WO2021100719A1 - アナフィラキシーの発症を予測するためのデータを収集する方法 - Google Patents

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WO2021100719A1
WO2021100719A1 PCT/JP2020/042862 JP2020042862W WO2021100719A1 WO 2021100719 A1 WO2021100719 A1 WO 2021100719A1 JP 2020042862 W JP2020042862 W JP 2020042862W WO 2021100719 A1 WO2021100719 A1 WO 2021100719A1
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WO
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ovm
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anaphylaxis
dcp
ige
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PCT/JP2020/042862
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博 木戸
鈴木　宏一
仁美 多田
和加子 品原
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応用酵素医学研究所株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the cutoff value determined by ROC analysis based on the degree of affinity (avidity) of IgE antibody for allergens in samples collected from infants / children with allergies is used as a criterion for determining the infants / children. On how to collect data to predict the likelihood of developing anaphylaxis.
  • Food allergy is defined as "a phenomenon in which symptoms that are detrimental to the living body are induced through an antigen-specific immunological mechanism caused by food” (see, for example, Non-Patent Document 1 and the like). It is said that oral immune tolerance usually works for foods that humans digest and absorb to maintain their lives so that the body does not react to undigested foreign substances. .. However, it is said that 5-10% of infants in the birth population develop some kind of food allergy by the first year of life, and the mechanism of the onset and the method of predicting the onset have not been completely elucidated.
  • Anaphylaxis is defined as "a hypersensitivity reaction in which the invasion of an allergen causes systemic allergic symptoms, including multiple organs, which can be life-threatening (rather than minor)” (eg, non-minor). See Patent Document 2 etc.). Therefore, for patients with allergies, the risk of anaphylaxis is of great concern.
  • An object of the present invention is to provide a means for predicting the risk of developing anaphylaxis in infants and children with allergies.
  • the present inventors considered that in a situation where it is not possible to effectively predict the onset of anaphylaxis simply by using the antibody titer of the IgE antibody as a parameter, another parameter may be necessary for predicting the onset of anaphylaxis. .. That is, in addition to IgE antibody, IgG1 antibody, IgG2 antibody, IgG3 antibody, IgG4 antibody, IgM antibody, IgA antibody, IgD antibody, etc. that react with the same allergen are present in the blood, and each of these antibodies is present. It was considered necessary to take into account that it is a polyclonal antibody that recognizes multiple epitopes in the antigen.
  • the present inventors selected a value of 1 / IC50 as a parameter indicating the avidity of the IgE antibody against the allergen, and multiplied the IgE antibody titer of each allergen-sensitized infant / child by the 1 / IC50 value, and the anaphylaxis value.
  • 1 / IC50 the avidity of the IgE antibody against the allergen
  • the value obtained by multiplying the IgE antibody titer by the 1 / IC50 value is the sensitivity and specificity as compared with the conventional test using only the IgE antibody amount.
  • AUC Area Under Curve
  • the present invention is specified by the following matters.
  • [1] Predict the risk of developing anaphylaxis in infants and children based on the cutoff value determined by ROC analysis based on avidity for IgE antibody allergens in samples collected from infants and children with food allergies. How to collect data to do.
  • the cutoff value determined by the ROC analysis based on the avidity of the IgE antibody against the allergen is the cut determined by the ROC analysis based on the value obtained by multiplying the antibody titer of the IgE antibody against the allergen by the avidity of the IgE antibody against the allergen.
  • the method for collecting the data according to the above [1] which comprises an off value.
  • FIG. 1 A schematic diagram of a DCP chip on which a protein is immobilized is shown.
  • Five types of heated chicken egg allergens against ovomucoid (OVM) were conducted on 343 infants aged 1 to 6 years who were judged to be class 2 or higher by the immunocap method for allergic positives and negatives in heated chicken egg OFC.
  • OVM ovomucoid
  • CAP OVM sIgE U / mL
  • DCP OVM sIgE BUe / mL
  • DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 [(BUe / mL) / (nM)]
  • DCP OVM sIgE The result of ROC analysis using 1 / DCP OVM sIgE IC50 (nM) is shown by the ROC curve.
  • the method of collecting data for predicting the risk of developing anaphylaxis in infants and children with food allergies is based on the avidity of IgE antibody against allergens in samples collected from infants and children with food allergies.
  • the method is not particularly limited as long as the method uses the cutoff value determined by the ROC analysis as a criterion, and the cutoff value determined by the ROC analysis based on the avidity of the IgE antibody against the allergen is the antibody titer of the IgE antibody against the allergen.
  • the cutoff value determined by ROC analysis using the value obtained by multiplying the avidity of the IgE antibody against the allergen as a parameter, and the cutoff value determined by ROC analysis using the IC50 of the IgE antibody as a parameter can be mentioned. It is also possible to make a judgment by using these two cutoff values together.
  • the method of the present invention also includes a non-medical method of collecting data, that is, a method of collecting data non-medically, and predicts the risk of developing anaphylaxis in infants and children with food allergies, excluding the actions of doctors. It also includes a method of collecting data to do so. Examples of the above food allergies include allergic reactions caused by specific foods that can be allergens, and anaphylaxis includes hypersensitivity reactions that can be life-threatening and are particularly serious among allergic reactions. ..
  • the above allergen means an antigen that establishes an allergen sensitization or induces an allergic reaction or even anaphylaxis.
  • any antigen protein or peptide capable of inducing the production of IgE antibody in humans, other sugar chains, nucleic acids, etc. are not particularly limited, but meat such as eggs, milk, beef, salmon, and tuna.
  • Examples of food allergen components such as fish such as fish, shrimp, crab and other shellfish and soft animals, grains, beans and nuts, fruits, vegetables, beer yeast, gelatin, etc., among others, ⁇ s1- Milk allergens such as casein, ⁇ s2-casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -lactoalbumin, ⁇ -lactoglobulin (BLG), which is the main component of whey allergen, ovomucoid (OVM), ovoalbumin (OVA), Conalbumin, or a mixture thereof, egg white allergen (EW), egg yolk allergen, and mixed egg allergen, gliadin, wheat allergen such as gluten, buckwheat allergen, peanut allergen such as Arah1, 11S globulin, etc.
  • Shell allergens such as sesame allergen and tropomyosin protein can be exemplified as major allergens.
  • the above-mentioned allergen sensitization is a state in which when an allergen enters the body, an immune function that treats it as a foreign substance and tries to eliminate it works, and an IgE antibody that recognizes and binds to the allergen is produced. Such a state is the allergen. It is said that they are sensitized to allergens or that allergen sensitization has been established, but allergen sensitization alone does not necessarily cause an allergic reaction.
  • the allergic reaction when the allergen is invaded again in the situation where the allergen sensitization is established, the IgE antibody on the mast cell binds to the allergen and the mast cell releases a chemical mediator such as histamine.
  • a chemical mediator such as histamine.
  • the above allergic symptoms include skin symptoms such as itching, urticaria, vascular edema, redness, and eczema; eye symptoms such as conjunctival hyperemia / edema, itching, tearing, and eyelid edema; nose such as squeezing, nasal juice, and nasal obstruction.
  • Symptoms include skin symptoms such as itching, urticaria, vascular edema, redness, and eczema; eye symptoms such as conjunctival hyperemia / edema, itching, tearing, and eyelid edema; nose such as squeezing, nasal juice, and nasal obstruction.
  • Symptoms Symptoms
  • Oropharyngeal symptoms such as discomfort / swelling of the oral cavity / lips / tongue, itching / swelling of the throat
  • Digestive symptoms such as abdominal pain, nausea, vomiting, diarrhea, bloody stools; , Pantrum, respiratory distress, asthma and other respiratory symptoms
  • the sample in the present invention is not particularly limited as long as it is a sample collected from an infant or child having allergies, and examples thereof include body fluids such as blood, serum, plasma, saliva, tears, nasal discharge, and urine collected from the patient. Although it can be done, serum and plasma are preferable.
  • serum is used as a sample, for example, blood can be collected from the brachial vein of a patient, the obtained blood is allowed to stand at 4 ° C. overnight, centrifuged, and the supernatant can be used as serum.
  • the infants / children having the above food allergies include infants / children aged 1 year and 0 months (1 year old) to 12 years old, preferably infants / children aged 1 to 6 years, and more preferably infants aged 1 to 3 years.
  • Infants and children who are clearly allergic to food allergies, and infants and children who are allergic positive by a known method and are determined to have food allergies can be mentioned.
  • Specific methods for determining that an infant / child has a food allergy include a skin prick test, a basophil activation test, a known IgE test method, and OFC, allergies based on the criteria of each method. Can be mentioned as a method of determining whether or not the patient has.
  • any method can detect the IgE antibody against the allergen in the sample and quantitatively measure the IgE antibody titer, including the above-mentioned known IgE test method.
  • the ELISA method using a labeled secondary antibody performed on a carrier can be preferably mentioned.
  • a carrier in the ELISA method it is advantageous to use a commercially available ELISA chip, a chip having a carbon layer formed on the surface of the carrier, or a peptide because it has less non-specific adsorption.
  • a chip into which a chemically modifying group has been introduced and a chip that has been subjected to an activation treatment can be mentioned, and among them, a DCP chip can be preferably mentioned.
  • the DCP method using the above-mentioned DCP chip, the immunocap method, Arastat 3g, Immunofast Check, Oriton IgE and the like can be exemplified.
  • blood samples such as serum are measured 1 to several tens of times, preferably 1.1 to 10 times, from the viewpoint of measuring with higher accuracy within the range of calibration line accuracy.
  • the IgE antibody titer it is also preferable to quantify the IgE antibody titer after diluting it 1.5 to 5 times more preferably. In that case, after measuring the IgE antibody titer by the DCP method using a DCP chip or the like, the dilution ratio of the blood sample Finally, it is necessary to determine the IgE antibody titer.
  • DCP method As a method for determining whether a target infant / child has an allergy, it is determined based on the degree of IgE antibody production in the blood sample of the target infant / child, that is, the IgE antibody titer. Yes, specifically, although the value varies depending on the allergen, taking ovomucoid (OVM) as an example, a method for determining allergy when it is 800 BUe / mL or more, preferably 1000 BUe / mL or more can be mentioned. ..
  • Examples of the DCP method include a method of measuring IgE antibody by ELISA using a DCP chip.
  • the DCP chip includes a surface of a substrate in which a carbon layer is DLC (diamond-like carbon) treated on the surface of a silicon substrate.
  • the surface of the glass slide is coated with an electrostatic layer treated with an amino group-containing compound or a polymer thereof and / or a copolymer, and further treated with a dicarboxylic acid, a polyvalent carboxylic acid, or the like, and then N-hydroxysuccinimide and / Or a chip activated with carbodiimides, a chip in which a chemical modification group is introduced into the surface of the carrier or the carbon layer, a chip further activated, and the like can be mentioned.
  • labeled secondary antibody examples include fluorescently labeled secondary antibodies such as HiLyte Fluor 555, Atto 532, Cy3, Alexa Fluor 555, Cy5, FITC, and Rhodamine, enzyme-labeled secondary antibodies such as peroxidase and alkaline phosphatase, and magnetic bead-labeled secondary antibodies.
  • fluorescently labeled secondary antibodies such as HiLyte Fluor 555, Atto 532, Cy3, Alexa Fluor 555, Cy5, FITC, and Rhodamine
  • enzyme-labeled secondary antibodies such as peroxidase and alkaline phosphatase
  • magnetic bead-labeled secondary antibodies examples of the labeled secondary antibody
  • Antibodies, infrared labeled secondary antibodies, labeled anti-human IgE antibodies can be exemplified.
  • a Fab fragment of an antibody, an F (ab') 2 fragment, or the like can also be used as the secondary antibody. The Fab fragment is obtained by treating
  • an IgE antibody titer of less than 0.35 UA / mL is class 0, and 0.35 to 0.69 UA / mL is class 1.
  • the unit of IgE antibody titer "UA / mL" is a unit of IgE antibody titer produced against allergens, which was originally set by Fadia, which developed the immunocap method, and the amount is IU / mL. Is the same as.
  • OFC Food Allergy Practice Guideline 2016 Digest Edition Chapter 7
  • https://www.jspaci.jp/allergy_2016/chap07.html The above OFC is defined as "Food Allergy Practice Guideline 2016 Digest Edition Chapter 7" (https://www.jspaci.jp/allergy_2016/chap07.html) of the Food Allergy Committee of the Pediatric Allergy Society, and allergies are confirmed. This is a test to confirm the presence or absence of symptoms by ingesting foods suspected of being allergic in single or multiple doses.
  • the total amount of food to be ingested once or dividedly is called the total load.
  • the intake interval and the division method it is proposed that the intake interval is 20 to 60 minutes, and the intake is gradually increased in 1 to 5 times within 1 to 2 hours, and in the case of 2 times, 60 times.
  • 1/4 (1st) of total intake per minute, 3/4 (2nd) or 1/3 of total intake, 2/3; 3 times, 1/8 every 30-60 minutes, 3/8, 1/2; 5 times, 1/16, 1/16, 1/8, 1/4, 1/2; 6 times every 20-40 minutes, 2/100, 4/100, 8/100, 16/100, 32/100, 38/100; etc. can be exemplified, but anaphylaxis may develop in infants, although it is premised on the presence of a doctor. Therefore, it is preferable to increase the number of times in order to carry out the test carefully, and gradually increase the load amount by dividing the test into 5 times or 6 times or more.
  • the total load is 1/2 for a 1-year-old child, 1 chicken egg for a 2-year-old or older, 50 mL for a 1-year-old child for milk, 200 mL for a 2-year-old or older, and 50 g for udon for wheat. For children over 2 years old, 200 g can be exemplified.
  • the criteria for determining that allergies are positive are as follows.
  • A Within minutes or hours from the start of allergen loading Skin symptoms-pruritus, urticaria, erythema, angioedema; and mucosal symptoms-conjunctival hyperemia, nasal juice, sneezing, pharyngeal discomfort
  • B Within minutes or hours from the start of allergen loading Respiratory symptoms-cough, wheezing; Gastrointestinal symptoms-abdominal pain, vomiting, diarrhea; and systemic symptoms-pallor of the face, decreased blood pressure, decreased consciousness level
  • C Within minutes or hours from the start of allergen loading 30% or more reduction in systolic blood pressure with respect to childhood age When one or more of (A), (B), and (C) are applicable, it is determined that the allergen is positive for the specific allergen.
  • A) Dyspnea eg, dyspnea, expiratory wheezing, stridor, decreased peak expiratory flow (PEF), hypoxia
  • B) Decreased blood pressure or associated organ failure eg hypotension, collapse, syncope, incontinence 2 Appearance of two or more of the following
  • C) Appearance of skin or mucosal symptoms eg, generalized urticaria, itch, flushing, uvula) ⁇ Swelling of the tongue and uvula
  • D) Dyspnea eg, dyspnea, expiratory wheezing, stridor, decreased peak expiratory flow (PEF), hypoxia
  • E) Decreased blood pressure or associated organ failure eg hypotension, collapse, syncope, incontinence
  • F) Persistent gastrointestinal symptoms eg colic, vomiting
  • the criterion for predicting the risk of developing anaphylaxis in infants and children with food allergies is a criterion prepared by using the antibody titer of IgE antibody against allergen and the avidity of IgE antibody against allergen.
  • the antibody titer of IgE antibody against allergen and the avidity of IgE antibody against allergen.
  • the value of IC50 is a value that is sometimes called a competitive binding inhibitory activity value.
