WO2020256434A1 - 해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속의 snc087 균주, 동 균주를 이용한 스타우로스포린의 생산방법, 동 균주의 배양방법 및 동 균주의 순수배양액 - Google Patents

해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속의 snc087 균주, 동 균주를 이용한 스타우로스포린의 생산방법, 동 균주의 배양방법 및 동 균주의 순수배양액 Download PDF

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strain
same
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staurosporine
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최그레이스
이정민
임미진
남상집
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국립해양생물자원관
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    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to a strain of SNC087 in the genus Streptomyces isolated from seawater, a method for producing staurosporine using the strain, a method for culturing the strain, and a pure culture solution of the strain, and more particularly, to a stauro with anticancer activity.
  • the SNC087 strain of the genus Streptomyces isolated from seawater which can contribute to the expansion of food, pharmaceuticals, and other related industries, and national health, as the production capacity of sporin is excellent and stable mass production is possible. It relates to providing a pure culture solution of the strain.
  • Staurosporine was first isolated from Streptomyces staurosporeus in 1977. Staurosporine is known to have antibacterial and antihypertensive activity. The main biological activity of staurosporine is its ability to inhibit protein kinase C by preventing ATP from binding to kinase. This is caused by the strong affinity of staurosporine with the ATP binding site. In addition, staurosporin induces apoptosis by activated caspase-3 to stop cell division in the G1 or G2 stage of the cell cycle. Therefore, in clinical studies, it was observed that staurosporin encapsulated with liposome nanoparticles has anticancer effects without side effects in an experiment in mice.
  • staurosporin Due to the anticancer effect and various biological activities of staurosporin, various studies are being conducted, including success in total synthesis of not only staurosporin but also analog substances.
  • Patent 08575146 pharmaceutical substance containing staurosporine (US Patent 05736542), staurosporine culture process (European patent application 91102374.5), purification process of staurosporine ( European Patent 02272850), an apoptosis inducing agent having a novel inhibitory effect against intracellular parasitic microorganisms (Japanese Patent Application 17125020), a protein kinase inhibitor for treating neurological diseases (Japanese Patent Application 17357071), etc.
  • staurosporine is being sold by reagent vendors at a high price of 2 million won or more per 1 mg. Accordingly, a stable mass production method of staurosporin, which has proven various uses, and a new method for stabilizing the price. Is required.
  • the present invention was conceived to solve the problems of the prior art as described above, and its object is that the production ability of staurosporine having anticancer activity is excellent and stable mass production is possible, so that food, pharmaceuticals, and other related industries It is to provide a novel strain of SNC087 of Streptomyces genus isolated from seawater that can contribute to the expansion of and national health, a culture method of the strain, and a pure culture solution of the strain.
  • the liquid medium is SYP liquid medium, characterized in that the culture method of the SNC087 strain (KCCM12505P) of the genus Streptomyces.
  • a method of culturing SNC087 strain (KCCM12505P) of Streptomyces genus characterized in that cultivation in SYP liquid medium by shaking at 25 to 29°C and 100 to 200 rpm.
  • staurosporine having anti-cancer activity is excellent in production capacity and can be stably mass-produced, thereby contributing to the expansion of food, pharmaceuticals, and other related industries and public health.
  • FIG. 1 is a photograph showing the morphology of SNC087 strain of the genus Streptomyces isolated from seawater in a SYP solid medium.
  • Figure 3 is a liquid chromatography chromatogram data measured for the extract of the SNC087 strain obtained in the present invention.
  • Figure 4 is a comparison result of the UV spectrum of the large peak (staurosporin) of 7.6 minutes in the liquid chromatography chromatogram of the SNC087 extract obtained in the present invention and the In-house database.
  • Figure 6 is the NMR data of the SNC087 extract obtained in the present invention.
  • the present inventors prepared an extract using ethyl acetate after liquid culture of the SNC087 strain of the genus Streptomyces isolated from seawater, and from this, a staurosporine compound represented by the following formula (1) was isolated to identify the structure of the compound.
  • the present invention was completed by evaluating the production amount of the compound.
  • SNC087 strain of the genus Streptomyces isolated from seawater is provided.
  • the process of obtaining and identifying the strain of SNC087 genus Streptomyces according to the present invention will be described in detail.
