WO2021060933A1 - Mmagnu2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Mmagnu2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, improving, or treating a disease infectious diseases such as Mycobacterium tuberculosis , nontuberculous mycobacteria (NTM) or Gram-positive bacteria containing the MMAGNU2 compound as an active ingredient.
  • a disease infectious diseases such as Mycobacterium tuberculosis , nontuberculous mycobacteria (NTM) or Gram-positive bacteria containing the MMAGNU2 compound as an active ingredient.
  • Mycobacterium tuberculosis develops after an incubation period for a certain period of time after infection, or develops acutely without an incubation period, causing complications with lung inflammation and asthma, causing the infected person to die.
  • simple carriers of Mycobacterium tuberculosis there are no subjective symptoms, so tuberculosis can be easily transmitted to other people, so there is a great difficulty in preventing and treating tuberculosis.
  • chemotherapy antagonistituberculosis drugs
  • tuberculosis drugs is a treatment method for tuberculosis.
  • the primary anti-tuberculosis drug for initial TB treatment is a combination therapy (isoniazid, rifampin, pyrazinamide, and ethambutol), which is a very effective TB treatment method with a cure rate of about 85%, but requires continuous administration for at least 6 months.
  • it causes considerable side effects, is expensive, and has a problem that the efficacy is uncertain for multidrug-resistant tuberculosis.
  • Non-tuberculosis mycobacteria have been known as non-pathogenic bacteria commonly present in the natural environment. However, as it was identified as an opportunistic infection in patients with acquired immunodeficiency syndrome, its importance began to emerge, and recently, it has been known that it can cause infection in patients with normal immune function. According to a national survey, non-tuberculosis mycobacterial disease has been continuously increasing since the 1990s. Tuberculosis and non-tuberculosis commonly show symptoms such as fatigue, cough, phlegm, and chest pain, which are not specific symptoms that can only be seen in patients with tuberculosis and non-tuberculosis.
  • non-tuberculosis mycobacteria show high resistance to existing anti-tuberculosis agents, they must be treated with long-term drug combination therapy. Therefore, there is a need for an effective therapeutic agent for non-tuberculosis mycobacterial infection, which is constantly increasing.
  • Gram-positive bacteria cause pneumonia, meningitis, and respiratory and skin diseases, and their risk is increasing day by day due to resistance to various antibiotics.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis or Gram-positive bacteria infection disease containing MMAGNU2 compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating infectious diseases of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis or Gram-positive bacteria containing MMAGNU2 compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of Mycobacterium tuberculosis , nontuberculous mycobacteria (NTM) or Gram-positive bacteria infection disease containing MMAGNU2 compound as an active ingredient, and in detail, Mycobacterium tuberculosis Therium tuberculosis ( Mycobacterium tuberculosis ) H37Rv and non-proliferative M.
  • tuberculosis SS18b strains were effectively inhibited in vitro, and the non-tuberculosis mycobacterium abscessus bacteria By confirming that it inhibits in vitro and zebrafish in vivo, it can be used in pharmaceutical compositions and health functional foods useful for the prevention, improvement and treatment of Mycobacterium tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infection. .
  • Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus , Micrococcus luteus and Enterococcus pecalis faecalis can be effectively inhibited and used as an effective treatment for infection of Gram-positive bacteria.
  • Figure 3 shows the results of the activity of MMAGNU2 against Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain (A) and non-proliferative M. tuberculosis SS18b strain (B).
  • FIG. 4 shows the survival results of non-infected zebrafish treated with MMAGNU2, rifapentine (RFT), and rifabutin (RFB) at various doses.
  • FIG. 5 shows the survival results of infected zebrafish treated with MMAGNU2, rifapentine (RFT), rifabutin (RFB) and clarithromycin (CLA).
  • FIG. 6 is a distribution diagram of MAB- GFP in captured zebrafish after treatment with MMAGNU2, rifapentine (RFT), rifabutin (RFB), rifampicin (RFP), and clarithromycin (CLA). Show the results.
  • Figure 8 shows the results of killing the drug of Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria after treatment.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a Mycobacterium tuberculosis, an Mycobacterium tuberculosis, or a Gram-positive bacterial infection disease containing a compound represented by the following Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the non-tuberculosis mycobacterium may be Mycobacterium abscessus , but is not limited thereto.