  • a competitive binding inhibitory activity value For example, as a competitive binding inhibitory activity between a immobilized allergen and a soluble allergen, the concentration of an allergen that inhibits an antigen-antibody binding reaction by 50%. It can be obtained by calculating a value representing. According to this calculation method, it is preferable that the value of IC50 can be evaluated even in the presence of IgG, IgA, IgD, and / or IgM antibodies other than IgE that recognize the same antigen.
  • the method for calculating the IC50 value of the IgE antibody is not particularly limited as long as it is a method capable of performing a competitive binding assay for the IgE antibody, and a measurement method by a biochemical assay such as ELISA can be mentioned.
  • a biochemical assay such as ELISA
  • an affinity measurement method such as Viacore, which can measure the degree of interaction using surface plasmon resonance technology, and isothermal titration calorimetry, can also be mentioned.
  • a method of measuring the affinity of the IgE antibody for the allergen by using a protein denaturing agent as a chaotropic agent that reduces the intermolecular attractive force between the antigen and the antibody or , Methods of measurement by competitive ELISA can be mentioned. Since the chaotropic agent may induce a decrease in the intermolecular attractive force of the antigen as well as the antibody, and the dilution ratio of the serum used as the sample changes the antigen-antibody binding inhibitory effect even if the concentration of the chaotropic agent is the same. It cannot be said that the reproducibility is high.
  • the measurement of the IC50 value by competitive ELISA using the competitive binding inhibition reaction method performed by adding various concentrations of allergen is highly reproducible because the IC50 value hardly changes depending on the dilution ratio of the sample. It is preferable that the IC50 values can be mutually compared between different allergens and the total binding activity of the antibody against the allergen can be quantitatively compared. Therefore, in calculating the IC50 value, it was confirmed that it is not necessary to multiply the dilution ratio of the sample even when the blood sample such as plasma or serum is diluted.
  • An example of a specific procedure by ELISA using the competitive binding inhibition reaction method is shown below.
  • a sample containing an IgE antibody that binds to an antigen-specific allergen has a sufficient concentration that the allergen can bind to all IgE antibodies within a certain period of time from a concentration of 0 (there is no antigen as a competitive binding inhibitor in the sample). Allergens at known concentrations prepared in stages are added as competitive binding inhibitors and allowed to react for a period of time.
  • Examples of the fixed time in the above-mentioned pre-stage reaction include 15 minutes to 2 hours, preferably 30 minutes to 1 hour.
  • a concentration appropriately determined by a person skilled in the art based on the amount of antibody present in the sample or the like can be used, and for example, it is added to serum or plasma.
  • Examples of the stepwise allergen concentration (final concentration) used for competitive inhibition include combinations of 0 nM, 0.1 nM, 1.0 nM, 10 nM, 100 nM, and 1000 nM, and 0 nM, 0.1 nM, 1.0 nM, 10 nM, and 100 nM. , 200 nM combinations and the like, but are not limited to these concentrations.
  • ELISA using the competitive binding inhibition reaction method is preferably performed for allergens having a definite molecular weight, but for allergens whose molecular weight is unknown and the allergen concentration cannot be adjusted by molar concentration, the above-mentioned stepwise allergen concentration is used. Can be adjusted in units such as mg / mL and ⁇ g / mL.
  • the concentration of the allergen that inhibits the antigen-antibody binding reaction by 50% is 100, which is the labeling amount of the labeled secondary antibody detected in the solution in which the concentration of the allergen is 0 in the pre-stage reaction.
  • IC50 concentration of the allergen that inhibits the antigen-antibody binding reaction by 50%
  • it is set to%, it is expressed as an antigen concentration (half maximal inhibition concentration: 50% inhibition concentration) at which the labeling amount is 50%.
  • the avidity of the IgE antibody against the allergen can be expressed as "1 / IC50" which is the reciprocal of the IC50 value based on the IC50 value.
  • the affinity of the IgE antibody in the sample is lower, the amount of the free primary IgE antibody present in the solution after the pre-stage reaction is larger, so that it is fixed.
  • the amount of antibody that binds to the allergen that has been converted increases, and the IC50 value becomes larger.
  • the affinity of the IgE antibody in the sample is higher, the amount of free primary IgE antibody present in the solution after the pre-step reaction is smaller, so that the amount of IgE antibody that binds to the immobilized allergen is reduced. Is less and the IC50 value is smaller. Therefore, when the affinity of the IgE antibody is lower, the avidity is set to a low value, and when the affinity of the IgE antibody is higher, the avidity is set to a high value. Therefore, the reciprocal of the IC50 value may be used for convenience. In particular, when evaluating by multiplying the IgE antibody titer by the antigen affinity (avidity) of IgE, the reciprocal of the IC50 value is used.
  • Examples of the labeled secondary antibody in the avidity calculation include fluorescently labeled secondary antibodies such as HiLyte Fluor 555, Atto 532, Cy3, Alexa Fluor 555, Cy5, FITC and rhodamine, enzyme-labeled secondary antibodies such as peroxidase and alkaline phosphatase, and magnetic beads. Examples thereof include a labeled secondary antibody and an infrared labeled secondary antibody.
  • a Fab fragment of the antibody, an F (ab') 2 fragment, or the like can also be used, and the Fab fragment can be obtained by treating the antibody with papain or the like to obtain the F (ab') 2 fragment. It can be prepared by treating with pepsin or the like.
  • a commercially available chip for ELISA As a carrier on which the allergen is immobilized and having high binding sensitivity, a commercially available chip for ELISA, a chip in which a carbon layer is formed on the surface of the carrier because it is advantageous in that non-specific adsorption is small, and a chip Since it is advantageous for immobilizing a peptide, a chip into which a chemically modifying group has been introduced or a chip subjected to an activation treatment can be mentioned, and among them, a DCP chip is preferable.
  • JP-A-2006-267058 and JP-A-2006-267603 can be used.
  • JP-A-2015-169616 that is, a method using the above-mentioned DCP chip can be included.
  • the criteria prepared based on the antibody titer of the IgE antibody and the avidity of the IgE antibody against the allergen in the present invention are not particularly limited as long as they can predict the risk of developing anaphylaxis in infants and children. It can be preferably mentioned that the prediction is made using the cutoff value by ROC analysis with the "value obtained by multiplying the antibody titer of the IgE antibody by the avidity for the allergen of the IgE antibody" as a parameter.
  • the ROC is a term translated as a receiver operating characteristic or a receiver operating characteristic, and is used to compare the predictability of an independent variable with respect to an outcome, which is a dichotomous variable, and to set a cutoff of the independent variable for an outcome. This is the method used for.
  • the anaphylaxis is positive accordingly.
  • the true positive rate and false positive rate for a person change.
  • the true positive rate and false positive rate are plotted as the true positive rate on the vertical axis and the false positive rate on the horizontal axis to create n types of ROC curves, the larger the area under the curve (AUC), the better.
  • AUC area under the curve
  • the method of setting the cutoff value in the above ROC analysis is not particularly limited as long as it can improve the predictive ability, but the method of determining the value having the maximum sensitivity- (1-specificity) as the cutoff value.
  • the cutoff value can be set by a known procedure using the ROC analyzer shown below or commercially available software.
  • ROC analysis can also be performed using a known commercially available analysis device, for example, GraphPad Prism ver. 5.4 (GraphPad, Inc.), can be performed using software such as JMP14 (jmp.Statistical Discovery. TM).
  • Example 1 The study in this example was approved by the Ethics Committee of Tokushima University (# 175-4), and from August 2012 to January 2019, the health insurance Naruto of Tokushima University and Tokushima University related hospitals. It was held at the hospital and National Hospital Organization Mie Hospital. Infants aged 1 year, 0 months to 6 years who have been confirmed to have allergen sensitization or allergies to eggs, or who are suspected of having allergies to eggs, with sufficient informed consent, either both parents or parents This was done for infants who gave their consent. The OFC was conducted based on the Food Allergy Committee of the Japanese Society of Allergology, Food Allergy Treatment Guidelines 2016, and the guidelines of Kyowa Planning.
  • the selection criteria for the test infants are shown. (1) Infants who have been confirmed to have allergen sensitization to chicken eggs and have been on a chicken egg-free diet for at least 6 months before OFC. (However, infants who underwent heated egg OFC for diagnostic purposes within 3 months before OFC were excluded.) (2) Infants who have been confirmed to have allergen sensitization to chicken eggs, have a blood test immediately before or within 4 months of OFC, and have been measured for ovomucoid-specific IgE by the immunocap method or DCP method. By this criterion, 472 people were selected.
  • Ovalbumin which is a component of chicken eggs, is known to lose its allergen activity by heating. Therefore, in this study, ovomucoid that does not lose allergen activity by heating by ingesting heated chicken egg powder in OFC. Using (OVM) as an index, we proceeded to investigate the presence or absence of anaphylaxis in test infants with chicken egg allergy.
  • test infants were divided into groups of 1-year-old children and 2-6-year-old children according to the amount of food that could be ingested according to their age.
  • the total load of chicken eggs in OFC of a 1-year-old child was 6.5 g (equivalent to 1/2 chicken egg) of heated chicken egg powder (Kewpie Corp.).
  • the total load of chicken eggs in OFC of a 2-6 year old child was 13 g of heated chicken egg powder (corresponding to one chicken egg).
  • the total load was divided into 6 stages of 2/100, 4/100, 8/100, 16/100, 32/100, and 38/100, and the load was gradually increased to give 15 to the test infant.
  • the test was conducted by ingesting the heated chicken egg powder in 6 divided doses at intervals of -30 minutes. That is, the 1-year-old child ingested the heated chicken egg powder in the order of 0.13 g, 0.26 g, 0.52 g, 1.04 g, 2.08 g, 2.47 g at intervals of 15-30 minutes in 6 divided doses. ..
  • the above-mentioned heated chicken egg powder is provided to each infant as a mixed powder to which pumpkin and sweet potato powder are added in order to make it difficult to know that it is a chicken egg and to correct the difference in the increase in intake for each intake. Was done.
  • Table 2 shows data on only the test infants aged 1-3 years, who have difficulty in diagnosing allergies in daily medical care because the immune system is underdeveloped among the above-mentioned test infants.
  • Example 2 [Measurement of OVM-specific IgE antibody titer by DCP method] Using serum samples collected before OFC for 343 infants aged 1 to 6 years, OVM (manufactured by Sigma), which is known as an allergen having a clear molecular weight contained in chicken eggs, is used as an antigen protein. The amount of IgE antibody that binds to OVM was measured as the OVM-specific IgE antibody titer. For quantification of IgE antibody titer, a fluorescence intensity calibration curve with a known concentration of human standard IgE antibody (75/502) purchased from the National Institute for Biological Standards and Control (Hertfordshire, England) was prepared, and a DCP chip was used. The OVM-specific IgE antibody titer (BUe / mL) was measured.
  • Chip activation A DCP chip made of a glass substrate is coated with an amino group-containing electrostatic layer, and a substrate into which a carboxyl group having a negative charge due to polyacrylic acid is introduced is used as a chemical cross-linking agent (100 mM WSC / HCl, 100 mM NHS, 0.1 M phosphorus). The activation treatment was carried out in a potassium phosphate buffer (pH 6.0)) while shaking at room temperature for 30 minutes in a light-shielded state.
  • a chemical cross-linking agent 100 mM WSC / HCl, 100 mM NHS, 0.1 M phosphorus.
  • the substrate was washed twice for 1 minute while shaking with MilliQ water, and then immediately water using a desktop centrifuge (Allegra TM X-22R Centrifuge, manufactured by Beckman Coulter). Was removed to prepare an activated chip.
  • OVM coupling reaction An antigen protein solution was prepared by dissolving OVM (manufactured by Sigma) as an antigen protein at a concentration of 0.2 to 2.0 mg / mL in a solution containing 5 to 30% DMSO or 5 to 30% PEG300.
  • the prepared antigen protein solution is dispensed into a flat bottom of a 384-well plate (manufactured by Corning Inc.), and after a 4 nL spot on the activation chip by a microarray production device (manufactured by OmniGrid Accent, DIGILAB), the temperature is adjusted to 15 ° C. to 30 ° C.
  • the mixture was dried for 1 to 18 hours to immobilize the OVM antigen protein.
  • a schematic diagram of the DCP chip on which the OVM is fixed is shown in FIG.
  • Blockmaster (Blocking reaction of unreacted active group) Blockmaster (JSR), a blocking reagent, was added to a reaction hole tank (well) on a chip on which OVM was immobilized as the antigen protein, and the mixture was allowed to stand in a light-shielded refrigerator (4 ° C.) for overnight reaction.
  • the blocking reagent was removed by suction with an ejector (VARIABLE SPEED PUMP, manufactured by BIORAD), transferred to a reaction plate again, added with 10 mL of a washing solution (50 mM TTBS), shaken for 5 minutes, and then the washing solution was removed by suction with an aspirator. Similarly, after washing three times, it was further washed three times with purified water (MilliQ water).
  • Serum samples of each test infant are appropriately diluted with a sample diluent (20 mM phosphate buffer, pH 7.4 / 0.3 M KCl / 0.05% Tween20) to prepare a serum dilution solution (primary antibody solution). 10 ⁇ L was added to the reaction hole tank, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours under shading.
  • sample diluent 20 mM phosphate buffer, pH 7.4 / 0.3 M KCl / 0.05% Tween20
  • a fluorescently labeled secondary antibody (HiLyte Fluor (trademark) or 555 cojuged anti-human IgE (HyTest) (diluted solution, IMMUNO SHOT Platimun / 1% BSA, final dilution concentration 10 ⁇ g / mL)) was prepared as a secondary antibody solution. did. 10 ⁇ L of the secondary antibody solution was dispensed into each reaction hole tank on the slide, and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours under shading.
  • Each test infant's serum sample is appropriately diluted with a sample diluent (20 mM phosphate buffer, pH 7.4 / 0.3 M KCl / 0.05% Tween20), for example, diluted 2.5 times to prepare a serum dilution solution (primary antibody solution). It was prepared and the antibody titer was measured. Next, the antibody titer of the obtained diluted solution was readjusted so that the competitive binding inhibitory activity (avidity) depending on the amount of soluble antigen added was within a detectable range.
  • the lower limit of the fluorescence intensity indicated by OVM IgE was adjusted so that the lower limit value was> measurement limit value (blank + 5SD) and the upper limit value of the fluorescence intensity was in the range of 5,000 or less.
  • 6 types of OVM solutions adjusted with the above sample diluent to 6-step concentrations of 0, 0.2, 2.0, 20, 100, and 200 nM were prepared as competitive binding inhibitors.
  • the IC50 value is 6 ⁇ L of each of the above 6 types of OVM solutions in advance with various concentrations of soluble OVM when measuring the antigen-antibody reaction between the IgE antibody contained in the sample and the OVM antigen immobilized on the chip.
  • Such fluorescence intensity is measured repeatedly 5 times to calculate the standard deviation (SD) value of fluorescence intensity, and the case where the fluorescence intensity is blank + 5SD (measurement limit lower limit value) or more is defined as the fluorescence intensity of IgE derived from the sample. did.
  • SD standard deviation
  • a fluorescently labeled secondary antibody HiLyte Fluor TM or 555 conjugated anti-human IgE (HyTest) (diluted solution, IMMUNO SHOT Platimun / 1% BSA, final dilution concentration 10 ⁇ g / mL) was prepared. 10 ⁇ L of the solution was dispensed into each reaction well on the slide and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours under shading.
