WO2020204108A1 - クロスフローろ過装置 - Google Patents

クロスフローろ過装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2020204108A1
WO2020204108A1 PCT/JP2020/015114 JP2020015114W WO2020204108A1 WO 2020204108 A1 WO2020204108 A1 WO 2020204108A1 JP 2020015114 W JP2020015114 W JP 2020015114W WO 2020204108 A1 WO2020204108 A1 WO 2020204108A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
flow path
substrate
cross
fine particles
region
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/015114
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真澄 山田
実 関
貴智 大内
優里香 櫻井
丈流 佐藤
Original Assignee
国立大学法人千葉大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人千葉大学 filed Critical 国立大学法人千葉大学
Priority to JP2021512194A priority Critical patent/JP7417294B2/ja
Publication of WO2020204108A1 publication Critical patent/WO2020204108A1/ja

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03B—SEPARATING SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS
    • B03B5/00—Washing granular, powdered or lumpy materials; Wet separating
    • B03B5/48—Washing granular, powdered or lumpy materials; Wet separating by mechanical classifiers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B07—SEPARATING SOLIDS FROM SOLIDS; SORTING
    • B07B—SEPARATING SOLIDS FROM SOLIDS BY SIEVING, SCREENING, SIFTING OR BY USING GAS CURRENTS; SEPARATING BY OTHER DRY METHODS APPLICABLE TO BULK MATERIAL, e.g. LOOSE ARTICLES FIT TO BE HANDLED LIKE BULK MATERIAL
    • B07B1/00—Sieving, screening, sifting, or sorting solid materials using networks, gratings, grids, or the like
    • B07B1/04—Stationary flat screens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C12M1/32—Inoculator or sampler multiple field or continuous type
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a cross-flow filtration device suitable for separating and purifying fine particles such as cultured cells, blood components, organelles, microorganisms, various synthetic fine particles, environmental fine particles, liposomes, and vesicles.
  • stem cells represented by iPS cells it is indispensable in regenerative medicine and drug evaluation model development to select only cells in a specific differentiated state.
  • monocytes and various mesenchymal stem cells present in the blood are useful in nerve regenerative medicine, cancer immunotherapy, peripheral blood vessel regeneration, etc., so these specific cells can be efficiently used. Separation and purification techniques are important.
  • Centrifugation and sedimentation separation are general-purpose methods because they enable the separation of a relatively large amount of particles by a simple method.
  • a long-time and multi-step separation operation may be required.
  • biomedical particles such as cells are separated for the purpose of medical diagnosis by ordinary batch-type centrifugation
  • a complicated and time-consuming separation operation is required by an inspection engineer with specialized skills.
  • the accuracy of separation depends on the skill of the operator.
  • JP2006-000848A shows a biopharmaceutical purification system in which multi-stage separation units are linked.
  • Such a system and a general syringe-mounted filter system have the advantages of being easy to operate, disposable, and have a high processing amount.
  • it is difficult to recover a large-sized component that has not passed through the filter, and it is extremely disadvantageous for separating and purifying large-sized cells present in blood, for example.
  • JP2005-205387A shows an example of a fine particle separation method using a microfluidic device.
  • the particle suspension and the sheath liquid are introduced into the flow path structure having branches, the particles are pressed against the narrow flow path portion, and then the flow path width is increased to increase the direction of the force exerted by the flow on the particles.
  • the particles are separated according to their size by taking advantage of the fact that they are different. In this method, precise separation is possible with a simple method, and the device itself can be made disposable. It is also possible to separate a group of particles to be separated into large particles and small particles and collect them separately.
  • the processing amount is not sufficient and the processing amount of the fine particle suspension is about several microliters per minute when separating an object having a diameter of several micrometers. Further, it is necessary to use a thin flow path structure having a diameter of several times to 10 times the fine particle diameter, and there is also a problem that a problem of clogging is likely to occur.
  • JP6403190B shows a method for separating fine particles using a microchannel based on a principle different from that of JP2005-205387A.
  • a main flow path having an inclination and a branch flow path arranged side by side so as to intersect the main flow path are combined to form a grid-like flow path structure, and fine particles are separated according to size.
  • JP2005-205387A method it has the effects of improving the amount of processing and reducing the effects of clogging, but it also has the problem of not achieving the separation of fine particles of submicrometer size. There is also a problem that the operation becomes complicated because it is necessary to introduce a solution containing no particles.
  • JP2018-0233926A shows an example of a cross-flow filtration system.
  • various cross-flow filtration systems including separation devices for artificial dialysis have been developed.
  • Cross-flow filtration systems generally allow for precise separation compared to normal filtration, can reduce the effects of clogging, and often achieve even higher throughputs.
  • a disposable system is not envisioned, and in many cases, bioparticles such as cells are not envisioned to be purified and recovered as a separation target.
  • a cross-flow filtration separation method that is applicable to medical diagnosis and assumes precise separation of cells and biological particles has hardly been put into practical use so far.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and the object thereof is “by simple operation”, “with high accuracy”, and “at least 0. Achieves a separation processing amount of about 1 mL or more ”,“ Can collect objects larger than a certain size ”,“ Less susceptible to clogging ”,“ Applicable to objects of submicrometer to several tens of micrometers There is, “it seeks to provide a new separation device for bioparticles. Furthermore, it is intended to provide an apparatus in which the apparatus itself is configured to be “relatively simple and inexpensive to manufacture” and “to be a disposable system”.
  • the invention according to one aspect of the present invention for achieving the above object is configured by joining a flat plate-shaped substrate A and a substrate B, respectively, and the substrate A is formed with pores communicating with each other.
  • the region C is partially provided, and the region C is at least partially in contact with the joint surface S between the substrate A and the substrate B, and at least partially in contact with the region C at the joint surface S, and at least partially.
  • the introduction flow path E and the recovery flow path F that exist in the same plane are formed, and the introduction flow path E and the recovery flow path F are arranged so as not to come into direct contact with each other.
  • the recovery flow path F has at least one outlet K capable of discharging the liquid and is in contact with the substrate B.
  • a cross-flow filtration device that performs filtration in region C. By doing so, when the fine particle suspension is continuously or instantaneously introduced from the inlet I, small fine particles that can pass through the porous region C are introduced from the introduction flow path E to the recovery flow path F. Large fine particles that are separated and recovered from the outlet K but cannot pass through the region C pass through the introduction flow path E as they are and are recovered from the outlet J, so that they can be separated by a simple operation. Further, since the introduction flow path E and the recovery flow path F can be formed on the same plane, the device itself can be manufactured relatively easily and at low cost.
  • the substrate A has a region D in which pores communicating with each other are not formed and is at least partially in contact with the joint surface S. It is desirable that the introduction flow path E includes a flow path portion G that is in contact with the joint surface S and exists in a region D that exists between the region C and the outlet J. By doing so, flow resistance is generated in the flow path portion G connected to the outlet J, so that the liquid can be more efficiently led out to the recovery flow path F, and more efficient separation can be performed. it can.
  • the introduction flow path E and the recovery flow path F may be arranged in a spiral shape parallel to each other at least partially.
  • the introduction flow path E and the recovery flow path F can be arranged at a relatively high density, and the device itself can be made compact, so that the cost of manufacturing the device can be reduced and the introduction flow can be reduced.
  • By controlling the distance between the path E and the recovery flow path F it is possible to perform more accurate separation.
