WO2020242157A1 - Iox1의 항생제, 항염증제 및 항패혈증제 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 8-하이드록시퀴놀린-5-카복시산(8-hydroxyquinoline-5-carboxylic acid, IOX1)의 항생제, 항염증제 용도, 및 패혈증 예방 또는 치료용도 등에 관한 것이다. IOX은 세포 내로의 투과성이 높아 약물로서의 적용이 용이하며, 항생 효과인 병원체의 생장을 저해할 뿐만 아니라, 숙주의 면역체계의 방어기전에도 관여하여 보다 강력한 면역체계 방어가 가능하도록 한다. 이는 박테리아 감염에 대한 새로운 개념의 항생제로서, 기존의 퀴놀론(Quinolone) 계열 항생제뿐만 아니라 다양한 항생제들에 대한 내성균 감염증의 치료가 가능해 광범위(broad spectrum) 항생제로서 활용될 수 있다.

Description

IOX1의 항생제, 항염증제 및 항패혈증제 용도

본 발명은 8-하이드록시퀴놀린-5-카복시산(8-hydroxyquinoline-5-carboxylic acid; 또는 IOX1, 이하 “IOX1”이라 함)의 항생제, 항염증제, 및 패혈증의 예방 또는 치료 용도 등에 관한 것이다.

본 출원은 2019년 5월 31일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0064528호 및 2020년 5월 22일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0061604호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.

최근 항생제 내성 박테리아의 증가로 병원체들이 약제에 대한 민감성이 떨어지기 때문에 약제가 효과를 나타내기 위해서는 종종 다량의 항생제를 사용하는 것이 필요한데, 이와 같은 높은 투여량은 종종 환자에게 독성을 나타내기도 한다. 이러한 약제내성 박테리아의 확산 증가가 인간의 건강에 심각한 위협을 주는 것으로 인지되고 있다. 따라서 약제 저항성 박테리아의 감염을 막기 위해서 신규한 작용메커니즘을 지닌 새로운 항생제를 개발하는 것이 무엇보다도 시급한 과제가 되고 있다.

한편 패혈증은 전 세계적으로 중환자실 이환율 및 사망률의 주요한 원인으로 알려져 있고 미국의 경우 해마다 750,000명의 패혈증 환자가 발생하며 국내에서도 정확한 통계는 없지만 매우 높은 발병률을 나타내고 있다. 치사율 또한 40% 정도로 매우 높은 편이나, FDA 승인을 받은 치료제는 한 가지뿐이며 아직까지 효과적인 치료법이나 치료약물은 매우 부족한 실정이다. 따라서 패혈증 치료약물의 개발은 임상적으로 상당한 의의를 가지며 치료제의 시장성도 매우 크다고 할 수 있다. 이에 따라 현재 패혈증 치료제를 개발하기 위한 연구가 국내외적으로 활발히 이루어지고 있다. 패혈증의 진행과정에서 나타나는 임상적 특성의 하나는 체내 염증계가 과활성화되는 것이므로, 패혈증의 치료를 위하여 이러한 염증반응을 수반하거나 촉진하는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1, 인터루킨-1), IL-6, 및 IL-10 등의 염증 유발 매개체를 억제하려는 수많은 시도가 있어왔으나 환자의 생존율을 개선하지 못했다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 IOX1을 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 IOX1을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 IOX1을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 히스톤 라이신 탈메틸화효소(Histone lysine demethylase)인 KDM4A의 특이적 저해제인 IOX1(8-hydroxyquinoline-5-carboxylic acid)이 박테리아의 DNA 자이레이즈(gyrase) 활성을 억제함으로써 항생제로서 사용될 수 있다는 새로운 발견에 기초하여, 새로운 개념의 항생제를 개발하였다. 본 발명의 항생제는 기존의 항생제에 대한 내성 박테리아에 의해 발생하는 패혈증을 비롯한 각종 박테리아 감염증 치료에 효과적으로 적용할 수 있는 새로운 개념의 항생제로서 박테리아의 DNA 자이레이즈 활성 억제를 통한 박테리아의 생장 억제 또는 사멸 유도뿐만 아니라, 숙주의 KDM4A의 조절을 통해 외부병원균에 대한 면역체계 항진에도 기여함으로써 박테리아에 대한 보다 강력한 방어를 가능케 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 대장균 K1 유래 패혈증 마우스 모델에서 IOX1에 의한 세균수 감소를 확인하였고(실시예 7 참조), IOX1의 처리에 의해 대장균, 아시네토박터 바우마니균의 생장이 직접적으로 억제됨을 확인하였으며(실시예 8 참조), 이는 IOX1의 박테리아 DNA 자이레이즈 특이적 활성 억제 효과에 의한 것임을 증명하였다(실시예 10 참조). 또한, 카바페넴계 약제 내성 아시네토박터 바우마니균(실시예 11 참조), 다제내성 아시네토박터 바우마니균(실시예 13 참조), 콜리스틴 내성 아시네토박터 바우마니균 및 황색포도상구균(실시예 14 참조)에 대한 IOX1의 박테리아 생장 억제 효과를 확인하였고, 이러한 IOX1의 항생 효과는 기존에 알려진 항생제인 시프로플록사신 및 히스톤 탈메틸화효소 억제제인 JIB-04와 비교하여 더 뛰어남을 보여주었다(실시예 15 및 16 참조). 즉, IOX1은 다양한 그람음성 및 그람양성균에 대한 항생(또는 항균; antibiosis) 효과를 나타냄을 확인한 것이다.

따라서 본 발명은 하기와 같은 화학식 1로 나타낼 수 있는 IOX1을 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 IOX1을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 세균의 억제 또는 살균 방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 IOX1의 세균 억제 또는 살균 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 IOX의 세균 억제 또는 살균에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

8-하이드록시퀴놀린-5-카복시산(8-hydroxyquinoline-5-carboxylic acid)은 주만지(jumonji) 도메인 포함 단백질(JMJD) 계열의 2-옥소글루타레이트(2-oxoglutarate) 의존성 히스톤 라이신 탈메틸화효소를 억제하는 화합물로서, 상기 화합물의 항생, 항염증, 및 항패혈증 효과에 대한 연구는 이전까지 이루어진 바 없다.

청구범위를 포함한 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된 용어 'IOX1'은 IOX1 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 의미로 사용되었다. IOX1은 당업계에 공지된 방법으로 제조된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 시판되는 IOX1을 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, “약학적으로 허용 가능한 염”이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

히스톤 라이신 탈메틸화효소(histone lysine demetylase: KDM)는 히스톤 단백질의 아미노산으로부터 메틸기를 제거할 수 있다. 히스톤 라이신 탈메틸화효소의 기질은 히스톤의 서브유닛(H1, H2A, H2B, H3, 및 H4), 아미노산의 순서, 및 메틸기의 개수에 따라 세분화된다. 메틸기가 1개, 2개, 및 3개인 기질은 각각 “me1”, “me2”, 및 “me3”으로 표시될 수 있다. 예를 들면, 본원의 실시예에서 언급되는 “H3K9me3”은 트리-메틸화된 히스톤 3의 9번째 라이신을 나타낸다. KDM4는 H3K9me3/2 및 H3K36me3/2를 기질로 하고, KDM4A(JMJD2A 또는 JHDM3A라고도 불림), KDM4B(JMJD2B 또는 JHDM3B라고도 불림), KDM4C(JMJD2C, JHDM3C, 또는 GASC1이라고도 불림), 및 KDM4D(JMJD2D 또는 JHDM3D라고 불림)가 속한다. KDM6은 H3K27me3/2를 기질로 하고, KDM6A(UTX라고도 불림) 및 KDM6B(JMJD3이라고도 불림)이 속한다. 예를 들면, 상기 IOX1, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 KDM4를 저해하는 활성을 가질 수 있다. 상기 KDM4는 히스톤 3 라이신 9의 삼중 메틸기, 또는 히스톤 3 라이신 36의 삼중 메틸기를 탈메틸화시키는 것일 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 “항생제”는 병원성 박테리아 감염의 치료 및 예방에 사용되는 항균제 약물을 통칭하는 것으로서, 엄격한 정의에서의 항생제는 다른 미생물에 대해 작용하는 미생물에 의해 생성된 물질을 의미하지만, 본원에서는 이에 제한되지 않으며, 합성(설폰아미드, 퀴놀론 등), 또는 반합성(메티실린, 아목시실린 등), 또는 식물, 또는 동물 등에서 유래하는 항균 물질을 모두 포함하며, 모든 유형의 미생물에 작용하는 모든 약제를 포함하는 의미로 사용되었다.

또한 본 발명은, IOX1에 의한 박테리아의 DNA 자이레이즈 활성 억제 용도를 제공한다.

또한 본 발명은, IOX1에 의한 그람양성(gram-positive) 또는 그람음성(gram-negative) 박테리아의 생장 억제 용도를 제공한다. 상기 그람양성 박테리아 및 그람음성 박테리아는 모두 DNA 자이레이즈를 가지고 있고, 이에 따라 IOX1의 박테리아 DNA 자이레이즈 활성 억제 기전에 의해 박테리아의 생장이 억제되는 효과가 나타나는 것이다.