  • the Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium tuberculosis infection includes all clinical symptoms manifested by infection with Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium tuberculosis, specifically Tuberculosis, lung disease, lymphadenitis, skin, soft tissue, osteoinfection or It may be a disseminated disease, but is not limited thereto.
  • the Gram-positive bacterial infection disease may be pneumonia, meningitis, respiratory disease, or skin disease, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutically acceptable salts are hydrochloride, bromate, sulfate, phosphate, nitrate, citrate, acetate, lactate, tartrate, maleate, gluconate, succinate, formate, trifluoro.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition
  • the pharmaceutical composition may be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant may be an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, and a coating agent. Solubilizing agents such as, expanding agents, lubricants, lubricants or flavoring agents may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be preferably formulated as a pharmaceutical composition, including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient for administration.
  • Acceptable pharmaceutical carriers for compositions formulated as liquid solutions are sterilized and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added as necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to prepare injection formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
  • the pharmaceutical formulation form of the pharmaceutical composition of the present invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions, and sustained-release formulations of active compounds.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is in a conventional manner through intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes. It can be administered as.
  • the effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means an amount required for prevention or treatment of a disease.
  • the type of disease, the severity of the disease, the type and content of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the patient's age, weight, general health condition, sex and diet, administration time, administration route and composition It can be adjusted according to various factors, including the rate of secretion, duration of treatment, and drugs used concurrently.
  • the composition of the present invention when administered once to several times a day, is administered once to several times a day, and in the case of a compound, the composition may be administered at a dose of 0.1 ng/kg to 10 g/kg. I can.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or ameliorating infectious diseases of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis or Gram-positive bacteria containing a compound represented by the following Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the non-tuberculosis mycobacterium may be Mycobacterium abscessus , but is not limited thereto.
  • the Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium tuberculosis infection includes all clinical symptoms manifested by infection with Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium tuberculosis, specifically Tuberculosis, lung disease, lymphadenitis, skin, soft tissue, osteoinfection or It may be a disseminated disease, but is not limited thereto.
  • the Gram-positive bacterial infection disease may be pneumonia, meningitis, respiratory disease, or skin disease, but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention is a health functional food composition
  • the health functional food composition may be provided in the form of a powder, granule, tablet, capsule, syrup or beverage, and the health functional food composition is a food or food additive other than the active ingredient. It is used together with, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use, for example, prevention, health or therapeutic treatment.
  • the effective dose of the active ingredient contained in the health functional food composition may be used in accordance with the effective dose of the pharmaceutical composition, but in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, it should be less than the above range. It is clear that the active ingredient can be used in an amount beyond the above range because there is no problem in terms of safety.
  • M. abscessus CIP 104536 T S and R-type strains were provided by Laurent Kremer (CNRS, IRIM, Universite' de adjoin, adjoin, France).
  • M. abscessus subsp . bolletii CIP108541 and M. abscessus subsp . massiliense CIP108297 was obtained from Collection de l'Institut Pasteur.
  • the M. abscessus strain which was made to have a bacterial lux operon using pMV306hsp+LuxG13 (Addgene #26161), was constructed as previously reported (Gupta et al., 2017).
  • tuberculosis strains are Middlebrook 7H9 broth with 10% albumin-dextrose-catalase (ADC) and Middlebrook 7H10 with 10% oleic acid-ADC (OADC). Incubated on plates at 37°C. Reagents were purchased from Sigma-Aldrich. Gram-negative and positive bacteria [ Staphylococcus aureus (strain 5185), Enterococcus faecalis (strain 5198), Micrococcus luteus (strain 5506), Escherichia coli (strain 5171), Bacillus subtilis (strain 2774), Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae (strain 4235), Salmonella ser . Typhi (strain 5559)] was purchased from the Gyeongsang National University Pathogen Resource Bank, and was cultured and tested in Luria-Bertani (LB) medium.
  • LB Luria-Bertani
  • MICs of the compounds were measured using the resazurin microtiter assay (REMA). Briefly, 100 ⁇ l Mueller-Hinton medium (MH), 7H9 and LB liquid medium were each added to each well of a 96-well microtiter plate, and antibiotics diluted 2 times serially were added directly to each well. The plate was covered and incubated at 37° C. for 3 days. Resazurin (0.01% [wt/vol]) was added to each well and the plates were rearranged overnight. Fluorescence was measured using a SpectraMax ® M3 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices, CA, USA) (ex. 560/em. 590 nm). MIC values were calculated using Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).
