WO2021026669A1 - Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas y su proceso de elaboración - Google Patents

Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas y su proceso de elaboración Download PDF

Info

Publication number
WO2021026669A1
WO2021026669A1 PCT/CL2020/050090 CL2020050090W WO2021026669A1 WO 2021026669 A1 WO2021026669 A1 WO 2021026669A1 CL 2020050090 W CL2020050090 W CL 2020050090W WO 2021026669 A1 WO2021026669 A1 WO 2021026669A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pva
weight
nanoparticles
micro
aqueous formulation
Prior art date
Application number
PCT/CL2020/050090
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Saddys María RODRÍGUEZ LLAMAZARES
Constanza SABANDO CORREA
Walther IDE
Richard Mauricio BASTÍAS IBARRA
Original Assignee
Universidad De Concepcion
Centro De Investigación De Polímeros Avanzados
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Concepcion, Centro De Investigación De Polímeros Avanzados filed Critical Universidad De Concepcion
Priority to BR112022002816A priority Critical patent/BR112022002816A2/pt
Priority to US17/632,152 priority patent/US11992007B2/en
Priority to EP20851715.1A priority patent/EP4015522A4/en
Publication of WO2021026669A1 publication Critical patent/WO2021026669A1/es
Priority to CONC2022/0001374A priority patent/CO2022001374A2/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests containing solids as carriers or diluents
    • A01N25/10—Macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2329/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an alcohol, ether, aldehydo, ketonic, acetal, or ketal radical; Hydrolysed polymers of esters of unsaturated alcohols with saturated carboxylic acids; Derivatives of such polymer
    • C08J2329/02—Homopolymers or copolymers of unsaturated alcohols
    • C08J2329/04—Polyvinyl alcohol; Partially hydrolysed homopolymers or copolymers of esters of unsaturated alcohols with saturated carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D129/00—Coating compositions based on homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an alcohol, ether, aldehydo, ketonic, acetal, or ketal radical; Coating compositions based on hydrolysed polymers of esters of unsaturated alcohols with saturated carboxylic acids; Coating compositions based on derivatives of such polymers
    • C09D129/02—Homopolymers or copolymers of unsaturated alcohols
    • C09D129/04—Polyvinyl alcohol; Partially hydrolysed homopolymers or copolymers of esters of unsaturated alcohols with saturated carboxylic acids