  • the introduction flow path E may include at least two inlets I and I'in which the liquid can be introduced, although not limited to the present invention.
  • the value of the diameter, width, or depth of the introduction flow path E is at least partially 500 micrometers or less, although it is not limited. By doing so, it is possible to separate small fine particles of about submicrometer to several tens of micrometers.
  • the distance between the introduction flow path E and the recovery flow path F is preferably 200 micrometers or more even in the shortest portion, although it is not limited. By doing so, more efficient separation can be performed even with a short flow path structure, the processing amount can be improved, and small fine particles of about submicrometer to several tens of micrometers can be targeted. It becomes possible to efficiently perform the separation.
  • fine particles that are soluble in water are mixed with the rubber-like resin material before or in the molten state thereof, and the above-mentioned It may be formed by dissolving the fine particles after polymerizing or solidifying the resin material.
  • the region C can be dissolved in the rubber-like resin material in an organic solvent that does not dissolve the resin material before or in the molten state thereof, although not limited to the present invention. It may be formed by mixing the fine particles, polymerizing or solidifying the resin material, and then dissolving the fine particles. By doing so, the production cost of the apparatus itself can be reduced, and particles made of, for example, polymethylmethacrylate (PMMA) or polystyrene (PS) are used as fine particles soluble in an organic solvent, and the particles are used. By controlling the diameter and shape, it is possible to perform more precise, high processing amount, and high precision separation.
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • PS polystyrene
  • the present invention is configured as described above, it is easy and reproducible to cross by simply joining a porous substrate and a non-porous substrate having a flow path structure formed on one of them. It becomes possible to manufacture a flow filtration device. Therefore, it can be widely used as a disposable general-purpose fine particle separating device.
  • the present invention is configured as described above, “by a simple operation”, “with high accuracy”, “a separation processing amount of at least about 0.1 mL per minute can be achieved”, and “constant”. It is possible to provide a new separation device for fine particles, which can collect objects larger than the size, is less susceptible to clogging, and can be applied to objects of submicrometer to several tens of micrometers. It becomes.
  • FIG. 5 is a schematic view showing an example of a cross-flow filtration device according to an embodiment, and is a cross-sectional view taken along the line XX'in FIGS. 1a and 1b of the cross-flow filtration device formed by joining the substrate A and the substrate B. is there.
  • FIG. 5 is a schematic view showing an example of a cross-flow filtration device having a flow path structure similar to that of the cross-flow filtration device shown in FIGS. 1a to 1c according to the embodiment, and the entire substrate A is a region.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view taken along the line XX'in FIG.
  • FIG. 5 is a schematic view showing an example of a cross-flow filtration device having a flow path structure similar to that of the cross-flow filtration device shown in FIGS. 1a to 1c according to the embodiment, and is present on the lower surface of the substrate A.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view taken along the line XX'in FIG. 2a of a cross-flow filtration device having a flow path structure formed in a region C.
  • FIG. 5 is a schematic view showing an example of a cross-flow filtration device having a flow path structure similar to that of the cross-flow filtration device shown in FIGS.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view taken along the line XX'in FIG. 2a of a cross-flow filtration device configured by C and having a flow path structure formed on the lower surface of the substrate A.
  • It is a schematic diagram which shows typically the flow path structure formed in the joint surface S in the cross-flow filtration apparatus which concerns on embodiment, and has one linear introduction flow path E and one linear recovery flow path F. Shows a cross-flow filtration device.
  • It is a schematic diagram which shows typically the flow path structure formed on the joint surface S in the cross-flow filtration apparatus which concerns on embodiment, and is one linear introduction flow path E and two linear recovery flow paths.
  • a cross-flow filtration device having F is shown.
  • FIG. 5 is a schematic view schematically showing a flow path structure formed on a joint surface S in the cross-flow filtration device according to the embodiment, and is a schematic view showing one introduction flow path E having a flow path portion G and two linear flow paths E.
  • a cross-flow filtration device having a recovery flow path F is shown. It is a schematic diagram which showed the flow path structure formed on the upper surface of the substrate A about the cross flow filtration apparatus which was arranged in a spiral shape which paralleled the introduction flow path E and the recovery flow path F which concerns on embodiment, and is circular.
  • the upper surface of the substrate A in the cross-flow filtration apparatus having a flow path structure arranged in a spiral shape is shown.
  • FIG. 6 is a schematic view showing a flow path structure formed on the upper surface of the substrate A of a cross-flow filtration device in which the introduction flow path E and the recovery flow path F are arranged in a spiral shape parallel to each other according to the embodiment, and is rectangular.
  • the upper surface of the substrate A in the cross-flow filtration apparatus having a flow path structure arranged in a spiral shape is shown.
  • FIG. 5 is a schematic view of a cross-flow filtration device having an introduction flow path E having two inlets I and I'according to the embodiment, showing the upper surface of the substrate A.
  • FIG. 5 is a schematic view of a cross-flow filtration device having an introduction flow path E having two inlets I and I'according to the embodiment, showing the lower surface of a substrate B on which the introduction flow path E and the recovery flow path F are formed.
  • It is the schematic which showed the form of the cross-flow filtration apparatus used for separating fine particles of several micrometers in diameter in an Example, and is the Z arrow view of FIG. 6c of the upper surface of substrate A.
  • FIG. 6c of the lower surface of a substrate B.
  • FIG. 6a is a schematic view showing a form of a cross-flow filtration device used for separating fine particles having a diameter of several micrometers in an embodiment, and is a diagram 6a of a cross-flow filtration device formed by joining a substrate A and a substrate B. And is a cross-sectional view taken along the line XX'in FIG. 6b.
  • FIG. 5 is a schematic view showing a form of a cross-flow filtration device used for separating fine particles having a diameter of several micrometers in an embodiment, and is an enlarged view of a region d in FIG. 6b.
  • FIG. 5 is a schematic view showing a form of a cross-flow filtration device used for separating fine particles having a diameter of several micrometers in an embodiment, and is an enlarged view of a region e in FIG. 6b.
  • it is a scanning electron microscope image of a porous region C formed by using a silicone resin and sodium chloride fine particles, and sodium chloride fine particles having a particle diameter of 30-60 micrometers and a particle diameter of 90-140 micrometers are used. It is a scanning electron microscope image of the cross section of the region C formed by the above.
  • it is a scanning electron microscope image of a porous region C formed by using a silicone resin and sodium chloride fine particles, and sodium chloride fine particles having a particle diameter of 30-60 micrometers and a particle diameter of 90-140 micrometers are used. It is a scanning electron microscope image of the cross section of the region C formed by the above. In the example, it is a scanning electron microscope image of a porous region C formed by using a silicone resin and sodium chloride fine particles, and is the surface of the surface of region C formed by using sodium chloride fine particles of a particle diameter of 30-60 micrometers. It is a scanning electron microscope image.
  • FIG. 9d is a schematic view showing another form of a cross-flow filtration device composed of three substrates used for separating fine particles having a diameter of several micrometers in an embodiment, and is a diagram 9d of the lower surface of the substrate located at the uppermost portion.
  • FIG. 9d It is a Z arrow view in. It is the schematic which showed the other form of the cross-flow filtration apparatus which consisted of three substrates used for separating fine particles of several micrometers in diameter in an Example, and is the Z arrow view in FIG. 9d of the lower surface of substrate A. It is a figure. It is the schematic which showed the other form of the cross-flow filtration apparatus which consisted of three substrates used for separating fine particles of several micrometers in diameter in an Example, and is the Z arrow view in FIG. 9d of the upper surface of substrate B. It is a figure. FIG.
