KR20180115620A - 세포내 결핵균 제어를 위한 Nutlin-3α (뉴트린-3α) 및 p53 발현 조절 조성물 또는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Nutlin-3α 화합물을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 Nutlin-3α 화합물은 p53 과발현을 통해 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 효과가 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 방법은 결핵의 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 전반적으로 면역학 분야에 관한 것이며, 부분적으로 결핵균의 생존 및 증식을 억제하는 방법에 관한 것이며 이를 위하여 Nutlin-3α (뉴트린-3α) 및 p53 발현 조절 조성물을 제공하는 방법에 관한 것이다.
결핵은 결핵균 및 다른 마이코박테리움(Mycobacterium)종의 감염에 의해 유발되는 만성 감염성 질병이다. 결핵은 매년 약 8백만명의 신규 감염자가 발생되며 3백만명의 목숨을 앗아가는 개발도상국의 주요 질병이며, 또한 선진국에서도 문제점으로 부각되고 있다. 상당한 기간 동안 감염은 무증상일 수 있으나, 결핵은 가장 공통적인 증상으로서 폐의 급성 염증을 나타내며, 그 결과 발열 및 마른 기침(nonproductive cough)을 유발시킨다. 치료하지 않으면, 일반적으로 심각한 합병증 및 사망을 초래한다.
결핵은 장기간에 걸친 항생제 요법을 이용하여 치료될 수 있으나, 이러한 치료법이 결핵의 확산을 막기에는 역부족이다. 감염된 개체들은 증상을 나타내지는 아니하나, 일정 기간 보균상태(contagious)일 수 있다. 게다가 치료 섭생을 엄격하게 따르더라도 환자의 행동을 통제하는 것은 어렵다. 일부 환자들은 치료과정을 끝마치지 못하는데, 이는 효험없는 치료와 약제 내성의 발달을 초래할 수 있다. 치료의 전 과정을 끝마친다 하더라도, 결핵균 감염은 감염된 개체로부터 근절되지 아니하며 여전히 재활성화될 수 있는 잠복성 감염으로 잔존하게 된다.
결핵의 확산을 통제하기 위해서는, 상기 질병에 대한 효과적인 예방접종(vaccination) 및 정확한 초기 진단이 가장 중요하다. 현재까지는 생균(live bacteria)을 이용한 예방접종이 보호 면역을 유도하기 위한 가장 효율적인 방법이다. 상기 목적을 위해 이용되는 가장 일반적인 마이코박테리움은 바실러스 칼메트-게링(BacillusCalmette-Guerin, BCG)인데, M. bovis의 비병원성 종이다. 그러나, BCG의 안정성 및 효능은 논쟁의 대상이 되고 있으며, 미국과 같은 일부 국가에서는 상기 제제를 사용한 일반 대중의 예방접종을 실시하지 않고 있다. 결핵의 진단은 일반적으로 피부 검정법을 이용하여 수행되는데, 상기 검정법은 투베르쿨린 PPD(proteinpurified derivative)에 대한 피내 노출을 포함한다. 항원-특이 T 세포 반응은 주입후 48-72시간 까지 주입 부위에서의 측정가능한 정도 경화(induration)를 초래하는데, 이는 마이코박테리움 항원에 대한 노출을 의미한다. 그러나 상기 검정법은 민감도 및 특이성에서 문제가 있으며, BCG로 예방접종된 개체들은 감염된 개체들과 구별될 수 없다.
p53 (분자량 53 kDa) 은 세포의 이상증식 및 돌연변이 억제 기능을 가진 대표적인 항암유전자이다. 또한, 전사인자로써 세포자사멸 (apoptosis) 에 관여하는 PUMA, Bax 등의 발현을 증가시켜, 암세포 및 세균 감염세포의 사멸 유도에 효과적인 단백질이다. 따라서, 대식세포의 결핵균 사멸과정에서 p53 역할이 중요할 것으로 여겨진다.