Definitions

  • the technology is oriented to the area of agriculture, more particularly, it corresponds to an aqueous formulation that reduces the damage caused by spring frosts in plants.
  • the magnitude of this damage depends fundamentally on: (i) intensity and duration of the frost; (7) concentration of ice nucleating active bacteria, known as INA; (7/7) degree of hardening, related to the adaptability of plants to low temperatures, which decreases rapidly after warm periods; (iv) resistance of the plant to freezing; and (v) phenological stage of the plant.
  • INA concentration of ice nucleating active bacteria
  • the real damage that a spring frost can cause is mainly defined by its magnitude (below zero ° C) and its duration.
  • ice formation typically begins in the extracellular spaces of plants because the extracellular fluid i it generally has a higher freezing point than intracellular fluid.
  • Extracellular ice crystals damage the cell membrane by increasing the concentration of intracellular solutes (dehydration), altering the osmotic pressure across the cell membrane and by mechanical stress with the increase in the size of the extracellular crystals (Saltveit and Morris , 1990). It is estimated that temperatures below 0 Q C for 30 to 45 minutes period of flowering and fruit of fruit species, would be sufficient to produce some kind of damage to the reproductive structures of the plant.
  • Flower buds are the most affected by spring frosts, vegetative buds and young shoots tend to hold longer, except in the most sensitive species in which the shoot can die, sprouting a few days later from the lateral buds.
  • the bud is more resistant than in the state of green button (flower wrapped in the sepals), and this more resistant than the state with the open flower (state in which the gynoecium can be more easily affected, as it is less protected by floral covers).
  • the maximum sensitivity occurs with the newly consolidated fruit. Once the fruit is formed, resistance increases with increasing fruit size (Sakai, 1987).
  • Passive methods include the selection of the cultivation site and the cold-resistant plant species or varieties, and the management of plant nutrition, where the fertilizers added to the plants are controlled to prepare them before a frost, favoring the hardening and recovery of tissues.
  • Cryoprotective agrochemicals are considered passive methods and are generally used by spraying before and during the frost season.
  • these products have shown low effectiveness, less than 50%, although they directly favor the natural adaptability of plants to freezing (hardening), which decreases sharply in early spring.
  • the resistance of the plant to frost lies in maintaining the fluidity of the cell membrane during freezing and in tolerating the dehydration induced by the formation of extracellular ice crystals, which lead to the rupture of the cell membrane.
  • the plant synthesizes dehydrins and antifreeze proteins, and reduces the amount of receptors and carriers located in the membrane during the pre-hardening stage in late autumn.
  • Antifreeze proteins or antifreeze glycoproteins inhibit the formation of ice crystals by reducing the freezing point of water and also control the size, shape and aggregation of ice crystals (Hass-Roudsari et al., 2012). Antifreeze proteins produce three effects: i) thermal hysteresis, which corresponds to the difference between the freezing point and the melting temperature in a non-equilibrium state; ii) modification of ice crystal shape, resulting in hexagonal ice crystal morphologies; and
  • MI MI inhibition of ice recrystallization during thawing, in recrystallization when cryoprotective agents are not present, voluminous crystals are formed at the expense of small crystals, which cause physical damage to the cell wall and facilitate the dehydration process due to osmotic difference.
  • antifreeze proteins as cryoprotectants is technically unsustainable from an industrial point of view, because extraction from natural sources such as the blood of insects and fish generates a high environmental impact. These proteins are naturally found in very low concentrations and exert their activity in a non-colligative way, making it very difficult to obtain the critical mass of proteins necessary to replicate it. Faced with this challenge, synthetic antifreeze proteins or analogues with cryoprotective activity have been synthesized (Peltier et al., 2010; Congdon et al., 2013).
  • PVA 30%, PVA 40%, PVA 50% and PVA 60% by direct saponification of PVAc All grades of PVA formed nanoparticles using a precipitation technique, with a trend towards a smaller particle size with an increasing degree of hydrolysis of PVA; 30% PVA resulted in significantly larger nanoparticles (225 nm) compared to 40-60% PVA (137-174 nm). 3.- "Preparation of monodisperse poly (vinyl alcohol) (PVA) nanoparticles by dispersion polymerization and heterogeneous surface saponification" (Lee, Y. et al.), Fibers and Polymers 17 (4): 502-511, 2016.
  • Vinyl acetate (VAc) was dispersion polymerized in a solvent mixture of ethanol and water. By increasing the amount of ethanol in the medium, the resulting PVAc nanoparticle size increased.
  • monodisperse nanoparticles of PVAc were saponified with different concentrations at 25 ° C for 0.5 - 3.0 h.
  • the PVA / PVAc nanoparticles obtained by heterogeneous saponification with a 4% alkaline solution, were uniform and with a star size distribution, with diameters ranging between 428-615 nm. Transmission electron microscopy confirmed the spherical nature and regular core / shell structure of the PVA / PVAc nanoparticles.
  • composition Refers to the use of freeze-resistant pesticide substrates. Its composition is 20 to 50% powdery pesticide, 0.15 to 1.5% low viscosity methylcellulose, 0.1 to 2.5% polyvinyl alcohol, partially desulfurized lignin sulfate or polymerized alkylaryl sulfonate, and 46 at 79.8% in aqueous ethylene glycol or propylene glycol solution in which the glycol-water ratio is from 2: 1 to 1: 23.
  • Figure 1 corresponds to the scanning electron microscopy images (a, d, and g), to the histograms from scanning microscopy (b, e, and h) and to the transmission electron microscopy images of the PVA micro / nanoparticles obtained at starting from PVA of different weight average molecular weight (c, fei); where: (a), (b) and (c) correspond to micro / nanoparticles of L-PVA; (d), (e) and (f) to micro / nanoparticles of m-PVA; and (g), (h) and (i) to micro / nanoparticles of ⁇ -PVA.
  • Figure 2 corresponds to the FTIR spectra of the PVA macromolecules of different weight average molecular weight (a, c and e) and of the PVA micro / nanoparticles (b, d and f), where: (a) and (b) correspond to L-PVA; (c) and (d) a m-PVA; and (e) and (f) to h-PVA.
  • Figure 3 corresponds to light microscopy images of a frozen drop of water containing: PVA solution of different weight average molecular weight at 1.0% w / v (A, B, E, F, I and J); dispersion of micro / nanoparticles of PVA 1.0% w / v (C, D, G, H, K and L) and NaCl solution at 0.137 mol / L (O and P), and at 0.7 mol / L (Q and R) at time zero (A, E, I, O, C, G, K and Q) and at 60 min (B, F, J, P, D, H, L and R) of maintaining the samples at -6 ° C; where: (A), (B), (C) and (D) correspond to L-PVA; E, F, G and H to m-PVA; and (I), (J), (K) and (L) to h-PVA.
  • Figure 4 corresponds to light microscopy images of a frozen drop of water containing: PVA solution of different weight average molecular weight at 0.01% w / v (A, B, E, F, I and J) and dispersion of micro / nanoparticles of PVA 0.01% w / v (C, D, G, H, K and L) and NaCl solution at 0.07 mol / L (O and P), at time zero (A, E, I, O, C, G and K) and after 60 min (B, F, J, P, D, H and L) of keeping the samples at -6 ° C; where: (A), (B), (C) and (D) correspond to L-PVA; (E), (F), (G) and (H) to m-PVA; and (I), (J), (K) and (L) to h-PVA.
  • Figure 5 corresponds to the micro-chamber tests on the effect of the application of the different products (water, PVA solution, micro / nanoparticle dispersion and commercial cryoprotectant) on the incidence of frost damage in flower primordia under simulated frost conditions (-5 ° C for 4h); the values represent the average of different phenological states.
  • Figure 6 corresponds to the results of the field test expressed in flower primordial damage in the phenological stages of: recessed bud, swollen bud, green button and flowering when applying the different products (water, PVA solution, dispersion of micro / nanoparticles and commercial cryoprotectant); where (a) corresponds to a PVA solution at 0.1% w / v; (b) to dispersion of PVA micro / nanoparticles (0.01% w / v), (c) to commercial cryoprotective agent and (d) to water.
  • the present technology corresponds to an aqueous formulation whose active principle is a biomimetic solute that reduces damage to plants caused by spring frosts.
  • This formulation contains micro / nanoparticles of PVA, a biomimetic polymer with an inhibitory activity on ice recrystallization, which achieves protection for plants, regardless of the phenological state, in conditions down to -5 ° C and for 4 hours.
  • the aqueous formulation comprises at least the following components: a. 0.001 - 2% weight of PVA micro / nanoparticles, whose molecular weight fluctuates between 10,000 - 100,000 g / mol and the percentage of acetate groups between 1 and 20%; b. 0.0001-0.4% weight of stabilizing agents such as polyvinylpyrrolidone and / or non-ionic surfactants such as tween c. 0.0005 - 0.05% weight of commercial category IV adjuvants such as Induce pH® that acts as a buffer or stopper when diluting the formulation concentrate; d. 0.00025 - 4% weight of emulsifier such as soy lecithin to enhance the adhesion of the formulation; and.
  • stabilizing agents such as polyvinylpyrrolidone and / or non-ionic surfactants such as tween
  • stabilizing agents such as polyvinylpyrrolidone and / or non-ionic surfactants such as tween
  • the formulation based on the PVA nanoparticles is obtained through a precipitation or alkaline treatment process, which comprises at least the following steps: a. dissolving PVA: PVA must be dissolved in water in at least a 1/50 ratio in a mineral bath and with temperatures ranging between 40 - 100 ° C, depending on the molecular weight and the degree of hydrolysis of the PVA and for at least 2 hour, using agitation with speeds between 500-900 rpm. b. dissolution: sodium hydroxide must be dissolved in water at room temperature (20 ° C), using agitation with speeds between 500 - 900 rpm and concentrations that fluctuate between 2 - 8% weight / volume; c.