  • the inventors of the present invention collected seawater near Gyeonggi Beach in Gijang-gun, Busan, and then added 100 ⁇ l of seawater to Mar4 solid medium (2 g kelp meal, 2 g D-mannitol, 1 g fish meal, 20 g/L KBr, 8 g/L Fe). 2 (SO 4 ) 3 ⁇ 4H 2 O, 30 ml DMSO, 970 ml filtered seawater, 21 g agar), and cultured at 27° C. to produce a single strain in SYP solid medium (10 g starch, 2 g yeast , 4 g peptone, 1 L filtered seawater, 21 g agar) was inoculated again to isolate and select pure strains.
  • the SNC087 strain isolated as described above was observed in the form of a strain belonging to the typical Streptomyces genus (see FIG. 1).
  • the SNC087 strain of the genus Streptomyces according to the present invention has a 16S rRNA gene nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and secretes staurosporin represented by Formula 1 below as a secondary metabolite.
  • the SNC087 strain of the genus Streptomyces was deposited with the Korea Microbial Conservation Center on April 30, 2019, and was given the accession number KCCM12505P.
  • the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of the SNC087 strain of the sp. Streptomyces of the present invention is as follows (SEQ ID NO: 1):
  • the 16S rRNA gene sequence of the SNC087 strain of the genus Streptomyces showed 99.9% homology with the 16S rRNA gene sequence of the Streptomyces sanyensis 219820 strain registered in NCBI GenBank.
  • the strain Streptomyces sanyensis 219820 has a production ability that is four times or more superior to the production amount of staurosporine produced under the same conditions.
  • the mutation occurred at the activation site of the gene related to the production of positional staurosporin, and this is thought to affect the production ability of staurosporin.
  • seawater was collected at Iwangwang Beach in Gijang-gun, Busan. 100 ⁇ l of collected seawater was added to Mar4 solid medium (2 g kelp meal, 2 g D-mannitol, 1 g fish meal, 20 g/L KBr, 8 g/L Fe 2 (SO 4 ) 3 ⁇ 4H 2 O, 30 ml) DMSO, 970 ml filtered seawater, 21 g agar), and cultured at 27°C to obtain a single strain in SYP solid medium (10 g starch, 2 g yeast, 4 g peptone, 1 L filtered sea water, 21 g) agar) to isolate and select pure strains.
  • SYP solid medium 10 g starch, 2 g yeast, 4 g peptone, 1 L filtered sea water, 21 g) agar
  • the purely isolated SNC087 strain was observed in the same morphology as the strains belonging to the genus Streptomyces as shown in FIG. 1.
  • 1 ml of the strain cultured at 27°C for 5 days in SYP liquid medium was taken and the “Tissue Genome DNA Isolation Kit” (Cosmogenetech co, Ltd., Seoul, South Korea) was used according to the manufacturer's protocol.
  • Genomic DNA was extracted.
  • PCR was performed using 27F and 1492R primers for amplification of 16S rRNA gene for species analysis.
  • the PCR product was purified using a "PCR purification kit” (Cosmogenetech co, Ltd..
  • the 16S rRNA gene sequence obtained from the SNC087 strain thus obtained was compared with information of previously reported strains using BLAST search of the GenBank/EMBL/DDBJ database. As a result, the 16S rRNA gene sequence of the SNC087 strain showed 99.9% homology with the Streptomyces sanyensis 219820 strain, and thus the SNC087 strain was considered to be a strain belonging to the genus Streptomyces .
  • Each 20 L of SNC087 was shaken in 1 L SYP liquid medium in 2.5-L Ultra Yield Flask at 27° C. and 150 rpm and incubated for 7 days, and then 20 L of ethyl acetate was added. After one day, the extracted ethyl acetate layer was obtained. The ethyl acetate layer was dried with a rotary evaporator to obtain 1.5 g.
  • Liquid chromatography chromatogram data was obtained for the SNC087 extract obtained in Example 3 as shown in FIG. 3, whereby a large peak (staurosporin) of 7.6 minutes was observed at the chromatogram confirmation UV wavelength 310 nm. .