  • the chip is transferred to a cleaning case, 10 mL of cleaning liquid (50 mM TTBS) is added, and the cleaning operation is repeated 3 times for 5 minutes using Double-Shaker NR3, and then purified water (MilliQ water) is further used. ) was added and washed 3 times for 1 minute. Centrifuge water droplets were removed (at 2000 rpm for 1 minute) with the above centrifuge to remove water droplets on the chip surface. The fluorescence intensity of the spots obtained from each chip was quantified by measuring the residual fluorescence amount with a fluorescence scanner (3D Gene Scanner, manufactured by Toray Industries, Inc.) (Ex: 532 nm, Em: 570 nm). In each infant / child to be tested, the OVM concentration showing 50% fluorescence intensity is "IC50" when the fluorescence intensity is 100% when the concentration of the solution in which OVM does not exist, that is, the competitive binding inhibitor is 0. Shown as a value.
  • ROC analysis was performed on 1-6 year old infants (343 cases) who underwent OFC in [Example 1]. Based on the results of diagnosing OFC positive as having chicken egg allergy and OFC negative as not having chicken egg allergy, the avidity of OVM-specific IgE value and OVM-specific IgE measured by the DCP method measured so far, and Using the OVM-specific IgE titer measured by the immunocap method, (1) The OVM-specific IgE value measured by the DCP method is multiplied by the value of 1 / IC50 [DCP OVM sIgE / DCP OVMs IgE IC50 [(BUe / mL) / (nM)]]; (2) IC50 value of OVM-specific IgE measured by the DCP method (DCPOVM sIgE IC50 (nM)); (3) The value of 1 / IC50 of OVM-specific IgE measured by the DCP method (1 / DCP OVM
  • the AUC values of the OVM-specific IgE values measured by the CAP OVM sIgE method (UA / mL) and the DCP OVM sIgE method (BUe / mL) were almost the same.
  • the AUC value of "DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50" which is obtained by multiplying the IgE antibody titer by OVM avidity, is the highest at 0.79, which is the cut-off value for the definitive diagnosis of allergy at this time.
  • the AUC value of DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 (quantity x quality) obtained by multiplying the IgE quantitative value by the OVM significance is compared with the IC50 value, the OVM avidity, and other single parameters. It was shown that the P value showing a significant difference was shown, and the risk of having chicken egg allergy and the absence of chicken egg allergy could be accurately determined.
  • OVM sIgE means ovomucoid (specific) IgE.
  • ROC analysis was performed on 256 infants aged 1-3 years, who were diagnosed as having a positive allergy and those who were diagnosed as having a negative allergy, based on the confirmed allergy diagnosis by OFC.
  • AUC value, cutoff value, sensitivity, and specificity were calculated for each of the above five types of parameters. The results are shown in Table 4.
  • the diagnostic cut-off value was 1556.70 (BUe / mL) / (nM), which was as low as 35% of the cut-off value of the subject (1-6 years old).
  • the DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 (amount ⁇ ) obtained by multiplying the IgE quantitative value by the OVM avidity in the same manner as the subject (1-6 years old).
  • the AUC value of (quality) is a P value showing a significant difference as compared with a single parameter such as an IC50 value or OVM avidity, and it was shown that the risk of having chicken egg allergy and the absence of chicken egg allergy can be accurately determined.
  • Example 4 Regarding the diagnosis of anaphylaxis risk by OFC in 343 infants aged 1 to 6 years old who were positive for chicken egg allergen sensitization shown in Table 1, (A) CAP OVM sIgE (UA / mL), (B).
  • the conventional allergen-specific IgE quantification method (A) CAP OVM sIgE (UA / mL) and (B) DCP OVM sIgE (BUe / mL) are allergic to chicken eggs.
  • the diagnosis of yes (EA +) and no (EA-) can be made with significant difference, but "life-threatening hypersensitivity reaction state, onset of anaphylaxis", that is, [(AN +) and (AN-)]. No significant difference was detected between the two groups in the diagnosis.
  • FIG. 6 shows the results of ROC analysis of the above five parameters for the diagnosis of anaphylaxis on OVM based on the OFC results of 1-6 year old subjects (343 cases).
  • the AUC value of DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 (quantity x quality) obtained by multiplying the IgE quantitative value by the OVM avidity in the subject (1-6 years old) is the IgE quantitative value of the conventional method.
  • the P value showed a significant difference, indicating that the risk of having chicken egg allergy and the absence of chicken egg allergy can be accurately determined.
  • Example 5 In 256 infants with an immature immune system of 1-3 years old who have difficulty in diagnosing allergies shown in Table 2, the diagnostic accuracy and usefulness of OFC-based anaphylaxis risk diagnosis are described in (A) CAP OVM sIgE (A) UA / mL), (B) DCP OVM sIgE (BUe / mL), (C) DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 [(BUe / mL) / (nM)], (D) DCP OVM sIgE IC50 (nM) , (E) 1 / DCP OVM sIgE IC50 (nM), and the results of the significant difference test between each group are shown in FIG. The statistical data of FIG. 7 is shown in Table 7 below.
  • the above parameter (quantity ⁇ quality) obtained by multiplying the OVM avidity by the DCP OVM sIgE value shows that the AUC value indicated by the ROC curve is 0.77, which is the highest among the five groups examined.
  • the sensitivity at this time showed the highest value of 1.00, indicating that it is useful for diagnosing the risk of developing anaphylaxis.
  • the above results are obtained in the (C) DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 [(BUe / mL) / (nM)] shown in FIGS.
  • the AUC value of DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 (quantity ⁇ quality) obtained by multiplying the IgE quantitative value by OVM anaphylaxis is the IgE of the conventional method. It showed a significant difference compared to the single parameters of antibody titer (UA / mL) and (BUe / mL), indicating that the risk of having chicken egg anaphylaxis and the absence of chicken egg anaphylaxis can be accurately determined.
  • IgE avidity for allergens can be measured by the competitive binding inhibitory activity (IC50 value) between the immobilized allergen and the soluble allergen, and can be shown with a 1 / IC50 value.
  • This method can evaluate not only the presence of IgG, IgA, IgD, and IgM antibodies other than IgE that recognize the same antigen, but also the difference in affinity between allergens and the difference in affinity between different allergens. It has the advantage that it can be evaluated with the parameters of. In the present invention, it has been difficult to diagnose the risk of developing anaphylaxis by the conventional allergen-specific IgE quantification method by measuring the avidity (1 / IC50 value) of the polyclonal IgE antibody against the allergen in human serum.
  • DCP OVM sIgE (BUe / mL) antibody titer multiplied by avidity DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 [(BUe / mL) / (nM)] can be used as a parameter to predict and diagnose the risk of developing anaphylaxis. It was confirmed.
  • the DCP OVM sIgE IC50 (nM) value and the 1 / DCP OVM sIgE IC50 (nM) value of the avidity-only parameter for the allergen the degree of significant difference is smaller than that of DCP OVM sIgE / DCP OVM sIgE IC50 [(BUe / mL) / (nM)], which is obtained by multiplying the antibody titer of DCP OVM sIgE (BUe / mL) by anaphylaxis. It was newly found that it is possible to distinguish the presence or absence of the onset of anaphylaxis.
  • Example 6 IC50 values for chicken egg allergy and chicken egg anaphylaxis calculated from previous ROC analysis, and cut-off values for the criteria [(BUe / mL) / IC50] created based on the IgE antibody titer and the avidity of IgE antibody against allergens.
  • Takatsuki Hospital in Osaka Prefecture which is a hospital in a different area from the hospital that acquired the data (Tables 1 to 8 etc.) so far, to the hospital of Takatsuki Hospital.
  • Cutoff value (That is, if it is 1 to 3 years old, it is 1225.80 (BUe / mL) / (nM) or more, and if it is 1 to 6 years old, it is 8960.00 (BUe / mL) / (nM) or more. It can be determined that there is a possibility of developing anaphylaxis.) Are shown respectively.
  • DCP OVM-sIgE 3 types of parameters obtained from 2 cases aged 1 to 3 years and 13 cases aged 8 to 15 years: DCP OVM-sIgE, DCP OVM-sIgE IC50, DCP OVM-sIgE The results of / DCP OVM-sIgE IC50 are shown in Table 10 below.
  • Table 10 shows a group determined to be negative for chicken egg allergy as a result of heated chicken egg OFC (egg allergy negative / anaphylaxis onset negative group), and two infants 1 to 3 years old and 8 to 15 years old. Eight children belong to it.
  • (B) is a group determined to be positive for chicken egg allergy as a result of heated chicken egg OFC and not developing anaphylaxis (chicken egg allergy positive / anaphylaxis onset negative group).
  • C is a group (chicken egg anaphylaxis onset group) which was determined to be positive for chicken egg allergy as a result of heated chicken egg OFC and developed anaphylaxis.
  • OVM sIgE IC50 (nM) OVM-specific IgE measured by the DCP method was 4. Since it is 39 nM and 194.71 nM, which is 1.13 nM or more, which is the cut-off value for the presence or absence of allergy in the IC50 value of OVM-specific IgE at 1 to 3 years old, it is confirmed that it falls within the allergy negative range. It was.
  • the values obtained by multiplying the OVM-specific IgE value measured by the DCP method by the value of 1 / IC50 are 757.12 (BUe / mL) / (nM) and 11.82 (BUe / mL) / (nM). ), which is lower than the cut-off value of 1556.70 for the presence or absence of allergy of OVM sIgE / OVMs IgE IC50 at 1 to 3 years old, so it was confirmed that the value falls within the allergy negative range. In fact, no signs of chicken egg allergy have been identified in these two infants.
  • these two subjects also showed a value higher than the cutoff value of 2.15 nM in the IC50 value (OVM sIgE IC50 (nM)) of OVM-specific IgE in the case of 1 to 3 years old regarding the presence or absence of the onset of anaphylaxis. ..
  • the cut-off value for the presence or absence of anaphylaxis using the parameters of OVMsIgE / OVMsIgEIC50 in the case of 1 to 3 years was lower than the cutoff value of 1225.80 (BUe / mL) / (nM), and anaphylaxis developed. It is highly unlikely that these two individuals will develop anaphylaxis due to egg intake so far.
  • OVM-specific IgE OVM sIgE IC50 (nM)
  • OVM sIgE IC50 (nM) OVM-specific IgE measured by the DCP method was 1.73 nM to 16. Since it is in the range of 03 nM and is 1.30 nM or more, which is the cut-off value for the presence or absence of allergy in the IC50 value of OVM-specific IgE at 1 to 6 years old, it was confirmed that it falls in the allergy negative range.
  • the value obtained by multiplying the OVM-specific IgE value measured by the DCP method by the value of 1 / IC50 is 170.93 (BUe / mL) / (nM) to 1082.41 (BUe / mL) / (nM). ), which is less than 4459.00 (BUe / mL) / (nM), which is the cut-off value for the presence or absence of allergy of OVMsIgE / OVMsIgEIC50 in 1 to 6 years old, and therefore falls within the range of allergy negative. It was confirmed that.
  • OVM-specific IgE OVM sIgE IC50 (nM)
  • the IC50 value of OVM-specific IgE measured by the DCP method was 0.93 nM, and was 1 to 6 years old. Since the IC50 value of OVM-specific IgE in the above is less than 1.30 nM, which is a cut-off value for the presence or absence of allergy, it falls within the range of allergy positive. Moreover, since the IC50 value of OVM-specific IgE at 1 to 6 years of age was less than 1.03 nM, which is the cut-off value for the presence or absence of anaphylaxis, it was presumed that anaphylaxis may develop.
  • the value obtained by multiplying the OVM-specific IgE value measured by the DCP method by the value of 1 / IC50 is 15133.54 (BUe / mL) / (nM), which is 1 to 6 years old. It is higher than the cut-off value of 1556.70 for the presence or absence of allergy of OVMsIgE / OVMsIgEIC50 in the above, and falls within the range of allergy positive.
  • OVM-specific IgE OVM sIgE IC50 (nM)
  • the IC50 value of OVM-specific IgE measured by the DCP method was 1.25 nM, and was 1 to 6 years old. Since the IC50 value of OVM-specific IgE in the above is less than 1.30 nM, which is a cut-off value for the presence or absence of allergy, it falls within the range of allergy positive. However, the IC50 value of OVM-specific IgE at 1 to 6 years was higher than the cut-off value of 1.03 nM for the presence or absence of anaphylaxis, and the possibility of developing anaphylaxis was considered to be low.
  • the value obtained by multiplying the OVM-specific IgE value measured by the DCP method by the value of 1 / IC50 shows 942.36 (BUe / mL) / (nM), and is in 1 to 6 years of age. It is lower than the cut-off value of 4459.00 for the presence or absence of allergy of OVMsIgE / OVMsIgEIC50, and falls within the range of allergy negative. It is also lower than the cut-off value of 8960.10 (BUe / mL) / (nM) for the presence or absence of anaphylaxis of OVMsIgE / OVMsIgEIC50 in 1 to 6 years of age. It can be said that this child is unlikely to develop anaphylaxis when two cutoff values at 1 to 6 years of age are applied. This child is currently under follow-up because he has no allergic symptoms even after ingesting chicken eggs.
  • OVM sIgE IC50 OVM-specific IgE IC50
  • the values obtained by multiplying the OVM-specific IgE value measured by the DCP method by the value of 1 / IC50 are 1465.64 (BUe / mL) / (nM) and 3897.79 (BUe / mL) / (nM). It is lower than the cut-off value of 4459.00 (BUe / mL) / (nM) for the presence or absence of allergy of OVM sIgE / OVMs IgE IC50 in 1 to 6 years old, and falls within the allergy negative range. It was. These two patients have minor symptoms of chicken egg allergy, but it is highly possible that they are in the transition period from positive to negative chicken egg allergy, and they are observing the course.
  • OVM sIgE IC50 (nM) OVM-specific IgE measured by the DCP method was 1.74 nM, and was 1 to 6 years old. Since the IC50 value of OVM-specific IgE in the above is 1.30 nM or more, which is a cut-off value for the presence or absence of allergy, it falls within the range of allergy negative.
  • the value obtained by multiplying the OVM-specific IgE value measured by the DCP method by the value of 1 / IC50 is 4897.47 (BUe / mL) / (nM), which is OVM sIgE / OVMs IgE at 1 to 6 years old. It is higher than the cut-off value of 4459.00 (BUe / mL) / (nM) for the presence or absence of allergy of IC50, and falls within the range of allergy positive.
  • the IC50 value is higher than 1.03 nM, which is the cut-off value for the presence or absence of anaphylaxis in the IC50 value of OVM-specific IgE at 1 to 6 years old, and OVM sIgE / OVMs IgE at 1 to 6 years old.
  • the value obtained by multiplying the OVM-specific IgE value by the value of 1 / IC50 is lower than the cut-off value of 8960.10 (BUe / mL) / (nM) for the presence or absence of anaphylaxis of IC50. It can be said that the possibility of developing anaphylaxis is low when two cutoff values for 1 to 6 years of age are applied. In fact, the child has mild symptoms and no history of developing anaphylaxis. Therefore, it was confirmed that the cutoff value calculated based on the data of 1 to 6 years old can be applied to children aged 8 to 15 years.
  • OVM sIgE IC50 (nM) OVM-specific IgE measured by the DCP method was 2.7 nM, and 1 to 6 years old. Since the IC50 value of OVM-specific IgE in the above is 1.30 nM or more, which is a cut-off value for the presence or absence of allergy, it falls within the range of allergy negative.
  • the value obtained by multiplying the OVM-specific IgE value measured by the DCP method by the value of 1 / IC50 is 317.17 (BUe / mL) / (nM), which is OVM sIgE / at 1 to 6 years old. It is much lower than the cut-off value of 4459.00 (BUe / mL) / (nM) for the presence or absence of allergy of OVMs IgE IC50, and falls within the range of allergy negative.
  • THG-13 cases have a cutoff value of 1.03 nM or more for the presence or absence of anaphylaxis in the IC50 value of OVM-specific IgE at 1 to 6 years of age, the possibility of developing anaphylaxis is low.
  • the cut-off value of 8960.10 (BUe / mL) / (nM) for the presence or absence of anaphylaxis of OVMsIgE / OVMsIgEIC50 in 1 to 6 years of age the possibility of developing anaphylaxis is low. Can be inferred. This child is currently under follow-up because he has allergic symptoms but has no history of anaphylaxis, the OVM antibody titer itself is very low, and a tendency to allergic symptoms is observed.
  • OVM sIgE IC50 (nM) OVM-specific IgE measured by the DCP method is 0.26 nM, which is a cut regarding the presence or absence of anaphylaxis of the IC50 value of OVM-specific IgE at the age of 1 to 6 years. The value was lower than the off value of 1.03 nM, which was consistent with the onset of anaphylaxis.
  • the value obtained by multiplying the OVM-specific IgE value measured by the DCP method by the value of 1 / IC50 is 81174.34 (BUe / mL) / (nM), which is OVM sIgE at the age of 1 to 6 years. It was significantly higher than the cut-off value of 8960.10 (BUe / mL) / (nM) for the presence or absence of anaphylaxis in / OVMs IgE IC50, which was consistent with the situation in which anaphylaxis was actually occurring.
  • the OVM-specific IgE value is multiplied by the value of 1 / IC50 [OVM sIgE / OVMs IgE IC50 [(BUe / mL) /). (NM)]], or if it becomes clear that the cut-off value for the presence or absence of anaphylaxis in IgE IC50 (nM) is exceeded, it is possible to receive dietary guidance from a doctor or the like. And it can be said that it is excellent.