  • hydrochloric acid 37% w / w and density 1.18 g / mL
  • the dispersion obtained in step (d) is mixed in a reactor with the different stabilizers, emulsifiers and / or adjuvants in at least a 1/10 ratio at room temperature, using stirring at speeds between 4000 - 8000 rpm.
  • this formulation allows: - inhibit the recrystallization of ice at concentrations greater than and equal to 0.01% w / v of PVA micro / nanoparticles;
  • Example 1 Preparation of an aqueous formulation of micro / nanoparticles of PVA and evaluation of its properties.
  • the dispersion was neutralized with hydrochloric acid (37% w / w and density 1.18 g / mL).
  • the samples were labeled according to the molecular mass of the PVA.
  • the L-PVA label corresponded to the dispersion of PVA micro / nanoparticles of low Mw (13000-23000 g / mol)
  • the m-PVA label to the dispersion of PVA micro / nanoparticles of medium M w (31000- 50,000 g / mol)
  • the h-PVA tag to the high M w PVA micro / nanoparticle dispersion. (89000-98000 g / mol).
  • the morphology and size of the PVA micro / nanoparticles before and after neutralization were analyzed using a JEOL-JSM 6380LV (Tokyo, Japan) scanning electron microscope operated at 20 kV.
  • a dispersion drop of PVA micro / nanoparticles was dried at room temperature and coated with a gold film (50 nm). The magnifications were 2000x, 5000x and 10000X.
  • FIG. 1 the microscopy images can be seen, where (A), (D) and (G) correspond to micro / nanoparticles of L-PVA; (B), (E) and (H) correspond to micro / nanoparticles of m-PVA; and (C), (F) and (I) correspond to micro / nanoparticles of fr-PVA.
  • the alkaline treatment of the aqueous PVA solution produces spherical shaped particles as can be seen in Fig. 1 A, B and C.
  • the size of these PVA micro / nanoparticles was measured directly from the SEM micrographs, using ImageJ software. , and the size distribution graphs were constructed from at least 190 particles (see Fig. 1 B, E and H).
  • the average size of the PVA micro / nanoparticles was 900 ⁇ 300, 1300 ⁇ 400, 1500 ⁇ 700 nm for L-PVA, m-PVA, and ⁇ -PVA samples, respectively.
  • the size distributions of the m-PVA and ⁇ -PVA micro / nanoparticles were broader than those of the L-PVA nanoparticles.
  • the ⁇ -PVA particle samples showed a greater amount of chain-shaped aggregates than the spherical micro / nanoparticles (see Fig. 1 C, F and I).
  • the effect of the molecular weight of PVA on the average size of the micro / nanoparticles can be explained taking into account that: at the concentration of 1% w / v, the ball was formed by a single chain (Budhlall et al., 2003), and that the distance between the fully hydrolyzed PVA chains was relatively short, due to competition between polymer-solvent and polymer-polymer interactions (Mansur et al, 2008).
  • the addition of the aqueous PVA solution to the NaOH solution decreased the solubility of the PVA, since hydration of the Na + and OH ions reduces the number of free water molecules available to interact with the PVA.
  • micellar structure depends on the degree of polymerization of the PVA chains that compose them. It is proposed that the micro / nanoparticles were stabilized by electrostatic repulsion of their negative charges, probably due to the absorption of free OH groups on the PVA particles by hydrogen bonding interactions, as can be deduced from the results of infrared FTIR spectroscopy.
  • Figure 1 shows the transmission electron microscopy images of the micro / nanoparticles obtained from PVA of different weight average molecular weights, where it is observed that the neutralized particles were covered by crystals of sodium chloride, suggesting the interaction of sodium hydroxide with PVA chains.
  • FTIR Fourier transform infrared spectroscopy
  • the FTIR spectra of the PVA micro / nanoparticles and of the PVA macro-molecules were recorded in triplicate on a Perkin Elmer Spectrum Two FTIR spectrophotometer (USA), in the range of 600-4000 cnr 1 to 4 cnr 1 of resolution.
  • the FTIR spectrum was taken with attenuated total internal reflectance (ATR).
  • the spectrum is displayed in transmittance mode.
  • the baseline correction of the spectrum was performed using Spectral Manager software, version 2.
  • the data were processed according to Pozo et al. (2016), using Origin software, version 8.6.
  • the FTIR spectra of myco / nanoparticles of PVA and PVA precursors are shown in Figure 2.
  • the spectra show peaks of PVA (Awada and Daneault, 2015).
  • the broad band between 3400-3100 cnr 1 is assigned to the stretching vibrations of the OH groups.
  • the symmetric and asymmetric vibration of the CH2 groups is observed at 2910 and 2942 cnr 1 , respectively.
  • the peaks around 1420 and 840 cnr 1 are associated with in-plane bending and stretching vibrations, respectively, of the CH2 group.
  • the most intense peak at 1080 crrn 1 corresponds to the stretching of C-OH in aliphatic alcohols.
  • the band at 1142 cnr 1 is attributed to the COC stretch vibration and is related to the crystallinity of PVA. This band was similar for both the PVA macromolecule and the PVA micro / nanoparticles, suggesting that no increases in crystallinity occur when the PVA micro / nanoparticles are formed.
  • the main differences between the spectra of the PVA micro / nanoparticles and the PVA precursors are the absence of bands between 1750-1735 cnr 1 and the presence of a new band at 1647 cnr 1 in the spectra of the PVA micro / nanoparticles.
  • the absence of bands in the region between 1750-1735 cnr 1 shows that PVA was completely hydrolyzed during the alkaline treatment.
  • the band at 1647 cnr 1 was attributed to out-of-plane bending vibration or the result of d (HOH), which is influenced by bridging hydrogen bonds.
  • the d (OH) band at wave numbers greater than 1645 cm-1 indicates a high proportion of bridging hydrogen bonds in the PVA microparticles.
  • IRI activity was evaluated using a method adapted from Knight et al. (1988).
  • a 10 pL drop was dropped from a height of 1.85 m onto a microscope slide, previously chilled for 1 h with dry ice.
  • the slide was then quickly transferred to the LTS120 Peltier System (Linkam, UK) coupled to the Olympus BX43 microscope (Japan) and kept at -6 ° C for 1 hr.
  • the recrystallization process was followed during thawing at -6 ° C using a polarizer for transmitted light (U-POT). Images were collected using an Olympus SC50 video camera at 10x magnification.
  • a negative control was used NaCl solution at different concentrations and NaCl was also added to the precursor PVA solution to better distinguish the ice crystal contour.
  • the selected NaCl concentration was equal to that present in the PVA micro / nanoparticles, except for the PVA macromolecules at 1% w / v, where a lower concentration of 0.137 mol / L NaCl was used (Biggs et al. 2019) , due to the insolubility of the macromolecule in a 0.7 mol / L NaCl solution.
  • the ice crystal size before (time zero) and after (1 hour) keeping the PVA samples at -6 ° C was compared to determine the ice recrystallization inhibition activity of the PVA micro / nanoparticles. with respect to the precursor PVAs.
  • Figures 3 and 4 show the evolution of the ice crystals for samples with PVA micro / nanoparticles and for the precursor PVA macromolecules at two concentrations: 1% w / v ( Figure 3) and 0.01% w / v ( Figure 4).
  • the sizes of the ice crystals increased with time in the NaCl solution of different concentrations.
  • the precursor PVA solutions of different molecular weights and the PVA micro / nanoparticle dispersions showed smaller crystal sizes at 60 min and at -6 ° C compared to the NaCl solution, despite the fact that the PVA solution at 1% w / v had the same NaCl concentration as the negative control.
  • the dispersions of micro / nanoparticles of PVA showed higher IRI activity than the solutions of the precursor PVA. This is explained by the hydrodynamic volume that PVA particles present when adsorbed on the ice surface, which prevents adjacent ice crystals from joining to form a larger one (Knight et al., 1995). In addition, it is observed that as the molecular weight of PVA increases, the degree of inhibition of recrystallization of ice was greater, which supports our theory. e.- Evaluation of the cryoprotectors of PVA micro / nanoparticles in fruit trees.
  • the test in the micro-chamber consisted of placing naked cherry darts of different phenological states in a cold chamber and applying the different products to inhibit frost damage.
  • Darts of 4-5 cherry buds of the ' Sweetheart ' variety were placed in a plastic tray with hydrated cotton. The bracts of each bud were then stripped to expose the internal tissue to low temperatures.
  • the darts were sprayed with different products: water, 0.1% w / v PVA solution, dispersion of micro / nanoparticles ft-PVA at 0.01% w / v or commercial cryoprotective agrochemical, and immediately placed in a micro- chamber at a temperature of - 5 ° C and relative humidity of 70% for a period of 4 hours.
  • Figure 5 shows the effect of the application of the different products on the incidence of frost damage in flower buds in the micro-chamber test, where the most effective product was the dispersion of micro / nanoparticles of PVA at 0.01. % w / v. This formulation reduced the incidence of frost damage in flower buds by approximately 10% with respect to the control (water).
  • the products applied were: water, PVA solution at 0.1% w / v, micro / nanoparticle dispersion ⁇ -PVA at 0.01% w / v and commercial cryoprotective agrochemical.
  • the applications were made in the phenological stages of: recessed bud, swollen bud, green button and flowering; and before a frost event.
  • the applications of hydrogenated cyanamide and the products were made through a manual motor-sprayer (SWISSMEX®, Jalisco, Mexico) with a capacity of 15 L.
  • the micro / nanoparticle formulation of PVA at 0.01% w / v reduced the amount of damaged flower buds in the buds by 85% ( Figure 6).
  • the amount of flower primordia per dart damaged was lower in all phenological stages, except in 54 and 41 days before flowering (recessed bud stage), where a significant greater effect of primordia damaged by the application of the product.
  • the formulation with dispersed PVA micro / nanoparticles was 45% more effective in reducing the incidence of damage, compared to commercial antifreeze.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Emulsifying, Dispersing, Foam-Producing Or Wetting Agents (AREA)