  • the present inventors In order to check the content of staurosporin in the crude extract of SNC087 strain, the present inventors injected 60 ⁇ g of the crude extract when purifying the material by using reverse phase column liquid chromatography, and calculated the content of staurosporine contained in the extract by area calculation method. And calculated. As a result of the calculation as in FIG. 7, 93% of the injected extract was identified as staurosporin. According to this, it can be confirmed that 55.8 ⁇ g of staurosporin was contained in 60 ⁇ g of the crude extract extracted from the culture medium of the SNC087 strain.
  • Staurosporin is actively used as an anticancer agent in the clinical stage, and staurosporin, which is still being studied in many fields, has been confirmed to have a yield of 24% after undergoing total synthesis through five stages.
  • the medium components and culture methods suggested by the present inventors and the obtained SNC087 strain, it can be confirmed that it is a method capable of obtaining high yield staurosporin through a biological process rather than a chemical method.

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Abstract

본 발명은 스타우로스포린을 생산하는 해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P), 동 균주를 이용한 스타우로스포린의 생산방법, 동 균주의 배양방법 및 동 균주의 순수배양액을 제공한다.

Description

해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속의 SNC087 균주, 동 균주를 이용한 스타우로스포린의 생산방법, 동 균주의 배양방법 및 동 균주의 순수배양액
본 발명은 해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속의 SNC087 균주, 동 균주를 이용한 스타우로스포린의 생산방법, 동 균주의 배양방법 및 동 균주의 순수배양액에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항암활성이 있는 스타우로스포린의 생산능이 우수하고 안정적으로 대량생산이 가능함으로써, 식품, 의약품, 기타 관련 산업의 확대 및 국민건강에 기여할 수 있는 해수로부터 분리된 신규한 스트렙토마이세스 속의 SNC087 균주, 동 균주의 배양방법 및 동 균주의 순수배양액을 제공에 관한 것이다.
스타우로스포린은 1977년 Streptomyces staurosporeus로부터 처음 분리되었다. 스타우로스포린은 항균 및 항고혈압 활성이 있는 것으로 알려져 있다. 스타우로스포린의 주요 생물학적 활성은 ATP가 키나아제(kinase)에 결합하는 것을 막음으로써 단백질 키나아제 C를 억제하는 기능이다. 이것은 스타우로스포린의 ATP 결합부위와의 강한 친화력에 의해 발생한다. 또한, 스타우로스포린은 활성화된 caspase-3에 의해서 세포자살(apoptosis)을 유도하여 세포주기 G1 또는 G2 단계의 세포분열을 정지시킨다. 이에 임상연구에서 리포좀나노입자(liposome nanoparticle)로 캡슐화된 스타우로스포린은 마우스를 대상으로 한 실험에서 부작용 없이 항암효과가 있는 것이 관찰되었다.
이러한 스타우로스포린의 항암효과 및 여러 생물학적 활성으로 스타우로스포린 뿐만 아니라 아날로그 물질까지 토탈 합성에 성공하는 등 여러 연구가 진행되고 있다.
스타우로스포린과 관련하여, 국내외 특허문헌으로는 스타우로스포린 생산 방선균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 대한 연구 (대한민국 특허1017885490000), 안구 혈관신생 질환 치료용 스타우로스포린 유도체의 용도 (대한민국 특허 1006984490000), 스타우로스포린 유도체의 약제학적 용도 (미국 특허08575146), 스타우로스포린을 포함하는 제약물질 (미국 특허 05736542), 스타우로스포린 배양 과정 (유럽 특허출원 91102374.5), 스타우로스포린의 정제 과정 (유럽 특허 02272850), 세포내 기생성 미생물에 대해 신규 억제 효과를 가지는 세포자살 유도제 (일본 특허출원 17125020), 신경질환 치료용 프로테인키나아제 저해제 (일본 특허출원 17357071) 등에 여러 용도가 알려져 있다.
현재 스타우로스포린의 경우 1 mg당 200만원 이상의 고가의 금액으로 시약판매업체에서 판매되고 있는 실정으로, 이에 다양한 용도가 증명되고 있는 스타우로스포린의 안정적인 대량생산 방법 및 가격의 안정화를 위한 새로운 방안이 요구되고 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 항암활성이 있는 스타우로스포린의 생산능이 우수하고 안정적으로 대량생산이 가능함으로써, 식품, 의약품, 기타 관련 산업의 확대 및 국민건강에 기여할 수 있는 해수로부터 분리된 신규한 스트렙토마이세스 속의 SNC087 균주, 동 균주의 배양방법 및 동 균주의 순수배양액을 제공함에 있다.