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Abstract

食物アレルギーを有する乳幼児・小児から採取した試料中の、ＩｇＥ抗体の抗体価とＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティを測定し、ＲＯＣ解析に基づき作成された判断基準によって前期乳幼児・小児のアナフィラキシーの発症リスクを予測することにより、アレルギーを有する乳幼児・小児のアナフィラキシー発症リスクを予測する手段を提供する。

Description

アナフィラキシーの発症を予測するためのデータを収集する方法
　本発明は、アレルギーを有する乳幼児・小児から採取した試料中の、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性の程度（アビディティ）等に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値を判断基準として、前記乳幼児・小児のアナフィラキシーを発症する可能性を予測するためのデータを収集する方法に関する。
　食物アレルギーは、「食物によって引き起こされる抗原特異的な免疫学的機序を介して生体にとって不利益な症状が惹起される現象」（例えば、非特許文献１等参照）と定義されている。ヒトが生命を維持するために消化・吸収する食物に対しては、未消化の異物に対して生体の防御反応を起こさないように、経口免疫寛容（免疫トレランス）が通常働いているとされる。しかし、出生人口の５－１０％の乳児が生後１年までに何らかの食物アレルギーを発症するとされており、その発症機序や発症予測法は未だ完全には解明されていない。
　アナフィラキシーは、「アレルゲンの侵入により、複数の臓器をはじめとする、全身性アレルギー症状が惹起され、（軽微な症状ではなく）生命に危機を与え得る過敏反応」と定義されている（例えば、非特許文献２等参照）。したがって、アレルギーを有する患者にとっては、アナフィラキシーをおこすおそれがあるか否かは、重大な関心事である
　現在、イムノキャップ［ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（サーモフィッシャー社）］法をはじめとする様々な抗原特異的ＩｇＥ抗体の抗体価を測定する方法が、アレルギーの診断のために用いられている。しかし、例えばイムノキャップ法において、被験者のアレルギー発症の可能性を示すプロバビリティーカーブを作成した場合、ＩｇＥ抗体価が比較的低いクラス２及び３の乳幼児において、アナフィラキシー発症の可能性は実際の発症率よりも低値を示す等の報告がある（例えば非特許文献３、４等参照）。
　また、生後６ヶ月までの乳児血漿試料を用いて、試料中のアレルゲンに対するＩｇＧ１及びＩｇＥの抗体価をそれぞれ定量測定し、予め統計処理されたＩｇＧ１からＩｇＥへのイムノグロブリンクラススイッチの程度に基づき作成された判断基準によって、前記食物アレルギー発症前の乳児において、前記アレルゲンに対してアレルギーを発症するリスクを予測するためのデータを収集する方法（例えば、特許文献１等参照）が提案されているが、アナフィラキシーを発症するかを予測することは困難であった。
　また、食物アレルギーを有する乳児・小児におけるアナフィラキシー発症についての最も確実な診断法とされている「食物経口負荷試験（Oral Food Challenge：ＯＦＣ）」は医師の立ち合いのもと行われるが、被験者がアナフィラキシーをおこす可能性があることから、ＯＦＣを行わずにアナフィラキシーを発症する可能性を予測する方法の開発が強く望まれている。しかし、アナフィラキシーを発症する可能性を予測するための有効な診断方法や、有効なバイオマーカー等についての報告はいまのところない。
国際公開ＷＯ２０１７/１９５８７１号パンフレット
食物アレルギーの診療の手引き２０１１、食物アレルギー研究会 Simons FE, Ardusso LR, Bilo MB, EI-Gamal YE, Ledford DK, Ring J, Sanchez-Borges M, Senna GE, Sheikh A, Thong BY, World Allergy Orhan J. 2011; 4: 13-37. Komata T, Soderstrom L, borres MP, Tachimoto H, Ebisawa M., J Allergy Clin Immunol. 2007; 119:1272-1274. Furuya K, Nagao M, Sato Y, Ito S, Fujisawa T., Allergy. 2016; 71:1435-1443.
　本発明の課題は、アレルギーを有する乳幼児・小児のアナフィラキシー発症リスクを予測する手段を提供することにある。
　本発明者らは、ＩｇＥ抗体の抗体価をパラメーターとするだけでは、アナフィラキシーを効果的に発症予測することができないという状況において、アナフィラキシーの発症予測には別のパラメーターが必要なのではないかと考えた。すなわち、血液中にはＩｇＥ抗体の他、同じアレルゲンに対して反応するＩｇＧ１抗体，ＩｇＧ２抗体，ＩｇＧ３抗体，ＩｇＧ４抗体，ＩｇＭ抗体，ＩｇＡ抗体，ＩｇＤ抗体等が存在し、これらの抗体は、それぞれが抗原における複数のエピトープを認識するポリクローナル抗体であることを考慮に入れる必要があると考えた。
　そして、当該ＩｇＥ抗体のアレルゲンへの結合を評価する場合には、従前から測定されているＩｇＥ抗体の定常部位のみを２次抗体で測定するＩｇＥ抗体価、すなわち図１に示すＩｇＥ抗体の定常部位（Ｆｃ領域）の「ＩｇＥの量」だけを測定するのではなく、ＩｇＥ抗体の可変部がアレルゲンに対して示す「ＩｇＥの質」としての「抗原と抗体との親和性の総和」（アビディティ：Ａｖｉｄｉｔｙ）を考慮に入れることが必要であることを思いついた。本発明者らは、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティを示すパラメーターとして１／ＩＣ５０の値を選択し、各アレルゲン感作陽性乳幼児・小児のＩｇＥ抗体価に１／ＩＣ５０値を乗じた数値、およびアビディティ値を用いて、アナフィラキシー発症の有無について解析を行い、上記パラメーターの有意差検定を行ったところ、既存のパラメーターを用いるよりも、アナフィラキシー発症者と非発症者間に顕著な統計学的有意差を示すことを見いだした。さらに検査の性能評価に用いられるＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線解析においても、ＩｇＥ抗体価に１／ＩＣ５０値を乗じた数値は従来のＩｇＥ抗体量のみの検査に比較して、その感度と特異度から計算される有用性指標値としての曲線下面積（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）の有意な増加が認められた。これまでアナフィラキシーの発症の可能性について有効な診断法がなかったアレルギー患者について、アナフィラキシーの発症予測を効果的に行うことが可能であることを確認して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の事項により特定されるものである。
［１］食物アレルギーを有する乳幼児・小児から採取した試料中の、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値を判断基準として、前記乳幼児・小児のアナフィラキシーの発症リスクを予測するためのデータを収集する方法。
［２］ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値が、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の抗体価に、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティを乗じた数値に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値であることを特徴とする、上記［１］記載のデータを収集する方法。
［３］ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティが、１／ＩＣ５０として数値化されることを特徴とする、上記［２］記載のデータを収集する方法。
［４］ＩＣ５０が、競合的結合阻害活性値であることを特徴とする、上記［３］記載のデータを収集する方法。
［５］ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値が、ＩｇＥ抗体のＩＣ５０に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値であることを特徴とする、上記［１］記載のデータを収集する方法。
［６］ＩＣ５０が、競合的結合阻害活性値であることを特徴とする、上記［５］記載のデータを収集する方法。
［７］アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の抗体価を、ＤＣＰチップを用いて測定することを特徴とする上記［２］～［６］のいずれか記載のデータを収集する方法。
［８］試料が血漿又は血清であることを特徴とする上記［１］～［７］のいずれか記載のデータを収集する方法。
　本発明によると、従来アナフィラキシー発症診断が困難であった、乳幼児・小児について、アナフィラキシーを発症する可能性を有意に予測できる。
ＩｇＥ抗体の「量」と「質」とを決める構造的特徴を示す。 タンパク質が固定化されたＤＣＰチップの模式図を示す。 １－６歳の乳幼児で、イムノキャップ法によりクラス２以上と判定された乳幼児３４３名に実施した、加熱鶏卵ＯＦＣにおけるアレルギー陽性者・陰性者について、加熱鶏卵アレルゲンのオボムコイド（ＯＶＭ）に対する５種の異なる測定パラメーター：ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］、 ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）を用いてＲＯＣ解析した結果を、ＲＯＣカーブ(曲線)で示す。 １－３歳の乳幼児で、イムノキャップ法によりクラス２以上と判定された乳幼児２５６名に実施した、加熱鶏卵ＯＦＣにおけるアレルギー陽性者・陰性者について、５種の異なるパラメーター：ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］、　ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ） を用いてＲＯＣ解析した結果を、ＲＯＣカーブで示す。 １－６歳の乳幼児で、イムノキャップ法によりクラス２以上と判定された乳幼児３４３名に５種（Ａ～Ｄ）の異なるパラメーター：（Ａ）ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）、（Ｂ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）、（Ｃ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ　ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］、（Ｄ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、（Ｅ）１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）を用いて、鶏卵アレルギー（ＥＡ）の有（＋）無（－）を加熱鶏卵［ＥＷ（ｈｅａｔ）］ＯＦＣ陽性、陰性で検定した結果と、さらに鶏卵アレルギー有（ＯＦＣ陽性）者について、アナフィラキシー（ＡＮ）の有（＋）無（－）について有意差を検定した結果を示す。 １－６歳の乳幼児で、イムノキャップ法によりクラス２以上と判定された乳幼児３４３名に５種の異なるパラメーター：ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）を用いて、ＯＦＣによるアナフィラキシー発症診断に依拠して、アナフィラキシー（ＡＮ）発症者（＋）と診断された被験者とＡＮ非発症者（－）と診断された被験者についてＲＯＣ解析した結果を示す。 １－３歳の乳幼児で、イムノキャップ法によりクラス２以上と判定された乳幼児２５６名に、５種（Ａ～Ｄ）の異なるパラメーター：（Ａ）ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）、（Ｂ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）、（Ｃ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］、（Ｄ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、（Ｅ）１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）を用いて鶏卵アレルギー（ＥＡ）の有（＋）無（－）をＯＦＣ陽性、陰性で検定した結果と、さらに鶏卵アレルギー有（ＯＦＣ陽性）者について、ＯＦＣによるアナフィラキシー（ＡＮ）の有（＋）無（－）について有意差を検定した結果を示す。 １－３歳の乳幼児で、イムノキャップ法によりクラス２以上と判定された乳幼児２５６名に５種の異なるパラメーター：ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）、ＤＣＰ ＯＶＭ　ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）を用いて、ＯＦＣによるアナフィラキシー発症診断に依拠して、アナフィラキシー（ＡＮ）発症者（＋）と診断された被験者とＡＮ非発症者（－）と診断された被験者とについてＲＯＣ解析した結果を示す。
　本発明の、食物アレルギーを有する乳幼児・小児のアナフィラキシー発症リスクを予測するためのデータを収集する方法としては、食物アレルギーを有する乳幼児・小児から採取した試料中の、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値を判断基準とする方法であれば特に制限されず、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値としては、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の抗体価に、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティを乗じた数値をパラメーターとして、ＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値や、ＩｇＥ抗体のＩＣ５０をパラメーターとして、ＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値を挙げることができ、これら２つのカットオフ値を併用して判断することも可能である。また、本発明の方法は非医療的に行われる場合、すなわち、非医療的にデータを収集する方法も含み、また、医師の行為を除く、食物アレルギーを有する乳幼児・小児のアナフィラキシー発症リスクを予測するためのデータを収集する方法をも含む。上記食物アレルギーとしては、アレルゲンとなりうる特定の食品によって引きおこされるアレルギー反応を挙げることができ、アナフィラキシーとは、アレルギー反応の中でも特に重篤な、生命に危機を与え得る過敏反応を挙げることができる。
　上記アレルゲンとは、アレルゲン感作を成立させ、又はアレルギー反応、さらにはアナフィラキシーを誘発する抗原を意味する。具体的には、ヒトにおいてＩｇＥ抗体の産生を誘導し得る任意の抗原タンパク質又はペプチド、その他糖鎖や核酸などであれば特に制限されないが、卵類、牛乳類、牛肉等の肉類、サケ、マグロ等の魚類、エビ、カニ等の甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母、ゼラチンなどの食物アレルゲンとなる成分を例示することができ、中でもαｓ１－カゼイン、αｓ２－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン、α－ラクトアルブミン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβ－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）等の乳アレルゲンや、オボムコイド（ＯＶＭ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、コンアルブミン、又はこれらの混合物である卵白アレルゲン（ＥＷ）や、卵黄アレルゲン、及びこれらが混合した卵アレルゲン、グリアジン、グルテン等の小麦アレルゲン、そばアレルゲンや、Ａｒａ ｈ１等の落花生アレルゲン、１１Ｓグロブリン等のごまアレルゲン、トロポミオシンタンパク質等の甲殻類アレルゲンを主要なアレルゲンとして例示することができる。
　上記アレルゲン感作とは、アレルゲンが体内に入った場合に、異物とみなして排除しようとする免疫機能が働き、アレルゲンを認識・結合するＩｇＥ抗体が産生する状態をいい、かかる状態を、そのアレルゲンに感作している、又はアレルゲン感作が成立しているなどというが、アレルゲン感作しているだけではアレルギー反応は必ずしもおこらない。
　上記アレルギー反応としては、上記アレルゲン感作が成立している状況において、再度アレルゲンが侵入した場合に、マスト細胞上のＩｇＥ抗体がアレルゲンに結合して、マスト細胞からヒスタミンなどの化学伝達物質が放出される反応を挙げることができ、かかるアレルギー反応により引き起こされる症状をアレルギー症状と呼ぶ。
　上記アレルギー症状としては、掻痒感、じんましん、血管性浮腫、発赤、湿疹等の皮膚症状；結膜充血・浮腫、掻痒感、流涙、眼瞼浮腫等の眼症状；くしゃみ、鼻汁、鼻閉等の鼻症状；口腔・口唇・舌の違和感・腫脹、咽頭の痒み・イガイガ感等の口腔咽頭症状；腹痛、悪心、嘔吐、下痢、血便等の消化器症状；咽頭絞扼感、咽頭浮腫、嗄声、咳嗽、喘鳴、呼吸困難、喘息等の呼吸器症状；アナフィラキシーショック頻脈、虚脱状態、意識障害、血圧低下等の全身症状等を挙げることができる。
　本発明における試料としては、アレルギーを有する乳幼児・小児から採取した試料であれば特に制限されず、患者から採取した血液、血清、血漿、唾液、涙液、鼻汁、尿等の体液を挙げることができるが、血清、血漿が好ましい。血清を試料として用いる場合は、例えば、患者の上腕静脈より採血を行い、得られた血液を４℃にて一晩静置した後、遠心分離し、その上清を血清として用いることができる。あるいは、低侵襲的に耳朶や指先を微量採血針等で穿刺して得られる５０～１００μＬの微量血液をマイクロキャピラリーチューブで採取してそのまま用いることも可能である。
　上記食物アレルギーを有する乳幼児・小児としては、１歳０ヶ月（１歳）～１２歳の乳幼児・小児、好ましくは１～６歳の乳幼児・小児、より好ましくは１～３歳の乳幼児であって、食物アレルゲンの摂取により、アレルギーの症状が出ることが明らかな乳幼児・小児や、公知の方法によりアレルギー陽性であり、食物アレルギーを有すると判定された乳幼児・小児を挙げることができる。また、アレルゲンに感作していることが明らかでありアレルギーを発症する可能性があるが、アレルギー症状が出現していない乳幼児・小児を含み、従来の食物アレルギーの確定診断法であるＯＦＣによって、アレルギー陽性者ではないと確定される乳幼児・小児を含みうる。
　上記乳幼児・小児が食物アレルギーを有すると判定するための具体的な方法としては、皮膚プリックテストや好塩基球活性化試験、公知のＩｇＥ検査法や、ＯＦＣにおいて、それぞれの方法における基準に基づきアレルギーを有するか否かを確定する方法を挙げることができる。
［ＩｇＥ抗体価の測定］
　上記ＩｇＥ抗体の抗体価を定量的に測定する方法としては、上記公知のＩｇＥ検査法を含め、試料中のアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を検出し、ＩｇＥ抗体価を定量測定することができる方法であれば特に限定されないが、担体上で行う標識二次抗体を用いるＥＬＩＳＡ法を好適に挙げることができる。ＥＬＩＳＡ法における担体としては、市販のＥＬＩＳＡ用チップや、非特異的吸着が少ない点において有利であることから、担体の表面にカーボン層が形成されたチップや、ペプチドを固定するために有利であることから、化学修飾基が導入されたチップや活性化処理が行われたチップを挙げることができ、なかでもＤＣＰチップを好適に挙げることができる。また、上記公知のＩｇＥ検査法としては、上記ＤＣＰチップを用いるＤＣＰ法、イムノキャップ法、アラスタット３ｇ、イムノファストチェック、オリトンＩｇＥ等を例示することができる。なお、ＩｇＥの抗体価を算出する際には、検量線の精度の範囲でより高い精度で測定する観点から、血清等の血液試料を1～数十倍、好ましくは1．１～１０倍、より好ましくは1．５～５倍に希釈したうえで、ＩｇＥ抗体価を定量することも好ましく、その場合は、ＤＣＰチップを用いるＤＣＰ法等によって、ＩｇＥ抗体価を測定後、血液試料の希釈倍率をかけて、最終的にＩｇＥ抗体価を決定する必要がある。
［ＤＣＰ法］
　上記ＤＣＰ法において、対象の乳幼児・小児がアレルギーを有するかを判定する方法としては、対象の乳幼児・小児の血液試料におけるＩｇＥ抗体の産生の程度、すなわちＩｇＥ抗体価をもとに判定することができ、具体的には、アレルゲンによって値は異なるがオボムコイド（ＯＶＭ）を例にすると、８００ＢＵｅ／ｍＬ以上、好ましくは１０００ＢＵｅ／ｍＬ以上である場合に、アレルギーを有すると判定する方法を挙げることができる。
　上記ＤＣＰ法としては、ＤＣＰチップを用いてＥＬＩＳＡによりＩｇＥ抗体を測定する方法を挙げることができ、上記ＤＣＰチップとしては、シリコン基板表面にカーボン層をＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）処理した基板の表面、又はガラススライドの表面に、アミノ基含有化合物かその重合体及び／又は共重合体を処理した静電層を施し、さらにジカルボン酸又は多価カルボン酸等を重ねて処理後、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類で活性化したチップや、担体の表面や上記カーボン層に化学修飾基が導入されたチップや、さらに活性化処理が行われたチップなどを挙げることができる。
　前記標識二次抗体としては、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｔｔｏ５３２、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光標識二次抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識二次抗体、磁気ビーズ標識二次抗体、赤外標識二次抗体、標識抗ヒトＩｇＥ抗体を例示することができる。上記二次抗体としては、抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も使用することができ、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
［イムノキャップ法］
　上記イムノキャップ法において、対象の乳幼児・小児がアレルギーを有するかを判定する方法としては、ＩｇＥ抗体価が、０．３５ＵＡ／ｍＬ未満をクラス０、０．３５～０．６９ＵＡ／ｍＬをクラス１、０．７０～３．４９ＵＡ／ｍＬをクラス２、３．５０～１７.４９ＵＡ／ｍＬをクラス３、１７.５０～４９.９９ＵＡ／ｍＬをクラス４、５０．００～９９．９９ＵＡ／ｍＬをクラス５、１００ＵＡ／ｍＬ以上をクラス６に分類し、クラス０は陰性であり、アレルゲン感作なし；クラス１は偽陽性で、アレルゲン感作はあるが、アレルギー症状は出ないレベルである；クラス２以上は、陽性であると判定する方法を挙げることができる。なお、ＩｇＥ抗体価の単位「ＵＡ／ｍＬ」は、イムノキャップ法を開発したファディア社が独自に設定した、アレルゲンに対して産生されるＩｇＥ抗体価の単位であり、量としては、ＩＵ／ｍＬと同じである。
［ＯＦＣ］
　上記ＯＦＣとは、小児アレルギー学会食物アレルギー委員会の「食物アレルギー診療ガイドライン２０１６ダイジェスト版　第７章」（https://www.jspaci.jp/allergy_2016/chap07.html）における定義によると、アレルギーが確定しているか疑われる食品を単回又は複数回に分割して摂取させ、症状の有無を確認する検査である。単回摂取、又は分割摂取させる対象の食品の総量を総負荷量という。摂取間隔及び分割方法の例としては、摂取間隔は２０－６０分で、１～２時間の中で１～５回に分けて漸増摂取することが提案されており、２回の場合は、６０分ごとに総摂取量の１／４（１回目）、３／４（２回目）又は総摂取量の１／３、２／３；３回の場合は３０―６０分ごとに１／８、３／８、１／２；５回の場合は、２０－４０分ごとに１／１６、１／１６、１／８、１／４、１／２；６回の場合は、２／１００、４／１００、８／１００、１６／１００、３２／１００、３８／１００；などを例示することができるが、乳幼児を対象とし、医師が立ち会うことが前提とはいえ、アナフィラキシーが発症する可能性が高い試験であるから、慎重に行うために回数をより多く、５回又は６回以上に分けて、徐々に負荷量を増加させることが好ましい。
　上記総負荷量としては、鶏卵の場合、１歳児は１/２個、２歳児以上は鶏卵１個、牛乳の場合は、１歳児は５０ｍＬ、２歳児以上は２００ｍＬ、小麦の場合は、うどん５０ｇ、２歳児以上は２００ｇを例示することができる。
　上記ＯＦＣにおいて、アレルギーが陽性であると判定される基準は以下のとおりである。
（Ａ）アレルゲン負荷開始から数分又は数時間以内に、
　皮膚症状－掻痒、蕁麻疹、紅斑、血管浮腫；及び
　粘膜症状－結膜充血、鼻汁、くしゃみ、咽頭違和感；の内一つ以上
　
（Ｂ）アレルゲン負荷開始から数分又は数時間以内に、
　呼吸器症状－咳嗽、喘鳴；　　　　　　　
　消化器症状－腹痛、嘔吐、下痢；及び
　全身症状－顔面蒼白、血圧低下、意識レベルの低下；の内一つ以上
 