P53 단백질은 MDM2 단백질에 의하여 유비퀴틴으로 표지되고 proteasome 에 의해 분해되는데, 항암제로 알려져 있는 Nutlin-3α (분자량 581.49)는 이러한 MDM2 와 결합하여 p53-MDM2 상호작용을 억제함으로써 p53 경로 활성을 증가시켜주는 화합물이다. 따라서, p53을 타겟으로 하여 결핵균 억제 방법으로써, Nutlin-3α 단독 또는 기존 항결핵 치료제와 병행하여 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
본 발명은 p53의 발현조절 또는 p53 활성을 유도하는 Nutlin-3α 를 이용하여 대식세포의 활성화에 기여하여, 기존 약제와 작용기전이 다르고 부작용이 상대적으로 적은 결핵 예방 및 효율적인 치료 방법을 제공하고자 한다.
전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Nutlin-3α 화합물을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
이렇게 제공된 Nutlin-3α 화합물은 p53 과발현 시키는 것을 특징으로 하며 이렇게 과발현된 p53은 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다.
또한 Nutlin-3α에 기존의 항결핵 약제를 병용하여 사용하는 것을 포함할 수 있다.
여기에서 사용되는 항결핵 약제는 리팜피신(Rifampicin), 아이소니아지드(Isoniazid), 에탐부톨(Ethambutol), 피라진아미드(Pyrazinamide)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
또한 상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 및 척추 결핵으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.
상기 사용된 Nutlin-3α의 분자식은 C30H30Cl2N4O4 이다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 종래 전혀 알려져 있지 않던 Nutlin-3α의 결핵균에 대한 기능을 활용한 것이므로, 기존 약제에 대해 다약제내성이 있는 결핵균에 대해서도 예방 및 치료효과를 기대할 수 있다. 또한 본 발명에 의하면 세포내에 잠복하고 있는 결핵균의 생장을 억제할 수 있기 때문에 단독으로 사용하거나, 종래 약제와 병용하는 경우 잠복성 결핵균을 제거할 수 있게 된다.
도 1은 Nutlin-3α 구조도를 나타낸 사진이다.
도 2는 결핵균이 감염된 대식세포에 처리된 Nutlin-3α 농도에 따른 p53 발현과 Caspase-3 활성을 보여주는 western blotting에 의한 단백질 발현 전기영동사진이다.
도 3은 Nutlin-3α 처리에 의해 대식세포 내 결핵균의 수가 유의하게 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 4 및 도 5는 항결핵 치료제 (아이소니아지드, 리팜피신, 피라지나마이드, 에탐부톨) 와 Nutlin-3α 병용 처리에 의해 대식세포 내 결핵균의 수가 유의하게 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6은 p53이 결핍된 macrophage를 가진 ㅤ마우스 폐에서 결핵균 생존수가 현저히 증가하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 7은 결핵균을 감염시킨 마우스에 Nutlin-3a (10mg/kg/day)를 복강 주입하여 p53 활성을 증가시켜주었을 때, 폐 조직 내의 결핵균 수가 현저히 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 8은 건강인 macrophage에 비해 결핵환자의 macrophage에서 p53의 발현이 현저히 떨어지는 것을 보여주는 그래프이다.
도 9는 Nutlin-3a를 통해 p53 활성을 증가시켜주었을 때, 세포 내의 결핵균 수가 현저히 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 2는 결핵균이 감염된 대식세포에 처리된 Nutlin-3α 농도에 따른 p53 발현과 Caspase-3 활성을 보여주는 western blotting에 의한 단백질 발현 전기영동사진이다.
도 3은 Nutlin-3α 처리에 의해 대식세포 내 결핵균의 수가 유의하게 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 4 및 도 5는 항결핵 치료제 (아이소니아지드, 리팜피신, 피라지나마이드, 에탐부톨) 와 Nutlin-3α 병용 처리에 의해 대식세포 내 결핵균의 수가 유의하게 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 6은 p53이 결핍된 macrophage를 가진 ㅤ마우스 폐에서 결핵균 생존수가 현저히 증가하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 7은 결핵균을 감염시킨 마우스에 Nutlin-3a (10mg/kg/day)를 복강 주입하여 p53 활성을 증가시켜주었을 때, 폐 조직 내의 결핵균 수가 현저히 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 8은 건강인 macrophage에 비해 결핵환자의 macrophage에서 p53의 발현이 현저히 떨어지는 것을 보여주는 그래프이다.