Abstract

Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas que comprende: (a) 0,001 – 2% peso de micro/nanopartículas de PVA de peso molecular entre 10.000 - 100.000 g/mol y de porcentaje de grupos acetatos entre 1 y 20%; (b) 0,0001 – 0,4% peso de agentes estabilizantes; (c) 0,0005 – 0,05% peso de coadyuvantes categoría IV; (d) 0,00025 – 4% peso de emulsificante; (e) 0,003 - 6% peso de hidróxido de sodio; y (f) 0,0065 – 13 % peso de ácido clorhídrico al 37% peso/peso y densidad 1,18 g/mL. Además del proceso de elaboración de la formulación acuosa y usos.

Description

UNA FORMULACIÓN ACUOSA QUE REDUCE LOS DAÑOS PRODUCIDOS POR HELADAS PRIMAVERALES EN PLANTAS Y SU PROCESO DE ELABORACIÓN.
Sector Técnico
La tecnología está orientada al área de la agricultura, más particularmente, corresponde a una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas.
Técnica Anterior
El daño por heladas tardías o primaverales en climas templados ocasiona grandes pérdidas económicas en la agricultura. Así, por ejemplo, en el Estado de Florida, EEUU, la industria de los cítricos ha sufrido pérdidas en cosecha y en plantaciones superiores en miles de millones de dólares (ODEPA, 2010). Este evento climatológico también afecta a países andinos, así en Chile se estima que las pérdidas por las heladas del mes de septiembre de 2013 estuvieron entre US$ 600 a US$ 900 millones y que el volumen de fruta exportada disminuyó entre 15 - 20%. Estas cifras estimativas sólo se refieren a la pérdida económica de esa temporada, ya que es difícil cuantificar las pérdidas por el daño fisiológico sufrido por las plantas debido a la helada.
La magnitud de este daño depende fundamentalmente de: (i) intensidad y duración de la helada; ( 7) concentración de bacterias activas nucleantes de hielo, conocidas como INA; (7/7) grado de endurecimiento, relacionado con la adaptabilidad de las plantas a las bajas temperaturas, que decrece rápidamente después de periodos cálidos; (iv) resistencia de la planta a la congelación; y (v) estadio fenológico de la planta. Así, en árboles frutales de hojas caducas, el daño se incrementa desde el desarrollo inicial de las yemas hasta el estadio de fruto pequeño, donde los cultivos son más sensibles a las heladas.
En los árboles frutales las pérdidas económicas por heladas tardías no sólo producen la merma o pérdida total de la cosecha por frutos deformes, con corteza parcial o total áspera o manchada, podridos, sino además al daño fisiológico sufrido por los árboles. Se debe considerar que las especies frutales de carozo tales como cerezo, ciruelo, duraznero, nectarino y almendro son más susceptibles a la pérdida total de la cosecha, ya que los frutos normalmente pierden su semilla y no son capaces de mantener su desarrollo partenocárpico.
El real daño que puede causar una helada primaveral se define principalmente por su magnitud (°C bajo cero) y por su duración. A medida que la temperatura desciende por debajo de 0°C, la formación de hielo se inicia típicamente en los espacios extracelulares de plantas debido a que el fluido extracelular i generalmente tiene un punto de congelación mayor que el fluido intracelular. Los cristales de hielo extracelulares dañan la membrana celular mediante el aumento de la concentración de solutos intracelulares (deshidratación), alteran la presión osmótica a través de la membrana celular y por el estrés mecánico con el aumento del tamaño de los cristales extracelulares (Saltveit y Morris, 1990). Se estima que temperaturas inferiores a 0QC durante 30 a 45 minutos en período de floración y cuaja de especies frutales, serían suficientes para producir algún tipo de daño en las estructuras reproductivas de la planta.
Las yemas de flor son las más afectadas por las heladas primaverales, las yemas vegetativas y los brotes jóvenes suelen aguantar más, salvo en las especies más sensibles en las que puede morir el brote, rebrotando unos días más tarde por las yemas laterales. Durante el desborre, la yema es más resistente que en el estado de botón verde (flor envuelta en los sépalos), y éste más resistente que el estado con la flor abierta (estado en el que se puede afectar más fácilmente el ginecéo, al estar menos protegido por las cubiertas florales). La sensibilidad máxima se da con el fruto recién consolidado. Una vez formado el fruto, la resistencia se incrementa al aumentar el tamaño del fruto (Sakai, 1987).
Los métodos existentes para disminuir el daño por heladas primaverales se clasifican en activos y en pasivos. Los métodos activos son aplicados al comienzo y durante la ocurrencia de la helada. Su principal objetivo es evitar la pérdida de calor del suelo y/o incidir activamente en la temperatura de la planta mediante aportes externos de energía. Ejemplo de métodos activos son: inversión de las capas de aire al mezclar, con ayuda de grandes hélices, el aire frío cercano al suelo con el aire cálido de las capas atmosféricas más altas; interrupción de la radiación que se pierde desde el suelo utilizando algún tipo de cubierta sobre la vegetación; aumento de los aportes energéticos al aire que rodea al vegetal u órgano con la ayuda de quemadores; y aspersión de agua sobre los cultivos, aprovechando la planta el calor liberado que produce el cambio de estado de líquido a sólido (80 cal/g).
Entre los métodos pasivos se encuentra la selección del emplazamiento del cultivo y de las especies o variedades de plantas resistentes al frío, y manejo de la nutrición vegetal, donde se controlan los fertilizantes que se agregan a las plantas para prepararlas antes de una helada, favoreciendo el endurecimiento y la recuperación de los tejidos.
Los agroquímicos crioprotectores se consideran métodos pasivos y se emplean generalmente por aspersión antes y durante la temporada de heladas. En particular, estos productos han demostrado baja efectividad, menor al 50%, aunque favorecen directamente la adaptabilidad natural de las plantas al congelamiento (endurecimiento), la cual decrece bruscamente a comienzos de la primavera. Se debe considerar que la resistencia de la planta a la helada radica en mantener la fluidez de la membrana celular durante el congelamiento y en tolerar la deshidratación inducida por la formación de cristales de hielo extracelulares, que conllevan a la ruptura de la membrana celular. Para ello, la planta sintetiza dehídrinas y proteínas anticongelantes, y reduce la cantidad de receptores y portadores localizados en la membrana durante el estadio de pre endurecimiento a finales del otoño.
Las proteínas anticongelantes o glicoproteínas anticongelantes inhiben la formación de cristales de hielo reduciendo el punto de congelación del agua y además controlan el tamaño, la forma y la agregación de los cristales de hielo (Hass- Roudsari et al., 2012). Las proteínas anticongelantes producen tres efectos: i) histéresis térmica, que corresponde a la diferencia entre el punto de congelación y la temperatura de fusión en estado de no equilibrio; ii) modificación de la forma de los cristales de hielo, lo que resulta en morfologías de cristales de hielo hexagonales; e
MI) inhibición de la recristalización del hielo durante el descongelamiento, en la recristalización cuando no están presentes agentes crioprotectores se forman cristales voluminosos a expensa de los cristales pequeños, que provocan daños físicos a la pared celular y facilitan el proceso de deshidratación por diferencia osmótica.
El empleo de proteínas anticongelantes como crioprotectores es técnicamente insostenible desde el punto de vista industrial, debido a que la extracción desde fuentes naturales como la sangre de insectos y peces genera un alto impacto medioambiental. Estas proteínas se encuentran naturalmente en muy bajas concentraciones y ejercen su actividad de forma no coligativa, haciendo muy difícil obtener la masa crítica necesaria de proteínas para replicarla. Ante este desafío se han sintetizado proteínas anticongelantes sintéticas o análogos con actividad crioprotectora (Peltier et al., 2010; Congdon et al., 2013).
Existen macromoléculas como polivinilpirrolidona y el polivinil alcohol (PVA) que de por sí son conocidos por sus propiedades crioprotectoras, específicamente actividad inhibitoria de la recristalización del hielo, a pesar de ser estructuralmente distintos a las proteínas. Los mecanismos de acción de las macromoléculas poliméricas no están completamente dilucidados. No obstante, la mayoría de los estudios concuerdan en que la adhesión de las macromoléculas a la superficie del hielo juega un papel preponderante en su efecto crioprotector.
Se han estudiado varias estrategias para modular o mejorar las propiedades crioprotectoras del PVA. Los PVA comerciales, atácticos y completamente hidrolizados (98 - 99% de grado) presentan actividad de inhibición de la recristalización de hielo (IRI), similar a las glicoproteínas anticongelantes (Biggs et al., 2017). La arquitectura y composición molecular (peso molecular y distribución de los grupos OH y acetato) se han modificado para mejorar las propiedades crioprotectoras del PVA. En general, un aumento en el peso molecular de PVA conduce a un aumento en la actividad IRI. Sin embargo, el PVA lineal, el ramificado y el que presenta conformación de estrella tienen actividades IRI comparables. Curiosamente, la estructura supramolecular del homopolímero de PVA modificado con grupos finales de catecol y coordinado a Fe 3+ (relación PVA: Fe 3+ de 1 : 0,33) aumenta la efectividad en la actividad IRI de PVA (Phillips et al., 2016), lo que sugiere que el volumen hidrodinámico de la estructura de PVA, por ejemplo, en forma de micro/nanopartículas de este polímero biomimético, juega un rol importante en IRI.
Algunos documentos vinculados con la presente tecnología se detallan a continuación:
1.- “Effect of Polyvinyl Alcohol on Ice Formation in the Presence of a Liquid/Solid Interface” (Zhu et al.); Langmuir 33(1): 191-196, 2016. Se señala que la formación de hielo es de gran importancia en los sistemas biológicos y en algunas aplicaciones tecnológicas, y que se ha demostrado que muchos polímeros sintéticos afectan la formación de hielo, en particular el PVA. Este estudio tiene por objeto comprender este proceso ya descrito. Se introdujo la sílice coloidal (CS) como modelo de interfaz líquido-sólido y se estudió el efecto del PVA en la formación de hielo en detalle. Los resultados mostraron que tanto el PVA como el CS promovían la formación de hielo, mientras que la mezcla de ellos (CS-PVA) prevenía su formación (anticongelante). La principal contribución proviene del factor cinético en lugar del factor de barrera energética. La combinación del comportamiento de adsorción de PVA en partículas de CS, sugiere que la adsorción de PVA en la interfase reduce la nucleación del hielo, lo que puede proporcionar nuevas ideas para el desarrollo de agentes crioprotectores.