  • FIG. 5 is a schematic view showing another form of a cross-flow filtration device composed of three substrates used for separating fine particles having a diameter of several micrometers in an embodiment, and is a substrate located at the top, substrate A, and the like.
  • 9A, 9b, and 9c are cross-sectional views taken along the line XX'of a cross-flow filtration device formed by joining the substrate B and the substrate B.
  • it is a graph which showed the fine particle separation behavior using the cross-flow filtration apparatus shown in FIG. 9, and in the cross-flow filtration apparatus which has the region C formed by using the sodium chloride fine particle of 30-60 micrometers in diameter.
  • FIG. 1a to 1c show schematic views showing an example of a cross-flow filtration device
  • FIG. 1a is a view taken along the line Z in FIG. 1c on the upper surface of the substrate A
  • FIG. 1b is a view on the lower surface of the substrate B. It is a Z arrow view in 1c
  • FIG. 1c is a cross-sectional view taken along the line XX'in FIGS. 1a and 1b of a cross-flow filtration device formed by joining a substrate A and a substrate B.
  • the substrate A is composed of a porous region C having communication holes and a non-porous region D. Further, the region C is formed so as to be exposed on the upper surface of the substrate A, and this surface corresponds to the joint surface S.
  • the substrates A and B shown in FIGS. 1a to 1c are physically fixed using a jig or adhesive tape, chemically directly bonded with an oxygen plasma, UV ozone, a silane coupling agent, or the like, or applied with an adhesive. It can be bonded by using a method such as bonding, thermocompression bonding, anode bonding, or any combination thereof.
  • the cross section of the introduction flow path E and the recovery flow path F is a rectangle having a uniform width.
  • the shape other than the rectangle may be a flow path structure having various cross-sectional shapes such as a polygon other than a quadrangle, a trapezoid, a semicircle, and a circle.
  • the flow path structure having a rectangular shape is suitable in the sense that it is easy to manufacture and it is easy to strictly control the interval between the flow paths.
  • two collection flow paths F are formed at equal intervals so as to sandwich the introduction flow path E, and each has an outlet K, so that a total of two collection flow paths F are formed. There is an exit K.
  • the introduction flow path E is arranged so as to partially contact the region C having the communicating pores, and the flow path portion G in the introduction flow path E is arranged so as to contact the non-porous region D. ing.
  • the diameter, width, or depth of the introduction flow path E may be any value as long as it can separate fine particles having a diameter of about several micrometers or less. However, from the viewpoint of performing precise separation, these values are preferably at least partially 500 micrometers or less, and particularly 200 micrometers or less in the case of a flow path structure having a rectangular cross section. Is more preferable.
  • the introduction flow path E and the recovery flow path F are independent and exist without contact with each other. It is necessary to do. In this case, the introduction flow path E and the recovery flow path F are indirectly connected by the communication holes existing in the region C.
  • the distance between the introduction flow path E and the recovery flow path F can be any value as long as the fine particles to be separated can be separated.
  • the value is preferably 200 micrometers or more even at the smallest value.
  • the introduction flow path E and the recovery flow path F may be configured by a micro flow path structure produced by using microfabrication technology. By doing so, it is possible to use a flow path structure in which the size and shape are arbitrarily and accurately controlled, so that the behavior and efficiency of fine particle separation can be arbitrarily controlled.
  • microfabrication technologies include injection molding, replica molding, direct machining by cutting, laser processing, direct electron beam drawing, three-dimensional modeling, three-dimensional stereolithography, wet etching, dry etching, embossing, and printing. Various methods such as can be used.
  • various materials can be used as the base material constituting the substrate B shown in FIGS. 1a to 1c.
  • silicone resins such as PDMS (polydimethylsiloxane), thermoplastic elastomers, various polymer materials such as acrylic, ceramics materials including glass, various metal materials such as stainless steel, etc. can be applied, and these It is also possible to use any plurality of types of substrates among the materials in combination.
  • the substrate B may be formed of a porous material.
  • the pores are formed in the substrate B, the effect is limited, so that the pores are not necessarily formed by the porous material.
  • the material of the substrate A a wide variety of materials similar to the substrate B can be used.
  • the area C and the area D may be made of different materials, or may be made of the same material.
  • the materials constituting the substrate A and the substrate B may be the same, partially different, or different as a whole.
  • the region C may have any shape and size as long as the introduction flow path E and the recovery flow path F can be efficiently contacted.
  • the flat plates are formed at least partially in a plane. Further, by making the region C surrounded by the region D except for the portion in contact with the joint surface S, the solution introduced from the inlet I can be made to flow out only from the outlet K and the outlet J. It is preferable to do so.
  • the porous region C In the production of the porous region C, soluble fine particles are mixed with the rubber-like resin material before or in the molten state thereof, and after the resin material is polymerized or solidified, the fine particles are dissolved. It is also possible to use the method. By doing so, the matrix of the region C having the communicating pores can be produced inexpensively, easily, and with good reproducibility. Silicone resin and thermoplastic elastomer are suitable as the rubber-like resin material.
  • the volume ratio of the fine particles mixed in the resin material may be any value as long as the pores that communicate with each other can be formed, but it is generally preferably in the range of 30 to 60%.
  • the substrate A and the substrate B are formed of a silicone resin, there is an advantage that they can be easily and firmly bonded by chemically activating them with oxygen plasma or the like, and thus these substrates. It is preferable to use a silicone resin as the material of.
  • Various fine particles that can be dissolved in water or an organic solvent can be used to form communication holes in region C.
  • any particles such as sodium chloride particles, potassium chloride particles, phosphate particles, sucrose particles, and glucose particles may be used.
  • various fine particles such as polymethylmethacrylate particles and polystyrene particles can be used.
  • the size of the fine particles to be dissolved is assumed to be in the range of about 0.1 micrometer to 1 millimeter in terms of average diameter, but in separating objects of submicrometer to several micrometers, it is necessary to separate them.
  • fine particles of about 10 micrometers to 500 micrometers. By using such fine particles, it is possible to form a communication hole having a size corresponding to the diameter thereof.
  • fine particles that can be dissolved in an organic solvent it is preferable to select an organic solvent that does not dissolve the region C, or to form the region C using a material that is insoluble in the organic solvent.
  • the thickness thereof may be any value as long as the purpose of separation is achieved. However, if the thickness is thinner than the diameter of the fine particles to be dissolved, it is difficult to form communication holes. Therefore, it is preferable to have a thickness of about three times the diameter of the fine particles to be dissolved. Generally, it is preferably in the range of about 0.1 to 5 mm.
  • FIGS. 2a to 2d show schematic views showing examples of three types of cross-flow filtration devices having a flow path structure similar to that of the cross-flow filtration devices shown in FIGS. 1a to 1c.
  • 2a is a diagram showing a flow path structure common to FIGS. 2b, 2c, and 2d, and is a Z arrow view in FIGS. 2b, 2c, and 2d.
  • FIG. 2b shows a cross-flow filtration device in which the entire substrate A is composed of a region C and a flow path structure is formed on the lower surface of the substrate B.
  • FIG. 2c shows a flow path structure in a region C existing on the lower surface of the substrate A.
