WO2021029633A1 - 금나노입자-selex에 기초한 표적특이적 압타머 선별법 - Google Patents

금나노입자-selex에 기초한 표적특이적 압타머 선별법 Download PDF

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    • C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting an aptamer.
  • An aptamer is a polynucleotide molecule having a specific binding ability for a target substance, and can be used for protein sensors, nanosensors, and the like.
  • Existing methods for screening aptamers take a lot of time in the screening process, so there is a problem in that it takes a long time to obtain an aptamer with more than a certain efficacy.
  • SELEX Systemic Evolution of Ligand Exponential Enrichment
  • Quantitative SELEX (positive SELEX) is a process of increasing the purity of an aptamer having high specificity for a target substance by repeating the SELEX process several times.
  • Negative SELEX is a process of selecting an aptamer having selective specificity for a target substance by performing an aptamer having binding ability to a sample used in the SELEX process or a substance having homology with the target substance.
  • Aptamers are similar in use to antibodies in that they can specifically bind to targets. However, in that an experimenter can select from a nucleic acid library artificially synthesized for a desired target substance in vitro , aptamers can be developed for a wide range of targets for which antibodies cannot be developed. In order to select an aptamer, a screening method called SELEX ( Nature , 1990 , 346 , 818-822) is generally used, which repeats about 10-20 rounds, binding of the target to the library, washing of the unbound sequence, and It consists of dissociation of the sequence bound to and amplification of the dissociated sequence.
  • SELEX Nature , 1990 , 346 , 818-852
  • a process of modifying the target and fixing it to the surface is required for the cleaning process, and after the SELEX round is completed, a post-SELEX process is required to improve the performance of the selected aptamer.
  • monitoring should be accompanied every 3-5 rounds completed during the SELEX round. Therefore, it takes at least several months to select an aptamer.
  • the present application prepares a gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library; Reacting the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library with the target material; Separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material from the reaction mixture; And it provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding to a target material comprising determining whether to proceed with an additional reaction through the color index of the reaction mixture.
  • the present application is to prepare the gold nanoparticles-single-stranded nucleic acid library, preparing gold nanoparticles by reduction and stabilization by citric acid; Preparing single-stranded nucleic acid library; Reacting the gold nanoparticles with the single-stranded nucleic acid library; And it provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding to a target material comprising removing the single-stranded nucleic acid not bound to the gold nanoparticles.
  • the present application provides a method of selecting a single-stranded nucleic acid having binding to a target material, characterized in that the gold nanoparticles have an average diameter of 15 nm to 50 nm.
  • the present application is a single-stranded nucleic acid having binding to the target material, characterized in that the separation of the single-stranded nucleic acid bound to the target material from the reaction mixture, and obtaining a supernatant after centrifuging the reaction mixture. It provides a method of selecting a stranded nucleic acid.
  • the present application further comprises separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material from the reaction mixture, and then separating the single-stranded nucleic acid from the target material, and then isolating the single-stranded nucleic acid. It provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding to Furthermore, the present application provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding properties to a target material including performing ethanol precipitation in the isolating the single-stranded nucleic acid.
  • the present application further comprises separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material, and then amplifying the single-stranded nucleic acid bound to the target material. Provides a method of choice.
  • the present application determines whether to proceed with an additional reaction through the color index of the reaction mixture, measuring the color index of the reaction mixture; It provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding properties to a target material comprising comparing the color index of the reaction mixture with a reference color index. Furthermore, the present application provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding property to a target material, further comprising inducing the gold nanoparticles to aggregate before measuring the color index of the reaction mixture. . Furthermore, the present application provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding properties to a target material including adding a salt to the reaction mixture by inducing the gold nanoparticles to aggregate.
  • the present application is to quantify the color index of the reaction mixture as the ratio of the absorbance values measured at two wavelengths before the gold nanoparticles are aggregated and the absorbance values measured at the same two wavelengths after aggregation. It provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding properties to a target material as characterized. Furthermore, the present application provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding property to a target material, characterized in that the color index of the reaction mixture is E620/E520.
  • the wavelength for measuring the absorbance may be selected differently according to the size of the gold nanoparticles, and the ratio between absorbances for indicating the aggregation change may be used as an inverse number.
  • the present application is a binding to a target material, characterized in that after determining whether to proceed with an additional reaction through the color index of the reaction mixture, separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material from the reaction mixture is performed sequentially.
  • the present application is a target, characterized in that after separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material, the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library is prepared and the target material-binding single-stranded nucleic acid selection process is repeated a specific number of times. It provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding to a substance.
  • the target material is a target, characterized in that it contains a group of low-molecular substances, ions, proteins, nucleic acids, viruses, and microorganisms capable of inducing aggregation of gold nanoparticles including brassinolide or bisphenol A It provides a method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding to a substance.
  • the present application separates the single-stranded nucleic acid bound to the target material from the reaction mixture, and determines whether to proceed with an additional reaction through the color index of the reaction mixture, and then, the gold nanoparticles of the single-stranded nucleic acid bound to the target material.
  • the present application relates to the binding property to a target material, characterized in that the target material is brassinolide and the non-target material is B-sitosterol, or the target material is bisphenol A and the non-target material is bisphenol S. It provides a method of selecting a single-stranded nucleic acid having.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid consisting of one nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4, 17 and 18, having binding to brassinolide, and relatively weak binding to B-sitosterol. Furthermore, the present application provides a single-stranded nucleic acid consisting of one nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 17 and 18, having binding to brassinolide, and relatively weak binding to B-sitosterol.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid consisting of one nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 5 to 16, having binding properties to bisphenol A, and relatively weak binding to bisphenol S. Furthermore, the present application provides a single-stranded nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, having binding properties to bisphenol A, and relatively weak binding to bisphenol S.
  • the present application provides a kit for purifying brassinolide containing a single-stranded nucleic acid composed of one or more nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1, 17 and 18.
  • the present application provides a kit for purifying brassinolide containing a single-stranded nucleic acid composed of one nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4, 17 and 18. Furthermore, the present application provides a kit for purifying brassinolide containing a single-stranded nucleic acid composed of one nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 17 and 18.
  • the present invention is to solve the above problems, and does not require complicated measurement equipment, and is a method that can check the progress of SELEX in a short time simply by changing the color of the nanoparticles.
  • measurement methods by colorimetric method of gold nanoparticles eg DNA detection, protein detection, heavy metal ion, immunoassay, etc.
  • a method of monitoring the selection process of aptamers through color change of nanoparticles is reported. None happened.
  • the binding force between the ssDNA and the target material is high, when the gold nanoparticles encounter salt, the surface of the nanoparticles is denatured to cause agglomeration, and the gold nanoparticles induce a color change during the aggregation process.
  • This phenomenon occurs because the degree of scattering of light and surface plasmon varies depending on the size of the nanoparticles.
  • they have a reddish brown color, but when agglomerated, the particle size increases and a larger wavelength is scattered, so that the color of the solution in which the gold nanoparticles are dissolved changes to purple, blue, gray, etc. depending on the size. do.
  • the SELEX process can be analyzed and monitored more quickly and easily.
  • a separate monitoring process is not required, and the aptamer selection process can be performed flexibly and at the convenience of the experimenter by judging the progression level only by the color change of gold nanoparticles compared to the existing SELEX.
  • the aptamer can be selected as the original target of the desired target. This makes it easy to select an aptamer for a substance of interest, and is expected to develop by using it extensively for target imaging, medical diagnosis, toxicity sensing in the environment or food field, and target-specific drug delivery treatment using the selected aptamer. I can.
  • 1 is a schematic diagram showing a method for selecting a single-stranded nucleic acid according to the present application.
  • 2 is an example 1 of a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • 3 is an exemplary gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library preparation process.
  • 4 is an example 2 of a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • 5 is an example 3 of a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • 6 is an example 4 of a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • 7 is an example 5 of a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • FIG. 8 is an example of a single-stranded nucleic acid selection method according to the present application, which includes a target material binding single-stranded nucleic acid selection process and a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • FIG. 10 is a photograph of a reaction mixture taken in the middle of a selection process for selecting single-stranded nucleic acids that bind to brassinolide.
  • 11 is a color index (E620/E520) measured in the middle of a selection process for selecting single-stranded nucleic acids that bind to bisphenol A.
  • FIG. 12 is a photograph of a reaction mixture taken in the middle of a selection process of selecting single-stranded nucleic acids that bind to bisphenol A.
  • FIG. 13 shows the secondary structure of the single-stranded nucleic acid BLA8-20 that binds to brassinolide.
  • 15 is a photograph of a reaction mixture obtained by reacting single-stranded nucleic acids selected by the method according to the present application with brassinolide and non-target materials thereof.
  • Figure 16 shows the secondary structure of the single-stranded nucleic acid nBPA40 binding to bisphenol A.
  • 17 is a measurement of the binding strength of the single-stranded nucleic acid selected by the method according to the present application, bisphenol A, and non-target materials thereof.
  • 20 is a comparative photograph of a reaction mixture obtained by reacting a single-stranded nucleic acid nBPA40 and a previously published aptamer with bisphenol A.
  • 21 is a result of comparing the sequence similarity between the single-stranded nucleic acid nBPA40 and the previously published aptamer.
  • Figure 22 shows the single-stranded nucleic acid BLA9-20 and the improved single-stranded nucleic acid prepared by cutting the same.
  • Fig. 24 is a measurement of changes in secondary structure after binding of tBLA-v1 and brassinolide.
  • 25 is a measurement of the change in secondary structure after binding of tBLA-v2 and brassinolide.
  • 26 is an example showing a method for detecting brassinolide using an aptamer.
  • react means making the reactants adjacent through mixing, adding, etc. so that reactants can interact, and/or a phenomenon caused by this. Regardless of whether the result of the reaction according to the present application is a physical change or a chemical change of the reactant.
  • nucleic acid and “single-stranded nucleic acid” in the present application follow commonly known definitions.
  • the nucleic acid selection method according to the present application and the nucleic acid selected thereby is a concept that can be extended regardless of the type of nucleic acid, so the nucleic acid of the present application is not only DNA, RNA, but all those that can be understood at the level of conventional technology at the time. It is intended as an inclusive concept.
  • nucleic acid library in the present application refers to a collection of at least two different types of nucleic acids.
  • Single-stranded nucleic acid library means a collection of at least two different types of single-stranded nucleic acids.
  • the nucleic acid library according to the present application may be in any form, such as a form in which a nucleic acid is contained in a microorganism, a form contained in a special formulation (micelle, liposome, etc.), a form dispersed without any other formulation, and the like.
  • Target substance means the specific substance in the selection of a single-stranded nucleic acid having binding properties to a specific substance for the purpose of the present application.
  • non-target substance means a substance intended not to bind to the single-stranded nucleic acid.
  • the target material and non-target material may be of any form such as small molecule, ion, protein, nucleic acid, virus, microbial group, and the like.
  • reaction mixture reaction mixture
  • reaction combination reaction combination
  • Gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library is formed by having a positional relationship between gold nanoparticles and single-stranded nucleic acids, and means a collection of gold nanoparticles and single-stranded nucleic acids formed at this time when there are at least two combinations do.
  • a method of preparing a gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library may include reacting gold nanoparticles with a single-stranded nucleic acid library. Gold nanoparticles and single-stranded nucleic acid libraries are combined through a reaction to form a gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library.
  • the bonding may be of any kind, such as through a physical force such as an electrostatic force or a chemical bonding.
  • the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library may be a single-stranded nucleic acid adsorbed around the gold nanoparticles.
  • a gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library may chemically bind a single-stranded nucleic acid to gold nanoparticles.
  • the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library preparation method of the present application may include preparing gold nanoparticles.
  • the method of preparing gold nanoparticles may be performed by a commonly known method of preparing gold nanoparticles.
  • the gold nanoparticles of the present application may be stabilized with citric acid and have affinity with ssDNA. In one embodiment, the gold nanoparticles of the present application may have an average diameter of 15 nm to 50 nm. The gold nanoparticles of the present application may be prepared by reduction and stabilization by citric acid.
  • the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library preparation method of the present application may include preparing a single-stranded nucleic acid library.
  • a method of preparing a single-stranded nucleic acid library may be performed by a commonly known method of preparing a nucleic acid library.
  • the single-stranded nucleic acid library of the present application may be prepared by a DNA synthesizer, error-prone PCR, and mutagenesis.
  • the single-stranded nucleic acid subjected to the single-stranded nucleic acid selection process according to the present application may be used as a single-stranded nucleic acid library.
  • the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library preparation method according to the present application may include an additional process in addition to those mentioned above.
  • the preparation method may include reacting the gold nanoparticles with the single-stranded nucleic acid library, and then removing the single-stranded nucleic acid not bound to the gold nanoparticles.
  • Some single-stranded nucleic acids may not bind gold nanoparticles well by nature. If these are included in the library, erroneous results may occur in the selection process of single-stranded nucleic acids below. For example, in the following selection process of single-stranded nucleic acids, they do not react with the target material, but are separated in the form of single-stranded nucleic acids to become impurities.
  • it is unintentionally dissociated from gold nanoparticles and acts as an error in the color index of the mixture.
  • removing the single-stranded nucleic acids that may act as errors may include centrifuging the reaction result, discarding the supernatant, and taking the rest.
  • the centrifugation may be performed at 3000 to 9000g.
  • the centrifugation may be performed at 6500 g.
  • the centrifugation may be performed for 5 to 20 minutes.
  • the centrifugation may be performed for 10 minutes.
  • removing the single-stranded nucleic acid not bound to the gold nanoparticles may include centrifuging the reaction product and then discarding the supernatant for a specific number of times.
  • the reaction may include mixing a gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library and a target material.
  • This table of contents is for explaining a method of separating a target substance-binding single-stranded nucleic acid that caused the reaction after the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library reacted with a target substance.
  • the single-stranded nucleic acid bound to the target material changes the interaction with the gold nanoparticles, and the single-stranded nucleic acid that does not react with the target material maintains binding to the gold nanoparticles. Therefore, these single-stranded nucleic acids can be separated by subjecting the reaction mixture to a physical impact or chemical manipulation.
  • a target substance-binding single-stranded nucleic acid may be separated by applying a physical shock to the reaction mixture.
  • the reaction mixture may be phase-separated to separate a target substance-binding single-stranded nucleic acid.