본 발명의 “항생제”, “항염증제”, 및 “패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물”은 그람양성 박테리아, 그람음성 박테리아, 및 이의 항생제 내성균주에 대하여 항생, 항염증, 또는 항패혈증 효과를 가지며, 구체적으로 다음과 같은 병원균에 대하여 상기 효과를 나타내는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 아시네토박터 바우마니( Acinetobacter baumannii), 방사선균류속( Actinomyces sp.) (예를 들어, 악티노 미세스 이스라에라이( Actinomyces israelii) 및 악티노미세스 네스런다이( Actinomyces naeslundii)), 에로모나스 속( Aeromonas sp.)(예를 들어, 에로모난스 하이드로필라( Aeromonas hydrophila), 에로모나스 베로나이 비오바 소브리아(에로모나스 소브리아)( Aeromonas veronii biovar sobria( Aeromonas sobria)) 및 에로모나스 카비에( Aeromonas caviae)), 아나플라스마 파고사이토필럼( Anaplasma phagocytophilum), 알칼리제니스 자일로스옥시단( Alcaligenes xylosoxidans), 악티노바실러스 악티노미세템코미탄( Actinobacillus actinomycetemcomitans), 바실루스 속( Bacillus sp.)(예를 들어 탄저균( Bacillus anthracis), 세레우스균( Bacillus cereus), 고초균( Bacillus subtilis), 투린지엔시스균( Bacillus thuringiensis), 및 바실루스 스티로서머필러스( Bacillus stearothermophilus)), 가세균 속( Bacteroides sp.)(예를 들어, 박테로이드 프레질리스( Bacteroides fragilis)), 바르토넬라 속( Bartonella sp)(예를 들어, 바르토넬라 바실리포르미스( Bartonella bacilliformis) 및 바르토넬라 핸셀레( Bartonella henselae)), 비피더스균 속( Bifidobacterium sp.), 보데텔라 속( Bordetella sp.) (예를 들어 백일해균( Bordetella pertussis), 파라백일해균( Bordetella parapertussis) 및 보데텔라 브론카이셉티카( Bordetella bronchiseptica)), 보렐리아 속( Borrelia sp.)(예를 들어, 회귀열보렐리아( Borrelia recurrentis) 및 보렐리아 버그도르페리( Borrelia burgdorferi)), 브루셀라균 속( Brucella sp.)(예를 들어, 소유산균( Brucella abortus), 개유산균( Brucella canis), 말타열균( Brucella melintensis) 및 돼지유산균( Brucella suis)), 버르크홀데리아 속( Burkholderia sp.)(예를 들어, 버르크홀데리아 수도말레이( Burkholderia pseudomallei) 및 버르크홀데이라 세파시아( Burkholderia cepacia)), 캄필로박터 속( Campylobacter sp.)(예를 들어, 공장캄필로박터( Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜리( Campylobacter coli), 캄필로박터 라리( Campylobacter lari) 및 캄필로박터 태아고균( Campylobacter fetus)), 캅노사이토파가속( Capnocytophaga sp.), 카르디오박테리움 호미니스( Cardiobacterium hominis), 클라미디아 트라코마티스( Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 수모니에( Chlamydophila pneumonia), 앵무병 클라미도필라( Chlamydophila psittaci), 시트로박터속 콕시엘라 부르네티( Citrobacter sp. Coxiella burnetii), 코리네박테리아 속( Corynebacterium sp.)(예를 들어, 디프테리아균( Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 제이키움( Corynebacterium jeikeum) 및 코리네박테리움( Corynebacterium)), 클로스트리듐 속( Clostridium sp.)(예를 들어, 웰치균( Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실리균( Clostridium difficile), 클로스트리듐 보툴리늄( Clostridium botulinum) 및 파상풍균( Clostridium tetani)), 에이케넬라 코로덴스( Eikenella corrodens), 엔테로박터 속( Enterobacter sp.)(예를 들어, 엔테로박터 에어로게네스균( Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로메란스( Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 클로아케( Enterobacter cloacae) 및 장독성원소 대장균( enterotoxigenic E. Coli), 장침입성 대장균( enteroinvasive E. Coli), 장병원성 대장균( enteropathogenic E. Coli), 장출혈성 대장균( enterohemorrhagic E. Coli), 장관집합성 대장균( enteroaggregative E. Coli) 및 요로질환유발성 대장균( Uropathogenic E. coli)과 같은 기회 감염성 대장균을 포함하는 대장균( Escherichia coli)), 장구균 속( Enterococcus sp.)(예를 들어 엔데로코쿠스 페칼리스( Enterococcus faecalis) 및 엔테로코쿠스 페슘( Enterococcus faecium)), 에르리치아 속( Ehrlichia sp.)(예를 들어, 에르리치아 카핀시아( Ehrlichia chafeensia) 및 에프리치아 카니스( Ehrlichia canis)), 돼지단독균( Erysipelothrix rhusiopathiae), 유박테리움 속( Eubacterium sp.), 야토병균( Francisella tularensis), 누클레아튬균( Fusobacterium nucleatum), 가드네렐라 베지날리스( Gardnerella vaginalis), 게멜라 모르빌로럼( Gemella morbillorum), 헤모필루스 속( Haemophilus sp.) (예를 들어, 인플루엔자균( Haemophilus influenzae), 헤모필루스 듀크레이( Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 에이집티우스( Haemophilus aegyptius), 헤모피루스 파라인플루엔자( Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 헤모리티쿠스( Haemophilus haemolyticus) 및 헤모필루스 파라헤모리티쿠스( Haemophilus parahaemolyticus)), 헬리코박터 속( Helicobacter sp.)(예를 들어, 헬리코박터 파일로리( Helicobacter pylori), 헬리코박터 시네디( Helicobacter cinaedi) 및 헬리코박터 페넬리에( Helicobacter fennelliae)), 킹겔라 킹게( Kingella kingii), 클레프시엘라속( Klebsiella sp.)(예를 들어, 폐렴간균( Klebsiella pneumoniae), 클레브시엘라 그라눌로마티스( Klebsiella granulomatis) 및 클레브시엘라 옥시토카( Klebsiella oxytoca)), 젖산균 속( Lactobacillus sp.), 리스테리아 모노사이토제니스( Listeria monocytogenes), 렙토스피라 인테로간스( Leptospira interrogans), 레지오필라 뉴모필라( Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스( Leptospira interrogans), 펩토사슬알균 속( Peptostreptococcus sp.), 모락셀라 카타르할리스( Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 속( Morganella sp.), 모비룬쿠스 속( Mobiluncus sp.), 미구균 속( Micrococcus sp.), 마이코박테리움 속( Mycobacterium sp.)(예를 들어, 나병균( Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 인트라셀룰레어( Mycobacterium intracellulare), 조형결핵균( Mycobacterium avium), 소결핵균( Mycobacterium bovis) 및 마이코박테리움 마리넘( Mycobacterium marinum)), 마이코플리즘 속( Mycoplasm sp.)(예를 들어, 폐렴 마이코플라즈마( Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라즈마 호미니( Mycoplasma hominis) 및 마이코플라즈마 제니탈리움( Mycoplasma genitalium)), 노카르디아균( Nocardia sp.)(예를 들어, 노카르니아 에스테로이드( Nocardia asteroides), 노카르디아 시리아시지오지카( Nocardia cyriacigeorgica) 및 노카르디아 브라질리엔시스( Nocardia brasiliensis)), 나이세리균( Neisseria sp.)(예를 들어, 임균( Neisseria gonorrhoeae) 및 수막염균( Neisseria meningitidis)), 파스튜렐라 멀토시다( Pasteurella multocida), 플레시오모나스 시겔로이드( Plesiomonas shigelloides), 프리보텔라 속( Prevotella sp.), 포르피로모나스 속( Porphyromonas sp.), 프리보텔라 멜로니노게니카( Prevotella melaninogenica), 프로테우스 속( Proteus sp.)(예를 들어, 프로테우스 불가리스( Proteus vulgaris) 및 프로테우스 미라빌리스( Proteus mirabilis)), 프로비덴시아 속( Providencia sp.)(예를 들어, 프로비덴시아 알칼리파시엔( Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리( Providencia rettgeri) 및 프로비덴시아 스투아르테( Providencia stuartii)), 녹농균( Pseudomonas aeruginosa), 프로피온산균 에크니( Propionibacterium acnes), 로도코쿠스 에쿠이( Rhodococcus equi), 살모넬라균 속( Salmonella sp.)(예를 들어, 살모넬라 엔테리카( Salmonella enterica), 장티푸스균( Salmonella typhi), 파라티푸스균( Salmonella paratyphi), 장염균( Salmonella enteritidis), 살모넬라 식중독( Salmonella cholerasuis) 및 쥐티푸스균( Salmonella typhimurium), 세라티아 속( Serratia sp.)(예를 들어, 영균( Serratia marcesans) 및 세라티아 리뮈파시엔( Serratia liquifaciens)), 시겔라 속( Shigella sp.)(예를 들어, 지하적리균( Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리( Shigella flexneri), 보이드 설사균( Shigella boydii) 및 시겔라 소네이균( Shigella sonnei)), 포도상구균 속( Staphylococcus sp.) (예를 들어, 황색포도상구균( Staphylococcus aureus), 표피포도상구균( Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 헤모리티쿠스( Staphylococcus hemolyticus), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스( Staphylococcus saprophyticus)), 연쇄상구균 속( Streptococcus sp.)(예를 들어, 폐렴 연쇄상구균( Streptococcus pneumoniae), 스펙티노마이신-내성혈청형 6B 폐렴 연쇄상구균(Spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae), 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 폐렴 연쇄상구균(Streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae), 에리트로마이신-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 옵토친-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 리팜피신내성 혈청형 18C 폐렴 연쇄상구균(Rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae), 테트라사이클린-내성 혈청형 19F 폐렴 연쇄상구균(Tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae), 페니실린-내성 혈청형 19F 폐렴 연쇄상구균(Penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 및 트리메소프림-내성 혈청형 23F 폐렴 연쇄상구균(Trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae), 클로람페니콜-내성 혈청형 4 폐렴 연쇄상구균(Chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae), 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 폐렴 연쇄상구균(Streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae), 옵토친-내성 혈청형 14 폐렴 연쇄상구균(Optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae), 리팜피신-내성 혈청형 18C 폐렴 연쇄상구균(Rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae), 페니실린-내성 혈청형 19F 폐렴 연쇄상구균(Penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 또는 트리메소프림-내성 혈청형 23F 폐렴 연쇄상구균(Trimethoprimresistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티에( Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄( Streptococcus mutans), 화농성 연쇄상구균( Streptococcus pyogenes), A군 용혈연쇄구균(Group A streptococci), 화농성연쇄상구균( Streptococcus pyogenes), B군 용혈연쇄구균(Group B streptococci), 스트렙토코쿠스 아갈락티에( Streptococcus agalactiae), C군 용혈연쇄구균(Group C streptococci), 스트렙토코쿠스 안지노수스( Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 이퀴스밀리스( Streptococcus equismilis), D군 용혈연쇄구균(Group D streptococci), 스트렙토코쿠스 보비스( Streptococcus bovis), F군 용혈연쇄구균(Group F streptococci) 및 스트렙토코쿠스 안지노수스( Streptococcus anginosus), G군 용혈연쇄구균(Group G streptococci), 스피릴룸 마이너스( Spirillum minus), 모닐리포르미스연쇄간균( Streptobacillus moniliformi), 트레포네마균 속( Treponema sp.)(예를 들어, 트레포네마 카라튬( Treponema carateum), 트레포네마 페테뉴( Treponema petenue), 매독트레포네마( Treponema pallidum) 및 트레포네마 엔데미쿰( Treponema endemicum), 트로페리마 위펠리( Tropheryma whippelii), 유레아플라스마 유레알티쿰( Ureaplasma urealyticum), 베요넬라 속( Veillonella sp.), 비브리오균 속( Vibrio sp.)(예를 들어, 아시아콜레라균( Vibrio cholerae), 장염비브리오균( Vibrio parahemolyticus), 장염비브리오균( Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스( Vibrio vulnificus), 비브리오 알지노리티쿠스( Vibrio alginolyticus), 비브리오 미미쿠스( Vibrio mimicus), 비브리오 홀리세( Vibrio hollisae), 비브리오 플루비알리스( Vibrio fluvialis), 비브리오 메치니코비( Vibrio metchnikovii), 비브리오 뎀셀라( Vibrio damsela) 및 비브리오 푸르니시( Vibrio furnisii)), 예르시니아 속( Yersinia sp.)(예를 들어, 여시니아 엔테로콜리티카( Yersinia enterocolitica) 및 페스트균( Yersinia pestis)) 및 말토필리아( Xanthomonas maltophilia).

상기 그람양성 박테리아는 스타필로코커스 속( Staphylococcus), 리스테리아 속( Listeria), 스트렙토코쿠스 속( Streptococcus), 코리네박테리움 속( Corynebacterium), 락토바실러스 속( Lactobacillus), 클로스트리듐 속( Clostridium), 엔테로코쿠스 속( Enterococcus), 에리시펠로트릭스 속( Erysipelothrix) 및 바실러스 속( Bacillus)을 포함하는 그람양성 박테리아로 당업계에 공지된 모든 그람양성 박테리아인 것이 바람직하며, 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis), 스타필로코커스 아우레우스( Staphylococcus aureus) 또는 스타필로코커스 에피더미디스( S. epidermidis)인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 이들의 항생제 내성 균주를 포함할 수 있다. 상기 그람음성 박테리아는 대장균 속( Escherichia), 슈도모나스 속( Pseudomonas), 살모넬라 속( Salmonella), 렙토스피라 속( Leptospira), 리케치아 속( Rickettsia)을 포함하는 그람음성 박테리아로 당업계에 공지된 모든 그람음성 박테리아 것이 바람직하며, 대장균( Escherichia coli), 슈도모나스 에루지노사( Psedomonas aeruginosa), 아시네토박터 바우마니( Acinetobacter baumannii) 또는 살모넬라 타이피뮤리움( Salmonella typhimurium)인 것이 보다 바람직하며, 구체적으로 대장균( Escherichia coli) 또는 아세네토박터 바우마니( Acinetobacter baumannii) 중 어느 하나 인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 이들의 항생제 내성 균주를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, IOX1은 대장균( E. coli) K1, 대장균 DH5α, 아시네토박터 바우마니균 KUMC.2015.sus, 아시네토박터 바우마니균 ATCC 19606, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니균(CRAB 90), 콜리스틴 내성 아시네토박터 바우마니균, 다제내성 아시네토박터 바우마니균, 황색포도상구균 등을 포함하는 박테리아에 대한 생장 억제 효과를 제공하며, 간, 폐, 신장, 및 비장에서의 감염된 박테리아 수(CFU) 또한 현저하게 감소시키는 효과를 제공한다. 즉, IOX1은 박테리아의 생장 저해 또는 살균제(bactericide)로서 작용할 수 있음을 본원에서 개시하였다. 이와 같은 IOX1에 의한 박테리아의 생장 저해 또는 살균 효과는 퀴놀론계열 항생제와 마찬가지로 DNA 자이레이즈(gyrase)의 활성을 억제함으로써, 보다 구체적으로는 DNA의 초나선(supercoil) 구조를 유도하는 서브유닛 A와 ATP를 가수분해하는 서브유닛 B의 활성을 동시에 억제함으로써 나타나는 것임을 확인하였다.