（Ｃ）アレルゲン負荷開始から数分又は数時間以内に、
　小児の年齢に対する収縮期血圧で３０％以上の低下
 
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の一つ以上に該当する場合に当該特定アレルゲンに対してアレルギーが陽性であると判定される。
　なお、アナフィラキシーが発症したと判定される基準は以下のとおりである。
「１　アレルゲン負荷から数分又は数時間以内での、皮膚又は粘膜症状の出現（例：全身蕁麻疹、かゆみ、紅潮、口唇・舌・口蓋垂の腫脹)、かつ、
以下のＡ）及びＢ）のうち１つ以上を満たす。
Ａ）呼吸障害（例：呼吸困難、呼気性喘鳴、吸気性喘鳴、ＰＥＦ（peak expiratory flow）低下、低酸素症）
Ｂ）血圧低下又は関連した臓器不全(例：低血圧、虚脱、失神、失禁) 
 
２　アレルゲン負荷から数分又は数時間以内での、以下に示すＣ）～Ｆ）のうち２つ以上の症状の出現
Ｃ）皮膚又は粘膜症状の出現（例：全身蕁麻疹、かゆみ、紅潮、口唇・舌・口蓋垂の腫脹）
Ｄ）呼吸障害（例：呼吸困難、呼気性喘鳴、吸気性喘鳴、ＰＥＦ（peak expiratory flow）低下、低酸素症）
Ｅ）血圧低下又は関連した臓器不全（例：低血圧、虚脱、失神、失禁）
Ｆ）持続する消化管症状 (例：疝痛、嘔吐) 」
　本発明における、食物アレルギーを有する乳幼児・小児のアナフィラキシー発症リスクを予測するための判断基準は、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の抗体価と、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体のアビディティとを用いて作成された基準であれば特に制限されないが、ＩｇＥ抗体の抗体価に、ＩｇＥ抗体のアビディティ（１／ＩＣ５０）を乗じた値を用いることが好ましい。
［ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティの算出］
　本発明における、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティの値としては、ＩｇＥ抗体のＩＣ５０又は１／ＩＣ５０の値として数値化された値を挙げることができる。ＩＣ５０の値は、競合的結合阻害活性値とも呼ばれることがある値であり、例えば、固相化アレルゲンと可溶性アレルゲン間の競合的結合阻害活性として、抗原抗体結合反応を５０％阻害するアレルゲンの濃度を表す値を算出することにより得ることができる。この算出方法によると、同じ抗原を認識するＩｇＥ以外のＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，及び／又はＩｇＭ抗体が存在していてもＩＣ５０の値の評価ができる点で好ましい。
　上記ＩｇＥ抗体のＩＣ５０値の算出方法としては、ＩｇＥ抗体の競合結合アッセイを実施できる方法によるものであれば特に制限されず、ＥＬＩＳＡ等の生化学的アッセイによる測定方法を挙げることができる。モノクローナル抗体や精製ＩｇＥ抗体にあっては、表面プラズモン共鳴テクノロジーを用いて相互作用の程度を測定することのできるバイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、等温滴定型カロリメトリー等によるアフィニィティー測定法も挙げることができる。
　上記ＥＬＩＳＡによりＩＣ５０値を算出する方法としては、抗原と抗体間に分子間引力を低下させるカオトロピック剤（Caotropic agent）としてタンパク質変性剤を使用して、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対する親和性を測定する方法や、競合的ＥＬＩＳＡにより測定する方法を挙げることができる。カオトロピック剤は抗体のみならず抗原の分子間引力の低下を誘導する可能性のあることや、検体として用いる血清の希釈倍率によって、カオトロピック剤の濃度が同じでも抗原抗体結合阻害効果が変化するため、再現性が高いといえない。一方、種々の濃度のアレルゲンを添加して行う競合的結合阻害反応法を用いた競合的ＥＬＩＳＡによるＩＣ５０値の測定は、試料の希釈倍率によってＩＣ５０値が変化することが少ないため再現性が高く、異なるアレルゲン間でのＩＣ５０値の相互比較が可能であり、アレルゲンに対する抗体の結合活性の総和を定量的に比較できる点で好ましい。そのため、ＩＣ５０値を算出するにあたっては、血漿、血清等の血液試料を希釈した場合であっても、試料の希釈倍率を乗じる必要はないことを確認した。競合的結合阻害反応法を用いたＥＬＩＳＡによる具体的手順の例を以下に示す。
（前段階反応）
　抗原特異的アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体を含む試料に、濃度０（試料中に競合的結合阻害物質としての抗原が存在しない）から、一定時間内にすべてのＩｇＥ抗体にアレルゲンが結合できる十分な濃度に至るまで、段階的に調製された既知の濃度のアレルゲンを競合的結合阻害物質として添加し、一定時間反応させる。
　上記前段階反応における一定時間としては、例えば、１５分～２時間、好ましくは３０分～１時間を挙げることができる。また、上記段階的に調製された既知の濃度としては、試料中に存在する抗体量等に基づき、当業者が適宜決定した濃度を用いることができるが、例えば、血清や血漿中に添加する、競合阻害に用いる段階的なアレルゲン濃度（最終濃度）の例としては、０ｎＭ、０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭの組合せや、０ｎＭ、０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭの組合せなどを挙げることができるがこれらの濃度に限定されるものではない。また、競合的結合阻害反応法を用いたＥＬＩＳＡは、分子量が明確なアレルゲンについて行うことが好ましいが、アレルゲンの分子量が不明で、モル濃度でアレルゲン濃度を調整できないアレルゲンについては、上記段階的アレルゲン濃度を、ｍｇ／ｍＬ、μｇ／ｍＬ等の単位により調整することができる。
（競合的結合阻害反応）
　上記前段階反応後の溶液を、アレルゲンが固定化されている担体に供し、上記前段階反応後の溶液中に遊離しているＩｇＥ抗体（一次抗体）を固定化されているアレルゲンに結合させる等の方法により反応させ、その後一次抗体の除去と洗浄過程の後にさらに標識二次抗体と反応させ、結合しているＩｇＥ抗体の結合量を算出する。
　前記抗原抗体結合反応を５０％阻害するアレルゲンの濃度、すなわち「ＩＣ５０」は、上記前段階反応において、競合アレルゲンの存在しない濃度０とした溶液について、検出される標識二次抗体の標識量を１００％とした場合に、上記標識量が５０％となる抗原濃度（half maximal inhibitory concentration：５０％阻害濃度）として表現される。
　アレルゲンに対するＩｇＥ抗体のアビディティは、前述のとおり、ＩＣ５０値を基に、ＩＣ５０値の逆数である「１／ＩＣ５０」として表現されることができる。上記競合的結合阻害反応法を用いたＥＬＩＳＡにおいて、試料中のＩｇＥ抗体の親和性がより低い場合は、前段階反応後の溶液中に存在する遊離一次ＩｇＥ抗体の量はより多くなるので、固定化されているアレルゲンに結合する抗体量は多くなり、ＩＣ５０値はより大きくなる。一方、試料中のＩｇＥ抗体の親和性がより高い場合は、前段階反応後の溶液中に存在する遊離一次ＩｇＥ抗体の量はより少なくなるので、固定化されているアレルゲンに結合するＩｇＥ抗体量は少なくなり、ＩＣ５０値はより小さくなる。したがって、ＩｇＥ抗体の親和性がより低い場合に、アビディティを低い数値とし、ＩｇＥ抗体の親和性がより高い場合に、アビディティを高い数値とするため、便宜上ＩＣ５０値の逆数を使用する場合がある。特にＩｇＥ抗体価にＩｇＥの抗原親和性（アビディティ）を乗じて評価する場合には、ＩＣ５０値の逆数が用いられる。
　アビディティ算出における前記標識二次抗体としては、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｔｔｏ５３２、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光標識二次抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識二次抗体、磁気ビーズ標識二次抗体、赤外標識二次抗体などを挙げることができる。また、上記二次抗体としては、抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も使用することができ、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
　前記アレルゲンが固定化されている結合感度の高い担体としては、市販のＥＬＩＳＡ用チップや、非特異的吸着が少ない点において有利であることから、担体の表面にカーボン層が形成されたチップや、ペプチドを固定するために有利であることから、化学修飾基が導入されたチップや活性化処理が行われたチップを挙げることができ、なかでもＤＣＰチップが好ましい。
　上記アレルゲンを固定化させたチップ、及びそれを用いたＩｇＥ抗体の定量測定方法としては、公知のチップや方法を用いることもでき、例えば特開２００６－２６７０５８号公報、特開２００６－２６７０６３号公報、特開２０１５－１６９６１６号公報に記載のチップ、すなわち上記ＤＣＰチップを用いる方法を含めることができる。
［ＲＯＣ解析］
　本発明における、ＩｇＥ抗体の抗体価とＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティとに基づき作成された判断基準としては、乳幼児・小児のアナフィラキシー発症リスクを予測することができる判断基準であれば特に限定されないが、「ＩｇＥ抗体の抗体価にＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティを乗じた数値」をパラメーターとして、ＲＯＣ解析によるカットオフ値を用いて予測することを好適に挙げることができる。
　上記ＲＯＣとは、受信者操作特性又は受信者動作特性などと訳される言葉であって、二分変数であるアウトカムに対する独立変数の予測能の比較や、アウトカムに対する独立変数のカットオフを設定するために利用される方法である。
　本発明において、上記二分変数であるアウトカムに対する独立変数の予測能の比較を行う方法としては、例えば異なるｎ種類のパラメーターにおいて、それぞれアナフィラキシー陽性となる閾値の設定を変化させると、それに応じてアナフィラキシー陽性者に対する真陽性率及び偽陽性率が変化する。真陽性率及び偽陽性率を、縦軸に真陽性率、横軸を偽陽性率としてプロットして、ｎ種類のＲＯＣ曲線が作成された場合に、その曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど優れたパラメーターであって、予測能が高いと評価する方法を挙げることができる。
　上記ＲＯＣ曲線の作成方法としては、あるパラメーターを選択した場合に、例えば、被験者の分類において、アナフィラキシー陽性値について任意の閾値の設定を行った場合に、アナフィラキシー陽性被験者を正しくＹに分類した場合をＴＹとして示し、アナフィラキシー陽性被験者を誤ってＹに分類した場合をＦＹとして示し、アナフィラキシー陰性被験者を正しくＮに分類した場合をＴＮとして示し、アナフィラキシー陰性被験者を誤ってＮに分類した場合をＦＮとして示し、陽性者を正しく陽性であると分類した場合の真陽性率（感度）＝ＴＹ／（ＴＹ＋ＦＮ）とし、陰性者を陽性であると分類した場合の偽陽性率（１－特異度）＝ＦＹ／（ＦＹ＋ＴＮ）とすると、ある閾値に対して（真陽性率，偽陽性率）、すなわち（感度，１－特異度）をプロットできるが、さらに、様々な閾値を設定してプロットを多数行うことによりＲＯＣ曲線を作成する方法を挙げることができる。
　上記ＲＯＣ解析においてカットオフ値を設定する方法としては、予測能を上げることができる方法であれば特に限定されないが、感度－(１－特異度)が最大の値をカットオフ値として決定する方法を例示することができ、かかるカットオフ値の設定は、以下に示すＲＯＣ解析装置や市販のソフトウェアを用いて公知の手順により決定することもできる。
　ＲＯＣ解析は、公知の市販の解析装置を用いて行うこともでき、例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．５．４ (GraphPad社)、ＪＭＰ１４ (jmp.Statistical Discovery. ＴＭ)等のソフトウェアを用いて行うことができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［実施例１］
（検体）
　本実施例における検討は、徳島大学の倫理委員会の承認（＃１７５－４）を得て、２０１２年８月から２０１９年１月までの間に、徳島大学、徳島大学関連病院の健康保険鳴門病院、国立病院機構三重病院にて行われた。
　鶏卵に対するアレルゲン感作やアレルギーがあることが確認された、又は鶏卵に対するアレルギーが疑われる１歳０ヶ月～６歳の乳幼児のうち、十分なインフォームドコンセントの下に、両親双方又は両親のいずれかから承諾が得られた乳幼児について行われた。また、ＯＦＣは、日本小児アレルギー学会食物アレルギー委員会、食物アレルギー診療ガイドライン2016、協和企画の指針に基づいて行った。
被験乳幼児の選択基準を示す。 
（１）鶏卵に対するアレルゲン感作が確認され、ＯＦＣ実施前６ヶ月以上鶏卵除去食を実施している乳幼児。
（但しＯＦＣ実施前３ヶ月以内に診断目的で加熱卵ＯＦＣを施行した乳幼児は除く。）
（２）鶏卵に対するアレルゲン感作が確認され、ＯＦＣ実施の直前か４ヶ月以内に血液検査が行われ、イムノキャップ法かＤＣＰ法によりオボムコイド特異的ＩｇＥの測定が実施された乳幼児。
　この基準によって、４７２名が選択された。
（アレルゲンの選択）
　鶏卵の成分であるオボアルブミンは、加熱によってアレルゲンとしての活性を失うことが知られているので、今回の検討では、加熱鶏卵パウダーをＯＦＣにおいて摂取させることにより、加熱によってもアレルゲン活性を失わないオボムコイド（ＯＶＭ）を指標として、鶏卵アレルギーを有する被験乳幼児におけるアナフィラキシー発症の有無について検討をすすめた。
　上記の４７２名の被験乳幼児について、ＯＦＣの４週間前以降、ＯＦＣの実施日までにすべての被験者から採取された血清は、分析まで凍結融解せずに－３０℃未満で保存された。ＯＦＣを実施する前に一般的に使用されているイムノキャップ法（ファディア社）を用いた血液検査によりオボムコイド（ＯＶＭ）に対するＩｇＥ抗体の産生の程度を測定し、クラス０－６に分類した。本発明は、アナフィラキシー発症診断におけるＩｇＥ抗体のアビディティ測定の有用性を検証することを目的とするため、ＩｇＥ抗体価が低くアビディティ測定困難なクラス０の陰性者とクラス１の疑陽性者を除き、オボムコイドに対してアレルゲン感作していると判定され、アビディティの値を抗原抗体結合反応を５０％阻害するアレルゲン濃度の算出が可能なクラス２以上の乳幼児３４３名についてＯＦＣを行うこととした。
（ＯＦＣの実施）
　上記イムノキャップ法において、ＯＶＭに対してアレルゲン感作陽性であると判定されたクラス２以上の３４３名の乳幼児について、ＯＦＣを行うことにより、鶏卵アレルギーの有無についての確定診断を実施した検体をアビディティ測定に用いた。ＯＦＣの実施方法はFuruya K et al., Allergy. 2016; 71:1435-1443と日本小児アレルギー学会食物アレルギー委員会、食物アレルギー診療ガイドライン２０１６、協和企画に記載されている方法に準拠した。
　具体的には、被験乳幼児を、年齢による食物の摂取可能量に応じて１歳児と２－６歳児とのグループに分けた。１歳児のＯＦＣにおける鶏卵の総負荷量は、加熱鶏卵パウダー (キューピー株式会社) を６．５ｇ（鶏卵１／２個に相当）とした。２－６歳児のＯＦＣにおける鶏卵の総負荷量は、加熱鶏卵パウダーを１３ｇ（鶏卵１個に相当）とした。
　上記総負荷量を２／１００、４／１００、８／１００、１６／１００、３２／１００、３８／１００、の６段階に分割し、徐々に負荷量を増加させることにより、被験乳幼児に１５－３０分間隔で６回にわけて加熱鶏卵パウダーを摂取させる方法で試験を行った。すなわち、１歳児は、０．１３ｇ、０．２６ｇ、０．５２ｇ、１．０４ｇ、２．０８ｇ、２．４７ｇの順に、加熱鶏卵パウダーを１５－３０分間隔で、６回に分けて摂取した。２－６歳児は、０．２６ｇ、０．５２ｇ、１．０４ｇ、２．０８ｇ、４．１６ｇ、４．９４ｇの順に、加熱鶏卵パウダーを１５－３０分間隔で、６回に分けて摂取した。
　なお、上記加熱鶏卵パウダーは、鶏卵であることをわからないようにするためと、摂取毎の摂取量の増加の違いを補正するために、カボチャやサツマイモ粉末を添加した混合パウダーとして、各乳幼児に供された。
　加熱鶏卵パウダーを摂取した乳幼児が、以下に示す基準に該当する場合に、ＯＦＣにおいて鶏卵に対するアレルギーが陽性であると確定した。以下に示す基準に該当しない場合は鶏卵に対するアレルギーが陰性であると確定した。
（アレルギー陽性の確定基準）
（Ａ）加熱鶏卵パウダー負荷開始から数分又は数時間以内に、
　皮膚症状－掻痒、蕁麻疹、紅斑、血管浮腫；及び
　粘膜症状－結膜充血、鼻汁、くしゃみ、咽頭違和感；の内一つ以上
　
（Ｂ）加熱鶏卵パウダー負荷から数分又は数時間以内に、
　呼吸器症状－咳嗽、喘鳴； 
　消化器症状－腹痛、嘔吐、下痢；及び
　全身症状－顔面蒼白、血圧低下、意識レベルの低下；の内一つ以上
 
