WO2021080331A1

WO2021080331A1 - 면역억제제를 포함하는 줄기세포의 치료효과 증진용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 치료효과 증진방법

Info

Publication number: WO2021080331A1
Application number: PCT/KR2020/014439
Authority: WO
Inventors: 나덕렬; 장종욱; 이나경; 황정원; 명수현; 이나희; 김형섭
Original assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation
Current assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2021-04-29
Anticipated expiration: 2022-04-25
Also published as: US12551493B2; CN114599359A; US20220370478A1

Abstract

본 발명은 면역억제제를 포함하는 줄기세포 생존율 증진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)를 투여한 마우스에 면역반응이 발생함을 확인하고, 이에 면역억제제를 병용 투여하여 면역 반응의 감소 및 줄기세포 생존율이 증진되는 등 줄기세포의 치료 효과가 현저히 향상되는 것을 실험적으로 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의하면 면역억제제를 포함하는 조성물을 이용하여 줄기세포의 생존율을 현저히 증진시킬 수 있으며, 이를 기반으로 줄기세포의 치료효과를 향상시킬 수 있고, 상기 조성물은 이종세포 투여로 인한 면역반응을 극복하여 정확하게 세포의 안정성 및 효능을 검증할 수 있어, 줄기세포의 치료 효과를 극대화시키는 중간엽 줄기세포 치료제로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

면역억제제를 포함하는 줄기세포의 치료효과 증진용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 치료효과 증진방법

본 발명은 면역억제제를 포함하는 줄기세포 생존율 증진용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 치료효과 증진방법에 관한 것이다.

줄기세포 (stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 이러한 줄기세포는 분화능력에 따라 만능 줄기세포 (totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell) 및 다분화능 줄기세포 (multipotent stem cell)로 분류할 수 있으며, 상기 다분화능 줄기세포는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다.

중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질 (stroma) 등에 존재하는 줄기세포로 여러 단백질을 외부에 분비하여 (paracrine effect) 미세환경 개선 효과가 가능한 것으로 알려져 있으며 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역 반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수 등으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양하여 다양한 질환의 치료제로 개발하고자 하는 노력이 꾸준히 이어져오고 있다.

특히, 중간엽 줄기세포는 다른 줄기세포와는 달리 면역 거부반응이 거의 없다는 연구가 활발히 진행 되고 있었으나, 최근 중간엽 줄기세포의 면역원성에 대한 연구가 발표된 바 있어, 중간엽 줄기세포의 면역 반응을 감소시키고 생존율을 높일 수 있는 치료 효과를 향상시킬 수 있는 방법이 필요하다.

중간엽 줄기세포와 면역억제제를 병용하여 면역 억제효과를 나타내는 연구는 시도 되었으나 (Transplant Immunology 37 (2016) 1-9), 면역억제제를 포함하는 줄기세포 생존율 증진용 조성물에 대한 연구는 부족한 실정이다.

본 발명자들은 줄기세포의 면역반응을 감소시키고 생존율을 높일 수 있는 치료효과 향상 방법에 대해 예의 연구한 결과, 종래 면역억제제로 알려져 있는 타크로리무스 (Tacrolimus) 또는 덱사메타손 (Dexamethasone)을 처리하였을 때 줄기세포의 생존율이 증진되는 것을 발견함으로써 줄기세포의 치료 효과가 현저히 향상됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은 면역억제제를 포함하는 줄기세포의 생존율 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 줄기세포의 생존율 증진용 조성물을 포함하는 줄기세포 치료 보조제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 면역억제제를 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응을 감소시키는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역억제제를 포함하는, 줄기세포의 생존율 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 면역억제제는 타크로리무스 (Tacrolimus) 또는 덱사메타손 (Dexamethasone)인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예로서 상기 타크로리무스 (Tacrolimus)는 1 내지 10 mg/kg 농도로 복강 투여하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 덱사메타손 (Dexamethasone)은 0.5 내지 3mg/kg 농도로 경구 투여하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 조성물은 상기 줄기세포로 인한 면역반응을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 줄기세포의 생존율 증진용 조성물을 포함하는 줄기세포 치료 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 면역억제제를 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 면역억제제는 타크로리무스 (Tacrolimus) 또는 덱사메타손 (Dexamethasone)인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 타크로리무스 (Tacrolimus)는 1 내지 10 mg/kg 농도로 복강 투여하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 덱사메타손 (Dexamethasone)은 0.5 내지 3mg/kg 농도로 경구 투여하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 면역억제제는 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여 또는 피하 투여 되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 줄기세포 생존율 증진 용도를 제공한다.