도 9는 Nutlin-3a를 통해 p53 활성을 증가시켜주었을 때, 세포 내의 결핵균 수가 현저히 감소하는 것을 보여주는 그래프이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 첨부된 도면은 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
본 발명은 Nutlin-3α 화합물이 p53 과발현시켜 대식세포의 세포자멸사를 작용시키는 것을 통하여 결핵균의 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, 따라서 본 발명은 Nutlin-3α 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
일반적으로 ‘Nutlin-3α’는 MDM2에 결합해 MDM2와 p53 단백질 간 결합을 저해하는 소형분자 화합물로서, 항암효과가 알려져 있으며, 화학구조는 하기 도 1과 같다. 좀 더 구체적으로 설명하자면 Nutlin-3α은 MDM2에 결합해 MDM2와 p53 단백질 간 결합을 저해하는 소형분자 화합물로서 고형암 등의 치료를 위해 현재 임상에서 개발 중인 항암 약물이다. 자세하게는, MDM2 단백질은 암을 억제하는 유전자로 알려진 p53의 전이활성(transactivation) 부위에 결합하여 활성화 능력을 차단시키는 역할을 하는데, Nutlin-3α 화합물의 경우 p53 과 유사한 분자 구조를 가지기 때문에 MDM2 단백질과 결합을 형성하며, 이로 인해 p53 단백질이 MDM2 단백질과 결합하지 못함에 따라 활성화 능력이 유지되어 p53이 과발현되게 되는 것이다. 그러나 상기 Nutlin-3α 화합물은 현재 임상에서 개발 중인 항암 약물로만 알려져 있으며, 결핵 치료와 관련하여 효과를 가진다는 내용에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 Nutlin-3α 화합물이 p53을 활성화시키는 기작을 통하여, 결핵을 개선시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
또한 본 발명의 하기 실시예 1에 따르면, 마우스 유래 대식세포인 Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 세포에 Nutlin-3α 화합물을 주입한 경우 결핵균의 수가 유의적으로 감소되는 것으로 나타나 결핵이 개선되는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명의 하기 실시예 2에 따르면, 기존 항결핵제와 병용하여 사용시 기존 항결핵제 단독으로 사용한 것에 비하여 월등히 높은 결핵균 감소의 효과를 보임을 확인할 수 있었다.
따라서 Nutlin-3α 화합물은 결핵을 개선시키는 효과 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 결핵에 대한 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 말하는 결핵에는 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다약제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵등을 포함할 수 있다.
또한 기존 항결핵제로서는 본 발명의 실시예 2에 사용된 리팜피신(Rifampicin), 아이소니아지드(Isoniazid), 에탐부톨(Ethambutol) 또는 피라진아미드(Pyrazinamide)등이 있을 수 있다.
본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
이하 좀 더 구체적인 실시예를 통해서 본 발명을 살펴보고자 한다.
실시예 1 : p53 발현 조절을 통한 세포 내 결핵균의 생장 억제 효과 1
세포 내 결핵균의 감염 시 Nutlin-3α 처리에 의한 p53 발현 여부와, 이것이 어떠한 역할을 가지는지를 분석하기 위하여 결핵균을 감염시킨 대식세포로부터 p53 의 발현과 세포 내 결핵균 사멸 효과를 확인하였다. 마우스 유래 대식세포인 Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) 세포를 사용하여, 병원성 결핵균(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)과 비병원성 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis H37Ra)을 세포당 균 수 1의 비율로 감염시키고 Nutlin-3α 를 처리한 후, 세포 내 결핵균의 생존 수를 측정하였다.
도 2는 결핵균 감염 시 발현되는 p53 단백질 발현 정도와 세포자멸사 마커인 Caspase-3 활성을 western blot 방법으로 확인한 결과로서 결핵균이 감염된 대식세포에서 p53 유도제인 Nutlin-3α (도 1) 처리 농도 증가에 따라 점점 p53 과 Caspas-3 의 활성이 증가하는 것을 보여준다. (도 2에서 β-actin은 내부콘트롤)
도 3은 결핵균이 감염된 큰대식세포에 Nutlin-3α (30 uM) 를 처리하여 24 시간 경과 후, 세포 내 생존하고 있는 결핵균 수를 7H10 agar 배지에서 14~21일 동안 배양하여 산출하였다. 그 결과, 대조군에 비해 Nutlin-3α (30 uM) 를 처리한 대식세포에서 세포 내 병원성 결핵균, 비병원성 결핵균의 생존수가 현저히 감소된 것을 보여준다.
