WO2020262092A1 - 光学測定装置及び光学測定システム - Google Patents

光学測定装置及び光学測定システム Download PDF

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原　雅明
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    • G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths

Definitions

  • the present disclosure relates to an optical measuring device and an optical measuring system.
  • FCM flow cytometer
  • microparticles flowing in a row in a flow path are irradiated with laser light of a specific wavelength, and light such as fluorescence, forward scattered light, or lateral scattered light emitted from each microparticle is emitted.
  • the type, size, structure, etc. of individual fine particles are determined by converting them into electrical signals with a detector, digitizing them, and performing statistical analysis on the results.
  • the optical measuring device of one form according to the present disclosure receives and fluoresces a spectroscopic optical system that disperses fluorescence emitted from a biological sample and the fluorescence dispersed by the spectroscopic optical system.
  • the image sensor includes an image sensor that generates information, and the image sensor is divided into a plurality of regions that receive different wavelength components of the fluorescence and generate fluorescence information for each of the wavelength components.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the schematic configuration example of the flow cytometer which concerns on 1st Embodiment. It is a schematic diagram which shows an example of the spectroscopic optical system in FIG. It is a block diagram which shows the schematic structure example of the image sensor which concerns on 1st Embodiment. It is a figure which shows an example of the positional relationship between a pixel array part and a detection circuit array in FIG. It is a figure which shows an example of the connection relationship between a pixel and a detection circuit in FIG. It is a circuit diagram which shows the circuit structure example of the pixel which concerns on 1st Embodiment. It is a timing chart which shows the operation example of the pixel which concerns on 1st Embodiment.
  • Timing chart which shows the operation example of the pixel which concerns on the modification of 1st Embodiment. It is a timing chart for demonstrating the operation example of the pulse light detection in the flow cytometer which concerns on 1st Embodiment. It is a figure which shows an example of the relationship between the position on the pixel array part and the wavelength of the dispersed light which concerns on 1st Embodiment. It is a figure which shows the example of the case where the image sensor which concerns on 1st Embodiment is made into a multi-channel. It is a figure which shows the spectrum of the fluorescence emitted from four kinds of fluorescent dyes excited by the excitation light of a wavelength 488 nm.
  • FIG. 1 shows an example of the virtual filter which concerns on 1st Embodiment realized with respect to the fluorescence shown in FIG.
  • FIG. 2nd Embodiment It is a block diagram which shows the schematic structure example of the optical measuring apparatus (system) which concerns on 2nd Embodiment.
  • the fluorescence amount of each fine particle is analyzed by extracting the fluorescence measured from the fine particles (also referred to as a sample or a biological sample) using the spectral information of the fluorescence marker used for staining.
  • an array type photodetector for spectrum detection is provided instead of the photodetector in which as many as the number of fluorescence markers are arranged in the conventional flow cytometer.
  • a multi-channel PMT in which a plurality of photomultiplier tubes are arranged in an array is used.
  • the number of channels in a multi-channel PMT is determined based on the wavelength width and wavelength resolution required to reproduce all fluorescence spectrum information excited by a laser beam of a certain wavelength. For example, assuming that the wavelength width required to reproduce the fluorescence spectrum information is about 300 nm, which is 500 to 800 nm, and the required wavelength resolution is about 9 to 10 nm, the number of channels of the multi-channel PMT is 30 to 32 channels. Set to degree.
  • wavelength widths and wavelength resolutions can be changed to some extent by optical design, it is difficult to easily change them after the device is commercialized because optical adjustment or the like is required.
  • a plurality of channels corresponding to the optimum wavelength width for fluorescence from each fluorescence marker are collectively signal-processed on the software.
  • a two-dimensional image sensor is used for the array type photodetector. Since the two-dimensional image sensor is smaller than the multi-channel PMT, it is possible to reduce the overall device scale.
  • the two-dimensional image sensor has more detection units than the multi-channel PMT, the wavelength resolution is fine and it is possible to acquire fluorescence spectrum information with high resolution. Therefore, it is possible to improve the reproducibility of the optical filter characteristics.
  • the optical measuring device and the optical measuring system according to the first embodiment will be described in detail with reference to the drawings.
  • the flow cytometer according to the present disclosure is not limited to the single spot type, and may be various flow cytometers such as a multi-spot type.
  • the single spot type means that there is one irradiation spot of the laser beam (excitation light)
  • the multi-spot type means that there are a plurality of irradiation spots.
  • the flow cytometer is classified into a cell analyzer type and a cell sorter type depending on whether or not it has a function of collecting a sample after the test, and the flow cytometer according to the present embodiment is either of them. You may.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a schematic configuration example of the flow cytometer as the optical measuring device or the optical measuring system according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic view showing an example of the spectroscopic optical system in FIG.
  • the flow cytometer 11 includes a flow cell 31, an excitation light source 32, a photodiode 33, a spectroscopic optical system 37, an individual image sensor (hereinafter referred to as an image sensor) 34, and a condenser lens 35. And 36.
  • a cylindrical flow cell 31 is provided in the upper part of the drawing, and the sample tube 51 is interpolated in the flow cell 31 substantially coaxially.
  • the flow cell 31 is a flow path through which the sample 53 flows, and has a structure in which the sample flow 52 flows downward in the drawing, and further, the sample 53 composed of cells or the like is discharged from the sample tube 51.
  • the sample 53 rides on the sample stream 52 in the flow cell 31 and flows down in a line.
  • the excitation light source 32 is, for example, a laser light source that emits excitation light 71 having a single wavelength, and irradiates the excitation light 71 to an irradiation spot 72 set at a position where the sample 53 passes.
  • the excitation light 71 may be continuous light or pulsed light having a certain long time width.
  • the sample 53 scatters the excitation light 71 and excites the sample 53 and the fluorescent marker attached to the sample 53.
  • the component that goes in the direction opposite to the excitation light source 32 across the irradiation spot 72 is referred to as the forward scattered light 73.
  • the scattered light also includes a component that goes away from the straight line connecting the excitation light source 32 and the irradiation spot 72 and a component that goes from the irradiation spot 72 to the excitation light source 32.
  • lateral scattered light a component that goes away from the straight line connecting the excitation light source 32 and the irradiation spot 72 and heads in a predetermined direction (hereinafter referred to as lateral) is referred to as lateral scattered light, and the excitation light source from the irradiation spot 72
  • backward scattered light a component that goes away from the straight line connecting the excitation light source 32 and the irradiation spot 72 and heads in a predetermined direction
  • the excited sample 53, the fluorescence marker, or the like when the excited sample 53, the fluorescence marker, or the like is deexcited, fluorescence having a wavelength peculiar to the atoms or molecules constituting them is emitted.
  • This fluorescence is radiated from the sample 53, the fluorescence marker, etc. in all directions, but in the configuration shown in FIG. 1, the components radiated from the irradiation spot 72 in a specific direction (sideways) are analyzed.
  • the target fluorescence is 74.
  • the light emitted laterally from the irradiation spot 72 includes laterally scattered light and the like in addition to fluorescence, but in the following, for simplification of the description, light components and the like other than the fluorescence 74 are appropriately omitted. ..
  • the forward scattered light 73 that has passed through the irradiation spot 72 is converted into parallel light by the condenser lens 35, and then the photo is arranged on the opposite side of the irradiation spot 72 from the excitation light source 32 at an angle slightly deviated from the optical axis. It is incident on the diode 33.
  • the fluorescence 74 is converted into parallel light by the condenser lens 36 and then incident on the spectroscopic optical system 37.
  • Each of the condenser lenses 35 and 36 may include other optical elements such as a filter that absorbs a specific wavelength and a prism that changes the traveling direction of light.
  • the condenser lens 36 may include an optical filter that reduces the laterally scattered light among the incident side scattered light and the fluorescence 74.
  • the spectroscopic optical system 37 includes, for example, one or more optical elements 371 such as a prism and a diffraction grating, and emits incident fluorescence 74 toward different angles for each wavelength.
  • the light is dispersed on the dispersed light 75.
  • the spreading direction H1 of the dispersed light 75 that is, the spectral direction by the spectroscopic optical system 37 is the row direction in the pixel array unit 91 of the image sensor 34 described later.
  • the dispersed light 75 emitted from the spectroscopic optical system 37 is incident on the image sensor 34. Therefore, the image sensor 34 is incident with dispersed light 75 having different wavelengths depending on the position in the direction H1.
  • the forward scattered light 73 is light having a large amount of light
  • the side scattered light and fluorescence 74 are weak pulsed light generated when the sample 53 passes through the irradiation spot 72. Therefore, in the present embodiment, the timing at which the sample 53 has passed through the irradiation spot 72 is detected by observing the forward scattered light 73 with the photodiode 33.
  • the photodiode 33 constantly observes the forward scattered light 73 emitted from the irradiation spot 72. In that state, when the amount of light detected by the passage of the sample 53 is increased by the forward scattered light 73, the photodiode 33 generates a trigger signal indicating the passage of the sample 53 at the timing when the amount of light increases, and this trigger signal is generated. Is input to the image sensor 34.
  • the image sensor 34 is, for example, an image sensor composed of a plurality of pixels in which an AD (Analog to Digital) converter is built in the same semiconductor chip.
  • Each pixel has a photoelectric conversion element and an amplification element, and the photoelectrically converted charge is accumulated inside the pixel.
  • a signal reflecting the amount of accumulated charge (pixel signal, also referred to as pixel value) is amplified and output via an amplification element at a desired timing, and is converted into a digital signal by a built-in AD converter.
  • spectral type flow cytometer 11 that disperses the fluorescence 74 emitted from the sample 53 by wavelength has been illustrated, but the present invention is not limited to this, and for example, the fluorescence 74 may not be separated. It is possible. In that case, the spectroscopic optical system 37 may be omitted.
  • the forward scattered light 73 is used to generate the trigger signal
  • the present invention is not limited to this, and for example, side scattered light, backscattered light, fluorescence, or the like is used.
  • a trigger signal may be generated.
  • FIG. 3 is a block diagram showing a schematic configuration example of a CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) type image sensor according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of the positional relationship between the pixel array unit and the detection circuit array in FIG.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of the connection relationship between the pixel and the detection circuit in FIG.
  • the CMOS type image sensor is a solid-state image sensor (also referred to as a solid-state image sensor) created by applying or partially using a CMOS process.
  • the image sensor 34 according to the first embodiment may be a so-called back-illuminated type in which the incident surface is a surface (hereinafter referred to as a back surface) opposite to the element forming surface of the semiconductor substrate, or the front surface side. It may be a so-called surface irradiation type.
  • the size, number, number of rows, number of columns, etc. illustrated in the following description are merely examples and can be changed in various ways.
  • the image sensor 34 includes a pixel array unit 91, a connection unit 92, a detection circuit 93, a pixel drive circuit 94, a logic circuit 95, and an output circuit 96.
  • the pixel array unit 91 includes, for example, a plurality of pixels 101 arranged in a matrix of 320 pixels in the row direction H1 and 36 pixels in the column direction V1 (hereinafter referred to as 320 ⁇ 36 pixels).
  • the size of each pixel 101 on the array surface may be, for example, 15 ⁇ m (micrometer) ⁇ 15 ⁇ m. In that case, the opening of the pixel array portion 91 is 4.8 mm (millimeter) ⁇ 0.54 mm.
  • the pixel drive circuit 94 drives each pixel 101 to cause each pixel 101 to generate a pixel signal.
  • the logic circuit 95 controls the drive timing of the detection circuit 93 and the output circuit 96 in addition to the pixel drive circuit 94. Further, the logic circuit 95 and / or the pixel drive circuit 94 also functions as a control unit that controls the reading of the pixel signal to the pixel array unit 91 in accordance with the passage of the irradiation spot 72 by the sample 53.
  • the image sensor 34 may further include an amplifier circuit such as an operational amplifier that amplifies the pixel signal before AD conversion.
  • an amplifier circuit such as an operational amplifier that amplifies the pixel signal before AD conversion.
  • the fluorescence 74 emitted laterally from the irradiation spot 72 is collimated by the condenser lens 36 and then converted into dispersed light 75 by the spectroscopic optical system 37. Then, the dispersed light 75 is incident on different regions on the light receiving surface where the pixels 101 of the pixel array unit 91 are arranged.
  • a wavelength component determined by the position of the row direction H1 in the pixel array unit 91 is input to each pixel 101 of the pixel array unit 91.
  • a wavelength component determined by the position of the row direction H1 in the pixel array unit 91 is input to each pixel 101 of the pixel array unit 91.
  • the image sensor 34 of FIG. 2 light having a shorter wavelength is incident on the pixel 101 located on the right side, and light having a longer wavelength is incident on the pixel 101 located on the left side.
  • Each pixel 101 generates a pixel signal according to the amount of illuminated light.
  • the generated pixel signal is read by, for example, a detection circuit 93 provided one-to-one with respect to the pixel 101.
  • Each detection circuit 93 includes an AD converter and converts the read analog pixel signal into a digital pixel signal.
  • the plurality of detection circuits 93 are arranged in two groups (detection circuit arrays 93A and 93B) with respect to the pixel array unit 91, for example.
  • One detection circuit array 93A is arranged on the upper side in the column direction of the pixel array unit 91, for example, and the other detection circuit array 93B is arranged on the lower side in the column direction of the pixel array unit 91, for example.
  • a plurality of detection circuits 93 are arranged in one row or a plurality of rows along the row direction.
  • each detection circuit 93 of the detection circuit array 93A arranged on the upper side in the column direction of the pixel array unit 91 is connected to the upper half of the pixels 101 in the column direction of the pixel array unit 91 and is arranged on the lower side in the column direction.
  • Each detection circuit 93 of the detection circuit array 93B may be connected to the lower half of the pixel 101 in the column direction of the pixel array unit 91.