본 발명자들은 인간 중간엽 줄기세포 (hMSC)를 투여한 마우스에 면역반응이 발생함을 확인하고, 이에 면역억제제를 처리하여 면역 반응의 감소 및 줄기세포 생존율이 증진되는 등 줄기세포의 치료 효과가 현저히 향상되는 것을 실험적으로 확인하였다.

따라서, 본 발명에 의하면 면역억제제를 포함하는 조성물을 이용하여 줄기세포의 생존율을 현저히 증진시킬 수 있으며, 이를 기반으로 줄기세포의 치료효과를 향상시킬 수 있고, 상기 조성물은 이종세포 투여로 인한 면역반응을 극복하여 정확하게 세포의 안정성 및 효능을 검증할 수 있어, 줄기세포의 치료 효과를 극대화시키는 중간엽 줄기세포 치료제로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 면역학적 염색 (IHC)을 통해 hMSC를 정상 마우스 뇌실질에 투여하였을 때, 면역 세포 침윤이 발생하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 2a는 Hematoxylin & Eosin (H&E) 조직염색을 통해 mouse MSC 및 hMSC를 정상 마우스 뇌실질에 투여하여 면역반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 2b는 면역학적 염색을 통해 Mouse MSC 및 hMSC를 정상 마우스 뇌실질에 투여하여 면역반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 hMSC 이식과 함께 병용한 면역억제제를 투여 실험 조건을 나타낸 것이다.

도 4a는 면역학적 염색 (IHC)을 통해 CD45 leukocyte의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 4b는 면역학적 염색 (IHC)을 통해 leukocyte의 많은 비율을 차지하고 있는 neutrophil의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5a는 면역학적 염색 (IHC)을 통해 Iba-1 microglia의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5b는 면역학적 염색 (IHC)을 통해 CD68 macrophage의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 면역학적 염색 (IHC)을 통해 면역억제제 투여로 인한 T세포의 분포 변화를 확인한 것으로, CD4 및 CD8α T 세포의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 qPCR을 통해 면역억제제 투여로 hMSC의 생존율이 증진됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 8a는 면역학적 염색 (IHC)을 통해 면역 결핍 누드 마우스에 hMSC를 투여 하였을 시 CD45 leukocyte의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 8b는 면역학적 염색 (IHC)을 통해 면역 결핍 누드 마우스에 hMSC를 투여 하였을 시 leukocyte의 많은 비율을 차지하고 있는 neutrophil의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 9a는 면역학적 염색 (IHC)을 통해 면역 결핍 누드 마우스에 hMSC를 투여 하였을 시 Iba-1 microglia의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 9b는 면역학적 염색 (IHC)을 통해 면역 결핍 누드 마우스에 hMSC를 투여 하였을 시 CD68 macrophage의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 면역학적 염색 (IHC)을 통해 면역 결핍 누드 마우스에 hMSC를 투여 하였을 시 T세포의 분포 변화를 확인한 것으로, CD4 그리고 CD8α T 세포의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 qPCR을 통해 면역 결핍 누드 마우스에 hMSC를 투여 하였을 시 hMSC의 생존율이 증진됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 인간 중간엽 줄기세포 (hMSC)를 투여한 마우스에 면역반응이 발생함을 확인하고, 이에 면역억제제를 처리하여 면역 반응의 감소 및 줄기세포 생존율이 증진되는 등 줄기세포의 치료 효과가 현저히 향상되는 것을 실험적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은, 면역억제제를 포함하는 줄기세포의 생존율 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 '면역억제제'란 체내 면역체계 활성을 줄이거나 억제하는 약으로서, 스테로이드제, 세포증식억제제, 항체제제, 이뮤노필린 작용 약물, 미코페놀레이트, 종양괴사인자 (TNF-α) 저해제 등을 통칭하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 면역억제제의 종류는 제한이 없으나, 구체적으로 칼시뉴린 (Calcineurine) 억제제 또는 스테로이드계 면역억제제인 것이 바람직하며, 보다 구체적으로 타크로리무스 (Tacrolimus) 또는 덱사메타손 (Dexamethasone)인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 타크로리무스 (Tacrolimus)의 투여용량은 제한이 없으나, 바람직하게는 1~10mg/kg 농도로 복강 투여 하는 것이 포함되며, 더욱 바람직하게는 3mg/kg 농도로 복강 투여하는 것이 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 덱사메타손 (Dexamethasone)의 투여용량은 제한이 없으나, 바람직하게는 0.5~3mg/kg 농도로 경구 투여 하는 것이 포함되며, 더욱 바람직하게는 1mg/kg 농도로 경구 투여하는 것이 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포 생존율 증진용 조성물은 줄기세포로 인한 면역반응을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 면역억제제 처리에 따른 줄기세포의 면역반응 감소 효과 및 줄기세포의 생존율 증진을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 정상마우스에 줄기세포 및 면역억제제를 투여 한 후 심장관류 (cardiac perfusion)를 수행하여 뇌를 적출하고 조직학적 염색을 통해 분석한 결과, 줄기세포 단독 투여군에 비해 면역억제제를 투여한 군에서 면역반응이 감소되는 것을 확인하였으며, hMSC를 단독 투여한 그룹에 비해 면역억제제를 투여한 그룹에서 CD45 면역세포 침윤이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 정상마우스에 줄기세포 및 면역억제제를 투여 한 후 심장관류 (cardiac perfusion)를 수행하여 뇌를 적출하고 qPCR을 통해 분석한 결과, 줄기세포 단독 투여군에 비해 면역억제제를 투여한 군에서 줄기세포 잔존율이 높게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