2.- “The Synthesis of High Molecular Weight Partially Hydrolyzed Poly(vinyl alcohol) Grades Suitable for Nanoparticle Fabrication” (Chana, Jasminder et al.), Journal of Nanoscience and Nanotechnology,8(11 ): 5739-5747, 2008. Se divulga que el PVA es un polímero sintético muy versátil que se forma por hidrólisis total o parcial de poli(acetato de vinilo) (PVAc). Este estudio se centra en los PVA parcialmente hidrolizados en un rango de 30 - 60%. Se sintetizaron los grados anfifílicos de PVA a escala de laboratorio, analizaron sus propiedades químicas y determinaron si estos grados podían ser utilizados para formar nanopartículas. PVA 30%, PVA 40%, PVA 50% y PVA 60% por saponificación directa de PVAc. Todos los grados de PVA formaron nanopartículas utilizando una técnica de precipitación, con una tendencia hacia un tamaño de partícula más pequeño con un grado creciente de hidrólisis de PVA; el PVA 30% resultó en nanopartículas significativamente mayores (225 nm) en comparación con el PVA 40 - 60% (137-174 nm). 3.- “Preparation of monodisperse poly(vinyl alcohol) (PVA) nanoparticles by dispersión polymerization and heterogeneous surface saponification” (Lee, Y. et al.), Fibers and Polymers 17(4): 502-511, 2016. Se describe una preparación con una distribución uniforme de tamaño de nanopartículas monodispersas de PVA/poli (acetato de vinilo) (PVAc) mediante saponificación de PVAc. El acetato de vinilo (VAc) se polimerizó en dispersión en una mezcla de disolvente de etanol y agua. Al aumentar la cantidad de etanol en el medio, el tamaño de nanopartícula de PVAc resultante aumentó. Para determinar la concentración de solución alcalina para la saponificación heterogénea, se saponificaron nanopartículas monodispersas de PVAc con diferentes concentraciones a 25°C durante 0,5 - 3,0 h. Las nanopartículas de PVA/PVAc, obtenidas por la saponificación heterogénea con una solución alcalina del 4%, fueron uniformes y con una distribución estrella de tamaño, con diámetros que oscilaron entre 428 - 615 nm. La microscopía electrónica de transmisión confirmó la naturaleza esférica y la estructura regular del núcleo/coraza de las nanopartículas de PVA/PVAc.
4.- Patente US 6,391 ,224 (Wowk): “ Polyvinyl alcohol compounds for inhibition of ice growth". Se divulga el PVA y compuestos similares para inhibir la congelación de agua y de soluciones acuosas. Se prefieren concentraciones que oscilan entre 0,01% y 10% p/p con hidrólisis de 80 a 97% y peso molecular inferior a 30kDa; u oligómeros de PVA tales como: 1 ,3, 5, 7 heptanetetrol y homólogos, son activos como compuestos inhibidores del hielo, y donde el PVA está compuesto entre 1 y 25% de acetato de vinilo.
5.- Patente US 3,399,991 (Clarence): “Freeze resistant pesticida! composition”. Se refiere al uso de sustratos de pesticidas resistentes a la congelación. Su composición es de 20 a 50% de pesticida pulverulento, 0,15 a 1 ,5% de metilcelulosa de baja viscosidad, 0,1 a 2,5% de alcohol polivinílico, sulfato de lignina parcialmente desulfurada o alquilaril sulfonato polimerizado, y 46 a 79,8% en solución acuosade etilenglicol o propilenglicol en la que la relación glicoLagua es de 2:1 a 1 :23.
En base a estos antecedentes, aún persiste la necesidad de encontrar alternativas que permitan modular la formación y el crecimiento de hielo, y con ello, inhibir la recristalización del hielo extracelular, mitigando así el daño que provocan las heladas primaverales en las plantas.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 : corresponde a las imágenes de microscopía electrónica de barrido (a, d y g), a los histogramas a partir de la microscopía de barrido (b, e y h) y a las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de las micro/nanopartículas de PVA obtenidas a partir de PVA de diferente peso molecular promedio en peso (c, f e i); donde: (a), (b) y (c) corresponde a micro/nanopartículas de L-PVA; (d), (e) y (f) a micro/nanopartículas de m-PVA; y (g), (h) e (i) a micro/nanopartículas de ñ-PVA. Figura 2: corresponde a los espectros FTIR de las macromoléculas de PVA de diferente peso molecular promedio en peso (a, c y e) y de las micro/nanopartículas de PVA (b, d y f), donde: (a) y (b) corresponde a L-PVA; (c) y (d) a m- PVA; y (e) y (f) a h- PVA.
Figura 3: corresponde a imágenes de microscopía óptica de una gota congelada de agua que contiene: solución de PVA de diferentes peso molecular promedio en peso al 1 ,0 % p/v (A, B, E, F, I y J); dispersión de micro/nanopartículas de PVA 1 ,0 %p/v (C, D, G, H, K y L) y solución de NaCI al 0,137 mol/L (O y P), y al 0,7 mol/L (Q y R) a tiempo cero (A, E, I, O, C, G, K y Q) y a los 60 min (B, F, J, P, D, H, L y R) de mantener las muestras a -6°C; donde: (A), (B), (C) y (D) corresponde a L-PVA; E, F, G y H a m-PVA; e (I), (J), (K) y (L) a h- PVA.
Figura 4: corresponde a imágenes de microscopía óptica de una gota congelada de agua que contiene: solución de PVA de diferentes peso molecular promedio en peso al 0,01 % p/v (A, B, E, F, I y J) y dispersión de micro/nanopartículas de PVA 0,01 %p/v (C, D, G, H, K y L) y solución de NaCI al 0,07 mol/L (O y P), a tiempo cero (A, E, I, O, C, G y K) y a los 60 min (B, F, J, P, D, H y L) de mantener las muestras a -6°C; donde: (A), (B), (C) y (D) corresponde a L-PVA; (E), (F), (G) y (H) a m-PVA;e (I), (J), (K) y (L) a h- PVA.
Figura 5: corresponde a los ensayos de microcámara sobre el efecto de la aplicación de los diferentes productos (agua, solución de PVA, dispersión de micro/nanopartículas y crioprotector comercial) en la incidencia del daño por heladas en primordios florales en condiciones simuladas de heladas (-5°C por 4h); los valores representan el promedio de distintos estados fenológicos.
Figura 6: corresponde a los resultados del ensayo de campo expresados en daño de primordios florales en los estados fenológicos de: yema en receso, yema hinchada, botón verde y floración al aplicar los diferentes productos (agua, solución de PVA, dispersión de micro/nanopartículas y crioprotector comercial); donde (a) corresponde a solución de PVA a 0,1 %p/v; (b) a dispersión de micro/nanopartículas de PVA (0,01 %p/v), (c) a agente crioprotector comercial y (d) a agua.
Divulgación de la Invención
La presente tecnología corresponde a una formulación acuosa cuyo principio activo es un soluto biomimético que reduce los daños en plantas producidos por heladas primaverales. Esta formulación contiene micro/nanopartículas de PVA, un polímero biomimético con actividad inhibidora de la recristalización del hielo, que logra una protección a las plantas, independientemente del estado fenológico, en condiciones de hasta -5°C y durante 4 horas.
Específicamente, la formulación acuosa comprende al menos los siguientes componentes: a. 0,001 - 2% peso de micro/nanopartículas de PVA, cuyo peso molecular fluctúa entre 10.000 - 100.000 g/mol y el porcentaje de grupos acetatos entre 1 y 20%; b. 0,0001 - 0,4% peso de agentes estabilizantes tales como polivinilpirrolidona y/o del tipo surfactantes no iónicos como tween c. 0,0005 - 0,05% peso de coadyuvantes comerciales categoría IV tales como Induce pH® que actúa como buffer o tapón al diluir el concentrado de la formulación; d. 0,00025 - 4% peso de emulsificante tal como la lecitina de soya para potenciar la adherencia de la formulación; e. 0,003 - 6% peso de hidróxido de sodio agente formador de las micro/nanopartículas de PVA; f. 0,0065 - 13 % peso de ácido clorhídrico (37% p/p y densidad 1 ,18 g/mL) como agente neutralizante.
La formulación en base a las nanopartículas de PVA se obtiene a través de un proceso de precipitación o tratamiento alcalino, el cual comprende al menos las siguientes etapas: a. disolución de PVA: el PVA se debe disolver en agua en al menos una relación 1/50 en baño mineral y con temperaturas que fluctúan entre 40 - 100 °C, dependiendo del peso molecular y el grado de hidrólisis del PVA y durante al menos 2 hora, empleando agitación con velocidades entre 500 - 900 rpm. b. disolución: el hidróxido de sodio se debe disolver en agua a temperatura ambiente (20 °C), empleando agitación con velocidades entre 500 - 900 rpm y concentraciones que fluctúan entre 2 - 8 % peso/volumen; c. mezclado: la solución obtenida en la etapa (a) se mezcla en un reactor que contiene una solución de la etapa (b) en la menos una relación de 1 /1 , mediante goteo usando una bomba peristáltica con velocidades que fluctúan entre 10 - 50 mL/h. Durante el mezclado se emplea agitación con velocidades entre 700 - 8000 rpm. En esta etapa se obtienen micro/nanopartículas de PVA cuyo tamaño fluctúa entre 300 - 3000 nm; d. neutralización: la dispersión obtenida en la etapa (c) se neutraliza con ácido clorhídrico (37% p/p y densidad 1 ,18 g/mL) hasta pH = 7, empleando agitación con velocidades entre 100 - 300 rpm; y e. mezcla de estabilizantes, emulsificantes y/o coadyuvantes: la dispersión obtenida en la etapa (d) se mezcla en un reactor con los diferentes estabilizantes, emulsificantes y/o coadyuvantes en al menos una relación 1/10 a temperatura ambiente, empleando agitación con velocidades entre 4000 - 8000 rpm.
Ventajosamente esta formulación permite: - inhibir la recristalización del hielo a concentraciones mayores e iguales que 0,01% p/v de micro/nanopartículas de PVA;
- reducir en heladas el daño en primordios florales de frutales de carozo en 20% con respecto al agua; y
- no ocasionar daños en la fruta cosechada, ni en la fruta durante la post- cosecha.
Ejemplos de aplicación
Ejemplo 1 . Elaboración de una formulación acuosa de micro/nanopartíclas de PVA y evaluación de sus propiedades.
PVA completamente hidrolizados y de tres masas moleculares promedios en peso (Mw) distintos (Mw= 13000-23000 g/mol, Mw= 31000-50000 g/mol y Mw = 89000- 98000 g/mol) se disolvieron en agua nanopura usando un baño de aceite natural y bajo un mezclador magnético a 100°C por alrededor de 2h. Una solución al 2% p/v se adicionó gota por gota a una solución de 6% p/v de hidróxido de sodio a velocidad de 30 mL/h usando una bomba a jeringa (TE 331 , Terumo, Japón) y bajo agitación constante a 700 rpm. La razón de la solución PVA:NaOH fue 1 :1. Luego, la dispersión se neutralizó con ácido clorhídrico (37% en p/p y densidad de 1 ,18 g/mL). Las muestras se etiquetaron de acuerdo a la masa molecular del PVA. Así, la etiqueta L-PVA correspondió a la dispersión de micro/nanopartículas de PVA de bajo Mw (13000-23000 g/mol), la etiqueta m-PVA a la dispersión de micro/nanopartículas de PVA de medio Mw (31000-50000 g/mol) y la etiqueta h-PVA a la dispersión de micro/nanopartículas de PVA de alto Mw. (89000-98000 g/mol).
Las micro/nanopartículas de PVA obtenidas se evaluaron mediante los siguientes ensayos: a.- Microscopía electrónica de barrido (SEM):
La morfología y tamaño de las micro/nanopartículas de PVA antes y después de la neutralización se analizaron usando un microscopio electrónico de barrido JEOL- JSM 6380LV (Tokyo, Japan) operado a 20 kV. Una gota de dispersión de micro/nanopartículas de PVA se secó a temperatura ambiente y se recubrió con una película de oro (50 nm). Los aumentos fueron 2000x, 5000x y 10000X. En la Figura 1 se pueden apreciar las imágenes de microscopía, donde (A), (D) y (G) corresponden micro/nanopartículas de L- PVA; (B), (E) y (H) corresponden amicro/nanopartículas de m-PVA; y (C), (F) e (I) corresponden a micro/nanopartículas de fr-PVA.
El tratamiento alcalino a la solución acuosa de PVA produce partículas de forma esférica como se puede observar en la Fig. 1 A, B y C. El tamaño de estas micro/nanopartículas de PVA se midió directamente de las micrografías SEM, utilizando el software ImageJ, y los gráficos de distribución de tamaño se construyeron a partir de al menos 190 partículas (ver Fig. 1 B, E y H). El tamaño promedio de las micro/nanopartículas de PVA fue de 900 ± 300, 1300 ± 400, 1500 ± 700 nm para muestras de L-PVA, m-PVA y ñ-PVA, respectivamente. El tamaño medio de partícula aumentó significativamente (prueba de Tukey, a = 0,05) al aumentar el peso molecular del PVA. Las distribuciones de tamaño de las micro/nanopartículas de m-PVA y ñ-PVA fueron más amplias que las correspondiente a las nanopartículas de L-PVA. En general, las muestras de partículas de ñ-PVA mostraron mayor cantidad de agregados en forma de cadena de las micro/nanopartículas esféricas (ver Fig. 1 C, F e I).