  • the present invention is not limited to this, and for example, each detection circuit 93 of the detection circuit array 93A is connected to the even-numbered row of pixels 101, and each detection circuit 93 of the detection circuit array 93B is connected to the odd-numbered row of pixels 101. It may be deformed.
  • a plurality of detection circuits 93 may be arranged in one row or a plurality of rows on one side (for example, the upper side in the column direction) of the pixel array unit 91.
  • the pixel array unit 91 36 pixels 101 are arranged in the column direction V1. Therefore, it is necessary to arrange 36 detection circuits 93 for one row of pixels. Therefore, as described above, when the detection circuits 93 are grouped into two detection circuit arrays 93A and 93B and the number of rows of each is one row, the 36 pixels 101 arranged in one column are each grouped. Eighteen detection circuits 93 may be arranged in each of the detection circuit arrays 93A and 93B.
  • the pixel signal read from each pixel 101 by the detection circuit 93 is converted into a digital pixel signal by the AD converter of each detection circuit 93. Then, the digital pixel signal is output to the external signal acquisition system 1 via the output circuit 96 as fluorescence information (corresponding to fluorescence spectrum information; hereinafter referred to as spectrum image) indicating information for each wavelength of the fluorescence 74. ..
  • the signal acquisition system (also referred to as a signal acquisition unit) 1 evaluates, for example, the spectrum image input from the image sensor 34, and inputs the evaluation value as a result to the analysis system 2. For example, the signal acquisition system 1 divides the spectrum image into a plurality of regions (corresponding to channel regions described later) arranged along the row direction H1 and adds up the pixel values of the pixels included in each region. Calculate the evaluation value of the spectral image (corresponding to the multi-channel analysis described later). Further, the signal acquisition system 1 adds up the pixel values of the pixels included in each of one or more regions (corresponding to a virtual filter described later) set in advance or arbitrarily set by the user to obtain a spectrum image. It may have a so-called virtual filter function for calculating an evaluation value.
  • Such a signal acquisition system 1 may be a DSP (Digital Signal Processor), an FPGA (Field-Programmable Gate Array), or the like provided in or outside the same chip as the image sensor 34, or may be a bus to the image sensor 34. It may be an information processing device such as a personal computer connected via a network or a network.
  • DSP Digital Signal Processor
  • FPGA Field-Programmable Gate Array
  • the analysis system 2 executes various analysis processes based on the evaluation value input from the signal acquisition system 1. For example, the analysis system 2 acquires information such as the type, size, and structure of the sample 53 based on the evaluation value. Further, the analysis system 2 may display the spectrum image and the evaluation value to the user and provide a UI (user interface) as an analysis tool.
  • Such an analysis system 2 may be, for example, an information processing device such as a personal computer connected to the signal acquisition system 1 via a bus or a network.
  • FIG. 6 is a circuit diagram showing an example of a pixel circuit configuration according to the first embodiment.
  • the pixel 101 includes a photodiode (also referred to as a photoelectric conversion element) 111, a storage node 112, a transfer transistor 113, an amplification transistor 114, a reset transistor 116, and a floating diffusion layer (Floating Diffusion:). FD) 117 and the like.
  • a photodiode also referred to as a photoelectric conversion element
  • storage node 112 a transfer transistor 113
  • an amplification transistor 114 a reset transistor 116
  • FD floating diffusion layer
  • a circuit composed of a photodiode 111, a transfer transistor 113, an amplification transistor 114, a reset transistor 116, and a floating diffusion layer 117 is also referred to as a pixel circuit. Further, the configuration of the pixel circuit excluding the photodiode 111 is also referred to as a readout circuit.
  • the photodiode 111 converts photons into electric charges by photoelectric conversion.
  • the photodiode 111 is connected to the transfer transistor 113 via the storage node 112.
  • the photodiode 111 generates a pair of electrons and holes from photons incident on the semiconductor substrate on which it is formed, and stores the electrons in the storage node 112 corresponding to the cathode.
  • the photodiode 111 may be of a so-called embedded type in which the storage node 112 is completely depleted when the charge is discharged by resetting.
  • the transfer transistor 113 transfers the electric charge from the storage node 112 to the floating diffusion layer 117 under the control of the row drive circuit 121.
  • the floating diffusion layer 117 accumulates electric charges from the transfer transistor 113, and generates a voltage having a voltage value corresponding to the amount of the accumulated electric charges. This voltage is applied to the gate of the amplification transistor 114.
  • the reset transistor 116 initializes by discharging the electric charge accumulated in the storage node 112 and the floating diffusion layer 117 to the power supply 118.
  • the gate of the reset transistor 116 is connected to the row drive circuit 121, the drain is connected to the power supply 118, and the source is connected to the stray diffusion layer 117.
  • the row drive circuit 121 controls the reset transistor 116 and the transfer transistor 113 to be on, pulls out the electrons stored in the storage node 112 to the power supply 118, and brings the pixels 101 into a dark state before storage, that is, The light is initialized to the non-incident state. Further, the row drive circuit 121 pulls out the electric charge accumulated in the floating diffusion layer 117 to the power supply 118 by controlling only the reset transistor 116 to be in the ON state, and initializes the electric charge amount.
  • the amplification transistor 114 amplifies the voltage applied to the gate and causes it to appear in the drain.
  • the gate of the amplification transistor 114 is connected to the floating diffusion layer 117, the source is connected to the power supply, and the drain is connected to the vertical signal line 124.
  • the amplification transistor 114 and the constant current circuit 122 form a source follower circuit.
  • the amplification transistor 114 amplifies the voltage of the floating diffusion layer 117 with a gain of a little less than 1 and causes it to appear on the vertical signal line 124.
  • the voltage appearing on the vertical signal line 124 is read out as a pixel signal by the detection circuit 93 including the AD conversion circuit.
  • the pixel 101 having the above configuration accumulates the electric charge generated by the photoelectric conversion internally during the period from the resetting of the photodiode 111 to the reading of the pixel signal. Then, when the pixel signal is read out, the pixel signal corresponding to the accumulated charge appears on the vertical signal line 124.
  • the row drive circuit 121 in FIG. 6 is, for example, a part of the pixel drive circuit 94 in FIG. 3, and the detection circuit 93 and the constant current circuit 122 are, for example, a part of the detection circuit 93 in FIG. Good.
  • FIG. 7 is a timing chart showing an operation example of the pixel according to the first embodiment.
  • the row drive circuit 121 applies a transfer control signal TRG applied to the gate of the transfer transistor 113 and a reset control applied to the gate of the reset transistor 116 at a timing immediately before the accumulation period. Raise the signal RST to a high level. As a result, both the transfer transistor 113 and the reset transistor 116 are turned on, and the electric charge accumulated in the storage node 112 between the photodiode 111 and the transfer transistor 113 is discharged to the power supply 118.
  • this control will be referred to as "PD reset”.
  • the reset transistor 116 when the reset transistor 116 is turned on, the floating diffusion layer 117 is also connected to the power supply 118 via the reset transistor 116, so that the electric charge accumulated in the floating diffusion layer 117 is also discharged to the power supply 118.
  • the row drive circuit 121 controls the transfer transistor 113 and the reset transistor 116 to the off state by lowering the transfer control signal TRG and the reset control signal RST to a low level. By this control, the storage node 112 is suspended and a new storage period is started.
  • the row drive circuit 121 raises the transfer control signal TRG to a high level.
  • the transfer transistor 113 is turned on, and the electric charge accumulated in the storage node 112 between the photodiode 111 and the transfer transistor 113 is transferred to the floating diffusion layer 117.
  • this control will be referred to as "charge transfer”.
  • the detection circuit 93 reads a signal (hereinafter referred to as sampling) of the stored signal appearing on the vertical signal line 124 during the period from the timing t14 when the transfer control signal TRG is lowered to the low level to the timing t15.
  • sampling a signal of the stored signal appearing on the vertical signal line 124 during the period from the timing t14 when the transfer control signal TRG is lowered to the low level to the timing t15.
  • the stored signal appearing on the vertical signal line 124 is read out by the detection circuit 93 as a pixel signal having a voltage value corresponding to the exposure amount to the photodiode 111, and is converted into a digital signal.
  • Multiple sampling of this stored signal is treated as the first readout in CDS (correlated double sampling) described later.
  • the row drive circuit 121 raises the reset control signal RST to a high level.
  • the reset transistor 116 is turned on, and the electric charge accumulated in the floating diffusion layer 117 is discharged to the power supply line VDD via the reset transistor 116.
  • this control will be referred to as "FD reset".
  • the voltage of the floating diffusion layer 117 in the reset state is amplified by the amplification transistor 114 and appears on the vertical signal line 124.
  • the potential that appears on the vertical signal line 124 when the floating diffusion layer 117 is in the reset state is referred to as a reset level.
  • the detection circuit 93 samples the pixel signal of the reset level appearing on the vertical signal line 124 during the period from the timing t16 to the timing t17 when the reset control signal RST is lowered to the low level.
  • the reset level appearing on the vertical signal line 124 is read out by the detection circuit 93 as a pixel signal of the voltage value (reset level) when the floating diffusion layer 117 is in the reset state, and is converted into a digital signal. Will be done.
  • This reset level multiple sampling is treated as a second readout in CDS (correlated double sampling) described later.
  • the detection circuit 93 compares the sampled accumulated signal with the reset signal, and determines the amount of incident photons based on the comparison result.
  • the detection circuit 93 may execute sampling of the stored signal a plurality of times, add all of them, and calculate an average value thereof, if necessary. Similarly, the detection circuit 93 may perform sampling of the reset signal a plurality of times, add all of them, and calculate an average value thereof, if necessary.
  • the detection circuit 93 executes the CDS for calculating the difference between the accumulated signal (or its average value) and the reset signal (or its average value).
  • the kTC noise generated at the time of FD reset is canceled, and a net pixel signal based on the amount of light of the fluorescence 74 is obtained.
  • the storage period of each pixel (pixel circuit) 101 is a period between the above-mentioned PD reset operation and the storage signal reading operation.
  • the transfer control signal TRG is turned off at the time of PD reset, and then the charge is transferred. Occasionally, it is the period until the transfer control signal TRG is turned off again.
  • a photon is incident on the photodiode 111 and an electric charge is generated during this storage period, it becomes a difference between the reset signal and the storage signal, and is acquired by the detection circuit 93 as the above-mentioned net pixel signal.
  • the noise mixed in with the AD conversion process can be canceled out.
  • FIG. 8 is a timing chart showing an operation example of the pixel according to the modified example.
  • the FD reset at the timings t15 to t16 performed in FIG. 7 is omitted, and the reset signal sampling is executed during the accumulation period of the timings t12 to t13 after the PD reset.
  • the next storage period of the photodiode 111 will start immediately after the charge transfer is completed, that is, when the transfer control signal TRG is turned off. As a result, the dead period during which the photons incident on the pixel 101 are not detected becomes almost zero.
  • the shortest cycle of unit accumulation can be defined by the total time required for sampling the reset signal and sampling the accumulated signal.
  • FIG. 9 is a timing chart for explaining an operation example of pulsed light detection in the flow cytometer according to the first embodiment.
  • the light intensity of the fluorescence 74 is drawn as a pulse waveform PL1 as shown in the uppermost stage of FIG. 9 as the sample 53 passes through the irradiation spot 72, and each pulse waveform PL1 passes through one sample 53.
  • the waveform corresponds to.
  • the light intensity of the forward scattered light 73 detected by the photodiode 33 shown in the middle part of FIG. 9 is a pulse having a timing similar to that of the pulse waveform PL1 in the upper part of FIG. 9 and having a large intensity increase rate. It is drawn like a waveform PL2.
  • the photodiode 33 acquires the passing timing of the sample 53 from the comparison between the intensity of the pulse waveform PL2 of the forward scattered light and the threshold value Th1, and generates the event signal S11.
  • the read access sequence is a global shutter with almost no dead period according to FIG.
  • the start and end of the accumulation period are performed simultaneously for all pixels.
  • the charge is transferred within the pixel in synchronization with the event signal S11 indicating the passage of the sample 53, and the accumulation period ends all the pixels at once.
  • the reading of the pixel signal is started. Further, at this time, the next storage period starts all at once for all pixels.
  • the image sensor 34 ends the accumulation period in the pixel, starts reading the pixel signal, and further starts the next accumulation period.
  • the timing T62 is the timing after a certain delay time t1 in consideration of the flow velocity and the magnitude of the sample 53 has elapsed from the timing T61 when the event signal S11 is acquired.
  • the pixel signal is read out by acquiring the difference between the AD conversion value of the stored signal and the AD conversion value of the reset signal that has already been acquired, thereby deriving a net pixel signal that offsets kTC noise and the like. Will be done. Further, following this, the reset signal is acquired and the AD conversion is performed in the next cycle, and when it is completed, the end of the next storage period and the reading can be performed. That is, the shortest cycle of event processing is equal to the shortest cycle of the unit storage period, which is determined by the time required for acquisition and AD conversion of each of the storage signal and the reset signal.
  • the total value of the net pixel signals output from the plurality of pixels 101 in each event processing corresponds to the total amount of photons received by the photodetector for each pulse.
  • the intensity of fluorescence 74 for each sample 53 is derived. That is, in the present embodiment, the incident light is integrated in the pixel 101 by accumulating the charge obtained by photoelectric conversion in the pixel 101 inside. Therefore, the AD conversion for the output from each pixel 101 may be performed once, and it is not necessary to perform the AD conversion a plurality of times in time series.
  • the minimum interval of events that can be handled is about 10 ⁇ s, and a maximum of 100,000 events can be handled per second.
  • the event that is, the passage of the sample 53 through the irradiation spot 72, can be evaluated.
  • a register is provided in the detection circuit 93 to temporarily store the pixel signal. By doing so, it is possible to execute the AD conversion of the reset signal and the stored signal and the output of the pixel signal in parallel by the pipeline method, so that the time required for the output of the pixel signal limits the storage cycle. There is no.
