구아닌(o8G)의 위치 동정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산 및 상기 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 변형 핵산 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 심비대증 치료용 약학 조성물 및 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 구현예는 항산화제를 유효성분으로 포함하는 심비대증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 심비대증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또 다른 구현예는 심비대증 저항성 동물 모델의 제작방법 및 심비대증 저항성 동물 모델을 제공한다.
또 다른 구현예는 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 5'말단으로부터 1번째 내지 9번재 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 마이크로 RNA는 하기 그룹 1의 마이크로RNA 중 하나 이상일 수 있다:
[그룹 1]
miR-1, miR-184, let-7f-5p, miR-1-3p, miR-122, let-7, miR-124.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 8-옥소구아닌(o8G)의 위치에서 o8G :A배열이 일어나는 표적 사이트를 인식할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥은 하기 그룹 2의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[그룹 2]
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p- UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-Uo8Go8GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3');
서열번호 66의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5' p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3'); 및
서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5' p- UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3').
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 세포 또는 동물에 주입할 경우 심근비대, 간암세포의 이동 억제 또는 세포사멸이 유도될 수 있다.
본 발명은 상술한 RNA 간섭 유도 핵산 및 항산화제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 8-옥소구아닌(o8G)의 위치 동정 방법을 제공한다:
(a) 세포로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 RNA로부터 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 항-o8G 항체를 이용하여 면역침강법(IP)으로 분리하는 단계;
(c) 상기 분리한 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 역전사하여 cDNA를 제조하고 8-옥소구아닌의 위치를 파악하기 위한 시퀀싱 라이브러리를 제작하여 시퀀싱하는 단계; 및
(d) 상기 시퀀싱 결과 구아닌 (Guanine; G)이 티민 (Thymine; T)으로 변형된 위치를 확인하여 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌 (o8G)으로 변형된 위치를 동정하는 단계.
또한, 본 발명은 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산으로서,
상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함하는 변형 핵산을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 변형 핵산과 특이적으로 결합하는 상기 마이크로RNA는 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 것이고,
상기 변형 핵산은 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 또는 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(A)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 변형 핵산은 5’-ACAUUCA-3’(서열번호 4), 5’-ACAUUAC-3’(서열번호 5), 또는 5’-AAAUUCC-3’(서열번호 6)의 염기 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산으로서,
상기 변형 핵산은 마이크로RNA의 5'말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나로부터 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함하는 변형 핵산 또는
상기 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 심비대증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 심비대증 치료용 약학 조성물은 항산화제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는, 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 간암치료용 약학 조성물은 상기 마이크로RNA가 miR-122일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 교모세포종 치료용 약학 조성물은 상기 마이크로RNA가 let-7 또는 miR-124일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물은 항산화제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 심비대증 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 항산화제는 RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)의 8-옥소구아닌(o8G)으로의 산화 변형을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 항산화제는 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC) 또는 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
또한, 본 발명은 동물의 심근 세포에서 발현되는 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형되어 있는지 여부를 확인하는 단계; 및
상기 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형되어 있는 경우 심비대증으로 분류하는 단계를 포함하는, 심비대증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 재조합 벡터를 동물의 수정란에 도입시키는 단계; 및
(c) 상기 수정란을 대리모에 이식한 후 수정란을 발생시켜 형질전환 동물 모델을 수득하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델의 제작 방법 및 상기 방법으로 제작된, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 심비대증 동물 모델의 심근 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 심비대증 동물 모델의 심근 세포에서 발현되는 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 구아닌(G)의 8-옥소구아닌(o8G)으로의 변형 빈도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 8-옥소구아닌(o8G)이 후보물질을 처리하지 않은 경우에 비해 감소할 경우, 상기 후보물질을 심비대증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는, 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 후보물질은 항산화제일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 마이크로RNA는 miR-1일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변형 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심비대증 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간암 전이 억제 또는 교모세포종 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심비대증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변형 핵산의 심비대증 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 간암 전이 억제 및 간암 치료 또는 교모세포종 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 심비대증 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제의, 심비대증 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산 및 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형된 마이크로RNA 핵산과 특이적으로 결합하는 변형 핵산을 이용하여 세포 또는 동물의 병리생리학적 현상을 조절할 수 있다.
구체적으로는 심비대증, 간암 또는 교모세포종 등의 진단 및 치료제 개발 등에 활용할 수 있다.
도 1a는 마우스 (n=7)에 75mg/kg 이소프로테레놀(isoproterenol, ISO)를 2일마다 29일 동안 복강 내 (I.P) 주사한 것을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 1b는 ISO 및 NAC 처리에 의한 마우스 심장 크기 변화를 확인한 도면이다.
도 1c은 ISO 처리에 의해 생성된 ROS의 RNA 산화 작용을 확인한 도면이다.
도 1d는 rCMC 세포에서 PE 또는 ISO 처리에 따른 마이크로RNA의 o8G 변형을 Ago2와 o8G의 면역형광염색에서 함께 나타나는 것으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1e는 H9c2에서 PE 또는 ISO 처리에 따른 o8G 및 Ago2의 면역형광염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 1f은 H9c2 및 rCMC 세포에서 o8G 특이적 항체를 사용한 도트 블롯 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 1g는 PE 처리된 H9c2 세포 (도 1g의 상단) 및 ISO 처리된 마우스 심장 (도 1g의 하단)에서의 northwestern 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 1h는 ISO 처리된 마우스 심장에 대해 겔 추출된 ~20nt miRNA를 이용하여 도트 블롯 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 o8G 시퀀싱 방법 (o8G-miSeq)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2b는 o8G에 대한 면역 침강 (Immunoprecipitation, IP) 최적화 프로세스를 나타낸 도면이다.
도 2c는 최적화된 IP 프로세스에 의한 o8G의 양을 나타낸 도면이다.
도 2d는 산화된 miRNA의 cDNA에서 G>T 변이를 제한 효소 부위의 서열-특이적 절단에 의해 간접적으로 (도 2d의 상단) 및 시퀀싱에 의해 직접적으로 (도 2d의 가운데 및 하단) 확인한 도면이다.
도 2e는 H9c2 세포에서 산화된 miRNA의 o8G-miSeq 결과를 나타낸 도면이다.
도 2f는 H9c2 세포에서의 Volcano plot 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2g는 rCMC 세포에서 산화된 miRNA의 o8G-miSeq 결과를 나타낸 도면이다.
도 2h 및 2i는 rCMC, H9c2 세포를 혈청 결핍에 노출시킨 후 o8G-miSeq 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2j는 H2O2 처리된 H9c2 세포에서 산화된 miRNA의 o8G-miSeq 결과를 Wang JX, 2015 년 결과 (Wang, J. X. et al. Oxidative Modification of miR-184 Enables It to Target Bcl-xL and Bcl-w. Mol Cell 59, 50-61)와 비교해 나타낸 도면이다.
도 3a는 rCMC 세포에서 PE 처리에 의해 산화 유도된 miRNA의 상대적인 o8G의 양을 나타낸 도면이다.
도 3b는 마우스 심장에서 ISO 처리에 의해 산화 유도된 miR-1의 상대적인 양 및 o8G IP에서의 miR-1의 양을 나타낸 도면이다.
도 3c 및 3d는 산화된 miR-1의 o8G:A 염기 배열을 통한 표적 침묵 효과를 확인한 도면이다.
도 3e는 PE 또는 H2O2 처리된 AC16에서 miR-1 oxo 사이트를 갖는 루시퍼라제 리포터의 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3f는 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용하여 GFP에 miR-1 7oxo 사이트를 가지는 이중 형광 단백질 (dFP) 리포터를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3g는 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용하여 GFP에 miR-1 seed 사이트를 가지는 이중 형광 단백질 (dFP) 리포터를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3h는 AC16, H9c2, rCMC, 마우스 심장에서의 miR-1 발현을 나타낸 도면이다.
도 3i는 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용하여 GFP에 miR-1 7oxo, 3oxo, 2oxo 사이트를 가지는 이중 형광 단백질 (dFP) 리포터를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3j는 H9c2 세포에서 miR-1 7oxo 사이트를 포함하는 GFP의 크기 (log10(FSC)) 및 GFP 값 (log10(GFP))의 분포를 나타낸 도면이다.
도 3k는 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용한 dFP 리포터 정량 결과를 나타낸 도면이다.
도 3l은 H9c2 세포에서 dFP 리포터 분석을 이용한 miR-1:7o8G (RFP:GFP-7oxo vs. RFP:GFP, NT)의 활성을 확인한 도면이다.
도 3m은 H9c2 세포에서 NAC 처리에 따른 dFP 리포터 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3n은 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용하여 RFP에 miR-1 7oxo 사이트를 가지는 dFP 리포터를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3o는 H9c2 세포에서 리포터 값 (RFP)이 25%로 가장 낮은 제한된 세포 집단만 고려할 때의 dFP 리포터 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3p는 H9c2 세포에서 2o8G, 3o8G, 7o8G, 및 miR-1의 존재 하에 miR-1 seed 사이트를 가지는 루시퍼라제 리포터 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 PE 또는 NAC 처리된 rCMC 세포에서 miR-1 발현의 효과를 확인한 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:o8G (miR-1:2o8G, miR-1:3o8G, miR-1:7o8G) 또는 miR-1:2U, miR-1:3U, miR-1:7U로 형질감염된 rCMC 세포에서 세포 크기를 확인한 도면이다.
도 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 산화된 miR-1 (miR-1:2o8G, miR-1:3o8G, miR-1:7o8G) 또는 miR-1:U (miR-1:2U, miR-1:3U, miR-1:7U)로 형질감염된 H9c2의 현미경 관찰 결과를 나타낸 도면이다 (scale bar, 50μm).
도 4d는 본 발명의 일 구현예에 따른 PE 및 NAC 처리에 의한 심장 비대 마커 ANP의 발현 증가를 확인한 도면이다.
도 4e는 miR-1:7U로 형질감염된 H9c2 세포의 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 4f는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:7o8G 또는 miR-1:7U로 형질감염 시킨 rCMC 세포 (도 4f의 상단) 및 H9c2 세포 (도 4f의 하단)의 시간 경과 이미지를 나타낸 도면이다.
도 4g는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:7o8G를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입하였을 때 생체 내에서 심장 비대에 미치는 영향 (도 4h의 상단) 및 qPCR 정량을 통해 심장 조직으로의 전달을 확인한 결과 (도 4h의 하단)를 나타낸 도면이다.
도 4h는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:7o8G의 생체 내 전달을 통한 마우스 심장을 나타낸 도면이다.
도 4i는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:7o8G를 마우스에 주입하였을 때 심실중격 (IS)의 면역염색 결과 및 심근세포와 ANP 발현을 확인한 도면이다.
도 5a는 간암세포인 Huh7에서 miR-122의 o8G 변형이 2번째와 3번째 염기에서 발생했을 때 인식할 수 있는 표적 싸이트에 대한 루시퍼라제 리포터를 수행한 결과를 Huh7에서 miR-122를 제거한 세포(Huh7:miR-122 KO)와 비교하여 나타낸 도면이다.
도 5b는 신경교종 세포인 HS683에서 let-7의 4번째 염기가 o8G로 변형되었을 때 인식할 수 있는 4oxo site에 대한 루시퍼라제 리포터를 사용하여, 변형된 let-7의 존재를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5c는 신경교종 세포인 HS683에서 우태혈청을 제거하여 산화스트레스를 주었을 때, miR-124의 4번째 염기가 o8G로 변형되었을 때 인식할 수 있는 4oxo site에 대한 루시퍼라제 리포터를 사용하여, 변형된 miR-124의 존재를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5d는 간암세포인 Huh7에 miR-122가 o8G로 산화 변형된 형태를 도입했을 때, 세포의 이동이 달라지는 것과 miR-122:2,3o8G이 항산화제와 함께 처리했을 때, 더 효율적인 효과를 나타내는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5e는 신경교종 세포인 HS683에서 let-7의 4번째 염기가 o8G로 변형된 let-7a:4o8G를 도입했을 때 세포사멸이 일어나는 기능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5f는 신경교종 세포인 HS683에서 miR-124의 4번째 염기가 o8G로 변형된 mir-124:4o8G를 도입했을 때 세포사멸이 일어나는 기능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 인간 심근병증 환자 심장의 좌심실 유래 Ago HITS-CLIP 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 Ago-mRNA cluster에서 o8G:A 결합의 빈도를 확인한 도면이다.
도 6c는 본 발명의 일 구현예에 따른 anti-seed 및 anti-7oxo의 염기 서열 (도 6c의 상단) 및 이에 대한 루시퍼라제 리포터 분석 결과 (도 6c의 하단)를 나타낸 도면이다.
도 6d는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (9x)의 miR-1 7oxo 표적 억제 활성을 나타낸 도면이다.
도 6e는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (4x)를 rCMC에 도입했을 때 나타나는 심장 비대 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 6f는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (4x) RNA 또는 α-MHC 13x 를 ISO-처리된 마우스에 주입하였을 때 나타나는 심장 비대 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 6g는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (α-MHC 13x)의 투여에 따른 심근 세포 크기 (도 6g의 상단) 및 miR-1:7o8G 타겟 억제 효과(도 6g의 하단)를 확인한 도면이다.
도 6h는 ISO 처리 마우스 심장에서 일 구현예에 따른anti-7oxo (4x 또는 13x) 투여가 ROS 상승에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 6i는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (α-MHC 13x)를 발현하는 형질전환 마우스를 생성하기 위해 설계한 재조합 벡터를 나타낸 도면이다.
도 6j는 도 5i의 재조합 벡터로 형질전환시킨 마우스에서 anti-7oxo (13x) 발현을 확인한 도면이다.
도 6k는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (13x)로 형질전환된 마우스에서 심장 크기를 확인한 도면이다.
도 6l은 일 구현예에 따른 anti-7oxo (13x)로 형질전환된 마우스에서 miR-1:7o8G 표적의 전체적인 억제를 확인한 도면이다.
도 6m은 일 구현예에 따른 anti-7oxo (13x)로 형질전환된 마우스의 심실 중격 (IS)에서 심근 세포의 크기 감소를 확인한 도면이다.
도 6n은 ROS에 의해 유도된 miR-1:7o8G의 위치 특이적 산화 및 이의 심장 비대 유도 과정에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
도 7a 는 혈장 샘플을 얻기 위한 일 구현예에 따른 심비대증 동물 모델에서 심비대증이 성공적으로 유도되었음을 확인한 도면이다.
도 7b 는 도 6a에서 혈장 샘플을 확보한 후 실험을 진행하는 과정을 설명한 도면이다.
도 7c 는 심비대증 및 그 대조군의 혈장 샘플에서 miRNA-1을 측정한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7d 는 심비대증 및 그 대조군의 혈장 샘플에서 o8G 면역 침강을 통해 측정한 결과 심비대증에서 산화 변형된 microRNA-1 (miR-1:o8G)이 증가됨을 확인한 도면이다.
도 8a는 H9c2 세포에서 항산화제 (N-acetylcysteine, 이하 NAC) 처리에 따른 PE에 의해 유도된 심장 비대의 감소를 면역염색으로 확인한 도면이다.
도 8b은 ISO 및 NAC 처리에 의한 마우스 심초음파 결과를 나타낸 도면이다.
도 8c는 rCMC 및 H9c2 세포에서 PE 및 NAC 처리에 따른 o8G의 면역형광염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 8d는 PE 또는 ISO를 처리하여 심근세포 비대를 유도한 H9c2 세포에 BHA와 Sigma-Aldrich사의 세포배양용 항산화제를 처리하여 심근세포 비대를 억제한 결과를 관찰한 도면이다.
도 8e는 PE로 심근세포 비대가 유도된 H9c2세포에 miR-1:7o8G을 억제하는 일 구현예에 따른 anti-miR-1-7oxo를 도입하였을 때, 항산화제인 NAC를 처리한 경우 심근세포 비대가 완전히 억제되는 것을 확인한 도면이다.
본 발명에서 용어 "뉴클레오타이드"는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당 및 하나 이상의 포스페이트기를 포함한다. 이들은 핵산 서열의 단량체 유닛이다.
RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉, 리보스에 존재하는 하이드록실기를 결여하는 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(Adenine; A) 및 구아닌(Guanine; G), 및 그들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 사이토신(Cytosine; C), 티민(Thymine; T) 및 유라실(Uracil; U), 및 그들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 뉴클레오타이드의 당은 리보스이고, 염기로는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 또는 유라실(U)을 포함한다.
본 발명에서 용어 "표적 사이트(target site)"는 마이크로 RNA의 5’ 말단을 기준으로, 2번째부터 8번째의 염기 서열과 결합하는 표적 염기 서열을 의미한다.
본 발명에서 "발단 지역(seed region)"은 마이크로RNA의 5' 말단 기준 1번째부터 9번째 사이의 염기 서열을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 “세포”의 종류는 척추동물, 예컨대 인간을 비롯한 포유동물(인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 소 등), 조류(닭, 타조 등), 양서류(개구리 등), 및 어류, 또는 무척추동물, 예컨대 곤충류(누에, 나방, 초파리 등), 식물, 효모와 같은 미생물 등이 포함되며, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "심비대증 (cardiac hypertrophy)"은 심근섬유가 비대한 결과, 심중량의 증가, 심실벽이 비후된 상태를 말하며, 심장비대증, 심부전증, 심섬유증 (cardiac fibrosis), 승모판막 폐쇄부전증, 대동맥판막 폐쇄부전증, 확장성 심근병증, 허혈성 심장 질환, 심실 중격 결손증, 삼첨판막 폐쇄부전증, 폐동맥판막 폐쇄부전증, 폐동맥 고혈압, 우심실 심근경색, 우심실을 침범하는 심근병증, 심방중격 결손증, 심방 세동, 비후성 심근증 또는 침윤성 심근증의 초기증상일 수 있으나, 상기 질환들 외에 심비대증과 관련된 질환이라면 그 종류에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 수행할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미한다. 적합한 조절 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promotor), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로모터 (promotor)"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위로 유전자 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, 목적 유전자의 과발현을 유도하기 위한 것이다. 예컨대, 본 발명의 재조합 벡터는 알파MHC (αMHC) 프로모터, 베타 MHC (β MHC) 프로모터, Nkx2.5 프로모터, 심근 트로포닌 T (cardiac troponin T; TNNT2) 프로모터, 근육 크레아틴 키나아제 (muscle creatine kinase; MCK) 프로모터, 인간 알파-골격 액틴 (human α-skeletal actin; HAS) 프로모터, 및 뮤린 줄기세포 바이러스 (murine stem cell virus; MSCV) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터가 작동 가능하게 연결되어 심근 세포 특이적 발현을 조절할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 알파MHC (αMHC) 프로모터가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있으나, 상기 프로모터의 종류에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "심근 세포 특이적"이란 용어는 심근 세포 이외의 세포에서는 발현되지 않거나 낮은 정도로 발현되는 반면, 심근 세포에서는 매우 높은 정도로 발현되는 특징을 의미한다.
본 발명에서 용어 "발현"은 폴리펩타이드 (polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭하며, 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 해독을 포함한다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 벡터 형태의 DNA를 세포에 물리화학적으로 직접 도입하거나 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 외래 유전자를 발현시킴으로써 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉, 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "항산화제"는 활성산소의 과량 생산을 막아주는 물질로서 세포와 조직에 있어 산화적 스트레스를 방지하는 역할을 한다. 상기 항산화제는 세포 내에서 해로운 반응을 일으키는 free radical이 DNA를 공격하거나, 지질을 산화시키기 전에 그들을 중화시킨다. 또한, 항산화제는 반응성이 높아 체내 유해물질과 반응하여 활성산소에 의한 연쇄반응을 막아 주어 세포를 보호하는 역할을 한다.