El efecto del peso molecular de PVA sobre el tamaño promedio de las micro/nanopartículas puede explicarse teniendo en cuenta que: a la concentración de 1% p/v, el ovillo estaba formado por una sola cadena (Budhlall et al., 2003), y que la distancia entre las cadenas de PVA completamente hidrolizado era relativamente corta, debido a la competencia entre las interacciones polímero- solvente y polímero-polímero (Mansur et al, 2008). La adición de la solución acuosa de PVA a la solución de NaOH disminuyó la solubilidad del PVA, ya que la hidratación de los iones Na+y OH reduce el número de moléculas de agua libres disponibles para interactuar con el PVA. Como resultado, la interacción polímero- polímero fue dominante y las cadenas de ovillos simples de PVA tendieron a unirse, formando una estructura micelar con forma esférica. Por lo tanto, el tamaño de esta estructura micelar depende del grado de polimerización de las cadenas de PVA que las componen. Se propone que las micro/nanopartículas se estabilizaron mediante repulsión electrostática de sus cargas negativas, probablemente debido a la absorción de grupos OH libres sobre las partículas de PVA por interacciones de puente hidrógeno, como se puede deducir de los resultados de espectroscopia infrarroja FTIR. El cambio en el entorno dieléctrico de las micro/nanopartículas de PVA mediante la adición de HCI condujo a una disposición pseudo-lineal de micro/nanopartículas, como se puede observar en las imágenes de SEM. b.- Microscopía de transmisión electrónica (TEM):
Este ensayo se realizó en un microscopio de transmisión JEOL/JEM 1200 EX II (EEUU) operado hasta 120 kV. Una gota de una dispersión diluida de micronanopartículas de PVA antes y después de la neutralización se colocó en una rejilla de Cu recubierta de carbono (G200 Hex) y luego se secó al aire.
En la Figura 1 (C, F y H) se muestra las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de las micro/nanopartículas obtenidas a partir de PVA de diferentes pesos moleculares promedios en peso, donde se observa que las partículas neutralizadas estaban recubiertas por cristales de cloruro de sodio, sugiriendo la interacción del hidróxido de sodio con las cadenas de PVA. c.- Espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR):
Los espectros FTIR de las micro/nanopartículas de PVA y de las macrocloléculas de PVA se registraron por triplicado en un espectrofotómetro Perkin Elmer Spectrum Two FTIR (EEUU), en el rango de 600 - 4000 cnr1 a 4 cnr1 de resolución. El espectro FTIR se tomó con reflectancia interna total atenuada (ATR). El espectro se muestra en modo de transmitancia. La corrección basal del espectro se realizó usando un software Spectral Manager, versión 2. Los datos fueron procesados de acuerdo a Pozo et al. (2018), usando el software Origin, versión 8.6.
Los espectros FTIR de mico/nanopartículas de PVA y precursores de PVA se muestran en la Figura 2. Los espectros muestran picos propios de PVA (Awada y Daneault, 2015). La banda ancha entre 3400 - 3100 cnr1 se asigna a las vibraciones de estiramiento de los grupos OH. La vibración simétrica y asimétrica de los grupos CH2 se observa en 2910 y 2942 cnr1 , respectivamente. Los picos alrededor de 1420 y 840 cnr1 están asociados a las vibraciones de flexión y estiramiento en el plano, respectivamente, del grupo CH2. El pico más intenso a 1080 crrn1 corresponde al estiramiento de C-OH en alcoholes alifáticos. Como era de esperar, las vibraciones asociadas al estiramiento C=0 del grupo acetato alrededor de 1715 cnr1 se observa a menor intensidad para los precursores de PVA con alto grado hidrolizado (98- 99%). La banda a 1142 cnr1 es atribuida a la vibración de estiramiento C-O-C y está relacionada con la cristalinidad del PVA. Esta banda fue similar tanto para la macromolécula de PVA como para las micro/nanopartículas de PVA, lo que sugiere que no se producen incrementos en la cristalinidad al formarse las micro/nanopartículas de PVA.
Las principales diferencias entre los espectros de las micro/nanopartículas de PVA y los PVA precursores son la ausencia de bandas entre 1750 - 1735 cnr 1 y la presencia de una nueva banda a 1647 cnr1 en los espectros de las micro/nanopartículas de PVA. La ausencia de bandas en la región entre 1750 - 1735 cnr1 da cuenta de que PVA fue completamente hidrolizado durante el tratamiento alcalino. La banda a 1647 cnr1 se atribuyó a que la vibración de doblaje fuera del plano o el resultado de d(HOH), la cual es influenciada por enlaces de hidrógeno tipo puente. La banda de d(OH) a número de onda mayores a 1645 cm-1 indica una alta proporción de enlaces de hidrógeno tipo puente en las micropartículas de PVA. d.- Ensayo de enfriamiento por salpicadura:
La actividad IRI se evaluó utilizando un método adaptado desde Knight et al. (1988). Una gota de 10 pL se dejó caer desde una altura de 1 ,85 m sobre un portaobjeto del microscopio, previamente enfriado durante 1 h con hielo seco. Luego, el portaobjeto se transfirió rápidamente al sistema Peltier LTS120 (Linkam, Reino Unido) acoplado al microscopio Olympus BX43 (Japón) y se mantuvo a -6 °C durante 1 h. El proceso de recristalización se siguió durante el descongelamiento a -6 °C utilizando un polarizador para la luz transmitida (U-POT). Las imágenes se recolectaron utilizando una cámara de video Olympus SC50 con un aumento de 10x. Como control negativo se utilizó una solución de NaCI a diferentes concentraciones y a la solución del PVA precursor también se le adicionó NaCI para distinguir mejor el contorno del cristal de hielo. La concentración de NaCI seleccionada fue igual a la presente en las micro/nanopartículas de PVA, excepto para las macromoléculas de PVA al 1% p/v, donde se utilizó una menor concentración de NaCI 0,137 mol/L (Biggs et al. 2019), debido a la insolubilidad de la macromolécula en una solución de NaCI al 0,7 mol/L. El tamaño del cristal de hielo antes (tiempo cero) y después (1 hora) de mantener a las muestras de PVA a -6°C se comparó para determinar la actividad de la inhibición de la recristalización del hielo de las micro/nanopartículas de PVA con respecto a los PVA precursores.
En las Figura 3 y 4 se muestra la evolución de los cristales de hielo para muestras con micro/nanopartículas de PVA y para las macromoléculas de PVA precursor a dos concentraciones: 1 % p/v (Figura 3) y 0,01 % p/v (Figura 4). Los tamaños de los cristales de hielo aumentaron en el tiempo en la solución de NaCI de diferentes concentraciones. Las soluciones de PVA precursor de distintos pesos moleculares y las dispersiones de micro/nanopartículas de PVA mostraron tamaños de cristales más pequeños a los 60 min y a - 6°C en comparación a la solución de NaCI, a pesar de que la solución de PVA al 1 %p/v tenía la misma concentración de NaCI que el control negativo. Las dispersiones de micro/nanopartículas de PVA presentaron mayor actividad de IRI que las soluciones de los PVA precursores. Esto se explica por el volumen hidrodinámico que presentan las partículas de PVA al ser adsorbidas en la superficie del hielo, lo que impide que los cristales de hielo adyacentes se unan para formar uno más grande (Knight et al., 1995). Además, se observa que a medida que aumenta el peso molecular del PVA, el grado de inhibición de recristalización del hielo fue mayor, lo que sustenta nuestra teoría. e.- Evaluación de las crioprotectoras de las micro/nanopartículas de PVA en árboles frutales.
Las propiedades crioprotectoras de las micro/nanopartículas de PVA en árboles frutales se evaluaron mediante ensayo de microcámara y ensayo de campo: e.1 Ensayo de microcámara:
El ensayo en la microcámara consistió en colocar dardos de cerezo desnudos de distintos estados fenológicos en cámara de frío y aplicarle los diferentes productos para inhibir el daño en heladas. Los dardos de 4 - 5 yemas de cereza de la variedad 'Sweetheart' se depositaron en una bandeja plástica con algodón hidratado. Seguidamente, las brácteas de cada yema se desnudaron para dejar el tejido interno expuesto a bajas temperaturas. Los dardos se asperjaron con diferentes productos: agua, solución de PVA al 0,1 % p/v, dispersión de micro/nanopartículas ft-PVA al 0,01% p/v o agroquímico crioprotector comercial, e inmediatamente se colocaron en una micro-cámara a temperatura de - 5°C y humedad relativa de 70% por un periodo de 4 horas. Los estados fenológicos testeados fueron: yema en receso, yema hinchada y de inicio de brotación. En la Figura 5 se muestra el efecto de la aplicación de los diferentes productos en la incidencia del daño por heladas en primordios florales en el ensayo de la microcámara, donde el producto más efectivo fue la dispersión de micro/nanopartículas de PVA al 0,01 %p/v. Esta formulación redujo aproximadamente en 10% la incidencia de daño por heladas en primordios florales con respecto al control (agua). e.2.- Ensayo de campo:
Los ensayos de campo se realizaron durante la temporada 2018-2019 en un huerto comercial de cereza del cultivar Sweetheart. El huerto del cultivar Sweetheart, estaba formado por árboles de nueve años de plantados, injertados sobre el porta- injerto Colt y plantado a una distancia de 4,5 x 3 m. Como unidad experimental se seleccionaron cuatro ramas por árbol a las que se le aplicó en el periodo de receso de la yema (julio 2018), cianamida hidrogenada (Dormex ®, T rostberg, Alemania) en una dosis del 2% v/v junto a un coadyuvante concentrado soluble (Break®, Hopewell, EEUU) en dosis del 0,01 % v/v. El experimento se planificó en un diseño de bloques completamente al azar con cuatro réplicas (árboles).
Los productos aplicados fueron: agua, solución de PVA al 0,1 % p/v, dispersión de micro/nanopartículas ñ-PVA al 0,01% p/v y agroquímico crioprotector comercial. Las aplicaciones se realizaron en los estados fenológicos de: yema en receso, yema hinchada, botón verde y floración; y antes de un evento de helada. Las aplicaciones de cianamida hidrogenada y de los productos se realizaron a través de una moto- pulverizadora manual (SWISSMEX®, Jalisco, México) con capacidad de 15 L.
En la temporada de 2018-2019 la cantidad de horas acumuladas con temperaturas bajo 0o C superó las 200 horas en la localidad donde se emplaza el huerto comercial en estudio. En este caso, la formulación micro/nanopartículas de PVA al 0,01% p/v redujo en un 85% la cantidad de primordios florales dañados en las yemas (Figura 6). Para este producto la cantidad de primordios florales por dardo dañados fue menor en todos los estados fenológicos, excepto en 54 y 41 días antes de la floración (estado de yema en receso), en donde no se apreció un efecto significativo mayor de primordios dañados por la aplicación del producto. La formulación con micro/nanopartículas de PVA dispersas fue 45% más efectiva en reducir la incidencia de daño, en comparación al anticongelante comercial.
Finalmente, estos ensayos permitieron demostrar que la formulación en base a nanopartículas de PVA permite reducir el daño producido por heladas en las plantas.