상기 결과들은 면역억제제 투여를 통해 인간 중간엽 줄기세포의 효과적인 면역 반응 감소 및 생존율을 증진시킬 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명에서 '줄기세포'란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell; iPSC) 또는 성체 줄기세포일 수 있고, 바람 직하게는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 '줄기세포 치료 보조제'란 당업계에서 일반적으로 사용되는 줄기세포 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제재를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 줄기세포 치료제의 줄기세포의 면역반응 감소 및 생존율 증진을 촉진하여 치료제의 효과를 향상시킬 수 있다.

상기 면역억제제를 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 면역억제제를 포함하는, 줄기세포의 생존율 증진 용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 마우스 뇌실질에 이종 hMSC 투여 후 면역 반응 확인

정상 마우스 뇌실질에 MEM (세포배양 배지) 또는 hMSC를 투여한 다음 일주일 후 sacrifice를 진행하였다. MEM을 세포 대신 투여하여 control 그룹으로 지정하고, 적출한 마우스의 뇌는 paraformalaldehyde (PFA)에 고정한 다음 절편 제작하여 조직학적 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 MEM 투여 군에서는 대부분 비특이적인 염색이 발견되었고, 백혈구 (leuokocyte; CD45 항체) 면역세포의 침윤이 거의 발견되지 않았으나 hMSC 투여군에서는 면역학적 염색 (immunohistochemistry, IHC)을 통해 투여 위치에 면역세포 침윤이 매우 높은 것을 확인하였다. hMSC 투여 위치에서 생착된 hMSC를 mitochondria 마커로 발견하였지만 면역세포의 수보다 현저히 적은 것을 확인하였다.

실시예 2. 마우스 뇌실질에 동계 mouse MSC 투여 후 면역 반응 확인

면역반응이 인간유래 즉 이종 세포를 마우스에 투여하였을 때만 유의적으로 발생하는 현상인지 확인하기 위해, 동계 (syngeneic) 마우스 (C57BL/6)의 줄기세포를 다른 C57BL/6 마우스에 실시예 1과 동일한 방법으로 투여하고 확인하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 Hematoxylin & Eosin(H&E) 조직염색을 통해 Mouse MSC를 투여한 군에서는 줄기세포가 MSC 특유의 섬유아세포 (fibroblast)의 형태로 성공적으로 생착된 것을 확인하였고, 도 2b에 나타낸 바와 같이, mouse MSC 투여위치 및 hMSC 투여위치에서 조직학적 염색을 수행한 결과, mouse MSC를 투여한 위치에서는 비특이적인 염색을 발견하였고 hMSC를 투여한 위치에서는 CD45를 발현하는 면역세포의 밀집이 증가된 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 동계 MSC보다 이종 MSC를 투여하였을 때 면역반응이 증가된다는 것을 확인하였고 MSC가 면역회피능이 아닌 면역원성을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 3. 면역억제제 병용 투여를 통한 중간엽 줄기세포 면역반응 감소 확인