  • 2d shows the cross-flow filtration device in which the entire substrate A is composed of the region C and the flow path structure is formed on the lower surface of the substrate A.
  • 'It is a cross-sectional view on the line.
  • various patterns can be assumed as the positional relationship between the substrate A including the region C, the substrate B, and the flow path structure.
  • the introduction flow path E and the recovery flow path F may be formed on the substrate A side, may be formed on the substrate B side, or may be formed on both the substrate A and the substrate B.
  • the substrate A may not have a region D and may be composed of a region C, or at least a part of the substrate B may be formed of a porous material.
  • FIG. 3a to 3c show schematic views schematically showing the flow path structure formed on the joint surface S in the three types of cross-flow filtration devices, and FIG. 3a shows a linear introduction flow path E.
  • FIG. 3a shows a linear introduction flow path E.
  • FIG. 3b shows a cross-flow filtration device having one straight introduction flow path E and two linear recovery flow paths F.
  • Reference numeral 3c indicates a cross-flow filtration device having one introduction flow path E having a flow path portion G and two linear recovery flow paths F, respectively.
  • various patterns can be assumed as the structures of the introduction flow path E and the recovery flow path F.
  • introduction flow paths E and recovery flow paths F there are a plurality of introduction flow paths E and recovery flow paths F. It doesn't matter if it exists.
  • the collection flow paths F exist on both sides of the introduction flow path E, those flow paths do not necessarily have to be arranged at equal intervals, but the recovery flow paths are located at the same positions on both sides of the introduction flow path E.
  • the presence of F is preferable from the viewpoint that the accuracy of separation can be easily controlled.
  • the flow path portion G may or may not be formed. However, since the resistance of the flow to the outlet J increases due to the presence of the flow path portion G, the relative flow rate to the outlet K can be increased, and more efficient separation becomes possible. .. Therefore, it may be preferable that the flow path portion G is formed. By appropriately adjusting the length, width, and depth of the flow path portion, it is possible to control the behavior of fine particle separation.
  • FIGS. 4a to 4d two types of cross-flow filtration devices in which the introduction flow path E and the recovery flow path F are arranged in a spiral shape parallel to each other are formed on the upper surface of the substrate A and the lower surface of the substrate B, respectively.
  • a schematic diagram showing the flow path structure is shown
  • FIG. 4a shows the upper surface of the substrate A in a cross-flow filtration device having a flow path structure arranged in a circular spiral shape
  • FIG. 4b shows a circular spiral.
  • the lower surface of the substrate B in the cross-flow filtration device having the flow path structure arranged in a shape is shown
  • FIG. 4c shows the upper surface of the substrate A in the cross-flow filtration device having the flow path structure arranged in a rectangular spiral shape.
  • FIG. 4d shows the lower surface of the substrate B in a cross-flow filtration apparatus having a flow path structure arranged in a rectangular spiral shape.
  • the flow path structure can be arranged in a limited space with high density and compactness, so that the device itself can be miniaturized, which is preferable.
  • the wording "spiral shape" in this case can take various forms such as a rectangle and a polygon as well as a circle.
  • the flow path structure in a circular or rectangular spiral shape, the flow path can be designed more smoothly.
  • the spiral arrangement may be such that the inlet I exists on the outside and the outlet J and the outlet K exist on the center side.
  • Various means can be used when continuously introducing a suspension of fine particles.
  • the simplest method is to connect a syringe or the like to the inlet I and pressurize manually or with a pump to continuously introduce a suspension of fine particles, but there are many other types of pumps. You can also use the system. Further, the suspension of fine particles may be continuously introduced into the flow path by sucking the solution from the outlet J and the outlet K.
  • the fine particles to be separated various synthetic fine particles, cultured cells, cells or biological particles existing in blood, environmental fine particles, liposomes, vesicles, etc. are assumed.
  • the solution it is preferable to use a solution capable of stably dispersing these fine particles, and particularly when separating cells or biological particles, it is preferable to use an aqueous solution having a buffering action.
  • the size of the pores formed in the region C is small, the distance between the introduction flow path E and the recovery flow path F is long, the depth value of the introduction flow path E is small, and the flow rate distributed to the outlet J.
  • FIG. 5a and 5b show a schematic view of a cross-flow filtration device forming an introduction channel E with two inlets I and I'
  • FIG. 5a shows the top surface of substrate A
  • FIG. 5b shows the lower surface of the substrate B on which the introduction flow path E and the recovery flow path F are formed.
  • Only one inlet is provided by continuously introducing a fine particle suspension from the inlet I and a solution containing no fine particles from the inlet I'to the introduction flow path E shown in FIGS. 5a and 5b.
  • Higher precision separation is achieved as compared to the introduction channel E.
  • the high accuracy here means that the proportion of small fine particles mixed in the solution recovered from the outlet J is reduced.
  • FIG. 6a to 6e are schematic views showing a form of a cross-flow filtration device used for separating fine particles having a diameter of several micrometers
  • FIG. 6a is a view taken along the line Z in FIG. 6c on the upper surface of the substrate A.
  • FIG. 6b is a view taken along the line Z in FIG. 6c on the lower surface of the substrate B
  • FIG. 6c is a cross-flow filtration device formed by joining the substrate A and the substrate B along the lines XX 6a and 6b.
  • 6d and 6e are enlarged views of the region d and the region e in FIG. 6b, respectively.
  • a mold made of negative photoresist is prepared by soft lithography, and PDMS (polydimethylsiloxane) prepolymer, which is a kind of silicone resin, is used for the mold.
  • PDMS polydimethylsiloxane prepolymer
  • the inlet I, the outlet J, and the outlet K are formed by punching holes.
  • the thickness of the substrate B was about 3 mm.
  • sodium chloride fine particles were mixed with PDMS at a volume ratio of 50%, cast into a flat plate and polymerized, and then PDMS containing no sodium chloride fine particles was cast around the PDMS. It was produced by dissolving the sodium chloride fine particles by immersing the formed base material in distilled water to form fine pores communicating with the portion corresponding to the region C.
  • the sodium chloride fine particles those having a particle diameter in the range of 30-60 micrometers and those having a particle diameter in the range of 90-140 micrometers were used.
  • the thickness of the region C was about 1 mm, and the thickness of the entire substrate A was about 2 mm.
  • the cross-flow filtration system shown in FIGS. 6a to 6e was formed by activating and joining these substrates A and B by oxygen plasma treatment.
  • both the introduction flow path E and the recovery flow path F have a depth of about 60 micrometers, and the introduction flow path E other than the flow path portion G and the introduction flow flow.
  • the widths of the flow path portion G and the recovery flow path F in the road E were 100 micrometers, 50 micrometers, and 200 micrometers, respectively.
  • the introduction flow path E and the recovery flow path F were arranged in a rectangular spiral shape, and the distance between these flow paths was 350 micrometers.
  • the length of the introduction flow path E other than the flow path portion G was 10 cm, and the length of the flow path portion G was 10 or 30 cm.
  • the flow path portion G is also arranged so as to be compactly folded into a spiral shape.
  • FIGS. 7a-7c show scanning electron microscopic images of the porous region C formed using PDMS and sodium chloride microparticles, with FIGS. 7a and 7b each having a particle size of 30-60 micrometers. It is a scanning electron microscope image of the cross section of the region C formed by using the sodium chloride fine particles of 90-140 micrometers, and FIG. 7c shows the region C formed by using the sodium chloride fine particles of 30-60 micrometers. It is a scanning electron microscope image of the surface of.