  • the isolated single-stranded nucleic acid has a smaller mass compared to the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid structure.
  • separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material may include obtaining a supernatant after centrifuging the reaction mixture.
  • the method for selecting a single-stranded nucleic acid having binding property to a target material may include selectively isolating a single-stranded nucleic acid binding to a target material.
  • the isolation means separating the single-stranded nucleic acid from the form of the single-stranded nucleic acid conjugated to the target material and then isolating the single-stranded nucleic acid. This can be performed by separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material, and then separating the single-stranded nucleic acid and the target material, and then isolating the single-stranded nucleic acid.
  • isolation of the single-stranded nucleic acid may be performed by commonly used methods.
  • isolating the isolated single-stranded nucleic acid may include performing ethanol precipitation.
  • the method of selecting a single-stranded nucleic acid having binding property to a target material may include selectively amplifying a single-stranded nucleic acid binding to a target material.
  • the single-stranded nucleic acid bound to the target material may be amplified.
  • nucleic acids For the amplification of single-stranded nucleic acids, all conventional methods such as PCR and artificial synthesis of nucleic acids can be used.
  • the gold nanoparticles have useful properties that can monitor the selection process according to the present application.
  • the method of selecting a single-stranded nucleic acid having binding to a target material according to the present application may include a monitoring process through a colorimetric method.
  • Gold nanoparticles have a characteristic that the observed physical properties change as the absorption spectrum of light changes according to the size of the particles. Typically, as the particles become larger, the mixture containing gold nanoparticles changes from red to purple. Gold nanoparticles have been used in colormetric sensor technology.
  • the reason the particle size changes is because the gold nanoparticles aggregate.
  • the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid structure according to the present application maintains a form dispersed by repulsive force by placing an electric charge on the surface.
  • the single-stranded nucleic acid is separated from the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid structure, and when the charge on the surface of the gold nanoparticle is overcome, the gold nanoparticles aggregate with each other.
  • salt-induced aggregation occurs when salt is added to a gold nanoparticle solution.
  • the physical properties of the gold nanoparticles can be usefully utilized for monitoring the selection process in the method for selecting single-stranded nucleic acids according to the present application.
  • Color index means a numerical value capable of expressing the optical properties of a particular object (eg, wavelength, refractive index, frequency, energy, absorbance, or reflectance, etc.).
  • the mixture containing gold nanoparticles generated in the selection process according to the present application has a specific color. In other words, depending on the average diameter of the gold nanoparticles contained in the mixture, the color becomes red to purple (the smaller the particle becomes larger). The average diameter of gold nanoparticles can be changed by aggregation of gold nanoparticles.
  • the method of selecting a single-stranded nucleic acid having binding property to a target material according to the present application may further include inducing Au nanoparticles to aggregate.
  • inducing the Au nanoparticles to aggregate may be performed prior to measuring the color index of the reaction mixture.
  • salt-induced aggregation may be induced by adding a salt to the mixture.
  • the salt and the gold nanoparticles do not react and thus do not aggregate properly.
  • gold nanoparticles are separated from single-stranded nucleic acids (eg, by reaction with a target material)
  • salt and gold nanoparticles react and gold nanoparticles aggregate.
  • the degree of aggregation will depend on how far the single-stranded nucleic acid is isolated. The selection process can be monitored by checking the color indices that change according to the size of the agglomerated particles.
  • the color index of the mixture may be the absorbance of the mixture. Furthermore, the color index of the mixture may be a ratio of a specific wavelength value of the absorption curve. In one example, the color index of the mixture may be extracted from a photograph of the mixture.
  • the present application provides a method of determining whether to proceed with an additional process through a color index of a reaction mixture during the selection process of a single-stranded nucleic acid.
  • the selection process can be monitored by the properties of the gold nanoparticles described above. Also, through this, it can be determined whether an additional process needs to be performed. For example, when it is determined that the single-stranded nucleic acid is not selected as desired, an additional selection process may be performed.
  • Gold nanoparticles have the advantage of being able to monitor the selection process optically without any manipulation.
  • the better the single-stranded nucleic acid included in the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library reacts with the target material the more single-stranded nucleic acids are separated from the gold nanoparticles. As the surface of the gold nanoparticles is more exposed, the gold nanoparticles aggregate better. At this time, the color of the mixture changes from red when the particles are small to purple when the particles are large. That is, as the binding property of the single-stranded nucleic acid to the target is improved, the color of the agglutination-induced mixture becomes closer to purple.
  • preparing a gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library and after reacting the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library with the target material, it may be further performed to determine whether to proceed with an additional process through the color index of the reaction mixture.
  • the process of determining whether to proceed with the additional process may be performed before or after separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material from the reaction mixture.
  • separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material from the reaction mixture may be performed.
  • 5 is a flowchart of an exemplary single-stranded nucleic acid selection process including determining whether to proceed with an additional reaction.
  • inducing the gold nanoparticles to aggregate may be performed prior to determining whether to proceed with an additional process through the color index of the reaction mixture according to the present application.
  • inducing the gold nanoparticles to aggregate may include adding a salt to the reaction mixture.
  • the salt may be NaCl.
  • determining whether to proceed with an additional process through the color index of the reaction mixture is because it is possible to know qualitatively and quantitatively how long the selection process has progressed through the color index. In one embodiment, determining whether to proceed with the additional process through the color index of the reaction mixture, measuring the color index of the reaction mixture; And comparing a color index of the reaction mixture with a reference color index.
  • the color indices of the reactants on which the determination is based may be selected from commonly known color indices.
  • the color index of the reaction mixture may be absorbance.
  • the color index of the reaction mixture may be a ratio of a specific wavelength value of the absorption curve.
  • the color index of the reaction mixture may be a ratio of absorbance of 620 nm and absorbance of 520 nm (hereinafter, E620/E520).
  • the wavelength for measuring the absorbance may be selected differently according to the size of the gold nanoparticles, and the ratio between absorbances indicating a change in aggregation may be used as an inverse number.
  • the color index of the reaction mixture may be derived from a photograph of the reaction mixture. For example, it may be data that can be computerized, such as an RGB code of a reaction mixture color. In one example, determining whether to proceed with the additional process may be based on the color index of two or more types of mixtures.
  • measuring the color index of the reaction mixture may be measuring the absorbance of the reaction mixture.
  • measuring the color index of the reaction mixture may be measuring an absorption curve of the reaction mixture.
  • measuring the color index of the reaction mixture may be taking a picture of the reaction mixture.
  • the standard color index refers to the absolute value of the color index to evaluate whether additional processing is necessary.
  • the color index of the reaction mixture may be greater than or equal to the reference color index.
  • the color index of the reaction mixture may be less than or equal to the reference color index.
  • the color index of the reaction mixture may have to be the same as the reference color index. The following is an example. As the binding property of the target material and single-stranded nucleic acid improves, the reaction mixture approaches purple, and the value of E620/E520 increases.
  • the E620/E520 of the reaction mixture can be more than a specific E620/E520 so that the binding properties of the single-stranded nucleic acid can be more than a specific. Furthermore, when E620/E520 of the reaction mixture is less than or equal to the specific E620/E520, the selection process may be repeated again.
  • the reference color index may be a color index before the gold nanoparticles are aggregated. Furthermore, the reference color index may be a ratio of absorbance values measured at two wavelengths before the gold nanoparticles are aggregated.
  • This table of contents describes the additional process when the additional process is performed by the determination process.
  • the additional process may be to repeat the target material binding single-stranded nucleic acid selection process for the same target material. For example, when it is determined that the binding property of the single-stranded nucleic acid is not sufficiently improved, the selection process may be repeated to improve the binding property of the single-stranded nucleic acid.
  • the additional process may be to perform a single-stranded nucleic acid selection process for binding target materials to different target materials.
  • a single-stranded nucleic acid selection process for binding target materials to different target materials.
  • such an additional process may be employed.
  • the additional process may be to perform a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process with respect to the non-target material.
  • the present application provides a process for selecting a single-stranded nucleic acid having binding properties to a target material.
  • the above describes one process as a configuration of the selection process.
  • a process for selecting a target material binding single-stranded nucleic acid combining the above processes will be described.
  • the "target material binding single-stranded nucleic acid selection process” is a process according to the present application, and refers to a process of selecting a single-stranded nucleic acid having binding properties to a specific target material.
  • the left side of FIG. 1 exemplarily shows the target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • Target material binding single-stranded nucleic acid selection process prepares a gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library; Reacting the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library with the target material; And it may include separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material from the reaction mixture.
  • the basic form of the single-stranded nucleic acid selection process using gold nanoparticles can be seen in FIG. 2.
  • the target material binding single-stranded nucleic acid selection process is to isolate the single-stranded nucleic acid after separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material, and then separating the single-stranded nucleic acid and the target material. It may further include.
  • the target material binding single-stranded nucleic acid selection process according to the present application may further include amplifying the isolated single-stranded nucleic acid after separating the single-stranded nucleic acid bound to the target material.
  • An exemplary single-stranded nucleic acid selection process can be seen in FIG. 4.
  • the process of selecting a target substance-binding single-stranded nucleic acid according to the present application may further include determining whether to proceed with an additional process through the color index of the reaction mixture.
  • An exemplary single-stranded nucleic acid selection process can be seen in FIG. 5 (300).
  • an example in which the additional process is repeating the target material binding single-stranded nucleic acid selection process for the same target material (350') can be seen in FIG. 6.
  • the target substance binding single-stranded nucleic acid selection process according to the present application may be repeated a specific number of times. As the selection process is repeated, the binding property of the single-stranded nucleic acid to the target material will be improved.
  • An exemplary single-stranded nucleic acid selection process can be seen in FIG. 7.
  • the target material of the present application may be brassinolide or bisphenol A.
  • it is a compound having a structure similar to that of the target material.
  • environmental hormones have a structure similar to that of endocrine hormones in living bodies.
  • binding to a similar structure eg, endocrine hormone
  • this may adversely affect the purity of the screening process and side effects of the treatment method.
  • the non-target material may be different from the target material.
  • Non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process is a process according to the present application and refers to a process of selecting a single-stranded nucleic acid that is not bound to a specific non-target material.
  • the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process is performed similarly to the target material-binding single-stranded nucleic acid selection process comprehensively described above.
  • the target substance binding single-stranded nucleic acid selection process includes separating the single-stranded nucleic acid bound to the target substance from the reaction mixture.
  • the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process is different in that it involves separating the single-stranded nucleic acid not bound to the non-target material from the reaction mixture.
  • the right side of Figure 1 shows an example of a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • the single-stranded nucleic acid constituting the same may be a single-stranded nucleic acid selected by the target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • the reaction between the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library and the non-target material conforms to the above description.
  • the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid may be separated after applying a physical shock to the reaction mixture.
  • the reaction mixture may be phase-separated to separate non-target material non-binding single-stranded nucleic acids.
  • the isolated single-stranded nucleic acid has a smaller mass compared to the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid structure.
  • separating the single-stranded nucleic acid not bound to the non-target material may include centrifuging the reaction mixture, and then obtaining the remainder except the supernatant.
  • non-target material non-binding single-stranded nucleic acid isolation and amplification of non-target material non-binding single-stranded nucleic acid apply mutatis mutandis as described above.
  • the process of isolating the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid is different in that the single-stranded nucleic acid must be separated from the gold nanoparticles.
  • the single-stranded nucleic acid is isolated after separating the single-stranded nucleic acid and gold nanoparticles. It may contain more.
  • the single-stranded nucleic acid and gold nanoparticles may be separated by heating the reaction mixture. Further, the single-stranded nucleic acid and gold nanoparticles may be separated by heating the reaction mixture at 95°C.
  • the monitoring method of the process applies mutatis mutandis to the above-described contents.
  • this selection process as the process proceeds, the binding force of the single-stranded nucleic acid decreases, and the binding of the single-stranded nucleic acid and the gold nanoparticles will be maintained. Therefore, unlike the target material binding single-stranded nucleic acid selection process, in this separation process, the color of the reaction mixture changes from purple to red as the binding strength between the single-stranded nucleic acid and the non-target material decreases.
  • the reaction mixture becomes red and the value of E620/E520 decreases.
  • the E620/E520 of the reaction mixture may be less than or equal to a specific E620/E520 so that the binding property of the single-stranded nucleic acid may be less than or equal to a certain level.
  • the selection process may be repeated again.
  • Non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process prepares a gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library; Reacting the gold nanoparticle-single-stranded nucleic acid library with a non-target material; And separating a single-stranded nucleic acid that is not bound to a non-target material from the reaction mixture.
  • the basic form of the single-stranded nucleic acid selection process using gold nanoparticles can be seen in FIG. 8 (520).
  • the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process is after separating the single-stranded nucleic acid not bound to the non-target material, and then separating the single-stranded nucleic acid and gold nanoparticles, and It may further include isolating the nucleic acid.
  • the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process may further include amplifying the isolated single-stranded nucleic acid after separating the single-stranded nucleic acid that is not bound to the non-target material. have.
  • the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process may further include determining whether to proceed with the additional process through the color index of the reaction mixture.
  • the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process may be repeated a specific number of times. As the selection process is repeated, the binding property of the single-stranded nucleic acid to the non-target material will decrease.
  • the non-target material of the present application may be B-sitosterol or bisphenol S.
  • the present application provides a method for selecting single-stranded nucleic acids.
  • a selection process for a single-stranded nucleic acid having binding property to a target material or not having binding property to a non-target material has been described.
  • This table of contents provides a method for selecting the desired single-stranded nucleic acid by combining these processes. For example, by serially performing the target material binding single-stranded nucleic acid selection process and the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process according to the present application, it has binding to the target material and non-binding to the non-target material.
  • target material binding single-stranded nucleic acid selection process and “non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process” mentioned below include all of the specific examples and examples described above.
  • the single-stranded nucleic acid selection method may include a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • the method for selecting a single-stranded nucleic acid according to the present application may include a process for selecting a single-stranded nucleic acid binding to two or more target substances. For example, when two target substances are selected, the method for selecting a single-stranded nucleic acid according to the present application includes a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process for the first target substance; And a single-stranded nucleic acid selection process capable of binding a target material to a second target material. 2 to 7 show examples including a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • the single-stranded nucleic acid selection method according to the present application may include a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process.
  • the method for selecting a single-stranded nucleic acid according to the present application may include a process for selecting a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid for two or more non-target materials.