정상 마우스 (C57B/L6)를 MEM 단독 투여 군, hMSC 단독 투여군, 덱사메타손 투여군, 타크로리무스 투여군, 덱사메타손 및 타크로리무스 병용투여군 총 5개의 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이 총 2x10⁵의 hMSC를 5μL의 MEM배지에 풀어서 좌표 A/P 0.5mm, M/L-1.7mm, D/V-3.3mm으로 1μL/min의 투여속도로 정상 마우스 뇌실질에 투여하였다. 덱사메타손은 1mg/kg의 용량으로 세포 투여 전날과 당일에 경구투여 하였고, 타크로리무스는 3mg/kg의 용량으로 세포 투여 전날부터 세포 투여 후 9일째까지 매일 복강투여 하였다. MEM 또는 hMSC 투여 7일 후 심장관류 (cardiac perfusion)를 수행하여 뇌를 적출한 다음 PFA로 고정시키고 조직 절편하여 조직학적 염색을 진행하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 hMSC를 단독 투여한 그룹에 비해 면역억제제를 투여한 모든 그룹에서 CD45 면역세포 침윤이 감소된 것을 IHC를 통해 확인하였다. 차이 또한 모든 그룹에서 hMSC 그룹에 비해 통계적으로 유의하였다. 백혈구의 여러 종류 중 호중구 (neutrophil) 세포가 제일 많은 비율 (40-75%)을 차지한다고 알려져 있다. CD45의 결과를 다시 한번 확인하기 위해 neutrophil을 염색 할 수 있는 항체를 이용하여 IHC를 진행하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, hMSC를 단독 투여한 그룹에 비해 면역억제제를 투여한 모든 그룹에서 호중구 면역세포의 침윤이 감소된 것을 IHC를 통해 확인한 결과, CD45와 동일한 발현 패턴이 관찰되었다.

이에 더하여, 면역세포 (CD45, neutrophil) 외 염증 세포의 발현 차이를 확인하고자 IHC를 추가로 진행하였다. 염증 세포의 대표적인 마커인 미세아교세포 (microglia)를 타겟하는 Iba-1 항체와 대식세포 (macrophage)를 타겟하는 CD68 항체를 사용하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 Iba-1는 CD45와 달리 투여한 세포가 응집 된 위치 보다 그 주변 조직에서 강하게 발현하는 것을 모든 그룹에서 관찰하였다. hMSC 그룹에 비해 Iba-1의 발현이 높았다. 하지만 덱사메타손 단독 투여군 외에, 타크로리무스 단독 투여군, 덱사메타손 및 타크로리무스 병용 투여군은 hMSC 그룹에 비해 차이가 통계적으로 유의미하지 않았다. CD68은 CD45, neutrophil, 및 Iba-1의 발현에 비해 전반적으로 발현이 매우 낮게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, hMSC 그룹에 비해 면역억제제를 투여한 모든 그룹의 CD68 발현 차이가 통계적으로 유의미 하지 않았다.

나아가, 면역억제제 투여로 인해 T 세포의 발현 차이가 어떻게 변하는지 확인하고자 도움 T 세포 (CD4) 및 세포 독성 T 세포 (CD8α)를 타겟 할 수 있는 항체들을 이용하여 IHC를 수행하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 전반적으로 모든 그룹에서 CD4 및 CD8α의 발현이 매우 낮았다. hMSC 그룹에 비해 덱사메타손 및 타크로리무스 단독 투여 군에서 CD4의 발현이 감소되는 것을 확인 하였다. 그 차이 또한 통계적으로 유의하였다. 면역억제제를 투여한 모든 그룹에서 hMSC 그룹에 비해 CD8α 발현 차이가 관찰되지 않았다.

실시예 4. 면역억제제 병용 투여를 통한 중간엽 줄기세포 생존율 증진 확인

인간 유래 중간엽 줄기세포 (hMSC)의 잔존량을 정량하기 위해, 실시예3과 동일한 조건으로 실험을 수행한 다음 적출한 마우스의 뇌에서 genomic DNA를 분리하여 인간 특이적으로 ALU DNA 서열에 결합할 수 있는 프라이머를 제작하고 qPCR (quantitative real time PCR)을 진행하였다. 또한 추가 실험을 진행하여 MEM 또는 hMSC 투여 7일 후 심장관류 (cardiac perfusion)를 수행하여 뇌를 적출한 다음 PFA로 고정시키고 조직을 절편하여 조직학적 염색을 진행하였다. 인간 유래 세포를 특이적으로 염색 할 수 있는 STEM121 항체를 이용하여 IHC도 진행 하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 hMSC 단독 투여군에 비해 면역억제제를 병용 투여한 경우 줄기세포의 잔존율이 높은 것을 확인하였다. 줄기세포의 잔존율은 덱사메타손 및 타크로리무스 병용투여군에서 가장 높게 나타났고, 그 다음으로 덱사메타손 단독투여군에서 높게 확인되었다. IHC를 통해서 동일한 결과를 STEM121 마커를 이용하여 확인하였다.