  • pores are formed by dissolving the sodium chloride fine particles, and the pores are partially in contact with each other.
  • the formation of communication holes was observed. Further, it was observed that a large number of micropores were formed on the surface of the porous region C.
  • FIG. 8a and 8b show scanning electron microscope images of the porous region C formed using silicone resin and polymethylmethacrylate fine particles having an average diameter of about 5 micrometer, respectively. It is a scanning electron microscope image of the cross section of C, and FIG. 8b is a scanning electron microscope image of the surface of region C.
  • FIGS. 9a-9d show schematic views showing another form of a three-board cross-flow filtration device used to separate fine particles of several micrometer diameter
  • FIG. 9a. 9D is a Z-arrow view of the lower surface of the substrate located at the uppermost portion
  • FIG. 9b is a Z-arrow view of the lower surface of the substrate A in FIG. 9d
  • FIG. 9c is a Z-arrow view of the upper surface of the substrate B in FIG. 9d
  • 9d is a cross-sectional view taken along the line XX'in FIGS. 9a, 9b, and 9c of a cross-flow filtration device formed by joining a substrate, a substrate A, and a substrate B located at the uppermost portion.
  • the cross-flow filtration device shown in FIGS. 9a to 9d is manufactured in the same manner as the cross-flow filtration device shown in FIGS. 6a to 6e.
  • the flow path structure in the cross-flow filtration device shown in FIGS. 9a to 9d is formed by joining three substrates, and the number of introduction flow paths E existing on the lower surface of the substrate A is eight in the middle. It is branched, and the branch finally merges on the lower surface of the substrate located at the uppermost portion and is connected to the outlet J-1 or the outlet J-2. Further, on the lower surface of the substrate A, recovery channels are formed on both sides of each of the eight branching introduction channels, and they merge on the lower surface of the substrate A, pass through the channel portion G, and exit K-. It is connected to 1 or K-2.
  • the width of the introduction flow path branched on the lower surface of the substrate A was 100 micrometers, the width of the recovery flow path was 200 micrometers, and their depths were about 50 micrometers.
  • FIG. 10 is a graph showing the fine particle separation behavior using the cross-flow filtration device shown in FIGS. 9a to 9d, and shows a cross-flow having a region C formed by using sodium chloride fine particles having a diameter of 30-60 micrometers.
  • a suspension containing standard polystyrene fine particles having an average diameter of 0.29 to 3.2 micrometers was introduced into the filtration device from the inlet I with the outlet J-2 and the outlet K-2 closed, and the outlet J- It is a graph which showed the number ratio of each fine particle contained in 1 and the solution recovered from outlet K-1.
  • the number of each fine particle collected from each outlet is calculated by "fine particle concentration" x "volume of liquid" in the recovered liquid, and the total of the particles collected from the two outlets is displayed as 100%. Is what you are doing.
  • the cross-flow filtration device in the present invention was used. It was suggested that hydraulic actions, including flow distribution, as well as the physical pore size of the communication holes, determine the size of the particles to be separated. This suggests that the cross-flow filtration device in the present invention is a separation device that is not easily affected by clogging.
  • the present invention is configured as described above, “by a simple operation of introducing a fine particle suspension”, “with high accuracy”, and “separation of at least about 0.1 mL / min or more”. Achieves the amount of processing, “can collect objects larger than a certain size”, “is less susceptible to clogging”, “can be applied to objects as small as submicrometers", continuous separator It is extremely useful as. Therefore, various industrial applications such as preparation of various synthetic fine particles, removal of fine particle impurities in biprocess such as antibody production, separation of various cells, pretreatment of body fluid samples such as blood for disease diagnosis, etc. Be expected.