본 발명에 있어서, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 타겟으로 하는 병리생리학적 현상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 타겟으로 하는 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
마이크로RNA(miRNA)는 ~21개의 염기로 구성된 작은 RNA로써, 표적 유전자의 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 기능을 한다. 마이크로RNA는 주로 5'말단에 위치하는 발단지역 (seed region, positions 1-8)의 염기서열을 통해 수백 개의 표적 mRNA를 인식하여 염기 배열하고 그 발현을 억제하여 생물학적 기능을 조절한다. 따라서, 마이크로RNA의 발단지역에 구아닌(Guanine; G)의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로의 변형이 발생할 경우, 이로 인해 가능하게 된 o8G:A 염기 배열을 통해 다른 mRNA와의 염기 배열로 인해 새로운 표적을 억제할 수 있으므로, 다른 병리생리학적 기능을 조절할 수 있다.
즉, 발단지역에 발생한 산화 변형은 자연적 또는 병리적으로 발생하는 마이크로RNA의 표적체 인식을 조절하는 기작일 수 있으며, 이를 기반으로 인위적으로 병리생리학적 기능을 유도하거나 억제할 수 있는 기술 개발이 가능하다. 이전부터 RNA에서 일어나는 8-옥소구아닌 변형은 주로 인체의 노화 과정과 관련된 질환군 (degenerative disease)에서 많이 발생한다고 알려져 왔으며, 심장질환 또한 이와 관련이 깊다. 따라서 8-옥소구아닌 변형을 기반으로 한 핵산체는 여러 다양한 질병을 조절할 수 있는 가능성이 있다.
본 발명은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
상기 핵산의 이중 가닥 중 하나의 단일 가닥에서 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌을 포함할 수 있고, 상기 핵산의 이중 가닥 모두, 즉 두 개의 단일 가닥 모두 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 내에 하나 이상의 8-옥소구아닌을 포함할 수 있다.
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA, 및 asiRNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, RNA 간섭을 유도하는 핵산이라면 상기 종류에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 마이크로 RNA는 하기 그룹 1의 마이크로RNA 중 하나 이상일 수 있다:
[그룹 1]
miR-1, miR-184, let-7f-5p, miR-1-3p, miR-122, let-7, miR-124.
예컨대, 상기 마이크로 RNA는 miR-1, miR-122, let-7 또는 miR-124일 수 있다.
일 예로, 상기 8-옥소구아닌(o8G)은 마이크로RNA의 5'말단으로부터 2번째, 3번째, 4번째, 7번째 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 miR-1의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 것일 수 있으며, 예컨대 상기 8-옥소구아닌(o8G)은 상기 miR-1의 5'말단으로부터 2번째, 3번째, 7번째 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 miR-122의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 것일 수 있으며, 예컨대 상기 8-옥소구아닌(o8G)은 상기 miR-122의 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 것일 수 있으며, 예컨대 상기 8-옥소구아닌(o8G)은 상기 let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 4번에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 8-옥소구아닌(o8G)의 위치에서 o8G:A 배열이 일어나 표적 사이트(target site)를 인식할 수 있다.
일 예로, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 하기 그룹 2의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
[그룹 2]
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p- UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-Uo8Go8GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3');
서열번호 66의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3');
서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p- UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3').
상술한 RNA 간섭 유도 핵산은 세포 또는 동물에 주입할 경우, 다양한 병리생리학적 현상을 조절할 수 있으며, 예를 들어, 심근비대, 간암세포의 이동 억제 또는 세포사멸(apoptosis) 등이 유도될 수 있다.
일 예로, miR-1의 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산은, 세포 또는 동물에 주입할 경우 심근비대가 유도될 수 있다.
일 예로, miR-122의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하고 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산은, 간암세포에 주입할 경우 간암세포의 이동 억제가 유도될 수 있다.
일 예로, let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하고 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산은, 신경교종 세포에 주입할 경우 세포사멸이 유도될 수 있다.
본 발명은 상술한 RNA 간섭 유도 핵산 및 항산화제를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 항산화제는 RNA 간섭 유도 핵산의 추가적인 산화, 즉 추가적인 구아닌(G)에서 8-옥소구아닌(o8G)으로의 산화를 방지하여 RNA 간섭 유도 핵산이 더욱 효과적으로 병리생리학적 현상을 조절할 수 있도록 한다. 상기 항산화제는 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 항산화제를 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)의 위치 동정 방법을 제공한다:
(a) 세포로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 RNA로부터 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 항-o8G 항체를 이용하여 면역침강법(IP)으로 분리하는 단계;
(c) 상기 분리한 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 역전사하여 cDNA를 제조하고 8-옥소구아닌(o8G)의 위치를 파악하기 위한 시퀀싱 라이브러리를 제작하여 시퀀싱하는 단계; 및
(d) 상기 시퀀싱 결과 구아닌 (Guanine; G)이 티민 (Thymine; T)으로 변형된 위치를 확인하여 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌 (o8G)으로 변형된 위치를 동정하는 단계.
상기 8-옥소구아닌(o8G)의 위치 동정 방법은 RNA를 역전사하여 Cdna를 제조하고 이를 시퀀싱함으로써, 기존의 위치 동정 방법보다 정확하게 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 위치를 동정할 수 있다.
또한, 본 발명은 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산을 제공한다.
상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상, 예를 들어, 6개, 7개 또는 8개 의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 변형 핵산은 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로 RNA와 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 또는 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(A)을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 변형 핵산은 5’-ACAUUCA-3’, 5’-ACAUUAC-3’, 5’-AAAUUCC-3’중 하나 이상의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상술한 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 DNA를 포함할 수 있으며, 상기 DNA는 본 발명의 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예컨대, 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 염기가 아데닌(A)일 경우 티민(T) 염기, 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 염기가 구아닌(G)일 경우 사이토신(C) 염기, 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 염기가 사이토신(C)일 경우 구아닌(G) 염기, 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 염기가 유라실(U)일 경우 아데닌(A) 염기를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 변형 핵산 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 심비대증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 예로, 상기 심비대증 치료용 약학 조성물은 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산을 포함할 수 있다.
상기 변형 핵산이 특이적으로 결합하는 상기 변형된 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p 중 어느 하나가 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 마이크로 RNA는, 예컨대 miR-1이 변형된 것일 수 있으며, 예컨대 miR-1의 5'말단으로부터 2번째, 3번째, 7번째 또는 이들의 조합에 해당하는 위치의 구아닌(G) 변형된 것 일 수 있다.
일 예로, 상기 심비대증 치료용 약학 조성물은 항산화제를 더 포함할 수 있다. 상기 항산화제는 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 항산화제를 모두 사용할 수 있으며, 예컨대 NAC, BAH 또는 세포배양용 항산화제(A1345; Sigma-Aldrich)를 더 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상술한 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
일 예로, 상기 간암치료용 약학 조성물은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 miR-122의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 miR-122의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 이들의 조합에 위치하는 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 염기 서열을 포함하는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 교모세포종 치료용 약학 조성물은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 5'말단으로부터 4번째에 위치하는 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 염기 서열을 포함하는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 간암치료용 약학 조성물은 RNA 간섭 유도 핵산 이외에도 항산화제를 더 포함할 수 있으며, 상기 교모세포종 치료용 약학 조성물도 마찬가지로 RNA 간섭 유도 핵산 이외에 항산화제를 더 포함할 수 있다. 상기 항산화제는 일반적으로 사용되는 항산화제를 의미하며, 예컨대 NAC, BAH 또는 세포배양용 항산화제(A1345; Sigma-Aldrich)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물은 항산화제를 더 포함함으로써, RNA 간섭 유도 핵산이 세포내의 활성산소에 의해 다른 구아닌(G)이 추가적으로 산화하는 것을 방지하여 그 기능을 극대화할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 피부 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 이 때, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 심비대증 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 항산화제는 마이크로RNA의 5’말단 기준 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)의 8-옥소구아닌(o8G)으로의 산화 변형을 억제하는, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항산화제는 구아닌(G) 염기가 8-옥소구아닌(o8G)으로 산화 변형되는 것을 억제하는 역할을 하며, 예컨대 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC), 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA), 아스코르브산 (ascorbic acid, Vitamin C), 글루타티온 (glutathione), 우레이트 (urate), 빌리루빈 (bilirubin), 비타민 E, 카로티노이드 (carotenoids), 유비퀴논 (ubizuinol, Co-Q10), 플라보노이드 (flavonoids), 항산화효소인 SOD (superoxide dismutase), 카탈라제 (catalase), 글루타티온 퍼옥시다아제 (glutathione peroxidase, GSH-PX), 글루타티온 리덕타아제 (glutathione reductase), 글루타티온 트랜스퍼라아제 (glutathione transferase), SOD 모사체 (CuDIOS), 엡셀렌 (ebselen), 라자로이드 (lazaroids, 21-aminosteroids), 포획성 올레핀 (captodative olefins), α-리포산 (α-lipoic acid)과 디하이드로리포산 (dihydrolipoic acid)(DHLA), 5-HTP (hydroxytryptophan), DHEA (dehydroepiandrosterone), 아미노산, 본초 항산화제 (herbal antioxidants), 및 미네랄로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC) 또는 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA)일 수 있으나, 상기 항산화제의 종류에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
또한, 본 발명은 동물의 심근 세포로부터 분리된 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형되어 있는지 여부를 확인하는 단계; 및
상기 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형되어 있는 경우 심비대증으로 분류하는 단계를 포함하는,
심비대증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 심비대증의 발병 여부를 확인하는 것이다.
일 예로, 상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 예로, 상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 예로, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 심비대증 억제를 위한 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 재조합 벡터를 동물의 수정란에 도입시키는 단계; 및
(c) 상기 수정란을 대리모에 이식한 후 수정란을 발생시켜 형질전환 동물 모델을 수득하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델의 제작 방법 및 상기 방법으로 제작된 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델을 제공한다.
일 예로, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있으며, 예컨대 miR-1일 수 있다.
예컨대, 상기 동물은 비-인간인 영장류, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 말 eh는 소일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 동물은 마우스일 수 있으나, 인간을 제외한 포유류라면 그 종류에 특별히 제한이 없다.
본 발명에 있어서, 벡터 형태의 DNA를 세포에 도입하는 방법으로는 특별히 제한이 없으며, 예컨대 뉴클레오펙션 (nucleofection), 일시적인 형질감염 (transient transfection), 세포 융합, 리포좀 매개된 형질감염 (liposem-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 인산칼슘을 이용한 형질감염 (Graham, FL 등, Virology, 52:456(1973)), DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염 (Capecchi, MR, Cell, 22:479(1980)), 양이온성 지질에 의한 형질감염 (Wong, TK 등, Gene, 10:87(1980)), 전기천공법 (Neumann E등, EMBO J, 1:841(1982)), 형질도입 또는 트랜스펙션과 같이 문헌 (Basic methods in molecular biology, Davis 등, 1986 및 Molecular cloning: A laboratory manual, Davis 등, 1986)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 이뤄질 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 심비대증 동물 모델의 심근 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 심비대증 동물 모델의 심근 세포에서 발현되는 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 구아닌(G)의 8-옥소구아닌(o8G)으로의 변형 빈도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 8-옥소구아닌(o8G)이 후보물질을 처리하지 않은 경우에 비해 감소할 경우, 상기 후보물질을 심비대증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는, 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 심비대증 동물 모델의 심근 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 o8G:A 배열 표적 사이트와의 결합 빈도에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미하며, 화학물질, 단백질, (폴리)뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA (small interference RNA), 또는 천연물 추출물 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 항산화제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 변형 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심비대증 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간암 전이 억제 또는 교모세포종 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심비대증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "개체"는 심비대증 억제를 위한 변형 핵산 또는 간암치료 또는 교모세포종 치료를 위한RNA 간섭 유도 핵산 또는 항산화제를 포함하는 조성물의 투여를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에 있어서, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 심비대증 억제를 위한 변형 핵산 또는 간암치료 또는 교모세포종 치료를 위한RNA 간섭 유도 핵산 또는 항산화제를 포함하는 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 변형 핵산의 심비대증 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RAN 간섭 유도 핵산의 간암 전이 억제 및 간암 치료 또는 교모세포종 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 심비대증 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 배양, 약물 처리 및 형질감염
1. 세포 배양
랫트(rat) 심근 아세포주 H9c2 (H9c2(2-1), ATCC CRL-1446; H9c2, 한국 세포주 은행), 인간 심실 심근 세포주 AC16 (J. Han, H.-W. Lee, 및 W.J.Park 제공), 및 인간 자궁 경부 선암종 세포주 HeLa (ATCC CCL-2)를 10% 소 태아 혈청 (FBS; Gibco), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin, Welgene)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Hyclone)에서 37℃, 5% CO2 배양 조건으로 성장시켰다.
결과의 일관성을 위해 두 개의 서로 다른 시설 (ATCC 및 한국 세포주 은행)에서 유지되는 H9c2의 여러 가지 다른 무리(batch)를 사용하였으며, AC16은 Dr. M.M. Davidson으로부터 제공받아(scc109, Millipore) 유래된 각각 다른 무리로부터 얻었다.
랫트 신생아 심근 세포 (rCMC)의 1 차 배양은 제조사의 프로토콜에 따라 Neomyt kit (nc-6031; Cellutron)를 사용하여 Seok, H. Y. et al. Circ Res 114, 1585-1595. 및 Huang, Z. P. et al. Circ Res 112, 1234-1243.에 전술한 바와 같이 준비하였다.
즉, 출생 후 1 일 (P1)에 Sprague Dawley 랫트 심장 유래 심실 조직을 수집한 후, 세척하고 3 내지 4mm 조각으로 잘랐으며, 37℃에서50ml 플라스크에서 교반하고, 심실 조각 유래 세포를 반복된 효소 반응 (Neomyt kit에 의해 제공된 용액)에 의해 완전히 분리시켰다. 수득한 상층액에서 strainer를 이용하여 소화되지 않은 조직을 제거한 다음, 초기에 2 시간 동안 플레이팅하여 쉽게 부착되는 비 심근 세포를 제거하였다. 마지막으로, 부착되지 않은 rCMC를 회수하고 10% FBS (Gibco), 5% 말 혈청 (HS; Welgene), 2% L-glutamine (Welgene), 0.1mM 5-Bromo-2'-deoxyuridine (Sigma-Aldrich), 100 U ml-1 페니실린, 및 100 μg ml-1 스트렙토마이신(Welgene)이 보충된 DMEM:M199 (Welgene)의 4:1 혼합물과 함께 SureCoat (sc-9035; Cellutron) 배양 플레이트에서 유지하였다.
2. 약물 처리
아드레날린성 비대를 유도하기 위해, 달리 지시되지 않는 한, rCMC, H9c2 또는 AC16을 일반적으로 200μM 페닐에프린(phenylephrine, PE) 또는 10μM 이소 프로테레놀(isoproterenol, ISO)로 처리하고 처리 48시간 후에 검사하였다. 혈청 결핍이 심근비대에 대한 전처리 조건으로 사용되기도 하기 때문에, 처리 24시간 전에 FBS 및 HS가 없는 동일한 배지를 대체하였다. 산화 방지제를 처리하는 경우, PE 또는 ISO를 처리하는 동안 2mM N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine, NAC)을 적용하였다.
3. 형질 감염
일반적으로, H9c2, AC16, rCMC 또는 HeLa 세포 내로의 이중 miRNA를 갖는 벡터의 형질감염(transfection) 또는 동시형질감염(cotransfection)은 Lipofectamine 2000 또는 3000 (Invitrogen)을 사용하여 수행되는 반면, miRNA 또는 miRNA 억제제 (50nM)의 형질감염은 RNAiMAX (Invitrogen) 또는 Lipofectamine 3000 (Invitrogen)을 사용하여 제조업체가 제공한 일반적인 프로토콜에 따라 수행하였다. 최대 효율을 달성하기 위해, Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen)를 사용하여 정확한 수의 세포를 계수하였으며 형질감염 전에 플레이트에 분주하였다.
실시예 2. ROS 및 세포 크기 측정
세포 ROS 수준의 정량적 측정을 위해, 유세포 분석법은 ROS 형광 염료에 기초하고, 다이하이드로에티디움(dihydroethidium, DHE)을 Muse Oxidative Stress Kit (Milipore)와 함께 Muse Cell Analyzer (Milipore)를 사용하여 적용하였다. 즉, 약물 처리 전날 H9c2 또는 AC16 세포를 106 cell/6 well-plate의 밀도로 분주하였다. 처리 후 10분부터 48 시간까지 세포를 회수하고, 고정, 염색하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 반복한 후 (n=3) 측정하였다. 분석을 위해, 동일한 수의 세포 (n=10,000)를 ROS 수준 및 세포 크기 모두에 대해 정량 하였다. FSC (Forward-Scattered Light)는 제조업체의 프로토콜에 따라 세포 크기로 측정되었다 (log10(FSC), y축; 비대, 세포 크기>3).
심장 조직 용해물에서 ROS의 양을 측정하기 위해, CM-H2DCFDA (Invitrogen)를 사용하였다. 프로테아제 억제제 (cOmplete, Mini, EDTA-free; Roche) 및 2.5 mM 데페록사민 메실레이트(deferoxamine mesylate, DFOM; Sigma-Aldrich)이 보충된 1x RIPA 용해 완충액 (DyneBio)에서 제조된 균질화된 용해물을 Qubit Protein Assay Kit (Invitrogen)를 사용하여 단백질에 대해 정량화하였다. 100μg의 용해물을 어두운 곳에서 37℃로 30분 동안 2μM CM-H2DCFDA와 함께 배양하였다. 형광 신호는 Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen)에 의해 검출되었다.
세포 ROS 수준을 시각화하기 위해, DHE (Invitrogen)가 사용되었다. 처음에, 24 시간 동안 H9c2 세포의 혈청을 결핍시키고 지시된 시점까지 100 μM PE로 처리 하였다. 그리고 나서 회수된 세포를 무혈청 DMEM으로 세척하고 빛을 피하면서 10 분 동안 37℃에서 10 μM의 DHE와 함께 배양하였으며, 배양 후 세포를 무혈청 DMEM으로 다시 세척하였다. ROS 이미지는 역 형광 현미경 (Leica DMi8)을 사용하여 얻었다.
실시예 3. 면역형광염색 (Immunofluorescence staining)
H9c2 또는 rCMC를 4% paraformaldehyde (PFA; Biosesang)로 15 분 동안 실온에서 고정시켰다. 이를 0.1% NP-40 (Sigma-aldrich)을 함유하는 PBS (Biosesang)로 2 회 세척 한 후, 샘플을 5% 소 혈청 알부민 (BSA; Bovogen)을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 2 회 세척하고, 다음의 조건으로 일차 항체를 배양하였다; 0.1% NP-40 및 3% BSA를 포함하는 PBS에서 4℃로 밤새; MF20 (1:1000, Developmental hybridoma), o8G (15A3, 1:1000, QED Bioscience) 및 Ago2 (ab5072, 1:200, Abcam). DAPI (1.5μg/ml, Vector lab)는 핵 염색에 사용하였다. H9c2 심근 아세포에서 상이한 정도의 운명 이질성때문에 (모든 H9c2 세포가 심근 세포와 동일한 계통에 있음에도 불구하고), MF20을 사용하여 심근 세포를 염색하였다. RNase의 처리를 위해, 일차 항체를 배양하기 전에 10μg/ml의 RNaseA (Invitrogen)를 실온에서 15 분 동안 사용하였으며, Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (1:1000, Abcam) 및 Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG (1:1000, Abcam)는 0.1% NP-40을 포함하는 PBS에서 실온에서 1시간 동안 2차 항체로서 사용되었다. 염색된 세포는 역 형광 현미경 (Leica DMi8)으로 조사하고, Leica Application Suite (LAS)로 분석하였으며, ImageJ (≥100 cells, https://imagej.nih.gov/)로 정량화하였다.