  • the event signal S11 indicating that the sample 53 has passed is generated at the timing T61 of the down edge where the pulse waveform PL2 is below the threshold value L1, but the pulse waveform PL2 is not limited to this. It may be generated at the timing T63 of the up edge that exceeds the threshold value L1. When the event signal S11 is generated at the up-edge timing T63, it becomes easy to deal with fluctuations in the size and flow rate of the sample 53.
  • the event signal S11 may be generated by using the detection result of the lateral scattered light or the fluorescence 74 (dispersed light 75). In that case, the light for event detection and the light for sample analysis may be separated and the light for event detection may be incident on the photodiode 33.
  • a light receiving element for generating an event may be separately mounted in the image sensor 34.
  • the delay time t1 from the event signal S11 is fixed here, the intensity attenuation of the pulse waveform PL2 due to the forward scattered light 73 is generally larger as the sample 53 is larger. Therefore, the intensity of the pulse waveform PL2 may be evaluated, for example, at the beginning of the pulse, and the length of the delay time t1 may be set accordingly. In this case, a longer delay time t1 may be set for the large sample 53.
  • a so-called global shutter method in which reading is started all at once for all the pixels of the pixel array unit 91 has been illustrated, but the present invention is not limited to this.
  • the rolling shutter method when one detection circuit 93 is connected to a plurality of pixels 101 in the same row, it is possible to adopt a so-called rolling shutter method in which pixel signals are read out in order from the pixels 101 connected to the same detection circuit 93. Is.
  • the rolling shutter method is adopted, the drain of the amplification transistor 114 and the vertical signal line 124 in the pixel circuit of each pixel 101 are connected to the drain of the amplification transistor 114 and the vertical signal line 124 according to the selection signal from the row drive circuit 121.
  • a selection transistor is added to control the connection of.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of the relationship between the position on the pixel array unit and the wavelength of dispersed light according to the first embodiment. ..
  • the spectroscopic optical system 37 disperses the fluorescence 74 in the row direction H1 and emits the dispersed light 75 spread in the row direction H1.
  • light having a wavelength of 500 nm is incident on the pixel 101 located on the leftmost side in the row direction H1
  • light having a wavelength of 800 nm is incident on the pixel 101 located on the rightmost side.
  • Fluorescence 74 is separated.
  • each pixel 101 has a wavelength width of about 0.9 to 1 nm depending on the position of the row direction H1. Light will be incident.
  • FIG. 11 is a diagram showing an example of multi-channel image sensor according to the first embodiment. That is, in this description, a case where the image sensor 34 is used as a multi-channel PMT is exemplified. Note that FIG. 11 shows a case where the image sensor 34 is divided into 32 channels.
  • the pixel array unit 91 is divided into a total of 32 regions in which the number of pixels in the row direction H1 is 10 pixels each.
  • the signal acquisition system 1 divides the spectrum image G1 acquired from the pixel array unit 91 into a total of 32 channel regions CH1 to CH32 having 10 pixels each in the row direction H1. In that case, the wavelength width of the light contained in each channel region CH1 to CH32 is about 9 to 10 nm.
  • the number of channels realized in the multi-channelization that is, the number of divisions of the pixel array unit 91 or the spectrum image G1 in the row direction H1 is not limited to 32, and can be variously modified.
  • the number of pixels in the row direction H1 in the pixel array unit 91 is 320 pixels, it is possible to divide into a channel region of a minimum of 1 channel and a maximum of 320 channels.
  • the width (number of pixels) of the row direction H1 of each channel region can be set separately for each channel region.
  • the light having a long wavelength has a wider spread in the row direction H1 than the light having a short wavelength.
  • the number of pixels in the row direction H1 such as the channel regions CH31 and CH32 where the long wavelength light is incident is set to the number of pixels of the channel regions CH1 and CH2 where the short wavelength light is incident. It may be larger than the number of pixels in the row direction H1.
  • the spectroscopic optical system 37 includes a prism that disperses the fluorescence 74 in a predetermined direction (for example, the direction corresponding to the row direction H1)
  • the first region for example, the direction in which the first wavelength component of the fluorescence 74 is incident is incident.
  • the width (number of pixels) of the row direction H1 of the channel region CH1) is the width (number of pixels) of the row direction H1 of the second region (for example, the channel region CH32) in which the second wavelength component longer than the first wavelength component is incident. May be narrower than.
  • the present embodiment when performing multi-channel analysis on the fluorescence 74, it is possible to freely design the number of channels, the channel width (wavelength width) of each channel, the center wavelength of each channel, and the like. is there.
  • FIG. 12 is a diagram showing a spectrum of fluorescence emitted from four types of fluorescent dyes, FITC, PE, PerCP-Cy5.5 and PE-Cy7, which are excited by excitation light having a wavelength of 488 nm.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of a virtual filter according to the first embodiment realized for the fluorescence shown in FIG. In FIG. 13, the leftmost pixel row in the pixel array unit 91 is the pixel row # 1, and the rightmost pixel row is the pixel row # 320.
  • fluorescent L1 having a center wavelength of about 530 nm is emitted from FITC.
  • fluorescent L2 having a central wavelength of about 585 is emitted from PE
  • fluorescent L3 having a central wavelength of about 695 nm is emitted from PerCP-Cy5.5
  • fluorescent L4 having a central wavelength of about 780 nm is emitted from PE-Cy7. Be radiated.
  • the signal acquisition system 1 has the center of the row direction H1 as the pixel string # 33 corresponding to the wavelength 530 nm and the width of the row direction H1 as the wavelength 30 nm with respect to the fluorescence L1 from the FITC.
  • a virtual filter (also referred to as a filter region) F1 having 33 pixels corresponding to the spectrum image G1 is set.
  • a virtual filter F2 in which the center of the row direction H1 is the pixel string # 91 corresponding to the wavelength 585 nm and the width of the row direction H1 is 46 pixels corresponding to the wavelength 42 nm is used as the spectrum image G1.
  • a virtual filter F3 in which the center of the row direction H1 is the pixel string # 208 corresponding to the wavelength of 695 nm and the width of the row direction H1 is 44 pixels corresponding to the wavelength of 40 nm is used.
  • the spectrum image G1 For the fluorescence L4 from PE-Cy7, the spectrum image is a virtual filter F4 in which the center of the row direction H1 is the pixel string # 299 corresponding to the wavelength of 780 nm and the width of the row direction H1 is 44 pixels corresponding to the wavelength of 40 nm. Set to G1.
  • the number of pixels in the column direction V1 may be 36 pixels, which is the same as the number of pixels in the column direction V1 of the pixel array unit 91, for example.
  • the total value of the pixel signals output from each pixel 101 of 33 ⁇ 36 pixels constituting the virtual filter F1 for example, from the signal acquisition system 1.
  • the total value of the pixel signals output from each pixel 101 of 44 ⁇ 36 pixels constituting the virtual filter F4 are output as an evaluation value.
  • the image sensor 34 as the photodetector, it is possible to acquire fluorescence spectrum information having fine wavelength resolution and high resolution, so that the reproducibility of the optical filter characteristics is improved. In addition, it is possible to set an optimum virtual filter for the fluorescence emitted from each fluorescent dye.
  • the number of virtual filters to be set, the center wavelength and / or wavelength width of each virtual filter, etc. can be freely designed according to the wavelength of the excitation light 71 to be used, the sample 53, and / or the type of the fluorescent marker, etc. It is possible. For example, when another fluorescent dye is added to the four fluorescent dyes illustrated in FIG. 12, the added virtual filter can be set in the spectrum image G1. At that time, the center wavelength and / or the wavelength width of each virtual filter may be adjusted in the region where the spectra of different fluorescence are close to each other.
  • the two-dimensional image sensor 34 is used as the array type photodetector in the spectrum type flow cytometer 11.
  • the scale of the apparatus can be reduced as compared with the case where the multi-channel PMT is used for the array type photodetector.
  • the image sensor 34 has a finer wavelength resolution and can acquire fluorescence spectrum information having a higher resolution than the multi-channel PMT, it is possible to realize a virtual filter that faithfully reproduces the optical filter characteristics. Is possible.
  • the image sensor 34 it is possible to add pixel values in an arbitrary wavelength width, so that the number of channels can be increased / decreased, the channel width can be changed, and the virtual filter function can be used when performing multi-channel analysis. It also has the advantage of facilitating design changes after commercialization, such as increasing or decreasing the number of filters and changing the center wavelength / wavelength width of each filter.
  • the spectrum type flow cytometer is exemplified, but the technique according to the present disclosure is not limited to the flow cytometer, and for example, digital pathology imaging (DPI) or the like. It can also be applied to medical devices.
  • DPI digital pathology imaging
  • DPI digital pathology imaging
  • the sample 53 is placed on the stage, and the sample 53 placed on the stage is scanned by the excitation light 71 from the excitation light source 32.
  • the scanning of the sample 53 placed on the stage by the excitation light 71 is controlled by the scanning control unit that controls the positional relationship between the stage and the excitation light source 32.
  • DPI digital pathology imaging
  • a line sensor in which pixels 101 are linearly arranged is used as the image sensor 34.
  • the line sensor receives the fluorescence 74 emitted from the sample 53 to obtain two-dimensional or three-dimensional image data (spectral image) for the entire sample 53. Generate.
  • the generated spectral image is input to the signal acquisition system 1 and evaluated, and the evaluation value is input to the analysis system 2 for analysis, as in the first embodiment.
  • FIG. 14 is a block diagram showing a schematic configuration example of the optical measuring device (system) according to the second embodiment.
  • the optical measuring device 200 of the present embodiment includes an observation unit 201.
  • the observation unit 201 was excited in a line shape with an excitation unit 210 that irradiates a pathological specimen (pathological sample) with a plurality of line illuminations having different wavelengths arranged in parallel to different axes, a sample stage 220 that supports the pathological specimen, and a line. It has a spectroscopic imaging unit 230 that acquires a fluorescence spectrum (spectral data) of a pathological specimen.
  • the optical measuring device 200 further includes a processing unit 202 corresponding to the signal acquisition system 1 and the analysis system 2 in the first embodiment.
  • the processing unit 202 typically forms an image of the pathological specimen (corresponding to a spectral image) or fluorescence based on the fluorescence spectrum of the pathological specimen (hereinafter, also referred to as sample S) acquired by the observation unit 201. Output the distribution of the spectrum.
  • the image referred to here refers to a composition ratio such as a dye constituting the spectrum or autofluorescence derived from a sample, an image converted from a waveform into RGB (red, green, blue) color, a luminance distribution in a specific wavelength band, and the like.
  • the excitation unit 210 and the spectroscopic imaging unit 230 are connected to the sample stage 220 via an observation optical system 240 such as an objective lens.
  • the observation optical system 240 has a function of following the optimum focus by the focus mechanism 260.
  • a non-fluorescent observation unit 270 for dark field observation, bright field observation, or the like may be connected to the observation optical system 240.
  • the focus mechanism 260, the non-fluorescent observation unit 270, and the like are connected to a control unit (PC (Personal Computer), etc.) that performs storage, control, and calculation processing.
  • PC Personal Computer
  • the excitation unit 210 includes a plurality of light sources capable of outputting a plurality of excitation lights having different wavelengths.
  • the plurality of light sources are typically composed of a light emitting diode (LED), a laser diode (LD), a mercury lamp, or the like, each of which is line-illuminated and irradiates the sample S of the sample stage 220.
  • Sample S is typically composed of slides including an observation target such as a tissue section, but of course other than that may be used.
  • Sample S is stained with a plurality of fluorescent dyes.
  • the observation unit 201 magnifies the sample S to a desired magnification for observation.
  • a plurality of line illuminations are arranged, and a plurality of imaging areas of the spectroscopic imaging unit 230 are arranged so as to overlap each illumination area.
  • the two line lights are arranged in parallel and separated from each other.
  • the longitudinal direction of each line illumination is the X-axis direction, and the arrangement direction is the Y-axis direction.
  • the wavelengths that make up the first line illumination and the wavelengths that make up the second line illumination are different from each other.
  • the line-shaped fluorescence excited by these line illuminations is observed in the spectroscopic imaging unit 230 via the observation optical system 240.
  • the spectroscopic imaging unit 230 includes an observation slit having a plurality of slits through which fluorescence excited by a plurality of line illuminations can pass, and at least one image sensor (image sensor) capable of individually receiving fluorescence that has passed through the observation slits. (Equivalent to 34). Two-dimensional imagers such as CCD (Charge Coupled Device) and CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) are used as the image sensor. By arranging the observation slits on the optical path, it is possible to detect the fluorescence spectra excited in each line without overlapping.
  • the spectroscopic imaging unit 230 acquires fluorescence spectroscopic data (x, ⁇ ) using a pixel array in one direction (for example, the vertical direction) of the image sensor as a wavelength channel from each line illumination.
  • the obtained spectral data (x, ⁇ ) are recorded in the processing unit 202 in a state in which the spectral data excited from which excitation wavelength is associated with each other.
  • the processing unit 202 can be realized by hardware elements used in a computer such as a CPU (Central Processing Unit), RAM (Random Access Memory), and ROM (Read Only Memory), and necessary software. Even if PLD (Programmable Logic Device) such as FPGA (Field Programmable Gate Array), DSP (Digital Signal Processor), or other ASIC (Application Specific Integrated Circuit) is used in place of or in addition to the CPU. Good.
  • CPU Central Processing Unit
  • RAM Random Access Memory
  • ROM Read Only Memory
  • PLD Programmable Logic Device
  • FPGA Field Programmable Gate Array
  • DSP Digital Signal Processor
  • ASIC Application Specific Integrated Circuit
  • the processing unit 202 has a storage unit 221 that stores spectral data representing the correlation between the wavelengths of the plurality of line illuminations and the fluorescence received by the image sensor.
  • a storage device such as a non-volatile semiconductor memory or a hard disk drive is used in the storage unit 221, and a standard spectrum of autofluorescence related to the sample S and a standard spectrum of a dye alone that stains the sample S are stored in advance.