  • the single-stranded nucleic acid selection method may include a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process for the first non-target material; And it may include a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process for the second non-target material.
  • the method for selecting a single-stranded nucleic acid according to the present application includes a target substance binding single-stranded nucleic acid selection process; And it may include a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process. Through this, it is possible to select a single-stranded nucleic acid having a binding property to a target material and weak binding to a non-target material. In one example, after the target material binding single-stranded nucleic acid selection process is performed, the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process may be performed.
  • the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process may be performed.
  • the target material binding single-stranded nucleic acid selection process and the non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process may be alternately performed.
  • a target material binding single-stranded nucleic acid selection process may be performed, and thereafter, a target material binding single-stranded nucleic acid selection process may be performed.
  • the target material may be brassinolide, and the non-target material may be B-sitosterol.
  • the target material may be bisphenol A, and the non-target material may be bisphenol S. 8 shows examples including a target material binding single-stranded nucleic acid selection process 510 and a non-target material non-binding single-stranded nucleic acid selection process 520.
  • kits or apparatus for performing the method of selecting a single-stranded nucleic acid of the present application is provided.
  • the kit may be a micro play-based kit.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid prepared by the method for selecting a single-stranded nucleic acid.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid having binding properties to a target material.
  • the single-stranded nucleic acid may have binding properties to two or more types of target materials. That is, when there are two types of target materials, the single-stranded nucleic acid may have binding properties to the first target material and the second target material.
  • the target material may be brassinolide or bisphenol A.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid with weak binding to a non-target material.
  • the single-stranded nucleic acid may have weak binding to two or more types of non-target materials.
  • the non-target material may be B-sitosterol or bisphenol S.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid having binding properties to a target material and weak binding to a non-target material.
  • the single-stranded nucleic acid may have binding properties to a target material and relatively weak binding to a non-target material.
  • the target material and/or the non-target material may be of two or more types.
  • the target material may be brassinolide and the non-target material may be B-sitosterol, or the target material may be bisphenol A and the non-target material may be bisphenol S.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid having binding properties to brassinolide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and relatively weak binding to B-sitosterol.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid having binding properties to bisphenol A consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and relatively weak binding to bisphenol S.
  • the present application provides an improved single-stranded nucleic acid based on the single-stranded nucleic acid. Through the improvement of the single-stranded nucleic acid, it is possible to prepare a single-stranded nucleic acid having a small size and improved binding to the target material or similar.
  • the improvement of the single-stranded nucleic acid may be performed by truncating a part of the single-stranded nucleic acid selected by the single-stranded nucleic acid selection method.
  • An improved single-stranded nucleic acid can be prepared by cutting out a portion of the single-stranded nucleic acid that mainly binds to the target material.
  • the improvement of the single-stranded nucleic acid may be performed by mutating a part of the single-stranded nucleic acid selected by the single-stranded nucleic acid selection method.
  • the present application provides a single-stranded nucleic acid having a binding property to brassinolide having a base sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, and relatively weak binding to B-sitosterol.
  • the single-stranded nucleic acid according to the present application can be used for various purposes.
  • the single-stranded nucleic acid according to the present application may act as an inhibitor against a specific biomolecule.
  • the single-stranded nucleic acid according to the present application can be used for the treatment of diseases related to a specific biomolecule.
  • the single-stranded nucleic acid according to the present application may be used as a sensor or a measurement kit for detecting, quantifying, extracting, and purifying a target material.
  • the present application covers not only single-stranded nucleic acids, but also conventional uses of single-stranded nucleic acids (or aptamers) using them.
  • a pharmaceutical composition for treating a specific disease comprising a single-stranded nucleic acid according to the present application.
  • a pharmaceutical composition for treating a disease against bisphenol A comprising a single-stranded nucleic acid having binding capacity to bisphenol A.
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmaceutically acceptable additive.
  • a method for removing bisphenol A using a single-stranded nucleic acid having binding power to bisphenol A is provided.
  • a sensor for detecting a target material, including a single-stranded nucleic acid according to the present application is provided.
  • a kit for quantifying, extracting, or purifying a target substance, including a single-stranded nucleic acid according to the present application is provided.
  • a kit for quantifying, extracting, or purifying brassinolide comprising a single-stranded nucleic acid having binding to brassinolide is provided.
  • the kit may be a device for selecting a specific target material such as chromatography.
  • the sensor may be a diagnostic kit for diagnosing a specific disease.
  • Gold nanoparticles modified with a carboxyl group were synthesized to verify the protease activity assay according to the present invention.
  • Gold nanoparticles were synthesized by reducing and stabilizing with citric acid, according to a commonly known method.
  • 20 mL of gold tetrachloride (HAuCl 4 ⁇ 3H 2 O, Sigma-Aldrich) stock solution at a concentration of 1 mM was added to 50 mL of distilled water and stirred continuously to prepare a solution with a final concentration of 300 nM.
  • 2 mL of 30 mM sodium citrate C 6 H 5 Na 3 O 7 ⁇ 2H 2 O, Sigma-Aldrich
  • the solution was stirred while boiling.
  • Random ssDNA library was prepared so that the ratio of A, G, C, T bases was 1:1:1;1, and primer sites for DNA amplification were located at both ends of 3'and 5'.
  • Gold nanoparticles stabilized with citrate can adsorb most ssDNAs, but their affinity with some ssDNAs may be poor depending on the base composition of the sequence.
  • the ssDNA library was prepared in the following two ways at the beginning of Gold-SELEX. did.
  • the first method is to add an additional centrifugation process in the first 1-4 rounds. It corresponds to Brassinlide Gold-SELEX among the following examples.
  • the composition of gold nanoparticles 75ul, ssDNA 150nM, 1X phosphate buffered saline (1X, PBS is as follows: 0.137M Sodium chloride, 2.7mM Potassium chloride, 4.3mM, Sodium phosphate (dibasic, anhydrous), 1.4mM Potassium phosphate (monobasic) , anhydrous)) 20ul and distilled water are mixed so that the final volume is 190ul, and the nanoparticles and ssDNA are allowed to adhere for 10 minutes.
  • the second method can be performed before proceeding with the target material and the first positive SELEX process, and corresponds to Bisphenol A Gold-SELEX among the following examples.
  • a total of 190 ul of sample was prepared by mixing 75 ul of gold nanoparticles with 150 nM of ssDNA, 20 ul of 1X PBS, and distilled water, and the ssDNA and gold nanoparticles were bound at room temperature for 10 minutes. After centrifugation at 6500 g for 10 minutes, the sequence not bound to the nanoparticles in the supernatant was removed, and the remaining gold nanoparticles + ssDNA were diluted in 40ul of distilled water. Boil at 95° C.
  • Positive SELEX is a SELEX process that increases the binding power of the target and ssDNA.
  • a total of 190 ul of reactants were prepared by mixing 30 pmol of ssDNA library, 75 ul gold nanoparticles, 1X PBS, and distilled water, and reacted at room temperature for 10 minutes to allow the gold nanoparticles and ssDNA to adhere, and then the first photographing and absorbance measurement were performed. All pictures were taken at the same place and conditions with one built-in camera, and the absorbance was measured in a wavelength range of 500-800 nm in a transparent 96 well plate using a microplate reader.
  • 10ul of target was added to the desired concentration and reacted at room temperature for 10-30 minutes, and the concentration, time, and temperature of this process may vary depending on the type of target and the progress of SELEX.
  • 10 1M NaCl was added to the sample, and the color change was waited for 15 minutes. After the color change was stabilized, the last photo was taken and the absorbance was measured. After the photographing, the sample was transferred to a 1.5 ul microtube and centrifuged at 6500 g for 10 minutes to take only the supernatant containing ssDNA+target.
  • the ssDNA obtained from the supernatant was separated from the target through ethanol precipitation. 20ul of 3M sodium acetate and 660ul of cold (stored at -20°C) 100% ethanol were added to the sample and reacted at -20°C for 30 minutes. The supernatant was discarded by centrifugation at 14000 rpm for 20 minutes, and 1 mL of cold 70% ethanol was added to wash the DNA pellet, followed by further centrifugation for 15 minutes. After removing all the supernatant and drying the pellet at room temperature for 10 minutes, 40ul of distilled water was added to dissolve the DNA. The ssDNA obtained through this process was amplified through polymerase chain reaction (PCR) and used in the next round.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Negative SELEX was also conducted to increase the specificity of the selected aptamer by lowering the binding power of ssDNA and counter target.
  • the third photographing and measurement process is the same as the positive SELEX.
  • 9 and 10 are Gold-SELEX results of selecting DNA aptamers that bind to brassionlide (BL), a kind of plant-derived steroid hormone.
  • BL brassionlide
  • the structures of the target material (bracinoleide) and the non-target material (B-sitosterol) are shown in Structural Formulas 1 and 2, respectively.
  • 9 and 10 are results of monitoring the entire process of SELEX by color change of gold nanoparticles.
  • the color change was measured as the ratio of the absorbance at 620nm and the absorbance at 520nm, and as the DNA binding power with the target or counter target increases, the gold nanoparticles after adding salt change from red to purple to blue.
  • the absorbance at 520 nm is lowered and the absorbance at 620 nm is increased, so that the value of E620/E520 is increased.
  • 11 and 12 are Gold-SELEX results of selecting a DNA aptamer that binds to bisbenol A (BPA) (Structural Formula 3), which is a kind of endocrine disrupting substance (environmental hormone).
  • BPA bisbenol A
  • a total of 11 rounds of SELEX for BPA were conducted, and consist of one positive SELEX and negative SELEX.
  • the target material and the non-target material were bisphenol A (structural formula 3) and bisphenol S (structural formula 4), respectively.
  • 11 and 12 are results of monitoring the entire SELEX process using the absorbance ratio at 620nm and 520nm. All measurements were performed in the same manner as BL SELEX.
  • the BL SELEX round 9 product and the 11 round product of BPA SELEX were amplified by PCR for sequence confirmation, followed by t-vector cloning and transformed into Dh5a competent cells. After 50-100 colonies were taken, the plasmid was prep and sequenced with the T7 promoter. As a result, the sequences with high similarity and high frequency of appearance were mainly analyzed, and the results are shown in the table below.
  • FIGS. 13 to 15 are the results of confirming the binding strength and specificity of the aptamer with respect to the target and counter targets of the aptamer selected for BL and Figures 16 to 18 for BPA.
  • Figure 13 is the secondary structure of the finally selected BL aptamer BLA9-20
  • Figure 16 is the secondary structure of the finally selected BPA aptamer nBPA40. Both structures are predicted and selected as sequences with the highest thermodynamic stability from the mfold web server (M. Zuker. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415, 2003.) Became.
  • the absorbance ratio E620/E520 measured in FIGS. 14 and 17 is ((Ext. Ratio when the analyte entered)-(Ext.Ratio when there is no analyte))/(When the analyte is not present. Ext.Ratio) was normalized. Standard reagents by concentration were prepared by diluting by concentration before the experiment, and diluted in 100% ethanol.
  • the structures of the materials used in the experiments of FIGS. 14 and 15 are shown in the lower part of FIG. 15, and all are intermediate products of the process of biosynthesis of BL in plants.
  • the types and structures of materials used in FIGS. 17 and 18 are shown at the bottom of FIG. 18.
  • the target detection ability of the two known BPA DNA aptamers selected by different SELEX methods and the new aptamer sequences selected as Gold-SELEX was compared by the gold nanoparticle colorimetric method, and the base sequence of the two aptamers was confirmed by the multi-align method. I did.
  • nBPA40 an aptamer selected as Gold-SELEX
  • nBPA40 an aptamer selected as Gold-SELEX
  • 22 to 25 are results of comparing the binding force with brassinolide by improving the BLA9-20 aptamer.
  • a truncated aptamer (tBLA9-20v1, 29 bp in total, SEQ ID NO: 17), which was constructed by cutting only the marked portion from BLA9-20 (total 60 bp), and a truncated pressure formed by adding a single base pair It was prepared with a timer (tBLA9-20v2, total 31 bp, SEQ ID NO: 18).
  • the secondary structure of tBLA9-20v1 and tBLA9-20v2 before and after treatment with brinolide was compared using circular dichroism (CD). In the case of tBLA9-20v1, the secondary structure was changed after the binding of brinolide. , In the case of tBLA9-20v2, it can be seen that there is no change in the secondary structure (FIGS. 24 and 25 ).
  • FIG. 26 shows that a bricinolide detection method using an aptamer can be detected using an aptamer precipitation method similar to immunoprecipitation using an antibody. That is, the surface of microbeads coated with avidin can be washed after reacting with biotin- aptamer (biotin-tBLA9-20v2) and Arabidopsis extract containing different concentrations of brassinolide. The brassinolide contained in the Arabidopsis thaliana extract is strongly bound to the bead surface. After the brassinolide bound to the aptamer is effectively extracted by treatment with final ethanol, it can be quantified by a gold nanoparticle colorimetric method.
  • biotin-tBLA9-20v2 biotin-tBLA9-20v2
  • Arabidopsis extract containing different concentrations of brassinolide.
  • the brassinolide contained in the Arabidopsis thaliana extract is strongly bound to the bead surface. After the brassinolide bound to the
  • Figure 27 shows the actual wild-type Arabidopsis extract (WT, wild-type Arabidopsis) and a mutant Arabidopsis extract (Sdet2, BL-deficient mutant Arabidopsis) grown in a medium in which brassinolide biosynthesis is inhibited, and brassinolide in the wild-type Arabidopsis
  • WT+BL wild-type Arabidopsis with BL-rich media
  • Sdel2 was relatively small and WT-BL was very high compared to wild-type Arabidopsis. It was confirmed that quantitative analysis was possible by indicating the color development range.

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Abstract

표적분자(핵산, 지질, 당, 단백질, 펩타이드 등의 생체분자나 호르몬, 저분자 화학물질, 독성물질, 이온 등을 모두 포함)를 인식하는 DNA/RNA 압타머를 선별하기 위해서는 Systematic Evolution of Ligand Exponential Enrichment (SELEX) 과정을 수반한다. 일반적으로 SELEX를 수행하기 위해서는 표적분자를 기판이나 비드 표면에 고정시키는 과정이 필수적으로 요구된다. 또한 SELEX과정의 각 round에서 실제 압타머 라이브로리가 표적물질과 잘 결합하고 있는지에 대해 관찰할 수 있는 positive/negative 모니터링이 불가능하기 때문에 수회에 걸친 round이후 선별된 압타머를 분석함으로써 SELEX과정이 올바르게 진행되고 있는지를 간접적으로 확인하고 있다. 이러한 종래의 문제점들을 획기적으로 해결함과 동시에 보다 손쉽고 간편한 SELEX 기법을 구성하기 위해, 본 발명에서는 금나노입자를 이용한 새로운 SELEX 기법을 제시하고자 한다.