실시예 4. 세포 크기 측정
배양액 또는 조직 절편으로부터의 세포 크기를 ImageJ 1.51s 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/)에서 "측정"기능을 사용하여 정량하였다. 모든 이미지를 여러 이미지에서 일관된 비교를 위해 35.56 x 26.67 inch2에 해당하는 2560 x 1962 픽셀 크기로 변환하였다. 이어서, 변환된 이미지에서 세포 면적을 inch2 (71.9 pixel/inch)의 단위로 측정하고 다음 분석에 사용하였다.
실시예 5. RNA 합성 및 변형
TriLink Biotechnologies (USA), Integrated DNA Technologies (USA), ST Pharm (Korea) 및 Bioneer (Korea)의 맞춤형 합성 및 변형 서비스를 사용하여 다양한 변형을 가진 RNA를 생산했으며, 그 품질을 질량 분석을 통해 모니터링 및 확인하였다.
리보뉴클레오티드 내의 8-옥소구아닌(o8G)을 miR-1(5'p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'; 서열번호 7)의 표시된 위치에 도입하였다; miR-1:7o8G, 5'p- UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 3); miR-1:2o8G, 5'p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 1); miR-1:3o8G, 5'p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 2).
산화된 유도체를 포함하는 miR-1의 이중체(duplex)는 합성된 miR-1 passenger 가닥 (5'p-ACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUA-3'(서열번호 8), 전달을 확인하는 경우, fluorescein isothiocyanate(FITC)가 5'말단에 부착됨)에 어닐링함으로써 in vitro에서 하기 조건으로 생성되었다; 90℃에서 2분, 30℃에서 1시간, 및 4℃에서 5분 동안.
또한, 리보뉴클레오티드 내의 8-옥소구아닌(o8G)을 miR-122(5'p-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3';서열번호 68), let-7(5'-pUGAGUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3'; 서열번호 69) 및 miR-124(5'-p UAAGGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3';서열번호 70)의 표시된 위치에 다음과 같이 도입하였다; miR-122:2,3o8G, 5'p-Uo8Go8GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3'(서열번호 65); let-74o8G: 5'p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3'(서열번호 66); miR-124:4o8G, 5'-p UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3'(서열번호 67).
산화된 유도체를 포함하는 miR-122, let-7 및 miR-124의 이중체(duplex)는 miR-1의 이중체(duplex)와 동일한 방법으로 제작되었다.
표시된 위치에서 G>U로의 치환을 포함하는 miR-1도 합성하였으며 (miR-1:2GU, 5'p-UUGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 9); miR-1:3GU, 5'p-UGUAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 10); miR-1:7GU, 5'p-UGGAAUUUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 11)) miR-1의 passenger 가닥으로 이중체화되었다. 대조군 miRNA로서, cel-miR-67 (D. Dharmacon에 의해 음성 대조군으로 제공된 C. elegans-특이적 miRNA)로부터 유래된 비표적 miRNA (NT) (5'-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUA-3'; 서열번호 12)를 siRNA로서 합성하고 이중체 (가이드 가닥: 5'p-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAdTdT-3'(서열번호 13), passenger 가닥: 5'p-UACUCUUUCUAGGAGGUUGUGAdTdT-3'(서열번호 14), 'dT'는 thymidine deoxynucleotide를 나타낸다)로 사용하였다. seed-매개 오프-타겟 효과를 배제하는 경우, NT는 이전에 보고된 바와 같이 가이드 및 passenger 가닥 둘 다에서 6번 위치에서 dSpacer (abasic deoxynucleotide; Ψ)를 포함하거나 1번 및 2번 위치에서 2'-O-methyl을 포함하도록 추가로 변형되었다.
o8G 유도된 G>T 돌연변이를 확인하기 위해, o8G:A 염기 결합을 통해 RT-PCR 동안 잠재적으로 EcoR1 사이트를 생성하는 39-oxo-R (o8G; 5'- CCUGGUCCCAGACUAAAGAAUo8GCUUGACAGUUAUCUCGUAUGCCGUCUUCUCGAGGUAGCGGAACCGUGAGCUUUGAAGU-3'; 서열번호 15), 및 이의 대조군으로 39R (G; 5'-CCUGGUCCCAGACUAAAGAAUGCUUGACAGUUAUCUCGUAUGCCGUCUUCUCGAGGUAGCGGAACCGUGAGCUUUGAAGU-3'; 서열번호 16)을 합성하였다. Spike-in 대조군으로서 o8G spike-in (5'p-Uo8Go8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'; 서열번호 17), G spike-in (5'p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'; 서열번호 18), 및 miRNA:o8G spike-in (5'p-UAAGo8GCACGCGGUGAAUGCCAA-3'; 서열번호 19)을 합성하였다.
경쟁적인 miR-1 및 miR-1:7o8G 억제제의 경우, anti-seed (2x: 5'-dTdTΨACAUUCCAΨACAUUCCAΨdTdT-3' (5'-ACAUUCC-3'는 miR-1 seed site; 서열번호 20)), anti-7oxo (2x: 5'-dTdTΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨdTdT-3', 4x: 5'-dTAAAUUCC AAAUUCCAGAAAUUCCACAAAUUCCAdT-3', 9x: 5'-dNdNΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨdNdN-3'; 'dN'은 데옥시뉴클레오티드, A, T, C 또는 G를 나타낸다 (5'-AAAUUCC-3'는 miR-1 7oxo site; 서열번호 6)), cont(anti-NT; 2x: 5'-dTdTΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨdTdT-3', 4x: 5'-dTGGUUGUG GGUUGUGAGGGUUGUGACGGUUGUGAdT-3', 9x: 5'-dNdNΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨdNdN-3' (5'-GGUUGUG-3'는 cont NT site; 서열번호 21)을 합성하였다. 억제제의 5' 및 3' 말단 모두에서 "dT" 또는 "dN"을 의도적으로 RNA 안정성에 기여하도록 부착하였다. 접합(junction)에서 추정되는 서열을 통한 오프-타겟 효과를 막기 위해 anti-seed (2x) 또는 anti-7oxo (2x)에서 타겟 부위의 접합에 무염기(abasic) 데옥시뉴클레오티드 (Ψ)를 도입함으로써 무염기 데옥시뉴클레오티드가 없는 억제제로부터 표현형에 차이가 없음을 확인하였다. 상기 서열에서 밑줄은 상응하는 표적 억제부위를 나타낸다.
실시예 6. RNA 추출
크기에 따라 RNA를 정제하기 위해 miRNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 제조업체에서 제공한 프로토콜에 따라 작은 (<~200nt) 및 큰 (>~200nt) RNA 분획을 분리하였다. 심장 조직 샘플의 경우, Minilys Personal Homogenizer (Bertin) 또는 유리 Homogenizer를 700μl Qiazol Lysis Reagent (Qiagen)의 존재 하에 사용하였고, 이전에 보고된 시험관 내 산화를 방지하기 위해 2.5mM DFOM (Sigma-aldrich)으로 보충하였다. 전체 RNA 정제를 위해, 2.5mM DFOM을 갖는 Qiazol Lysis Reagent만 20% 클로로포름 (Merck)을 첨가 한 후 사용하였고, 이어서 이소프로필 알코올로 RNA 침전시키고 RQ1 RNase free DNase (37℃에서 30분; 열 불활성화와 함께 용액 정지, 65℃에서 10분; Promega)를 처리하였다. RNA의 정확한 정량을 위해, 분광광도계 (Denovix) 및 Qubit 형광 정량 (Invitrogen)을 사용하였다.
miRNA를 정제하기 위해, 총 RNA로부터 ~20nt의 겔 추출을 수행하였다. 겔 로딩 완충제 II (90℃에서 2분; Ambion)에서 변성된 총 RNA를 ~20nt miRNA 마커 (합성된 miR-1)의 표시와 함께 15% Urea-PAGE 겔에 의해 분리하였으며, 그 크기는 14-30 ssRNA Ladder 마커 (Takara)로 교차 확인하였다. 그리고 나서 SYBR Gold로 염색한 후, 겔에서 ~20nt 크기를 잘라내고, 겔 추출 완충액 (0.5M 암모늄 아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 0.1% SDS, 1mM EDTA, pH 8.0)과 함께 65℃에서 밤새 thermomixer (Thriller, Peqlab)에서 배양하였으며, Oligo Clean & Concentrator 키트 (Zymo)로 추가 정제하였다.
실시예 7. ELISA를 통한 o8G의 정량
o8G의 비색 검출 및 정량화는 제조사의 프로토콜에 따라 OxiSelect Oxidative RNA Damage ELISA kit (Cell Biolabs)를 사용하여 수행하였다. 샘플의 제조로서, 정제된 작은 RNA 또는 큰 RNA (0.4-5μg)를 37℃에서 1시간 동안 Nuclease P1 (Wako)로 처리하고, 에탄올 침전을 통해 추출하고, 항-o8G 항체의 결합을 위해, o8G/BSA 컨쥬 게이트와 경쟁하도록 첨가하고, 플레이트 상에 사전 코팅하였으며 이어서 검출을 위해 해당 키트에서 제공하는HRP결합된 이차 항체에 반응시켰다. 샘플의 흡광도는 분광 광도계 (450nm, GloMax-Multi Detection System; Promega)로 측정하였으며, o8G의 농도는 미리 결정된 o8G 표준 곡선과 비교하여 추정되었고 상대량으로 나타내었다.
실시예 8. 약물 처리
모든 실험 절차는 고려대학교 실험동물운영위원회의 승인을 받았으며 동물 보호 및 실험 동물 사용 가이드를 준수하여 수행하였다. 아드레날린성 심장 비대를 유도하기 위해, ISO (75 mg/kg)를 총 29일 동안 2 일마다 8 주에서 12 주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(Koatech)에 복강 내 주사(IP)를 통해 투여하였다. 모의-주입 대조군(Mock)으로서, 동일한 부피의 PBS를 사용하였으며, 항산화 효과를 조사하기 위해 100 mg/kg NAC를 투여하였다. 주사된 약물에 따라 마우스를 여러 그룹으로 나누었다 (각 그룹마다 n=4, 샘플 크기는 이전 연구(Lee, H. S. et al. Nature communications 6, 10154) 에서 사용된 최소 수에 기초하여 선택됨): Mock, ISO, ISO+NAC, 및 NAC. 처음 주사하고 29일 후, 각각의 심장 중량(heart weight, HW), 체중(body weight, BW) 및 경골 길이(tibia length, TL)를 측정하여 심장 조직을 수집하고; HW/BW 또는 HW/TL을 표준화된 심장 크기로 사용하였다. 모든 샘플은 ROS 측정, CLEAR-CLIP 및 RNA 추출에 이어서 o8G ELISA, 도트 블롯(dot blot), 노스웨스턴, IP 및 qPCR에 대해 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 파라콰트(paraquat) (Sigma-Aldrich) 처리를 위해, 10 mg/kg 파라콰트를 매주 총 4 주 동안 IP를 통해 마우스에 투여하였다. 그런 다음, RNA를 추출하여 ELISA에 사용 하였다. RNA-Seq의 경우, 1일, 3일 및 5일에 ISO를 3회 IP 주사하고 1 주일 후에 마우스 (n=3)를 희생시켰으며, 동일한 부피의 PBS를 대조군으로 주입하였다. RNA-Seq 라이브러리 및 qPCR 분석을 구축하는데 사용될 때까지 모든 샘플은 -80℃에서 보관하였다.
실시예 9. 심초음파
심장 초음파를 모니터링하고 삼성 의료 센터의 동물 이미징 핵심 시설의 통제 하에 기록하였다. 구체적으로, 마우스는 처음에 마취를 유도하기 위해 2~5% 이소 플루란(isoflurane)에 노출시키고 ~5분 동안의 심초음파 기록 (Visual Sonics Vevo 2100 Imaging System)을 측정하는 동안 1% 이소플루란으로 유지하였다. M-모드 tracing 하에서 2-D 짧은축(short-axis)은 개별 기록 위치, 마우스의 유두 영역을 고정시키기 위해 적용되었다. 이완기 및 수축기 벽 두께를 포함하는 심박수, 좌심실 (left ventricular, LV) 치수, 및 LV 말기-이완기 및 말기-수축기 챔버 치수를 측정하였다.
실시예 10. 도트 블롯(dot blot) 및 노스웨스턴 블롯(northwestern blot) 분석
도트 블롯의 경우, 크기별 RNA (80-300ng) 또는 겔 정제된 miRNA (50ng)가 Zeta-Probe 블롯팅 막 (Bio-Rad)에 점으로 표시되었고, Spectrolinker XL-1000 (Spectroline)에서 최적의 가교 (120mJ/cm2) 옵션으로 UV 조사에 의해 가교결합 되었다. 노스웨스턴 블롯의 경우, 총 RNA는 Gel Loading Buffer II (90℃에서 2 분; Ambion)에서 변성시키고, 22nt miRNA 사이즈 마커 (합성된 miR-1)를 사용하여 15% Novex TBE-Urea 겔 (Invitrogen)로 분리하였으며, Zeta-Probe 블롯팅 막으로 옮기고, UV (120mJ/cm2, Spectrolinker XL-1000)로 가교결합 시켰다. 상기 막은 실온에서 1시간 동안 5% BSA와 함께 1 x TBST (Biosesang)로 차단하고 실온에서 1 시간 동안 1 x TBST에서 항-o8G 항체 (15A3, 1:2000; QED Bioscience)와 함께 배양 하였다. 그런 다음, HRP가 결합된 goat anti-mouse IgG (1:5000, Pierce)를 실온에서 1시간 동안 TBST에서 사용하고, 이어서 검출을 위해 ECL (SuperSignal West Pico PLUS, Pierce)과 반응시켰다. 형광단이 결합된 2차 항체 (Alexa Fluor 680 Goat anti-mouse IgG, 1 x TBST에서 1:15000, Invitrogen)를 사용하는 경우, Blocker FL 형광 차단 버퍼 (ThermoFisher)를 차단 및 항-o8G 항체와 함께 배양하는데 둘 다에 사용하였다. 형광 신호를 iBright FL100 이미징 시스템 (Invitrogen)에 의해 직접 정량하고, SYBR Gold (1:10000, Invitrogen)에 의해 염색된 점으로 표시된 RNA의 총량에 대한 상대적인 강도로 계산하였다.
실시예 11. o8G 면역 침강(Immunoprecipitation, IP)의 최적화
항-o8G 항체 (15A3, QED Bioscience)에 대한 o8G의 면역 침강 (IP) 조건을 최적화하기 위해, 2 개의 o8G 염기를 포함하는 합성 20nt-길이 RNA인 o8G spike-in (5'p-Uo8Go8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3')을 o8G가 없는 G spike-in (5'p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3')과 비교하였다. 항-o8G 항체가 부착된 비드(bead)를 제조하기 위해, 2.5 μg의 항-o8G 항체 (15A3, QED Bioscience)를 실온에서 1 시간 동안 25 μl의 Dynabeads Protein G (Invitrogen)와 200 μl의 PBS에서 배양 하였다. 항-o8G 항체의 비특이적 상호 작용을 막기 위해, 250 μg의 데옥시구아노 신(deoxyguanosine) (dG, Sigma-Aldrich)의 첨가가 또한 비드(bead) 제조 동안 시험되었다. 세척 및 정제를 위해 DynaMag-2 magnet (Invitrogen)을 사용하여 Dynabeads Protein G를 분리하였다. PBS로 3번 비드를 씻은 후 o8G spike-in vs. G spike-in (10pg 또는 100pg, 300ng small RNA의 존재하에)을 위해 IP 버퍼의 다른 조건을 확인하였다; 0.04% NP-40를 함유한 PBS; 저세정제, 0.004% NP-40를 함유한 PBS; 고세정제, PXL (PBS, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 0.5% NP-40). 참고로, 모든 IP 공정은 2.5mM DFOM 및 40U 재조합 RNase 억제제 (Takara)의 존재 하에 4℃에서 2 시간 동안 수행되었다.
세척 완충제의 다른 조건들도 검사하였다; 고세정제, IP 버퍼 (2 회)> PXL (4회)> PBS (2회); 염 추가, 100mM NaCl로 보충된 PBS (3회)> PBS (5회); 고염으로 일련의 세척, TE (15mM Tris-HCl pH 7.5, 5mM EDTA)> 고세정제를 함유한 TE (1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS, 및 2.5mM EGTA) 및 고염 (1M NaCl)> 고세정제 및 염을 함유한 TE (120mM NaCl)> 세척 완충제 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM MgCl, 150mM NaCl, 0.05% NP-40); 극도의 염으로 일련의 세척, TE> 고세정제 및 고염을 함유한 TE> 고세정제 및 극도의 염 (2M NaCl)을 함유한 TE> 고세정제 및 염을 함유한 TE> 세척 버퍼. 비드 내의 RNA를 2.5mM DFOM 및 20% 클로로포름이 보충된 700μl의 Qiazol Lysis Reagent로 정제한 다음 RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo)를 사용하였다. Spike-in control의 크기가 22nt이기 때문에, o8G spike-in 및 G spike-in의 양은 miRNA에 대한 정량적 RT-PCR (qPCR)에 의해 측정되었으며, 이의 상대적인 비율은 신호:IP 공정에서의 노이즈를 추정하는데 사용되었다.
실시예 12. miRNA에 대한 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)
miRNA를 정량화하기 위해, miRNA qPCR 방법 또는 TaqMan MicroRNA 분석법 (Applied Biosystems)을 사용하였다. 구체적으로, miRNeasy Mini Kit (Qiagen)에 의해 정제된 1μg의 small RNA 또는 IP 정제된 RNA는 Poly(A) Polymerase (Ambion)를 사용하여 총 10μl 부피로 폴리아데닐화 시켰다. 이어서 폴리아데닐화 된 RNA를 2μM의 올리고(dT) adaptor 프라이머 (5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3′; 서열번호 22)와 함께 SuperScript III 역전사 효소(reverse transcriptase) (Invitrogen)를 사용하여 역전사 시켰다. qPCR 반응은 정방향 (표적 miRNA로서 동일한 서열) 및 역방향 프라이머 (5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3′; 서열번호 23)와 함께 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)에서 수행되었다; 사이클링 조건 (95℃에서 5분; 95℃에서 15초, 55℃에서 15초, 및 72℃에서 20초의 45 cycles; 및 72℃에서 5분). U6 snRNA는 o8G 또는 G spike-in (forward: 5′-TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT-3’(서열번호 24), reverse: 5′- GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3′(서열번호 25)) 또는 miRNA:o8G spike-in (forward: 5′-TAAGGCACGCGGTGAATGCCAA-3′(서열번호 26), reverse: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC -3′(서열번호 27))을 사용하는 것을 제외하고, 일반적으로 참조 대조군 (control, forward: 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′(서열번호 28), reverse: 5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′(서열번호 29))으로서 측정되었다.
TaqMan MicroRNA Assay를 사용하는 경우, 제조업체가 제공한 프로토콜을 따라 수행하였다. 즉, 100ng의 small RNA를 각각의 miRNA 서열을 인식하는 특정 RT 프로브와 함께 MicroRNA 역전사 키트 (Applied biosystems)를 사용하여 역전사 시켰다. RT 산물과 함께, qPCR 반응을 특정 qPCR 프라이머와 TaqMan Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG; Invitrogen)에서 수행하였다. 특정 miRNA를 검출하는데 사용된 RT 프로브 및 qPCR 프라이머는 다음과 같은 키트에 의해 공급되었다; rCMC에서 miR-1b, hsa-miR-1 (ID: 002222); rCMC에서 miR-1-3p, rno-miR-1 (ID: 002064); rCMC에서 miR-184, has-miR-184 (ID: 000485); rCMC에서 let-7f, hsa-let-7f (ID: 000382); H9c2, AC16, rCMC 및 마우스 심장에서 miR-1, hsa-miR-1 (ID: 00222); U6, U6 snRNA (ID: 001973); o8G 또는 G spike-in, hsa-miR-1 (ID: 002222); miRNA:o8G spike-in, mmu-miR-124a (ID: 001182); NT, cel-miR-67-3p (ID: 000224). 모든 qPCR 분석은 기술적 복제물 (n=3) 및 역전사 효소 없이 동시 반응(parallel reaction) (음성 대조군)을 갖으며 Rotor-Gene Q (Qiagen)에 의해 수행되었다.