  • CIP 104536 T in rough and smooth form was incubated at 30° C. in Middlebrook 7H9 broth containing albumin dextrose saline (ADS) concentrate and 0.05% Tween 80.
  • Mab The expressed green fluorescence was maintained in the logarithmic phase, washed by centrifugation, and then dispensed into 5 ⁇ l to prepare a frozen stock to be stored at -80°C. Before injection, the number of CFU in the inoculum was checked through serial dilution. For infection, the bacterial inoculum was diluted with PBST containing 0.05% Tween 80, and resuspended with 0.085% Phenol red to obtain 20 CFU/nl.
  • Nanoject III microinjector (Drummond Scientific) 3 nl containing 400 CFU was injected via tail vein injection of zebrafish embryos in early developmental stages (above 1,024-cellstage). After injection, the embryos were placed in a 96 well plate containing blue fish water (fish water containing 1 g/liter of methylene blue), two per well.
  • MMAGNU2 at a concentration of 25 ⁇ M, rifampicin, rifapentine, and rifabutin were directly added to water containing embryos, and untreated embryos were used as negative controls. In addition, embryos treated with clarithromycin were used as a positive control. The water to which the compound was added was replaced once a day. Drug efficacy for each concentration was determined through bacterial burden, GFP quantification and embryo survival kinetics. To create a survival curve, dead embryos (no heartbeat) were recorded daily for 13 days.
  • MMAGNU2 shown in FIG . 1 exhibits the growth inhibitory effect of Mab
  • the present inventors performed a drug sensitivity test with Mab CIP 104536 T R-type strain in 7H9 broth medium.
  • the growth inhibitory activity of MMAGNU2 was compared with rifapentine (RFT), rifabutin (RFB), rifampicin (RFP), and clarithromycin (CLA).
  • RFT rifapentine
  • RBP rifabutin
  • RFP rifampicin
  • CLA clarithromycin
  • MMAGNU2 significantly reduced resazurin fluorescence in a concentration-dependent manner.
  • MMAGNU2 showed much stronger activity than rifopentin and rifampicin, but not rifabutin and clarithromycin.
  • MMAGNU2 is a Mab conjugate in 7H9 medium Mab subsp . bolletii CIP108541, Mab subsp . For massiliense CIP108297 and Mab CIP 104536 T S, MIC 90 as low as 4.0-6.2 ⁇ M (Refers to the minimum inhibitory concentration of 90% bacterial growth.) showed a strong inhibitory activity. These results support that MMAGNU2 is an effective compound against all phylogenetic close Mab subspecies. In addition, MMAGNU2 also showed activity against Mycobacterium tuberculosis H37Rv and non-proliferative M. tuberculosis SS18b strains (FIG. 3 ).
  • Example 2 Mab CIP 104536 T R-type infected In zebrafish In vivo effect
  • the maximum tolerated dose was measured using various concentrations of MMAGNU2.
  • MMAGNU2 the maximum tolerated dose
  • FIG. 4 the zebrafish treated with MMAGNU2 did not show any reduction in survival until 7 days after treatment. However, it was found that 60-74% of zebrafish were significantly killed at all doses used on day 8. Moreover, 100% of zebrafish died on the 9th day after MMAGNU2 treatment. In addition, these survival curves were repeated for two different rifamycin derivatives such as rifabutin and rifampicin.
  • the present inventors injected Mab of 400 CFU into zebrafish, and treated with 25 ⁇ M of MMAGNU2, rifabutin, rifampicin and clarithromycin, respectively, and the survival rate was measured.
  • the non-Mab -infected zebrafish survived until the 13th day.
  • all Mab -infected zebrafish without MMAGNU2 treatment died on the 13th day.
  • it was found that the lifespan of zebrafish treated with 25 ⁇ M MMAGNU2 was significantly extended. When 25 ⁇ M of MMAGNU2 was treated, about 54% of Mab -infected zebrafish could survive until the 13th day.
  • MMAGNU2 25 ⁇ M of MMAGNU2 is an effective compound.
  • rifabutin it showed a very similar survival profile to MMAGNU2 treatment.