（Ｃ）加熱鶏卵パウダー負荷から数分又は数時間以内に、
　小児の年齢に対する収縮期血圧で３０％以上の低下
 
上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の一つ以上に該当する場合に鶏卵に対するアレルギーが陽性であると確定した。
（アナフィラキシー発症の確定基準）
　World Allergy Orhan J. 2011; 4: 13-37に従ってWorld Allergy Organization Anaphylaxis GuidelinesのCriteria for Diagnosing Anaphylaxis の記載に基づき、以下の１～３の基準のいずれか１つ以上を満たした場合にアナフィラキシーを発症したと判定した。
１　加熱鶏卵パウダー負荷から数分又は数時間以内での、皮膚又は粘膜症状の出現（例：全身蕁麻疹、かゆみ、紅潮、口唇・舌・口蓋垂の腫脹)、かつ、
以下のＡ）及びＢ）のうち１つ以上を満たす。
Ａ）呼吸障害（例：呼吸困難、呼気性喘鳴、吸気性喘鳴、ＰＥＦ（peak expiratory flow）低下、低酸素症）
Ｂ）血圧低下又は関連した臓器不全(例：低血圧、虚脱、失神、失禁) 
 
２　加熱鶏卵パウダー負荷から数分又は数時間以内での、以下に示すＣ）～Ｆ）のうち２つ以上の症状の出現
Ｃ）皮膚又は粘膜症状の出現（例：全身蕁麻疹、かゆみ、紅潮、口唇・舌・口蓋垂の腫脹）
Ｄ）呼吸障害（例：呼吸困難、呼気性喘鳴、吸気性喘鳴、ＰＥＦ（peak expiratory flow）低下、低酸素症）
Ｅ）血圧低下又は関連した臓器不全（例：低血圧、虚脱、失神、失禁）
Ｆ）持続する消化管症状 (例：疝痛、嘔吐) 
 