Description

금나노입자-SELEX에 기초한 표적특이적 압타머 선별법
본 발명은 압타머의 선별 방법에 관한 것이다. 압타머는 목적 물질에 대하여 특이적인 결합 능력을 갖는 폴리뉴클레이티드 분자로서, 단백질 센서, 나노센서 등에 활용될 수 있다. 기존 압타머의 선별 방법은 스크리닝 과정에서 많은 시간이 소요되어 어느 효능 이상의 압타머를 수득하기 위하여 오랜 시간이 걸리는 문제가 있다.
Systemic Evolution of Ligand Exponential Enrichment (SELEX) 기술은 목적 물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 선별하기 위한 기술로서, 무작위 서열의 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생성하고 증폭시킨 후 목적 물질과 결합된 압타머를 분리하는 방법이다.
양적 SELEX (positive SELEX)는 SELEX 과정을 여러번 반복하여 목적 물질에 대한 높은 특이성을 갖는 압타머의 순도를 높이는 과정이다.
음적 SELEX (negative SELEX)는 SELEX 공정에 쓰이는 시료 또는 목적 물질과 상동성을 갖는 물질에 대하여 결합 능력을 갖는 압타머를 함으로써 목적 물질에 대하여 선택적인 특이성을 갖는 압타머를 선별하는 과정이다.
압타머는 타겟에 특이적으로 결합할 수 있다는 점에서 항체와 쓰임이 비슷하다. 그러나 in vitro에서 실험자가 원하는 표적물질에 대해 인공적으로 합성된 핵산 라이브러리로부터 선정할 수 있다는 점에서 압타머는 항체가 개발될 수 없는 다양한 범위의 타겟에 대해 용도에 맞게 개발될 수 있다. 압타머를 선정하기 위해서는 일반적으로 SELEX (Nature, 1990, 346, 818-822) 라는 스크리닝 방식이 사용되는데 이는 10-20 round 정도가 반복되며, 타겟과 라이브러리의 결합, 결합하지 않은 서열의 세척, 타겟과 결합한 서열의 해리, 해리된 서열의 증폭 과정으로 이루어져 있다. 일부 타겟의 경우 세척과정을 위해 타겟을 modification 하여 표면에 고정시키는 과정이 필요하며, SELEX round가 완료된 이후에는 선정된 압타머의 성능을 개선시키기 위한 post-SELEX과정이 필요하다. 또한, SELEX round 진행 중 3-5라운드 완료마다 monitoring이 수반되어야 한다. 그러므로 압타머를 선정하기 위해서는 최소 수개월의 시간이 필요하다.
압타머 선정과정을 간소화하고 더 나은 압타머를 선정하기 위해 SELEX를 변형시키는 다양한 방법들이 보고되어 있다. Graphene oxide를 사용하여 타겟을 표면에 고정하지 않고 압타머를 선정할 수 있는 GO-SELEX(Chem. Commum, 2012, 48, 2071-2073), click chemistry를 이용하여 post-SELEX 과정을 간소화할 수 있는 Click-SELEX(Nature Protocols, 2018, 13, 1153-1180) 등이 대표적이다. 그러나 모니터링은 여전히 SELEX에서 중요 과제이며, 이는 실험자가 SELEX round가 진행되는 동안은 압타머가 원하는 방향으로 선정되고 있는지 확인할 수 없기 때문이다. SELEX 과정 안에는 라이브러리를 증폭하는 PCR 에서의 오류, target의 낮은 순도, 과한 selective pressure 등 SELEX가 실패할 수 있는 변수들이 다수 포함되어 있으므로 모니터링은 SELEX의 진행 경과를 판단하기 위해 필수적이다.
본 출원은 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함; 상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 타겟물질을 반응시킴; 상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함; 및 상기 반응혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 반응 진행 여부를 결정함을 포함하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
나아가, 본 출원은 상기 금 나노입자-단일 가닥 핵산 라이브러리를 준비함은, 시트르산에 의한 환원 및 안정화에 의하여 금 나노입자를 준비함; 단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함; 상기 금 나노입자와 상기 단일가닥 핵산 라이브러리를 반응시킴; 및 상기 금 나노입자와 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 제거함을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 금 나노입자는 15nm 내지 50nm의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함은, 상기 반응혼합물을 원심분리 한 후 상청액을 수득함을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후, 단일가닥 핵산과 상기 타겟물질을 떼어낸 후 상기 단일가닥 핵산을 단리함을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다. 더 나아가, 본 출원은 상기 단일가닥 핵산을 단리함은 에탄올 침전을 수행함을 포함하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후, 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 증폭함을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 반응 혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 반응 진행 여부를 결정함은, 상기 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함; 상기 반응 혼합물의 색상 지표를 기준 색상 지표와 비교함을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다. 더 나아가, 본 출원은 상기 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함에 앞서, 상기 금 나노입자가 응집 되도록 유도함을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다. 다시 더 나아가, 본 출원은 상기 금 나노입자가 응집되도록 유도함은 상기 반응혼합물에 염을 첨가함을 포함하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 반응 혼합물의 색상 지표는 금나노입자가 응집되기 전 2개의 파장에서 측정한 흡광도 값들의 비율과 응집된 이후의 동일한 2개의 파장에서 측정한 흡광도 값들의 비율로서 정량화하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다. 더 나아가, 본 출원은 상기 반응 혼합물의 색상 지표는 E620/E520인 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다. 흡광도를 측정하기 위한 파장은 금 나노입자의 크기에 따라 다르게 선택될 수 있고 응집 변화를 나타내기 위한 흡광도 간의 비율은 역수로서 사용될 수도 있다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 반응 혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 반응 진행 여부를 결정한 후, 상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함이 순차적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후, 이의 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비하여 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 특정 횟수 반복하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 타겟물질은 브라시놀리드, 또는 비스페놀 A를 포함한 금나노입자의 응집을 유도할 수 있는 저분자 물질, 이온, 단백질, 핵산, 바이러스, 미생물군을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
또는 나아가, 본 출원은 상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함, 및 상기 반응혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 반응 진행 여부를 결정함 이후, 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산의 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함; 상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 논타겟물질을 반응시킴; 상기 반응혼합물로부터 논타겟물질과 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 분리함을 더 포함하고, 이때, 상기 타겟물질과 상기 논타겟물질은 서로 다른 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다. 더 나아가, 본 출원은 상기 타겟물질은 브라시놀리드이고 상기 논타겟물질은 B-시토스테롤이거나, 또는 상기 타겟물질은 비스페놀 A이고 상기 논타겟물질은 비스페놀 S인 것을 특징으로 하는 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다.
본 출원은 서열번호 1 내지 4, 17 및 18로부터 선택된 하나의 염기서열로 구성되고, 브라시놀리드에 대한 결합성을 가지며, B-시토스테롤에 대한 결합성이 상대적으로 약한 단일가닥 핵산을 제공한다. 나아가, 본 출원은 서열번호 1, 17 및 18로부터 선택된 하나의 염기서열로 구성되고, 브라시놀리드에 대한 결합성을 가지며, B-시토스테롤에 대한 결합성이 상대적으로 약한 단일가닥 핵산을 제공한다.
본 출원은 서열번호 5 내지 16으로부터 선택된 하나의 염기서열로 구성되고, 비스페놀 A에 대한 결합성을 가지며, 비스페놀 S에 대한 결합성이 상대적으로 약한 단일가닥 핵산을 제공한다. 나아가, 본 출원은 서열번호 8의 염기서열로 구성되고, 비스페놀 A에 대한 결합성을 가지며, 비스페놀 S에 대한 결합성이 상대적으로 약한 단일가닥 핵산을 제공한다.
본 출원은 서열번호 1, 17 및 18로부터 선택된 하나 이상의 염기서열로 구성된 단일가닥 핵산을 포함하는 브라시놀리드를 정제하기 위한 키트를 제공한다.
본 출원은 서열번호 1 내지 4, 17 및 18로부터 선택된 하나의 염기서열로 구성된 단일가닥 핵산을 포함하는 브라시놀리드를 정제하기 위한 키트를 제공한다. 나아가, 본 출원은 서열번호 1, 17 및 18로부터 선택된 하나의 염기서열로 구성된 단일가닥 핵산을 포함하는 브라시놀리드를 정제하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 복잡한 측정 장비가 필요없으며, 나노입자의 색깔 변화만으로 간단하게 SELEX의 진행 상황을 단시간내에 확인할 수 있는 방법이다. 지금까지 금 나노입자의 비색법에 의한 측정법 (예. DNA검출, 단백질 검출, 중금속 이온, 면역측정법 등)은 널리 수행되어왔으나, 나노입자의 색상 변화를 통한 압타머의 선정 과정을 모니터링 하는 방법은 보고된 바가 없다. 본 기술에서 ssDNA와 타겟물질 간의 결합력이 높을 경우, 금 나노입자는 염을 만났을 때 나노입자 표면이 변성이 되어 응집이 발생하고, 응집과정에서 금 나노입자는 색깔 변화를 유도하게 된다. 이는 나노입자 크기에 따른 표면 플라즈몬 및 빛의 산란 정도가 변화하기 때문에 발생하는 현상이다. 즉, 일반적인 금 나노입자의 경우 적갈색을 띄고 있으나, 응집 시에는 입자 크기가 커지고 보다 큰 파장을 산란하게 되어 금 나노입자가 녹아 있는 용액의 색깔이 그 크기에 따라 보라색, 푸른색, 잿빛 등으로 변하게 된다. 반면에, ssDNA와 타겟의 결합력이 약할 시에는 위와 같은 금 나노입자의 응집이 억제가 되어 색깔 변화가 덜 발생하게 해당 SELEX라운드에서의 ssDNA pool과 타겟과의 결합력을 색깔의 변화를 통해 신속하고 빠르게 분석 할 수 있다. 용액 내 금 나노입자 색깔의 변화는 간단한 흡광분석만으로 손쉽게 정량이 가능하며, 매 라운의 마지막에 염을 추가하여 쉽게 모니터링이 가능하기 때문에 기존 방법에 비해 보다 효과적인 SELEX 과정 평가가 가능하다.
진술한 바와 같이, 금 나노입자의 단일가닥 DNA에 대한 친화력과 염으로 인한 응집현상을 활용하면 보다 신속하고 간편하게 SELEX과정을 분석하고 모니터링 할 수 있다. 특히 별도의 monitoring 과정이 필요하지 않고, 기존의 SELEX와 비교하였을 때 금나노입자의 색 변화만으로 진행 수준을 판단하여 압타머 선정 과정을 유연하고 실험자 편의에 맞게 진행 할 수 있다. 또한 SELEX를 하기 위해 타겟을 화학적으로 modification 할 필요가 없는 labeling-free 방식으로서, 원하는 타겟의 원형 그대로 압타머 선정을 진행할 수 있다. 이를 이용하면 관심 물질에 대한 압타머 선정이 간편해질 뿐만 아니라 선정된 압타머를 이용한 타겟 이미징, 의료 진단, 환경 또는 식품분야에서의 독성 센싱, 타겟 특이적 약물 전달 치료 등에 광범위하게 활용하여 발전을 기대할 수 있다.
도 1은 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법을 나타낸 개요도이다.
도 2는 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정의 예시 1이다.
도 3은 예시적인 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리 준비 과정이다.
도 4는 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정의 예시 2이다.
도 5는 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정의 예시 3이다.
도 6는 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정의 예시 4이다.
도 7은 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정의 예시 5이다.
도 8은 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법의 예시로서, 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정과 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함하는 것이다.
도 9는 브라시놀리드에 결합하는 단일가닥 핵산을 선정한 선택 과정의 중간에 측정된 색상 지표 (E620/E520)이다.
도 10은 브라시놀리드에 결합하는 단일가닥 핵산을 선정한 선택 과정의 중간에 촬영한 반응혼합물의 사진이다.
도 11은 비스페놀 A에 결합하는 단일가닥 핵산을 선정한 선택 과정의 중간에 측정된 색상 지표 (E620/E520)이다.
도 12는 비스페놀 A에 결합하는 단일가닥 핵산을 선정한 선택 과정의 중간에 촬영한 반응혼합물의 사진이다.
도 13은 브라시놀리드와 결합하는 단일가닥 핵산 BLA8-20의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 14는 본 출원에 의한 방법에 의하여 선택된 단일가닥 핵산과 브라시놀리드 및 이의 논타겟물질들의 결합력을 측정한 것이다.
도 15는 본 출원에 의한 방법에 의하여 선택된 단일가닥 핵산과 브라시놀리드 및 이의 논타겟물질들을 반응시킨 반응혼합물의 사진이다.
도 16은 비스페놀 A와 결합하는 단일가닥 핵산 nBPA40의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 17은 본 출원에 의한 방법에 의하여 선택된 단일가닥 핵산과 비스페놀 A 및 이의 논타겟물질들의 결합력을 측정한 것이다.
도 18은 본 출원에 의한 방법에 의하여 선택된 단일가닥 핵산과 비스페놀 A 및 이의 논타겟물질들을 반응시킨 반응혼합물의 사진이다.
도 19는 단일가닥 핵산 nBPA40과 기존에 발표된 압타머의 비스페놀 A에 대한 결합력을 비교 측정한 것이다.
도 20은 단일가닥 핵산 nBPA40 및 기존에 발표된 압타머를 비스페놀 A와 반응시킨 반응혼합물의 사진을 비교 촬영한 것이다.
도 21은 단일가닥 핵산 nBPA40과 기존에 발표된 압타머 사이의 서열 유사성을 비교한 결과이다.
도 22는 단일가닥 핵산 BLA9-20과 이를 절단하여 제조한 개량된 단일가닥 핵산을 나타낸 것이다.
도 23은 tBLA-v1과 tBLA-v2의 브라시놀리드에 대한 결합력을 측정한 결과이다.
도 24는 tBLA-v1과 브라시놀리드의 결합 후의 2차 구조의 변화를 측정한 것이다.