  • Other rifamycin derivatives, rifampicin and rifopentin failed to treat Mab-infected zebrafish even at high concentrations (25 ⁇ M). It was confirmed that about 90% of Mab -infected zebrafish died on the 13th day from the day of infection. The positive control clarithromycin showed excellent survival rate. Up to 13 dpi at 25 ⁇ M clarithromycin, 65% of infected zebrafish were able to survive.
  • the present inventors observed the distribution of infected Mab in zebrafish under a fluorescence microscope.
  • the present inventors used Mab-GFP with pMV262-GFP.
  • Each rifamycin derivative was treated with 25 ⁇ M once daily until 5 dpi.
  • infected Mab- GFP was gradually distributed.
  • the size of GFP was enlarged in the zebrafish head and yolk.
  • MMAGNU2 was treated with Mab- GFP infected zebrafish, only a limited level of GFP expression could be observed at 5 dpi.
  • GFP expression inside zebrafish at 5 dpi showed a significant reduction in GFP compared to the untreated group, rifampicin treated with 25 ⁇ M, and rifopentin. Although, unlike in the untreated condition, rifabutin has the ability to limit the distribution of GFP in zebrafish, the reduction in the difference in GFP expression was not significantly different from that of MMAGNU2.
  • the GFP distribution was double-verified through CFU measurement, which was to confirm whether the viable bacterial load in the inside of Mab-infected zebrafish after compound treatment was reduced.
  • the zebrafish were homogenized, respectively, and CFU was measured. As shown in Fig. 7 , the untreated negative control showed a maximum viable bacterial load at 5 dpi. However, both MMAGNU2 and rifabutin showed excellent reduction in viable bacterial CFU at 25 ⁇ M concentration. This significant effect was comparable to that of 10 ⁇ M treatment with clarithromycin. In addition, rifampicin and rifopentin failed to reduce the bacterial load in Mab infected zebrafish.
  • MMAGNU2 is Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus (Strain 5185) and Micrococcus luteus (Strain 5506) and Enterococcus pecalis ( Enterococcus faecalis ) effectively killing ex vivo was confirmed through the REMA method.

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Abstract

본 발명은 MMAGNU2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria; NTM) 또는 그람 양성균 감염 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 상세하게는 결핵균인 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv 및 비-증식성 M. tuberculosis SS18b 균주를 시험관 내(in vitro)에서 효과적으로 억제시켰으며, 비결핵 항산균인 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus) 균을 시험관 내(in vitro) 및 제브라피쉬 생체 내(in vivo)에서 억제시킴을 확인하여, 결핵균 및 비결핵 항산균 감염 질환의 예방, 개선 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다. 또한, 생체 외 실험에서 그람 양성균인 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis)를 효과적으로 억제하여 그람 양성 세균의 감염에 효과적인 치료로 이용될 수 있다.

Description

MMAGNU2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 MMAGNU2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria; NTM) 또는 그람 양성균 감염 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
결핵균은 감염 후 일정 기간 동안 잠복기를 거친 후 발병되거나 또는 잠복기 없이 급성으로 발병하여 폐의 염증과 천식을 동반하는 합병증을 일으켜 감염자를 사망시킨다. 결핵균 단순 보균자의 경우, 자각증상이 없으므로 결핵을 타인에게 쉽게 전염시킬 수 있어 결핵의 예방 및 치료에 큰 어려움이 있는 실정이다. 현재 결핵에 대한 치료방법으로 화학요법(항결핵제)이 있다. 초기 결핵치료를 위한 1차 항결핵제는 약제의 병합요법(isoniazid, rifampin, pyrazinamide 및 ethambutol)으로 약 85% 정도의 결핵 치료율을 나타내는 매우 효과적인 결핵 치료 방법임에도 불구하고, 최소 6개월 이상 지속적인 투여가 필요하고, 상당한 부작용을 초래하며, 비용이 많이 들 뿐만 아니라 다약제 내성 결핵에 대해서는 효능이 불투명하다는 문제가 있다.