상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.
(1) 스타우로스포린을 생산하는 해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P).
(2) 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)를 배양하여 배양물로부터 스타우로스포린을 생산하는 방법.
(3) 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)를 고체 배지에서 1차 배양한 후 이로부터 생성된 콜로니를 액체배지에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)의 배양방법.
(4) 상기 (3)에 있어서,
액체배지는 SYP 액체배지인 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)의 배양방법.
(5) 상기 (3)에 있어서,
SYP 액체배지에 25~29℃, 100~200 rpm으로 쉐이킹하며 배양하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)의 배양방법.
(6) 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)의 순수 배양액.
상기와 같이 본 발명에 의하면, 항암활성이 있는 스타우로스포린의 생산능이 우수하고 안정적으로 대량생산이 가능함으로써, 식품, 의약품, 기타 관련 산업의 확대 및 국민건강에 기여할 수 있다.
도 1은 해수로부터 분리한 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주의 SYP 고체배지에서의 형태를 나타내는 사진.
도 2는 배양한 SNC087 균주의 전체 추출물에 대한 역상 액체크로마토그래피 (UV 310 nm). 빨간색 화살표는 스타우로스포린을 가리킨다.
도 3은 본 발명에서 확보한 SNC087 균주의 추출물을 대상으로 측정한 액체크로마토그래피 크로마토그램 데이터.
도 4는 본 발명에서 확보한 SNC087 추출물의 액체크로마토그래피 크로마토그램에서 7.6분대의 큰 피크(스타우로스포린)의 UV 스펙트럼 및 In-house 데이터베이스와의 비교결과.
도 5는 본 발명에서 확보한 SNC087 추출물의 액체크로마토그래피 크로마토그램에서 7.6분대의 큰 피크의 Mass 스펙트럼 데이터.
도 6은 본 발명에서 확보한 SNC087 추출물의 NMR 데이터.
도 7은 본 발명에서 확보한 SNC087 균주의 조추출물 중 스타우로스포린의 함량을 확인하기 위한 역상 칼럼 액체크로마토그래피 결과 및 추출물에 포함된 스타우로스포린의 함량을 면적계산법을 이용하여 계산한 결과.
본 발명자들은 해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속의 SNC087 균주를 액체배양 후 에틸아세테이트를 이용하여 추출물을 조제하였고, 이로부터 하기 화학식 1으로 표시되는 스타우로스포린 화합물을 분리하여 화합물의 구조를 동정하였으며, 또한 상기 화합물의 생산량을 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020007906-appb-I000001
본 발명에서는 해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속의 SNC087 균주가 제공된다. 이하, 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주의 획득 및 분리동정과정에 관하여 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 부산 기장군 일광해수욕장 인근에서 해수를 채취한 뒤, 해수 100 ㎕를 Mar4 고체배지 (2 g kelp meal, 2 g D-mannitol, 1 g fish meal, 20 g/L KBr, 8 g/L Fe2(SO4)3·4H2O, 30 ml DMSO, 970 ml 필터된 해수, 21 g agar)에 접종하고, 27℃에서 배양하면서 생성된 단일 균주를 SYP 고체배지 (10 g starch, 2 g yeast, 4 g peptone, 1 L 필터된 해수, 21 g agar)에 다시 접종하여 순수한 균주를 분리 및 선별하였다.
이와 같이 분리된 SNC087 균주는 전형적인 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주의 형태적 양상이 관찰되었다 (도 1 참조).
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주는 서열번호 1로 나타내어지는 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지며 이차대사산물로서 하기의 화학식 1인 스타우로스포린을 분비한다. 상기 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주는 한국미생물보존센터에 2019년 4월 30일자로 기탁하여, 수탁번호 KCCM12505P를 부여받았다.