  • the spectral data (x, ⁇ ) received by the image sensor is stored in, for example, the storage unit 221.
  • the observation unit 201 further includes a scanning mechanism 250 that scans a plurality of line illuminations with respect to the sample stage 220 in the Y-axis direction, that is, in the arrangement direction of each line illumination.
  • a scanning mechanism 250 that scans a plurality of line illuminations with respect to the sample stage 220 in the Y-axis direction, that is, in the arrangement direction of each line illumination.
  • dye spectra (fluorescence spectra) excited at different excitation wavelengths which are spatially separated by ⁇ y on the sample S, can be continuously recorded in the Y-axis direction.
  • the shooting area is divided into a plurality of parts in the X-axis direction, the sample S is scanned in the Y-axis direction, then the sample S is moved in the X-axis direction, and the scan in the Y-axis direction is repeated. ..
  • a single scan can capture spectroscopic images from samples excited by several excitation wavelengths.
  • the sample stage 220 is typically scanned in the Y-axis direction, but a plurality of line illuminations may be scanned in the Y-axis direction by a galvanometer mirror arranged in the middle of the optical system.
  • the three-dimensional data (X, Y, ⁇ ) is acquired for each of the plurality of line illuminations. Since the three-dimensional data derived from each line illumination is data whose coordinates are shifted by ⁇ y with respect to the Y axis, it is corrected and output based on the value of ⁇ y recorded in advance or the value of ⁇ y calculated from the output of the image sensor 34. To.
  • the line illumination as the excitation light is composed of two lines, but the line illumination is not limited to this, and may be three, four, or five or more lines.
  • each line illumination may include a plurality of excitation wavelengths selected so as not to deteriorate the color separation performance as much as possible.
  • the different axes are parallel. Although the resolution is not as high as that, a multicolor spectrum can be obtained.
  • the image forming unit 223 is based on the spectroscopic data stored in the storage unit 221 (or the spectroscopic data calibrated by the data calibration unit 222) and the interval corresponding to the interaxial distance ( ⁇ y) of the excitation line. Form a fluorescent image of.
  • the three-dimensional data derived from each line illumination is data whose coordinates are shifted by ⁇ y with respect to the Y axis, it is corrected and output based on the value of ⁇ y recorded in advance or the value of ⁇ y calculated from the output of the image sensor.
  • the image forming unit 223 executes a process (stitching) for connecting the captured images into one large image. Thereby, a pathological image regarding the multiplexed sample S can be acquired.
  • the formed fluorescence image is output to the display unit 203.
  • the image forming unit 223 is based on the standard spectra of the autofluorescence of the sample S and the dye alone stored in the storage unit 221 in advance, and the autofluorescence of the sample S and the dye from the captured spectral data (measurement spectrum). Separately calculate the component distribution.
  • a calculation method a least squares method, a weighted least squares method, or the like can be adopted, and a coefficient is calculated so that the captured spectral data becomes a linear sum of the standard spectra.
  • the calculated coefficient distribution is stored in the storage unit 221 and output to the display unit 203 to be displayed as an image.
  • the light detection unit of the DPI can be the image sensor 34 as in the first embodiment.
  • the multi-channel analysis and the virtual filter function can be applied to the DPI.
  • the present technology can also have the following configurations.
  • a spectroscopic optical system that disperses the fluorescence emitted from a biological sample
  • An image sensor that receives the fluorescence dispersed by the spectroscopic optical system and generates fluorescence information
  • the image sensor is an optical measuring device that is divided into a plurality of regions that receive different wavelength components of the fluorescence and generate fluorescence information for each of the wavelength components.
  • the optical measuring device further comprising a signal acquisition unit for evaluating the fluorescence information generated by the image sensor.
  • the signal acquisition unit divides the fluorescence information into a plurality of channel regions arranged along the spectral direction of the fluorescence dispersed by the spectroscopic optical system, and adds up the pixel values of each of the plurality of channel regions.
  • the optical measuring apparatus according to (3) above, which calculates an evaluation value of the fluorescence information.
  • the optical measuring device calculates an evaluation value of the fluorescence information by adding up the pixel values of each of one or more filter regions in the fluorescence information.
  • the spectroscopic optical system includes a prism that disperses the fluorescence in a predetermined direction. Of the plurality of regions, the width of the first region in which the first wavelength component of the fluorescence is incident is longer than the first wavelength component of the fluorescence in the direction corresponding to the predetermined direction.
  • the optical measuring apparatus according to any one of (1) to (5), which is narrower than the width of the second region in which the component is incident in the direction corresponding to the predetermined direction.
  • the optical measuring device according to (3) further comprising an analysis unit that analyzes the biological sample based on the evaluation result of the fluorescence information by the signal acquisition unit.
  • the image sensor is Multiple photoelectric conversion elements arranged in a matrix and A detection circuit that generates a plurality of the pixel values constituting the fluorescence information based on the electric charge generated in each of the photoelectric conversion elements.
  • an excitation light source for irradiating the biological sample with excitation light having a predetermined wavelength.
  • the excitation light source irradiates a predetermined region in the flow path with the excitation light.
  • An excitation light source that emits excitation light of a predetermined wavelength
  • the optical measuring apparatus according to any one of (1) to (10) above.
  • a spectroscopic optical system that disperses the fluorescence emitted from a biological sample
  • An image sensor that receives the fluorescence dispersed by the spectroscopic optical system and generates fluorescence information