비결핵 항산균은 자연환경에 흔히 존재하는 비병원성 세균으로 알려져 왔다. 그러나, 후천성면역결핍증 환자에서 기회 감염균으로 확인되면서 그 중요성이 부각되기 시작하였고, 최근에는 면역기능이 정상인 환자에서도 감염을 일으킬 수 있음이 알려졌다. 전국적인 실태조사에 의하면 비결핵 항산균증은 1990년대 이후 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 결핵 및 비결핵은 공통적으로 피로감, 기침, 가래, 흉통 등의 증상을 보이는데, 이는 결핵 및 비결핵 환자에서만 볼 수 있는 특이한 증상이 아니다. 더욱이, 비결핵 항산균은 기존의 항 결핵제에 대하여 높은 내성을 보이기 때문에, 장기간 약제 병용요법으로 치료하여야 한다. 따라서, 지속적으로 증가 추세에 있는 비결핵 항산균 감염 질환에 대한 효과적인 치료제가 요구되고 있다. 또한, 그람 양성세균은 폐렴, 수막염, 그리고 호흡기 및 피부질환을 야기 시키며 다양한 항생제에 대한 내성으로 그 위험이 날로 커져가고 있다.
이에, 본 발명에서는 MMAGNU2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 MMAGNU2 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MMAGNU2 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 MMAGNU2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria; NTM) 또는 그람 양성균 감염 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 상세하게는 결핵균인 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv 및 비-증식성 M. tuberculosis SS18b 균주를 시험관 내(in vitro)에서 효과적으로 억제시켰으며, 비결핵 항산균인 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus) 균을 시험관 내(in vitro) 및 제브라피쉬 생체 내(in vivo)에서 억제시킴을 확인하여, 결핵균 및 비결핵 항산균 감염 질환의 예방, 개선 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다. 또한, 생체 외 실험에서 그람 양성균인 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis)를 효과적으로 억제하여 그람 양성 세균의 감염에 효과적인 치료로 이용될 수 있다.
도 1은 MMAGNU2의 화학구조식을 나타낸다.
도 2는 MMAGNU2의 시험관 내(in vitro) 활성 결과를 나타낸다.
도 3은 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv 균주(A) 및 비-증식성 M. tuberculosis SS18b 균주(B)에 대한 MMAGNU2의 활성 결과를 나타낸다.
도 4는 MMAGNU2, 리파펜틴(rifapentine; RFT), 리파부틴(rifabutin; RFB)을 다양한 용량으로 처리한 비-감염된 제브라피쉬의 생존 결과를 나타낸다.
도 5는 MMAGNU2, 리파펜틴(rifapentine; RFT), 리파부틴(rifabutin; RFB) 및 클래리트로마이신(clarithromycin; CLA)로 처리한 감염된 제브라피쉬의 생존 결과를 나타낸다.
도 6은 MMAGNU2, 리파펜틴(rifapentine; RFT), 리파부틴(rifabutin; RFB), 리팜피신(rifampicin; RFP) 및 클래리트로마이신(clarithromycin; CLA)로 처리한 후, 포획된 제브라피쉬 내 MAB-GFP 분포도 결과를 나타낸다.
도 7은 처리 후 박테리아 부하를 5dpi에서 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 처리 후 그람 양성세균과 그람 음성세균들의 약물에 대한 사멸 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020013128-appb-I000001
바람직하게는, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 결핵균 또는 비결핵 항산균 감염 질환은 결핵균 또는 비결핵항산균의 감염에 의해 나타나는 모든 임상적 증상을 포함하는 것으로, 구체적으로 결핵, 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 그람 양성균 감염 질환은 폐렴, 수막염, 호흡기 질환 또는 피부질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 질산염, 구연산염, 초산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 글루콘산염, 숙신산염, 포름산염, 트리플루오로아세트산염, 옥살산염, 푸마르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염, 캠퍼술폰산염, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 칼슘염 및 마그네슘염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 MMAGNU2로 명명하였다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020013128-appb-I000002
바람직하게는, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 결핵균 또는 비결핵 항산균 감염 질환은 결핵균 또는 비결핵항산균의 감염에 의해 나타나는 모든 임상적 증상을 포함하는 것으로, 구체적으로 결핵, 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 그람 양성균 감염 질환은 폐렴, 수막염, 호흡기 질환 또는 피부질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물이 건강기능식품 조성물인 경우, 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 균주 및 배양
M. abscessus CIP 104536T S 및 R-타입 균주는 Laurent Kremer (CNRS, IRIM, Universite´ de Montpellier, Montpellier, France)로부터 제공받았다. M. abscessus subsp . bolletii CIP108541 및 M. abscessus subsp . massiliense CIP108297는 Collection de l'Institut Pasteur로부터 얻었다. pMV306hsp+LuxG13 (Addgene #26161)을 사용하여 박테리아 lux 오페론을 갖도록 한 M. abscessus 균주는 이전에 보고된 대로 제작하였다(Gupta et al., 2017). M. abscessus 및 M. tuberculosis 균주는 10% 알부민-덱스트로스-카탈레이즈(albumin-dextrose-catalase; ADC)가 첨가된 Middlebrook 7H9 broth 및 10% 올레익산-ADC(oleic acid-ADC; OADC)가 첨가된 Middlebrook 7H10 plates에서 37℃로 배양하였다. 시약은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 그람 음성 및 양성세균들[Staphylococcus aureus (strain 5185), Enterococcus faecalis (strain 5198), Micrococcus luteus (strain 5506), Escherichia coli (strain 5171), Bacillus subtilis (strain 2774), Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae (strain 4235), Salmonella ser . Typhi (strain 5559)]은 경상대학교 병원체 자원은행에서 분양 받았으며, Luria-Bertani (LB) 배지에서 배양되고 테스트 되었다.