본 발명의 상기 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 다음과 같다 (서열번호 1):
AGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGTGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTTCGAA
스트렙토마이세스 속 SNC087 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 등록되어 있는 Streptomyces sanyensis 219820 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열과 99.9%의 상동성을 보였다. 하지만, 본 발명의 실시예에서 확인을 통해 Streptomyces sanyensis 219820 균주가 동일한 조건에서 생산하는 스타우로스포린의 생산량에 비하여 4배 이상 우수한 생산능을 갖는 것으로 보아 약간의 유전자 차이에도 불구하고 이러한 차이가 유전자의 위치상 스타우로스포린의 생산과 관련된 유전자의 활성화 위치에 생긴 변이일 가능성이 있어 이로 인해 스타우로스포린의 생산능에 영향을 주는 것으로 판단된다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명하고자 하나 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
[실시예 1] 해수로부터 균주 탐색 및 선별
2014년 부산 기장군 일광해수욕장에서 해수를 채집하였다. 채집한 해수 100 ㎕를 Mar4 고체배지 (2 g kelp meal, 2 g D-mannitol, 1 g fish meal, 20 g/L KBr, 8 g/L Fe2(SO4)3ㅇ4H2O, 30 ml DMSO, 970 ml 필터된 해수, 21 g agar)에 접종하고, 27℃에서 배양하면서 생성된 단일 균주를 SYP 고체배지 (10 g starch, 2 g yeast, 4 g peptone, 1 L 필터된 해수, 21 g agar)에 다시 접종하여 순수한 균주를 분리 및 선별하였다. 순수 분리된 SNC087 균주는 도 1과 같이 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주들과 같은 형태적 양상이 관찰되었다. 균주의 종 동정을 위해 SYP 액체배지에서 5일 동안 27℃에서 배양된 균주 1 ml을 취하여 "Tissue Genome DNA Isolation Kit"(Cosmogenetech co, Ltd., Seoul, South Korea)를 이용하여 제조회사 프로토콜에 의하여 genomic DNA를 추출하였다. 종 분석을 위해 16S rRNA 유전자 증폭을 위해 27F 및 1492R 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 "PCR purification kit" (Cosmogenetech co, Ltd.. Seoul, South Korea)을 이용하여 정제 후, capillary electrophoresis 기계 (Applied Biosystems 3730XL)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 이렇게 얻어진 SNC087 균주로부터 얻어진 16S rRNA 유전자 염기서열은 GenBank/EMBL/DDBJ 데이터베이스의 BLAST 서치를 활용하여 이전에 보고된 균주들의 정보와 비교하였다. 그 결과 SNC087 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열의 경우 Streptomyces sanyensis 219820 균주와 99.9% 상동성을 보임에 따라 본 SNC087 균주의 경우 Streptomyces 속에 속하는 균주로 판단된다.
[실시예 2] 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주의 대량 액체배양
SNC087 20 L를 각각 2.5-L Ultra Yield Flask에 1 L SYP 액체배지에 27℃, 150 rpm으로 쉐이킹하며 7일 동안 배양 후, 20 L의 에틸아세테이트를 넣었다. 하루가 지난 후, 추출된 에틸아세테이트 층을 얻었다. Rotary evaporator로 에틸아세테이트 층을 건조시켜 1.5 g을 얻었다.
[실시예 3] 화합물 스타우로스포린 생산확인
조추출물 1.5 g을 1% formic acid를 포함한 H2O과 1% formic acid를 포함한 acetonitrile의 5~100% acetonitrile (1% formic acid 포함)의 단계적 구배에 따르는 C18 실리카를 이용한 역상 칼럼 크로마토그래피-질량분석기 (LC-MS)로 분석하였다. UV 310 nm에서의 크로마토그래피 데이터와 In-house UV spectrum 데이터베이스와의 비교 및 MS 데이터를 확인한 결과, 7.6분에서 스타우로스포린의 피크와 데이터베이스의 스타우로스포린과의 상동성, 분자량 466에 해당하는 MS 데이터 값 및 NMR 데이터를 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 SNC087 균주의 20 L 액체배양 후 조추출물로부터 약 1.4 g의 스타우로스포린을 확보할 수 있었다.
[실시예 4] 화합물의 동정
상기 실시예 3에서 확보한 SNC087 추출물을 대상으로 액체크로마토그래피 크로마토그램 데이터를 도 3과 같이 얻었으며, 이에 의하면 크로마토그램 확인 UV 파장 310 nm에서, 7.6분대의 큰 피크(스타우로스포린)가 관찰되었다.