도 25는 tBLA-v2와 브라시놀리드의 결합 후의 2차 구조의 변화를 측정한 것이다.
도 26은 압타머를 이용한 브라시놀리드 검출 방법을 나타낸 예시이다.
도 27은 서로 다른 브라시놀리드 농도를 포함하는 애기장대 추출물로부터 브라시놀리드의 양을 정량한 실험 결과이다.
정의
본 출원의 용어 "반응 (react, reacting, and to react)"은 반응물이 상호작용할 수 있도록 혼합, 첨가 등을 통하여 인접하게 함, 및/또는 이에 의한 현상을 의미한다. 본 출원에 의한 반응은 그 결과가 반응물의 물리 변화, 화학 변화인 것을 불문한다.
본 출원의 용어 "핵산" 및 "단일가닥 핵산 (single-stranded nucleic acid)"은 통상적으로 알려진 정의에 따른다. 특히, 본 출원에 의한 핵산의 선택 방법 및 이로 인해 선택된 핵산은 핵산의 종류에 무관하게 확장될 수 있는 개념이므로, 본 출원의 핵산은 DNA, RNA 뿐 아니라 당시의 통상적 기술 수준으로 이해할 수 있는 것들을 모두 포함하는 개념으로 의도되었다.
본 출원의 용어 "핵산 라이브러리 (nucleic acid library)"는 서로 다른 적어도 두 종의 핵산의 모음을 의미한다. "단일가닥 핵산 라이브러리"란 서로 다른 적어도 두 종의 단일가닥 핵산의 모음을 의미한다. 본 출원에 의한 핵산 라이브러리는 핵산이 미생물 내에 들어있는 형태, 특별한 제형 (미셀, 리포좀 등)에 포함된 형태, 별다른 제형이 없이 분산된 형태 등 그 형태를 불문한다.
"타겟물질 (target substance)"은 본 출원의 목적인 특정 물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택에 있어, 상기 특정 물질을 의미한다. "논타겟물질 (nontarget substance)"은 단일가닥 핵산을 선택함에 있어, 상기 단일가닥 핵산이 결합하지 않도록 의도되는 물질을 의미한다. 상기 타겟물질 및 논타겟물질은 저분자 물질 (small molecule), 이온, 단백질, 핵산, 바이러스, 미생물군 등 그 형태를 불문한다.
본 출원의 용어 "반응 혼합물," "반응 결합물" 등은 특정 방법의 단계를 설명함에 있어, 해당 단계에서의 혼합물의 상태를 지칭하기 위한 것이다. 즉, 해당 단계를 수행하기 전 이미 진행된 반응, 단계 등에 의하여 만들어진 시계열적 결과물 그 자체를 지칭하기 위한 용어로서, 특정 조성, 및 구성에 구애 받기 위한 것이 아니다.
금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리의 준비
개요
본 출원은 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리의 준비 방법을 제공한다. "금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리"는 금 나노입자와 단일가닥 핵산이 인접한 위치관계를 가짐으로써 형성되고, 이때 형성되는 상기 금 나노입자와 단일가닥 핵산의 조합이 적어도 두가지 이상일 때 이의 모음을 의미한다.
일 구체예에서, 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리의 준비 방법은 금 나노입자와 단일가닥 핵산 라이브러리를 반응시킴을 포함할 수 있다. 금 나노입자와 단일가닥 핵산 라이브러리는 반응을 통해 결합하여 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 형성한다. 이때, 결합은 정전기력 등의 물리적 힘, 또는 화학 결합 등을 통한 것 등 종류를 불문한다. 일 예시에서, 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리는 금 나노입자 주위에 단일가닥 핵산이 흡착된 것일 수 있다. 다른 예시에서, 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리는 금 나노입자에 단일가닥 핵산이 화학적 결합할 수 있다.
금 나노입자의 준비
본 출원의 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리의 준비 방법은 금 나노입자를 준비함을 포함할 수 있다. 이때, 금 나노입자의 준비 방법은 통상적으로 알려진 금 나노입자의 준비 방법에 의할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원의 금 나노입자는 시트르산으로 안정화되어 ssDNA와 친화력이 있는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 본 출원의 금 나노입자는 15nm 내지 50nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 본 출원의 금 나노입자는 시트르산에 의한 환원 및 안정화에 의하여 제조될 수 있다.
단일가닥 핵산 라이브러리의 준비
본 출원의 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리의 준비 방법은 단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함을 포함할 수 있다. 이때, 단일가닥 핵산 라이브러리의 준비 방법은 통상적으로 알려진 핵산 라이브러리의 준비 방법에 의할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원의 단일가닥 핵산 라이브러리는 DNA 합성기 (DNA synthesizer), 에러-프론 PCT (error-prone PCR), 돌연변이 유도 등에 의하여 제조될 수 있다. 일 구체예에서, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 공정을 거친 단일가닥 핵산을 단일가닥 핵산 라이브러리로 사용할 수 있다.
추가 과정
본 출원에 의한 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리의 준비 방법은 상기 언급된 것들 외에 추가 과정을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 준비 방법은 금 나노입자와 단일가닥 핵산 라이브러리를 반응시킨 후, 상기 금 나노입자와 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 제거함을 포함할 수 있다. 일부 단일가닥 핵산은 본성에 의하여 금 나노입자와 잘 결합하지 못할 수 있다. 라이브러리에 이들이 포함되는 경우, 이하 단일가닥 핵산의 선택과정에서 잘못된 결과를 가져올 수 있다. 예를 들어, 하기 단일가닥 핵산의 선택 과정에서, 이들은 타겟물질과 반응하지 않지만 단일가닥 핵산의 형태로 분리되어 불순물이 된다. 또한, 하기 비색반응을 통한 모니터링 과정에서 의도치 않게 금 나노입자로부터 해리되어 혼합물의 색상 지표의 오차로 작용한다.
따라서, 미리 라이브러리에 선택 과정에서 노출될 수 있는 물리적 충격을 가함으로써 (원심분리 등) 오차로 작용할 수 있는 단일가닥 핵산을 제거할 수 있다. 이의 일 예시에서, 상기 금 나노입자와 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 제거함은 상기 반응결과물을 원심분리한 후 상층액을 버리고 나머지를 취함을 포함할 수 있다. 이때, 상기 원심분리는 3000 내지 9000g로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 원심분리는 6500g로 수행될 수 있다. 또는, 상기 원심분리는 5분 내지 20분 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 원심분리는 10분 동안 수행될 수 있다. 또는, 상기 금 나노입자와 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 제거함은 상기 반응결과물을 원심분리한 후 상층액을 버림을 특정 횟수 반복함을 포함할 수 있다.
금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 타겟물질의 반응
상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 타겟물질을 반응시킴으로써 타겟물질과 결합하는 단일가닥 핵산 (이하 "타겟물질 결합성 단일가닥 핵산")을 검출할 수 있다. 이는 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산은 금 나노입자와의 상호작용이 변화하기 때문이다 (예를 들어, 분리될 수 있음). 일 구체예에서, 상기 반응은 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 타겟물질을 혼함함을 포함할 수 있다.
타겟물질 결합성 단일가닥 핵산의 분리 (separating target substance binding single-stranded nucleic acid)
본 목차는 상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리가 타겟물질과 반응한 후, 반응을 일으킨 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산을 분리하는 방법을 설명하기 위한 것이다.
위에서 설명했듯이, 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산은 금 나노입자와의 상호작용이 변화하고, 타겟물질과 반응하지 않은 단일가닥 핵산은 금 나노입자와의 결합을 유지한다. 따라서 상기 반응혼합물에 물리적 충격 또는 화학적 조작을 가함으로써 이들 단일가닥 핵산을 분리할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 반응혼합물에 물리적 충격을 가하여 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산을 분리할 수 있다. 일 예시에서, 상기 반응혼합물을 상 분리하여 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산을 분리할 수 있다. 분리된 단일가닥 핵산은 금 나노입자-단일가닥 핵산 구조에 비하여 질량이 작다. 구체적인 예시에서, 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함은, 상기 반응혼합물을 원심분리한 후 상청액을 수득함을 포함할 수 있다.
타겟물질 결합성 단일가닥 핵산의 단리 (isolating target substance binding single-stranded nucleic acid)
본 출원에 의한 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법은 선택적으로 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산을 단리함을 포함할 수 있다. 상기 단리함이란, 타겟물질과 결합된 단일가닥 핵산 형태로부터 단일가닥 핵산을 떼어낸 후 이를 단리하는 것을 의미한다. 이는 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후, 단일가닥 핵산과 상기 타겟물질을 떼어낸 후 상기 단일가닥 핵산을 단리함으로써 수행될 수 있다.
이때, 상기 단일가닥 핵산의 단리는 통상적으로 쓰이는 방법들에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 분리된 단일가닥 핵산을 단리함은 에탄올 침전을 수행함을 포함할 수 있다.
타겟물질 결합성 단일가닥 핵산의 증폭
본 출원에 의한 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법은 선택적으로 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산을 증폭함을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 증폭된 서열의 순도를 높이기 위하여 위에 설명된 것처럼 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후, 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 증폭할 수 있다.
단일가닥 핵산의 증폭은 PCR, 핵산의 인공 합성 등 통상적인 방법을 모두 활용할 수 있다.
금 나노입자의 특성: 비색반응과 선택 과정의 모니터링
이하에서 설명되는 바와 같이 금 나노입자는 본 출원에 의한 선택 과정을 모니터링할 수 있는 유용한 특성을 가지고 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법은 비색법을 통한 모니터링 과정을 포함할 수 있다.
금 나노입자의 응집과 비색반응
금 나노입자는 입자의 크기에 따라 빛의 흡수 스펙트럼이 변화함으로써 관측되는 물성이 변하는 특징을 갖는다. 대표적으로, 입자가 커지면 금 나노입자를 포함하는 혼합물은 붉은색에서 보라색으로 변한다. 금 나노입자는 비색센서 (colormetric sensor) 기술에 사용되는 바 있다.
입자의 크기가 변하는 이유는 금 나노입자가 응집하기 때문이다. 본 출원에 의한 금 나노입자-단일가닥 핵산 구조는 표면에 전하를 띄어 척력에 의해 분산된 형태를 유지한다. 금 나노입자-단일가닥 핵산 구조로부터 단일가닥 핵산이 분리되고, 금 나노입자 표면의 전하가 극복되면 금 나노입자가 서로 응집하게 된다. 대표적으로 금 나노입자 용액에 염을 첨가하는 경우 염유도 응집 (salt-induced aggregation)이 일어나는 것으로 알려져있다. 이러한 금 나노입자의 물성은 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법에 있어 선택 과정의 모니터링에 유용하게 활용될 수 있다.
금 나노입자를 포함하는 혼합물의 색상 지표 (colormetric index)
"색상 지표 (color index)"는 특정 대상의 광학적 특성을 표현할 수 있는 수치를 의미한다 (예를 들어, 파장, 굴절율, 주파수, 에너지, 흡광도, 또는 반사율 등). 본 출원에 의한 선택 과정에 있어 생성되는 금 나노입자를 포함하는 혼합물은 특정한 색상을 띈다. 즉, 해당 혼합물에 포함된 금 나노입자의 평균 직경에 따라 붉은색에서 보라색의 색상을 띄게 된다 (입자가 작은 것부터 커질 수록). 금 나노입자의 평균 직경은 금 나노입자의 응집에 의하여 변화할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법은 Au 나노입자가 응집되도록 유도함을 더 포함할 수 있다. 이때 나아가, 상기 Au 나노입자가 응집되도록 유도함은 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함에 앞서 수행될 수 있다.
일 예시에서, 상기 혼합물에 염을 첨가하여 염유도 응집을 유도할 수 있다. 이때 금 나노입자가 금 나노입자-단일가닥 핵산 구조의 형태이면 염과 금 나노입자가 반응하지 않아 제대로 응집되지 않는다. 그러나 금 나노입자가 단일가닥 핵산과 분리된 형태이면 (예컨데, 타겟물질과의 반응에 의하여) 염과 금 나노입자가 반응하여 금 나노입자가 응집된다. 응집되는 정도는 단일가닥 핵산이 얼마나 분리되었는지에 따라 달라질 것이다. 응집된 입자의 크기에 따라 변화한 색상 지표를 확인하면 선택 과정을 모니터링할 수 있다.
일 예시에서, 혼합물의 색상 지표는 혼합물의 흡광도일 수 있다. 나아가, 혼합물의 색상 지표는 흡광곡선의 특정 파장값의 비율일 수 있다. 일 예시에서, 혼합물의 색상 지표는 혼합물의 사진 (photograph)으로부터 추출될 수 있다.
색상 지표를 통한 추가적 과정 진행 여부 판단
1) 개요
본 출원은 단일가닥 핵산의 선택 과정 중, 반응혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 과정의 진행 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 위에서 설명된 금 나노입자의 특성에 의하여 선택 과정의 모니터링이 가능하다. 또한 이를 통해 추가적인 과정이 진행되어야 하는지 판단할 수 있다. 예를 들어, 단일가닥 핵산이 목적한만큼 선택되지 않았다고 판단되는 경우, 추가적인 선택 과정을 거칠 수 있다. 금 나노입자는 별다른 조작없이 광학적으로 선택 과정을 모니터링할 수 있는 장점을 갖는다.
본 출원의 선택 과정에 의하면, 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리에 포함된 단일가닥 핵산과 타겟 물질이 잘 반응할수록, 금 나노입자로부터 단일가닥 핵산이 많이 분리된다. 금 나노입자의 표면이 더 많이 노출되므로 금 나노입자가 더 잘 응집된다. 이때, 혼합물의 색은 입자가 작을 때 빨간색에서, 입자가 클 때 보라색으로 변화한다. 즉, 단일가닥 핵산의 타겟에 대한 결합성이 개선될수록, 응집 유도된 혼합물의 색은 보라색에 가까워진다.