실시예 13. RT-PCR에서 o8G>T 전환 분석
o8G가 A와 쌍을 이룰 수 있기 때문에, 합성된 39-oxo-R에서 GAAUo8GC에서 GAATTC (EcoRI 부위)로의 변화에 기초하여 G>T 전환을 유도하는 효능을 조사하였다. RT 프라이머 (5'-ACTTCAAAGCTCACGGTTCCGCTACCTCGAGAAGACGGCATACGA-3'(서열번호 30), Bioneer)와 함께 SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen)에 의해 o8G 대조군 (39-oxo-R) 및 G 대조군 (39R)의 역전사를 수행하였다. cDNA는 PCR 반응 (98℃에서 10 초; 98℃에서 10초, 40℃에서 30초, 72℃에서 20초의 30 cycle; 및 72℃에서 10분)에서 프라이머 (forward: 5'-CCTGGTCCCAGACTAAAGAAT-3'(서열번호 31), reverse: 5'-ACTTCAAAGCTCACGGTTCCG-3'(서열번호 32); Bioneer)와 함께 Ex Taq (Takara)로 증폭시켰다. Oligo Clean & Concentrator 키트 (Zymo)로 정제한 후, RT-PCR 산물을 EcoRI (NEB)로 분해하고 TBE에서의 12% PAGE 겔 상에서 분리하였다.
RT-PCR에서 o8G 유도된 G>T 전환은 또한 시퀀싱에 의해 직접 확인되었다. 각 결찰 단계 후에, RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo)를 사용한 것을 제외하고, 변형이 있는 small RNA-Seq 라이브러리 구축을 위한 프로토콜 (실시예 14 참조)에 따라 22nt 합성 RNA (5'p-UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3'; 서열번호 33)를 포함하는 400ng의 o8G에 대해 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다. 특히, 5' adaptor에서 퇴행(degenerate) 바코드 (4개 랜덤 뉴클레오티드)로 인해 고유 판독 값을 계산하여 o8G 위치의 뉴클레오티드 빈도를 분석할 수 있어, PCR 증폭에서 교란치우침(confounding bias)을 배제할 수 있다.
실시예 14. o8G-miSeq
RT-PCR에서 o8G IP 조건 및 o8G 유도 G>T 전환의 최적화에 기초하여, 산화된 miRNA 및 그의 o8G 위치를 식별하기 위한 시퀀싱 방법 (o8G-miSeq)이 개발되었다. 1.2mg의 데옥시구아노신(deoxyguanosine) (Sigma)이 보충된 PBS (총 부피 500μl)에서 Dynabeads Protein G (Invitrogen) 125μl와 함께 1시간 동안 실온에서 교대로 12.5μg의 항-o8G 항체 (15A3, QED Bioscience)를 배양함으로써 항체가 부착된 마그네틱 비드(bead)를 제조하였다. 세척 및 정제를 위해, DynaMag-2 magnet (Invitrogen)을 사용하여 Dynabeads Protein G를 분리하였다. PBS 세척 2 회 후, miRNeasy Mini Kit (Qiagen)로부터 정제된 7-10 μg의 small RNA 샘플을 2.5mM DFOM (Sigma) 및 40U 재조합 RNase 억제제 (Takara)를 포함하는 200μl의 PXL에서 준비된 비드와 혼합하였다. 4℃에서 교대로 배양하고 2시간 후, 극도의 염으로 일련의 세척을 적용하였다; TE (15mM Tris-HCl pH 7.5, 5mM EDTA); 고세정제 (1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS, 및 2.5mM EGTA) 및 고염 (1M NaCl)을 함유한 TE; 고세정제 및 극도의 염 (2M NaCl)을 함유한 TE; 고세정제 및 염 (120mM NaCl)을 함유한 TE; 세척 완충제 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM MgCl, 150mM NaCl, 0.05% NP-40). 비드상의 정제된 산화 small RNA는 그대로 또는 추출 후에 추가로 처리하였다.
온전한 비드로 처리하는 경우, 비드의 RNA를 PNK 버퍼 (50mM Tris-Cl pH 7.4, 10mM MgCl2, 0.5% NP-40)로 2 회 세척하고 1mg/ml BSA 및 40U 재조합 RNase 억제제 (Takara)가 보충된 80μl T4 RNA ligase 완충액 (NEB) 중 8μl의 T4 RNA ligase 2 절단 KQ (NEB)를 사용하여 70℃에서 2 분간 배양한 후 얼음 위에서 제조한 0.25μM의 3'adaptor (5'-(rApp)T(PMe)GGAATTCTCGGGTGCCAAGG(ddC)-3'(서열번호 34); rApp: adenylate, PMe: methyl-phosphonate, ddC: dideoxy-cytosine; Trilink)와 결찰하였다. 열 혼합기(thermomixer) (Thriller, Peqlab)에서 28℃로 1시간 동안 배양한 후, 비드를 PXL (2.5mM DFOM)로 1회, PNK 완충제로 2 회 세척하였다. 5' adaptor 결찰의 경우, 70℃에서 2분 동안 배양한 후 얼음 상에서 제조된 0.25 μM의 5'adaptor (5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN (2'-methoxy-C)-3'(서열번호 35); Trilink)를 8μl의 T4 RNA ligase (Thermo), 1mg/ml BSA 및 40U 재조합 RNase 억제제로 구성된 총 80μl의 T4 RNA ligase 완충제의 비드 상에서 열 혼합기 (Thriller, Peqlab)에서 28℃로 1시간 동안 RNA와 함께 배양하였다. PXL (2.5mM DFOM) 및 1x 제1가닥 버퍼 (Invitrogen)로 순차적으로 세척한 후, 비드 상의 RNA를 다음과 같이 역전사 시켰다; 총 40 μl의 1x제1가닥 버퍼 중 1μl의 SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen), 0.72μM RT 프라이머 (5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; 서열번호 36), 375μM dNTP, 7.25mM DTT 및 4U 재조합 RNase 억제제; 열 혼합기 (Thriller, Peqlab)에서 55℃로 1시간 동안 배양. 수득된 cDNA를 PCR에 의해 추가로 증폭시켜 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다.
동시에, cDNA 시퀀싱 라이브러리는 또한 input samll RNA (0.4-1μg; small RNA-Seq) 또는 o8G IP (2.5mM DFOM 및 20% 클로로포름이 보충된 700μl의 Qiazol Lysis Reagent로 비드에서 정제되고, 이어서 RNA Clean & Concentrator-5 kit로 농축)로부터 추출된 생산물로부터 수행되었다. 처음, 20% PEG 8000 및 20U 재조합 RNase 억제제가 보충된 총 13μl의 T4 RNA ligase 버퍼에서 1μl의 T4 RNA ligase 2 절단 KQ (NEB)를 사용하여 0.25μM 3'adaptor (70℃에서 2분 동안 배양 후 얼음 상에서 제조됨)를 결찰시켰다; 28℃에서 60분 동안 배양한 후 65℃에서 20분 동안 불활성화함. 그런 다음, 0.25μM 5'adaptor를 포함하는 13μl의 T4 RNA ligase 버퍼, 2μl의 T4 RNA Ligase (ThermoFisher), 40U 재조합 RNase 억제제, 및 1mg/ml BSA를 첨가하여 5'adaptor를 결찰시켰으며, 이는 28℃에서 60 분 동안 배양하고 65℃에서 20분 동안 불활성화 하였다. 결찰된 총 RNA 샘플을 70℃에서 2분 동안 10μM RT 프라이머의 1μl와 함께 변성시키고, 얼음 상에 1분 동안 놓고, 다음과 같이 역전사 시켰다; 총 40μl의 1x 제 1 가닥 버퍼 중 1μl의 SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen), 375μM dNTP, 7.25mM DTT 및 4U 재조합 RNase 억제제; 55℃에서 1 시간 동안, 70℃에서 15 분 동안 배양. 생성된 cDNA를 시퀀싱 라이브러리를 제조하기 위해 PCR을 통해 추가로 증폭시켰다.
제조된 cDNA를 Truseq 인덱스 adaptor 서열 (Illumina)을 포함하도록 추가로 처리하였다. 먼저, 100nM universal forward 프라이머 (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'; 서열번호 37) 및 100 nM RT 프라이머로 Q5 고-정확도 2x 마스터 믹스 (NEB)를 사용하여 PCR을 통해 cDNA를 증폭시켰다; 98℃에서 30초; 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 15 초의 5 cycles; 및 72℃에서 10분. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 1차 PCR 산물을 정제한 후, 용리의 일부를 사용하여 Q5 고-정확도 2x 마스터 믹스에 SYBR Geen I (1:10000, Invitrogen)을 첨가하여 qPCR (Rotor-Gene Q; Qiagen)을 수행하였으며, 증폭의 선형 범위에 도달하는데 필요한 사이클 수를 결정하였다. 정해진 최적 사이클 횟수로, 프라이머 세트와 함께 Q5 고-정확도 2x 마스터 믹스를 사용하여 multiplexing barcode (250nM universal forward primer, 250nM barcode primer: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-6mer barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; 서열번호 38)를 생성하기 위해 나머지 정제된 1차 PCR 산물에 대해 2차 PCR을 수행하였다. ~ 20nt insert를 함유하는 PCR 산물의 예상 크기는 15% Urea-PAGE 겔 추출 (실시예 6 참조) 또는 3% agarose 겔 cassette와 함께 Pippin Prep (Sage Science)을 사용하여 추가로 정제되었으며, cross-check와 함께 Qubit RNA HS assay kit (Invitrogen) 및 Fragment Analyzer (Advanced analytical)를 이용하여 정량화하였다. 최종적으로, 상기 제조된 라이브러리를 HiSeq 2500 시스템 (Illumina)에 의해 50 개의 단일-말단 판독으로서 시퀀싱하고 CASAVA (Illumina)를 이용하여 역 다중화시켰다.
실시예 15. 생물정보학 및 통계 데이터 분석
생물 정보학 분석을 위해, 주로 Python 스크립트 (http://clip.korea.ac.kr/oxog/)와 UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu/)를 사용하였다. RNA-Seq 분석은 Tuxedo Suite를 사용하여 수행되었다; TopHat2 (http://ccb.jhu.edu/software/tophat), Cufflinks 및 Cuffdiff (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/). Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net)를 사용하여 miRNA에 대한 시퀀싱 리드의 맵핑을 수행하였다. CLIP 데이터의 피크(peak) 분석은 CLIPick (http://clip.korea.ac.kr/clipick/)에 의해 처리되었다. 별도의 표시가 없는 한 기본 매개 변수와 함께 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)를 사용하여 GO 분석을 수행하고 REVIGO (http://revigo.irb.hr/)로 시각화하였다. 기능적 주석의 보강은 GSEA (http://software.broadinstitute.org/gsea/)를 사용하여 분석되었다.
표준 실험실 실습 무작위화 절차를 동일한 연령 및 성별의 세포주 그룹 및 마우스에 사용하였다. 실험자들은 실험 및 결과 평가 동안 배치에 대한 정보가 주어지지 않았다. Kolmogorov-Smirnov test (KS test), t-test (unpaired two-tailed) 및 Fisher's exact test (맵핑된 총 miR-1 판독값에 상대적)를 포함한 모든 통계적 테스트는 Scipy (http://www.scipy.org/) 또는 Excel (two-sided test)을 이용하여 수행하였다. 값은 달리 언급되지 않는 한 mean±s.d를 나타낸다. 통계적 유의성은 기본적으로 P=0.05로 설정되었으며, 분산은 그룹간에 유사했다.
실시예 16. o8G-miSeq 데이터 분석
역다중화된(demultiplexed) 시퀀싱 판독 (FASTQ 파일)은 2개의 불일치 (Bowtie --norc -l 7 -n 2 -a -f)를 허용하는 Bowtie를 사용하여 정렬되었으며, 축소된 시퀀싱 판독은 인덱싱 되었으며 (기본 매개변수와 함께 bowtie-build indexer 사용), miRBase (http://www.mirbase.org/)에서 동일한 종의 성숙 miRNA 서열에 의해 맵핑되었다. 불일치 오류가 있는 판독 값을 필터링하여 결과를 더 구문 분석했으며, 그 결과 품질 점수는 20 미만이었다. miRNA 당 판독 수는 총 판독 값 (총 판독 값 백만 당 판독 값; RPM)으로 정규화되고 log2 값 (예: log2 (입력(input)) 및 log2 (o8G IP))으로 사용되었다. 특히, 입력 small RNA-Seq (입력; miRNA 빈도)에서의 RPM으로 o8G IP 시퀀싱 (o8G IP)의 RPM을 매겨 o8G의 풍부도값(enrichment)를 추정하고 log2 비율로 계산하고 volcano plot 분석에서 유의성 (-log10 (P-value), t-test)으로 나타내었다. miRNA 서열에서 G의 빈도에 의해 영향을 받는 o8G IP bias를 조사하기 위해, 서열 (G의 수) 및 o8G 풍부도값 (bin size = 1)에서 G-함량에 의해 분류된 miRNA의 수는 열 지도 분석 (Treeview, http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm)을 통해 시각화하였다. PE 처리에 따른 차등 o8G 풍부도를 분석하기 위해, 상대적인 o8G 풍부도값을 PE 처리 vs. mock (무처리) 사이의 o8G 풍부도 비율로부터 계산하였다. Base calling에서 최고 품질 점수를 갖는 불일치(mismatch)의 경우만을 고려하여, miRNA 서열의 각 위치에서 발생하는 불일치의 백분율은 총 match 빈도에 대해 상대적으로 계산되었다; 불일치 (%). 특히, miR-1:2U 및 miR-1:3U로부터의 seed 서열은 무시할 만한 것으로 취급될 수 있는 매우 낮은 발현을 나타내는 종-특이적 miRNA, mdo-miR-12320-3p 및 mmu-miR-7216-3p(<80 시퀀싱 판독값)를 가진 miR-1:7U를 제외하고 다른 포유 동물 miRNA (n=17,948; miRBase, http://www.mirbase.org/)와 중복되지 않는다.
실시예 17. o8G IP 및 qPCR에 의한 산화된 miRNA 정량
rCMC (n=3)를 100μM PE로 48시간 동안 처리하거나 ISO (75mg kg-1)를 만성 주사하여 마우스에서 비대성 심장을 유도한 후 (n=3), small RNA는 miRNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 그런 다음, 교차-확인으로 분광 광도계 (Denovix) 및 Qubit 형광 정량화 (Invitrogen) 둘 다에 의해 정확하게 측정된 동일한 양의 small RNA (2μg, PE 처리 vs. 처리 없음)를 10pg miRNA:o8G spike-in 대조군의 존재하에 o8G 면역 침전에 사용 하였다. Qiazol Lysis Reagent 및 RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo)를 사용하여 비드에서 RNA를 추출한 후, TaqMan MicroRNA Assay 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 o8G IP의 특정 miRNA의 양을 평가하였다. 참고로, 역전사 전의 모든 과정은 2.5mM DFOM의 존재 하에 수행되어 시험관내 RNA의 산화를 방지 하였다. IP 공정으로부터의 변이를 정상화하기 위해, o8G IP에서 miRNA:o8G spike-in의 양을 qPCR로 측정하고 특정 miRNA의 상대적인 o8G 값을 정량하기 위한 분모로 사용하였다. 또한, o8G IP에서 U6 snRNA를 측정함으로써 상대적 수준을 추정하고 특정 miRNA에서 산화의 풍부함을 확인하기 위해 표준화에 사용하였다.
실시예 18. 루시퍼라제(luciferase) 리포터 제작
miRNA-매개 유전자 억제 활성을 측정하기 위해, psiCheck-2 (Promega) 또는 pmirGLO 벡터 (Promega)를 사용하였다. 특히 miR-1 oxo 부위의 경우, 표적 부위를 나란히 반복하고 (n=5) psiCheck-2의 Renilla luciferase (hRLuc)의 3'UTR에 삽입하여 검출 민감도를 증가시켰다.
이러한 벡터 구축을 위해, 다양한 miR-1 oxo 부위를 포함하는 합성 duplex oligos (Macrogen)를 지시된 바와 같이 XhoI 및 NotI 부위를 통해 psiCheck-2 플라스미드에 클로닝하였다; miR-1-seed site, forward: 5'-TCGAGACATTCCACATTCCACATTCCACATTCCACATTCCGC-3'(서열번호 39), reverse: 5'-GGCCGCGGAATGTGGAATGTGGAATGTGGAATGTGGAATGTC-3'(서열번호 40); miR-1-2oxo site, forward: 5'-TCGAGACATTCAACATTCAACATTCAACATTCAACATTCAGC-3'(서열번호 41), reverse: 5'-GGCCGCTGAATGTTGAATGTTGAATGTTGAATGTTGAATGTC-3'(서열번호 42); miR-1-3oxo site, forward: 5'-TCGAGACATTACACATTACACATTACACATTACACATTACGC-3'(서열번호 43), reverse: 5'-GGCCGCGTAATGTGTAATGTGTAATGTGTAATGTGTAATGTC-3'(서열번호 44); miR-1-7oxo site, forward: 5'-TCGAGAAATTCCAAATTCCAAATTCCAAATTCCAAATTCCGC-3'(서열번호 45), reverse: 5'-GGCCGCGGAATTTGGAATTTGGAATTTGGAATTTGGAATTTC-3'(서열번호 46); miR-1 control site, forward: 5'-TCGAGACTTTCCACTTTCCACTTTCCACTTTCCACTTTCCGC-3'(서열번호 47), reverse: 5'-GGCCGCGGAAAGTGGAAAGTGGAAAGTGGAAAGTGGAAAGTC-3'(서열번호 48)). 중요하게도, miR-1 control site는 동일한 염기를 가짐으로써 miR-1 seed site의 위치 6 (pivot)에서 미스매치를 가지며, 여기서 손상된 pivot은 seed-매개된 표적 억제를 상실하는 것으로 보고되고, 따라서 음성 대조군으로 사용되도록 구성하였다.
상기와 동일한 방식으로, miR-122, let-7, miR-124의 발단부분에 o8G 변형 생성시 인식할 수 있는 서열을 5'말단기준으로 8번째까지의 상보적인 서열에 o8G 변형이 일어난 부위에 대해서는 A로 치환하여 제작하였다,
확인된 miR-1:7o8G 표적 mRNA에서 7oxo 사이트를 민감하게 확인하기 위해, psiCheck-2 벡터를 다음과 같이 표적 사이트의 2 회 또는 3 회 반복을 포함하도록 변형시키고 서브클로닝 하였다. 먼저, 예측된 오프셋 7oxo 부위 (3:8)를 함유하는 반딧불 유전자 (hluc+)는 ApaI 및 XbaI 사이트를 통해 7oxo 사이트가 없고 pmirGLO 벡터 (Promega)에 위치한 상이한 반딧불 유전자 (Luc2)로 대체하였다.
실시예 19. 루시퍼라제(luciferase) 리포터 분석
다양한 루시퍼라제 리포터 벡터 (pmirGLO, psiCheck-2 또는 원하는 부위를 함유하는 이의 변형된 플라스미드) 및/또는 합성 duplex miRNA (50-75nM, 달리 명시됨)를 H9c2, rCMC 및 AC16에 형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후, 발현된 루시퍼라제의 활성을 일반적으로 측정하였다. 약물 처리의 경우, 명시된 농도의 PE, H2O2 및/또는 NAC를 명시된 시간 동안 처리하고, 형질감염 후 24 시간에 시작하여 처리 후 수득하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 복제물 (n=6)로 GloMax-Multi Detection System (Promega)과 함께 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템 (Promega)을 이용하여 상대적 활성 (반딧불 루시퍼라제로 표준화된 Renilla 루시퍼라제 활성)을 측정하였다. miRNA-매개 억제의 효율을 평가하기 위해, 상이한 농도의 miRNA (0 내지 100nM)를 HeLa에 형질감염 시켰다. 그런 다음, Scipy (scipy.optimize.curve_fit)를 사용하여 시그모이드함수 (sigmoid function)에 대해 비선형 최소 제곱 피팅을 수행하여 IC50을 계산하였다. 최소 제곱이 함수에 맞지 않는 경우 회귀선에서 대략적인 IC50을 계산하였다.