  • the present invention since the present invention is configured as described above, it exhibits excellent effects such as "a separation device or system can be manufactured relatively easily and at low cost” and "a disposable system can be made”. .. Therefore, it can be expected to be used as an inexpensive and general-purpose disposable filter device that can be used with the same usability as a syringe filter, and as a new device useful in various research and development fields such as biochemical research and environmental analysis.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
  • Filtering Materials (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)

Abstract

簡単な操作によって、高い精度で、少なくとも毎分０．１ｍＬ程度以上の分離処理量を達成でき、一定サイズよりも大きい対象も回収でき、目詰まりの影響をうけにくく、サブミクロン～数１０ミクロン程度の対象に適用可能でき、簡便かつ低コストに作製できる、微粒子分離装置を提供する。平板状の基板Ａおよび基板Ｂを接合することによって構成されており、基板Ａは内部に連通した細孔が形成された領域Ｃを備えており、領域Ｃは基板Ａと基板Ｂの接合面Ｓに対して少なくとも部分的に接しており、少なくとも部分的に接合面Ｓにおいて領域Ｃに接し、同一平面において互いに直接的に接触しないように配置されている導入流路Ｅおよび回収流路Ｆが形成されており、導入流路Ｅは液体を導入できる入口Ｉおよび液体を排出できる出口Ｊを有し、回収流路Ｆは液体を排出できる出口Ｋを有しており、基板Ｂに接した領域Ｃにおいてろ過を行うクロスフローろ過装置を開発する。

Description

クロスフローろ過装置
　本発明は、培養細胞、血液成分、オルガネラ、微生物、各種合成微粒子、環境微粒子、リポソーム、ベシクルなどの微粒子を分離精製する上で好適なクロスフローろ過装置に関する。
　ポリマーや無機材料からなる各種合成粒子、あるはリポソームなどやベシクルなどの微粒子は、精密機械工学、機能性材料、分離プロセス、薬剤送達などの分野において幅広く利用されている。クロマトグラフィー用分離担体、液晶スペーサーや電子ペーパー用微粒子、ドラッグデリバリー用キャリアなど、様々な種類の合成微粒子の調製において、特にそのサイズを均一にすることは不可欠である。そのため、微粒子の混合物中に存在する特定の微粒子を効率的に分離精製する技術は必須である。
　またたとえば、血液中に存在する特定の細胞や生体微粒子を分離精製し、それら微粒子の機能や存在割合を解析することによって、様々な疾患の診断が可能となる。たとえば、血液中に存在する循環がん細胞を定量評価することによって、がんの早期診断やがん治療法の効能の検証が可能となる。また、妊婦の血液中に存在する胎児由来有核赤血球を単離し解析することによって、染色体異常の確定診断が可能になる。さらに近年では、血液中に存在する直径５０～１０００ナノメートル程度の微小なベシクルやエクソソームを解析することによって、各種疾患の診断が可能になると期待されている。
　またたとえば、ｉＰＳ細胞に代表される幹細胞の分化において、特定の分化状態にある細胞のみを選抜することは、再生医療や薬剤評価モデル開発においても不可欠である。このほかにも、血液中に存在する単球や、各種間葉系幹細胞は、神経の再生医療、がん免疫療法、末梢血管の再生などにおいて有用であるため、それら特定の細胞を効率的に分離精製する技術は重要である。
　複雑な微粒子集団から、特定の性質（例としてサイズ）を有する微粒子を分離・選抜するための技術として、これまでに様々な手法が提案されてきた。たとえば、遠心分離、沈降分離、フィルトレーション、マイクロ流体デバイスによる分離手法、などが代表例として挙げられ、また細胞などの生体粒子の分離・選抜に特化した手法として、フローサイトメーターなどの技術も頻繁に用いられている。しかしながら、既存の方法には、「分離の精度」、「操作の簡単さ」、「分離装置やシステムのコスト」、「分離速度」などの観点で、一長一短があり、これらをすべて満たす技術は未だ発展の途上にある。また、通常のフィルトレーション技術のように、「一定サイズよりも小さい対象は回収できるが、大きい対象を回収できない」という課題を有するものもある。さらに、診断医療を目的として特定の細胞や生体粒子を分離する場合、サンプル間のコンタミネーションを防ぎ、また再現性を担保するためにも、分離装置自体が使い捨てにできることが望ましく、そのためには分離装置を簡便かつ効率的に作製できることが必要となる。加えて、マイクロ流体デバイスを用いた手法では一般的に、「目詰まりしやすい」という問題も避けがたい。さらにまた、「１００ナノメートル～１マイクロメートル程度の微小な対象も分離できる」手法であることも望ましい。以下、上記した既存の分離手法とその課題について、それぞれ概説する。
　遠心分離や沈降分離は、簡便な手法によって、比較的大量の粒子分離を可能とするため、汎用的に利用されている手法である。しかしながら、精度の高い分離を行うためには、長時間かつ多段階の分離操作が必要となる場合がある。特に、通常のバッチ式の遠心分離によって、医療診断を目的として細胞などの生体粒子を分離する場合、専門的なスキルを有する検査技師による、煩雑で時間のかかる分離操作が必要となる、といった欠点があり、さらにまた、分離の精度が操作者の技術に依存するという課題もある。
　フィルトレーションは、簡便な分離操作を実現できる方法である。一例として、ＪＰ２００６－０００８４８Ａには、多段階の分離ユニットを連結した、生物薬剤の精製システムが示されている。このようなシステムや、一般的なシリンジ装着型のフィルターシステムは、簡便な操作で、使い捨てでき、処理量も高い、という利点がある。しかしながら、フィルターを透過しなかったサイズの大きい成分を回収することは困難であり、たとえば、血液中に存在するサイズの大きな細胞を分離精製する上では極めて不利である。
　ＪＰ２００５－２０５３８７Ａには、マイクロ流体デバイスを用いた微粒子の分離手法の例が示されている。この手法では、分岐を有する流路構造に粒子懸濁液とシース液を導入し、細い流路部分において粒子を押し付け、その後、流路幅を大きくすることで、流れが粒子に与える力の方向が異なることを利用し、サイズによる粒子の分離を行う。この手法では、簡便な手法で精密な分離が可能であり、装置自体を使い捨てとすることもできる。また分離対象となる粒子群を大きなものと小さなものに分離し、別々に回収することもできる。しかしながら、処理量が十分でなく、直径数マイクロメートルの対象を分離する際に、微粒子懸濁液の処理量が毎分数マイクロリットル程度である、という欠点がある。また、微粒子径の数倍～１０倍程度の、細い流路構造を用いねばならず、目詰まりの問題が起きやすいという課題もある。
　ＪＰ６４０３１９０Ｂには、ＪＰ２００５－２０５３８７Ａとは異なる原理による、マイクロ流路を用いた微粒子の分離手法が示されている。この手法では、傾斜を有する主流路と、主流路と交差するように並設された枝流路を組み合わせ、格子状の流路構造を形成し、サイズによる微粒子の分離を行う。ＪＰ２００５－２０５３８７Ａの手法が持つ利点に加え、処理量の向上や、目詰まりの影響の軽減、などの効果があるが、やはりサブマイクロメートルサイズの微粒子分離を達成できていないという課題があり、さらに、粒子を含まない溶液の導入が必要であるため操作が煩雑になる、という課題もある。
　「ネイチャープロトコルズ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、２０１６（１１）、１３４－１４８．には、主に細胞を分離対象とした、螺旋状のマイクロ流路を用いた手法が示されている。この手法では、直径数１００マイクロメートルの構造を用いるため、目詰まりの問題が起こりにくく、また高い分離の処理量が達成される。さらに使い捨ての流路を用いて、簡便な操作によって分離できる、という利点もある。しかしながら、ＪＰ２００５－２０５３８７ＡおよびＪＰ６４０３１９０Ｂに示した手法と同様に、サブマイクロメートルサイズの微粒子分離に適用できない、という課題がある。
　さらに、連続的な濾過分離を可能とする、クロスフローろ過システムも広く利用されてきた。ＪＰ２０１８－０２３９２６Ａには、クロスフローろ過システムの一例を示している。この手法に限らず、人工透析用の分離装置なども含めた様々なクロスフローろ過システムが開発されてきた。クロスフローろ過システムは一般的に、通常のフィルトレーションと比較して精密な分離を可能とし、目詰まりの影響も低減でき、さらに高い処理量を達成できる場合が多い。しかしながら、使い捨てのシステムが想定されていない場合も多く、さらにまた、細胞などの生体粒子を分離対象として精製し回収することを想定していない場合が多い。特に、医療診断に適用可能な、細胞や生体粒子の精密な分離を想定したクロスフローろ過分離手法は、これまでにほとんど実用化されていない。