또한 본 발명은, IOX1에 의한 혈중 내독소(endotoxin) 수치를 감소시키는 효과를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “내독소(LPS; lipopolysaccharide)”란, 일반적으로 그람-음성 박테리아에 의해 생성되고 생물학적으로 또는 화학적으로 박테리아의 외막으로부터 배출될 수 있는 주요 성분을 구성하는 생체 활성 화합물을 의미한다. 내독소는 지질 A라 불리는 지질 성분 및 공유결합된 폴리사카라이드로 이루어지는 양쪽 친매성 분자이다. 유전적, 생체합성적, 생물학적 및 구조적 특성들 때문에, 탄수화물 부분은 지질 A-기부 코어 영역 및 O-특이적 측쇄로 더 분화될 수 있다. 내독소는 세포막에 고정되어 있기 때문에 분비되지 않으며, 세균이 죽는 경우에만 외부 환경으로 유출된다. 미생물이 외부로 분비하는 외독소(exotoxin)에 비해서 독성이 떨어지지만, 다량의 내독소에 노출되면 출혈성 쇼크나 심한 설사를 유발할 수 있으며, 비교적 소량에 노출된 경우에도 고열이나 백혈구 수치 변화 등이 나타날 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, IOX1은 그람음성 박테리아인 대장균( E. coli) K1, 대장균 DH5α, 아시네토박터 바우마니균 KUMC.2015.sus, 아시네토박터 바우마니균 ATCC 19606, 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니균(CRAB 90), 및 다제내성 아시네토박터 바우마니균 등을 포함하는 박테리아에 의해 생성된 혈청 중의 내독소 수치를 현저하게 감소시킨다는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은, 항생제 내성 박테리아에 대한 생장 억제 용도를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “내성” 또는 “항생제 내성”은 미생물학의 숙련자가 충분히 이해하고 있는 용어이다. 항생제 내성 박테리아는 적어도 하나의 이전 유효 약물에 더 이상 영향이 없는 박테리아이며, 적어도 하나의 이전 유효 약물에 의한 항생제 공격을 견디는 능력을 발생한 것을 의미한다. 항생제 내성 박테리아는 그의 후손에게 상기 견디는 능력을 전달할 수 있다. 상기 항생제 내성 기전은 다양하다. 예컨대, 내성은 항생제가 박테리아의 내부 또는 박테리아 상의 작용 부위에 도달하지 않게 물리적으로 방지하는 비투과성 기전, 항생제를 박테리아로부터 신속하게 제거함으로써 박테리아의 내부 또는 박테리아 상의 작용 부위에 유효량의 항생제가 도달하지 못하게 방지하는 유출 기전, 항생제를 파괴하거나, 항생제를 무해한 (또는 덜 유해한) 화합물로 변환시키거나 또는 화합물을 보다 쉽게 배출시키는 대사 기전, 박테리아가 항생제에 의해 저해되는 경로와 다른 경로를 이용하는 바이패스 기전, 또는 항생제에 덜 민감한 항생제 타겟(예, 효소) 형태의 박테리아나 타겟을 가지고 있지 않은 박테리아를 통해서 나타날 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 상기 IOX1에 의한 생장 억제 효과를 보이는 항생제 내성 박테리아는 카바페넴(Carbapenem)계 항생제, 퀴놀론(Quinolone) 계 항생제, 및 콜리스틴(colistin) 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제에 대한 내성 박테리아일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 박테리아는 대장균( Escherichia coli), 아시네토박터 바우마니균( Acinetobacter baumannii), 및 황색포도상구균( Staphylococcus aureus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 골수 유래 수지상세포에서 IOX1의 처리에 의해 전염증성 사이토카인의 발현이 감소되는 것을 확인하였으며(실시예 4 참조), LPS-유도 내독소혈증(endotoxemia) 마우스 모델(실시예 6 참조), 대장균 K1 유래 패혈증 마우스 모델(실시예 7참조), 아시네토박터 바우마니균 유래 패혈증 마우스 모델(실시예 9 참조), 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니균(CRAB 90) 유래 패혈증 마우스 모델(실시예 12 참조) 및 CCI(cecal content-injected) 패혈증 마우스 모델(실시예 17 참조) 등에서 IOX1이 항염증(anti-inflammatory) 효과를 나타냄을 확인하였다.

따라서 본 발명은 IOX1을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 제공한다. 본 발명자들은 IOX1이 전술한 박테리아의 생장 억제 또는 살균 효과뿐만 아니라 숙주의 면역체계에도 작용하여 염증반응에도 영향을 미침을 발견하였으며, 구체적으로는 박테리아에 의한 염증반응에 의해 분비되는 전염증성 사이토카인의 수준을 현저하게 감소시킴을 확인하였다.

또한, 본 발명은 IOX1을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증의 억제 방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 IOX1의 염증 억제 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 IOX1의 염증 억제에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “항염증”은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선, 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다. 상기 “염증성 질환”이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 본 발명의 한 양태에서는 박테리아에 의해 유발되는 염증 반응에 대한 억제 효과를 제공한다.

또한, 본 발명은 박테리아에 의한 염증반응의 과활성화를 억제하는 효과를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 염증반응의 과활성화를 억제하는 것은 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)”은, 체내에서 발생하는 염증반응을 유발시키는 사이토카인을 의미하는데, 이들 전염증성 사이토카인은 특별히 이에 제한되지 않으나, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70 등이 될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, IOX1은 상기 전염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로써, 염증 반응을 억제하는 효과를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리아에 의한 염증반응은 그람양성 박테리아 또는 그람음성 박테리아에 의한 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리아는 항생제에 내성을 가진 박테리아 일 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예에서, 상기 염증반응을 유발하는 박테리아는 카바페넴(Carbapenem)계 항생제, 퀴놀론(Quinolone)계 항생제, 및 콜리스틴(colistin) 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제에 대한 내성 박테리아일 수 있다.

또한 본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 박테리아는 대장균( Escherichia coli), 아시네토박터 바우마니균( Acinetobacter baumannii), 및 황색포도상구균( Staphylococcus aureus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 대장균 K1 유래 패혈증 마우스 모델(실시예 7 참조), 아시네토박터 바우마니균 유래 패혈증 마우스 모델(실시예 9 참조), 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니균(CRAB 90) 유래 패혈증 마우스 모델(실시예 12 참조) 및 CCI 패혈증 마우스 모델(실시예 17 참조) 등에서 IOX1을 투여하는 경우 패혈증의 증상이 완화 또는 경감되며, 나아가 패혈증을 예방하고 장기의 손상을 억제함을 확인하여, IOX1이 패혈증의 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있음을 증명하였다.

따라서 본 발명은 IOX1을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 IOX1을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 패혈증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 IOX1의 패혈증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 IOX1의, 패혈증의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “패혈증”이란 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 상태를 말한다. 발열 증상, 혹은 저체온증, 호흡수의 증가(빈호흡), 심박수의 증가(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라고 부른다. 이러한 전신성 염증 반응 증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 신체의 감염 병소에서 병원균이 지속적 또는 단속적으로 혈류에 들어와 여러 장기조직에 정착하여 병소를 만들고 심한 전신 증상을 보이는 것으로, 유약자, 고령자, 쇠약자가 걸리기 쉽다. 원인균으로는 포도상구균, 연쇄상구균, 대장균, 녹농균, 결핵균, 폐렴간균, 진균, 혐기성균군 등이 있다. 현재까지 이에 대한 명확한 치료제가 없는 실정이다. 본 발명자들은 패혈증이 유도된 생쥐의 생존률이 개선되고, 혈중의 염증 유발 사이토카인의 발현이 억제되는 것을 확인하여 IOX1 이 패혈증의 예방 또는 치료에 유용하다는 것을 확인하였다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 패혈증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 패혈증 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명자들은 패혈증이 유도된 생쥐의 생존률이 개선되고, 혈중의 염증 유발 사이토카인의 발현이 억제되는 것을 확인하여 IOX1이 패혈증의 예방 또는 치료에 유용하다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은 패혈증에 의한 장기 손상을 억제할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물은 패혈증으로 인한 장기의 손상을 억제하는 것에 의하여 패혈증을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 장기는 패혈증으로 인하여 손상된 장기로, 본 발명의 상기 조성물에 의해 장기 손상이 억제될 수 있는 장기에는 제한이 없으나, 바람직하게는 간 또는 신장 중 어느 하나 이상의 장기일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 혈청 내 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(ALT; alanine aminotransferase, 이하 “ALT”라 함), 아스파테이드 아미노트랜스퍼레이즈(AST; aspartate aminotransferase, 이하 “AST”라 함), 혈액 내 요소 질소(blood urea nitrogen, 이하 “BUN”이라 함) 및 크레아티닌 활성분석을 통한 장기손상 지표를 분석해 본 결과, 간 및 신장의 손상을 억제하는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 패혈증의 유발원은 그람양성 박테리아 또는 그람음성 박테리아일 수 있다.

또한 본 발명의 일 구체예에서, 상기 박테리아는 항생제에 내성을 가진 박테리아일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 패혈증의 유발원은 카바페넴(Carbapenem) 계 항생제, 퀴놀론(Quinolone)계 항생제, 및 콜리스틴(colistin) 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제에 대한 내성 박테리아일 수 있다.

또한 본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 박테리아는 대장균 ( Escherichia coli), 아시네토박터 바우마니균( Acinetobacter baumannii), 및 황색포도상구균( Staphylococcus aureus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 항생제, 항염증제 및 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내의 상기 IOX1의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 또는 0.001 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 항생제, 항염증제 및 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 이의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항생제, 항염증제 및 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 항생제, 항염증제 및 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1928, 2208, 2906, 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드 처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000,6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 1828, 2906, 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O3), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 항생제, 항염증제 또는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 항생제, 항염증제 또는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 항생제, 항염증제 또는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 항생제, 항염증제 또는 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명은 IOX1을 유효성분으로 포함하는 항생제, 항염증제 내지 패혈증의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, IOX1은 세포 내로의 투과성이 높아 in vivo 약물로서 적용이 용이하다. 또한, 기존의 항생제들은 잘 알려져 있듯이 병원체(pathogen)의 생장 저해에만 관여한다면, 항생 효과를 보이는 IOX1은 병원체의 생장을 저해할 뿐만 아니라, 숙주의 면역체계의 방어기전에도 관여하여 보다 강력한 면역체계 방어가 가능하도록 한다. 이는 박테리아 감염에 대한 전혀 새로운 개념의 면역 대응방안을 제시하는 새로운 개념의 항생제로서 적용 가능하며, 기존의 퀴놀론(Quinolone)계열 항생제뿐만 아니라 다양한 항생제들에 대한 내성균 감염증의 치료가 가능해 광범위(broad spectrum) 항생제로서 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 골수유래 수지상 세포가 성숙함에 따라, 수지상 세포의 활성화에 관여하는 유전자의 발현 패턴 변화를 나타낸 히트맵(heatmap, 좌측 도표), 및 히스톤 라이신 탈메틸화효소(histone lysine demethylase) 중 하나인 Kdm4a와 Kdm6b 유전자의 배수 변화를 나타낸 것으로서, 마이크로어레이(microarray)를 수행하여 LPS 처리 후 각각 0일, 6일, 및 7일이 경과한 때의 유전자 변화량을 측정하였다(우측 그래프).