Claims

Reivindicaciones
1.- Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas CARACTERIZADO porque comprende al menos los siguientes componentes:
1. 0,001 - 2% peso de micro/nanopartículas de PVA de peso molecular entre 10.000 - 100.000 g/mol y de porcentaje de grupos acetatos entre 1 y 20%; ii. 0,0001 - 0,4% peso de agentes estabilizantes; i¡¡. 0,0005 - 0,05% peso de coadyuvantes categoría IV; iv. 0,00025 - 4% peso de emulsificante; v. 0,003 - 6% peso de hidróxido de sodio; y vi. 0,0065 - 13 % peso de ácido clorhídrico al 37% peso/peso y densidad 1 ,18 g/mL.
2.- Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas según reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el agente estabilizante es polivinilpirrolidona y/o surfactantes no iónicos como tween.
3.- Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas según reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque los coadyuvantes de categoría IV es del tipo Induce pH®.
4.- Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas según reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el emulsificante es lecitina de soya.
5.- Un proceso para elaborar la formulación acuosa CARACTERIZADO porque comprende al menos las siguientes etapas: a. disolución de PVA: el PVA se debe disolver en agua en al menos una relación 1/50 en baño mineral y con temperaturas que varían entre 40 - 100 °C, dependiendo del peso molecular y el grado de hidrólisis de PVA y durante al menos 2 hora, empleando agitación con velocidades entre 500 - 900 rpm; b. disolución de hidróxido de sodio: se debe disolver hidróxido de sodio en agua a temperatura ambiente, empleando agitación con velocidades entre 500 - 900 rpm y concentraciones que varían entre 2 - 8 % peso/volumen; c. obtención de micro/nanopartículas de PVA: la solución obtenida en la etapa “a” se mezcla en un reactor que contiene la solución de la etapa “b” en al menos una relación de 1/1 , mediante goteo usando una bomba peristáltica con velocidades que varían entre 10 - 50 mL/h y utilizando agitación con velocidades entre 700 - 8000 rpm, para obtener micro/nanopartículas de PVA cuyo tamaño varía entre 300 - 3000 nm; d. neutralización: la dispersión obtenida en la etapa “c” se neutraliza con ácido clorhídrico hasta pH 7, empleando agitación con velocidades entre 100 - 300 rpm; y e. mezcla de estabilizantes, emulsificantes y/o coadyuvantes: la dispersión neutralizada se mezcla en un reactor con los diferentes estabilizantes, emulsificantes y/o coadyuvantes en al menos una relación 1/10 a temperatura ambiente, empleando agitación con velocidades entre 4000 - 8000 rpm.
6.- Uso de la formulación acusa CARACTERIZADO porque sirve para inhibir la recristalización del hielo.
7.- Uso de la formulación acuosa CARACTERIZADO porque sirve para reducir los daños en plantas en heladas de hasta -5°C y durante 4 horas.
PCT/CL2020/050090 2019-08-14 2020-08-11 Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas y su proceso de elaboración WO2021026669A1 (es)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR112022002816A BR112022002816A2 (pt) 2019-08-14 2020-08-11 Formulação aquosa que reduz os danos causados por geadas de primavera em plantas e método de produção da mesma
US17/632,152 US11992007B2 (en) 2019-08-14 2020-08-11 Aqueous formulation that reduces damage caused by spring frosts in plants and production method thereof
EP20851715.1A EP4015522A4 (en) 2019-08-14 2020-08-11 AQUEOUS FORMULATION FOR REDUCING SPRING FREEZE DAMAGE TO PLANTS AND METHOD OF PRODUCTION
CONC2022/0001374A CO2022001374A2 (es) 2019-08-14 2022-02-10 Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas y su proceso de elaboración.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CL2019002299A CL2019002299A1 (es) 2019-08-14 2019-08-14 Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas y su proceso de elaboración.
CL2299-2019 2019-08-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021026669A1 true WO2021026669A1 (es) 2021-02-18