　上述のように、これまでに様々な微粒子の分離精製装置が提案されてきたが、「簡単な操作によって」、「高い精度で」、「少なくとも毎分０．１ｍＬ程度以上の分離処理量を達成でき」、「一定サイズよりも大きい対象も回収でき」、「目詰まりの影響をうけにくく」、「サブマイクロメートル程度の微小な対象にも適用可能であり」、さらに「分離装置やシステムを比較的簡便かつ低コストに作製でき」、「使い捨てのシステムにできる」、微粒子の分離・選抜装置は、ほとんど開発されていない。
　本発明は、従来の技術の有する上記したような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、「簡単な操作によって」、「高い精度で」、「少なくとも毎分０．１ｍＬ程度以上の分離処理量を達成でき」、「一定サイズよりも大きい対象も回収でき」、「目詰まりの影響をうけにくく」、「サブマイクロメートル～数１０マイクロメートル程度の対象に適用可能である」、生体粒子の新規分離装置を提供しようとするものである。さらに、その装置自体が「比較的簡便かつ低コストに作製でき」、「使い捨てのシステムにできる」ように構成されるような装置を提供しようとするものである。
　上記目的を達成するための、本発明の一観点に係る発明は、それぞれ平板状の基板Ａおよび基板Ｂを接合することによって構成されており、基板Ａは内部に連通した細孔が形成された領域Ｃを部分的に備えており、領域Ｃは基板Ａと基板Ｂの接合面Ｓに少なくとも部分的に接しており、接合面Ｓにおいてそれぞれ少なくとも部分的に領域Ｃに接触しておりかつ少なくとも部分的に同一平面に存在する導入流路Ｅおよび回収流路Ｆが形成されており、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆは互いに直接的に接触しないように配置されており、導入流路Ｅは液体を導入できる少なくとも１つの入口Ｉおよび液体を排出できる少なくとも１つの出口Ｊを有しており、回収流路Ｆは液体を排出できる少なくとも１つの出口Ｋを有しており、基板Ｂに接した領域Ｃにおいてろ過を行うクロスフローろ過装置である。このようにすることで、入口Ｉから微粒子懸濁液を連続的あるいは瞬間的に導入すると、多孔性の領域Ｃを通過できるような小さい微粒子は、導入流路Ｅから回収流路Ｆへと導入され、出口Ｋより分離回収されるが、領域Ｃを通過できない大きい微粒子は、導入流路Ｅをそのまま通過して、出口Ｊより回収されるため、簡便な操作によって分離が可能となる。さらに、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆを同一平面に形成することができるため、装置自体を比較的簡単に低コストで作製することも可能となる。
　また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、基板Ａは、内部に連通した細孔が形成されておらず、接合面Ｓに少なくとも部分的に接する領域Ｄを備えており、導入流路Ｅは、接合面Ｓに接し、かつ領域Ｃとおよび出口Ｊの間に存在する領域Ｄに存在する流路部分Ｇを備えていることが望ましい。このようにすることで、出口Ｊに接続する流路部分Ｇにおいて流れの抵抗が生じるため、より効率的に液体を回収流路Ｆに導出させることができ、より高効率な分離を行うことができる。
　また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆは、少なくとも部分的に、互いに平行ならせん形状に配置されていても良い。このようにすることで、比較的高い密度で導入流路Ｅおよび回収流路Ｆを配置することができ、装置自体をコンパクトにできるため、装置作製のコストを低下させることができるほか、導入流路Ｅと回収流路Ｆの間隔を制御することで、より精度の高い分離を行うことが可能となる。
　また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、導入流路Ｅは、液体を導入できる少なくとも２つの入口Ｉおよび入口Ｉ’を備えていても良い。このようにすることで、入口Ｉから微粒子懸濁液、入口Ｉ’から微粒子を含まない溶液をそれぞれ連続的に導入すれば、より精度の高い分離が可能となる。
　また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、導入流路Ｅの直径、幅、あるいは深さの値は、少なくとも部分的に５００マイクロメートル以下であることが望ましい。このようにすることで、サブマイクロメートル～数１０マイクロメートル程度の小さな微粒子を対象とした分離が可能となる。
　また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆの距離は、最も短い部分においても２００マイクロメートル以上であることが望ましい。このようにすることで、短い流路構造であってもより効率的な分離を行うことができ、処理量を向上させることができるほか、サブマイクロメートル～数１０マイクロメートル程度の小さな微粒子を対象とした分離を効率的に行うことができるようになる。
　また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ｃは、ゴム状の樹脂材料に対して、その重合前あるいはその溶融状態において、水に溶解可能な微粒子を混合し、前記樹脂材料を重合あるいは固化した後に、前記微粒子を溶解することによって形成されていても良い。このようにすることで、装置自体の作製コストを低減することができるほか、水に溶解可能な微粒子として、たとえば塩化ナトリウム粒子などを用い、その粒径や形状を制御することで、より精密、高処理量、かつ高精度な分離を行うことが可能となる。
　また、本観点に係る発明において、限定されるわけではないが、領域Ｃは、ゴム状の樹脂材料に対して、その重合前あるいはその溶融状態において、前記樹脂材料を溶解しない有機溶媒に溶解可能な微粒子を混合し、前記樹脂材料を重合あるいは固化した後に、前記微粒子を溶解することによって形成されていてもよい。このようにすることで、装置自体の作製コストを低減することができるほか、有機溶媒に溶解可能な微粒子として、たとえばポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）やポリスチレン（ＰＳ）などからなる粒子を用い、その粒径や形状を制御することで、より精密、高処理量、かつ高精度な分離を行うことが可能となる。
　本発明は、以上に述べられたように構成されているため、どちらか一方に流路構造を形成した、多孔性の基板と非多孔性の基板を接合するだけで、簡便かつ再現性良くクロスフローろ過装置を作製することが可能になる。そのため、使い捨て出来る汎用的な微粒子分離装置として幅広く利用可能となる。
　また本発明は、以上に述べられたように構成されているため、「簡単な操作によって」、「高い精度で」、「少なくとも毎分０．１ｍＬ程度の分離処理量を達成でき」、「一定サイズよりも大きい対象も回収でき」、「目詰まりの影響をうけにくく」、「サブマイクロメートル～数１０マイクロメートル程度の対象に適用可能である」、微粒子の新規分離装置を提供することが可能となる。
実施形態に係る、クロスフローろ過装置の例を示した概略図であり、基板Ａ上面の図１ｃにおけるＺ矢視図である。 実施形態に係る、クロスフローろ過装置の例を示した概略図であり、基板Ｂ下面の図１ｃにおけるＺ矢視図である。 実施形態に係る、クロスフローろ過装置の例を示した概略図であり、基板Ａと基板Ｂを接合して形成したクロスフローろ過装置の図１ａおよび図１ｂにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。 実施形態に係る、図１ａ～図１ｃに示したクロスフローろ過装置における流路構造と類似した流路構造を形成したクロスフローろ過装置の例を示した概略図であり、図２ｂ、図２ｃ、および図２ｄに共通する流路構造を示した図、かつ、図２ｂ、図２ｃ、および図２ｄにおけるＺ矢視図である。 実施形態に係る、図１ａ～図１ｃに示したクロスフローろ過装置における流路構造と類似した流路構造を形成したクロスフローろ過装置の例を示した概略図であり、基板Ａの全体が領域Ｃによって構成され、かつ流路構造が基板Ｂの下面に形成されたクロスフローろ過装置の、図２ａにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。 実施形態に係る、図１ａ～図１ｃに示したクロスフローろ過装置における流路構造と類似した流路構造を形成したクロスフローろ過装置の例を示した概略図であり、基板Ａの下面に存在する領域Ｃに流路構造が形成されたクロスフローろ過装置の、図２ａにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。 実施形態に係る、図１ａ～図１ｃに示したクロスフローろ過装置における流路構造と類似した流路構造を形成したクロスフローろ過装置の例を示した概略図であり、基板Ａの全体が領域Ｃによって構成され、かつ流路構造が基板Ａの下面に形成されたクロスフローろ過装置の、図２ａにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。 実施形態に係るクロスフローろ過装置における、接合面Ｓに形成した流路構造を模式的に示した概略図であり、直線的な導入流路Ｅと直線的な回収流路Ｆを１本ずつ有するクロスフローろ過装置を示している。 実施形態に係るクロスフローろ過装置における、接合面Ｓに形成した流路構造を模式的に示した概略図であり、直線的な１本の導入流路Ｅと直線的な２本の回収流路Ｆを有するクロスフローろ過装置を示している。 実施形態に係るクロスフローろ過装置における、接合面Ｓに形成した流路構造を模式的に示した概略図であり、流路部分Ｇを有する１本の導入流路Ｅと直線的な２本の回収流路Ｆを有するクロスフローろ過装置を示している。 