도 2a 내지 도 2c는 LPS에 의해 유도된 생쥐 골수유래 수지상 세포의 성숙에 따른 염증반응에서 IOX1이 상기 염증반응을 억제함을 나타낸 것이다: (도 2a) IOX1를 다양한 농도로 처리하여 세포의 생존력을 분석한 그래프로서, 비교 분석을 위한 양성 대조군으로 세포사멸(apoptosis) 유발 물질인 과산화수소(H ₂O ₂)를 사용하였다. (도 2b) 골수유래 수지상 세포(BMDC)에 대한 IOX1의 LPS 매개 면역반응 평가를 위해, 각 농도 별로 IOX1을 처리하고 30분 경과 후 LPS에 의해 분비되는 사이토카인(cytokine)을 분석한 도면이다. (도 2c) 골수유래 수지상 세포(BMDC)에 대한 IOX1의 LPS 매개 면역 반응에 대한 억제 효과의 보다 정확한 확인을 위해 수지상 세포 성숙 마커(maturation marker)인 CD80, CD86, MHC1, 및 MHC2의 발현을 분석한 도면이다.

도 3a 및 도 3b는 LPS에 의해 유도된 골수유래 수지상 세포의 성숙에서 IOX1 처리시 KDMs 및 전염증성 사이토카인의 RNA 수준을 나타낸 것이다: (도 3a) 골수유래 수지상 세포에 IOX1를 전처리하고, 30분이 경과한 후에 LPS를 처리한 뒤 KDM의 mRNA 발현 수준, 및 (도 3b) 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12α 및 IL-10의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4a 내지 도 4d는 IOX1 처리에 의한 수지상 세포 및 폐에서의 KDM4A, H3K9me3, 및 H3K36me3의 발현 변화를 나타낸 것이다: (도 4a 및 도 4c) 수지상 세포 및 폐에서 LPS 및 IOX1을 각각 처리 또는 미처리 한 네 개의 그룹에서 KDM4A의 발현을 웨스턴 블롯팅(IB) 및 면역침강법(IP)으로 확인한 도면이다. (도 4b 및 도 4d) 수지상 세포 및 폐에서 LPS 및 IOX1을 각각 처리 또는 미처리 한 네 개의 그룹에서 H3K9me3, 및 H3K36me3의 발현을 웨스턴 블롯팅(Western blotting 또는 IB) 및 면역침강법(IP)으로 확인한 도면이다.

도 5a 내지 도 5d는 LPS-유도 내독소혈증(endotoxemia) 마우스 모델에서 IOX1의 항염증 효과를 확인하기 위해, 6주령의 암컷 BALB/c 마우스에 내독소 유래 패혈증 유발 후, LPS 투여 30분 전에 IOX1을 투여하여 생존율 및 전염증성 사이토카인을 측정한 것이다: (도 5a) IOX1과 LPS 투여 생쥐의 생존율을 48시간 관찰하여 나타낸 도면이다. (도 5b) IOX1를 투여한 마우스의 혈청을 LPS(20mg/kg) 주사 30분 뒤 수확하여 혈청 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다(좌측 그래프). 마우스 폐를 스테인리스 비드로 균질화한 후 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, 및 IL-6)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다(우측 그래프). (도 5c) 표준 H&E 염색법에 기초하여 폐에 대한 PMNs(polymorphonuclear leukocytes, 다핵형 백혈구)의 침윤을 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)에 의해 염색한 것이다. (도 5d) 혈청 AST(Aspartate transaminase), ALT(Alanine transaminase), BUN(Blood urea nitrogen) 및 크레아티닌(Creatinine)의 수준을 측정한 것이다.

도 6a 내지 도 6f는 E. coli K1을 접종하여 유도된 패혈증 마우스 모델에서 면역 반응 또는 염증 반응이 IOX1에 의해 억제될 수 있는지 알아본 것이다: (도 6a) IOX1 투여 30분 후 E. coli K1을 마우스 복강에 투여하여 48시간 및 72시간 동안의 생존율을 확인한 것이다. (도 6b) 혈청 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, 및 IL-6)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다(좌측 그래프). 마우스 폐를 스테인리스 비드로 균질화한 후 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, 및 IL-6)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다(우측 그래프). (도 6c) 표준 H&E 염색법에 기초하여 폐에 대한 PMNs의 침윤을 헤마톡실린 및 에오신에 의해 염색한 것이다. (도 6d) 혈청 AST, ALT, BUN 및 크레아티닌의 수준을 측정한 것이다. (도 6e) 마우스의 폐, 간, 신장 및 비장을 스테인리스 비드로 균질화한 후, 용해물을 PBS로 희석하고 LB 한천 플레이트에서 하룻밤 동안 배양한 것이다. (도 6f) 혈청 내독소의 농도를 생물학적내독소시험(LAL Test)을 통해 측정한 것이다.

도 7a 및 도 7b는 E. coli 및 A. baumannii 균에 대한 IOX1의 시간-사멸 동역학 프로파일(time-kill kinetics profile) 분석을 나타낸 것이다: (도 7a) E. coli DH5α에 대한 IOX1의 항생제 효과를 나타낸 것이다. (도 7b) A. baumannii KUMC.2015.sus에 대한 IOX1의 항생제 효과를 나타낸 것이다.

도 8a 내지 도 8f는 임상 표준 균주인 A. baumannii ATCC 19606에 의한 면역 반응이 IOX1에 의해 억제될 수 있는지 여부를 확인한 것이다: (도 8a) IOX1 및 A. baumannii ATCC 19606 주입 마우스의 생존율을 36시간동안 관찰하여 나타낸 도면이다. (도 8b) 혈청 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70 및 IL-10)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다(좌측 그래프). 마우스 폐를 스테인리스 비드로 균질화한 후 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70 및 IL-10)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다(우측 그래프). (도 8c) 표준 H&E 염색법에 기초하여 폐에 대한 PMNs의 침윤을 헤마톡실린 및 에오신에 의해 염색한 것이다. (도 8d) 혈청 AST, ALT, BUN 및 크레아티닌의 수준을 측정한 것이다. (도 8e) 마우스의 폐, 간, 신장 및 비장을 스테인리스 비드로 균질화한 후, 용해물을 PBS로 희석하고 LB 한천 플레이트에서 하룻밤 동안 배양한 것이다. (도 8f) 혈청 내독소의 농도를 생물학적내독소시험(LAL Test)을 통해 측정한 것이다.

도 9a 및 도 9b는 박테리아에 대한 항생제로서 IOX1이 어떠한 방식으로 작용하는지 알아보기 위해 수행한 아가로스 젤 DNA 자이레이즈 분석 및 효소 분석을 나타낸 도면이다: (도 9a) IOX1 처리에 따른 자이레이즈의 초나선 형성 활성을 평가한 도면이다. (도 9b) IOX1 처리에 따른 자이레이즈의 ATP 가수분해 활성을 평가한 도면이다. 음성대조군(효소 없음) 및 양성대조군(억제제 없음)과 비교하여, 0.5 내지 10μM의 IOX1 존재하에 E. Coli DNA 자이레이즈의 ATPase 효소의 활성을 평가하였다.

도 10a 및 도 10b는 카바페넴 내성 바우마니균(CRAB 90)에 대한 IOX1의 시간-사멸 동역학 프로파일 분석을 나타낸 것이다: (도 10a) CRAB 90에 대한 IOX1의 항생제 효과를 이미페넴과 비교하여 나타낸 것이다. (도 10b) CRAB 90에 대한 IOX1와 이미페넴을 병용 투여한 경우 항생제 효과를 나타낸 것이다.

도 11a 내지 도 11f는 카바페넴 내성 균주인 CRAB 90에 의한 면역 반응이 IOX1에 의해 억제될 수 있는지 여부를 확인한 것이다: (도 11a) IOX1 및 CRAB 90을 주입한 마우스의 생존율을 36시간 동안 관찰한 도면이다. (도 11b) 혈청 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70, 및 IL-10)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다(좌측 그래프). 마우스 폐를 스테인리스 비드로 균질화한 후 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70 및 IL-10)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다(우측 그래프). (도 11c) 표준 H&E 염색법에 기초하여 폐에 대한 PMNs의 침윤을 헤마톡실린 및 에오신에 의해 염색한 것이다. (도 11d) 혈청 AST, ALT, BUN 및 크레아티닌의 수준을 측정한 것이다. (도 11e) 마우스의 폐, 간, 신장 및 비장을 스테인리스 비드로 균질화한 후, 용해물을 PBS로 희석하고 LB 한천 플레이트에서 하룻밤 동안 배양한 것이다. (도 11f) 혈청 내독소의 농도를 생물학적내독소시험을 통해 측정한 것이다.

도 12a 내지 도 12d는 카바페넴과 퀴놀론에 내성을 가지고 있는 다제내성 아시네토박터 바우마니균(multidrug-resistant A. baumannii)에 대한 기존의 항생제 이미페넴(카바페넴계 항생제), 시프로플록사신(퀴놀론계 항생제), 및 IOX1의 시간-사멸 동역학 프로파일 분석을 나타낸 것이다: 각각 (도 12a) MDR- A. baumannii AB 15-20, (도 12b) A. baumannii AB 15-21, (도 12c) A. baumannii AB K-YYK-21, 및 (도 12d) A. baumannii AB K-YYK-22 균주에 대하여 분석한 도면이다.

도 13a 및 도 13b는 IOX1의 시간-사멸 동역학 프로파일 분석을 나타낸 것이다: (도 13a) 그람양성 박테리아인 황색포도상구균( Staphylococcus Aureus)에 대하여 암피실린(ampicillin; AMP)과 IOX1의 생장 저해 능력을 비교한 그래프이다. (도 13b) 콜리스틴(Colistin) 내성 아시네토박터 바우마니균에 대하여 콜리스틴과 IOX1의 생장 저해 능력을 비교한 그래프이다.

도 14는 마우스에서 카바페넴 내성 바우마니균(CRAB 90)에 의한 면역 반응이 항생제인 시프로플록사신 또는 주만지 히스톤 탈메틸화효소 억제제(Jumonji histone demethylation inhibitor)인 JIB-04에 의해 억제될 수 있는지 여부를 비교 확인한 것이다.

도 15는 JIB-04의 항균 능력을 알아보기 위해 E. coli DH5α 균주에 각각 암피실린(양성대조군) 및 JIB-04를 처리하여 시간-사멸 동역학 프로파일을 나타낸 것이다.

도 16a 내지 도 16c는 CCI(cecal content-injection) 유도 패혈증 모델에서 IOX1의 패혈증 예방 및 치료 효과를 확인한 것이다: (도 16a) IOX1 투여 30분 후 맹장 내용물(CCI)를 마우스 복강에 투여하여 48시간 동안 생존율을 확인한 것이다. (도 16b) 혈청 내 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β및 IL-6)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정한 것이다. (도 16c) 혈청 내 AST, ALT, BUN 및 크레아티닌의 수준을 측정한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: LPS(lipopolysaccharide)에 의한 골수유래 수지상 세포(Bone marrow-derived dendritic cell)의 활성화 유도 및 유전자 프로파일링(profiling)

골수유래 수지상 세포에 LPS를 처리하여 활성화를 유도한 후 유전자 발현이 변화되는지를 알아보기 위한 유전자 프로파일링을 수행하였다.