2. REMA를 이용한 MIC 측정
화합물들의 MICs는 resazurin microtiter assay (REMA)를 이용하여 측정하였다. 간단히 설명하면, 100 μl Mueller-Hinton medium (MH), 7H9 그리고 LB 액상배지를 각각 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가하였고, 2배 연속 희석한 항생제를 각 웰에 직접 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 레자주린(Resazurin; 0.01% [wt/vol])을 각 웰에 첨가하였고, 플레이트들을 밤새도록 재배양하였다. 형광도는 SpectraMax® M3 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 측정하였다(ex. 560/em. 590 nm). MIC 수치는 Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)를 사용하여 계산하였다.
3. 박테리아 및 접종 준비
조면(rough) 및 활면(smooth) 형태 CIP 104536T는 알부민 덱스트로스 살린(Albumin Dextrose Saline; ADS) 농축액 및 0.05% Tween 80이 첨가된 Middlebrook 7H9 broth에서 30℃로 배양하였다. pMV262-GFP 플라스미드를 가진 재조합 Mab는 50 mg/liter 카나마이신 존재하에서 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP)을 발현시켰다. Mab 발현 녹색 형광은 대수기(logarithmic phase)에 유지되었고, 원심분리하여 씻어낸 후, 5 μl로 분주하여 -80℃에서 보관할 동결 스톡(stock)을 제조하였다. 주입 전, 연속 희석을 통해 접종액의 CFU 수를 점검하였다. 감염을 위해, 박테리아 접종액은 0.05% Tween 80가 포함된 PBST로 희석하였고, 20 CFU/nl을 얻기 위해서, Phenol red 0.085%로 재현탁하였다.
4. 배아 내 Mab 의 미세주입
Nanoject III microinjector (Drummond Scientific)를 사용하여, 초기 발달 단계(1,024-cellstage 이상)의 제브라피쉬 배아 꼬리 혈관 정맥 주사를 통해 (caudal vein injection) 400 CFU를 함유하는 3 nl를 주입하였다. 주입 후, 배아는 블루 피쉬 워터(1g/liter의 메틸렌 블루를 포함하는 피쉬 워터)를 포함하는 96 well 플레이트에 well 당 두 마리씩 위치 시켰다.
5. M.abscessus -감염 제브라피쉬에서의 약물 효능 평가
25 μM 농도의 MMAGNU2, 리팜피신(rifampicin), 리파펜틴(rifapentine), 그리고 리파부틴(rifabutin)을 배아가 포함된 물에 직접 첨가하였고, 처리하지 않은 배아는 음성 대조군으로 사용하였다. 또한 클래리트로마이신(clarithromycin)을 처리한 배아는 양성 대조군으로 사용하였다. 화합물이 첨가된 물은 매일 한 번 교체하였다. 각각의 농도에 대한 약물 효능은 박테리아 부하(bacterial burden), GFP 정량화 및 배아 생존 동력학을 통해 측정하였다. 생존율 곡선을 작성하기 위해서, 죽은 배아(심장 박동 없음)는 13일 동안 매일 기록하였다. 박테리아 부하(bacterial load)의 정량화를 위해, 5 dpi 배아 그룹을 수집하였고, 26-게이지(gauge) 바늘 및 D1000 hand held homogenizer (Benchmark Scientific)를 통해 2% Triton X-100-PBST에 개별적으로 균질화시켰다. PBST에 녹인 10배 희석된 부유액을 50 mg/liter 암피실린 및 BBL MGIT PANTA가 포함된 7H10에 접종하였고, CFU를 측정하기 위해 3 내지 5일 동안 배양하였다. 형광도 정량화는 각 조건의 5개 형광 이미지를 수집하여 GFP 단백질의 발현 차이를 분석하였다.