３　加熱鶏卵パウダー負荷から数分又は数時間以内での、年齢に応じた収縮期血圧の低下、又は収縮期血圧の３０％以上の低下を示した場合
　上記ＯＦＣにおいて陽性であると判定された乳幼児を鶏卵アレルギーありと診断し、上記ＯＦＣにおいて陰性であると判定された乳幼児を鶏卵アレルギーなしと診断した。さらに、鶏卵アレルギーありと診断された被験乳幼児において、アナフィラキシー反応が現れた乳幼児をアナフィラキシーあり（ＡＮ＋）とし、アナフィラキシー反応が現れなかった乳幼児をアナフィラキシーなし（ＡＮ－）とした。また、被験乳幼児について、ＯＦＣ実施前に行ったイムノキャップ法を用いた血液検査により分類されたクラスについても記載した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（結果１）
　表１から明らかなとおり、上記加熱鶏卵パウダーによるＯＦＣを行った３４３名の１－６歳の乳幼児のうち、ＯＦＣ陽性であって、鶏卵アレルギーであると確定したのは２０４名であった。一方、ＯＦＣ陰性であって、鶏卵アレルギーではないと確定したのは１３９名であった。また、鶏卵アレルギーであると確定した２０４名のうち、アナフィラキシーを発症すると判定されたのは３８名であり、アナフィラキシーを発症しないと判定されたのは１６６名であった。
　したがって、ＯＦＣを実施した１－６歳の乳幼児のうち、５９．５％が鶏卵アレルギーであると確定され、４０．５％が鶏卵アレルギーではないことが確定された。なお、前段階で行ったイムノキャップ法において、オボムコイド感作が陽性であると判定され、クラス２～６に分類された乳幼児における男女比は、男児６６．５％、女児３３．５％であって、男児が有意に高値を示した。しかし、ＯＦＣによる鶏卵アレルギーの確定診断においては、鶏卵アレルギーあり、鶏卵アレルギーなし、鶏卵アレルギーあり、かつＡＮ＋、鶏卵アレルギーありかつＡＮ－のそれぞれにおける男女比に有意な差は認められなかった。また、鶏卵アレルギーであることが確定した乳幼児において、重篤な症状を示したＡＮ＋の乳幼児は１８．６％を占めた。鶏卵アレルギーであることが確定したが、ＡＮ－の乳幼児アレルギー症状は、生命に危機を与え得る過敏反応状態ではなかった。
（結果２）
　上記被験乳幼児のうち、免疫系が未発達であるため、日常的な診療では、アレルギーの診断に困難を伴う１－３歳の被験乳幼児のみについてのデータを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から明らかなとおり、上記加熱鶏卵パウダーによるＯＦＣを行った２５６名の１－３歳の乳幼児のうち、ＯＦＣ陽性であって、鶏卵アレルギーであることが確定したのは１４７名であった。一方、ＯＦＣ陰性であって、鶏卵アレルギーではないと確定したのは１０９名であった。また、鶏卵アレルギーであることが確定した１４７名のうち、アナフィラキシーを発症すると判定されたのは２８名であり。アナフィラキシーを発症しないと判定されたのは１１９名であった。
　したがって、ＯＦＣを実施した１－３歳の乳幼児のうち、５７．４％が鶏卵アレルギーであると確定され、４２．６％が鶏卵アレルギーではないと確定された。また、鶏卵アレルギーであると確定した乳幼児において、重篤な症状を示したＡＮ＋の乳幼児は１９．０％を占めた。鶏卵アレルギーであると確定したが、ＡＮ－の乳幼児アレルギー症状は、生命に危機を与え得る過敏反応状態ではなかった。以上より、免疫系が未熟とされる１－３歳の乳幼児における、鶏卵アレルギーが確定した乳幼児のアナフィラキシー発症乳幼児の割合は、１－６歳と比較して、有意差がないことが確認された。
［実施例２］
［ＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体価のＤＣＰ法による測定］
　上記１－６歳の乳幼児３４３名について、ＯＦＣを行う前に採取した血清試料を用いて、抗原タンパク質として、鶏卵に含まれる分子量の明らかなアレルゲンとして知られているＯＶＭ（シグマ社製）を抗原としてＤＣＰチップに固定化して、ＯＶＭと結合するＩｇＥ抗体量をＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体価として測定した。なおＩｇＥ抗体価の定量に当たっては、National Institute for Biological Standards and Control(Hertfordshire, England)より購入した既知の濃度のヒト標準ＩｇＥ抗体（７５／５０２）による蛍光強度検量線を作成し、ＤＣＰチップを用いてＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体価（ＢＵｅ／ｍＬ）を測定した。
［ＯＶＭ固定化ＤＣＰチップの作製］
（チップの活性化）
　ガラス基板からなるＤＣＰチップに、アミノ基含有静電層を施し、さらにポリアクリル酸による負の電荷を帯びるカルボキシル基を導入した基板を化学架橋剤（１００ｍＭ ＷＳＣ・ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮＨＳ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０））中で、遮光した状態で室温にて３０分間振盪しながら活性化処理を行った。反応後の化学架橋剤を廃棄後、基板をＭｉｌｌｉＱ水で振盪しながら１分間の洗浄を２回行った後、直ちに卓上遠心機（ＡｌｌｅｇｒａＴＭＸ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｒ，Beckman Coulter社製）を用いて水分を除去し、活性化チップを調製した。
（ＯＶＭのカップリング反応）
　５～３０％ＤＭＳＯ又は５～３０％ＰＥＧ３００を添加した溶液に、抗原タンパク質としてＯＶＭ（シグマ社製）を０．２～２．０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して、抗原タンパク質溶液を調製した。かかる調製された抗原タンパク質溶液を３８４穴プレート平底（コーニング社製）に分注し、マイクロアレイ作製装置（ＯｍｎｉＧｒｉｄＡｃｃｅｎｔ，DIGILAB社製）により、上記活性化チップ上に４ｎＬスポット後、１５℃～３０℃にて１～１８時間乾燥し、ＯＶＭ抗原タンパク質を固定化した。ＯＶＭが固定化されたＤＣＰチップの模式図を図２に示す。
（未反応活性基のブロッキング反応）
　上記抗原タンパク質としてＯＶＭが固定化されたチップにブロッキング試薬のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社）を反応穴槽（ウェル）に添加し、遮光下冷蔵(４℃)にて静置し終夜反応させた。上記ブロッキング試薬をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、再度反応プレートに移し、洗浄液（５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０ｍＬ添加後、５分間揺動した後にアスピレーターで洗浄液を吸引除去した。同様に３回洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）で３回洗浄した。遠心機（Allegra（商標）、Ｘ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ(BECKMAN COULTER社製)）で、遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)して、チップ表面の水滴を除去し、ＯＶＭ固定化ＤＣＰチップを作製した。
（一次抗体反応）
　サンプル希釈液（20 mM phosphate buffer, pH 7.4/0.3 M KCl/0.05% Tween20）で各被験乳幼児の血清試料を適宜希釈して、血清希釈溶液（一次抗体液）を調製し、かかる希釈試料を、反応穴槽に１０μＬ添加し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
（二次抗体との反応）
　上記の操作で得られた希釈試料をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(ＴＴＢＳ：５０ｍＭ　Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.95% Tween20）を１０ｍＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返して洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。次に蛍光標識した二次抗体(ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は ５５５ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＥ（ＨｙＴｅｓｔ社）（希釈液、IMMUNO SHOT Platimun/1 % BSA、最終希釈濃度１０μｇ／ｍＬ））を二次抗体液として調製した。かかる二次抗体液を、スライド上の各反応穴槽に１０μＬ分注し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
（抗原に捕捉された一次抗体の検出）
　上記希釈二次抗体液をアスピレーターで吸引除去後、チップを洗浄用ケースに入れＤｏｕｂｌｅ－ＳｈａｋｅｒＮＲ３(TAITEC社製)を用いて洗浄作業を５分間３回繰返し行った。その後、精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加え１分間３回すすぎ、上記遠心機で水滴を除去し乾燥させた。蛍光スキャナー（３Ｄ Gene Scanner、東レ社製）で蛍光強度を測定(Ｅｘ：５３２ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ)し、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。測定単位は、抗原と抗原抗体反応により結合したＩｇＥ抗体価として、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｕｎｉｔ（ＢＵｅ）で表し、チップに固定化した既知の濃度のそれぞれの標準抗体の蛍光強度の検量線から測定して表した。１ＢＵｅ＝２．４ ｎｇとして以下表記する。
［実施例３］
［ＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体のアビディティの測定］
　上記１－６歳の乳幼児３４３名について、ＯＦＣを行う前に採取した血清試料及び抗原タンパク質としてＯＶＭ（シグマ社製）を用いて、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体のＯＶＭに対するアビディティを測定した
　前記ＯＶＭ固定化ＤＣＰチップを用い以下の反応を行った。
（一次抗体反応）
　サンプル希釈液（20 mM phosphate buffer, pH 7.4/0.3 M KCl/0.05% Tween20）で各被験乳幼児の血清試料を適宜希釈、例えば２．５倍に希釈して、血清希釈溶液（一次抗体溶液）を調製し、抗体価を測定した。次に、得られた希釈液の抗体価を、添加した可溶性抗原量に依存した競合的結合阻害活性（アビディティ）が検出可能な範囲になるように再調整した。具体的には、ＯＶＭ ＩｇＥ の示す蛍光強度の下限値が、＞測定限界値（ブランク＋５ＳＤ）で、上限値の蛍光強度が５，０００以下の範囲になるように調整した。また、０，０．２，２．０，２０，１００, ２００ｎＭの６段階の濃度に上記サンプル希釈液で調整した６種類のＯＶＭ溶液を競合的結合阻害物質として調製した。ＩＣ５０値は、検体に含まれるＩｇＥ抗体とチップに固相化したＯＶＭ抗原との抗原・抗体反応を測定する際に、種々の濃度の可溶性ＯＶＭを予め上記６種類のＯＶＭ溶液を１種類ずつ６μＬをそれぞれ上記血清希釈溶液（６μＬ）に添加して（合計１２μＬ）、２５℃にて３０分反応させる前段階反応を行った。反応後それぞれの前段階反応液について１０μＬを採取して、上記ＯＶＭ固定化ＤＣＰチップに加え、遮光下３７℃にて２時間静置した。なお、上記ブランク+５ＳＤは、測定限界下限値を示し、具体的には、緩衝液のみの検体血清なしの条件下で、反応液に含まれる蛍光標識２次抗体が非特異的に抗原と結合することに由来する蛍光強度をブランク値とした。かかる蛍光強度は、５回繰り返し測定して蛍光強度のstandard deviation （ＳＤ）値を算出し、ブランク＋５ＳＤ（測定限界下限値）以上の蛍光強度を示す場合を、サンプルに由来するＩｇＥの蛍光強度とした。
（二次抗体との反応）
　ＤＣＰチップ上で反応が行われた血清希釈溶液をアスピレーター(VARIABLE SPEED PUMP、BIORAD社製)で吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０ｍＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返して洗浄し、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。次に蛍光標識した二次抗体(ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）又は ５５５ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＥ（ＨｙＴｅｓｔ社）（希釈液、IMMUNO SHOT Platimun/1 % BSA、最終希釈濃度１０μｇ／ｍＬ）を調製した。かかる二次抗体液を、スライド上の各反応ウェルに１０μＬ分注し、遮光下３７℃にて２時間静置した。
　その後アスピレーターで吸引除去後、チップを洗浄用ケースに移し、洗浄液(５０ｍＭ ＴＴＢＳ）を１０ｍＬ添加後、Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｈａｋｅｒ ＮＲ３を用いて洗浄作業を５分間３回繰り返し洗浄した後、さらに精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）を加えて１分間３回洗浄した。上記遠心機で遠心水滴除去(２０００ｒｐｍにて１分間)してチップ表面の水滴を除去した。残存蛍光量を蛍光スキャナー（３D Gene Scanner、東レ社製）で蛍光強度を測定(Ｅｘ：５３２ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ)することにより、各チップから得られたスポットの蛍光強度の数値化を行った。各被検乳幼児・小児において、ＯＶＭが存在しない溶液、すなわち競合的結合阻害物質の濃度が０の場合の蛍光強度を１００％としたときに、蛍光強度が５０％を示すＯＶＭ濃度を「ＩＣ５０」値として示した。
［ＲＯＣ解析］
［参考例１］
　［実施例１］でＯＦＣを行った１－６歳の乳幼児（３４３例）について、ＲＯＣ解析を行った。ＯＦＣ陽性を鶏卵アレルギーありと診断し、ＯＦＣ陰性を鶏卵アレルギーなしと診断した結果を基に、これまでに測定したＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価とＯＶＭ特異的ＩｇＥのアビディティ、及び、イムノキャップ法 により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価とを用いて、
（１）ＤＣＰ法 により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値 を乗じた［ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］］；
（２）ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＤＣＰＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））；
（３）ＤＣＰ法　により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥの１／ＩＣ５０の値（１／ＤＣＰ ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））；
（４）ＤＣＰ法　により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価（ＤＣＰ ＯＶＭｓ ＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ））；
（５）イムノキャップ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価（ＣＡＰ ＯＶＭｓ ＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ））；
の５種類のパラメーターについてＲＯＣ解析を行った。結果を図３に示す。これ以降、ＲＯＣ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒ．５．４ (GraphPad社)、ＪＭＰ１４ (jmp.Statistical Discovery.TM)を用いて行った。
　また、１－６歳の３４３名の乳幼児を対象に、ＯＦＣによるＯＶＭに対するアレルギーの確定診断に依拠して、アレルギー陽性確定者と診断された被験者とアレルギー陰性確定者と診断された被験者について、上記５種類のパラメーター毎に、ＲＯＣ解析を行い、ＡＵＣ値、カットオフ値、感度、特異度を算出した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＣＡＰ ＯＶＭ sＩｇＥ法（ＵＡ／ｍＬ）とＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ　法（ＢＵｅ／ｍＬ）により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価のＡＵＣ値はほぼ同等であった。検討した５種類のパラメーターの中で、ＩｇＥ抗体価にＯＶＭアビディティを乗じた「ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０」のＡＵＣ値が０．７９と最も高く、この時のアレルギー確定診断のカットオフ値は、４４５９．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）を示した。したがって、ＩｇＥ抗体価にＯＶＭアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０の値が、このカットオフ値すなわち、４４５９．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）以上を示す場合は、鶏卵アレルギー有のリスクが高いと判定し、このカットオフ値未満を示す場合には、鶏卵アレルギーのリスクが低いと判定することができる。したがって、これまで鶏卵アレルギーが疑われる患者に一律に実施していた食餌制限を、リスクの高い患者のみに実施し、リスクの低い患者には食餌制限を解除する等、患者のクオリティーオブライフの向上に利すると推定された。なお図３の下段に示すように、ＩｇＥ定量値にＯＶＭアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（量×質）のＡＵＣ値は、ＩＣ５０値やＯＶＭアビディティ等の単独パラメーターに比較して、有意差を示すＰ値を示し鶏卵アレルギー有のリスクと、鶏卵アレルギー無しを正確に判定できることが示された。なお、本願明細書において、「ＯＶＭ sＩｇＥ」は、オボムコイド（に）特異的な（specific）ＩｇＥを意味する。
［参考例２］
［実施例１］で示した被験者（１－６歳）の中で、特に免疫系が未発達で、日常診療でのアレルギーの診断に困難を伴うとされる被験者（１－３歳）２５６名を対象に、ＯＦＣによるＯＶＭに対するアレルギーの確定診断に依拠して、アレルギー陽性確定者と診断された被験者とアレルギー陰性確定者と診断された被験者について、上記５種類のパラメーターについてＲＯＣ解析を行った結果を図４に示す。
　また、１－３歳の２５６名の乳幼児を対象に、ＯＦＣによるアレルギー確定診断に依拠して、アレルギー陽性確定者と診断された被験者とアレルギー陰性確定者と診断された被験者について、ＲＯＣ解析を行い、上記５種類のパラメーター毎に、ＡＵＣ値、カットオフ値、感度、特異度を算出した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（結果）
　アレルギー診断に困難を伴うとされる被験者（１－３歳）においても、被験者（１－６歳）の場合と同様に５種類のパラメーターで検討した。被験者（１－３歳）では、イムノキャップ法（ＵＡ／ｍＬ）とＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価（ＢＵｅ／ｍＬ）のＡＵＣ値において、被験者（１－６歳）の場合とほぼ同等の値が確認された。検討した５種類のパラメーターの中で、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ値にアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０のＡＵＣが、他のパラメーターと比較して０．７９と最も高く、この時のアレルギー確定診断のカットオフ値は、１５５６．７０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）を示し、被験者（１－６歳）のカットオフ値の３５％と低値を示した。なお図４の下段に示すように、被験者（１－３歳）においては被験者（１－６歳）と同様に、ＩｇＥ定量値にＯＶＭアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（量×質）のＡＵＣ値は、ＩＣ５０値やＯＶＭアビディティ等の単独パラメーターに比較して、有意差を示すＰ値で、鶏卵アレルギー有のリスクと、鶏卵アレルギー無しを正確に判定できることが示された。
［実施例４］
　表１に示す１－６歳の鶏卵アレルゲン感作陽性者３４３名の乳幼児において、ＯＦＣによるアナフィラキシー発症リスク診断について、図５に示すように、（Ａ） ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）、（Ｂ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）、（Ｃ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］、（Ｄ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、（Ｅ）１／ＤＣＰ ＯＶＭ sＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、の５種類のパラメーターについて診断精度と有用性を評価し、各群間の有意差検定を実施した。また、図５の統計学的データを以下の表５に示す。
（結果）
　図５、及び表５から明らかなとおり、従来からのアレルゲン特異的ＩｇＥ定量法の（Ａ）ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）や、（Ｂ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）では、鶏卵アレルギーの有（ＥＡ＋）、無（ＥＡ－）の診断は有意差を持って診断できるが、「生命の危機を与え得る過敏反応状態、アナフィラキシーの発症」、即ち［（ＡＮ＋）及び（ＡＮ－）］の診断においては、両群間に有意差は検出できなかった。しかし、（Ｃ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］をパラメーターにすると、鶏卵アレルギー陽性者の中の（ＡＮ＋）と（ＡＮ－）を有意差（Ｐ＝０．００４１）を持って識別できることが判明した。なお、（Ｄ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、（Ｅ）１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）値でも、Ｐ値はそれぞれ、０．０１８３、０．０１８４の比較的良好な値を示した。このように、ＯＶＭアビディティを用いることにより、アナフィラキシー発症リスク診断は特に診断精度が増加し、その効果はパラメーターＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］で、最も明らかに示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　１－６歳の被験者（３４３例）のＯＦＣ結果によるＯＶＭに対するアナフィラキシー発症診断について、上記の５種類のパラメーターについてＲＯＣ解析を行った結果を図６に示す。
　また、上記ＲＯＣ解析を行った１－６歳の３４３名の乳幼児を対象に、ＯＦＣによるアナフィラキシー発症診断に依拠して、アナフィラキシー発症者と診断された被験者とアナフィラキシー非発症者と診断された被験者について、上記５種類のパラメーター毎に、ＡＵＣ値、カットオフ値、感度、特異度を算出した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＲＯＣ解析では、ＯＶＭアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］をパラメーターにすると、ＡＵＣは０．７６と他のパラメーターに比較して最も高く、０．７－０．８内にあることから鶏卵アナフィラキシーの発症に関する診断精度は良好と判定された。このパラメーターのカットオフ値は、８９６０．１０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］を示し、鶏卵アレルギー有のリスクの４４５９．００［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］よりも約２倍高く、この値を超える値が出た場合は、鶏卵アナフィラキシーの発症リスクが高くなると推定することができた。なお図６の下段に示すように、被験者（１－６歳）においてＩｇＥ定量値にＯＶＭアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（量×質）のＡＵＣ値は、従来法のＩｇＥ定量値［（ＵＡ／ｍＬ）／ｍＬ］単独パラメーターに比較して、Ｐ値は有意差を示し、鶏卵アレルギー有のリスクと、鶏卵アレルギー無しを正確に判定できることが示された。
［実施例５］
　表２に示す１－３歳の免疫系が未熟でアレルギーの診断に困難を伴う２５６名の乳幼児において、ＯＦＣによるアナフィラキシー発症リスク診断について、その診断精度と有用性を、（Ａ） ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）、（Ｂ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）、（Ｃ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］、（Ｄ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、（Ｅ）１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、の５種類のパラメーターについて評価し、各群間の有意差検定を実施した結果を図７に示す。また、図７の統計学的データを以下の表７に示す。
（結果）
　図７から明らかなとおり、（Ａ）ＣＡＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＵＡ／ｍＬ）や、（Ｂ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）では、鶏卵アレルギーの有（ＥＡ＋）、無（ＥＡ－）の診断は有意差を持って診断できるが、アナフィラキシーの発症リスク診断においては、１－６歳と同様に両群間に有意差は認められなかった。しかし、（Ｃ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］をパラメーターにすると、鶏卵アレルギー陽性者の中の（ＡＮ＋）と（ＡＮ－）を有意差（Ｐ＝０．００７７）をもって識別できることが判明した。また、抗原親和性パラメーターの（Ｄ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、（Ｅ）１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）でも、Ｐ値はそれぞれ０．００９２、０．００９３と良好な値を示し、アナフィラキシーの発症予測診断に有用であることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記ＲＯＣ解析を行った１－３歳の２５６名の乳幼児を対象に、ＯＦＣによるアナフィラキシー発症診断に依拠して、アナフィラキシー発症者と診断された被験者とアナフィラキシー非発症者と診断された被験者について、上記５種類のパラメーター毎に、ＡＵＣ値、カットオフ値、感度、特異度を算出した。結果を図８と表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　従来アナフィラキシー発症診断が困難であった１－３歳の乳幼児のアナフィラキシー発症者と非発症者間のＲＯＣ解析における、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］のカットオフ値は表８に示す如く１２２５．８０で、１－６歳が示すカットオフ値（８９６０．１０）の１３．７％と低値を示し、１－３歳の乳幼児ではアナフィラキシーが発症しやすいことが明確になった。ＯＶＭアビディティをＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ値に乗じた上記パラメーター（量×質）は、図８及び表８に示すとおり、ＲＯＣ曲線の示すＡＵＣの値は、検討した５群の中で最も高く０．７７を示し、この時の感度は最高値の１．００を示し、アナフィラキシー発症リスク診断に有用であることが示された。以上の結果は、図７及び表７が示す（Ｃ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］においては、ＥＡ（＋）（ＡＮ－）群と、ＥＡ（＋）（ＡＮ＋）群間のＰ値はＰ＝０．００７７で有意差（Ｐ＜０．００８）を示した。また（Ｄ）ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）、（Ｅ）１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）においても、ＥＡ（＋）（ＡＮ－）群と、ＥＡ（＋）（ＡＮ＋）群間のＰ値はそれぞれＰ＝０．００９２、Ｐ＝０．００９３で、比較的良好な結果であった。また図８の下段に示すように、被験者（１－３歳）においてもＩｇＥ定量値にＯＶＭアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（量×質）のＡＵＣ値は、従来法のＩｇＥ抗体価の（ＵＡ／ｍＬ）や（ＢＵｅ／ｍＬ）の単独パラメーターに比較して、有意差を示しており、鶏卵アナフィラキシー有のリスクと、鶏卵アナフィラキシー無しを正確に判定できることが示された。以上から、１－３歳のアナフィラキシー発症リスク診断におけるＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］のカットオフ値１２２５．８０以上である場合は、鶏卵アナフィラキシーの発症リスクが高いと判定できると推定した。