구체적으로, RNA의 순도(purity) 및 무결성(integrity)은 ND-1000 분광 광도계(NanoDrop, 미국) 및 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, 미국)를 사용하여 평가하였다. RNA 라벨링 및 하이브리드화는 Agilent사의 One-Color Microarray 기반 유전자 발현 분석 프로토콜(Agilent Technology, V 6.5, 2010)을 사용하여 수행하였다. 간단히 말하면, 100ng의 총(total) RNA를 각 샘플로부터 선형적으로 증폭시키고, Cy3-dCTP로 표지하였다. 표지된 cRNA는 RNAeasy 미니 키트(Qiagen, 독일)을 사용하여 정제하였다. 표지된 cRNA(pmol Cy3 · μg cRNA-1)의 농도 및 특이적 활성은 ND-1000 분광광도계를 사용하여 측정 하였다. 다음으로, 600ng의 각 표지된 cRNA 샘플을 60℃에서 30분 동안 가열하기 전에 5μL, 10X 블로킹제(blocking agent) 및 25X 단편화 완충액 1μL를 첨가하여 단편화 하였다. 마지막으로, 25μL 2X GE 하이브리드화 완충액(hybridization buffer)를 첨가하여 표지된 cRNA를 희석시켰다. 총 40μL의 하이브리드화 용액을 개스킷 슬라이드(gasket slide)에 분주하고 Agilent SurePrint G3 마우스 GE 8X60K 마이크로어레이(Agilent Technologies)에 삽입하였다. 이 슬라이드를 혼성화 오븐(Agilent Technologies)에서 65℃17시간 동안 배양한 후 Agilent One-Color 마이크로어레이 기반 유전자 발현 분석 프로토콜(Agilent Technology, V 6.5, 2010)에 따라 실온(22℃에서 세척하였다. 하이브리드화된 어레이는 Agilent 마이크로어레이 스캐너 D(Agilent Technologies)를 이용하여 즉시 스캔하였다. 원시 데이터(raw data)는 Agilent 피쳐 익스트렉션(Feature Extraction) 소프트웨어 v11.0.1.1(Agilent Technologies)를 사용하여 추출한 다음, 원시 데이터 텍스트 파일을 생성하기 위해 Agilent 피쳐 익스트렉션 프로토콜을 사용하여 자동 요약하였다. 이는 추가 분석을 위한, 어레이에 포함된 각각의 유전자에 대한 발현 데이터를 제공한다. 플래그 A로 표지된 어레이 프로브를 제거하였고, 선택된 각 gProcessedSignal 값(녹색 채널에 대하여 처리된 신호)은 사분위수(quantile) 방법을 사용하여 대수적으로 변환하고 정규화 하였다. 발현 데이터 내의 통계적 유의성은 배수 변화(fold change)와 LPE 테스트에 의해 결정되었으며, 귀무가설(null hypothesis)은 두 그룹간에 발현 차이가 없다는 것이었다. 계층적 군집 분석(Hierarchical cluster analysis)은 유사성의 척도로서, 완전 연결(complete linkage)과 유클리드 거리(Euclidean distances)를 사용하여 수행되었다. 현저한 프로브 목록을 위한 유전자-농축(Gene-Enrichment)과 기능적 주석(Functional Annotation) 분석은 DAVID(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, http://david.abcc.ncifcrf.gov)를 사용하여 수행하였다. 차별적으로 발현된 유전자의 모든 데이터 분석 및 시각화는 R 3.0.2 (http://www.r-project.org)를 사용하여 수행하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 마이크로어레이(microarray) 분석 결과와 같이, 미성숙(immature) 수지상 세포는 LPS에 의한 자극에 따라 성숙하는 동안 히스톤 탈메틸화(demethylation)에 관여하는 KDM4A와 KDM6B 효소의 발현 수준이 특이적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 상기 KDM의 특이적인 저해제로서 8-hydroxyquinoline-5-carboxylic acid(IOX1)를 선정하여 LPS에 의한 골수유래 수지상 세포 활성이 IOX1에 의해 조절될 수 있는지 여부를 in vitro 및 in vivo에서 확인하였다.

실시예 2: IOX1 처리에 따른 세포 생존력 평가(cell viability assay)

마우스로부터 얻은 골수유래 수지상 세포(BMDC)를 96-well 마이크로 플레이트에 각각 2 X 10 ⁶ cells/well이 되도록 시딩(seeding)하고 IOX1을 각각 10μM, 50μM, 100μM, 200μM 및 500μM의 농도로 처리한 후 밤새 배양하였다. 음성 대조군으로는 DMSO, 양성 대조군으로는 과산화수소(H ₂O ₂)를 사용하였다.

세포 생존력 평가는 발광성(luminescent) 세포 생존력 키트(Promega, 미국)를 이용하여 대사 활성 세포의 지표인 ATP의 존재를 측정함으로써 평가하였다. 이를 위해 세포 배양 상등액(supernatant)에 존재하는 ATP를 루미노미터(luminometer)를 사용하여 정량화 하였다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, IOX1의 농도가 100μM 이하인 경우에는 골수유래 수지상 세포에 대한 독성이 관찰되지 않음을 확인하였다.

실시예 3: IOX1의 LPS에 의한 골수유래 수지상 세포(bone marrow-derived dendritic cell: BMDC) 면역 반응 억제 능력 측정

3.1. 효소결합면역침강분석(Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 이용한 전염증성 사이토카인 분비량 분석

LPS에 의해 유도된 면역 반응 및 IOX1 처리시 상기 면역 반응에 미치는 영향을 알아보기 위하여 ELISA를 이용해 전염증성 사이토카인 분비량을 분석하였다. 골수유래 수지상 세포를 50ng/ml LPS에 의해 자극하고, 상기 자극 전·후로 하여 IOX1을 처리하였다. 이후, 배양 배지를 수집하였고, 배지의 상등액 중의 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70, 및 IL-10 수준을 ELISA로 측정하였다. ELISA는 제조사(eBioscience)의 지침에 따라 샌드위치(sandwich) ELISA를 사용하여 결정하였다.

그 결과 도 2b에 나타난 바와 같이, IOX1은 LPS에 의해 증가된 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL- 12p70, 및 IL-10의 분비를 현저하게 감소시킴을 확인할 수 있었다. 나아가 상기와 같은 전염증성 사이토카인 분비의 감소는 IOX1의 농도에 의존적인 경향을 보였다.

3.2. 유세포 분석(flow cytometry)을 이용한 수지상 세포 표면 분석

골수유래 수지상 세포(BMDC)에 대한 IOX1의 LPS 매개 면역 반응에 대한 억제 효과를 확인을 위해 수지상 세포 성숙 마커(maturation marker)인 CD80, CD86, MHC1, 및 MHC2의 발현을 유세포 분석을 통해 확인하였다. 골수유래 수지상 세포를 각각 도 2c에 표시된 농도의 IOX1으로 30 분간 전처리 한 후 LPS(50ng/ml)로 밤새 자극하였다. 자극된 골수유래 수지상 세포의 표면 분자 발현은 유세포 분석을 통해 확인하였다. 골수유래 수지상 세포는 각각 FITC 항-CD11c 항체(클론: N418), PE 항-CD86 항체(클론: GL-1), PE 항-H-2Kd/H-2Dd 항체(클론: 34-1-2S), 및 PE 항-I-A/I-E PE 항체(클론: M5/114.15.2)(BioLegend, 미국)로 염색되었다. 이후, CD80, CD86, MHC class I, 및 MHC class II의 발현을 유세포 분석기(FACSCalibur, BD Biosciences, 미국)로 분석하였다.

그 결과 도 2c에 나타난 바와 같이, 골수유래 수지상 세포에서 LPS에 의해 증가하였던 수지상 세포 성숙 마커인 CD80, CD86, MHC1, 및 MHC2가 IOX1을 처리한 경우 IOX1의 농도 의존적으로 그 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 IOX1이 LPS에 의해 유도된 골수유래 수지상 세포에서의 면역 반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4: IOX1 처리에 의한 골수유래 수지상 세포에서의 KDMs 및 사이토카인 mRNA의 발현 변화 분석

4.1. RNA 추출 및 역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction: RT-qPCR)

골수유래 수지상 세포에서 LPS에 의해 활성화된 히스톤 라이신 탈메틸화효소에 대한 IOX1의 영향을 검증하기 위해 KDM4A와 KDM6B의 발현 여부를 RT-qPCR을 통해 분석하였다. 총(total) RNA를 TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하여 추출한 후, RNA 샘플을 동일한 농도로 조정하여 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 4368813)를 사용하여 역전사시켰다. 합성된 cDNA는 제조사의 프로토콜에 따라 LightCycler®480 SYBR Green I 마스터 믹스(Roche Diagnostics, 스위스, 카탈로그 번호 04887352001)를 넣고 Cycler®480 II 를 사용하여 증폭하였다. 사용된 RT-qPCR 프라이머 서열은 다음과 같다:

Kdm4a, 정방향, 5'-TATGGAGCAGACGTGAATGG-3' (서열번호 1) 및 역방향, 5'-CCACATGCCGAAGTAAAGGT-3' (서열번호 2);

Kdm6b, 정방향, 5'-TCCGAGAGTCCTACCTGTCC-3' (서열번호 3) 및 역방향, 5'-GATGACGGTGATGGGGTTC-3' (서열번호 4);

Tnf-α, 정방향, 5'-TCGTAGCAAACCACCAAGTG-3' (서열번호 5) 및 역방향, 5'-AGATAGCAAATCGGCTGACG-3' (서열번호 6);

IL-1β, 정방향, 5'-GACCTTCCAGGATGAGGACA-3' (서열번호 7) 및 역방향, 5'-TCCATTGAGGTGGAGAGCTT-3' (서열번호 8);

IL-6, 정방향, 5'-CTTGGGACTGATGCTGGTGA-3' (서열번호 9) 및 역방향, 5'-TGCAAGTGCATCATCGTTGT-3' (서열번호 10);

IL-10, 정방향, 5'-GGTTGCCAAGCCTTATCGGA-3' (서열번호 11) 및 역방향, 5'-ACCTGCTCCACTGCCTTGCT-3' (서열번호 12);

IL-12α, 정방향, 5'-CCAGGGTCATTCCAGTCTCT-3' (서열번호 13) 및 역방향, 5'-TCTTCAATGTGCTGGTTTGG-3' (서열번호 14);

β-액틴, 정방향, 5'-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3' (서열번호 15) 및 역방향, 5'-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3' (서열번호 16).

RT-qPCR 분석은 95℃에서 5분간 초기 변성(denaturation) 단계를 거친 후, 95℃에서 10초, 60℃에서 10초, 72℃에서 10초를 한 사이클로 하여 45 사이클을 수행하였다. 증폭된 RNA 값의 정량은 LightCycler®480 프로그램 (Roche Diagnostics, 스위스)을 사용하여 자동으로 결정되었다.

그 결과 도 3a에 나타난 바와 같이, LPS에 의해 증가하였던 KDM4A와 KDM6B의 mRNA 수준이 IOX1 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, IOX1의 처리에 의해 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12α 및 IL-10의 mRNA 발현 역시 감소되는 것을 확인하였다.

4.2. 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real time-polymerase chain reaction: RT-PCR)

TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하여 총 RNA을 추출하였고, DNase I(Biobasic, 미국)로 분해한 다음, 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, 미국)를 사용하여 역전사시켰다. LightCycler 480 II(Roche, 스위스)와 LightCycler 480 SYBR Green I Master mix(Roche)를 사용하여 제조사의 권장 조건에 따라 cDNA의 증폭을 수행하였다.

실시예 5: IOX1 처리에 의한 수지상 세포 및 폐에서의 KDM4A, H3K9me3, 및 H3K36me3의 발현 변화 분석

KDM4A는 유전자-비활성화(gene-inactivating) H3K36와 H3K9의 삼중-메틸기(tri-methyl marks)를 제거하여 유전자 발현의 유지에 기여한다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 IOX1 처리에 의한 KDM4A, H3K36me3, 및 H3K9me3의 발현 변화를 확인하고자 웨스턴 블롯팅(Western blotting, IB) 및 면역침강법(Immunoprecipitation, IP)을 수행하였다.

먼저 C57BL/6 마우스로부터 채취한 수지상 세포를 50 μM IOX1의 존재 또는 부재하에 50ng/mL LPS로 밤새 LPS로 자극시켰다. BALB/c 마우스의 폐에는 20mg/kg IOX1의 존재 또는 부재하에 하룻밤 동안 10mg/kg LPS를 주사하였다. IOX1으로 처리한 수지상 세포와 폐에서 추출한 총 단백질 추출물에 대하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 KDM4A(도 4a 및 4c), H3K9me3 및 H3K36me3(도 4b 및 4d)를 검출하였고, 히스톤 H3를 로딩 대조군으로서 사용하였다. 보다 구체적으로, 단백질(샘플 당 총 25μg)을 10% 황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate) 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)으로 분리한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인으로 트랜스퍼 하였다. 상기 멤브레인을 0.05% Tween-20 (TBS-T)가 함유된 트리스완충식염수(Tris-buffered saline)에 용해된 5% 탈지유로 블로킹(blocking)한 후, 도 4a 내지 도 4d에 표시한 항체와 함께 배양하였다. 멤브레인을 TBS-T로 세척한 후, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)가 컨쥬게이트된 2차 항체와 함께 배양하고, 향상된 화학발광 키트(enhanced chemiluminescence kit, Merck, 독일)를 사용하여 시각화하였다.