Family

ID=70457274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CL2020/050090 WO2021026669A1 (es) 2019-08-14 2020-08-11 Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas y su proceso de elaboración

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11992007B2 (es)
EP (1) EP4015522A4 (es)
BR (1) BR112022002816A2 (es)
CL (1) CL2019002299A1 (es)
CO (1) CO2022001374A2 (es)
WO (1) WO2021026669A1 (es)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3399991A (en) 1964-05-05 1968-09-03 Du Pont Freeze-resistant pesticidal composition
US6391224B1 (en) 1998-09-21 2002-05-21 21St Century Medicine, Inc. Polyvinyl alcohol compounds for inhibition of ice growth

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013117925A1 (en) * 2012-02-08 2013-08-15 University Of Warwick Cryopreservation of cells in absence of vitrification inducing agents

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3399991A (en) 1964-05-05 1968-09-03 Du Pont Freeze-resistant pesticidal composition
US6391224B1 (en) 1998-09-21 2002-05-21 21St Century Medicine, Inc. Polyvinyl alcohol compounds for inhibition of ice growth

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GHANA, JASMINDER ET AL.: "The Synthesis of High Molecular Weight Partially Hydrolyzed Poly(vinyl alcohol) Grades Suitable far Nanoparticle Fabrication", JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY, vol. 8, no. 11, 2008, pages 5739 - 5747
INADA, T. ET AL.: "Thermal hysteresis caused by non-equilibrium antifreeze activit of poly (vinyl alcohol)", CHEMICAL PHYSICS LETTERS, vol. 394, 29 July 2004 (2004-07-29), pages 361 - 365, XP055793905, Retrieved from the Internet <URL:https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0009261404010553> [retrieved on 20201023], DOI: 10.1016/j.cplett. 2004.07.021 *
LEE, Y. ET AL.: "Preparation of monodisperse polyvinyl alcohol) (PV A) nanoparticles by dispersion polymerization and heterogeneous surface saponification", FIBERS AND POLYMERS, vol. 17, no. 4, 2016, pages 502 - 511
STRUBBS, C. ET AL.: "Multivalent Presentation of Ice Recrystallization Inhibiting Polymers on Nanoparticles Retain Activity", LANGMUIR, vol. 35, 10 August 2018 (2018-08-10), pages 7347 - 7353, XP055793901, Retrieved from the Internet <URL:https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.langmuir.8b01952> [retrieved on 20201023], DOI: 10.1021/acs.langmuir.8b01952 *
VALENZUELA, M. ET AL.: "Efectividad de la aplicación de un agente crioprotector en el control del daño por heladas en cerezo (Prunus avium L.", TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MAGISTER EN CIENCIAS AGRONÓMICAS CON MENCIÓN EN PRODUCCIÓN Y PROTECCIÓN VEGETAL, VER TODO EL DOCUMENTO, 9 October 2020 (2020-10-09), XP055793908, Retrieved from the Internet <URL:http-//repositorio.udec.cl/jspui/handle/11594/824> [retrieved on 20201023] *
VALENZUELA, M. ET AL.: "POLÍMERO DE PVA COMO HERRAMIENTA PARA PREVENIR EL DAÑO POR HELADAS EN YEMAS FLORALES DEL CEREZO Prunus avium L.", CHILEAN JOURNAL OF AGRICULTURAL & ANIMAL SCIENCES (EX AGRO-CIENCIA), vol. 36, no. 2, 28 July 2020 (2020-07-28), pages 97 - 109, XP055793902, Retrieved from the Internet <URL:http://dx.doi.org/10.29393/chjaas36-7pm40007> [retrieved on 20201023] *
WANG, C. ET AL.: "Foliar uptake of pesticides. Present status and future challenge", PESTICIDE BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY, vol. 87, 19 May 2006 (2006-05-19), pages 1 - 8, XP005726058, Retrieved from the Internet <URL:https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0048357506000691> [retrieved on 20201023], DOI: 10.1016/j.pestbp. 2006.04.00 4 *
ZHU ET AL.: "Effect of Polyvinyl Alcohol on Ice Formation in the Presence of a Liquid! Solid Interface", LANGMUIR, vol. 33, no. 1, 2016, pages 191 - 196

Also Published As

Publication number Publication date
CL2019002299A1 (es) 2020-04-24
EP4015522A1 (en) 2022-06-22
BR112022002816A2 (pt) 2022-05-10
US11992007B2 (en) 2024-05-28
US20220312760A1 (en) 2022-10-06
EP4015522A4 (en) 2023-10-04
CO2022001374A2 (es) 2022-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20090104446A1 (en) Polymers for Protecting Materials from Damage
US4601842A (en) Prevention of freezing at moderate supercooling using biogenic ice nucleation inhibitors
JP2013530109A (ja) 安定化された生物学的に利用可能な可溶性ケイ酸塩溶液
BR112013012174B1 (pt) Composição concentrada emulsionável, processo para preparar a composição e método para controlar fungos fitopatogênicos
AU758412B2 (en) Compositions for protecting plants from frost and/or freeze and methods of application thereof
JP2003516120A (ja) 植物の霜害からの保護のためにその過冷却を高める方法
CN105884508A (zh) 茶树专用防寒抗冻水溶肥、其制备方法及应用
CN106417262A (zh) 一种壳聚糖基植物叶面水分蒸发抑制剂及其制备方法
CN102014634B (zh) 提高作物对冰冻和/或霜冻的耐受性的方法
WO2021026669A1 (es) Una formulación acuosa que reduce los daños producidos por heladas primaverales en plantas y su proceso de elaboración
Wisniewski et al. Extrinsic ice nucleation in plants: what are the factors involved and can they be manipulated?
CN103461328A (zh) 异丙甲草胺微囊悬浮剂及其制备方法和应用
EP2700316A1 (en) Use of a herbicidal composition for controlling parasitic plants
MXPA97000140A (es) Mejoramiento del regimen de germinacion de semilla con aplicacion de inhibidores de biosintesis de etileno
ES2265305B1 (es) Composicion acuosa crioprotectora y metodo de aplicacion.
CN110612985B (zh) 一种猕猴桃除芽剂及其应用
AU2008281323A1 (en) A composition and uses thereof
CN107646843A (zh) 用于防治十字花科植物夜蛾的增效型悬浮剂及其制备方法
WO2022195326A1 (es) COMPOSICION PARA EL SECADO DE TILLANDSIA sp
WO2005110083A1 (es) Composición acuosa crioprotectora y método de aplicación
Arnoldussen Plant Based Dispersions Are a Novel Class of Sprayable Frost Protectants for Fruit Crop
CN117279507A (zh) 稳定的农用化学品悬浮液浓缩剂组合物
Li et al. Crop performance of chilled plants treated with GLK-8903
RU2522522C1 (ru) Способ обработки садовых деревьев и винограда для защиты от низких температур и весенних заморозков
CN112752799A (zh) 保护植物免受冷害的植物基组合物

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112022002816

Country of ref document: BR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20851715

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020851715

Country of ref document: EP

Effective date: 20220314

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112022002816

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20220214