또한 도 4와 같이 상기 SNC087 추출물의 액체크로마토그래피 크로마토그램에서 7.6분대의 큰 피크(스타우로스포린)의 UV 스펙트럼 및 In-house 데이터베이스와의 비교결과, 도 5에서와 같이 SNC087 추출물의 액체크로마토그래피 크로마토그램에서 7.6분대의 큰 피크의 Mass 스펙트럼 데이터 및, 도 6에서와 같이 SNC087 추출물의 NMR 데이터 (용매: DMSO-d6)를 검토한 결과, 하기 화학식 1의 스타우로스포린임을 확인하였다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020007906-appb-I000002
[실시예 5] SNC087 균주로부터 스타우로스포린 생산 함량 계산
본 발명자들은 SNC087 균주의 조추출물 중 스타우로스포린의 함량을 확인하기 위하여 역상 칼럼 액체크로마토그래피를 이용하여 물질 정제 시 조추출물 60 ㎍을 주입하여 추출물에 포함된 스타우로스포린의 함량을 면적계산법을 이용하여 계산하였다. 도 7에서와 같이 계산 결과 주입한 추출물의 93%가 스타우로스포린으로 확인되었다. 이에 의하면 SNC087 균주의 배양액으로부터 추출된 조추출물 60 ㎍에는 55.8 ㎍의 스타우로스포린이 포함되어 있는 것을 확인할 수 있다.
본 발명자들이 시도한 SNC087 균주의 대량배양 20 L에서는 1.5 g의 조추출물을 얻었으며, 이로부터 1.4 g의 스타우로스포린을 확보할 수 있었다. 이 양은 배양액 리터당 70 mg의 높은 생산성을 보였다. 본 발명자들이 확보한 SNC087 균주와 99.9% 유사성을 가진 S. sanyensis 219820 의 경우 기존에 보고된 문헌에 의하면 20 L 배양 시 325.1 mg의 스타우로스포린을 생산하는 결과와 비교하면, 4배 이상의 높은 생산량을 확인할 수 있었다.
스타우로스포린은 임상단계에서 활발하게 항암제로서 사용되어지고 있으며, 현재까지도 많은 분야에서 연구되고 있는 스타우로스포린의 경우 5단계를 거치는 전합성을 거친 후 24%의 수율이 확인되고 있다. 본 발명자들이 제시한 배지성분 및 배양방법 그리고 확보한 SNC087 균주의 경우 화학적 방법이 아닌 생물학적 과정을 거쳐 높은 수율의 스타우로스포린을 확보할 수 있는 방법임을 확인할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
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<213> Streptomyces sp.
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(1397)
<400> 1
tgcagtcgac gatgaacctc cttcgggagg ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt 60
gggcaatctg ccctgcactc tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggatacga 120
ctcgggaggg catccttccg ggtggaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta 180
tcagcttgtt ggtggggtga tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg 240
cgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg 360
ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag cgcaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc 420
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta 480
ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt cgcgtcggat gtgaaagctc ggggcttaac 540
cccgggtctg cattcgatac gggcaggcta gagtgtggta ggggagatcg gaattcctgg 600
tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg 660
ccattactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 720
tccacgccgt aaacgttggg aactaggtgt tggcgacatt ccacgtcgtc ggtgccgcag 780
ctaacgcatt aagttccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt 840
gacgggggcc cgcacaagca gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct 900
taccaaggct tgacatatac cggaaagtgc tagagatagt gccccccttg tggtcggtat 960
acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1020
gagcgcaacc cttgttctgt gttgccagca tgcccttcgg ggtgatgggg actcacagga 1080
gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg 1140
tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg gtacaatgag ctgcgatgcc gtgaggcgga 1200
gcgaatctca aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt 1260
cggagttgct agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta 1320
cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc caaccccttg 1380
tgggagggag cttcgaa 1397
Figure WO-DOC-FIGURE-132

Claims (6)

  1. 스타우로스포린을 생산하는 해수로부터 분리된 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P).
  2. 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)를 배양하여 배양물로부터 스타우로스포린을 생산하는 방법.
  3. 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)를 고체 배지에서 1차 배양한 후 이로부터 생성된 콜로니를 액체배지에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)의 배양방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    액체배지는 SYP 액체배지인 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)의 배양방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    SYP 액체배지에 25~29℃, 100~200 rpm으로 쉐이킹하며 배양하는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)의 배양방법.
  6. 스트렙토마이세스 속 SNC087 균주(KCCM12505P)의 순수 배양액.
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