면역침강법은 수지상 세포에서 IOX1의 존재 또는 부재하에 H3K9me3, H3K36me3 및 대조군으로서 히스톤 H3에 대한 특이적 항체를 사용하여 수행하였다. 보다 구체적으로, 해당 항체를 1ml의 각 세포 추출물에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 교반기에서 배양하였다. 사전에 세척된 단백질 A-아가로스 비드(beads)의 50% 슬러리(slurry) 50μL를 각 샘플에 첨가한 다음 4 ℃에서 12시간 더 배양한 후, 샘플을 용균 완충액(lysis buffer)으로 4회 세척하였고 전술한 바와 같이 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다.

그 결과 도 4a 내지 도 4d에 나타난 바와 같이, IOX1의 처리에 의해 H3K36me3, 및 H3K9me3에 작용하는 히스톤 라이신 탈메틸화효소인 KDM4A(JMJD2a; 주몽지 도메인 포함 단백질 2a)의 발현이 in vitro(수지상세포, 도 4a) 및 in vivo(폐, 도 4c)에서 억제됨을 확인하였다. LPS에 의해 감소된 H3K9me3 및 H3K27me3의 발현 또한 IOX1에 의해 in vitro(수지상세포, 도 4b) 및 in vivo(폐, 도 4d) 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 IOX1이 LPS에 의한 KDM-매개 H3K9me3 및 H3K27me3의 탈메틸화를 조절하여 염증 관련 유전자의 발현을 저해할 수 있음을 시사한다.

실시예 6: LPS-유도 내독소혈증(endotoxemia) 마우스 모델에서 IOX1의 항염증(anti-inflammatory) 효과

상기 실시예 3의 in vitro에서 확인한 IOX1의 항염증(anti-inflammatory) 효과를 in vivo에서도 확인하고자 내독소혈증 마우스 모델을 이용하였다.

구체적으로, 생존율 분석을 위해 6주령의 암컷 BALB/c 마우스에 IOX1(Sellectchem) 20mg/kg을 복강내(intraperitoneal) 주사하고, 30분 경과 후 상기 IOX1 주사 마우스(5마리/그룹)에 LPS( E. coli O127:B8, Sigma-Aldrich, 미국) 20mg/kg를 복강내 주사하였다. 생존율은 48시간 동안 관찰되었다.

다른 분석을 위해, 2시간 후, IOX1 투여 마우스에 10mg/kg의 LPS (5마리/그룹)를 복강내 주사하였다. 2시간 후, 전염증성 사이토카인 ELISA를 위해 상기 마우스 혈청을 수확하였다. 다음 날, 이 쥐들은 동물 윤리에 따라 희생되었다. 폐의 절반은 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하였다. 그리고 나서, 상기 폐의 조직 슬라이드를 만들기 위해 얇게 썰고, 슬라이드는 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다(도 5c). 폐의 다른 반쪽은 불렛 블렌더(Bullet Blender) 균질기(Next Advance, 미국)를 사용하여 균질화 하였다. 폐의 전염증성 사이토카인을 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 혈청에서 ALT 및 AST를 측정하여 간기능의 손상 정도를 평가하였고, BUN 및 크레아티닌 농도를 측정하여 신장기능의 손상 정도를 관찰하였다. 상기 ALT, AST, BUN, 및 크레아티닌의 수치는 총 실험 자동화 시스템(Hitachi, 일본) 및 TBA-200FR NEO(Toshiba, 일본) 시스템을 사용하여 측정하였다.

그 결과 도 5a 내지 도 5d에서 나타난 바와 같이, LPS를 단독 투여한 마우스 그룹의 생존율은 18시간 이내에 0% 였으나, IOX1를 함께 투여한 경우에는 생존율이 약 40%까지 증가한 것으로 나타났다(도 5a). 내독소혈증 마우스의 혈청 및 폐에서 증가된 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6는 IOX1에 의해 현저하게 감소하였다(도 5b). 또한 LPS에 의해 증가된 마우스의 혈중 AST, ALT, BUN, 및 크레아티닌의 수준도 IOX1에 의해 현저하게 저해되었다(도 5d). 이러한 결과는 IOX1이 LPS 유래 내독소혈증 마우스 모델에서 치료 효과가 있음을 시사한다.

실시예 7: 대장균( E. Coli ) K1 유래 패혈증 마우스 모델에서 IOX1의 항패혈증(antiseptic) 효과

세포벽에 LPS(내독소)를 포함하는 그람음성 박테리아에 의한 면역 반응이나 염증이 IOX1에 의해 억제될 수 있는지 결정하기 위해 본원에서는 대표적인 그람음성 박테리아인 E. coli K1을 이용한 패혈증 마우스 모델을 사용하였다. 구체적으로, 6주령 암컷 BALB/c 마우스에 20mg/kg의 IOX1(Selleckchem, 미국)을 복강내 주사하였다. 생존율 분석을 위해, 30분 경과 후, IOX1를 투여한 마우스에 E. coli K1(1 Х10 ⁷ CFU/마우스)(5마리/그룹)을 복강내 주사하였다. 생존율은 48-72시간 동안 관찰하였다. 다른 분석을 위해, 30분 후, IOX1를 투여한 마우스에 E. coli K1(5 Х10 ⁸ CFU/마우스)(5마리/그룹)를 복강내 주사하였다. 2시간 후, 전염증성 사이토카인을 ELISA를 이용하여 측정하기 위해 혈청을 수확하였다. 다음 날, 상기 마우스들은 동물 윤리에 따라 희생시키고, 폐의 절반은 파라포름알데히드로 고정하였다. 그리고 나서, 상기 폐를 조직 슬라이드로 만들기 위해 얇게 썰고, 슬라이드는 헤마톡실린과 에오신을 이용하여 염색하였다. 나머지 반 쪽의 폐, 간, 신장, 및 비장은 Bullet Blender 균질기(Next Advance, 미국)를 사용하여 균질화하였다. 폐 용해물(lysate)의 전염증성 사이토 카인은 ELISA로 측정하였다. 조직 용해물 중의 잔류 박테리아를 PBS로 희석하고 하룻밤 동안 LB 한천 플레이트에서 배양하였다. 혈청 내 AST, ALT, BUN 및 크레아티닌(Creatinine) 수치는 총 실험 자동화 시스템(Hitachi, 일본) 및 TBA-200FR NEO(Toshiba, 일본) 시스템을 사용하여 측정하였다. 혈청 내독소(endotoxin)의 수준은 생물학적내독소시험(Limulus Amebocyte Lysate, LAL TEST)에 의해 결정하였고, 발색 반응은 405 nm에서 측정하였다.

그 결과 도 6a 내지 도 6f에 나타난 바와 같이, E. coli K1만 투여한 그룹의 경우 19시간 이내에 마우스의 생존율은 0% 였으나, IOX1를 투여한 그룹의 경우에는 72시간 까지 생존율이 약 60%로 증가하였다(도 6a). 또한 IOX1을 투여 한 E. coli K1 유래 패혈증 마우스 모델의 혈청과 폐에서 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 수치가 감소하였다(도 6b). 폐에서 E. coli K1으로 증가된 면역 세포의 침윤(도 6c) 및 AST, ALT, BUN과 크레아티닌의 수준 또한 IOX1의 투여에 의해 감소됨(도 6d)을 보였다. 이와 같은 결과는 IOX1이 E. coli K1에 의해 유도된 패혈증에서 혈중 ALT, AST, BUN, 및 크레아티닌 농도 증가의 억제를 통해 간 및 신장 기능의 손상을 억제할 수 있음을 시사하는 것이며, 이에 의해 패혈증을 예방 또는 치료할 수 있음을 뒷받침하는 것이다. 나아가 E. coli K1 유래 패혈증 마우스 모델의 각 기관에서 IOX1의 세균 제거능을 확인하기 위해 간, 폐, 및 신장에 남아있는 세균의 수를 측정하였고, 그 결과 E. coli K1에 의해 증가된 간, 폐, 및 신장에서의 세균 수(CFU)는 IOX1에 의해 현저히 감소됨을 확인하였다(도 6e). 또한 IOX1은 E. coli K1에 의해 증가된 마우스 혈청 내의 내독소 수준도 현저히 감소시켰다(도 6f). 이러한 결과는 IOX1가 세균의 제거 및 내독소 제거를 유도하여 E. coli K1 유래 패혈증을 치료할 수 있음을 시사한다.

실시예 8: 그람음성(Gram-negative) 박테리아에 대한 IOX1의 항균(antibiotic) 효과

상기 실시예 7의 박테리아 유발 패혈증 모델에서 IOX1에 의해 세균의 수 및 내독소 수치가 현저히 감소됨을 확인하여, IOX1의 직접적인 영향에 의한 항균력 여부를 분석하였다. 구체적으로, IOX1의 살균 활성에 대한 실험은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다. E. coli DH5α(4.03 Х10 ⁴ CFU/mL) 및 A. baumannii KUMC.2015.sus(4.3 Х10 ⁴ CFU/mL)를 특정 농도(0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)의 IOX1가 첨가된 37℃ MH 배지에서 배양하였다. 10μL의 세균 현탁액을 다양한 시간 간격(0, 2, 4, 6, 8, 12시간)으로 수집하고, MH 배지로 연속 희석하여 LB 한천에 도말한 후, 생장 가능한 콜로니를 얻기 위해 5% CO ₂의 존재하에 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 양성대조군으로는 이미페넴(Imipenem, 25ug/ml)을 사용하였고, 실험은 3번 반복(triplicate) 시행하였다.

그 결과 도 7a 및 도 7b에서 나타난 바와 같이, E. coli DH5α에 대해서는 항생제인 이미페넴과 마찬가지로, IOX1 농도 25, 50, 및 100ug/mL에서 농도 의존적으로 12시간까지 생장이 억제됨을 확인하였다(도 7a). A. baumannii KUMC.2015.sus 균에서는 IOX1의 농도 의존적으로 생장이 억제되다가, IOX1의 농도가 50ug/mL 이상인 경우 균의 생장이 완전히 억제되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 IOX1이 직접적으로 박테리아의 성장을 저해하는 항생제로서의 역할을 할 수 있음을 확인시켜 주는 것이다.

실시예 9: 아시네토박터 바우마니균( Acinetobacter baumannii ) 유래 패혈증 마우스 모델에서 IOX1의 항패혈증(antiseptic) 효과

상기 실시예 7의 E. coli k1 마우스 패혈증 모델 외에, 추가로 임상 표준 균주인 A. baumannii ATCC 19606에 의한 면역 반응이 IOX1에 의해 억제될 수 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 6주령의 암컷 BALB/c 마우스에 20mg/kg의 IOX1(Selleckchem, 미국)을 복강내 주사하고, 생존율 분석을 위해, 30분 후 IOX1 투여 마우스에 A. baumannii ATCC 19606(1.9 Х10 ⁴ CFU/마우스)를 주사하였다(5마리/그룹). 생존율은 36시간 동안 관찰하였다. 다른 분석을 위해, 30분 후 IOX1를 투여한 마우스에 A. baumannii KUMC ATCC 19606(9.5 Х10 ³ CFU/마우스)를 복강내 주사하였다(5마리/그룹). 2시간 후 전염증성 사이토카인 ELISA를 위해 혈청을 수확하였다. 다음 날, 마우스들은 동물 윤리에 따라 희생시켰고, 폐의 절반은 파라포름알데히드로 고정하였다. 그리고 나서, 상기 폐를 조직 슬라이드로 만들기 위해 얇게 썰고 슬라이드는 헤마톡실린과 에오신을 이용하여 염색하였다. 나머지 반 쪽의 폐, 간, 신장 및 비장은 Bullet Blender 균질기(Next Advance, 미국)를 사용하여 균질화 하였다. 폐 용해물의 전염증성 사이토카인은 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 조직 용해물 중의 잔류 박테리아를 PBS로 희석하고 하룻밤 동안 LB 한천 플레이트에서 배양하였다. 혈청 내 AST, ALT, BUN 및 크레아티닌 수치는 총 실험 자동화 시스템(Hitachi, 일본) 및 TBA-200FR NEO(Toshiba, 일본) 시스템을 사용하여 측정하였다. A. baumannii KUMC ATCC 19606 유발성 패혈증 마우스 모델의 기관에서 IOX1이 세균 제거에 영향을 주는지 확인하기 위해 간, 폐, 신장 및 비장에 남아있는 세균 수를 측정하였다. 혈청 내독소의 수준은 생물학적내독소시험에 의해 결정하였고, 발색 반응은 405nm에서 측정하였다.