  • a signal acquisition unit that evaluates the fluorescence information generated by the image sensor
  • An analysis unit that analyzes the biological sample based on the evaluation result of the fluorescence information by the signal acquisition unit,
  • the image sensor is an optical measurement system including a plurality of regions that receive different wavelength components of the fluorescence and generate fluorescence information for each wavelength component.

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Abstract

大型化を抑制しつつマルチカラー分析を可能にする。実施形態に係る光学測定装置は、生体検体から放射した蛍光を分光する分光光学系（３７）と、前記分光光学系で分光された前記蛍光を受光して蛍光情報を生成するイメージセンサ（３４）と、を備え、前記イメージセンサは、それぞれ前記蛍光のうちの異なる波長成分を受光して前記波長成分ごとの蛍光情報を生成する複数の領域に分割されている。

Description

光学測定装置及び光学測定システム
　本開示は、光学測定装置及び光学測定システムに関する。
　従来、細胞、微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子の蛋白質を分析するための方法として、フローサイトメトリー（Flow　Cytometry）が存在する。このフローサイトメトリーに用いられる装置は、フローサイトメータ（Flow　Cytometer：ＦＣＭ)と称される。フローサイトメータでは、流路内を１列になって流れる微小粒子に特定波長のレーザ光を照射して、各微小粒子から発せられた蛍光や前方散乱光や側方散乱光などの光を光検出器で電気信号に変換して数値化し、その結果に対して統計解析を行うことにより、個々の微小粒子の種類、大きさ、構造などが判定される。
　また、近年では、基礎医学及び臨床分野の要請に基づき、複数の蛍光色素を使用したマルチカラー分析が可能なフローサイトメータが開発されている。
特開２０１７－５８３６１号公報
　しかしながら、従来のフローサイトメータでは、光検出器として光電子増倍管（Photomultiplier　Tube）が使用されていたため、マルチカラー分析を可能とした場合の装置構成が大型化してしまうという課題が存在した。
　そこで本開示では、大型化を抑制しつつマルチカラー分析を可能とした光学測定装置及び光学測定システムを提案する。
　上記の課題を解決するために、本開示に係る一形態の光学測定装置は、生体検体から放射した蛍光を分光する分光光学系と、前記分光光学系で分光された前記蛍光を受光して蛍光情報を生成するイメージセンサと、を備え、前記イメージセンサは、それぞれ前記蛍光のうちの異なる波長成分を受光して前記波長成分ごとの蛍光情報を生成する複数の領域に分割されている。
第１の実施形態に係るフローサイトメータの概略構成例を示す模式図である。 図１における分光光学系の一例を示す模式図である。 第１の実施形態に係るイメージセンサの概略構成例を示すブロック図である。 図３における画素アレイ部と検出回路アレイとの位置関係の一例を示す図である。 図３における画素と検出回路との接続関係の一例を示す図である。 第１の実施形態に係る画素の回路構成例を示す回路図である。 第１の実施形態に係る画素の動作例を示すタイミングチャートである。 第１の実施形態の変形例に係る画素の動作例を示すタイミングチャートである。 第１の実施形態に係るフローサイトメータにおけるパルス光検出のオペレーション例を説明するためのタイミングチャートである。 第１の実施形態に係る画素アレイ部上の位置と分散光の波長との関係の一例を示す図である。 第１の実施形態に係るイメージセンサをマルチチャネル化する場合の例を示す図である。 波長４８８ｎｍの励起光で励起された４種類の蛍光色素から放射された蛍光のスペクトルを示す図である。 図１２に示す蛍光に対して実現される第１の実施形態に係るバーチャルフィルタの一例を示す図である。 第２の実施形態に係る光学測定装置（システム）の概略構成例を示すブロック図である。
　以下に、本開示の一実施形態について図面に基づいて詳細に説明する。なお、以下の実施形態において、同一の部位には同一の符号を付することにより重複する説明を省略する。
　また、以下に示す項目順序に従って本開示を説明する。
　　１．はじめに
　　２．第１の実施形態
　　　２．１　フローサイトメータの概略構成例
　　　２．２　イメージセンサの構成例
　　　２．３　画素の回路構成例
　　　２．４　画素の動作例
　　　　２．４．１　画素動作の変形例
　　　２．５　パルス光検出のオペレーション例
　　　２．６　画素アレイ部上の位置と分散光の波長との関係例
　　　２．７　イメージセンサをマルチチャネル化する場合
　　　２．８　イメージセンサでバーチャルフィルタ機能を実現する場合
　　　２．９　作用・効果
　３．第２の実施形態
　１．はじめに
　フローサイトメータを用いた分析のうち、一度の測定で複数の蛍光色素（蛍光マーカともいう）を使用するマルチカラー分析では、それぞれの光検出器に目的以外の蛍光マーカからの光が漏れ込み、分析精度が低下してしまう場合がある。そこで従来のフローサイトメータでは、目的の蛍光マーカから目的の光情報のみを取り出すために蛍光補正を行っているが、スペクトルが近接している蛍光マーカの場合、光検出器への漏れ込みが大きくなるために蛍光補正がうまくできないという問題が発生することがある。
　このような問題を解消するため、蛍光のスペクトルを取得して解析する、いわゆるスペクトル型のフローサイトメータが開発されている。スペクトル型フローサイトメータでは、微小粒子（検体又は生体検体ともいう）から測定された蛍光を染色に使用した蛍光マーカのスペクトル情報を使って抽出することで、各微少粒子の蛍光量を分析する。
　このようなスペクトル型フローサイトメータには、従来のフローサイトメータでは蛍光マーカの数だけ多数配置している光検出器の代わりに、スペクトル検出用のアレイ型の光検出器が設けられる。
　アレイ型光検出器には、例えば、複数の光電子増倍管がアレイ状に配列するマルチチャネルＰＭＴが用いられる。マルチチャネルＰＭＴのチャンネル数は、ある波長のレーザ光で励起された全ての蛍光スペクトラム情報を再現するのに必要な波長幅及び波長分解能に基づいて決定される。例えば、蛍光スペクトラム情報を再現するのに必要な波長幅が５００～８００ｎｍのおよそ３００ｎｍであり、必要な波長分解能がおよそ９～１０ｎｍであるとすると、マルチチャネルＰＭＴのチャネル数は、３０～３２チャンネル程度に設定される。
　これら波長幅と波長分解能とは、光学設計によりある程度変更可能ではあるが、光学調整等が必要になるため、装置が製品化された後で容易に変更することは困難である。
　また、スペクトル型フローサイトメータで取得された蛍光スペクトラム情報を解析するための機能として、各蛍光マーカからの蛍光に最適な波長幅に相当するチャンネルを複数まとめてソフトウエア上で信号処理して、光学フィルタを疑似的に再現する、いわゆるバーチャルフィルタ機能が存在するが、上記のようなマルチチャネルＰＭＴを使用した場合、蛍光スペクトラム情報を再現するのに必要な波長幅とマルチチャネルＰＭＴで実現し得るチャンネル数とから決定される波長分解能によって各バーチャルフィルタの波長幅の取り得る値が離散した値になるため、光学フィルタの特性を忠実に再現することが困難であった。
　そこで以下の実施形態では、アレイ型光検出器に２次元イメージセンサを用いることとする。２次元イメージセンサは、マルチチャネルＰＭＴと比較して小型であるため、全体的な装置規模を縮小することが可能である。
　また、２次元イメージセンサは、マルチチャネルＰＭＴと比較して、検出部が多いため、波長分解能が細かく、解像度の高い蛍光スペクトラム情報を取得することが可能である。そのため、光学フィルタ特性の再現性を高めることが可能となる。
　さらに、２次元イメージセンサを用いることで、任意の波長幅で画素値を加算することが可能となるため、マルチチャネル分析を行なう際のチャネル数の増減やチャネル幅の変更、バーチャルフィルタ機能を使用する場合のフィルタ数の増減や各フィルタの中心波長／波長幅の変更など、製品化後の設計変更が容易になるというメリットも備える。
　２．第１の実施形態
　まず、第１の実施形態に係る光学測定装置及び光学測定システムについて、図面を参照して詳細に説明する。本実施形態では、シングルスポット型のフローサイトメータについて例を挙げるが、本開示に係るフローサイトメータは、シングルスポット型に限定されず、マルチスポット型など、種々のフローサイトメータであってよい。なお、シングルスポット型とは、レーザ光（励起光）の照射スポットが１つであることを意味し、マルチスポット型とは、照射スポットが複数であることを意味する。また、フローサイトメータは、検査後の検体を分取する機能を備えるか否かで、セルアナライザ型とセルソータ型とに分類されるが、本実施形態に係るフローサイトメータは、そのどちらであってもよい。
　２．１　フローサイトメータの概略構成例
　図１は、第１の実施形態に係る光学測定装置又は光学測定システムとしてのフローサイトメータの概略構成例を示す模式図である。図２は、図１における分光光学系の一例を示す模式図である。
　図１に示すように、フローサイトメータ１１は、フローセル３１と、励起光源３２と、フォトダイオード３３と、分光光学系３７と、個体撮像素子（以下、イメージセンサという）３４と、集光レンズ３５及び３６とを備える。
　図中の上方には、円筒状のフローセル３１が設けられており、その中であって、かつ、ほぼ同軸上にサンプルチューブ５１が内挿されている。フローセル３１は、検体５３が流れる流路であって、サンプル流５２が図中の下方向に流れ下る構造とされ、さらに、サンプルチューブ５１から細胞等からなる検体５３が放出される。検体５３は、フローセル３１内のサンプル流５２に乗って、一列に並んで流れ下る。
　励起光源３２は、例えば、単一波長の励起光７１を出射するレーザ光源であり、励起光７１を検体５３が通過する位置に設定された照射スポット７２に照射する。励起光７１は、連続光であってもよいし、ある程度長い時間幅を持つパルス光であってもよい。
　励起光７１が照射スポット７２で検体５３に照射されると、検体５３による励起光７１の散乱や、検体５３やこれに付された蛍光マーカ等の励起が発生する。
　本説明において、検体５３で散乱した散乱光のうち、照射スポット７２を挟んで励起光源３２と反対方向へ向かう成分を前方散乱光７３という。なお、散乱光には、励起光源３２と照射スポット７２とを結ぶ直線から外れた方向へ向かう成分や、照射スポット７２から励起光源３２へ向かう成分も含まれる。本説明では、散乱光のうち、励起光源３２と照射スポット７２とを結ぶ直線から外れた所定の方向（以下、側方という）へ向かう成分を側方散乱光と称し、照射スポット７２から励起光源３２へ向かう成分を後方散乱光と称する。
　また、励起した検体５３や蛍光マーカ等からは、これらが脱励起する際に、それらを構成する原子や分子に固有の波長を持つ蛍光が放射される。この蛍光は、検体５３や蛍光マーカ等から全方位へ向けて放射されるが、図１に示す構成では、それらのうち、照射スポット７２から特定の方向（側方）へ放射された成分を分析対象の蛍光７４としている。また、照射スポット７２から側方へ出射する光には、蛍光の他に側方散乱光等も含まれるが、以下では、説明の簡略化のため、蛍光７４以外の光成分等を適宜省略する。
　照射スポット７２を通過した前方散乱光７３は、集光レンズ３５により平行光に変換された後、照射スポット７２を挟んで励起光源３２と反対側に光軸から少しずれた角度に配置されたフォトダイオード３３に入射する。一方、蛍光７４は、集光レンズ３６により平行光に変換された後、分光光学系３７に入射する。なお、集光レンズ３５及び３６それぞれは、特定の波長を吸収するフィルタや光の進行方向を変更するプリズムなどの他の光学素子を含んでもよい。例えば、集光レンズ３６は、入射した側方散乱光及び蛍光７４のうち、側方散乱光を低減する光学フィルタを含んでもよい。
　分光光学系３７は、図２に示すように、例えば、プリズムや回折格子などの１つ以上の光学素子３７１を含んで構成され、入射した蛍光７４を、波長ごとに異なる角度へ向けて出射する分散光７５に分光する。なお、本説明では、分散光７５の広がりの方向Ｈ１、すなわち、分光光学系３７による分光方向を、後述するイメージセンサ３４の画素アレイ部９１における行方向とする。
　分光光学系３７から出射した分散光７５は、イメージセンサ３４に入射する。したがって、イメージセンサ３４には、方向Ｈ１における位置に応じて異なる波長の分散光７５が入射する。
　ここで、前方散乱光７３が光量の大きい光である一方、側方散乱光や蛍光７４は、検体５３が照射スポット７２を通過した際に発生する微弱なパルス光である。そこで本実施形態では、前方散乱光７３をフォトダイオード３３で観察することで、検体５３が照射スポット７２を通過したタイミングを検出する。
　例えば、フォトダイオード３３は、常時、照射スポット７２から出射した前方散乱光７３を観察している。その状態で、検体５３の通過により検出されている光量が前方散乱光７３により増加すると、フォトダイオード３３は、光量が増加したタイミングで、検体５３の通過を示すトリガ信号を生成し、このトリガ信号をイメージセンサ３４に入力する。
　イメージセンサ３４は、例えば、同一の半導体チップ内にＡＤ（Analog　to　Digital）変換器を内蔵した複数画素よりなる撮像素子である。各画素は光電変換素子と増幅素子とを有し、光電変換された電荷は画素内部に蓄積される。蓄積電荷量を反映した信号（画素信号。画素値ともいう）は、所望のタイミングで増幅素子を介して増幅されて出力され、内蔵されたＡＤ変換器によってデジタル信号に変換される。
　なお、本説明では、検体５３から放射した蛍光７４を波長で分光する、いわゆるスペクトル型のフローサイトメータ１１を例示したが、これに限定されず、例えば、蛍光７４を分光しない構成とすることも可能である。その場合、分光光学系３７が省略されてよい。
　また、本説明では、トリガ信号の生成に前方散乱光７３を使用した場合を例示したが、これに限定されるものではなく、例えば、側方散乱光や後方散乱光や蛍光等を使用してトリガ信号を生成してもよい。
　２．２　イメージセンサの構成例
　次に、第１の実施形態に係るイメージセンサ３４について説明する。図３は、第１の実施形態に係るＣＭＯＳ（Complementary　Metal-Oxide-Semiconductor）型のイメージセンサの概略構成例を示すブロック図である。図４は、図３における画素アレイ部と検出回路アレイとの位置関係の一例を示す図である。図５は、図３における画素と検出回路との接続関係の一例を示す図である。
　ここで、ＣＭＯＳ型のイメージセンサとは、ＣＭＯＳプロセスを応用して、または、部分的に使用して作成された固体撮像素子（固体撮像装置ともいう）である。第１の実施形態に係るイメージセンサ３４は、入射面が半導体基板における素子形成面とは反対側の面（以下、裏面という）側である、いわゆる裏面照射型であってもよいし、表面側である、いわゆる表面照射型であってもよい。なお、以下の説明において例示するサイズ、個数、行数、列数等は、単なる例であって、種々変更することが可能である。
　図３に示すように、イメージセンサ３４は、画素アレイ部９１と、接続部９２と、検出回路９３と、画素駆動回路９４と、ロジック回路９５と、出力回路９６とを備える。