실시예 20. 이중(dual) 형광 리포터 제조
이중 형광 단백질 (dFP) 리포터 벡터는 psiCheck-2 (Promega)에 기초하여 구축하였고, 루시퍼라제 유전자는 형광 단백질 유전자로 대체하였다. pUlta (Addgene; Malcolm Moore 제공)에서 eGFP 유전자를 증폭시키고 NheI 및 XhoI 사이트를 통해 hRLuc를 대체하였다; forward 프라이머: 5'-TAGGCTAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGA-3'(서열번호 49), reverse 프라이머: 5'-GGGCTCGAGCGATCGCCTAGAATTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'(서열번호 50). pTRIPZ (Thermo Scientific)에서의 TurboRFP 유전자를 증폭시키고, ApaI 및 XbaI 사이트 (forward 프라이머: 5'-GAAGGGCCCTATGAGCGAGCTGATCAAGGAGA-3'(서열번호 51), reverse 프라이머: 5'-GACTCTAGAATTATTATCTGTGCCCCAGTTTGCTAG-3'(서열번호 52))를 통해 hluc+를 대체하고, 추가로 처리하여 PCR-매개 결실을 통한 hluc+ 서열의 잔류 33bp를 제거하였으며 (forward 프라이머: 5'-GTACTGTTGGTAAAGCCACCATGAGCGAGCTGATCA-3'(서열번호 53), reverse 프라이머: 5'-TCCTTGATCAGCTCGCTCATGGTGGCTTTACCAACA-3'(서열번호 54)), 이어서 결실되지 않은 골격 플라스미드를 제거하였다 (DpnI 처리). 모든 PCR 반응은 제조사의 프로토콜에 따라 PfuUltra High-Fidelity DNA 중합효소 (Agilent Technologies)를 사용하여 진행하였다. 또한, 전환된 dFP 벡터 (Jens Gruber로부터 제공된 p.UTA.3.0 Empty; Addgene plasmid #82447)를 사용했는데, 이는 psiCheck-2 벡터에서 유래되었지만 acGFP는 hluc+를 대체하였고 RFP는 hRLuc를 대체하였다; 마치 리포터 및 대조군 형광 유전자가 dFP에서 교환된 것처럼. 마지막으로, miR-1 seed 사이트, 7oxo 사이트, 2oxo 사이트 및 3oxo 사이트는 psiCheck-2에 사용된 동일한 서브클로닝(subcloning) 방법에 따라 dFP 또는 전환된 dFP 벡터 (p.UTA.3.0)에 삽입되었다.
실시예 21. 유세포 분석기를 이용한 단일 세포 리포터 분석
유세포 분석기를 이용하여 단일 세포 수준에서 miRNA 매개 유전자 억제를 측정하기 위해 형광 단백질 리포터 벡터를 사용하였다. 먼저, miR-1 seed, 7oxo, 3oxo 또는 2oxo 사이트를 함유하는 dFP (RFP:GFP-site) 또는 전환된 dFP (GFP:RFP-site)를 H9c2에 형질감염 시키고 형질감염 후 24시간에 세포를 수집하였다. 양성 대조군으로서, 각 표적 사이트에 대한 동족의 miRNA (50nM)를 공동형질감염 시켰다. miR-1 oxo 사이트의 억제가 내인성 miR-1에 의해 매개됨을 확인하기 위해, miRIDIAN microRNA 헤어핀 억제제 (Dharmacon)로부터 얻은 50nM miR-1 특이적 억제제를 또한 공동형질감염 시켰다. 공동형질감염의 경우, 동일한 양의 NT를 대조군으로 사용하였다. 약물 처리를 위해, 200μM PE (혈청-고갈된 H9c2) 또는 2mM NAC를 형질감염 시점에서 시작하여 24시간 동안 처리하였다. 세포를 4% BSA (Bovogen) 및 5mM EDTA (Sigma)와 함께 PBS (Biosesang)에서 회수하고 유세포 분석기로 분석하였다.
dFP (RFP:GFP-site) 형질감염된 H9c2의 경우, 초기에 4-blue 구성으로 작동되는 BD Accuri C6 Plus (BD Biosciences)를 사용하였다 (오직 블루 레이저 장비를 갖춤, 여기 파장: 488nm; 표준 필터, GFP: 533/30, RFP: 670 LP). 살아있는 단일 세포를 게이팅한 후 (FSC 및 SSC에 기초하여), 리포터 발현이 없는 세포를 psi-Check2 형질감염된 세포에 의해 추정된, 자동 형광의 기초 수준에 기초하여 추가로 여과 제거하였다. 이어서, GFP vs. RFP 신호 (n=10,000 cells)의 산점도(scatter plots)를 분석하였다. H9c2의 세포 크기는 FSC 값에 의해 추정되었다. 산화된 miR-1 매개 억제에 대한 PE 처리의 효과를 시험하기 위해, PE 처리 vs. 무처리를 비교함으로써 GFP 강도 (log2(GFP)) 또는 상대적 GFP 비율 (log2 (GFP/RFP))에 따른 세포 분포를 나타내었으며, 누적 분율 분석 (Scipy, scypy.stats.ks_2samp)를 사용하여 수행된 KS test)에 의해 추가로 통계적으로 분석되었다.
dFP (RFP:GFP-site) 및 전환된 dFP (GFP:RFP-site) 모두에 대한 검출 민감도를 높이기 위해 이후 청색 (488nm) 및 황색 (561nm) 레이저가 장착된 Attune NxT 유세포 분석기를 사용하여 GFP및 RFP 모두의 완전 여기를 달성하였다. 상기 분석을 위해, GFP 및 RFP 신호의 범위는 초기에 산점도 분석에서 선택되었고, 유사한 범위의 벡터 발현 (dFP에 대한 log10(RFP) 및 전환된 dFP에 대한 log10(GFP)에 의해 추정됨; 동일하게 들어감)으로부터 유도된 리포터 값 (dFP에 대한 log10(GFP) 및 전환된 dFP에 대한 log10(RFP))을 평균화하여 상대적 비율로 정량화하였다. 궁극적으로 상대적인 fold 변화는 사이트가 없는 동일한 리포터에서 유래된 값 (예: dFP, RFP 값의 각 bin에 있는 GFP 값의 평균은 사이트가 없는 대조군에서 값으로 표시됨)으로 상대적 비율을 표준화하여 계산하였다. 리포터 발현에서 단지 가장 낮은 25%에 대해서만 분석 범위를 좁히기 위해, 각각의 벡터 발현 값의 bin에서의 리포터 값에서 가장 낮은 25%를 가진 세포만을 사용함으로써 상대적 배수 변화를 재계산하였다.
실시예 22. miR-1:o8G를 이용한 심장 세포 비대 유도
NT-6Ψ, miR-1, miR-1:7o8G, miR-1:2o8G, miR-1:3o8G, miR-1:7U, miR-1:2U, miR-1:3U를 제조사의 프로토콜에 따라 RNAiMax 또는 Lipofectamine 3000 (Invitrogen)에 의해 H9c2 또는 rCMC 세포로 형질감염 시켰으며, 정지 이미지를 얻기 위해, 도립현미경 (Leica DMi8)을 사용하고 ImageJ (≥100 세포, https://imagej.nih.gov/)로 분석하였다. Time-lapse 이미지를 생성하기 위해, miR-1:7o8G 또는 miR-1:7U의 형질감염 후 Lumascope 400 (Etaluma)을 20분 간격으로 0에서 50h 사이로 사용하였다.
실시예 23. 마우스에 miRNA 투여
마우스로의 miRNA의 생체 내 전달을 수행하였다. 구체적으로, duplex miRNA (5mg kg-1)를 제조사의 프로토콜에 따라 생체 내 jetPEI (N/P 비율=5; Polyplus)를 사용하여 정맥 내 주사 (I.V.)를 통해 12 주령 수컷 C57BL/6 마우스 (Koatech)에 투여하였다. 주입된 miRNA (NT vs. miR-1:7o8G, NT vs. miR-1:7U; n=4)에 따라 마우스를 2개의 그룹으로 분배함으로써 2세트의 실험을 설계하였다. miR-1:7o8G (4mg kg-1) 또는 miR-1:7U (4mg kg-1)를 주사하는 경우, NT (1mg kg-1)도 함께 주사하여 마우스 심장으로의 전달을 확인하였다. 특히, 주사에 사용된 miR-1:7o8G 또는 miR-1:7U의 이중체는 5'말단에 FITC를 함유하는 miR-1 passenger 가닥을 사용하여 심장 조직으로의 전달을 확인함으로써 생성되었다. 주사는 1일 및 2일에 2회 수행되었고 마우스는 7일에 희생되었다. 각각의 심장 측정으로 심장 조직을 수집하였다; HW, BW 및 TL. 절단된 심장 조직을 RNA 추출 (small RNA 및 large RNA; miRNeasy Mini Kit, Qiagen)에 즉시 사용하였고, 전달된 NT의 양을 qPCR (miRNA 섹션에 대한 qPCR의 상세한 방법 참조)에 이어서 RNA-Seq 및 qPCR 분석으로 조사하였다. 절단된 심장의 일부는 또한 면역조직화학 분석을 위해 슬라이드상의 조직 절편으로서 제조되었다.
실시예 24. mRNA에 대한 정량적 RT-PCR
RNase-Free DNase Set (Qiagen)를 이용한 컬럼의 DNA 분해를 통해 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen) 및 올리고 (dT) 프라이머로 역전사를 수행하였다. qPCR 분석은 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 수행하였다. 모든 반응은 표준 2 단계 사이클링 프로토콜로 3 회 수행하였으며, 대조군으로서 ACTB 및 GAPDH를 사용하여 ΔCT 방법에 의해 상대적 정량을 계산하였다.
실시예 25. 심장 조직의 면역조직화학
해부된 마우스 심장 조직을 고정시키고 (4% paraformaldehyde, 밤새 4℃), 저장하고 (70% 에탄올), 파라핀으로 포매하고, 절단한 후 (횡단면, 연속절편; 5μm 폭) haematoxylin 및 eosin (H&E)으로 염색하였다. 파라핀-포매한 절편 준비, H&E 염색, 및 Masson's trichrome 염색은 서비스 가입을 통해 심혈관 제품 평가 센터 (연세대학교 의과 대학, 한국) 또는 병리학 핵심 시설 (서울대학교 의과 대학, 한국)에 의해 수행되었다. 그런 다음, 제조된 슬라이드 상에서 면역형광염색을 수행하였다. Histo-Clear (National Diagnostics)로 절편을 탈파라핀한 후, 일련의 희석된 에탄올로 섹션을 가수 분해하고 PBS에 저장하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 BD Retrievagen Antigen Retrieval Systems (BD Biosciences)을 사용하여 항원을 회수하였다. 이어서, PAP pen (Sigma)에 의해 정의 된 표적 염색 영역을 명시된 바와 같이 면역염색 시켰다; 차단 용액 (10% 정상 염소 혈청 및 1% BSA를 함유한 PBS), 1시간 동안 RT; MF20 항체 (1:200, Developmental hybridoma), 차단 용액, 4℃에서 밤새; Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (1:1000, Abcam), 차단 용액, 실온에서 1시간. 또한, Alex Fluor 594 결합된 WGA (50μg/ml; Invitrogen)와 DAPI (1.5μg/ml; Vector lab)를 적용하여 세포막과 핵을 각각 시각화하였다. 염색된 조직을 도립 형광 현미경 (Leica DMi8; 20x 또는 40x 배율)으로 관찰하고, Leica Application Suite (LAS)로 분석하고 ImageJ (≥100 세포, https://imagej.nih.gov/)로 정량화 하였다.
실시예 26. 형질전환 마우스 생성
심근세포 특이적 형질전환 마우스 (TG)를 생산하기 위해, anti-7oxo (α-MHC 13x) 플라스미드를 BamHI를 사용하여 분해하여 형질전환 cassette를 분리하였다. 겔-정제된 형질전환 cassette를 교배 후 과배란된 C57BL/6 암컷 마우스 (PMSG 및 HCG에 의해 유도됨)로부터 제조된 마우스 수정란의 핵에 주사하였다. 그 후, 마우스 배아 (수정된 단세포 수정란)를 가임신 암컷 마우스 (Korea Bio Co. Ltd, Seoul, Korea)에 이식하였다. 전달 후, anti-7oxo TG(+) 마우스 모두 hGH 폴리 (A)에 상응하는 프라이머 세트(forward: 5'-CCACCAGCCTTGTCCTAATAAA-3'(서열번호 55), reverse: 5'-CAGCTTGGTTCCCAATAGA-3'(서열번호 56))를 사용하여 게놈 DNA (말단으로부터 정제됨)의 PCR 분석에 의해 확인하였다. anit-7oxo TG의 경우, 4 개의 독립적인 설립자 라인 (F0; #44, #65, #68, 및 #69)을 설정하고 연구하였다. 모든 마우스는 임의로 음식과 물을 허용하고 12:12 시간 light:dark 주기로 유지시켰다.
실시예 27. RNA-Seq 라이브러리 구축 및 분석
RNA-Seq 라이브러리는 어댑터 결찰 기반 방법 또는 가닥-변위 정지/결찰 방법을 사용하여 전체 또는 large RNA로부터 생성되었다. 어댑터 결찰 기반 방법의 경우, 100ng의 총 RNA (miRNeasy Mini Kit; Qiagen에서 정제됨)를 제조사의 프로토콜에 따라 NeoPrep (Illumina)을 사용하여 TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina)에 적용했다; 샘플 이름: H9C2-NT-N1, H9C2-miR-1-2o8G-N1, H9C2-miR-1-3o8G-N1. 또한, TruSeq Stranded mRNA Libraries는 Omega Bioservices (Norcross, GA, USA)에 의해 구축, 시퀀싱 및 역다중화되었다; 샘플 이름: H9C2-NT-O1, H9C2-NT-O2, H9C2-miR-1-7o8G-O1, H9C2-miR-1-7o8G-O2.
나머지 샘플은 다음과 같이 가닥 변위 정지/결찰 방법을 사용하여 처리되었다. 즉, 1.5μg의 large RNA (> 200nt, RNeasy 또는 miRNeasy Mini Kit; Qiagen에 의해 추출됨)로부터, 폴리아데닐화된 mRNA를 10μl의 Dynabead Oligo (dT)25 (Invitrogen)를 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 사용하여 정제하였다. 이어서, 정제된 mRNA 10ng에 제조사의 지시에 따라 SENSE Total RNA-Seq 라이브러리 키트 (Lexogen)를 사용하여 RNA-Seq 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리가 생성된 후, 이들은 최적 사이클이 가장 낮은 PCR에 의해 증폭되었으며, 이는 상이한 사이클의 결과를 비교하거나 상기 실시예 14의 o8G-miSeq의 방법에 기재된 바와 같이 qPCR을 수행함으로써 결정되었다. 증폭된 라이브러리의 품질은 크기 분포 및 양에 대해 Fragment Analyzer (Advanced analytical)를 사용함으로써 확인되었다. 필요한 경우, urea-PAGE 겔 추출 또는 Pippin Prep (Sage Science)을 크기 선택을 위해 추가로 사용하였다. 마지막으로, Qubit RNA HS 분석 키트 (Thermo Fisher)와 Fragment Analyzer를 사용하여 준비된 다중화된 라이브러리를 정확하게 정량화하고, 50개의 단일-말단 판독으로서 HiSeq 2500 시스템 (Illumina)에 의해 시퀀싱되도록 적용하였다. 시퀀싱하기 위해 H9C2-cont, H9C2-anti-7oxo, mHT-ISO-cont, mHT-ISO-anti-7oxo, mHT-ISO-anti-7oxo-TG(-) 및 mHT-ISO-anti-7oxo-TG(+)로 명명된 샘플, MiniSeq 시스템 (Illumina)을 사용하였다. HiSeq 2500 시스템의 결과와 일관성을 유지하기 위해 MiniSeq 시스템에는 SE50 정보만 사용되었다.
역다중화된 서열 분석 판독 (CASAVA; Illumina를 사용하여 획득)을 RefSeq 유전자 주석의 공급하에 TopHat2 (tophat2 -a 4 -g 1 --b2-sensitive -r 100 --mate-std-dev=50 --library-type fr-firststrand)를 사용하여 마우스 게놈 (mm9) 또는 랫트 게놈 (rn5)에 정렬하였다. 가닥 변위 정지/결찰 방법을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제조한 경우, 판독의 시작 측으로부터 처음 9개의 뉴클레오티드를 제조사의 지시에 따라 TopHat2에 대해 트리밍 하였다. Cufflinks (cufflinks -N-b)를 사용하여 전사 수준을 정량화하고, 동일한 실험 조건을 가진 그룹에서의 맵핑 결과의 공급과 함께 Cuffdiff (Cuffdiff --FDR=0.1 -b -N --min-alignment-count=10 -library-norm-method=geometric)로 차등 전사 프로파일을 분석했다. 오직 유효한 상태의 값만 선택되고, 배수 변화 및 통계적 유의성 (p-value)에 추가로 사용되었다. 복제물이 두 가지 다른 라이브러리 구축 방법 (어댑터 결찰 기반 방법 및 가닥 변위 정지/결찰 방법)에서 파생된 경우 cufflinks는 동일한 유형의 라이브러리에만 사용된 다음, 중앙값 RPKM 및 p-value (t-test, two-tailed)를 모든 복제물로부터 계산하였다.
실시예 28. 누적 분율 분석
주어진 miRNA 또는 miRNA 억제제에 따라 추정되는 표적 전사체의 억제 또는 탈억제의 경향을 시험하기 위해, 배수 변화 (log2 비율)에 따른 누적 분율을 분석 하였다. 추정되는 miR-1:o8G 표적은 3'UTR (UCSC 게놈 브라우저에서 다운로드한 RefSeq에 의해 정의됨)에서 miR-1 oxo 사이트를 함유하는 전사체로서 선택되었으며, 여기서 miR-1:o8G의 위치 2-8에 매치되는 모든 6mer (o8G:C 대신 o8G:A의 매치)는 별도의 표시가 없는 한 일반적으로 조사되었다. "사이트 없음"은 mRNA 서열에서 miR-1 seed 사이트 및 oxo 사이트를 함유하지 않는 전사체를 나타낸다. "Cont 사이트"는 3'UTR에 miR-1 대조군 사이트를 함유하는 전사체를 나타내고, oxo 사이트에서 o8G와 결합하는 뉴클레오티드가 이전 연구에서 음성 대조군으로서 사용된 바와 같이 G로 치환되었다. KS test는 총 mRNA 또는 cont 사이트에 대해 Scipy (scypy.stats.ks_2samp)를 사용하여 수행하였다. 배수 변화 및 유의성 (-log10 (p-value))을 계산하여 Volcano plot 을 분석하였으며, 이 중 컷오프를 사용하여 차등적으로 발현된 유전자 (DEG)를 선택하였다.