그 결과 도 8a 내지 도 8f에 나타난 바와 같이, A. baumannii ATCC 19606 감염 18시간 이내 생존율은 0% 였으나, 항생제인 이미페넴을 투여한 마우스의 생존율은 100%로 나타났고, IOX1을 단일 투여한 경우에는 생존율이 약 40%까지 증가하는 것을 확인하였다(도 8a). 또한 IOX1을 투여한 A. baumannii KUMC ATCC 19606 유래 패혈증 마우스 모델의 혈청과 폐에서 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70, 및 IL-10의 수치가 감소되었다(도 8b). IOX1은 항생제 이미페넴과 마찬가지로, 폐에서 A. baumannii ATCC 19606에 의해 증가된 면역 세포의 침윤(도 8c) 및 AST, ALT, BUN, 그리고 크레아티닌의 수준 또한 효과적으로 감소시켰다(도 8d). 세균 및 내독소 제거와 관련하여서는, A. baumannii KUMC ATCC 19606에 의해 증가된 간, 폐, 신장 및 비장에서의 세균 수(CFU)가 IOX1에 의해 유의하게 감소되었음을 확인하였고, A. baumannii KUMC ATCC 19606에 의해 증가된 마우스 혈청 내 내독소 수준도 IOX1에 의해 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 IOX1이 세균의 제거 및 내독소 제거를 유도하여 A. baumannii KUMC ATCC 19606 유발성 패혈증을 치료할 수 있음을 보여준다.

실시예 10: 박테리아에 대한 항생제로서 IOX1의 작용 기전 확인

10.1. 아가로스 젤 DNA 자이레이즈(gyrase) 분석법

DNA 자이레이즈(gyrase)는 2개의 A 서브유닛과 2개의 B 서브유닛으로 구성되어 있는데, A 서브유닛은 DNA의 초나선(supercoiling) 구조를 유도하고, B 서브유닛은 ATP 가수분해에 의한 초나선 형성에 필요한 에너지를 제공한다. 이에 본 발명자들은 IOX1의 DNA 자이레이즈 A 서브유닛에 대한 영향을 분석하여 그 작용방식을 확인하였다. IOX1은 퀴놀린(quinoline)의 유도체로서, 퀴놀린은 DNA 자이레이즈 서브유닛 B17과 안정적인 상호 작용을 형성하여 E. coli DNA 자이레이즈에 작용하는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, IOX1이 퀴놀린 계열 항생제인 시프로플록사신(Ciprofloxacin)과 유사한 작용을 하는지 여부를 조사하기 위해 자이레이즈 특이적 억제 활성 분석을 수행하였다. 자이레이즈 활성 저해 분석에서 기질로는 이완된 원형의 PBR322 플라스미드를 사용하였고, 자이레이즈 활성이 있을 경우 초나선 구조를 형성할 것이므로, 초나선 및 이완된 형태의 플라스미드를 아가로스 젤 전기 영동을 통해 판단하였다.

그 결과 도 9a에서 나타난 바와 같이, 자이레이즈의 활성 저해는 이완된 플라스미드 형태를 증가시키는데, IOX1는 초나선 구조 형성을 감소시켜 이완된 플라스미드가 증가함을 확인하였다(도 9a).

10.2. 효소 분석법(Enzymatic assay)

자이레이즈 서브유닛 B의 활성에 대하여 IOX1이 직접적인 영향을 미치는지 여부를 분석하기 위해 DNA 자이레이즈 ATPase 결합 분석을 통하여 서브유닛 B32의 ATPase 활성을 평가하였다. ATP의 가수 분해는 NADH가 NAD ⁺로 전환되므로, 이러한 전환을 확인함으로써 ATPase의 활성을 확인할 수 있다. 이에 NAD ⁺의 생성을 340nm 분광도에서 평가하였고 이를 음성대조군과 비교하였다. 보다 구체적으로는, E. coli 자이레이즈 ATPase 결합 분석 키트를 사용하여 제조사의 지시 사항(Inspiralis, 영국, 카탈로그 번호 ATPG001)에 따라 수행하였다. 반응 혼합물(100㎕)은 40mM HEPES-KOH(pH 7.6), 10mM 아세트산 마그네슘(magnesium acetate), 10mM DTT(dithiothreitol), 2mM ATP, 500mM 칼륨 글루타메이트(potassium glutamate), 0.05mg/ml 알부민, 3μg의 이완된 pBR322 DNA, 80mM PEP(2-phosphoenolpyruvate), 피루브산 키네이스/락테이트 탈수소화효소(stock pyruvate kinase/lactate dehydrogenase, 제조사 지침에 따른 농도), 20mM NADH, 50nM DNA 자이레이즈를 함유하며, 10% DMSO에 용해된 50, 25, 10, 또는 5μM의 UVI5008, 또는 0.01N HCl에 용해된 30μM의 시프로플록사신 중 하나를 함유한다. 음성대조군 및 양성대조군은 각각 10% DMSO에서 효소의 부재 및 존재로 나타냈다. 25℃340nm에서 10분 동안 흡광도를 측정하였다. 반응은 30mM ATP를 첨가한 후에 시작되었으며, 이어서 340nm에서의 흡광도를 25℃에서 60분 동안 모니터링 하였다.

그 결과 도 9b에서 나타난 바와 같이, IOX1이 존재하는 경우 DNA 자이레이즈 ATPase 활성이 감소됨을 확인하였다.

상기 실시예 10.1. 및 10.2.의 두 결과를 통해 IOX1이 DNA 자이레이즈의 A 와 B 서브유닛의 활성 모두에 연관되어, 전반적인 자이레이즈의 활성을 감소시키고 있음을 확인하였다.

10.3. ITC(Isothermal titration calorimetry)

ITC(등온 적정 열량측정법)는 생체 분자 상호 작용의 열역학 및 결합 친화도를 측정하여 상호 작용이 일어나는 방식에 대한 이해를 돕는다. 이 기법은 분자 사이에서 집합체가 형성될 때 방출되거나 흡수된 열의 측정에 기반한다. 본 발명자들은 ITC를 사용하여 IOX1과 DNA 자이레이즈 사이의 결합력을 추가로 확인하기 위해 주사기 안에 DNA 자이레이즈 0.75μM (in 12.5% 글리세롤) 40μL와 세포에 IOX1 0.075μM (in PBS) 300 μL를 분주한 후에 35℃, 13 injection 조건으로 분석하였다.

그 결과 도 9c에 나타난 바와 같이, 박테리아 DNA 자이레이즈의 서브유닛 A가 각각 10-x 및 10-y임을 나타내었으며, 이는 IOX1과 박테리아의 DNA 자이레이즈가 직접 결합하여 작용한다는 사실을 시사하는 결과이다.

실시예 11: 카바페넴(carbapenem) 내성 아시네토박터 바우마니균(CRAB 90)에 대한 IOX1의 생장 억제 효과

IOX1의 시간-사멸 동역학 프로파일(time-kill kinetics profile) 분석을 통해, IOX1 각각의 농도별, 시간별로 분석하여 IOX1이 농도 의존적으로 세균의 생장을 억제함을 확인하였다. 구체적으로, IOX1의 살균 활성에 대한 실험은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다. CRAB 90 (4.66 Х10 ⁴ CFU/mL)을 특정 농도(0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)의 IOX1가 첨가된 37℃ MH 배지에서 배양하였다. 10μL의 세균 현탁액을 다양한 시간 간격(0, 2, 4, 6, 8, 12시간)으로 수집하고, MH 배지로 연속 희석하여 LB 한천에 도말한 후, 생장 가능한 콜로니를 얻기 위해 5% CO ₂의 존재하에 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 양성대조군으로는 이미페넴(25ug/ml)을 사용하였고, 실험은 3번 반복(triplicate) 시행하였다.

그 결과 도 10a 및 10b에 나타난 바와 같이, 고농도의 이미페넴 항생제에 대해서도 카바페넴-내성 바우마니균(CRAB 90)은 생장이 억제되지 않고 내성이 나타났지만, IOX1은 농도 의존적으로 CARB 90의 생장을 억제함을 확인하였다(도 10a). 또한 이미페넴과 IOX1의 CRAB 90 생장 억제에 대한 병용 효과를 보기 위하여 이미페넴을 낮은 농도(12.5ug/ml)로 IOX1와 함께 처리하였을 경우, 단독처리 하였을 때 보다 농도 의존적인 균 성장 억제 효과가 향상됨을 확인하였다(도 10b).

실시예 12: 카바페넴 내성 아시네토박터 바우마니균(CRAB 90) 유래 패혈증 마우스 모델에서 IOX1의 항패혈증(antiseptic) 효과

IOX1의 in vivo에서 항패혈증 효과를 갖는지 여부에 대하여 알아보기 위해 CRAB 90으로 유발된 패혈증 마우스 모델을 사용하였다. 보다 구체적으로는, 6주령의 암컷 BALB/c 마우스에 20mg/kg의 IOX1(Selleckchem)을 복강내 주사하고, 생존율 분석을 위해 30분 후 IOX1 투여 마우스에 CRAB 90(1.4 Х10 ⁴ CFU/마우스)를 주사하였다(5마리/그룹). 생존율은 36시간 동안 관찰되었다. 다른 분석을 위해, 30분 후 IOX1를 투여한 마우스에 CRAB 90(7 Х10 ³ CFU/마우스)를 복강내 주사하였다(5마리/그룹). 2시간 후, 전염증성 사이토카인 ELISA를 위해 혈청을 수확하였다. 다음 날, 마우스들은 동물 윤리에 따라 희생시켰고, 폐의 절반은 파라포름알데히드로 고정하였다. 그리고 나서, 상기 폐를 조직 슬라이드로 만들기 위해 얇게 썰고 슬라이드는 헤마톡실린과 에오신을 이용하여 염색하였다. 나머지 반 쪽의 폐, 간, 신장 및 비장은 Bullet Blender 균질기(Next Advance)를 사용하여 균질화하였다. 폐 용해물의 전염증성 사이토카인은 샌드위치 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 조직 용해물 중의 잔류 박테리아를 PBS로 희석하고 하룻밤 동안 LB 한천 플레이트에서 배양하였다. 혈청 내 AST, ALT, BUN 및 크레아티닌 수치는 총 실험 자동화 시스템(Hitachi) 및 TBA-200FR NEO(Toshiba) 시스템을 사용하여 측정하였다. CRAB 90 유발성 패혈증 마우스 모델의 기관에서 IOX1이 세균 제거에 영향을 주는지를 확인하기 위해 간, 폐, 신장 및 비장에 남아있는 세균의 수를 측정하였다. 혈청 내독소의 수준은 생물학적내독소시험에 의해 결정하였고, 발색 반응은 405nm에서 측정하였다.