（まとめ）
　これまでアレルギー診断は、図１に示すように血液中のアレルゲン特異的ＩｇＥの（量）のみが測定されており、アレルゲン特異的ＩｇＥの質としての抗原親和性は、考慮されていなかった。抗体の示す反応は、抗体の「量」と「質」から成り立っていることから、アレルゲン特異的ＩｇＥの生体反応は、その「量」と「質」を合わせて評価すべきである。抗体の「質」として、本発明では抗原アビディティの有用性を検討した。
　アレルゲンに対するＩｇＥアビディティは、固相化アレルゲンと可溶性アレルゲン間の競合的結合阻害活性（ＩＣ５０値）で測定し、１／ＩＣ５０値を持って示すことができる。この方法は、同じ抗原を認識するＩｇＥ以外のＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＭ抗体が存在していても評価できるだけでなく、アレルゲン間の親和性の違いや、異なるアレルゲン相互の親和性の違いを同一のパラメーターで評価できる利点を持つ。本発明では、ヒト血清中のポリクローナルＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティ（１／ＩＣ５０値）を測定することで、従来のアレルゲン特異的ＩｇＥ定量法ではアナフィラキシーの発症リスクを診断することが困難であったが、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）抗体価にアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］をパラメーターにすることで、アナフィラキシーの発症リスクを予測診断できることを確認した。さらに１－６歳、及び１－３歳の鶏卵アレルギー陽性患者のアナフィラキシー発症リスク診断では、アレルゲンに対するアビディティ単独パラメーターのＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）値、及び、１／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ）値でも、ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ（ＢＵｅ／ｍＬ）抗体価にアビディティを乗じたＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］に比べて有意差の程度は減じるものの、有意差を持ってアナフィラキシーの発症の有無を区別できることが新たに判明した。
［実施例６］
　これまでのＲＯＣ解析から算出された鶏卵アレルギーと鶏卵アナフィラキシーのＩＣ５０値と、ＩｇＥ抗体価とＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づいて作成された判断基準［（ＢＵｅ／ｍＬ）／ＩＣ５０] のカットオフ値の実装性（有効性）を検討するため、これまでのデータ（表１～表８等）を取得した病院とは別地域の病院である大阪府の高槻病院に依頼して、高槻病院の病院倫理委員会の承認（倫理委員会承認番号：２０１９－９２）の下、ＯＦＣを実施するアレルギー患者を２０２０年２月２０日よりリクルートし、患者及びその家族の同意を得て採血を行い、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ値の測定とそのアビディティの値の算出を実施した。
　測定の第一期として、２０２０年２月２０日から２０２０年６月１７日までの約４ヶ月に収集できた鶏卵アレルギー患者１９症例のうち、ＯＶＭが関与する加熱鶏卵ＯＦＣを実施した症例は１５症例であった。これ以外の鶏卵アレルギー患者４例は、生卵のアレルゲンであるオボアルブミンを原因とすることが判明していたので、今回の検討からは除外した。加熱鶏卵ＯＦＣを実施した１５症例につき、特許に記載された鶏卵アレルギーと鶏卵アナフィラキシーのＩＣ５０値と、[（ＢＵｅ／ｍＬ）／ＩＣ５０]値のカットオフ値の有効性を検証した。
　高槻病院小児科で加熱鶏卵ＯＦＣを実施できた症例は、１～３歳が１５症例中２例で、その他の１３症例は８～１５歳であった。本研究では８～１５歳の１３例については、１～６歳のカットオフ値を用いて有効性を検討することとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（鶏卵アレルギー診断におけるカットオフ値)
　上記表９に示される数値の内容は、以下のとおりである。
［１］１～３歳及び１～６歳の乳幼児において、ＯＦＣによるＯＶＭに対するアレルギーの確定診断に依拠して、鶏卵アレルギー陽性確定者と診断された被験者と、鶏卵アレルギー陰性確定者と診断された被験者とについて、ＲＯＣ解析を行った結果のカットオフ値を、前記表３及び表４から以下のとおり抽出した。
（１）ＤＣＰ法により測定された、ＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））におけるアレルギーの有無についてのカットオフ値；
（すなわち、１～３歳の場合は、１．１３ｎＭ未満、１～６歳の場合は、１．３０ｎＭ未満の場合に、アレルギー陽性と判定することができる。）
（２）ＤＣＰ法 により測定された、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に１／ＩＣ５０の値を乗じた［ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］］におけるアレルギーの有無についてのカットオフ値；
（１～３歳の場合は、１５５６．７０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）、１～６歳の場合は、４４５９．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）以上の場合に、アレルギー陽性と判定することができる。）
（鶏卵アナフィラキシー発症診断におけるカットオフ値)
［２］１～３歳及び１～６歳の乳幼児において、ＯＦＣによる鶏卵アナフィラキシー発症診断に依拠して、アナフィラキシー発症者と診断された被験者と、アナフィラキシー非発症者と診断された被験者とについて、ＲＯＣ解析を行った結果のカットオフ値を、前記表６及び表８から以下のとおり抽出した。
（３）ＤＣＰ法により測定された、ＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ-ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））におけるアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値；（すなわち、１～３歳の場合は、２．１５ｎＭ未満、１～６歳の場合は、１．０３ｎＭ未満の場合に、アナフィラキシー発症の可能性ありと判定することができる。）
（４）ＤＣＰ法 により測定された、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に１／ＩＣ５０の値を乗じた［ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］］におけるアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値；
（すなわち、１～３歳の場合は、１２２５．８０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）以上、１～６歳の場合は、８９６０．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）以上の場合に、アナフィラキシー発症の可能性ありと判定することができる。）
がそれぞれ示されている。
　上記高槻病院でＯＦＣを行った症例について、１～３歳の２例と、８～１５歳の１３例から得られた３種パラメーター：ＤＣＰ ＯＶＭ－ｓＩｇＥ、ＤＣＰ ＯＶＭ－ｓＩｇＥ ＩＣ５０、ＤＣＰ ＯＶＭ－ｓＩｇＥ／ＤＣＰ ＯＶＭ－ｓＩｇＥ ＩＣ５０の結果を以下の表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０の(Ａ)は、加熱鶏卵ＯＦＣの結果、鶏卵アレルギー陰性と判定された群（鶏卵アレルギー陰性・アナフィラキシー発症陰性群）であり、１～３歳の乳幼児の２名と８～１５歳の小児８名が属する。（Ｂ）は、加熱鶏卵ＯＦＣの結果、鶏卵アレルギー陽性と判定されて、かつ、アナフィラキシーを発症していない群（鶏卵アレルギー陽性・アナフィラキシー発症陰性群）である。（Ｃ）は、加熱鶏卵ＯＦＣの結果、鶏卵アレルギー陽性と判定されて、かつ、アナフィラキシーを発症した群（鶏卵アナフィラキシー発症群）である。
（鶏卵アレルギー陰性・アナフィラキシー発症陰性群）
　加熱鶏卵ＯＦＣの結果、鶏卵アレルギー陰性と判定された１～３歳の乳幼児の２名については、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））が、４．３９ｎＭと１９４．７１ｎＭであって、１～３歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１．１３ｎＭ以上であるので、アレルギー陰性の範囲に入ることが確認された。また、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値は、７５７．１２（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）と１１．８２（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）であって、１～３歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１５５６．７０よりも低い値であるので、アレルギー陰性の範囲に入ることが確認された。実際に、この２名の乳幼児においては、鶏卵アレルギーの兆候は確認されていない。
　なお、この２名は、アナフィラキシー発症の有無についても、１～３歳の場合のＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））におけるカットオフ値２．１５ｎＭよりも高い値を示した。また、１～３歳の場合のＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のパラメーターを用いるアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値１２２５．８０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも低い値を示し、アナフィラキシーを発症する可能性も非常に低いと考えられ、この２名について今のところ、鶏卵摂取によるアナフィラキシー発症の報告は受けていない。
　したがって、１～３歳において、ＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値をパラメーターとして、ＲＯＣ解析により決定されたアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値、及び、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に１／ＩＣ５０の値を乗じた値をパラメーターとして、ＲＯＣ解析により決定されたアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値が、有効に適用可能であることが確認された。
　ＴＨＧ－２３及びＴＨＧ－４４を除いた８～１５歳の小児６名については、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））が、１．７３ｎＭ～１６．０３ｎＭの範囲であって、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１．３０ｎＭ以上であるので、アレルギー陰性の範囲に入ることが確認された。また、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値は、１７０．９３（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）～１０８２．４１（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）であって、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアレルギーの有無についてのカットオフ値である４４５９．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）未満であるので、アレルギー陰性の範囲に入ることが確認された。
　また、ＴＨＧ－４４の１名を除いたこれら８～１５歳の小児７名については、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値をパラメーターとするアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値１．０３ｎＭよりもいずれも高い値を示し、１～６歳の場合のＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のパラメーターとするアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値８９６０．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも低い値を示した。これら８～１５歳の小児６名は、アナフィラキシー発症の兆候は全く示されておらず、１～６歳におけるカットオフ値を使用して、アナフィラキシー発症を予測できることを確認した。
　８～１５歳の小児１名（ＴＨＧ－４４）については、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））が、０．９３ｎＭであって、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１．３０ｎＭ未満であるので、アレルギー陽性の範囲に入る。また、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である１．０３ｎＭ未満であるので、アナフィラキシー発症の可能性があると推測された。
　ＴＨＧ－４４症例では、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値が、１５１３３．５４（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）であって、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１５５６．７０よりも高い値であり、アレルギー陽性の範囲に入る。また、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である８９６０．１０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも高いので、アナフィラキシー発症の可能性が非常に高いことが予測される。したがって、この小児については、未だ、鶏卵を摂取することによるアレルギー症状は確認されていないものの、将来、アナフィラキシー発症の可能性があるとして、医師の監督の下、特に鶏卵に関する食事指導を行い、経過観察中である。
　８～１５歳の小児１名（ＴＨＧ－２３）については、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））が、１．２５ｎＭであって、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１．３０ｎＭ未満であるので、アレルギー陽性の範囲に入る。しかし、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である１．０３ｎＭより高値であり、アナフィラキシー発症の可能性は少ないとされた。
　ＴＨＧ－２３症例では、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値は、９４２．３６（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）を示し、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアレルギーの有無についてのカットオフ値である４４５９．００よりも低い値であり、アレルギー陰性の範囲に入る。また、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である８９６０．１０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも低い。１～６歳における２つのカットオフ値を適用した場合、この小児がアナフィラキシーを発症する可能性は低いといえる。この小児については、現在、鶏卵を摂取してもアレルギー症状は出ていないことから、経過観察中である。
（鶏卵アレルギー陰性群についてのまとめ）
　鶏卵アレルギー陰性群（（Ａ）群）において、ＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値におけるアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値、及び、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に１／ＩＣ５０の値を乗じた値におけるアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値を有効に利用できることが確認された。また、８～１５歳の小児についても１～６歳のデータをもとに算出されたカットオフ値が適用できることが確認された。
（鶏卵アレルギー陽性・アナフィラキシー発症陰性群）
　加熱鶏卵ＯＦＣの結果、鶏卵アレルギー陽性と判定された８～１５歳の小児の２名（ＴＨＧ－３１及び４７）については、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））が、１．０５ｎＭと０．４８ｎＭであって、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１．３０ｎＭ以下であるので、アレルギー陽性の範囲に入ることが確認された。
　ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値は、１４６５．６４（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）と３８９７．７９（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）であって、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアレルギーの有無についてのカットオフ値である４４５９．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも低い値であり、アレルギー陰性の範囲に入った。この２名は、鶏卵アレルギーの軽微な症状はでているが、鶏卵アレルギー陽性から陰性への移行期である可能性が高く、経過を観察している。
　また、これらの小児は、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である８９６０．１０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも相当程度低いので、アナフィラキシー発症の可能性が低いことが予測され、実際にアナフィラキシーの症状はでていない。しかし、ＴＨＧ－４７症例については、ＩｇＥのＩＣ５０値がアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値よりも低く、今後も経過観察が必要とされる。
　８～１５歳の小児１名（ＴＨＧ－２１）については、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））が、１．７４ｎＭであって、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１．３０ｎＭ以上であるので、アレルギー陰性の範囲に入る。ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値は、４８９７．４７（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）であって、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアレルギーの有無についてのカットオフ値である４４５９．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも高い値であり、アレルギー陽性の範囲に入る。
　ＴＨＧ－２１症例においては、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である１．０３ｎＭよりもＩＣ５０値が高く、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である８９６０．１０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値が低い。１～６歳における２つのカットオフ値を適用した場合、アナフィラキシーを発症する可能性は低いといえる。実際、この小児は、症状は軽快で、アナフィラキシー発症したという既往歴はない。したがって、８～１５歳の小児についても、１～６歳のデータをもとに算出されたカットオフ値が適用できることが確認された。
　８～１５歳の小児１名（ＴＨＧ－１３）については、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））が、２．７ｎＭであって、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアレルギーの有無についてのカットオフ値である１．３０ｎＭ以上であるので、アレルギー陰性の範囲に入る。また、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値は、３１７．１７（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）であって、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアレルギーの有無についてのカットオフ値である４４５９．００（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりもはるかに低い値であり、アレルギー陰性の範囲に入る。
　ＴＨＧ－１３症例は、１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である１．０３ｎＭ以上であるので、アナフィラキシー発症の可能性は少ない。また、１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である８９６０．１０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも顕著に低いので、アナフィラキシー発症の可能性が低いことが推測できる。この小児は、現在アレルギー症状は出ているがアナフィラキシーの発症既往歴は無く、ＯＶＭ抗体価自体が非常に低く、アレルギー症状の軽快傾向が観察されることから、経過観察中である。
（鶏卵アナフィラキシー発症群）
　アナフィラキシーを発症した１０歳の小児についての検討である。ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値（ＯＶＭ ｓＩｇＥ ＩＣ５０（ｎＭ））は、０．２６ｎＭであって、前記１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である１．０３ｎＭよりも低い値であり、アナフィラキシー発症の状況と一致した。また、ＤＣＰ法により測定されたＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に、１／ＩＣ５０の値を乗じた値は、８１１７４．３４（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）であって、前記１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値である８９６０．１０（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）よりも、顕著に高い数値であり、実際にアナフィラキシーを発症している状況と一致した。
　したがって、この１０歳の小児においても、前記１～６歳におけるＯＶＭ特異的ＩｇＥのＩＣ５０値のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値、及び、前記１～６歳におけるＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０のアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値を用いた判断を適用することができることが確認できた。
（まとめ）
　ＩｇＥ抗体の抗体価とアレルゲンに対するＩｇＥ抗体のアビディティとに基づき算出されたＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値によって、乳幼児・小児のアナフィラキシーの発症リスクを予測することをできることが確認された。また、１～６歳児のデータをもとに算出したＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０をパラメーターとするアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値や、ＩｇＥ ＩＣ５０をパラメーターとするアナフィラキシーの有無についてのカットオフ値の、いずれか又は併用して、８～１５歳の小児に適用可能であることを確認した。なお、本発明によると、アナフィラキシーをいまだ発症していない乳幼児・小児についても、例えば、ＯＶＭ特異的ＩｇＥ価に１／ＩＣ５０の値を乗じた［ＯＶＭ ｓＩｇＥ／ＯＶＭｓ ＩｇＥ ＩＣ５０［（ＢＵｅ／ｍＬ）／（ｎＭ）］］、又は、ＩｇＥ　ＩＣ５０（ｎＭ）におけるアナフィラキシー発症の有無についてのカットオフ値を超えていることが明らかになった場合は、医師等による食事に関する指導などを受けることができるという点で、優れているといえる。
 

Claims (8)

  1. 食物アレルギーを有する乳幼児・小児から採取した試料中の、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値を判断基準として、前記乳幼児・小児のアナフィラキシーの発症リスクを予測するためのデータを収集する方法。
  2. ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値が、アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の抗体価に、ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティを乗じた数値に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値であることを特徴とする、請求項１記載のデータを収集する方法。
  3. ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティが、１／ＩＣ５０として数値化されることを特徴とする、請求項２記載のデータを収集する方法。
  4. ＩＣ５０が、競合的結合阻害活性値であることを特徴とする、請求項３記載のデータを収集する方法。
  5. ＩｇＥ抗体のアレルゲンに対するアビディティに基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値が、ＩｇＥ抗体のＩＣ５０に基づくＲＯＣ解析により決定されたカットオフ値であることを特徴とする、請求項１記載のデータを収集する方法。
  6. ＩＣ５０が、競合的結合阻害活性値であることを特徴とする、請求項５記載のデータを収集する方法。
  7. アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の抗体価を、ＤＣＰチップを用いて測定することを特徴とする請求項２～６のいずれか記載のデータを収集する方法。
  8. 試料が血漿又は血清であることを特徴とする請求項１～７のいずれか記載のデータを収集する方法。
     
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