　画素アレイ部９１は、例えば、行方向Ｈ１に３２０画素、列方向Ｖ１に３６画素の行列状（以下、３２０×３６画素という）に配列した複数の画素１０１を備える。各画素１０１の配列面におけるサイズは、例えば、１５μｍ（マイクロメートル）×１５μｍであってよい。その場合、画素アレイ部９１の開口は、４．８ｍｍ（ミリメートル）×０．５４ｍｍとなる。
　画素駆動回路９４は、各画素１０１を駆動することで、各画素１０１に画素信号を生成させる。ロジック回路９５は、画素駆動回路９４の他、検出回路９３や出力回路９６の駆動タイミングを制御する。また、ロジック回路９５及び／又は画素駆動回路９４は、検体５３による照射スポット７２の通過に合わせて画素アレイ部９１に対する画素信号の読出しを制御する制御部としても機能する。
　なお、イメージセンサ３４は、ＡＤ変換前の画素信号を増幅するオペアンプ等の増幅回路をさらに備えていてもよい。
　照射スポット７２から側方へ出射した蛍光７４は、それぞれ、集光レンズ３６でコリメートされた後、分光光学系３７により分散光７５に変換される。そして、分散光７５は、画素アレイ部９１の画素１０１が配列する受光面における異なる領域に入射する。
　画素アレイ部９１の各画素１０１には、分散光７５のうち、画素アレイ部９１における行方向Ｈ１の位置によって定まる波長成分が入力される。例えば、図２に例示する位置関係では、図２のイメージセンサ３４中、右側に位置する画素１０１ほど波長の短い光が入射し、左側に位置する画素１０１ほど波長の長い光が入射する。
　各画素１０１は、照射された光量に応じた画素信号を生成する。生成された画素信号は、例えば、画素１０１に対して一対一に設けられた検出回路９３により読み出される。各検出回路９３は、ＡＤ変換器を含み、読み出したアナログの画素信号をデジタルの画素信号に変換する。
　ここで、図４及び図５に示すように、複数の検出回路９３は、例えば、画素アレイ部９１に対して２つのグループ（検出回路アレイ９３Ａ及び９３Ｂ）に分かれて配列している。一方の検出回路アレイ９３Ａは、例えば、画素アレイ部９１の列方向上側に配置され、他方の検出回路アレイ９３Ｂは、例えば、画素アレイ部９１の列方向下側に配置される。各検出回路アレイ９３Ａ及び９３Ｂでは、複数の検出回路９３が行方向に沿って１行又は複数行に配列している。
　例えば、画素アレイ部９１の列方向上側に配置された検出回路アレイ９３Ａの各検出回路９３は、画素アレイ部９１の列方向における上半分の画素１０１に接続され、列方向下側に配置された検出回路アレイ９３Ｂの各検出回路９３は、画素アレイ部９１の列方向における下半分の画素１０１に接続されてもよい。ただし、これに限定されず、例えば、検出回路アレイ９３Ａの各検出回路９３を偶数列の画素１０１に接続し、検出回路アレイ９３Ｂの各検出回路９３を奇数列の画素１０１に接続するなど、種々変形成されてよい。また、たとえば、複数の検出回路９３が画素アレイ部９１の一方の側（例えば、列方向上側）に１行又は複数行に配列していてもよい。
　画素アレイ部９１において、画素１０１は列方向Ｖ１に３６個配列している。したがって、画素１列に対しては、３６個の検出回路９３を配置する必要がある。そこで、上述したように、検出回路９３を２つの検出回路アレイ９３Ａ及び９３Ｂにグループ分けし、それぞれの行数を１行とした場合、１列に並ぶ３６個の画素１０１に対しては、各検出回路アレイ９３Ａ及び９３Ｂにおいて１８個ずつの検出回路９３を配置すればよい。
　説明を図３に戻す。各画素１０１から検出回路９３によって読み出された画素信号は、各検出回路９３のＡＤ変換器によってデジタルの画素信号に変換される。そして、デジタルの画素信号は、蛍光７４の波長ごとの情報を示す蛍光情報（蛍光スペクトラム情報に相当。以下、スペクトル画像という）として、出力回路９６を介して外部の信号取得システム１へ出力される。
　信号取得システム（信号取得部ともいう）１は、例えば、イメージセンサ３４から入力されたスペクトル画像を評価し、その結果としての評価値を解析システム２に入力する。例えば、信号取得システム１は、スペクトル画像を行方向Ｈ１に沿って配列する複数の領域（後述するチャネル領域に相当）に分割し、それぞれの領域に含まれる画素の画素値を合算することで、スペクトル画像の評価値を算出する（後述するマルチチャネル分析に相当）。また、信号取得システム１は、予め設定された、もしくは、ユーザが任意に設定した、１つ以上の領域（後述するバーチャルフィルタに相当）それぞれに含まれる画素の画素値を合算してスペクトル画像の評価値を算出する、いわゆるバーチャルフィルタ機能を備えていてもよい。
　このような信号取得システム１は、イメージセンサ３４と同一チップ内又は外部に設けられたＤＳＰ（Digital　Signal　Processor）やＦＰＧＡ（Field-Programmable　Gate　Array）等であってもよいし、イメージセンサ３４にバスやネットワークを介して接続されたパーソナルコンピュータなどの情報処理装置等であってもよい。
　解析システム（解析部ともいう）２は、信号取得システム１から入力された評価値に基づいて、種々の解析処理を実行する。例えば、解析システム２は、評価値に基づいて検体５３の種類、大きさ、構造などの情報を取得する。また、解析システム２は、スペクトル画像や評価値をユーザに表示するとともに、解析ツールとなるＵＩ（ユーザインタフェース）を提供してもよい。このような解析システム２は、例えば、信号取得システム１にバスやネットワークを介して接続されたパーソナルコンピュータなどの情報処理装置等であってよい。
　２．３　画素の回路構成例
　次に、図６を参照して、第１の実施形態に係る画素１０１の回路構成例について説明する。図６は、第１の実施形態に係る画素の回路構成例を示す回路図である。
　図６に示すように、画素１０１は、フォトダイオード（光電変換素子ともいう）１１１と、蓄積ノード１１２と、転送トランジスタ１１３と、増幅トランジスタ１１４と、リセットトランジスタ１１６と、浮遊拡散層（Floating　Diffusion：ＦＤ）１１７とを備える。転送トランジスタ１１３、増幅トランジスタ１１４及びリセットトランジスタ１１６には、例えば、Ｎ型のＭＯＳ（Metal-Oxide-Semiconductor）トランジスタが用いられてよい。
　フォトダイオード１１１、転送トランジスタ１１３、増幅トランジスタ１１４、リセットトランジスタ１１６及び浮遊拡散層１１７で構成された回路は、画素回路とも称される。また、画素回路のうち、フォトダイオード１１１を除く構成は、読出し回路とも称される。
　フォトダイオード１１１は、光子を光電変換により電荷に変換する。このフォトダイオード１１１は、蓄積ノード１１２を介して転送トランジスタ１１３に接続される。フォトダイオード１１１は、自身が形成された半導体基板に入射した光子から、電子とホールのペアを発生させ、そのうちの電子をカソードに相当する蓄積ノード１１２に蓄積する。フォトダイオード１１１は、リセットによる電荷排出時に、蓄積ノード１１２が完全空乏化される、いわゆる埋込み型であってもよい。
　転送トランジスタ１１３は、行駆動回路１２１の制御に従って、蓄積ノード１１２から浮遊拡散層１１７へ電荷を転送する。浮遊拡散層１１７は、転送トランジスタ１１３からの電荷を蓄積して、その蓄積した電荷の量に応じた電圧値の電圧を生成する。この電圧は、増幅トランジスタ１１４のゲートに印加される。
　リセットトランジスタ１１６は、蓄積ノード１１２や浮遊拡散層１１７に蓄積された電荷を電源１１８に放出して初期化する。このリセットトランジスタ１１６のゲートは行駆動回路１２１に接続され、ドレインは電源１１８に接続され、ソースは浮遊拡散層１１７に接続される。
　行駆動回路１２１は、例えば、リセットトランジスタ１１６と転送トランジスタ１１３とをオン状態に制御することで、蓄積ノード１１２に蓄積された電子を電源１１８に引き抜き、画素１０１を蓄積前の暗状態、すなわち、光が未入射の状態に初期化する。また、行駆動回路１２１は、リセットトランジスタ１１６のみをオン状態に制御することで、浮遊拡散層１１７に蓄積された電荷を電源１１８に引き抜き、その電荷量を初期化する。
　増幅トランジスタ１１４は、ゲートに印加された電圧を増幅してドレインに出現させる。この増幅トランジスタ１１４のゲートは浮遊拡散層１１７に接続され、ソースは電源に接続され、ドレインは垂直信号線１２４に接続される。
　増幅トランジスタ１１４と定電流回路１２２とは、ソースフォロワ回路を形成している。増幅トランジスタ１１４は、浮遊拡散層１１７の電圧を１弱のゲインで増幅して垂直信号線１２４に出現させる。垂直信号線１２４に出現した電圧は、画素信号として、ＡＤ変換回路を含む検出回路９３により読み出される。
　以上のような構成を備える画素１０１は、フォトダイオード１１１のリセットが実行されてから画素信号の読出しが実行されるまでの期間、光電変換により発生した電荷を内部に蓄積する。そして、画素信号の読出しが実行された際には、蓄積電荷に応じた画素信号を垂直信号線１２４に出現させる。
　なお、図６における行駆動回路１２１は、例えば、図３における画素駆動回路９４の一部であり、検出回路９３及び定電流回路１２２は、例えば、図３における検出回路９３の一部であってよい。
　２．４　画素の動作例
　次に、図７のタイミングチャートを参照して、第１の実施形態に係る画素１０１の動作例について説明する。図７は、第１の実施形態に係る画素の動作例を示すタイミングチャートである。
　図７に示すように、タイミングｔ１１～ｔ１２において、行駆動回路１２１は、蓄積期間直前となるタイミングで、転送トランジスタ１１３のゲートに印加する転送制御信号ＴＲＧ及びリセットトランジスタ１１６のゲートに印加するリセット制御信号ＲＳＴをハイレベルに立ち上げる。これにより、転送トランジスタ１１３及びリセットトランジスタ１１６がともにオン状態となり、フォトダイオード１１１と転送トランジスタ１１３との間の蓄積ノード１１２に蓄積された電荷が電源１１８へ排出される。以降において、この制御を「ＰＤリセット」と称する。
　また、リセットトランジスタ１１６をオン状態とした場合、浮遊拡散層１１７もリセットトランジスタ１１６を介して電源１１８に接続されるため、浮遊拡散層１１７に蓄積された電荷も電源１１８へ排出される。
　タイミングｔ１２では、行駆動回路１２１は、転送制御信号ＴＲＧ及びリセット制御信号ＲＳＴをローレベルに立ち下げることで、転送トランジスタ１１３及びリセットトランジスタ１１６をオフ状態に制御する。この制御により、蓄積ノード１１２は浮遊状態となって、新たな蓄積期間が開始される。
　次に、タイミングｔ１３～ｔ１４において、行駆動回路１２１は、転送制御信号ＴＲＧをハイレベルに立ち上げる。これにより、転送トランジスタ１１３がオン状態となり、フォトダイオード１１１と転送トランジスタ１１３との間の蓄積ノード１１２に蓄積された電荷が浮遊拡散層１１７へ転送される。以降において、この制御を「電荷転送」と称する。
　このように、フォトダイオード１１１に発生した電荷を浮遊拡散層１１７へ転送すると、垂直信号線１２４には、浮遊拡散層１１７に蓄積されている電荷の電荷量に応じた電圧値の電圧が増幅トランジスタ１１４により増幅されて出現する。本説明では、フォトダイオード１１１に発生した電荷が浮遊拡散層１１７に蓄積されている状態で垂直信号線１２４に出現する電位を蓄積信号という。
　検出回路９３は、転送制御信号ＴＲＧがローレベルに立ち下げられたタイミングｔ１４からタイミングｔ１５の期間、垂直信号線１２４に出現した蓄積信号の信号読出し（以下、サンプリングという）を行う。このサンプリングでは、垂直信号線１２４に出現した蓄積信号が、フォトダイオード１１１への露光量に応じた電圧値の画素信号として、検出回路９３により読み出されて、デジタル信号に変換される。この蓄積信号の多重サンプリングは、後述するＣＤＳ（相関二重サンプリング）における１回目の読出しとして扱われる。
　次に、タイミングｔ１５～ｔ１６において、行駆動回路１２１は、リセット制御信号ＲＳＴをハイレベルに立ち上げる。これにより、リセットトランジスタ１１６がオン状態となり、浮遊拡散層１１７に蓄積されていた電荷がリセットトランジスタ１１６を介して電源線ＶＤＤへ放出される。以降において、この制御を「ＦＤリセット」と称する。
　このように、浮遊拡散層１１７をリセットすると、垂直信号線１２４には、リセット状態にある浮遊拡散層１１７の電圧が増幅トランジスタ１１４により増幅されて出現する。本説明では、浮遊拡散層１１７がリセット状態にある際に垂直信号線１２４に出現する電位をリセットレベルという。
　検出回路９３は、蓄積信号のサンプリングと同様に、リセット制御信号ＲＳＴがローレベルに立ち下げられたタイミングｔ１６からタイミングｔ１７の期間、垂直信号線１２４に出現したリセットレベルの画素信号のサンプリングを行う。このサンプリングでは、垂直信号線１２４に出現したリセットレベルが、浮遊拡散層１１７がリセット状態にある際の電圧値（リセットレベル）の画素信号として、検出回路９３により読み出されて、デジタル信号に変換される。このリセットレベルの多重サンプリングは、後述するＣＤＳ（相関二重サンプリング）における２回目の読出しとして扱われる。
　検出回路９３は、サンプリングした蓄積信号とリセット信号とを比較して、その比較結果に基づいて入射光子量を判定する。
　なお、検出回路９３は、蓄積信号のサンプリングを複数回実行し、その全て加算し、必要に応じて、それらの平均値を算出してもよい。同様に、検出回路９３は、リセット信号のサンプリングを複数回実行し、その全て加算し、必要に応じて、それらの平均値を算出してもよい。
　そして、検出回路９３は、蓄積信号（またはその平均値）と、リセット信号（またはその平均値）との差分を算出するＣＤＳを実行する。このＣＤＳにより、ＦＤリセットの際に生じるｋＴＣノイズが相殺されて、蛍光７４の光量に基づいた正味の画素信号が求められる。
　各画素（画素回路）１０１の蓄積期間は、上述のＰＤリセット動作と蓄積信号の読出し動作との間の期間であり、正確には、ＰＤリセット時に転送制御信号ＴＲＧを立ち下げてから、電荷転送時に再度、転送制御信号ＴＲＧを立ち下げるまでの期間である。この蓄積期間にフォトダイオード１１１に光子が入射し電荷が発生すると、それはリセット信号及び蓄積信号の間の差分となり、上記の正味の画素信号として検出回路９３により取得される。
　なお、検出回路９３において、ＡＤ変換器を通したデジタル値同士でＣＤＳを実施することで、ＡＤ変換過程に伴って混入したノイズも相殺することができる。
　２．４．１　画素動作の変形例
　ところで、図７を用いて動作例では、単位蓄積が完了して次の蓄積が開始される間、特に、蓄積信号のサンプリング期間において、蓄積が実施されない不感期間が発生している。そこで、特に、高速なサンプリングに対応するため、このような不感期間を除去するようにしてもよい。
　図８は、変形例に係る画素の動作例を示すタイミングチャートである。図８の例では、図７で実施したタイミングｔ１５～ｔ１６におけるＦＤリセットが省略され、ＰＤリセット後のタイミングｔ１２～ｔ１３の蓄積期間中に、リセット信号のサンプリングが実行されている。
　その場合、フォトダイオード１１１の次の蓄積期間は、電荷転送が完了した直後、すなわち、転送制御信号ＴＲＧを立ち下げたときからスタートすることになる。これによって画素１０１に入射した光子が検知されない不感期間はほぼゼロになる。
　なお、図７及び図８のいずれの動作例においても、単位蓄積の最短サイクルはリセット信号のサンプリングと蓄積信号のサンプリングとの合計所要時間によって規定され得る。
　２．５　パルス光検出のオペレーション例
　次に、図９のタイミングチャートを参照して、第１の実施形態に係るフローサイトメータ１１におけるパルス光検出のオペレーション例について説明する。図９は、第１の実施形態に係るフローサイトメータにおけるパルス光検出のオペレーション例を説明するためのタイミングチャートである。