실시예 29. Ago HITS-CLIP 데이터 분석
심근병증 환자의 좌심실 조직으로부터의 Ago HITS-CLIP 결과는 GEO 데이터베이스 (GSE83410)로부터 검색되었다. miRNA 서열을 포함하는 판독은 Bowtie (샘플 판독에 대한 성숙 miRNA 서열의 정렬)로부터의 '역방향'맵핑에 의해 2 개의 미스매치 허용과 함께 확인되었으며, miRNA 판독의 위치 미스매치가 miR-1에 대해 분석되었다. miR-1 oxo 사이트의 enrichment 분석을 위해, G:U 결합에 의해 매개된 miR-1 seed 사이트와 비교하여, 이전 연구 (Spengler, R. M. et al., Nucleic Acids Res 44, 7120-7131)에 의해 제공된 Ago2 결합 클러스터를 분석하였다. 뇌 특이적 miRNA인 miR-124의 seed 사이트는 심장 조직에서 존재하지 않기 때문에 음성 대조군으로 사용되었다. miR-1의 비-핵생성 융기(bulge) 사이트 또한 음성 대조군으로서 사용되었다.
심근병증 환자에서 miR-1 7oxo 사이트를 확인하기 위해, Ago HITS-CLIP의 로우 시퀀싱 데이터를 CLIPIck에 의해 처리하였다. 구체적으로, FASTQ 파일은 처음에 품질 점수 (fastq_filter.pl -f mean:0-24:20)에 기초하여 필터링되고 축소되었다 (fastq2collapse.pl). 그런 다음, 전처리된 판독값을 동일한 매개 변수로 NovoAlign 프로그램 (http://www.novocraft.com)을 사용하여 인간 게놈 (hg19)에 정렬하였다. 주석이 달린 전사체 (RefSeq)에서 판독값을 선택한 후 BedTools 및 SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/)를 사용하여 정렬된 Ago CLIP 판독값을 BED 또는 BAM 파일로 생성하고 인간의 심장 (RNA-Seq Atlas로부터 유래됨, http://medicalgenomics.org/rna_seq_atlas)에서 발현 프로파일 공급과 함께 피크 분석에 사용하였다. 피크(peak), 편집된 모든 판독값, 및 추정 miR-1 7oxo 사이트 (2-8 위치의 6mer)를 시각화하기 위해, UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu/)를 적용하였다.
실시예 30. CLEAR-CLIP
ISO 처리 또는 PBS 처리된 마우스로부터 해부된 마우스 심장 조직 (~150mg)을 분쇄하고 UV 조사 (400mj/cm2, 3회; Spectrolinker XL-1000)하여 생체 내(in vivo) RNA-단백질 복합체에서의 공유 가교결합을 유도하였다. 37℃에서 5분 동안 50μU/μl RNAse A (affymetrix)를 처리함으로써 프로세스된 Ago-관련 단편 mRNA는 60mg의 Dynabeads Protein A (Invitrogen)에 부착된 2개의 다른 anti-Ago 항체 (2A8; Diagenode, 2E12; Abnova) 10μg에 의해 면역 침전되었다. miRNA-표적 mRNA 키메라를 생성하기 위한 결찰은 16℃에서 밤새 0.625U/μl T4 RNA ligase 1 (NEB)을 처리함으로써 수행되었으며, 25℃에서 75 분 동안 3% DMSO (Sigma) 및 18% PEG8000 (Sigma)의 존재 하에 추가로 1U/μl T4 RNA ligase 1 (NEB)을 처리함으로써 강화되었다. 동위원소가 표지된 RNA-단백질 복합체는 NuPAGE 10% Bis-Tris Gel (Invitrogen)을 작동시켜 크기별로 분리하고, nitrocellulose막 (BA85; Whatman)으로 옮기고, 절단하고, 4mg/ml proteinase K (Roche) 및 7M urea (Sigma)로 처리하였으며, 산 페놀:클로로포름:IAA (125:24:1; Invitrogen) 및 RNA Clean & Concentrator-5 키트 (Zymo)로 추출하였다. 정제된 RNA는 어댑터 결찰 및 RT-PCR에 적용하여 small RNA-Seq Library Prep 키트 (Lexogen)를 사용함으로써 고 처리량 시퀀싱을 위한 라이브러리를 생성하였으며, 최종적으로 HiSeq 2500 시스템 (Illumina)으로 시퀀싱 하였다.
시퀀싱 판독을 전처리하고 맵핑하였으며, 어댑터 서열이 제거된 후, miRNA 서열을 함유하는 잠재적인 키메라 판독이 '역방향'맵핑에 의해 확인되었고, 여기서 성숙한 miRNA 서열은 Bowtie를 사용하여 샘플 라이브러리에 반대로 정렬되었다. 그런 다음, 나머지 서열을 마우스 게놈 (mm9)에 맵핑하고, 2A8 및 2E12 항체 둘 다로부터 조합된 엑손과 겹친 것만을 위해 추가로 선택하고 궁극적으로 키메라 판독을 포함하는 miR-1에만 초점을 맞추었다. miR-1 seed 및 oxo 사이트 조사에 있어서, ISO 주입 및 비주입 마우스 심장 사이의 강화 결과를 비교하여 맵핑된 키메라 판독으로부터 상류 (5', -) 및 하류 (3', +)가 확장되었다 (-/+ 0, -/+ 25, -/+ 50, -/+ 100).
실시예 31. 심근세포-특이적 miR-1:7o8G 억제제의 구축
심근 세포에서 miR-1:7o8G를 특이적으로 억제하기 위해, 심근 세포 특이적 α-MHC 프로모터를 보유하는 pJG/ALPHA MHC 플라스미드에 기초하여 다중 miR-1 7oxo 표적 사이트를 함유하는 경쟁적 억제제를 구축하였다. 13개의 miR-1 7oxo 사이트 (5'-AAAUUCC-3'; 서열번호 6) 또는 대조군 NT 표적 사이트 (5'-GGUUGUG-3'; 서열번호 21)를 포함하는 합성 이중 올리고 (Macrogen)를 SalI 및 HindIII 사이트를 통해 지시된 바와 같이 pJG/ALPHA MHC 벡터에 클로닝 하였다; anti-7oxo, α-MHC 13x, forward: 5'-TCGACAAATTCCAAAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAAAAATTCCACAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCAAAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAA-3'(서열번호 57), reverse: 5'-AGCTTTGGAATTTGTGGAATTTCTGGAATTTATGGAATTTTTGGAATTTCTGGAATTTATGGAATTTGTGGAATTTTTGGAATTTGTGGAATTTCTGGAATTTATGGAATTTTTGGAATTTG-3'(서열번호 58); cont, anti-NT, forward: 5'-TCGACGGTTGTGAAGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGTGACGGTTGTGAAGGTTGTGACGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGTGAAGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGTGACGGTTGTGAA-3'(서열번호 59), reverse: 5'-AGCTTTCACAACCGTCACAACCCTCACAACCATCACAACCTTCACAACCCTCACAACCATCACAACCGTCACAACCTTCACAACCGTCACAACCCTCACAACCATCACAACCTTCACAACCG-3'(서열번호 60). 주목할 만한 것은, 대조군 벡터 (anti-NT)는 cel-miR-67 (C. elegans-)에서 유래한 비표적 siRNA (NT)의 결합 부위를 포함하는 것을 제외하고는 anti-7oxo (α-MHC 13x)에 사용된 것과 동일한 플라스미드였다. pJG/ALPHA MHC 벡터는 Jeffrey Robbins (Addgene plasmid #55594)으로부터 제공받아 Dr. Da-Zhi Wang에 의해 제공되었다.다른 경쟁적 miRNA 억제제는 RNA로 합성되었다 (RNA 합성 방법 참조).
실시예 32. ISO-처리된 마우스에 miRNA억제제의 투여
경쟁적 miR-1:7o8G 억제제 (anti-7oxo)가 생체 내에서 ISO-유도 심장 비대를 약화시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, ISO (75 mg kg-1)는 처음에 8 주 내지 12 주령의 수컷 C57BL/6J 마우스 (Korea Bio Co. LTD)로 복강 내 주사 (I.P)를 통해 투여되었고, 이 때 동일한 부피의 PBS를 대조군으로서 사용하였다 (각 세트에 대해 n=5). 8 시간 후, 제조사의 프로토콜에 따라 명시된 양 및 비율로 생체 내 jetPEI (Polyplus)를 사용하여 anti-7oxo 또는 대조군 (anti-NT)을 마우스에 정맥 주사 하였다; anit-7oxo (α-MHC 13x) 또는 cont (anti-NT 13x), 1.9 mg kg-1, N/P 비율=8; anti-7oxo (4x) 또는 cont (anti-NT 4x), 5 mg kg-1, N/P 비율=5. 연속 주사는 1일, 2일 및 5일에 3 회 수행되었으며, 7일째에 모든 마우스를 희생시키고 심장을 검사하였다. hGH poly (A) (forward: 5'-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT-3'(서열번호 61), reverse: 5'-CCAGCTTGGTTCCCAATAGA-3'(서열번호 62))를 포함하는 anti-7oxo 전사체의 RT-qPCR을 수행함으로써 심장 조직으로의 anti-7oxo (α-MHC 13x)의 전달율을 측정하였다. anti-7oxo (4x)가 마우스 심장으로 전달되는 것을 확인하기 위해, poly (A) tailing 기반 miRNA qPCR 방법 (miRNA에 대한 정량적 PCR의 방법 참조)을 anti-7oxo (4x) (forward, 5’-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT-3’; 서열번호 63) 특이적 프라이머로 수행하였다.
실시예 33. ISO 시간 코스에서 miR-1:o8G의 정량
ISO 시간 코스 (ISO time course) 실험에서 산화된 miR-1의 양의 변화를 조사하기 위해, 75 mg kg-1 ISO를 IP 주사를 통해 마우스에 투여하고, 주입된 마우스를 처리 시점으로부터 1일, 5일 및 7일에 희생시켰다 (각 시점에 대해 n=4). 동일한 부피의 PBS를 또한 주입하고 마우스를 즉시 희생시켜 0일째에 샘플로서 사용하였다 (n=4). 심장을 해부한 후, miRNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 small RNA를 추출하였다. miR-1:o8G를 정량하기 위해, "o8G IP 및 qPCR에 의한 산화된 miRNA의 정량화" 방법에 기술된 바와 같이 o8G IP 및 그 다음 miR-1 qPCR을 수행 하였지만, 다음과 같이 약간의 변형이 있었다; 비드 제조에서, 150μl의 PXL에서 3μg의 anti-o8G 항체 (15A3, QED Bioscience), 30μl의 Dynabeads Protein G (Invitrogen), 및 300μg의 deoxyguanosine (dG, Sigma-Aldrich); IP 배양에서, 2.5mM DFOM 및 40U 재조합 RNase 억제제 (Takara)를 포함하는 250μl의 PXL에서 2μg의 small RNA 샘플 및 1pg의 o8dG RNA spike-in (miR-124-3p:4o8dG: 5'p-UAAGo8dGCACGCGGUGAAUGCC-3'; 서열번호 64).
실시예 34. 3'UTR에서 miR-1 표적 사이트의 서열 보존 분 석
3'UTR에서 보존되는 서열의 모티프를 카운팅 하는 경우, 포유류에 대한 PhastCons 결과는 UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu)로부터 얻어졌으며, 스코어가 0.9 이상이고 보존율 (보존된 모티프 수/모든 모티프 수; %)로 계산된 경우에만 사용되었다. 모든 3'UTR (RefSeq에 의해 정의됨)에서의 보존율은 miR-1의 4 개의 다른 부위 (seed, 2oxo, 3oxo 및 7oxo 부위)에 대해 보존된 miRNA 패밀리의 seed 사이트 (위치 2-8에서 n=103, 6mer)와 함께 계산되었다. 이 중 대부분의 포유동물에서 서열이 보존된다 (그러나 일반적으로 태반 포유동물을 넘어서는 안됨; http://www.targetscan.org). 백그라운드 대조군으로서, 모든 6-mer (n=4098)의 보존도 계산되었다. 결과 분포는 누적 분율 및 모집단의 비율로 표시되었다.
실시예 35. 데이터 가용성
o8G-miSeq (SRP189806, SRP189807, SRP189808, SRP226125), RNA-Seq (SRP189813, SRP189117, SRP189812, SRP189811, SRP189809, SRP213998, SRP214400, SRP228274) 및 CLEAR-CLIP (SRP189810)의 모든 로우 시퀀싱 데이터는 Sequence Read Archives에 보관되었다. Spike-in이 있는 o8G IP의 시퀀싱 데이터를 포함하여 모든 FASTQ 파일은 프로젝트 웹 사이트 (http://clip.korea.ac.kr/oxog/)에서도 제공된다.
실시예 36. 심비대증 동물 모델의 혈장 (plasma)에서 miR-1:o8G측정
실시예 8 에서 기술한 바와 같은 동일한 방법으로 ISO 주입을 통하여 마우스의 심비대증을 유도하였다 (도6a). 이후 PBS를 처리한 대조군 3마리와 과 ISO를 처리한 실험군 3마리에서 각각 700μl의 혈액을 채취한 뒤, 4도, 1000x g, 5분 간 원심분리기를 통해 침강시켜 혈장을 분리하였다. 각군당 350ul동량의 혈장으로 부터 Qiagen사의 miRNeasy Serum/Plasma Kit를 사용하여 small RNA를 추출하였고, 추출된 small RNA에서 miR-1의 측정은,실시예 12에서 기술한 바와 같이qPCR을 실시하여U6의 양으로 보정하여 정량하였다. 또한 혈장에서 분리한 100ng의 small RNA로 부터 실시예 11 에서 기술한 바와 같이 항체침강 (IP)을 통해 o8G 변형된 RNA를 특이적으로 분리하고, qPCR 방법을 통해 miR-1을 정량하였다. 또한, o8G 로 변형된 miR-1 정량은, 8G 항체를 이용한 면역침강 실험 시 o8G 가 DNA형태로5번째에 합성된 1pg의 miR-124-3p:4o8dG (UAAGo8dGCACGCGGUGAAUGCC-3'; 서열번호 64)을 함께 넣어주어 qPCR로 측정하여 보정하여 측정하였다.
실험예 1. ROS 의존성 심장 비대에서의 miRNA 산화
H9c2 랫트 심근 모세포 세포주에α-아드레날린성 수용체 (AR) 작용제 (페닐에프린; PE)를 처리하여 PE처리에 의한 병리생리학적 비대 자극 및 ROS 생성과 miRNA의 산화를 확인하였다. ROS 형광 염료 (DHE)를 사용하여 유세포 분석(10,000 cells, n=3)으로 분석한 결과, PE 처리 후 세포 내에서 ROS가 증가되었음을 확인하였으며,. 특히 PE로 처리된 후 발생한 비대 세포 중에서 93%는 처리 후 ROS의 생성이 1.8 배 증가하였다. 아드레날린성 비대를 자극하기 위해 확립된 전제 조건인 혈청 결핍도 높은 기저 ROS 수준으로 확대 표현형을 향상시킨다.
생체 내 마우스 모델로 더 확장하여, 도 1a에 나타낸 β-AR 작용제, 이소프로테레놀(isoproterenol, ISO)의 만성 투여는, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 심장 비대 (~13% 증가)를 유도한다. 이 중 병리는 심초음파로 확인하였으며, 상기 ISO를 처리하였을 때 ROS를 생성하는 것을 확인하였다.
다음으로, 상기의 ISO를 투여한 심장 비대 마우스 모델에서 RNA가 ROS에 의해 산화되었는지 조사하였다.
크기(200 뉴클레오티드 기준)에 따라 RNA를 분리하여, ISO처리에 의해 유도된 8-옥소구아닌(8-oxoguanine, o8G)을 o8G 특이적 항체로 ELISA를 이용하여 측정하였다. 측정 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, small RNA 에서 large RNA보다 약 3.1배 더 많이 o8G가 생성되었음을 확인하였다. 이는 large RNA가 파라콰트(paraquat, PQ) 처리에 의해 유발되는 산화 스트레스를 받는 경우에도, large RNA (1.8 배)보다 더 급격한 것으로 나타났다.
small RNA의 산화는 도 1d에 나타낸 바와 같이 RNA 유도 침묵 복합체의 핵심 단백질인 Argonaute2 (Ago2)와 o8G의 공존 (colocalization)에 기초하여 miRNA로 추가로 해부되었고, 이는 PE-처리된 rCMC (~8 배)에서 정량화되어 증가되는 것을 확인하였으며, 도 1e에 나타낸 바와 같이 PE- 또는 ISO- 처리된 H9c2에서도 증가되는 것을 확인하였다 (plane 당 o8G+, Ago2+; 100 cells, n=4; P=0.05).
독립적으로, o8G 특이적 항체를 사용한 도트 블롯 분석은 도 1f에 나타낸 바와 같이, 산화환원반응-의존적 방식으로 PE-처리된 H9c2 및 rCMC로부터 small RNA (<200nt)의 산화가 증가하는 것으로 나타났다.
PE 처리된 H9c2 및 ISO 주입 마우스 심장에서 miRNA의 산화를 확인하였을 때, 도 1g에 나타낸 바와 같이 PE 처리된 H9c2 (도 1g의 상단) 및 ISO 주입 마우스 심장 (도 1g의 하단)에서의 northwestern 분석 결과, 및 도 1h에 나타낸 겔 추출 ~20nt miRNA의 도트 블롯 분석 결과를 통해 PE 및 ISO 각각의 처리에 의해 o8G는 ~20nt 크기의 miRNA에서 발행하는 것을 확인하였다.
상기 실험 결과들을 요약하면, 심장 비대는 산화환원반응-의존적이며, ROS의 생성을 가능하게 하고, 생성된 ROS는 miRNA의 o8G 변형을 유도한다.
실험예 2. 심장 miRNA에서의 위치-특이적 o8G의 서열 분석
산화된 miRNA 및 상응하는 o8G 위치를 확인하기 위해, o8G의 면역 침강 (IP)을 최적화하고 o8G-유도된 G>T 염기전환을 검출함으로써 miRNA 에서 o8G에 대한 새로운 시퀀싱 방법 (o8G-miSeq)을 개발하였으며, 이의 모식도를 도 2a에 나타내었다.
먼저, 도 2b에 나타낸 바와 같이 CLIP에 사용된 조건을 채택하여 o8G에 대한 IP 프로세스가 광범위하게 개선되었으며, 도 2c에 나타낸 바와 같이 최적화된 IP는 비특이적 배경(비산화된 G)에 비해 ~3000 배의 합성 o8G 양을 나타내었다. o8G가 A와 쌍을 이룰 수 있기 때문에, cDNA에서 G>T 변이를 유도하는 효능은 ~50-60%에 도달하도록 향상되었으며, 이는 도 2d에 나타낸 바와 같이 획득된 제한 효소 부위의 서열-특이적 절단에 의해 간접적으로 (도 2d의 상단) 및 시퀀싱에 의해 직접적으로 (도 2d의 가운데 및 하단) 입증되었다.
이어서, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 o8G-miSeq를 초기에 H9c2에 적용하고, miR-1b를 그의 기본 발현 (o8G enrichment, log2 (IP/input)=7; miRNA-Seq에 의해 표준화 됨)과 관련하여 가장 산화된 miRNA로서 확인하였고, o8G 풍부도 (enrichment), 즉 miRNA에 대한 input read count에 표준화된 o8G IP의 log 비율은 miRNA 빈도에 따라 점으로 표시하여 도 2e의 좌측 도면에 나타내었으며, 히트맵 밀도로서 서열에서의 G의 수를 도 2e의 우측 도면에 나타내었다.
Figure PCTKR2020017341-appb-T000001
IP는 miRNA의 양 및 G-함량으로부터 편향(bias)을 모두 관찰하지 않음으로써 구체적으로 수행되는 것으로 입증되었으며, Volcano plot으로서 유의성 (-log10(P-value))을 나타낸 도 2f에서와 같이 miR-1b에서 o8G는 유의적으로 높고 (P <0.01), G>T 돌연변이율에 기초하여 seed 영역 (위치 2, 3 및 7)에서 현저한 것으로 확인되었다. 또한, 하기 표 2와 같이 rCMC에 대한 추가 적용에 의해, 도 2g에 나타낸 바와 같이 o8G-miSeq는 seed 영역의 식별된 위치(위치 2, 3 및 7)에서 o8G의 증가 (도 2g의 상단)와 함께 PE 처리에 따라 miR-1b가 우선적으로 산화됨을 추가로 나타내었다 (상대적 o8G 풍부도, log2(PE/Mock)=1.66; 도 2g의 하단).