6. 윤리
모든 제브라피쉬 실험은 경상대학교의 실험동물연구 윤리위원회의 승인을 받았다(GNU-190325-E0014).
< 실시예 1> 시험관 내(in vitro) Mab CIP 104536 T 의 성장을 억제하는 MMAGNU2
도 1에 나타낸 MMAGNU2가 Mab의 성장 억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 7H9 broth 배지에서 Mab CIP 104536T R-type 균주로 약물 감수성 시험을 수행하였다. MMAGNU2의 성장 억제 활성은 리파펜틴(rifapentine; RFT), 리파부틴(rifabutin; RFB), 리팜피신(rifampicin; RFP) 및 클래리트로마이신(clarithromycin; CLA)과 비교하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, MMAGNU2는 농도-의존적 방식으로 레자주린 형광도를 상당히 감소시켰다. 또한, MMAGNU2는 리파펜틴 및 리팜피신 보다 훨씬 강력한 활성을 나타냈으나, 리파부틴 및 클래리트로마이신에서는 그렇지 않았다. 표 1에 나타낸 바와 같이, MMAGNU2는 7H9 배지에서 Mab 복합체인 Mab subsp . bolletii CIP108541, Mab subsp . massiliense CIP108297 및 Mab CIP 104536T S에 대해, 4.0-6.2 μM 정도의 낮은 MIC90 (세균 증식 90% 최소 억제 농도를 일컫는다.)로 강력한 억제 활성을 나타냈다. 상기 결과는 MMAGNU2가 계통학적으로 가까운 모든 Mab 아종(subspecies)에 대해 효과적인 화합물이라는 것을 뒷받침한다. 또한, MMAGNU2는 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 및 비-증식성 M. tuberculosis SS18b 균주에 대해서도 활성을 나타냈다(도 3).
Figure PCTKR2020013128-appb-T000001
< 실시예 2> Mab CIP 104536 T R-type 감염된 제브라피쉬에서의 생체 내(in vivo) 효과
우선, 여러 농도의 MMAGNU2를 사용하여 최대허용용량(maximum tolerated dose; MTD)를 측정하였다. 이를 위해, Mab 감염되지 않은 제브라피쉬를 5, 10 및 25 μM의 MMAGNU2로 처리하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, MMAGNU2 처리된 제브라피쉬는 처리 후 7일까지는 어떠한 생존율 감소도 나타내지 않았다. 하지만, 8일째 모든 사용 용량에서 60-74%의 제브라피쉬가 상당히 죽는 것으로 나타냈다. 더구나, MMAGNU2 처리 후 9일째 100%의 제브라피쉬가 죽었다. 또한, 리파부틴 및 리팜피신과 같은 서로 다른 2개의 리파마이신 유도체에서도 이러한 생존 곡선이 반복되었다. 5, 10 및 25 μM의 리파부틴 및 리팜피신을 처리한 8일 후, 각각 47-65% 및 70-72%의 제브라피쉬가 죽었다. 또한, 9일째 살아남은 제브라피쉬는 없었다. 상기 결과를 토대로, 본 발명자들은 MMAGNU2, 리파부틴 및 리팜피신의 3가지 농도 모두 제브라피쉬에 대해 유사한 독성 프로파일을 나타낸다고 결론내릴 수 있었고, 생체 내(in vivo) 효능 분석에 25 μM 농도의 각 화합물을 사용하기로 하였다. 상기 화합물 독성 결과를 기초로, 본 발명자들은 제브라피쉬에 400 CFU의 Mab를 주입하였고, 25 μM의 MMAGNU2, 리파부틴, 리팜피신 및 클래리트로마이신을 각각 처리하여, 생존율을 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, Mab 비감염 제브라피쉬는 13일째까지 살아남았다. 이에 비해, MMAGNU2 처리하지 않은 Mab-감염된 제브라피쉬는 13일째 전부 죽었다. 하지만, 25 μM의 MMAGNU2 처리한 제브라피쉬는 수명이 상당히 연장되는 것으로 나타났다. 25 μM의 MMAGNU2를 처리하면, 약 54%의 Mab-감염된 제브라피쉬가 13일째까지 살아남을 수 있었다. 이는 Mab-감염된 제브라피쉬를 치료하기 위해, 25 μM의 MMAGNU2가 효과적인 화합물이라는 것을 나타낸다. 리파부틴의 경우, MMAGNU2 처리와 매우 유사한 생존율 프로파일을 나타냈다. 다른 리파마이신 유도체인 리팜피신 및 리파펜틴은 고농도(25 μM)에서도 Mab 감염된 제브라피쉬를 치료하는데 실패하였다. 약 90%의 Mab-감염된 제브라피쉬가 감염일로부터 13일째 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군인 클래리트로마이신은 우수한 생존율을 나타내었다. 25 μM의 클래리트로마이신에서 13 dpi까지 감염된 제브라피쉬의 65%가 생존할 수 있었다.