　蛍光７４の光強度は、照射スポット７２への検体５３の通過に伴って、図９の最上段で示されるようなパルス波形ＰＬ１として描かれ、各パルス波形ＰＬ１が検体５３の１個分の通過に対応する波形となる。この時、図９の中段で示される、フォトダイオード３３で検出された前方散乱光７３の光強度は、図９の上段におけるパルス波形ＰＬ１とタイミングが類似して、かつ、強度増加率の大きいパルス波形ＰＬ２のように描かれる。
　タイミングＴ６１において、フォトダイオード３３は、前方散乱光のパルス波形ＰＬ２の強度と、閾値Ｔｈ１との比較から、検体５３の通過タイミングを取得して、イベント信号Ｓ１１を発生する。
　ここで、イメージセンサ３４における蓄積期間の終了と信号読出しとは、検体５３が通過したことを示すイベント信号Ｓ１１に同期して実施される。読出しのアクセスシーケンスは、図９に準じ、不感期間の殆ど無いグローバルシャッタとする。
　すなわち、蓄積期間の開始と終了とは、全画素同時一斉に行われる。この時、検体５３の通過を示すイベント信号Ｓ１１に同期して電荷の画素内転送が行われ、蓄積期間が全画素一斉に終了する。そして、画素信号の読出しが開始される。さらに、このとき次の蓄積期間が全画素一斉にスタートする。
　タイミングＴ６２において、イメージセンサ３４は、画素における蓄積期間を終了し、画素信号の読出しを開始し、さらには、次の蓄積期間を開始する。ここで、タイミングＴ６２は、イベント信号Ｓ１１を取得したタイミングＴ６１から、検体５３の流速と大きさを考慮した一定の遅延時間ｔ１が経過した後のタイミングである。
　画素信号の読出しでは、蓄積信号のＡＤ変換値と、既に取得済みであるリセット信号とのＡＤ変換値との差分取得を伴って実施され、これによってｋＴＣノイズ等を相殺した正味の画素信号が導出される。さらに、これに引き続いて、次のサイクルにおけるリセット信号の取得とＡＤ変換が実施され、それが完了した時点で次の蓄積期間の終了と読出しとが可能になる。すなわち、イベント処理の最短サイクルは単位蓄積期間の最短サイクルに等しく、それは蓄積信号とリセット信号との各々の取得とＡＤ変換に要する時間により決定される。
　各イベント処理において複数の画素１０１から出力される正味の画素信号の総計値は、パルスごとに光検出器が受光した光子の総量に相当する。これによって検体５３ごとの蛍光７４の強度が導出される。すなわち、本実施形態においては、画素１０１が光電変換された電荷を内部に蓄積することにより、画素１０１内で入射光の積分が行われている。したがって、各画素１０１からの出力に対するＡＤ変換は一回でよく、時系列的に複数回のＡＤ変換を実施する必要はない。
　例えば、リセット信号のＡＤ変換と蓄積信号のＡＤ変換とそのＣＤＳとに、合計で１０μｓの時間を要したとすると、対応できるイベントの最小間隔は約１０μｓとなり、１秒間に最大１００，０００個のイベント、すなわち、照射スポット７２への検体５３の通過を評価できることになる。
　なお、各画素１０１から画素信号を読み出す時間以外に、出力回路９６を介して読み出した画素信号を出力する時間も要することとなるが、例えば、検出回路９３にレジスタを設けて画素信号を一時保存しておくことで、リセット信号及び蓄積信号のＡＤ変換と画素信号の出力とをパイプライン方式で並列に実行することが可能であるため、画素信号の出力に要する時間が蓄積サイクルを制約することはない。
　また、この例では、検体５３が通過したことを示すイベント信号Ｓ１１を、パルス波形ＰＬ２が閾値Ｌ１を下回ったダウンエッジのタイミングＴ６１で発生させているが、これに限定されず、パルス波形ＰＬ２が閾値Ｌ１を上回ったアップエッジのタイミングＴ６３で発生させてもよい。イベント信号Ｓ１１をアップエッジのタイミングＴ６３で発生させる場合、検体５３の大きさや流量の変動に対応することが容易となる。
　また、イベント信号Ｓ１１は、側方散乱光や蛍光７４（分散光７５）の検出結果を用いて発生させてもよい。その場合、イベント検出用の光と検体解析用の光とを分光し、イベント検出用の光をフォトダイオード３３に入射させてもよい。
　さらに、フォトダイオード３３に代えて、イメージセンサ３４内にイベント発生用の受光素子を別途搭載してもよい。
　さらにまた、イベント信号Ｓ１１からの遅延時間ｔ１をここでは一定としたが、一般に前方散乱光７３によるパルス波形ＰＬ２の強度減衰量は検体５３が大きいほど大きい。従って、パルス波形ＰＬ２の強度を、例えば、パルスの冒頭部分で評価し、それに応じて遅延時間ｔ１の長さを設定してもよい。この場合、大きな検体５３に対しては長めの遅延時間ｔ１が設定されてよい。
　さらにまた、本説明では、画素アレイ部９１の全画素に対して一斉に読出しを開始する、いわゆるグローバルシャッタ方式を例示したが、これに限定されるものではない。例えば、１つの検出回路９３を同一列の複数の画素１０１に接続した場合には、同一の検出回路９３に接続された画素１０１から順に画素信号を読み出す、いわゆるローリングシャッタ方式を採用することも可能である。なお、ローリングシャッタ方式を採用する場合、各画素１０１の画素回路における増幅トランジスタ１１４のドレインと垂直信号線１２４には、行駆動回路１２１からの選択信号に従って増幅トランジスタ１１４のドレインと垂直信号線１２４との接続を制御する選択トランジスタが追加される。
　２．６　画素アレイ部上の位置と分散光の波長との関係例
　図１０は、第１の実施形態に係る画素アレイ部上の位置と分散光の波長との関係の一例を示す図である。上述したように、分光光学系３７は、蛍光７４を行方向Ｈ１に分光して、行方向Ｈ１に広がった分散光７５を出射する。図１０に示す例では、分光光学系３７は、行方向Ｈ１において最も左側に位置する画素１０１に波長５００ｎｍの光が入射し、最も右側に位置する画素１０１に波長８００ｎｍの光が入射するように、蛍光７４を分光する。ここで、上述したように、画素アレイ部９１における行方向Ｈ１の画素数を３２０画素とすると、各画素１０１には、行方向Ｈ１の位置に応じて、約０．９～１ｎｍの波長幅の光が入射することとなる。
　２．７　イメージセンサをマルチチャネル化する場合
　図１１は、第１の実施形態に係るイメージセンサをマルチチャネル化する場合の例を示す図である。すなわち、本説明では、イメージセンサ３４をマルチチャネルＰＭＴとして使用する場合が例示される。なお、図１１は、イメージセンサ３４を３２チャンネルに分割する場合を示している。
　図１１に示すように、イメージセンサ３４を３２チャンネルのマルチチャネル化する場合、画素アレイ部９１は、行方向Ｈ１の画素数が１０画素ずつの計３２個の領域に分割される。具体的には、信号取得システム１は、画素アレイ部９１から取得したスペクトル画像Ｇ１を、行方向Ｈ１の画素数が１０画素ずつの計３２個のチャネル領域ＣＨ１～ＣＨ３２に分割する。その場合、各チャネル領域ＣＨ１～ＣＨ３２に含まれる光の波長幅は、約９～１０ｎｍとなる。
　なお、マルチチャネル化において実現するチャネル数、すなわち、画素アレイ部９１又はスペクトル画像Ｇ１の行方向Ｈ１の分割数は、３２個に限定されず、種々変形することが可能である。例えば、画素アレイ部９１における行方向Ｈ１の画素数を３２０画素とした場合には、最小で１チャンネル、最大で３２０チャンネルのチャネル領域に分割することが可能である。
　また、光検出部としてイメージセンサ３４を用いる本実施形態では、例えば、チャネル領域それぞれの行方向Ｈ１の幅（画素数）を、チャネル領域ごとに別々に設定することが可能である。
　例えば、分光光学系３７にプリズムを用いる場合には、長い波長の光の方が、短い波長の光に比べて、行方向Ｈ１への広がりが広くなる。そのような場合、例えば、図１１に示す例において、長い波長の光が入射するチャネル領域ＣＨ３１、ＣＨ３２等の行方向Ｈ１の画素数を、短い波長の光が入射するチャネル領域ＣＨ１、ＣＨ２等の行方向Ｈ１の画素数よりも大きくしてもよい。すなわち、分光光学系３７が蛍光７４を所定方向（例えば、行方向Ｈ１に対応する方向）に分光するプリズムを含んでいる場合、蛍光７４のうちの第１波長成分が入射する第１領域（例えばチャネル領域ＣＨ１）の行方向Ｈ１の幅（画素数）は、第１波長成分よりも長い第２波長成分が入射する第２領域（例えば、チャネル領域ＣＨ３２）の行方向Ｈ１の幅（画素数）よりも狭くてもよい。
　このように、本実施形態では、蛍光７４に対してマルチチャネル分析を行なう場合に、チャネル数、各チャネルのチャネル幅（波長幅）、各チャネルの中心波長等を自由に設計することが可能である。
　２．８　イメージセンサでバーチャルフィルタ機能を実現する場合
　また、本実施形態に係るイメージセンサ３４を用いて、バーチャルフィルタ機能を実現することも可能である。図１２は、波長４８８ｎｍの励起光で励起されたＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５及びＰＥ－Ｃｙ７の４種類の蛍光色素から放射された蛍光のスペクトルを示す図である。図１３は、図１２に示す蛍光に対して実現される第１の実施形態に係るバーチャルフィルタの一例を示す図である。なお、図１３では、画素アレイ部９１における左端の画素列を画素列＃１とし、右端の画素列を画素列＃３２０としている。
　図１２に示すように、４８８ｎｍの励起光Ｌ０をＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５及びＰＥ－Ｃｙ７の４種類の蛍光色素に照射した場合、ＦＩＴＣからは中心波長が５３０ｎｍ程度の蛍光Ｌ１が放射され、ＰＥからは中心波長が５８５程度の蛍光Ｌ２が放射され、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５からは中心波長が６９５ｎｍ程度の蛍光Ｌ３が放射され、ＰＥ－Ｃｙ７からは中心波長が７８０ｎｍ程度の蛍光Ｌ４が放射される。
　そこで信号取得システム１は、図１３に示すように、ＦＩＴＣからの蛍光Ｌ１に対しては、行方向Ｈ１の中心を波長５３０ｎｍに相当する画素列＃３３とし、行方向Ｈ１の幅を波長３０ｎｍに相当する３３画素としたバーチャルフィルタ（フィルタ領域ともいう）Ｆ１をスペクトル画像Ｇ１に設定する。ＰＥからの蛍光Ｌ２に対しては、行方向Ｈ１の中心を波長５８５ｎｍに相当する画素列＃９１とし、行方向Ｈ１の幅を波長４２ｎｍに相当する４６画素としたバーチャルフィルタＦ２をスペクトル画像Ｇ１に設定する。ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５からの蛍光Ｌ３に対しては、行方向Ｈ１の中心を波長６９５ｎｍに相当する画素列＃２０８とし、行方向Ｈ１の幅を波長４０ｎｍに相当する４４画素としたバーチャルフィルタＦ３をスペクトル画像Ｇ１に設定する。ＰＥ－Ｃｙ７からの蛍光Ｌ４に対しては、行方向Ｈ１の中心を波長７８０ｎｍに相当する画素列＃２９９とし、行方向Ｈ１の幅を波長４０ｎｍに相当する４４画素としたバーチャルフィルタＦ４をスペクトル画像Ｇ１に設定する。
　なお、それぞれのバーチャルフィルタＦ１～Ｆ４では、列方向Ｖ１の画素数は、例えば、画素アレイ部９１の列方向Ｖ１の画素数と同じ、３６画素であってよい。
　以上のようなバーチャルフィルタＦ１～Ｆ４をスペクトル画像Ｇ１に設定した場合、信号取得システム１からは、例えば、バーチャルフィルタＦ１を構成する３３×３６画素の各画素１０１から出力された画素信号の合算値と、バーチャルフィルタＦ２を構成する４６×３６画素の各画素１０１から出力された画素信号の合算値と、バーチャルフィルタＦ３を構成する４４×３６画素の各画素１０１から出力された画素信号の合算値と、バーチャルフィルタＦ４を構成する４４×３６画素の各画素１０１から出力された画素信号の合算値とが、評価値として出力される。
　このように、本実施形態では、光検出器としてイメージセンサ３４を用いることで、波長分解能が細かく、解像度の高い蛍光スペクトラム情報を取得することが可能であるため、光学フィルタ特性の再現性を高めることや、各蛍光色素から放出された蛍光に対して最適なバーチャルフィルタを設定することなどが可能となる。
　なお、設定するバーチャルフィルタの数、各バーチャルフィルタの中心波長及び／又は波長幅等は、使用する励起光７１の波長や検体５３及び／又は蛍光マーカの種類等に応じて自由に設計することが可能である。例えば、図１２に例示した４つの蛍光色素に対して別の蛍光色素を追加した場合には、追加した分のバーチャルフィルタをスペクトル画像Ｇ１に設定することが可能である。その際、異なる蛍光のスペクトルが近接する領域では、各バーチャルフィルタの中心波長及び／又は波長幅が調整されてよい。
　また、マルチスポット型のフローサイトメータとした場合には、それぞれの励起光７１によって検体５３及び／又は蛍光マーカから放射される蛍光に応じて、最適なバーチャルフィルタを設定することも可能である。
　２．９　作用・効果
　以上のように、第１の実施形態によれば、スペクトル型のフローサイトメータ１１において、アレイ型光検出器に２次元のイメージセンサ３４が用いられる。これにより、アレイ型光検出器にマルチチャネルＰＭＴを使用した場合と比較して、装置規模を小型化することが可能となる。その結果、全体的な装置規模を縮小することが可能である。
　また、イメージセンサ３４は、マルチチャネルＰＭＴと比較して、波長分解能が細かく、解像度の高い蛍光スペクトラム情報を取得することが可能であるため、光学フィルタ特性を忠実に再現したバーチャルフィルタを実現することが可能となる。
　さらに、イメージセンサ３４を用いることで、任意の波長幅で画素値を加算することが可能となるため、マルチチャネル分析を行なう際のチャネル数の増減やチャネル幅の変更、バーチャルフィルタ機能を使用する場合のフィルタ数の増減や各フィルタの中心波長／波長幅の変更など、製品化後の設計変更が容易になるというメリットも備える。
　３．第２の実施形態
　上述した第１の実施形態では、スペクトル型フローサイトメータを例示したが、本開示に係る技術は、フローサイトメータに限定されず、例えば、デジタルパソロジーイメージング（ＤＰＩ）などの医療機器にも適用することが可能となる。
　デジタルパソロジーイメージング（ＤＰＩ）では、検体５３は、ステージ上に載置され、ステージ上に載置された検体５３が励起光源３２からの励起光７１によって走査される。ステージ上に載置された検体５３の励起光７１による走査は、ステージと励起光源３２との位置関係を制御する走査制御部によって制御される。
　また、デジタルパソロジーイメージング（ＤＰＩ）では、イメージセンサ３４として、画素１０１が直線状に配列したラインセンサが用いられる。ラインセンサは、励起光７１がステージ上の検体５３を走査した際に、検体５３から放射された蛍光７４を受光することで、検体５３全体に対する２次元又は３次元の画像データ（スペクトル画像）を生成する。
　生成されたスペクトル画像は、第１の実施形態と同様に、信号取得システム１に入力されて評価され、その評価値が解析システム２に入力されて解析される。
　図１４は、第２の実施形態に係る光学測定装置（システム）の概略構成例を示すブロック図である。
　図１４に示すように、本実施形態の光学測定装置２００は、観察ユニット２０１を備える。観察ユニット２０１は、異軸平行に配置された波長の異なる複数のライン照明を病理標本（病理サンプル）に照射する励起部２１０と、病理標本を支持するサンプルステージ２２０と、ライン状に励起された病理標本の蛍光スペクトル（分光データ）を取得する分光イメージング部２３０とを有する。
　光学測定装置２００は、第１の実施形態における信号取得システム１及び解析システム２に相当する処理ユニット２０２をさらに備える。処理ユニット２０２は、観察ユニット２０１によって取得された病理標本（以下、サンプルＳともいう）の蛍光スペクトルに基づいて、典型的には、病理標本の画像（スペクトル画像に相当）を形成し、あるいは蛍光スペクトルの分布を出力する。ここでいう画像とは、そのスペクトルを構成する色素やサンプル由来の自家蛍光などの構成比率、波形からＲＧＢ（赤緑青）カラーに変換されたもの、特定の波長帯の輝度分布などをいう。