Figure PCTKR2020017341-appb-T000002
이어서, rCMC의 비대성 표현형을 악화시키기 위해 rCMC를 혈청 결핍에 노출시킨 후 하기 표 3에 나타낸 것과 같이 o8G-miSeq 분석을 위한 PE 처리를 수행하였다. 그 결과, 도 2h에 나타낸 바와 같이 miR-1 서열에서 G>T 전환율에 의해 추정된 바대로, 위치 7에서 o8G는 극적으로 증가하였으며 (miR-1:7o8G, ~2배 증가). 도 2i 및 표 4에 나타낸 바와 같이 강화된 miR-1b 산화를 관찰하는 것 외에도 상당한 양의 o8G (log2(o8G-IP)>10)와 함께 miR-184, let-7f-5p 및 miR-1-3p (P<0.01)와 같은 다른 miRNA에서도 유의적인 산화가 관찰되었다. 특히, miR-184는 도 2j에 나타낸 바와 같이 이전의 H2O2 처리결과와 동일하게 확인되었으며, 그 외의 다른 miRNA의 경우는 약간의 불일치가 있었다.
전반적으로, o8G-miSeq를 사용함으로써, 심장 비대 동안 산화된 miR-1 및 그의 특정 o8G 위치를 정확하게 검출할 수 있었다.
Figure PCTKR2020017341-appb-T000003
Figure PCTKR2020017341-appb-T000004
실험예 3. 산화된 miR-1의 o8G:A 염기쌍을 통한 표적 침묵 효과
상기 실험예 2에서 확인한 바와 같이 산화된 miRNA (miR-1b, miR-1-3p, miR-184 및 let-7f)에 대하여, 도 3a에 나타낸 바와 같이, PE 처리에 따른 o8G IP (miRNA:o8G)을 통해 이들의 양의 유의한 증가를 관찰하고 rCMC에서 이들을 검증하였다 (P<0.05, t-test). 그 중에서 miR-1은 가장 극적인 향상을 보였으며 (~2.5-5배), 도 3b에 나타낸 바와 같이 ISO 처리 후 하향 조절에도 불구하고 ISO-처리된 비대성 마우스 심장에서도 확인되었다.
miR-1을 중심으로, seed 영역에서 식별된 o8G 위치 (위치 2, 3 및 7)가 miR-1 (miR-1:2o8G, miR-1:3o8G 및 miR-1:7o8G)이 o8G:A 염기 결합을 통해 상응하는 새로운 표적 사이트 (2oxo, 3oxo 및 7oxo 사이트)를 인식할 수 있는지 여부를 조사하였고, 그 결과를 도 3c에 나타내었다.
루시퍼라제 리포터 분석을 수행함으로써, 합성된 miR-1:2o8G, miR-1:3o8G 및 miR-1:7o8G가 해당 산화변형시 G;A염기배열로 인식할 수 있는 oxo 사이트 (2oxo, 3oxo 및 7oxo 사이트)를 가진 표적을 침묵시킬 수 있음을 확인하였으며, 이는 miR-1에 의해 억제되지 않았다.
실제로, 도 3d에 나타낸 바와 같이 miR-1 oxo 사이트를 갖는 이들 루시퍼라제 리포터는 모두 PE-처리된 rCMC에서 억제되었지만 항산화제 NAC의 존재 하에서 활성화 되었고, 이는 타겟 인식을 바꾸고 침묵을 수행하기에 충분한 rCMC의 아드레날린성 자극에 의해 생성된 내인성 miR-1:o8G의 수준을 시사한다.
또한, 도 3e에 나타낸 바와 같이 PE 또는 H2O2 처리 직후 AC16에서 일관된 결과를 관찰하였다.
다음으로, 세포 집단의 이질성으로부터 합성 효과를 배제하기 위해, 도 3f에 나타낸 바와 같이 이중 형광 단백질 (dFP) 리포터로 유세포 분석법을 수행하였다: miRNA 표적 사이트를 갖는 녹색 형광 단백질 유전자 (GFP) 및 사이트를 가지지 않는 적색 형광 단백질 유전자 (RFP). dFP 리포터는 비대성 H9c2에서 상대적 활성의 누적 분율 분석 (P=1.56 x 10-5, Kolmogorov-Smirnov test (KS test), GFP/RFP)에 의해 관찰된 것이다.
내인성 miR-1의 낮은 발현 수준(아마도 도 3h에 나타낸 심근 아세포주의 운명 이질성에 기인함)에도 불구하고 도 3g에 나타낸 바와 같이, 개별 H9c2 세포 수준에서 miR-1:o8G-의존적 억제를 검출할 수 있었다. dFP 리포터의 모든 miR-1 옥소 부위 (7oxo, 3oxo 및 2oxo 부위)는 o8G-miSeq (도 2f)에 의해 관찰 된 miR-1:o8G 위치 (2, 3 및 7)와 일치하여 miR-1:o8G의 기저 수준에 의해 매개된 억제를 검출하기 위한 민감도를 가지고 내생적으로 억제되는 것을 도 3i에서 확인하였으며, miR-1 억제제 또는 동족 miR-1 변이체를 형질 감염시킴으로써 확인되었다.
또한, dFP 리포터는 도 3j에 나타낸 바와 같이 비대 H9c2에서 miR-1 7oxo 사이트의 유의한 PE-의존적 억제를 검출하였다.
또한, 두 형광 단백질의 완전한 여기로부터의 감도가 증가함에 따라, 도 3k에 나타낸 바와 같이 사이트를 가지지 않는(no site) dFP 리포터 (RFP:GFP, NT)와 비교하여 값을 비교함으로써 도 3l에 나타낸 miR-1:7o8G (RFP:GFP-7oxo vs. RFP:GFP, NT) 및 도 3m에 나타낸 NAC 처리에 의한 이의 활성화 (RFP:GFP-7oxo, mock vs. NAC)의 내인성 수준에 의한 miR-1의 억제를 검증하여 분석을 면밀히 조사 하였다.
중요하게도, 세포에서 유사한 범위의 대조군 형광값 (RFP)으로 리포터 형광 값 (GFP-7oxo)을 평균화하여 계산된 이러한 상대적 억제는 리포터 형광값 (GFP-7oxo)의 가장 낮은 25% 일 때 두드러졌으며, 높은 수준의 miR-1:7o8G를 갖는 세포 집단의 존재를 암시하는 것으로 고려되었다. 또한, 도 3n에 나타낸 바와 같이 리포터와 대조군 형광 단백질이 상호 교환된 dFP 리포터는 miR-1:7o8G의 내인성 수준에 의한 miR-1 7oxo 사이트의 억제 및 억제의 PE 의존적 증가를 민감하게 검출하였다.
또한, 도 3o에 나타낸 바와 같이 전환된 dFP 리포터를 사용하여, 리포터 값 (RFP)이 25%로 가장 낮은 제한된 세포 집단만 고려할 때 miR-1 7oxo 사이트의 PE-유도 억제가 보다 실질적인 것으로 관찰되었으며, miR-1 억제제를 도입함으로써 회복된 리포터 활성 (RFP)의 관찰은 miR-1 7oxo 부위의 PE-의존적 억제가 miR-1에 의해 매개됨을 추가로 확인하였다. 특히, 도 3p에 나타낸 바와 같이 산화된 miR-1 (2o8G, 3o8G 및 7o8G)의 도입은 산화되지 않은 miR-1보다 덜 강력하지만, o8G:C 염기 결합의 유지된 활성때문에 루시퍼라제 리포터에서 seed 사이트를 억제할 수 있었다. miR-1:7o8G는 아드레날린성 심장 비대에서 획득된 o8G:A 염기 결합을 통해 표적 mRNA를 침묵시키는 것으로 관찰되었다.
실험예 4. miR-1:o8G의 심장 비대 유도 확인
miR-1이 비대에서 음성 기능을 하는 것으로 보고되었지만, PE 처리는 도 4a에 나타낸 rCMC 세포의 현미경 관찰 결과 및 세포 크기 정량 결과와 같이 rCMC의 miR-1-유도 위축을 감소시켰다. 세포 크기 (inch2, n=100)는 ImageJ를 이용하여 정량하였다.
상기 실험예 2에서의 miR-1:o8G의 발견과 PE 유도된 비대의 산화환원반응 의존성에 의해 지속된 합성 miR-1:2o8G, miR-1:3o8G 또는 miR-1:7o8G을 도입하여, 도 4b에 나타낸 바와 같이, PE 처리보다 실질적으로 rCMC의 비대가 더 유도되는 것을 관찰하였다.
이러한 효과는 o8G를 U로 치환한 합성 miR-1 (miR-1:2U, miR-1:3U 및 miR-1:7U)를 도입한 경우에도 대등하게 나타났으며, 이를 통해 비대 현상의 발생이 o8G:A 염기 결합에 의존한다는 것을 알 수 있다.
이러한 효과는 도 4c에 나타낸 바와 같이, H9c2에서도 동일하게 관찰되었다.
구체적으로, 도 4d에 나타낸 qPCR 측정 결과와 같이 miR-1:7o8G 또는 miR-1:7U에 의해 유도된 비대는 PE 처리에서 관찰된 바와 같이 심장 비대 마커로 알려진 심방 artrial natriuretic peptide (ANP)의 발현을 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과는 도 4e에 나타낸 유세포 분석과 rCMC (도 4f의 상단) 및 H9c2 (도 4f의 하단)의 시간 경과 이미지에 의해 추가로 확인하였다.
또한, miR-1:7o8G가 생체 내에서 심장 비대에 미치는 영향에 대해 시험 하였다. 도 4g에 나타낸 바와 같이 miR-1:7o8G를 꼬리 정맥을 통해 비 표적화 대조군 (NT)을 갖는 polyethylenimine (PEI) 복합체로서 주사하고(도 4g의 상단), 정량적 PCR (qPCR)에 의해 심장 조직으로의 전달을 검증하였다(도 4g의 하단). 결과적으로, 도 4h에 나타낸 바와 같이 심장 크기의 적어도 ~10% 이상이 유의하게 증가하였으며 (P=0.001, n=3), 도 4i에 나타낸 바와 같이 H&E 염색한 심장 조직 중에서 심실중격 (interventricular septum, IS)을 면역염색하고 심근 세포의 크기를 정량한 결과 심근 세포 크기의 ~19% 증가 및 ANP 발현의 상당한 상향 조절을 관찰하였다. 이 때, 도 4j에서 WGA(wheat germ agglutinin)는 세포 경계, MF20은 심근세포, DAPI는 핵 염색에 사용하였다.
상기 실험 결과를 요약하면, miR-1, 특히 miR-1:7o8G의 위치-특이적 산화는 o8G:A 염기 결합을 통해 생체 내에서 심장 비대를 충분히 이끌어 낼 수 있다.
실험예 5. 산화된 miR-122, let-7 및 miR-124의 발견과 이로 인한 기능 획득
심근비대증 이외에도 산화스트레스가 발생되는 것으로 알려진 다른 질병에 대해서도 여러 마이크로RNA의 5'말단으로부터 8번째까지의 발단부분이 o8G 변형 여부를 확인하였다.
우선 활성산소가 증가된 것으로 알려진 종양 중, miR-122가 특이적으로 많이 발현되는 간세포에서 유래된 간암세포주인 Huh7에서, miR-122의 구아닌 중 2번째 (2oxo), 3번째 (3oxo), 또는 2번째와 3번째가 o8G 변형이 되어있는지 (2oxo, 3oxo) 루시퍼라아제 리포터를 제작하여 확인해보았다. 이때의 루시퍼라아제 리포터 실험은 miR-122의 발단부분에서 o8G:A 배열로 결합하여 인식할 수 있는 표적싸이트를 5개를 포함하도록 psi-check2 (Promega사) 벡터를 사용하여 제작한 후, Huh7에 트랜스팩션한 후 측정하였다. 또한, 해당 싸이트의 억제가 직접적으로 miR-122에 의한 것임을 밝히기 위해, Huh7에서 CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 교정으로 miR-122 유전자를 없앤 세포주 (Huh7:miR-122 KO)를 miRNA CRISPR knockout kits (Canopy Bioscience사)를 사용하여 제작하여 동일한 조건에서 함께 실험하였다.
상기 실험에 의한 결과는 도 5a에 나타내었다.
실험 결과, 기존의 miR-122가 인식하는 발단 싸이트 (seed: 5'-ACACUCCA-3') 표적이 억제되었을 뿐만 아니라, 2번 o8G 변형 싸이트 (2oxo: 5'-ACACUCAA-3'), 3번 o8G 변형 싸이트 (3oxo: 5'-ACACUACA-3'), 2번과 3번이 동시에 o8G 변형된 싸이트 (2oxo, 3oxo: 5'-ACACUAAA-3' )가 억제되었다.
또한, Huh7:miR-122 KO 에서 miR-122의 3번 o8G 변형 싸이트 (3oxo), 2번과 3번이 동시에 o8G 변형된 싸이트 (2oxo, 3oxo)의 억제가 사라지는 것을 관찰하여, 해당 억제가 miR-122의 변형에 의한 것임을 증명하였다.
let-7에 대해서 4번째 o8G 싸이트(4oxo: 5'-CUACAUCA-3')에 대한 루시퍼라아제 리포트를 이전과 동일한 방법으로 제작하고 이를 이용하여 종양교모세포인 HS683에서 측정해본 결과 let-7의 발단 싸이트 (seed: 5'-CUACCUCA-3') 보다는 그 저해정도가 작지만, 대조군에 비하여 유의하게 억제되는 것 (P<0.01)을 확인하였으며, 그 결과는 도 5b에 나타내었다.
또한, 신경세포 및 교모세포에서 많이 발현되는 것으로 알려진 miR-124에 대해서도 동일하게 o8G 변형이 발단 지역에 생성되었는 지를 알아보기 위해서, miR-124의 4번째 o8G 변형 표적 싸이트 (4oxo: 5'-GUGCAUUA-3')에 대해서도 루시퍼라아제 리포터 실험을 교모세포종인 HS683 세포에서 실시하였으며, 그 결과는 도 5c에 나타내었다.
실험결과 miR-124의 발단 싸이트(seed: 5'-GUGCCUUA-3')는 억제가 되었으나, 4oxo 싸이트의 억제는 관찰되지 않았다. 종양세포의 경우 영양분이나 혈액공급이 부족할 경우 산화스트레스가 증가되어 세포내의 산화가 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, HS683에서 발현되는 miR-124의 o8G 변형이 이러한 상황에서 증가하는지를 알아보기 위해서, 세포배양 배지에 혈청을 없애고 실험을 진행해보았고, 이 때에는 miR-124의 4oxo 싸이트가 유의하게 (P<0.01) 억제되는 것을 발견하였다.
상기 실험 결과를 통하여, 간암 세포의 miR-122에서는 2번째, 3번째, 또는 2번째 3번째가 함께 o8G 변형이 되어 있다는 사실과, 교모세포종에서는 let-7의 4번째 염기가 o8G 변형이 되어 있고 miR-124는 배양액에서의 혈청 제거와 같이 종양 세포에서 일어날 수 있는 산화스트레스를 주었을 때 4번째 염기의 o8G 변형이 일어나, 이들이 새롭게 인식하는 표적 유전자에 대해서 그 발현을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
간암세포에서 전이가 되기 위해서는 우선적으로 간암세포의 이동능력이 필요하고, 이 때 miR-122의 발현은 간암 세포의 이동을 억제하는 것으로 알려져 있다. 간암세포주인 Huh7에서 miR-122가 2번째와 3번째가 o8G 변형(miR-122:2,38G)이 되어 있는 것을 관찰하였으므로, 해당 산화 miR-122가 간암세포의 이동능력에 영향을 미치는지를 살펴보기 위해서, miR-122:2,3o8G (5'p-Uo8Go8GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3', 서열번호 65)를 Trilink사의 RNA합성 서비스를 통해 합성하고 이를 passenger strand(has-miR-122-5p)와 이중체를 만든 후 Huh7에 트랜스팩션 시킨 후 상처치유분석 (wound-healing assay) 실험을 진행하였다.
실험 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, 대조군인 NT-6pi (cel-miR-67의 6번째 염기를 모두 dSpacer로 치환한 것)에 비해서 miR-122:2,3o8G를 세포에 도입했을 때 Huh7의 이동능력이 현저하게 저해됨을 확인하였다.
이렇게 세포에 도입된 miR-122:2,3o8G는 세포내의 활성산소에 의해서 다른 구아닌이 추가적으로 산화되어 그 기능이 다소 줄어들 가능성이 있다(도 8e 참조). 따라서, 세포 배양용 항산화제(Sigma-Aldrich사의 antioxidant supplement)를 처리하고 동일하게 상처치유분석 실험을 진행해 보았을 때는, miR-122:2,3o8G의 간암세포 이동 억제능이 더 크게 나타남을 확인하였다. 즉 o8G 변형된 마이크로RNA의 생물학적인 효과는 해당 세포에 항산화제를 함께 처리함으로서 그 기능을 극대화 할 수 있다.
또한, 교모세포종에서 확인한 o8G 변형 마이크로RNA인 let-7:4o8G 의 기능을 조사하기 위해서, 이를 siRNA형태로 합성하고 (let-7:4o8G: 5'p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3', 서열번호 66 ) duplex 형태로 HS683 세포에 도입한 후 세포사멸(apoptosis)을 eBioscience Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Invitrogen사)를 사용하여 Attune NxT 유세포 분석기를 통해 측정하였다.
실험 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이, HS683의 세포사멸이 유의하게 증가되었음을 확인하였다.
상기와 동일한 실험을 miR-124:4o8G의 siRNA 합성 형태( 5'p- UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3', 서열번호 67) 에 대해서 수행하였고, 도 5f에 나타낸 바와 같이, 세포사멸이 유도됨을 관찰하였다.
실험예 1 내지 5의 실험 결과를 참조하면, 여러 마이크로RNA의 발단지역 (5'말단 기준 8번째까지의 염기)에 일어나는 o8G 변형은 합성하여 해당 세포내로 도입하였을 때 다양한 병리생리학적 기능을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
실험예 6. 심근병증에서 miR-1:7o8G 및 이의 기능 상실
인간 심근병증 환자 심장의 좌심실로부터 얻은 Ago HITS-CLIP 결과를 분석함으로써 miR-1의 산화를 조사하였다 (n=6, 표 5 내지 7 참조).