2) 공정 내 순서
일 구체예에서, 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함; 및 상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 타겟물질을 반응시킴 이후 상기 반응혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 과정의 진행 여부를 결정함을 더 수행할 수 있다. 이때, 상기 추가적인 과정의 진행 여부를 결정하는 과정은 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함의 전 또는 후에 수행될 수 있다. 일 예시에서, 상기 반응 혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 과정의 진행 여부를 결정함이 진행된 후, 상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함이 수행될 수 있다. 도 5는 추가적인 반응 진행 여부를 결정함을 포함하는 예시적인 단일가닥 핵산의 선택 과정의 흐름도를 나타낸 것이다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 반응 혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 과정의 진행 여부를 결정함에 앞서, 금 나노입자가 응집되도록 유도함이 수행될 수 있다. 일 예시에서, 상기 금 나노입자가 응집되도록 유도함은 상기 반응 혼합물에 염을 첨가함을 포함할 수 있다. 이때, 상기 염은 NaCl일 수 있다.
3) 결정 방법
반응 혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 과정의 진행 여부를 결정할 수 있다. 색상 지표를 통하여 선택 과정이 얼마나 진행되었는지 정성적, 정량적으로 알 수 있기 때문이다. 일 구체예에서, 반응 혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 과정의 진행 여부를 결정함은, 상기 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함; 및 상기 반응 혼합물의 색상 지표를 기준 색상 지표와 비교함을 포함하는 것을 포함할 수 있다.
결정의 기준이 되는 반응물의 색상 지표는 통상적으로 알려진 색상 지표들로부터 선택될 수 있다. 일 예시에서, 반응 혼합물의 색상 지표는 흡광도일 수 있다. 나아가, 반응 혼합물의 색상 지표는 흡광곡선의 특정 파장값의 비율일 수 있다. 더 나아가, 반응 혼합물의 색상 지표는 620nm의 흡광도와 520nm의 흡광도의 비율 (이하 E620/E520)일 수 있다. 이때, 흡광도를 측정하기 위한 파장은 금 나노입자의 크기에 따라 다르게 선택될 수 있고 응집변화를 나타내는 흡광도 간의 비율은 역수로서 사용될 수도 있다. 일 예시에서, 반응 혼합물의 색상 지표는 반응 혼합물의 사진으로부터 도출될 수 있다. 예를 들어, 반응 혼합물 색상의 RGB 코드 등 전산 처리 가능한 데이터일 수 있다. 일 예시에서, 추가적인 과정의 진행 여부를 결정함에 있어, 두 종류 이상의 혼합물의 색상 지표를 기준으로 할 수 있다.
결정 과정이 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함을 포함하는 경우, 해당 측정에 대해서 설명한다. 일 예시에서, 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함은 반응 혼합물의 흡광도를 측정하는 것일 수 있다. 또는, 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함은 반응혼합물의 흡광곡선을 측정하는 것일 수 있다. 일 예시에서, 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함은 반응 혼합물의 사진을 찍는 것일 수 있다.
결정 과정이 반응 혼합물의 색상 지표를 기준 색상 지표와 비교함을 포함하는 경우, 해당 비교에 대해서 설명한다. 기준 색상 지표 (standard color index)는 추가적인 과정이 필요한지 평가하기 위한 색상 지표의 절댓값을 의미한다. 일 예시에서, 반응 혼합물의 색상 지표가 기준 색상 지표 이상이어야 할 수 있다. 일 예시에서, 반응 혼합물의 색상 지표가 기준 색상 지표 이하이어야 할 수 있다. 일 예시에서, 반응 혼합물의 색상 지표가 기준 색상 지표와 동일해야 할 수 있다. 이하는 예시이다. 타겟 물질과 단일가닥 핵산의 결합성이 개선될수록 반응혼합물은 보라색에 가까워지며, E620/E520의 값이 커진다. 따라서 반응혼합물의 E620/E520가 특정 E620/E520 이상이 되도록 하여 단일가닥 핵산의 결합성이 특정 이상이 되도록 할 수 있다. 나아가, 반응혼합물의 E620/E520가 특정 E620/E520 이하인 경우, 다시 선택 과정을 반복하도록 할 수 있다. 일 예시에서, 기준 색상 지표는 금나노입자가 응집되기 전의 색상 지표일 수 있다. 나아가, 기준 색상 지표는 금나노입자가 응집되기 전의 2개의 파장에서 측정한 흡광도 값들의 비율일 수 있다.
4) 추가적인 과정
본 목차는 상기 판단 과정에 의하여 추가적인 과정이 수행되는 경우, 상기 추가적인 과정에 관하여 설명한다.
일 구체예에서, 상기 추가적인 과정은 동일한 타겟 물질에 대한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 반복하는 것일 수 있다. 예컨데, 단일가닥 핵산의 결합성이 충분히 개선되지 않았다고 판단될 경우, 선택 과정을 반복하여 단일가닥 핵산의 결합성을 개선할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 추가적인 과정은 상이한 타겟 물질에 대한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 수행하는 것일 수 있다. 예컨데, 두 개 이상의 타겟 물질에 대하여 결합성을 갖는 단일가닥 핵산을 제조하고자 하는 경우, 이러한 추가적인 과정을 채용할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 추가적인 과정은 논타겟 물질에 대한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 수행하는 것일 수 있다.
타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정
본 출원은 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산을 선택하기 위한 공정을 제공한다. 이상은 선택 공정의 구성으로서의 일 과정을 설명한 것이다. 본 목차에서는, 상기 과정들을 조합한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정에 대하여 설명한다. "타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정"은 본 출원에 의한 공정으로서, 특정 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산을 선택하는 공정을 의미한다. 도 1의 좌측은 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 예시적으로 나타낸 것이다.
본 출원에 의한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함; 상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 타겟물질을 반응시킴; 및 상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함을 포함할 수 있다. 금 나노입자를 이용한 단일가닥 핵산의 선택 공정의 기본적인 형태는 도 2에서 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후, 단일가닥 핵산과 상기 타겟물질을 떼어낸 후 상기 단일가닥 핵산을 단리함을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후, 상기 분리된 단일가닥 핵산을 증폭함을 더 포함할 수 있다. 예시적인 단일가닥 핵산의 선택 공정을 도 4에서 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 상기 반응혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 과정의 진행 여부를 결정함을 더 포함할 수 있다. 예시적인 단일가닥 핵산의 선택 공정을 도 5에서 확인할 수 있다 (300). 이때, 추가적인 과정이 동일한 타겟물질에 대한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 반복하는 것 (350')인 예시를 도 6에서 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 특정 횟수 반복될 수 있다. 선택 공정이 반복될수록 타겟물질에 대한 단일가닥 핵산의 결합성은 개선될 것이다. 예시적인 단일가닥 핵산의 선택 공정을 도 7에서 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원의 타겟물질은 브라시놀리드, 또는 비스페놀 A일 수 있다.
논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정
개요
타겟물질과 유사한 구조를 갖는 화합물인 경우가 있다. 예를 들어, 환경호르몬 (environmental hormones)은 생체의 내분비 호르몬과 유사한 구조를 가지고 있다. 이러한 타겟물질에 대한 결합성 단일가닥 핵산을 선택하는 경우, 유사한 구조 (예컨데, 내분비 호르몬)에 대한 결합성 역시 띄게 될 수 있다. 이는 경우에 따라 스크리닝 공정의 순도, 치료 방법의 부작용 등 악영향을 미칠 수 있다.
이에 따라 타겟물질에 대한 결합성을 갖되, 이와 유사한 논타겟물질 (nontarget substance)에 대하여 결합성을 갖지 않는 단일가닥 핵산을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 통상적으로 이 과제는 네거티브 SELEX (negative SELEX) 수단을 통하여 해결된다. 논타겟 물질은 타겟물질과 상이할 수 있다.
본 출원은 금 나노입자를 기반으로 한 단일가닥 핵산 선택 방법에 있어, 논타겟물질에 대하여 결합하지 않은 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다. "논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정"은 본 출원에 의한 공정으로서, 특정 논타겟물질에 대하여 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 선택하는 공정을 의미한다. 상기 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 이상에서 포괄적으로 설명된 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정과 유사하게 수행된다. 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정에서는 반응혼합물로부터 타겟 물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함을 포함한다. 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 이와 달리 반응혼합물로부터 논타겟물질과 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 분리함을 포함하는 점에서 상이하다. 도 1의 우측은 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정의 예시를 나타낸 것이다.
금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리의 준비
논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정에 있어, 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리의 준비는 상기 설명된 내용들을 준용한다. 예시적으로, 이를 구성하는 단일가닥 핵산은 상기 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정에 의하여 선택된 단일가닥 핵산일 수 있다.
금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 논타겟 물질의 반응
논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정에 있어, 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 논타겟 물질의 반응은 상기 설명된 내용들을 준용한다.
논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산의 분리
위에서 설명한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산의 분리와 달리, 본 목차의 선택 공정에서는 논타겟물질과 결합하지 않는 비결합성 단일가닥 핵산을 분리하는 것이 바람직하다. 따라서 상기 반응혼합물에 물리적 충격 또는 화학적 조작을 가하여 논타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리하고, 금 나노입자-단일가닥 핵산 형태로 남아있는 단일가닥 핵산을 분리해야 한다.
일 구체예에서, 상기 반응혼합물에 물리적 충격을 가한 후 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산을 분리할 수 있다. 일 예시에서, 상기 반응혼합물을 상 분리하여 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산을 분리할 수 있다. 분리된 단일가닥 핵산은 금 나노입자-단일가닥 핵산 구조에 비하여 질량이 작다. 구체적인 예시에서, 상기 논타겟물질과 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 분리함은, 상기 반응혼합물을 원심분리한 후 상청액을 제외한 나머지를 수득함을 포함할 수 있다.
논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산의 단리/증폭
논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정에 있어, 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산의 단리 및 증폭은 상기 설명된 내용들을 준용한다.
단, 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산을 단리하는 과정은 단일가닥 핵산을 금 나노입자로부터 분리 (detach)시켜야 하는 점에서 상이하다. 본 출원에 의한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은, 논타겟물질과 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 분리한 후, 단일가닥 핵산과 금 나노입자를 떼어낸 후 상기 단일가닥 핵산을 단리함을 더 포함할 수 있다. 일 예시에서, 상기 단일가닥 핵산과 금 나노입자는 반응 혼합물을 가열함을 통해 떼어낼 수 있다. 나아가, 상기 단일가닥 핵산과 금 나노입자는 반응 혼합물을 95 ℃에서 가열함을 통해 떼어낼 수 있다.
금 나노입자의 비색반응을 통한 모니터링
논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정에 있어, 공정의 모니터링 방법은 상기 설명된 내용들을 준용한다. 다만, 본 선택 공정의 경우, 공정이 진행될수록 단일가닥 핵산의 결합력이 떨어져 단일가닥 핵산과 금 나노입자의 결합이 유지될 것이다. 따라서, 상기 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정과 달리, 본 분리 공정에서는 단일가닥 핵산과 논타겟물질의 결합력이 약해질수록 반응혼합물의 색이 보라색에서 빨간색으로 변화한다.
논타겟 물질과 단일가닥 핵산의 결합성이 약해질수록 반응혼합물은 빨간색에 가까워지며, E620/E520의 값이 작아진다. 일 예시에서, 반응혼합물의 E620/E520가 특정 E620/E520 이하가 되도록하여 단일가닥 핵산의 결합성이 특정 이하가 되도록 할 수 있다. 나아가, 반응혼합물의 E620/E520가 특정 E620/E520 이상인 경우, 다시 선택 과정을 반복하도록 할 수 있다.
전체 공정
본 출원에 의한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함; 상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 논타겟물질을 반응시킴; 및 상기 반응혼합물로부터 논타겟물질과 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 분리함을 포함할 수 있다. 금 나노입자를 이용한 단일가닥 핵산의 선택 공정의 기본적인 형태는 도 8에서 확인할 수 있다 (520).
일 구체예에서, 본 출원에 의한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 상기 논타겟물질과 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 분리한 후, 단일가닥 핵산과 금 나노입자를 떼어낸 후 상기 단일가닥 핵산을 단리함을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 상기 논타겟물질과 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 분리한 후, 상기 분리된 단일가닥 핵산을 증폭함을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 상기 반응혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 과정의 진행 여부를 결정함을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정은 특정 횟수 반복될 수 있다. 선택 공정이 반복될수록 논타겟물질에 대한 단일가닥 핵산의 결합성은 낮아질 것이다.
일 구체예에서, 본 출원의 논타겟물질은 B-시토스테롤, 또는 비스페놀 S일 수 있다.
본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법
본 출원은 단일가닥 핵산의 선택 방법을 제공한다. 상기 설명에 의하여 단일가닥 핵산의 선택 방법으로서 타겟물질에 대한 결합성을 갖거나 논타겟물질에 대한 결합성을 갖지 않는 단일가닥 핵산의 선택 공정을 기술하였다. 본 목차에서는 이러한 공정들을 조합하여 원하는 단일가닥 핵산을 선택하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 출원에 의한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정과 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 직렬적으로 수행하여, 타겟물질에 대한 결합성을 갖고 논타겟물질에 대한 비결합성을 갖는 단일가닥 핵산을 수득할 수 있다. 이하 언급되는 "타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정" 및 "논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정"은 이상에서 설명된 구체예 및 예시를 모두 포함한다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법은 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함할 수 있다. 일 예시에서, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법은 2개 이상의 타겟물질에 대한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함할 수 있다. 예를 들어 2개의 타겟물질이 선택된 경우, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법은 제1 타겟물질에 대한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정; 및 제2 타겟물질에 대한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함할 수 있다. 도 2 내지 도 7은 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함하는 예시들을 나타내고 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법은 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함할 수 있다. 일 예시에서, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법은 2개 이상의 논타겟물질에 대한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함할 수 있다. 예를 들어 2개의 논타겟물질이 선택된 경우, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법은 제1 논타겟물질에 대한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정; 및 제2 논타겟물질에 대한 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산의 선택 방법은 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정; 및 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 포함할 수 있다. 이를 통해 타겟물질에 대한 결합성을 갖고 논타겟물질에 대한 결합성이 약한 단일가닥 핵산을 선택하는 것이 가능하다. 일 예시에서, 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정이 수행된 후, 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정이 수행될 수 있다. 나아가, 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정에서 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후, 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 수행할 수 있다. 또는 나아가, 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정과 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 교대로 수행할 수 있다. 예를 들어, 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 수행한 후, 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 수행하고, 그 후 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 수행할 수 있다. 일 예시에서, 상기 타겟물질은 브라시놀리드이고, 상기 논타겟물질은 B-시토스테롤일 수 있다. 일 예시에서, 상기 타겟물질은 비스페놀 A이고, 상기 논타겟물질은 비스페놀 S일 수 있다. 도 8은 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정 (510) 및 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정 (520)을 포함하는 예시들을 나타내고 있다.