　サンプルステージ２２０に対して、対物レンズなどの観察光学系２４０を介して、励起部２１０と分光イメージング部２３０が接続されている。観察光学系２４０はフォーカス機構２６０によって最適な焦点に追従する機能を持っている。観察光学系２４０には、暗視野観察、明視野観察などの非蛍光観察部２７０が接続されてもよい。フォーカス機構２６０、非蛍光観察部２７０などは記憶、制御、計算処理を行う制御部（ＰＣ（Personal　Computer）など）に接続されている。
　励起部２１０は、波長の異なる複数の励起光を出力することができる複数の光源を備える。複数の光源は、典型的には、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザダイオード（ＬＤ）、水銀ランプなどで構成され、それぞれがライン照明化され、サンプルステージ２２０のサンプルＳに照射される。
　サンプルＳは、典型的には、組織切片等の観察対象を含むスライドで構成されるが、勿論それ以外であってもよい。サンプルＳは、複数の蛍光色素によって染色されている。観察ユニット２０１は、サンプルＳを所望の倍率に拡大して観察する。ライン照明が複数配置されており、それぞれの照明エリアに重なるように分光イメージング部２３０の複数の撮影エリアが配置される。２つのライン照明はそれぞれ平行に離間して配置される。各ライン照明の長手方向をＸ軸方向とし、配列方向をＹ軸方向とする。
　１つめのライン照明を構成する波長と、２つめのライン照明を構成する波長は相互に異なっている。これらライン照明により励起されるライン状の蛍光は、観察光学系２４０を介して分光イメージング部２３０において観測される。
　分光イメージング部２３０は、複数のライン照明によって励起された蛍光がそれぞれ通過可能な複数のスリット部を有する観測スリットと、観測スリットを通過した蛍光を個々に受光可能な少なくとも１つの撮像素子（イメージセンサ３４に相当）とを有する。撮像素子には、ＣＣＤ（Charge　Coupled　Device）、ＣＭＯＳ（Complementary　Metal　Oxide　Semiconductor）などの２次元イメージャが採用される。観測スリットを光路上に配置することで、それぞれのラインで励起された蛍光スペクトルを重なりなく検出することができる。
　分光イメージング部２３０は、それぞれのライン照明から、撮像素子の１方向（例えば垂直方向）の画素アレイを波長のチャンネルとして利用した蛍光の分光データ（ｘ、λ）を取得する。得られた分光データ（ｘ、λ）は、それぞれどの励起波長から励起された分光データであるかが紐づけられた状態で処理ユニット２０２に記録される。
　処理ユニット２０２は、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）、ＲＡＭ（Random　Access　Memory）、ＲＯＭ（Read　Only　Memory）等のコンピュータに用いられるハードウエア要素および必要なソフトウエアにより実現され得る。ＣＰＵに代えて、またはこれに加えて、ＦＰＧＡ（Field　Programmable　Gate　Array）等のＰＬＤ(Programmable　Logic　Device)、あるいは、ＤＳＰ（Digital　Signal　Processor）、その他ＡＳＩＣ（Application　Specific　Integrated　Circuit）等が用いられてもよい。
　処理ユニット２０２は、複数のライン照明の波長と撮像素子で受光された蛍光との相関を表す分光データを記憶する記憶部２２１を有する。記憶部２２１には、不揮発性半導体メモリ、ハードディスクドライブ等の記憶装置が用いられ、サンプルＳに関する自家蛍光の標準スペクトル、サンプルＳを染色する色素単体の標準スペクトルがあらかじめ格納されている。撮像素子で受光した分光データ（ｘ、λ）は、例えば、記憶部２２１に記憶される。
　観察ユニット２０１はさらに、サンプルステージ２２０に対して複数のライン照明をＹ軸方向、つまり、各ライン照明の配列方向に走査する走査機構２５０を備える。走査機構２５０を用いることで、サンプルＳ上において空間的にΔｙだけ離れた、それぞれ異なる励起波長で励起された色素スペクトル（蛍光スペクトル）をＹ軸方向に連続的に記録することができる。この場合、例えば、撮影領域がＸ軸方向に複数に分割され、Ｙ軸方向にサンプルＳをスキャンし、その後、Ｘ軸方向に移動し、さらにＹ軸方向へのスキャンを行うといった動作が繰り返される。１回のスキャンで数種の励起波長によって励起されたサンプル由来の分光スペクトルイメージを撮影することができる。
　走査機構２５０は、典型的には、サンプルステージ２２０がＹ軸方向に走査されるが、光学系の途中に配置されたガルバノミラーによって複数のライン照明がＹ軸方向に走査されてもよい。最終的に、（Ｘ、Ｙ、λ）の３次元データが複数のライン照明についてそれぞれ取得される。各ライン照明由来の３次元データはＹ軸についてΔｙだけ座標がシフトしたデータになるので、あらかじめ記録されたΔｙ、または撮像素子３４の出力から計算されるΔｙの値に基づいて、補正され出力される。
　ここまでの例では励起光としてのライン照明は２本で構成されたが、これに限定されず、３本、４本あるいは５本以上であってもよい。またそれぞれのライン照明は、色分離性能がなるべく劣化しないように選択された複数の励起波長を含んでもよい。またライン照明が１本であっても、複数の励起波長から構成される励起光源で、かつそれぞれの励起波長と、撮像素子で所得されるロウデータとを紐づけて記録すれば、異軸平行ほどの分離能は得られないが、多色スペクトルを得ることができる。
　画像形成部２２３は、記憶部２２１に記憶された分光データ（あるいはデータ校正部２２２によって校正された分光データ）と、励起ラインの軸間距離（Δｙ）に相当する間隔とに基づいて、サンプルＳの蛍光画像を形成する。
　各ライン照明由来の３次元データは、Ｙ軸についてΔｙだけ座標がシフトしたデータになるので、あらかじめ記録されたΔｙ、または撮像素子の出力から計算されるΔｙの値に基づいて補正され、出力される。
　画像形成部２２３は、撮影した画像を繋げて１つの大きな画像にするための処理（スティッチング）を実行する。これにより、多重化されたサンプルＳに関する病理画像を取得することができる。形成された蛍光画像は、表示部２０３に出力される。
　さらに、画像形成部２２３は、記憶部２２１にあらかじめ記憶されたサンプルＳの自家蛍光及び色素単体の各標準スペクトルを基に、撮影された分光データ（測定スペクトル）からサンプルＳの自家蛍光及び色素の成分分布を分離計算する。演算方法としては、最小二乗法、重み付け最小二乗法などが採用可能であり、撮影された分光データが上記標準スペクトルの線形和になるような係数を計算する。算出された係数の分布は、記憶部２２１に記憶されるとともに、表示部２０３へ出力されて画像として表示される。
　以上のように、ＤＰＩに対しても、第１の実施形態と同様に、その光検出部をイメージセンサ３４とすることが可能である。また、マルチチャネル分析やバーチャルフィルタ機能についても同様に、ＤＰＩに対して適用することが可能である。
　以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示の技術的範囲は、上述の実施形態そのままに限定されるものではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。また、異なる実施形態及び変形例にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
　また、本明細書に記載された各実施形態における効果はあくまで例示であって限定されるものでは無く、他の効果があってもよい。
　なお、本技術は以下のような構成も取ることができる。
（１）
　生体検体から放射した蛍光を分光する分光光学系と、
　前記分光光学系で分光された前記蛍光を受光して蛍光情報を生成するイメージセンサと、
　を備え、
　前記イメージセンサは、それぞれ前記蛍光のうちの異なる波長成分を受光して前記波長成分ごとの蛍光情報を生成する複数の領域に分割されている
　光学測定装置。
（２）
　前記蛍光情報は、前記イメージセンサの画素ごとの画素値を前記領域ごとに合算した値、又は、前記画素ごとの画素値よりなる画像データである前記（１）に記載の光学測定装置。
（３）
　前記イメージセンサで生成された前記蛍光情報を評価する信号取得部をさらに備える前記（１）又は（２）に記載の光学測定装置。
（４）
　前記信号取得部は、前記蛍光情報を前記分光光学系によって分光された前記蛍光の分光方向に沿って配列する複数のチャネル領域に分割し、前記複数のチャネル領域それぞれの画素値を合算することで、前記蛍光情報の評価値を算出する前記（３）に記載の光学測定装置。
（５）
　前記信号取得部は、前記蛍光情報における１つ以上のフィルタ領域それぞれの画素値を合算することで、前記蛍光情報の評価値を算出する前記（３）に記載の光学測定装置。
（６）
　前記分光光学系は、前記蛍光を所定方向に分光するプリズムを含み、
　前記複数の領域のうち、前記蛍光のうちの第１波長成分が入射する第１領域の前記所定方向に対応する方向の幅は、前記蛍光のうちの前記第１波長成分よりも長い第２波長成分が入射する第２領域の前記所定方向に対応する方向の幅よりも狭い
　前記（１）～（５）の何れか１項に記載の光学測定装置。
（７）
　前記信号取得部による前記蛍光情報の評価結果に基づいて前記生体検体を解析する解析部をさらに備える前記（３）に記載の光学測定装置。
（８）
　前記イメージセンサは、
　　行列状に配列する複数の光電変換素子と、
　　前記光電変換素子それぞれに発生した電荷に基づいて前記蛍光情報を構成する複数の前記画素値を生成する検出回路と、
　を備える前記（２）に記載の光学測定装置。
（９）
　前記生体検体に所定波長の励起光を照射する励起光源をさらに備える前記（１）～（８）の何れか１項に記載の光学測定装置。
（１０）
　前記生体検体が流れる流路をさらに備え、
　前記励起光源は、前記流路における所定の領域に前記励起光を照射する
　前記（９）に記載の光学測定装置。
（１１）
　所定波長の励起光を出射する励起光源と、
　前記生体検体を載置するステージと、
　前記励起光が前記ステージ上の前記生体検体を走査するように前記ステージと前記励起光源との位置関係を制御する走査機構と、
　をさらに備える前記（１）～（１０）の何れか１項に記載の光学測定装置。
（１２）
　生体検体から放射した蛍光を分光する分光光学系と、
　前記分光光学系で分光された前記蛍光を受光して蛍光情報を生成するイメージセンサと、
　前記イメージセンサで生成された前記蛍光情報を評価する信号取得部と、
　前記信号取得部による前記蛍光情報の評価結果に基づいて前記生体検体を解析する解析部と、
　を備え、
　前記イメージセンサは、それぞれ前記蛍光のうちの異なる波長成分を受光して前記波長成分ごとの蛍光情報を生成する複数の領域を備える光学測定システム。
　１　信号取得システム
　２　解析システム
　１１　フローサイトメータ
　３１　フローセル
　３２　励起光源
　３３　フォトダイオード
　３４　イメージセンサ
　３５、３６　集光レンズ
　３７　分光光学系
　３７１　光学素子
　５１　サンプルチューブ
　５２　サンプル流
　５３　検体
　７１　励起光
　７２　照射スポット
　７３　前方散乱光
　７４　蛍光
　７５　分散光
　９１　画素アレイ部
　９２　接続部
　９３　検出回路
　９３Ａ、９３Ｂ検出回路アレイ
　９４　画素駆動回路
　９５　ロジック回路
　９６　出力回路
　１０１　画素
　１１１　フォトダイオード
　１１２　蓄積ノード
　１１３　転送トランジスタ
　１１４　増幅トランジスタ
　１１６　リセットトランジスタ
　１１８　電源
　１２１　行駆動回路
　１２２　定電流回路
　１２４　垂直信号線
　２００　光学測定装置
　２０１　観察ユニット
　２０２　処理ユニット
　２０３　表示部
　２１０　励起部
　２２０　サンプルステージ
　２３０　分光イメージング部
　２４０　観察光学系
　２５０　走査機構
　２６０　フォーカス機構
　２７０　非蛍光観察部
　２２１　記憶部
　２２２　データ校正部
　２２３　画像形成部
　ＣＨ１～ＣＨ３２　チャネル領域
　Ｆ１～Ｆ４　バーチャルフィルタ
　Ｇ１　スペクトル画像
　Ｈ１　行方向
　Ｖ１　列方向

Claims (12)

  1. 　生体検体から放射した蛍光を分光する分光光学系と、
    　前記分光光学系で分光された前記蛍光を受光して蛍光情報を生成するイメージセンサと、
    　を備え、
    　前記イメージセンサは、それぞれ前記蛍光のうちの異なる波長成分を受光して前記波長成分ごとの蛍光情報を生成する複数の領域に分割されている
    　光学測定装置。
  2. 　前記蛍光情報は、前記イメージセンサの画素ごとの画素値を前記領域ごとに合算した値、又は、前記画素ごとの画素値よりなる画像データである請求項１に記載の光学測定装置。
  3. 　前記イメージセンサで生成された前記蛍光情報を評価する信号取得部をさらに備える請求項１に記載の光学測定装置。
  4. 　前記信号取得部は、前記蛍光情報を前記分光光学系によって分光された前記蛍光の分光方向に沿って配列する複数のチャネル領域に分割し、前記複数のチャネル領域それぞれの画素値を合算することで、前記蛍光情報の評価値を算出する請求項３に記載の光学測定装置。
  5. 　前記信号取得部は、前記蛍光情報における１つ以上のフィルタ領域それぞれの画素値を合算することで、前記蛍光情報の評価値を算出する請求項３に記載の光学測定装置。
  6. 　前記分光光学系は、前記蛍光を所定方向に分光するプリズムを含み、
    　前記複数の領域のうち、前記蛍光のうちの第１波長成分が入射する第１領域の前記所定方向に対応する方向の幅は、前記蛍光のうちの前記第１波長成分よりも長い第２波長成分が入射する第２領域の前記所定方向に対応する方向の幅よりも狭い
    　請求項１に記載の光学測定装置。
  7. 　前記信号取得部による前記蛍光情報の評価結果に基づいて前記生体検体を解析する解析部をさらに備える請求項３に記載の光学測定装置。
  8. 　前記イメージセンサは、
    　　行列状に配列する複数の光電変換素子と、
    　　前記光電変換素子それぞれに発生した電荷に基づいて前記蛍光情報を構成する複数の前記画素値を生成する検出回路と、
    　を備える請求項２に記載の光学測定装置。
  9. 　前記生体検体に所定波長の励起光を照射する励起光源をさらに備える請求項１に記載の光学測定装置。
  10. 　前記生体検体が流れる流路をさらに備え、
    　前記励起光源は、前記流路における所定の領域に前記励起光を照射する
    　請求項９に記載の光学測定装置。
  11. 　所定波長の励起光を出射する励起光源と、
    　前記生体検体を載置するステージと、
    　前記励起光が前記ステージ上の前記生体検体を走査するように前記ステージと前記励起光源との位置関係を制御する走査機構と、
    　をさらに備える請求項１に記載の光学測定装置。
  12. 　生体検体から放射した蛍光を分光する分光光学系と、
    　前記分光光学系で分光された前記蛍光を受光して蛍光情報を生成するイメージセンサと、
    　前記イメージセンサで生成された前記蛍光情報を評価する信号取得部と、
    　前記信号取得部による前記蛍光情報の評価結果に基づいて前記生体検体を解析する解析部と、
    　を備え、
    　前記イメージセンサは、それぞれ前記蛍光のうちの異なる波長成分を受光して前記波長成分ごとの蛍光情報を生成する複数の領域を備える光学測定システム。
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