실시예 5. (개념 증명) 면역 결핍 마우스에서 중간엽 줄기세포 면역반응 감소 확인

본 연구의 개념을 증명 (Proof of concept) 하기 위해 면역 결핍 마우스를 이용한 추가 실험을 수행하였다. 정상 C57BL/6 그리고 면역 결핍 BALB/c 누드 마우스에서 실시예 3과 동일한 조건으로 MEM 혹은 hMSC를 투여하였다. 실시예 3과 달리 면역억제제를 병용 투여 하지 않았다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 hMSC를 투여 한 위치에서 정상 마우스 (C57BL/6)에 비해 면역 결핍 (BALB/c 누드) 마우스의 CD45 (도 8a) 및 Neutrophil (도 8b)의 발현이 감소 되는 것을 확인하였다. 이것은 정상 마우스에 면역억제제를 hMSC와 병용 투여 한 후 면역세포의 분포와 동일한 결과임을 확인하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이 정상 마우스에 비해 누드 마우스의 Iba-1 및 CD68 발현 차이가 통계적으로 유의미하지 않았다.

도 10에 나타낸 바와 같이 정상 마우스에 비해 누드 마우스의 CD4 T 세포의 발현이 급격히 감소 하는 것을 확인하였다. 정상 마우스에 비해 누드 마우스의 CD8α T 세포의 발현이 감소 하는 것 같았으나 그 차이가 통계적으로 유의미 하지 않았다.

실시예 6. (개념 증명) 면역 결핍 마우스에서 중간엽 줄기세포 생존율 증진 확인

인간 유래 중간엽 줄기세포 (hMSC)의 잔존량을 정량하기 위해, 실시예 3과 동일한 조건으로 실험을 수행한 다음 적출한 마우스의 뇌에서 genomic DNA를 분리하여 인간 특이적으로 ALU DNA 서열에 결합할 수 있는 프라이머를 제작하고 qPCR (quantitative real time PCR)을 진행하였다. 인간 유래 세포를 특이적으로 염색 할 수 있는 STEM121 항체를 이용하여 IHC도 진행하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 정상 마우스에 비해 정상 마우스에 비해 면역 결핍 누드 마우스에서 줄기세포의 잔존율이 높은 것을 확인하였다. IHC에서도 정상 마우스에 비해 면역 결핍 누드 마우스에서 STEM121의 발현이 높은 것을 관찰하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명에 따른 면역억제제를 포함하는 조성물은 줄기세포의 생존율을 현저히 증진시킬 수 있으며, 이종세포 투여로 인한 면역반응을 극복하여, 줄기세포의 치료 효과를 극대화시키는 중간엽 줄기세포 치료제로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Claims

면역억제제를 포함하는, 줄기세포의 생존율 증진용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 면역억제제는 타크로리무스(Tacrolimus) 또는 덱사메타손(Dexamethasone)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진용 조성물.
제2항에 있어서,

상기 타크로리무스(Tacrolimus)는 1 내지 10mg/kg 농도로 복강 투여하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진용 조성물.
제2항에 있어서,

상기 덱사메타손은 0.5 내지 3mg/kg 농도로 경구 투여하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물은 상기 줄기세포로 인한 면역반응을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진용 조성물.
제6항에 있어서,

상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 줄기세포 치료 보조제.
면역억제제를 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응을 감소시키는 방법.
제9항에 있어서,

상기 면역억제제는 타크로리무스(Tacrolimus) 또는 덱사메타손(Dexamethasone)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응을 감소시키는 방법.
제10항에 있어서,

상기 타크로리무스(Tacrolimus)는 1 내지 10mg/kg 농도로 복강 투여하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응을 감소시키는 방법.
제10항에 있어서,

상기 덱사메타손(Dexamethasone)은 0.5 내지 3mg/kg 농도로 경구 투여하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응을 감소시키는 방법.
제9항에 있어서,

상기 면역억제제는 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여 또는 피하 투여 되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응을 감소시키는 방법.
면역억제제를 포함하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응 감소 용도.
제14항에 있어서,

상기 면역억제제는 타크로리무스(Tacrolimus) 또는 덱사메타손(Dexamethasone)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증진 및 면역반응 감소 용도.