본 출원에 의하여 본 출원의 단일가닥 핵산의 선택 방법을 수행하기 위한 키트 또는 장치가 제공된다. 일 구체예에서, 상기 키트는 마이크로 플레이 기반의 키트일 수 있다.
단일가닥 핵산
본 출원의 단일가닥 핵산의 선택 방법에 의하여 준비된 단일가닥 핵산
본 출원은 상기 단일가닥 핵산의 선택 방법에 의하여 준비된 단일가닥 핵산을 제공한다.
일 구체예에서, 본 출원은 타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산을 제공한다. 나아가, 상기 단일가닥 핵산은 두 종류 이상의 타겟물질에 대한 결합성을 가질 수 있다. 즉, 타겟물질이 두 종류인 경우 상기 단일가닥 핵산은 제1 타겟물질 및 제2 타겟물질에 대한 결합성을 가질 수 있다. 예시적으로, 상기 타겟물질은 브라시놀리드, 또는 비스페놀 A일 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원은 논타겟물질에 대한 결합성이 약한 단일가닥 핵산을 제공한다. 나아가, 상기 단일가닥 핵산은 두 종류 이상의 논타겟물질에 대하여 약한 결합성을 가질 수 있다. 예시적으로, 상기 논타겟물질은 B-시토스테롤, 또는 비스페놀 S일 수 있다.
일 구체예에서, 본 출원은 타겟물질에 대한 결합성을 가지며, 논타겟물질에 대한 결합성이 약한 단일가닥 핵산을 제공한다. 이때, 상기 단일가닥 핵산은 타겟물질에 대한 결합성을 가지며, 논타겟물질에 대한 결합성이 상대적으로 약한 것일 수 있다. 나아가, 상기 타겟물질 및/또는 논타겟물질은 두 종류 이상일 수 있다. 예시적으로, 상기 타겟물질은 브라시놀리드이고 상기 논타겟물질은 B-시토스테롤이거나, 또는 상기 타겟물질은 비스페놀 A이고 상기 논타겟물질은 비스페놀 S일 수 있다.
본 출원은 서열번호 1, 또는 2의 염기서열로 이루어지는 단일가닥 핵산을 제공한다. 일 예시에서, 본 출원은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 브라시놀리드에 대한 결합성을 가지고, B-시토스테롤에 대한 결합성이 상대적으로 약한 단일가닥 핵산을 제공한다. 일 예시에서, 본 출원은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 비스페놀 A에 대한 결합성을 가지고, 비스페놀 S에 대한 결합성이 상대적으로 약한 단일가닥 핵산을 제공한다.
단일가닥 핵산의 개량
본 출원은 상기 단일가닥 핵산을 기초로 하여 개량된 단일가닥 핵산을 제공한다. 단일가닥 핵산의 개량을 통해 크기가 작으면서도 타겟 물질에 대한 결합성이 개량되거나 유사한 단일가닥 핵산의 준비가 가능하다.
일 예시에서, 단일가닥 핵산의 개량은 상기 단일가닥 핵산의 선택 방법에 의하여 선택된 단일가닥 핵산의 일부를 잘라내어 (truncate) 수행될 수 있다. 단일가닥 핵산 중 타겟 물질과 주요하게 결합하는 부위를 잘라내어 개량된 단일가닥 핵산을 준비할 수 있다.
일 예시에서, 단일가닥 핵산의 개량은 상기 단일가닥 핵산의 선택 방법에 의하여 선택된 단일가닥 핵산의 일부를 뮤테이션시켜 수행될 수 있다.
본 출원은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 브라시놀리드에 대한 결합성을 가지고, B-시토스테롤에 대한 결합성이 상대적으로 약한 단일가닥 핵산을 제공한다.
단일가닥 핵산의 용도
본 출원에 의한 단일가닥 핵산은 다양한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산은 특정 생체 분자 (biomolecule)에 대한 억제제로 작용할 수 있다. 나아가, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산은 특정 생체 분자와 관련된 질병의 치료용으로 사용될 수 있다. 또한, 본 출원에 의한 단일가닥 핵산은 타겟 물질을 검출, 정량, 추출, 정제하기 위한 센서, 측정 키트 등에 사용될 수 있다. 본 출원은 단일가닥 핵산 만이 아니라 이들을 이용한 단일가닥 핵산 (또는 압타머)의 통상적인 용도들을 포괄한다.
본 출원에 의하여 본 출원에 의한 단일가닥 핵산을 포함하는 특정 질병을 치료하기 위한 약학적 조성물이 제공된다. 일 예시에서, 비스페놀 A에 대한 결합력을 갖는 단일가닥 핵산을 포함하는 비스페놀 A에 대한 질병을 치료하기 위한 약학적 조성물이 제공된다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있다. 또는, 본 출원에 의하여 비스페놀 A에 대한 결합력을 갖는 단일가닥 핵산을 이용하는 비스페놀 A를 제거하기 위한 방법이 제공된다.
본 출원에 의하여 본 출원에 의한 단일가닥 핵산을 포함하는, 타겟 물질을 검출하기 위한 센서가 제공된다. 또한, 본 출원에 의하여 본 출원에 의한 단일가닥 핵산을 포함하는, 타겟 물질을 정량, 추출, 또는 정제하기 위한 키트가 제공된다. 일 예시에서, 브라시놀리드에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산을 포함하는 브라시놀리드를 정량, 추출, 또는 정제하기 위한 키트가 제공된다. 일 예시에서, 상기 키트는 크로마토그래피 등 특정 타겟 물질의 선택을 위한 기기일 수 있다. 일 예시에서, 상기 센서는 특정 질병을 진단하기 위한 진단 키트일 수 있다.
실험예
실험예 1. 테스트를 위한 금 나노입자의 합성
본 발명에 의한 단백질 분해효소 활성분석 검증을 위해 카르복실기로 변형된 금 나노입자가 합성되었다.
금 나노입자는 흔히 알려진 방법대로, 시트르산(citrate)으로 환원 및 안정화 하는 방법으로 합성되었다. 요약하자면, 1 mM 농도의 사염화금(HAuCl4ㆍ3H2O, Sigma-Aldrich) stock solution 20 mL를 50 mL 의 증류수에 넣고 지속적으로 교반시켜 최종 농도 300 nM의 용액을 만들었다. 이 용액에, 30 mM 시트르산 소듐(C6H5Na3O7ㆍ2H2O, Sigma-Aldrich) 2 mL이 더해져 최종 농도 600 nM이 되도록 하였고, 교반시켰다. 환원시키고 금 콜로이드를 형성하기 위해, 용액을 끓이면서 교반시켰다.
실험예 2. 금 나노입자에 기초한 SELEX(Gold-SELEX)를 수행하기 위한 ssDNA library 준비
Random ssDNA library 는 A,G,C,T염기의 비율이 1:1:1;1이 되도록 준비하였으며, 3'과 5' 양 말단에 DNA 증폭을 위한 프라이머 자리를 위치시켰다. Citrate로 안정화된 금나노입자는 대부분의 ssDNA를 흡착할 수 있으나, 서열의 염기 구성에 따라 일부 ssDNA와는 친화력이 떨어질 수 있다. 금나노입자와의 결합력이 낮은 서열이 타겟물질과의 친화도와 상관 없이 금나노입자로부터 탈락하여 positive SELEX과정에 선정되는 것을 방지하기 위하여 Gold-SELEX 의 시작 단계에서 다음의 두가지 방법으로 ssDNA library를 준비했다.
첫번째 방법은 초반 1-4라운드 가량에 추가적인 원심분리 과정을 넣는 방법이다. 하기 실시예 중 Brassinlide Gold-SELEX 에 해당된다. 금나노입자 75ul와 ssDNA 150nM, 1X phosphate buffered saline(1X, PBS의 조성은 다음과 같다. 0.137M Sodium chloride, 2.7mM Potassium chloride, 4.3mM, Sodium phosphate (dibasic, anhydrous), 1.4mM Potassium phosphate (monobasic, anhydrous)) 20ul, 증류수를 섞어 최종 부피가 190ul가 되도록 하고 10분동안 나노입자와 ssDNA가 붙을수 있도록 한다. 금나노입자와 친화력이 없는 ssDNA 서열을 제거하기 위해 6500g에서 10분동안 원심분리해준 뒤에 상층액을 버리고, 남은 금나노입자+ssDNA를 0.1X PBS 190ul로 희석하여 이후 SELEX과정에 사용했다.
두번째 방법은 타겟물질과 첫 positive SELEX과정을 진행하기 전에 수행할 수 있으며, 하기 예시 중 Bisphenol A　Gold-SELEX에 해당된다. 금나노입자 75ul와 ssDNA 150nM, 1X PBS 20ul, 증류수를 섞어 총 190ul의 샘플을 준비하여 상온에서 10분동안 ssDNA와 금나노입자를 결합시킨다. 6500g에서 10분동안 원심분리하여 상층액의 나노입자에 결합하지 않은 서열을 제거하고 남아있는 금나노입자+ssDNA를 40ul 증류수에 희석하였다. 95℃에서 10분 끓여 ssDNA를 나노입자로부터 해리시킨 뒤에 13000rpm으로 1분 원심분리하여 상층액의 ssDNA만 취한다. PCR하여 해리된 ssDNA를 증폭하고 해당 과정을 1-3 cycle반복하여 금나노입자와 결합하지 않는 서열을 ssDNA library로 부터 제거할 수 있으며 준비된 library는 Gold-SELEX에 사용되었다.
실험예 3. 금 나노입자의 비색법에 기초한 Brassinolide(이하 BL)와 Bisphenol A(이하 BPA)에 대한 Gold-SELEX 의 monitoring과 압타머 선정
Gold-SELEX의 활용성을 확인하기 위하여, BL과 BPA 두가지 표적물질에 대한 압타머 선정을 진행하였다. Positive SELEX는 타겟과 ssDNA의 결합력을 높히는 SELEX과정이다. ssDNA library 30pmol, 75ul 금나노입자, 1X PBS, 증류수를 섞어 총 190ul의 반응물을 준비하여 금나노입자와 ssDNA가 붙을 수 있도록 10분동안 상온에서 반응시킨 뒤 첫번째 사진촬영과 흡광도 측정을 진행하였다. 사진촬영은 모두 동일한 장소와 조건에서 한대의 휴대전화 내장 카메라로 진행되었으며, 흡광도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 투명 96 웰 플레이트에서 500-800nm의 파장 범위를 측정하였다. 측정 뒤에 10ul의 타겟을 원하는 농도만큼 첨가하고 10-30분 동안 상온에서 반응시켰으며, 이 과정의 농도, 시간, 온도는 타겟의 종류와 SELEX의 진행상황에따라 달라질 수 있다. 첫번째와 동일한 방법으로 사진촬영과 흡광도 측정을 완료한 뒤에 샘플에 1M NaCl을 10첨가하고 15분 동안 색 변화를 기다렸다. 이후 색 변화가 안정된 뒤에 마지막 사진촬영과 흡광드 측정을 진행하였다. 촬영이 끝난 샘플은 1.5ul 마이크로 튜브로 옮겨 6500g에서 10분동안 원심분리하여 ssDNA+target이 포함되어 있는 상층액만 취했다.
상층액에서 얻은 ssDNA는 Ethanol precipitation과정을 통해 타겟으로부터 분리되었다. 3M Sodium acetate 20ul, 차가운 (-20℃ 보관) 100% 에탄올 660ul를 샘플에 첨가하여 -20℃에서 30분 동안 반응하였다. 14000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고, 차가운 70%에탄올 1mL을 첨가해 DNA펠렛을 세척한 뒤 15분동안 추가로 원심분리하였다. 상층액을 모두 제거하고 10분동안 상온에서 펠렛을 말린 뒤에 40ul 증류수를 넣어 DNA를 녹여내었다. 이런 과정으로 얻은 ssDNA는 polymerase chain reaction(PCR)을 통해 증폭되어 다음 라운드에 사용되었다.
한편 ssDNA와 counter target의 결합력을 낮춰 선정된 압타머의 특이성을 높히기 위해 Negative SELEX도 진행되었다. 첫번째 촬영 및 측정까지의 과정은 positive SELEX와 동일하며 target 대신 배제하고자 하는 counter taraget을 원하는 농도만큼 10ul를 샘플에 섞어주었다. 이후 3번째 촬영 및 측정 과정까지 positive SELEX와 동일하다. 측정이 끝난 샘플을 1.5ul 마이크로 튜브로 옮겨 6500g에서 10분동안 원심분리한 뒤에 상층액을 버리고 금나노입자+ssDNA 펠렛에 40ul의 증류수를 첨가하여 95℃에서 10분 끓여 나노입자로부터 counter target과 결합하지 않은 DNA를 해리시켰다. 해리된 DNA는 PCR 과정을 통해 증폭하여 다음 라운드에 사용하였다.
도 9 및 10은 식물유래 스테로이드 호르몬의 일종인 brassionlide(BL)에 결합하는 DNA압타머를 선정한 Gold-SELEX 결과이다. 압타머 또는 항체가 존재하지 않는 물질에 대하여 Gold-SELEX를 총 9라운드 완료하였으며, BL에 높은 결합력을 보이는 서열을 선정하기 위한 positive SELEX 2단계, beta-sitosterol에 대한 결합력이 낮은 서열을 선정하기 위한 negative SELEX 1단계로 이루어져 있다. 타겟 물질 (브라시놀리드)과 논타겟 물질 (B-시토스테롤)의 구조는 각각 구조식 1 및 2와 같다.
[구조식 1] 브라시놀리드 (Brassinolide)
Figure PCTKR2020010534-appb-I000001
[구조식 2] B-시토스테롤 (B-sitosterol)
Figure PCTKR2020010534-appb-I000002
도 9와 10은 SELEX전과정을 금나노입자의 색상 변화에 의해 모니터링한 결과이다. 색상 변화는 620nm에서의 흡광도와 520nm에서의 흡광도의 비율로 측정되었으며, 타겟 또는 counter target과의 DNA결합력이 높을수록 염을 추가한 뒤의 금나노입자가 적색에서 보라색을 거쳐 푸른색으로 변화하게 되고, 그 결과 520nm에서의 흡광도가 낮아지고 620nm의 흡광도가 올라가기 때문에 E620/E520 의 값이 올라가게 된다.