다음으로, 본 발명자들은 제브라피쉬 내 감염된 Mab 분포도를 형광현미경 하에서 관측하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 pMV262-GFP를 갖는 Mab-GFP를 사용하였다. 각각의 리파마이신 유도체들은 5 dpi까지 매일 한 번씩 25 μM을 처리하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 미처리 대조군에서는 감염된 Mab-GFP가 점진적으로 분포되었다. GFP의 크기는 제브라피쉬 머리 부위와 난황 (yolk)에서 확대되었다. 하지만, Mab-GFP 감염된 제브라피쉬에 MMAGNU2를 처리하면, 5 dpi에서 오직 제한된 수준의 GFP 발현을 관측할 수 있었다. 5 dpi에서의 제브라피쉬 내부의 GFP 발현은 화합물을 처리하지 않은 미처리(Untreated) 그룹, 25 μM을 처리한 리팜피신, 그리고 리파펜틴 보다 상당한 GFP 감소를 나타냈다. 비록 미처리 조건에서와는 달리, 리파부틴이 제브라피쉬 내 GFP 분포를 제한하는 능력은 가지고 있으나,GFP 발현 차이 저하는 를 MMAGNU2와 크게 다르지 않았다. 양성대조군인 클래리트로마이신 처리한 제브라피쉬는 5 dpi에서 가장 적은 양의 GFP 수준을 나타냈다. 상기 GFP 분포는 CFU 측정을 통해 이중 검증하였는데, 이는 화합물 처리 후 Mab 감염된 제브라피쉬의 내부에 생존 박테리아 부하가 감소하는지 확인하기 위함이었다. 상기에서 언급한 농도로 각가의 화합물을 처리한 후, 제브라피쉬는 각각 균질화시켰고, CFU를 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 미처리 음성 대조군에서는 5 dpi에 최대 생존 박테리아 부하를 나타냈다. 하지만, MMAGNU2 및 리파부틴은 모두 25 μM 농도에서 우수한 생존 박테리아 CFU 감소를 나타냈다. 이러한 상당한 효과는 클래리트로마이신을 10 μM 처리한 것과 비교할 수 있는 수준이었다. 또한, 리팜피신 및 리파펜틴은 Mab 감염된 제브라피쉬 내 박테리아 부하를 감소시키는데 실패하였다.
또한, 도 8에서 보이는 바와 같이, MMAGNU2는 그람 양성세균인 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (strain 5185)와 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) (strain 5506) 및 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis)를 효과적으로 생체 외 사멸시키는 것을 REMA 방법을 통하여 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2020013128-appb-I000003
  2. 제1항에 있어서, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)인 것을 특징으로 하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 결핵균 또는 비결핵 항산균 감염 질환은 결핵, 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환인 것을 특징으로 하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 그람 양성균 감염 질환은 폐렴, 수막염, 호흡기 질환 또는 피부질환인 것을 특징으로 하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2020013128-appb-I000004
  6. 제5항에 있어서, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)인 것을 특징으로 하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 결핵균 또는 비결핵 항산균 감염 질환은 결핵, 폐질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환인 것을 특징으로 하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 그람 양성균 감염 질환은 폐렴, 수막염, 호흡기 질환 또는 피부질환인 것을 특징으로 하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
PCT/KR2020/013128 2019-09-26 2020-09-25 Mmagnu2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물 WO2021060933A1 (ko)

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