실시예 2 : p53 발현 조절을 통한 세포 내 결핵균의 생장 억제 효과 2
세포 내 결핵균의 감염 시 Nutlin-3α 처리에 의한 p53 발현 조절이 어떠한 역할을 가지는지를 분석하기 위하여 기존의 항결핵 치료제와 병용하여 사용한 후, 세포 내 결핵균의 수를 측정하였다.
도 4 및 도5는 대식세포내 결핵균 감염 시 항결핵 치료제인 아이소니아지드(10 ng/ml), 리팜피신(10 ng/ml), 피라지나마이드(100 ng/ml) 또는 에탐부톨(100 ng/ml) 과 Nutlin-3α (30 uM) 를 병용하여 처리하였을 때 세포 내 결핵균의 증식 억제효과를 확인한 그림이다. 병원성 결핵균 또는 비병원성 결핵균이 감염된 대식세포에 항결핵 치료제 단독 또는 Nutlin-3α 와 병용 처리하여 24 시간 경과 후, 세포 내에 생존하고 있는 결핵균의 수를 측정하였다. 실험 결과, 항결핵 치료제 단독사용에 비해 항결핵 치료제와 Nutlin-3α 를 병용하여 처리하였을 때 세포 내 결핵균 수가 유의하게 감소하는 것을 보여준다.
도 6은 대조군 (wild type) 또는 macrophage의 p53이 결핍된 (p53 conditional knockout) 마우스에 비병원성 결핵균을 비강 내 감염시킨 후, 폐 조직 내 생존하고 있는 결핵균 수를 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비해 p53이 결핍된 macrophage를 가진 ㅤ마우스 폐에서 결핵균 생존수가 현저히 증가하는 것을 보여준다. ㅤ
도 7은 비강을 통해 비병원성 결핵균을 감염시킨 마우스에 Nutlin-3a (10mg/kg/day)를 복강 주입하여 p53 활성을 증가시켜주었을 때, 폐 조직 내의 결핵균 수가 현저히 감소하는 것을 나타낸다.
도 8은 건강인(n=9) 또는 결핵환자(n=13)의 혈액에서 분리한 macrophage 에 비병원성 결핵균을 감염시킨 후, Real-time PCR 방법을 통해 p53 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 건강인 macrophage에 비해 결핵환자의 macrophage에서 p53의 발현이 현저히 떨어지는 것을 알 수 있다.
도 9는 건강인 또는 결핵환자 혈액에서 유래한 macrophage에 비병원성 결핵균을 감염시킨 후, Nutlin-3a (10 uM)를 처리하고 세포 내 결핵균 생존 수를 측정하였다. 그 결과로, Nutlin-3a를 통해 p53 활성을 증가시켜주었을 때, 세포 내의 결핵균 수가 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
상기 실시예에서는 세포 내 p53 의 발현을 증가시킴으로써 세포 내 결핵균을 생존을 억제시킬 수 있음을 보았다. 따라서 p53 을 조절하는 유효성분으로 본 발명에 의한 조성물 (Nutlin-3α) 을 결핵균 감염세포에 처리하는 경우 즉, 본 발명에 의한 조성물을 결핵균 보균자, 결핵환자 또는 기존 항결핵제 내성 환자에게 처치하는 경우에도 세포 내 결핵균을 사멸시킬 수 있음을 기대할 수 있다.
통계처리에 사용한 방법은 Bonferroni’s multiple comparison test로, p-값 < 0.05 일 때 *, p-값 < 0.01 일 때 **, p-값 < 0.001 일 때 ***로 표시하였다.
Claims (6)
- Nutlin-3α 화합물을 유효성분으로 포함하는 결핵 예방 및 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 Nutlin-3α 화합물은 p53 과발현 시키는 것을 특징으로 하는 결핵 예방 및 치료용 약학적 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 p53 과발현은 결핵균에 감염된 대식세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도함으로써 결핵균의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 결핵 예방 및 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 Nutlin-3α 화합물에 항결핵 약제를 병용하여 사용하는 결핵 예방 및 치료용 약학적 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 항결핵 약제는 리팜피신(Rifampicin), 아이소니아지드(Isoniazid), 에탐부톨(Ethambutol) 또는 피라진아미드(Pyrazinamide)인 결핵 예방 및 치료용 약학적 조성물. - 제1항 내지 제5항에 있어서,
상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다약제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵인 결핵 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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