도 9와 10에서, 1-4라운드까지 BL에 대한 positive SELEX가 진행될 수록 타겟에 대한 ssDNA pool의 결합력이 높아져 색상이 붉은색에서 보래색으로 바뀌었다. 5-7라운드 동안은 라운드가 진행될 수록 b-sitosterol에 대한 DNA pool의 결합력이 감소하여 금나노입자의 색상이 붉은색으로 바뀌었다. 7라운드의 경우, 모니터링 결과에 근거하여 6라운드 산물이 충분한 타겟 특이성을 획득하였다고 판단하였으며 같은 6라운드 산물을 사용하여 positive SELEX인 7라운드를 추가로 진행했고 이를 7-P라운드라 했다. 그 결과 4라운드와 비교하여 7-P의 타겟과의 친화도가 감소하였음을 확인하였고, 7-N은 폐기하고 7-P 부터 9라운드까지 positive SELEX를 추가로 진행하였다. 그리고 BL에 대한 결합력이 4라운드만큼 다시 회복되었을 때 SELEX를 완료하였다.
도 11 및 12는 내분비계교란물질(환경호르몬)의 일종인 비스베놀 A(BPA) (구조식 3)에 결합하는 DNA 압타머를 선정한 Gold-SELEX결과이다. 기존에 다른 SELEX방법으로 압타머가 개발되어있는 알려진 타겟에 대해 본 발명으로 새로운 압타머 선정을 완료함으로써 기존의 SELEX방법과 비교하여 Gold-SELEX의 압타머 선정 효율을 증명하고자 하였다.
BPA에 대한 SELEX 는 총 11라운드가 진행되었으며, 한번의 positive SELEX와 Negative SELEX로 구성되어 있다. 타겟 물질과 논타겟 물질은 각각 비스페놀 A (구조식 3) 및 비스페놀 S (구조식 4)였다.
[구조식 3]
Figure PCTKR2020010534-appb-I000003
[구조식 4]
Figure PCTKR2020010534-appb-I000004
도 11, 도 12는 620nm와 520nm에서의 흡광도 비율을 이용한 SELEX전체 과정을 모니터링한 결과이다. 모든 측정은 BL SELEX와 동일하게 진행되었다.
도 11, 도 12에서, 1-8라운드까지 BPA에 대한 positive SELEX가 진행될 수록 타겟에 대한 ssDNA pool의 결합력이 높아져 색상이 붉은색에서 보라색으로 바뀌는것을 확인하였다. 8라운드의 경우 DNA pool이 BPA에 대한 충분한 결합력을 얻었다고 생각되어, 7라운드 산물의 타겟 특이성을 확인하기 위해 Bisphenol S(BPS)를 타겟과 동일한 농도로 사용하여 counter SELEX를 추가로 진행하였다. 그 결과 7라운드 산물은 BPS에 대해서도 BPA와 비슷한 결합력을 나타냄을 확인했다. 타겟 특이적 결합력이 높은 BPA 압타머를 선정하기 위해 8-P는 폐기하였고, 8-N부터 11라운드까지 Negative-SELEX를 진행하였다. BPS에 대한 결합력이 2라운드 수준으로 감소한 뒤에 SELEX를 완료하였다.
실험예 4. Gold-SELEX 의 시퀀싱 결과 확인
SELEX가 완료된 후, 서열확인을 위해 BL SELEX 9라운드 산물, BPA SELEX의 11라운드 산물을 PCR로 증폭하여 t-vector cloning하여 Dh5a competent cell에 transformation 시켰다. 50-100개의 colony를 취하여 플라스미드를 prep한 뒤에 T7 promoter로 시퀀싱하였다. 그 결과 유사도가 높고 출현 빈도가 높은 서열을 위주로 분석하였으며 결과는 아래 표와 같다.
Figure PCTKR2020010534-appb-I000005
Figure PCTKR2020010534-appb-I000006
실험예 5. 금 나노입자의 비색법에 기초한 BL과 BPA에 대한 압타머 결합력 및 특이성 확인
각각의 최종 SELEX 라운드의 산물로부터 가장 타겟에 대한 친화도가 높은 서열 한가지씩을 선정하였으며, 각각의 후보들에 대해 타겟 결합력과 특이성을 확인하였다. 모든 실험은 Gold-SELEX와 같은 조건으로 실험하였다.
도 13 내지 15는 BL 에 대해, 도 16 내지 18는 BPA에 대해 선정된 압타머의 target과 counter target들에 대하여 압타머의 결합력과 특이성을 확인한 결과이다. 도 13이 최종적으로 선정된 BL 압타머인 BLA9-20의 2차 구조이고, 도 16은 최종적으로 선정된 BPA압타머인 nBPA40의 2차 구조이다. 두 구조 모두 mfold web server(M. Zuker. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415, 2003.)로부터 열역학적으로 안정성이 가장 높은 서열로 예측, 선정되었다. 그리고 도 14, 15, 17, 및 18로부터 선정된 압타머들은 각각의 타겟에 대한 대한 결합력이 가장 높으며, 비슷한 구조의 다른 물질들에 대해서는 낮은 상대적으로 낮은 결합력을 가지고 있음을 확인할 수 있다. 도 14 및 17에서 측정된 흡광도 비율 E620/E520은 정확한 비교를 위해 ((분석물이 들어갔을 때의 Ext. Ratio)-(분석물이 없을 때의 Ext. Ratio ))/(분석물이 없을 때의 Ext. Ratio)의 식으로 normalize 되었다. 농도별 표준 시약은 실험 전에 농도별로 희석하여 준비되었으며, 100% 에탄올에 희석되었다. 도 14 및 15의 실험에 사용된 물질들의 구조가 도 15 하단에 나타나 있으며, 모두 식물체내에서 BL이 생합성 되는 과정의 중간 산물이다. 도 17 및 18에 사용된 물질들의 종류와 구조가 도 18 하단에 나타나 있다.
실험예 6. 알려진 BPA 압타머와 Gold-SELEX로 선정된 BPA압타머의 비교
다른 SELEX방법으로 선정되어 이미 알려져있는 BPA DNA 압타머와 Gold-SELEX로 선정된 새로운 압타머 서열 두가지의 타겟 감지 능력을 금나노입자 비색법으로 비교하였고, multi align기법으로 두 압타머의 염기서열을 확인하였다.
실험조건은 Gold-SELEX 압타머 선정 과정과 동일하게 진행되었으며, 도 19와 도 20의 결과에서 확인할 수 있듯, Gold-SELEX로 선정된 압타머인 nBPA40이 기존에 발표되어있는 압타머보다 금나노입자 비색 센서로 활용하기에 적합한 것으로 보인다. 그리고 서로 다른 방법으로 선정되었음에도 불구하고, 도 21의 결과로 보아 nBPA40과 기존의 압타머 간 유사성이 높은 부분들이 발견되었다. 붉은색의 경우 90%이상의 유사성, 푸른색의 경우 50-90% 유사성, 검정색이 경우 50% 미만의 유사성을 보임을 의미한다.
실험예 7. 브라시놀리드 결합성 압타머의 개량화
도 22 내지 도 25는 BLA9-20 압타머를 개량화하여 브라시놀리드와의 결합력을 비교한 결과이다. 도 22에서 나타낸 바와 같이, BLA9-20 (총 60 bp)에서 표시된 부분만을 절단하여 구성한 truncated 압타머 (tBLA9-20v1, 총 29 bp, 서열번호 17) 형태와, single base pair를 추가하여 구성한 truncated 압타머 (tBLA9-20v2, 총 31 bp, 서열번호 18)로 제작하였다. 이 2가지의 truncated 압타머에 대해 브라시놀리드의 결합력을 금 나노입자의 비색법으로 측정한 결과 tBLA9-20v2가 tBLA9-20v1보다는 상대적으로 높이 측정되었으며 tBLA9-20v2 결합친화도는 BLA9-20에 비해 다소 높게 측정 (K d=54.2 nM)되었다 (도 23). tBLA9-20v1과 tBLA9-20v2에 브라이놀리드를 처리하기 전과 처리 후에 2차구조를 circular dichroism (CD)을 사용하여 비교한 결과 tBLA9-20v1의 경우는 브라이놀리드의 결합이후 2차구조가 바뀌는 반면, tBLA9-20v2의 경우는 2차구조에 변화가 없다는 것을 알 수 있다 (도 24 및 도 25).
실험예 8. 브라시놀리드 결합성 압타머를 이용한 브라시놀리드의 검출 방법
도 26은 압타머를 이용한 브리시놀리드 검출방법으로서 항체를 이용한 면역침강법 (immunoprecipitation)과 유사한 압타머 침강법 (aptamer precipitation)으로 활용하여 검출할 수 있음을 나타낸다. 즉, 아비딘으로 코팅된 마이크로비드 표면을 바이오틴-압타머 (biotin- tBLA9-20v2)를 결합시키고 각각 다른 농도의 브라시놀리드가 포함된 애기장대 추출물과 반응 후 세척할 수 있다. 애기장대 추출물에 포함된 브라시놀리드는 비드 표면에 강하게 결합되어 있게 되는데 최종 에탄올을 처리하여 압타머에 결합된 브라시놀리드를 효과적으로 추출 후 금나노입자 비색법으로 정량화 할 수 있다. 도 27은 실제 야생형 애기장대 추출물 (WT, wild-type Arabidopsis)과 브라시놀리드 생합성이 저해되는 배지에서 자란 돌연변이 애기장대 추출물 (Sdet2, BL-deficient mutant Arabidopsis), 그리고 야생형 애기장대에 브라시놀리드가 풍부하게 존재하는 배지에서 자란 추출물 (WT+BL, wild-type Arabidopsis with BL-rich media)을 분석하여 표준 정량 곡선과 비교한 결과 야생형 애기장대에 비해 Sdel2는 상대적으로 적고, WT-BL는 매우 높은 발색범위를 나타내어 정량적으로 분석이 가능함을 확인하였다.
[부호의 설명]
110, 210, 310, 410: 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함
111: 금 나노입자를 준비함
112: 단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함
113: 금 나노입자와 단일가닥 핵산 라이브러리를 반응시킴
120, 220, 320, 420: 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 타겟물질을 반응시킴
130, 230, 330, 430: 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함
240, 340: 단일가닥 핵산과 타겟물질을 떼어낸 후 상기 단일가닥 핵산을 단리함
250: 단리한 단일가닥 핵산을 증폭함
350: 추가적인 과정
350': 추가적인 과정 - 동일한 타겟 물질에 대한 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 반복
510: 타겟물질 결합성 단일가닥 핵산 선택 공정을 수행한 후 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함
520: 논타겟물질 비결합성 단일가닥 핵산 선택 공정
1000: 압타머 BLA9-20
2000: 개량압타머 tBLA9-20v1
3000: 개량압타머 tBLA9-20v2

Claims (15)

  1. 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함;
    상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 타겟물질을 반응시킴;
    상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함; 및
    상기 반응혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 반응 진행 여부를 결정함
    을 포함하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  2. 제1항에 있어,
    상기 금 나노입자-단일 가닥 핵산 라이브러리를 준비함은,
    시트르산에 의한 환원 및 안정화에 의한 15nm 내지 50nm의 평균직경을 갖는 금 나노입자를 준비함;
    단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함;
    상기 금 나노입자와 상기 단일가닥 핵산 라이브러리를 반응시킴; 및
    상기 금 나노입자와 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 제거함을 포함하는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  3. 제1항에 있어,
    상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함은,
    상기 반응혼합물을 원심분리 한 후 상청액을 수득함을 포함하는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  4. 제1항에 있어,
    상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후,
    단일가닥 핵산과 상기 타겟물질을 떼어낸 후 상기 단일가닥 핵산을 단리함을 더 포함하는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  5. 제4항에 있어,
    상기 단일가닥 핵산을 단리함은 에탄올 침전을 수행함을 포함하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  6. 제1항에 있어,
    상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리한 후,
    상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 증폭함을 더 포함하는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  7. 제1항에 있어,
    상기 반응 혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 반응 진행 여부를 결정함은,
    상기 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함;
    상기 반응 혼합물의 색상 지표를 기준 색상 지표와 비교함을 포함하는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  8. 제7항에 있어,
    상기 반응 혼합물의 색상 지표를 측정함에 앞서, 상기 금 나노입자가 응집 되도록 유도함을 더 포함하는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  9. 제8항에 있어,
    상기 금 나노입자가 응집되도록 유도함은 상기 반응혼합물에 염을 첨가함을 포함하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  10. 제1, 7, 및 8항 중 어느 하나에 있어,
    상기 반응 혼합물의 색상 지표는 금나노입자가 응집되기 전 2개의 파장에서 측정한 흡광도 값들의 비율과 응집된 이후 동일한 2개의 파장에서 측정한 흡광도 값들의 비율로서 정량화하는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  11. 제1항에 있어,
    상기 반응 혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 반응 진행 여부를 결정한 후, 상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함이 순차적으로 수행되는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  12. 제1항에 있어,
    상기 타겟물질은 브라시놀리드, 또는 비스페놀 A를 포함한 금나노입자의 응집을 유도할 수 있는 저분자 물질, 이온, 단백질, 핵산, 바이러스, 미생물군을 포함하는 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  13. 제1항에 있어,
    상기 반응혼합물로부터 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산을 분리함, 및
    상기 반응혼합물의 색상 지표를 통하여 추가적인 반응 진행 여부를 결정함 이후,
    상기 타겟물질과 결합한 단일가닥 핵산의 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리를 준비함;
    상기 금 나노입자-단일가닥 핵산 라이브러리와 논타겟물질을 반응시킴;
    상기 반응혼합물로부터 논타겟물질과 결합하지 않은 단일가닥 핵산을 분리함;
    을 더 포함하고,
    이때, 상기 타겟물질과 상기 논타겟물질은 서로 다른 것을 특징으로 하는
    타겟물질에 대한 결합성을 갖는 단일가닥 핵산의 선택 방법.
  14. 서열번호 1, 17 및 18로부터 선택된 하나의 염기서열로 구성되고,
    브라시놀리드에 대한 결합성을 가지며, B-시토스테롤에 대한 결합성이 상대적으로 약한 단일가닥 핵산.
  15. 서열번호 1, 17 및 18로부터 선택된 하나 이상의 염기서열로 구성된 단일가닥 핵산을 포함하는 브라시놀리드를 정제하기 위한 키트.
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