Figure PCTKR2020017341-appb-T000005
Figure PCTKR2020017341-appb-T000006
Figure PCTKR2020017341-appb-T000007
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 비록 비율은 낮았지만, Ago- 관련 miR-1에서 동일한 패턴의 G>T 돌연변이 (위치 2, 3, 7)가 검출되었고 (도 6a 좌측 도면), 주로 가장 높은 빈도의 위치 7과 더불어 다른 작은 위치 (위치 2, 3, 및 12; n=4)를 가진 환자 그룹 (1,2,4 및 5)을 포함하는 것으로 군집화되었다; 다른 하나 (3 및 6)는 위치 2에서 독점적으로 가장 높은 빈도를 가졌다 (n=2)(도 6a 우측 도면). 표준화된 Ago-mRNA 클러스터에서, 위치 2, 3, 또는 7을 통해 o8G:A 결합으로 나타나는 산화된 miR-1 표적 사이트는 도 6b에 나타낸 바와 같이 예상보다 현저하게 관찰되었으며 (P<0.01, chi-square test), G:U 결합 (~10%) 및 control 사이트 (~7%)를 초과하는 평균 ~18%에 해당한다.
miR-1:7o8G의 생리학적 관련성을 추가로 다루기 위해, 기능 손실을 평가 하였다. seed-매개된 표적 부위의 탠덤(tandem) 반복을 보유하기 위해 RNA로서 합성된 경쟁적 억제제인 miRNA sponge로부터의 개념을 채택하여, 도 6c에서와 같이 miR-1 (anti-seed) 및 miR-1:7o8G (anti-7oxo)를 준비하였으며 (도 6c의 상단), 이들의 특정 억제에 대해 검증하였다 (도 6c의 하단).
anti-7oxo (9x)의 억제 활성은 도 6d에 나타낸 바와 같이 RNA-Seq (표 8 참조)를 수행함으로써 혈청이 결핍된 H9c2에서 miR-1 7oxo 표적을 전체적으로 억제하는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2020017341-appb-T000008
이어서, 도 6e에 나타낸 바와 같이 anti-7oxo (4x)가 rCMC에 도입되고 PE-유도 비대를 약화시키는 것으로 나타났다. 또한 합성된 anti-7oxo (4x) RNA 로서 또는 13 개의 표적 부위를 함유하는 심근 세포-특이적 발현 벡터 (α-MHC 13x)로서 ISO-처리된 마우스에 주입된, anti-7oxo (4x 및 α-MHC 13x) 둘 다 도 6f에 나타낸 바와 같이 강력하게 아드레날린성 심장 비대에 길항작용을 하였으며, anti-7oxo (α-MHC 13x)의 전달 정도가 확인되고 이들의 억제 활성과 상관 관계가 있는 것으로 관찰되었다.
anti-7oxo (α-MHC 13x)의 투여는 도 6g에 나타낸 바와 같이 심근 세포 크기를 유지시켰고 (도 6g의 상단), miR-1:7o8G 타겟을 전체적으로 억제하였다 (도 6g의 하단 및 표 9 참조). 그러나, 도 6h에 나타낸 바와 같이 ISO 처리 마우스 심장에서 ROS 상승에 미치는 영향은 없었다
Figure PCTKR2020017341-appb-T000009
또한, 도 6i에 나타낸 바와 같이, anti-7oxo (α-MHC 13x)를 발현하는 형질전환 마우스를 생성하였고 (TG), 표 10 및 도 6j에 나타낸 바와 같이 이의 발현이 확인되었다 (RNA-Seq).
Figure PCTKR2020017341-appb-T000010
그 결과, 도 6k에 나타낸 바와 같이 그들의 심장 크기에 기초적인 차이는 없었으나 (도 6k의 상단), ISO-유도된 심장 비대는 3 개의 상이한 TG 모델 모두에서 유의하게 예방되었고 (도 6k의 하단), 도 6l에 나타낸 바와 같이 miR-1:7o8G 표적의 전체적인 억제를 나타냈으며, 도 6m에 나타낸 바와 같이 ISO 처리 (TG(+)ISO vs. TG(-)ISO)의 존재 하에서도 IS에서 심근 세포의 크기가 감소하였다.
종합하면, miR-1, 특히 miR-1:7o8G의 위치-특이적 산화는 심장 비대 및 질병의 내인성 드라이버 역할을 하면서 심근병증 환자에서 표적 상호작용을 발생시키고 바꾸는 것을 시사함을 입증하였다. 이와 관련하여, ROS에 의해 유도된 본 발명에 따른 miR-1:7o8G의 위치 특이적 산화 및 이의 심장 비대 유도 과정에 대한 개략도를 도 6n에 나타내었다.
실험예 7. 심비대증 동물 모델의 혈장 (plasma)에서 miR-1:o8G 증가 확인
심비대증 모델 및 심근비대 환자의 심장조직에서 miR-1의 o8G 변형이 증가되는 것을 관찰한 후, 이를 비침습적으로 검출하여 심비대증을 진단할 수 있는지 확인하기 위해서, 심비대증을 유도시킨 마우스의 혈액에서 miR-1의 o8G 변형을 검출하고자 하였다. 우선 ISO 처리를 통해 마우스의 심비대증이 유도되었는지를 확인하였다. 도 7a는 ISO를 통하여 유도한 심비대증의 대표 심장 사진으로 각 군당 3마리이다. ISO 가 처리된 실험군의 심장이 대조군에 비해 평균적으로 약 30% (36% H/B vs 32% H/T) 로 심장 크기가 증가하였다. 이의 자세한 내용은 표 11에 기록하였다. 또한, 동물모델의 혈액에서 miR-1:o8G 가 측정되는지, 또한 심비대증에 enrichment 되는지 확인하기 위해, 혈장을 분리하고 miR-1:o8G 를 정량하였다 (n=3).
Figure PCTKR2020017341-appb-T000011
이어, 각 동물 모델로부터 분리한 혈액에서 혈장을 분리하고 small RNA를 추출한 후, 분리된 small RNA에서의 miR-1의 양을 측정하면서 동시에 miR-1이 o8G 변형된 양을 o8G 에 대한 면역침강을 통해 측정하였다 (도 7b). 동량의 혈장에서 추출된 RNA로부터 miR-1의 양을 측정한 결과, miR-1이 혈장에 존재하며, 해당 양은 심비대 유도와 상관없이 동량이 존재하는다는 것을 실험군과 대조군 사이의 측정 결과가 통계적으로 유의하지 않게 나오는 것으로 확인할 수 있었다 (도 7c).
이후 혈장에 존재하는 miR-1:o8G 를 확인하기 위해 혈장에서 분리한 small RNA에 대해 o8G-IP를 진행하였다 (도 7b). 이때 o8G-IP과정에서의 차이를 보정하여 정량하기 위해 o8G 가 5번 위치에 DNA로 합성된 human miR-124-3p를 면역침강 전에 small RNA 샘플에 동량을 넣어 사용하였다. 그 결과, 심비대증 혈장에서 관찰한 산화 변형된 miR-1:o8G 은 각 3마리의 경우 평균적으로 약 379% 증가하였으며, 이 변화는 통계적으로 유의미함을 Student's t-test 결과를 통해 확인하였다 (p= 0.031) (도 7d). 종합하여 보면, 혈장에서 qPCR을 통해 측정된 microRNA-1는 심비대증과 대조군에서 차이가 없지만, o8G-IP-qPCR 을 통해 산화 변형된 microRNA-1 (miR-1:o8G) 를 측정한 결과 심비대증에서 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 이를 통해 비침습적으로 혈액을 기반으로 하여 miR-1:o8G 측정을 통해 심비대증을 진단할 수 있다는 점을 관찰하였다.
실험예 8. 심근 비대에 대한 항산화제의 효과 및 항산화제 처리 시 miR-1:7o8G를 억제하는 anti-miR-1-7oxo의 심근세포 비대 억제능 향상 확인.
PE처리에 의해 유도된 비대 세포에 항상화제 NAC를 처리하면, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 비대가 감소된 것을 확인하였으며 (n=4; inch2, ImageJ), 도 8b에 나타낸 바와 같이, ISO와 NAC의 공동 처리는 ISO-유도된 심장 비대를 약화시킴을 확인하였다.
또한, 도 8c에 나타낸 바와 같이, ISO 또는 PE 처리에 의한 o8G 증가가 NAC의 처리에 따라 감소하는 것을 확인하였다 (scale bar, 100μm). 즉 항산화제 NAC의 처리에 따라 miRNA의 산화가 감소하였다.
NAC처리에 의해서 ISO에 의한 심비대증이 억제되는 현상을 관찰한 후 (도 1b), 다른 항산화제 처리를 통해서도 동일하게 심비대증을 억제할 수 있는지를 확인하기 위해서, H9c2 세포에 PE와 ISO를 처리하여 심근세포의 비대를 유도시키면서 다른 항산화제인 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA)과 세포배양용 항산화제로 판매되고 있는 Sigma-Aldrich사의 Antioxidant Supplement (A1345)를 처리해보았다 (도8d). 그 결과, 항산화제의 종류에 상관없이 모두 심근세포의 크기를 줄였으며, 특히 PE나 ISO를 처리하더라고 전혀 H9c2 심근세포주의 크기가 커지지 않는다는 것을 3번의 반복 실험으로 통계적으로 유의하게 확인하였다 (*, P<0.01).
또한, 쥐(rat) 배아에서의 일차심근세포(rCMC)를 배양한 후 PE처리에 의해서 해당 세포에서 비대증이 일어남을 확인하였다 (도 8e, 위 패널). 여기에 miR-1의 7번이 o8G 변형된 형태(miR-1:7o8G)를 억제하도록 이를 인식하는 7oxo site를 여러 개 포함하는 저해용 anti-7oxo(4x)를 도입했을 때, 심근세포의 비대가 진행되었다가 억제되는 것을 다시 확인하였으며, 추가적으로 항산화제인 NAC를 함께 처리하였을 때에는 심근세포가 전혀 비대해지지 않는 최대의 효과를 관찰할 수 있었다 (도 8e, 중간 패널). 이러한 결과는 항산화제의 효과가 anti-7oxo(4x)와 시너지하게 작용하여 일어나는 현상일 수 있으며, 또한 anti-7oxo(4x)를 세포에 도입 후 PE처리에 의해서 증가되는 활성산소에 의해서 추가적으로 일어날 수 있는 o8G 산화가 anti-7oxo(4x)에 일어나는 것을 막아서 나타내는 효과 일 수도 있다. 실제로 세포에 인위적으로 도입하는 RNA에서 추가적인 o8G 생성이 일어나서 그 효과가 저해되는 지를 알아보기 위해서, 이번에는 활성산소가 발생되는 PE처리가 아닌 miR-1:7o8G 도입으로 심근세포 비대를 유도하고 동시에 산화스트레스를 가하고자 100μM의 과산화수소(H2O2)를 처리해보았다 (도 8e, 아래 패널). 그 결과, 기존의 miR-1:7o8G 발현으로 인한 심근세포 비대 현상이 과산화수소 처리에 의해서 저해되는 것을 관찰하였으며, 이와는 반대로 항산화제인 NAC를 처리하였을 때는 miR-1:7o8G에 의해 유도되는 심근세포 비대가 보다 효율적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 이러한 결과로 미루어 보아, 항산화제 처리는 NAC만이 아닌, BHA와 다른 일반적인 세포배양용 항산화제 등 항산화 효과를 나타낼 수 있다면 심근세포 비대를 억제할 수 있다는 사실을 확인했을 뿐만 아니라, 항산화제의 처리는 o8G 변형된 마이크로RNA 또는 이를 억제하는 RNA 에 일어날 수 있는 추가적인 산화변형을 막아 인위적인 RNA 발현을 통한 심근세포 크기의 조절을 효율적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 심비대증은 생리적 비대와 병리적 비대로 나타나는데, 생리적 비대는 운동선수나 임산부의 경우 충분한 혈액공급이 필요할 때 이를 원할하게 공급하기 위해서 심장을 비대하게 하는 경우로 상황에 따라서는 심장의 기능을 강화하기 위한 용도로 임시적으로 유도하는 것이 필요할 수 있다. 따라서 심근세포로의 miR-1:7o8G 도입으로 인한 심비대 유도는 이러한 생리적 비대로서 작용할 수도 있으며, 이때의 항산화제 처리는 심근세포 비대의 효과를 효율적으로 유도할 수 있을 뿐 아니라, 일반적으로 병리학적 현상을 일으키는 추가적인 산화스트레스를 막아 병리적 심비대증을 억제하는 효과를 나타낼 수도 있을 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (30)

  1. 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 서열을 포함하는 RNA간섭 유도 핵산.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 마이크로 RNA는 하기 그룹 1의 마이크로RNA 중 하나 이상인 RNA 간섭 유도 핵산:
    [그룹 1]
    miR-1, miR-184, let-7f-5p, miR-1-3p, miR-122, let-7, miR-124.
  4. 제1항에 있어서,
    8-옥소구아닌(o8G)의 위치에서 o8G:A 배열이 일어나 표적 사이트를 인식하는 RNA 간섭 유도 핵산.
  5. 제1항에 있어서,
    하기 그룹 2의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산:
    [그룹 2]
    서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
    서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
    서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p- UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
    서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-Uo8Go8GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3');
    서열번호 66의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3');
    서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p- UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3').
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산을 세포 또는 동물에 주입할 경우 심근비대, 간암세포의 이동 억제 또는 세포사멸이 유도되는 RNA 간섭 유도 핵산.
  7. 제1항의 RNA 간섭 유도 핵산 및 항산화제를 포함하는 조성물
  8. 하기의 단계를 포함하는, 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)의 위치 동정 방법:
    (a) 세포로부터 RNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 RNA로부터 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 항-o8G 항체를 이용하여 면역침강법(IP)으로 분리하는 단계;
    (c) 상기 분리한 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된RNA를 역전사하여 cDNA를 제조하고 8-옥소구아닌(o8G)의 위치를 파악하기 위한 시퀀싱 라이브러리를 제작하여 시퀀싱하는 단계; 및
    (d) 상기 시퀀싱 결과 구아닌 (G)이 티민 (Thymine; T)으로 변형된 위치를 확인하여 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌 (o8G)으로 변형된 위치를 동정하는 단계.
  9. 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산으로서,
    상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
    상기 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함하는 변형 핵산.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 변형된 마이크로RNA는 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 것이고,
    상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 또는 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
    상기 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(A)을 포함하는 변형 핵산.
  11. 제9항에 있어서,
    5’-ACAUUCA-3’, 5’-ACAUUAC-3’, 5’-AAAUUCC-3’중 하나 이상의 염기 서열을 포함하는 변형 핵산.
  12. 제9항 내지 제11항의 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산으로서,
    상기 변형 핵산은 마이크로RNA의 5'말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나로부터 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
    상기 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함하는 변형 핵산 또는
    상기 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는
    심비대증 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p인 심비대증 치료용 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    항산화제를 더 포함하는 심비대증 치료용 약학 조성물.
  16. 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는, 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 마이크로 RNA는 miR-122인 간암치료용 약학 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 let-7 또는 miR-124인 교모세포종 치료용 약학 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    항산화제를 더 포함하는 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물.
  20. 항산화제를 유효성분으로 포함하는 심비대증 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 항산화제는 RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)의 8-옥소구아닌 (8-oxoguanine; o8G)으로의 산화 변형을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 항산화제는 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC) 또는 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA)인 약학 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p인 약학 조성물.
  23. 동물의 심근 세포로부터 분리된 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형되어 있는지 여부를 확인하는 단계; 및
    상기 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형되어 있는 경우 심비대증으로 분류하는 단계를 포함하는,
    심비대증 진단을 위한 정보제공방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드인, 심비대증 진단을 위한 정보제공방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드인, 심비대증 진단을 위한 정보제공방법.
  26. 제23항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p인, 심비대증 진단을 위한 정보제공방법.
  27. (a) 제8항의 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 벡터를 제작하는 단계;
    (b) 상기 재조합 벡터를 동물의 수정란에 도입하는 단계; 및
    (c) 상기 수정란을 발생시켜 형질전환 동물 모델을 수득하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델의 제작 방법.
  28. 제27항의 방법으로 제작된, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델.
  29. (a) 심비대증 동물 모델의 심근 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 심비대증 동물 모델의 심근 세포에서 발현되는 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 구아닌 (Guanine; G)의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로의 변형 빈도를 분석하는 단계; 및
    (c) 상기 8-옥소구아닌(o8G)이 후보물질을 처리하지 않은 경우에 비해 감소할 경우, 상기 후보물질을 심비대증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는, 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 후보물질은 항산화제인, 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
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US17/780,600 US20230227820A1 (en) 2019-11-28 2020-11-30 Rna interference-inducing nucleic acid comprising 8-oxoguanine, modified nucleic acid binding to microrna comprising 8-oxoguanine, and uses thereof

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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101481007B1 (ko) 2012-07-19 2015-01-14 전남대학교산학협력단 심장 비대 억제 조성물 및 이를 포함하는 심장비대증 치료제
KR20180040107A (ko) * 2016-10-11 2018-04-19 주식회사 인코드젠 Rna 간섭 유도 핵산 및 이를 포함하는 hpv 감염 유발 암의 치료용 약학 조성물
KR102012943B1 (ko) * 2018-05-31 2019-08-21 고려대학교 산학협력단 마이크로rna의 비정규 표적을 억제하는 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010111290A1 (en) * 2009-03-23 2010-09-30 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions related to modified guanine bases for controlling off-target effects in rna interference
EP2754714A1 (en) * 2013-01-14 2014-07-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Inhibitory oligonucleotides and their use in therapy
CN104940230A (zh) * 2015-06-24 2015-09-30 青岛大学 一种通过自由基攻击微小rna造成rna氧化损伤的方法
CN104878117A (zh) * 2015-06-24 2015-09-02 青岛大学 一种氧化修饰的微小rna筛选方法
WO2018209288A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded rna complexes and uses related thereto

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101481007B1 (ko) 2012-07-19 2015-01-14 전남대학교산학협력단 심장 비대 억제 조성물 및 이를 포함하는 심장비대증 치료제
KR20180040107A (ko) * 2016-10-11 2018-04-19 주식회사 인코드젠 Rna 간섭 유도 핵산 및 이를 포함하는 hpv 감염 유발 암의 치료용 약학 조성물
KR102012943B1 (ko) * 2018-05-31 2019-08-21 고려대학교 산학협력단 마이크로rna의 비정규 표적을 억제하는 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAPECCHI, MR, CELL, vol. 22, 1980, pages 479
DAVIS ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1986
GRAHAM, FL ET AL., VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456
HEEYOUNG SEOK, HAEJEONG LEE, SOHYUN LEE, SEUNG HYUN AHN, HYE-SOOK LEE, GEUN-WOO D. KIM, JONGJIN PEAK, JONGYEUN PARK, YOU KYUNG CHO: "Position-specific oxidation of miR-1 encodes cardiac hypertrophy", NATURE, vol. 584, no. 7820, 5 August 2020 (2020-08-05), pages 279 - 285, XP037218303, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/s41586-020-2586-0 *
HUANG, Z. P. ET AL., CIRC RES, vol. 112, pages 1234 - 1243
LEE, H. S. ET AL., NATURE COMMUNICATIONS, vol. 6, pages 10154
MALAYAPPAN B , GARRETT T.J. , SEGAL, M , LEEUWENBURGH, C.: "Urinary analysis of 8-oxoguanine, 8-oxoguanosine, fapy-guanine and 8-oxo-2'-deoxyguanosine by high-performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry as a measure of oxidative stress", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. 1167, no. 1, 11 September 2007 (2007-09-11), pages 54 - 62, XP022241952, ISSN: 0021-9673, DOI: 10.1016/j.chroma.2007.08.024 *
NEUMANN E ET AL., EMBO) J, vol. 1, 1982, pages 841
QIONGMAN KONG , CHIEN-LIANG GLENN LIN: "Oxidative damage to RNA: mechanisms, consequences, and diseases", CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES, vol. 67, no. 11, 11 February 2010 (2010-02-11), pages 1817 - 1829, XP019837803, ISSN: 1420-9071, DOI: 10.1007/s00018-010-0277-y *
See also references of EP4144349A4
SPENGLER, R. M. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES, vol. 44, pages 7120 - 7131
WANG JIAN-XUN, GAO JIE, DING SU-LING, WANG KUN, JIAO JIAN-QIN, WANG YIN, SUN TENG, ZHOU LU-YU, LONG BO, ZHANG XIAO-JIE, LI QIAN, L: "Oxidative Modification of miR-184 Enables It to Target Bcl-xL and Bcl-w", MOLECULAR CELL, vol. 59, no. 1, 1 July 2015 (2015-07-01), pages 50 - 61, XP055817198, ISSN: 1097-2765, DOI: 10.1016/j.molcel.2015.05.003 *
WANG, J. X. ET AL.: "Oxidative Modification of miR-184 Enables It to Target Bcl-xL and Bcl-w", MOL CELL, vol. 59, pages 50 - 61, XP055817198, DOI: 10.1016/j.molcel.2015.05.003
WONG, TK ET AL., GENE, vol. 10, 1980, pages 87

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