그 결과 도 11a 내지 11f에서 나타난 바와 같이, CRAB 90을 단독투여한 경우 18시간 이내에 마우스의 생존율은 0% 였으며, 항생제인 이미페넴을 각각 1, 10, 20 mg/kg 농도로 투여한 마우스의 생존율 또한 0% 였다. 그러나 IOX1을 투여하였을 때에는 생존율이 80%까지 증가함을 확인하였다(도 11a). 또한 IOX1을 투여한 CRAB 90 유도성 패혈증 마우스 모델의 혈청과 폐에서 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70, 및 IL-10의 수치가 감소한 반면, 이미페넴을 투여한 경우에는 IOX1과 같은 사이토카인의 억제 효과가 나타나지 않았다(도 11b). IOX1을 투여한 경우는, 효과가 없었던 항생제 이미페넴과 비교시, 훨씬 더 효과적으로 폐에서 CRAB 90으로 인해 증가된 면역 세포의 침윤(도 11c) 및 AST, ALT, BUN과 크레아티닌 수준(도 11d) 감소를 확인하였다. 세균 및 내독소 제거와 관련하여서는, CRAB 90에 의해 증가된 간, 폐, 신장 및 비장에서 세균 수(CFU)가 IOX1에 의해 현저하게 억제됨을 확인하였다(도 11e). 또한 IOX1은 CRAB 90에 의해 증가된 마우스 혈청의 내독소 수준 역시 감소시켰고, 이러한 결과는 IOX1가 세균 및 내독소를 제거하여 카바페넴 내성균으로 인한 패혈증을 치료할 수 있음을 보여주는 것이다.

실시예 13: 다제내성 아시네토박터 바우마니균에 대한 IOX1의 생장 억제 효과

카바페넴과 퀴놀론에 내성을 가지고 있는 다제내성 아시네토박터 바우마니균(multidrug-resistant A. baumannii)에 대한 이미페넴(imipenem, 카바페넴계 항생제), 시프로플록사신(ciprofloxacin, 퀴놀론계 항생제), 및 IOX1의 시간-사멸 동역학 프로파일(time-kill kinetics profile) 분석을 수행하였다. 구체적으로, IOX1의 살균 활성에 대한 실험은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다. MDR- A.baumannii AB 15-20(1.7 Х10 ⁴ CFU/mL), 15-21(1.5 Х10 ⁴ CFU/mL), K-YYK-21(1.8 Х10 ⁴ CFU/mL), 및 K-YYK-21(3.1 Х10 ⁴ CFU/mL)을 특정 농도(0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)의 IOX1가 첨가된 37℃ MH 배지에서 배양하였다. 10μL의 세균 현탁액을 다양한 시간 간격(0, 2, 4, 6, 8, 12시간)으로 수집하고, MH 배지로 연속 희석하여 LB 한천에 도말한 후, 생장 가능한 콜로니를 얻기 위해 5% CO ₂의 존재하에 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 양성대조군으로는 이미페넴과 시프로플록사신을 사용하였고, 실험은 3번 반복(triplicate) 시행하였다.

그 결과 도 12a 내지 도 12d에 나타난 바와 같이, 이미페넴과 시프로플로사신은 다제내성균에 대한 생장 억제 효과를 보이지 못했지만, IOX1은 농도 의존적으로 상기 4가지의 모든 다제내성균에 대하여 생장 억제 효과를 보였다(도 12a 내지 도 12d).

실시예 14: 황색포도상구균( Staphylococcus aureus ) 및 콜리스틴(Colistin) 내성 아시네토박터 바우마니균에 대한 IOX1의 생장 억제 효과

그람양성 박테리아인 황색포도상구균에 대하여 암피실린과 IOX1의 시간-사멸 동역학 프로파일 분석, 및 그람음성 박테리아인 콜리스틴 내성 아시네토박터 바우마니균에 대한 콜리스틴 및 IOX1의 시간-사멸 동역학 프로파일 분석을 수행하였다. 구체적으로, IOX1의 살균 활성에 대한 실험은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다. 황색포도상구균(9.0 Х10 ⁴ CFU/mL), 및 콜리스틴 내성 아시네토박터 바우마니균 2(8.1 Х10 ⁴ CFU/mL)를 특정 농도(0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)의 IOX1이 첨가된 37℃ MH 배지에서 배양하였다. 10μL의 세균 현탁액을 다양한 시간 간격(0, 2, 4, 6, 8, 12시간)으로 수집하고, MH 배지로 연속 희석하여 LB 한천에 도말한 후, 생장 가능한 콜로니를 얻기 위해 5% CO2의 존재하에 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 양성대조군으로는 각각 암피실린과 콜리스틴을 사용하였고, 실험은 3번 반복 시행하였다.

그 결과 도 13a 및 13b에서 나타난 바와 같이, 암피실린과 마찬가지로 IOX1도 농도 의존적으로 그람양성 박테리아인 황색포도상구균의 생장을 저해함을 확인하였다(도 13a). 또한 콜리스틴은 내성균의 생장을 저해하지 못하였지만, IOX1은 농도 의존적으로 콜린스틴 내성균의 생장을 저해하였다.

실시예 15: 카바페넴(carbapenem) 내성 아시네토박터 바우마니균(CRAB 90)에 대한 시프로플록사신(Ciprofloxacin)과 JIB-04의 면역 반응 억제 여부의 확인

항생제인 시프로플록사신과 히스톤 탈메틸화효소 억제제인 JIB-04가 CRAB 90 균에 의한 면역 반응을 억제할 수 있는지 알아보기 위해 마우스 패혈증 모델에서 혈청 ALT 및 AST의 수준을 측정하여 간기능의 손상 정도를 평가하였다. 구체적으로, 6주령 암컷 BALB/c 마우스에 20mg/kg의 시프로플록사신(Sigma, 미국), 또는 JIB-04(Selleckchem)을 각각 복강내 주사하였다. 30분 경과 후 위 시프로플록사신 또는 JIB-04 투여 마우스에 CRAB 90(7 × 10 ³ CFU/마우스, 5마우스/그룹)를 복강내 주사하였다. 그 후 ALT 및 AST 수치를 총 실험 자동화 시스템(Hitachi) 및 TBA-200FR NEO(Toshiba) 시스템을 사용하여 측정하였다.

그 결과 도 14에서 나타난 바와 같이, 시프로플록사신과 JIB-04 모두 CRAB 90 균에 의해 증가한 AST와 ALT 수준을 완벽하게 감소시키지 못하였다.

실시예 16: 그람음성(Gram-negative) 박테리아에 대한 JIB-04의 항균(antibiotic) 효과

JIB-04의 직접적인 영향에 의한 항균력 여부를 분석하였다. 구체적으로, JIB-04의 살균 활성에 대한 실험은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다. E. coli DH5α (4.03 Х10 ⁴ CFU/mL)를 특정 농도(0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)의 JIB-04가 첨가된 37℃ MH 배지에서 배양하였다. 10μL의 세균 현탁액을 다양한 시간 간격(0, 2, 4, 6, 8, 12시간)으로 수집하고, MH 배지로 연속 희석하여 LB 한천에 도말한 후, 생장 가능한 콜로니를 얻기 위해 5% CO ₂의 존재하에 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 양성대조군으로는 암피실린을 사용하였고, 실험은 3번 반복 시행하였다.

그 결과 도 15에 나타난 바와 같이, JIB-04는 E. coli DH5α 균에 대한 직접적인 항균 능력이 전무함을 확인하였다.

실시예 17: CCI(cecal content-injected) 패혈증 마우스 모델에서 IOX1의 항균(antimicrobial) 효과

실제 패혈증 상태를 모방하기 위해, 30-40mg의 맹장 내용물(cecal contents)을 C57BL/6 마우스에 주사하였다. 구체적으로, 맹장 내용물을 얻기 위해 이산화탄소를 이용하여 마우스를 희생시킨 후, 맹장절제술(cecectomy)을 수행하였다. 맹장(cecum)은 무균 술기를 사용하여 정중선 복부 절개를 통해 회맹판(ileo-cecal valve) 바로 아래에서 적출하였다. 수득한 맹장 내용물은 면봉으로 페트리 접시에 압출시켰다. 맹장 내용물을 칭량한 후, 적절한 부피의 PBS를 접시에 첨가하여 최종 농도 30 또는 40mg/mL가 되도록 하였고, 연삭 유리를 사용하여 맹장 내용물을 다져주었다. 상기 내용물을 부드럽게 주입하기 위해 100-μm 세포 스트레이너(strainer)에 통과시켰다. 이어서, 마우스에 1mL의 균질화된 맹장 내용물을 복강내 주사하였다. IOX1은 30분 전에 20mg/kg의 투여량으로 동일하게 복강 내 투여하였다. IOX1 및/또는 맹장 내용물(40mg/kg)이 주입된 마우스를 48시간 동안 관찰하여 생존율을 측정하였다. 혈중 염증성 사이토카인의 수준 측정을 위해, 맹장 내용물(30mg/마우스)을 주입하고 30분이 경과한 뒤 혈청을 수확하여 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 수준을 샌드위치 ELISA 키트로 측정하였다. 혈청 AST, ALT, BUN 및 크레아티닌의 수준은 실험실 의학 시스템(laboratory medicine system)에 의해 측정되었다.

그 결과 도 16a 내지 16c에 나타난 바와 같이, 맹장 내용물을 주사한 그룹의 경우 20시간 이내 생존율이 0%로 나타난 반면, IOX1을 주사한 그룹의 경우에는 생존율이 60%로 크게 증가하였다(도 16a). 또한, CCI 패혈증 마우스 모델의 혈청을 분석한 결과 염증성 사이토카인의 수치 및 AST, AL, BUN, 크레아틴의 수준이 크게 증가하였는데, IOX1의 전처리에 의해 이러한 증가가 유의하게 감소되었음을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 종합하면, IOX1은 그람양성균 및 음성균의 복합균에 대하여도 항패혈증 효과가 있음을 증명한 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명에 따른 IOX1을 유효성분으로 포함하는 항생제, 항염증제 및 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 병원체의 생장 저해 및 숙주 면역체계의 방어기전에 관여하여 보다 강력한 항생, 항염증 및 항패혈증 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 기존의 항생제들에 대한 내성균 감염증의 치료가 가능하다는 점에서 산업적 이용 가치가 클 것으로 예상된다.

Claims (23)

1. IOX1(8-hydroxyquinoline-5-carboxylic acid)을 유효성분으로 포함하는 항생제.
2. 제1항에 있어서,

   상기 IOX1은 박테리아의 DNA 자이레이즈 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항생제.
3. 제1항에 있어서,

   상기 IOX1은 그람양성(gram-positive) 박테리아 또는 그람음성(gram-negative) 박테리아의 생장을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항생제.
4. 제1항에 있어서,

   상기 IOX1은 항생제 내성 박테리아의 생장을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항생제.
5. 제4항에 있어서,

   상기 박테리아는 카바페넴(Carbapenem)계 항생제, 퀴놀론(Quinolone)계 항생제, 및 콜리스틴(colistin) 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제에 대한 내성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 항생제.
6. IOX1을 유효성분으로 포함하는 항염증제.
7. 제6항에 있어서,

   상기 IOX1은 박테리아에 의한 염증반응의 과활성화를 억제하는 것인, 항염증제.
8. 제7항에 있어서,

   상기 염증반응의 과활성화를 억제하는 것은 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것인, 항염증제.
9. 제7항 있어서,

   상기 박테리아는 그람양성 박테리아 또는 그람음성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 항염증제.
10. 제7항에 있어서,

    상기 박테리아는 항생제 내성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 항염증제.
11. 제7항에 있어서,

    상기 박테리아는 카바페넴계 항생제, 퀴놀론계 항생제, 및 콜리스틴 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제에 대한 내성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 항염증제.
12. IOX1을 유효성분으로 포함하는, 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
13. 제12항에 있어서,

    상기 IOX1은 박테리아의 DNA 자이레이즈 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
14. 제12항에 있어서,

    상기 IOX1은 패혈증에 의한 장기 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는, 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
15. 제12항에 있어서,

    상기 패혈증의 유발원은 그람양성 박테리아 또는 그람음성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
16. 제13항에 있어서,

    상기 박테리아는 항생제 내성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
17. 제16항에 있어서,

    상기 항생제 내성 박테리아는 카바페넴계 항생제, 퀴놀론계 항생제, 및 콜리스틴 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제에 대한 내성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
18. IOX1(8-hydroxyquinoline-5-carboxylic acid)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 세균 억제 또는 염증 억제 방법.
19. IOX1의 세균 억제 또는 염증 억제 용도.
20. IOX1의 세균 억제 또는 염증 억제에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도.
21. IOX1을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 패혈증의 예방 또는 치료 방법.
22. IOX1의, 패혈증의 예방 또는 치료 용도.
23. IOX1의 패혈증에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도.

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