実施形態に係る、導入流路Ｅと回収流路Ｆが互いに平行ならせん形状に配置されたクロスフローろ過装置について、基板Ａの上面に形成した流路構造を示した概略図であり、円形のらせん形状に配置された流路構造を有するクロスフローろ過装置における基板Ａの上面を示している。 実施形態に係る、導入流路Ｅと回収流路Ｆが互いに平行ならせん形状に配置されたクロスフローろ過装置について、基板Ｂの下面に形成した流路構造を示した概略図であり、円形のらせん形状に配置された流路構造を有するクロスフローろ過装置における基板Ｂの下面を示している。 実施形態に係る、導入流路Ｅと回収流路Ｆが互いに平行ならせん形状に配置されたクロスフローろ過装置について、基板Ａの上面に形成した流路構造を示した概略図であり、矩形のらせん形状に配置された流路構造を有するクロスフローろ過装置における基板Ａの上面を示している。 実施形態に係る、導入流路Ｅと回収流路Ｆが互いに平行ならせん形状に配置されたクロスフローろ過装置について、基板Ｂの下面に形成した流路構造を示した概略図であり、矩形のらせん形状に配置された流路構造を有するクロスフローろ過装置における基板Ｂの下面を示している。 実施形態に係る、２つの入口ＩおよびＩ’を備えた導入流路Ｅを形成したクロスフローろ過装置の概略図であり、基板Ａの上面を示している。 実施形態に係る、２つの入口ＩおよびＩ’を備えた導入流路Ｅを形成したクロスフローろ過装置の概略図であり、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆを形成した基板Ｂの下面を示している。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、クロスフローろ過装置の形態を示した概略図であり、基板Ａ上面の図６ｃにおけるＺ矢視図である。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、クロスフローろ過装置の形態を示した概略図であり、基板Ｂ下面の図６ｃにおけるＺ矢視図である。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、クロスフローろ過装置の形態を示した概略図であり、基板Ａと基板Ｂを接合して形成したクロスフローろ過装置の図６ａおよび図６ｂにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、クロスフローろ過装置の形態を示した概略図であり、図６ｂにおける領域ｄの拡大図である。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、クロスフローろ過装置の形態を示した概略図であり、図６ｂにおける領域ｅの拡大図である。 実施例において、シリコーン樹脂および塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した、多孔性の領域Ｃの走査電子顕微鏡像であり、粒子径３０－６０マイクロメートルおよび粒子径９０－１４０マイクロメートルの塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した領域Ｃの断面の走査電子顕微鏡像である。 実施例において、シリコーン樹脂および塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した、多孔性の領域Ｃの走査電子顕微鏡像であり、粒子径３０－６０マイクロメートルおよび粒子径９０－１４０マイクロメートルの塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した領域Ｃの断面の走査電子顕微鏡像である。 実施例において、シリコーン樹脂および塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した、多孔性の領域Ｃの走査電子顕微鏡像であり、粒子径３０－６０マイクロメートルの塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した領域Ｃの表面の走査電子顕微鏡像である。 実施例において、シリコーン樹脂および平均直径約５マイクロメートルのポリメチルメタクリレート微粒子を用いて形成した、多孔性の領域Ｃの走査電子顕微鏡像であり、領域Ｃの断面の走査電子顕微鏡像である。 実施例において、シリコーン樹脂および平均直径約５マイクロメートルのポリメチルメタクリレート微粒子を用いて形成した、多孔性の領域Ｃの走査電子顕微鏡像であり、領域Ｃの表面の走査電子顕微鏡像である。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、３枚の基板からなるクロスフローろ過装置の他の形態を示した概略図であり、最上部に位置する基板下面の図９ｄにおけるＺ矢視図である。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、３枚の基板からなるクロスフローろ過装置の他の形態を示した概略図であり、基板Ａ下面の図９ｄにおけるＺ矢視図である。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、３枚の基板からなるクロスフローろ過装置の他の形態を示した概略図であり、基板Ｂ上面の図９ｄにおけるＺ矢視図である。 実施例において、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、３枚の基板からなるクロスフローろ過装置の他の形態を示した概略図であり、最上部に位置する基板、基板Ａ、および基板Ｂを接合して形成したクロスフローろ過装置の図９ａ、図９ｂ、および図９ｃにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。 実施例において、図９に示されるクロスフローろ過装置を用いた微粒子分離挙動を示したグラフであり、直径３０－６０マイクロメートルの塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した領域Ｃを有するクロスフローろ過装置に対し、出口Ｊ－２および出口Ｋ－２を塞いだ状態で、入口Ｉから、平均直径０．２９～３．２マイクロメートル標準ポリスチレン微粒子を含む懸濁液を導入し、出口Ｊ－１および出口Ｋ－１から回収された溶液に含まれる各微粒子の個数割合を示したグラフである。
　以下、本発明に係るクロスフローろ過装置に関する最良の形態を詳細に説明するものとする。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものではない。
　図１ａ～図１ｃには、クロスフローろ過装置の例を示した概略図が示されており、図１ａは基板Ａ上面の図１ｃにおけるＺ矢視図であり、図１ｂは基板Ｂ下面の図１ｃにおけるＺ矢視図であり、図１ｃは、基板Ａと基板Ｂを接合して形成したクロスフローろ過装置の図１ａおよび図１ｂにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。
　図１ａ～図１ｃに示されるクロスフローろ過装置において、基板Ａは、連通孔を有する多孔性の領域Ｃおよび非多孔性の領域Ｄによって構成されている。また、領域Ｃは、基板Ａの上面に露出するように形成されており、この面が接合面Ｓに相当する。
　図１ａ～図１ｃに示される基板Ａおよび基板Ｂは、冶具や粘着テープ等を用いた物理的な固定、酸素プラズマ・ＵＶオゾン・シランカップリング剤等による化学的な直接接合、接着剤塗布による接合、熱圧着による接合、陽極接合、また、これらの任意の組み合わせ、などの手法を利用することによって接合することができる。
　導入流路Ｅおよび回収流路Ｆの断面は、幅が均一な矩形である。ただし、矩形以外の形状として、四角形以外の多角形、台形、半円形、円形など、様々な断面形状を有する流路構造であっても構わない。ただし、矩形の形状を有する流路構造は、作製が容易であることや、流路間の間隔を厳密に制御しやすいという意味において、好適である。
　図１ａ～図１ｃに示されるクロスフローろ過装置において、回収流路Ｆは、導入流路Ｅを挟むように等間隔に２本形成されており、それぞれが出口Ｋを有するため、合計２個の出口Ｋが存在する。
　導入流路Ｅは、部分的に、連通する細孔を有する領域Ｃに接するように配置されており、導入流路Ｅにおける流路部分Ｇは、非多孔性の領域Ｄに接するように配置されている。
　導入流路Ｅの直径、幅、あるいは深さの値は、直径数マイクロメートル程度あるいはそれ以下のサイズの微粒子を分離できるサイズであれば、どのような値をとっても構わない。ただし、精密な分離を行うという観点から、これらの値は、少なくとも部分的に５００マイクロメートル以下であることが好ましく、特に矩形の断面を有する流路構造の場合には２００マイクロメートル以下であることがより好ましい。
　入口Ｉから導入した懸濁液に含まれる微粒子を、領域Ｃに存在する連通孔を用いて分離するという観点から、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆは、それぞれ独立し、接触せずに存在することが必要となる。この場合、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆは、領域Ｃに存在する連通孔によって、間接的に連結されていることになる。
　導入流路Ｅおよび回収流路Ｆの間隔は、分離対象となる微粒子の分離が可能であれば、どのような値をとることもできる。ただし、領域Ｃに形成した連通孔のサイズ分布を一定にし、また水力学的な分離を達成するという観点から、その値は、最も小さい場合でも、２００マイクロメートル以上となることが好ましい。
　導入流路Ｅおよび回収流路Ｆは、微細加工技術を用いて作製されたマイクロ流路構造によって構成されていても良い。このようにすることで、サイズや形状が任意かつ正確に制御された流路構造を用いることができるため、微粒子分離の挙動や効率を任意に制御することが可能となる。なお、そのような微細加工技術としては、インジェクションモールディング、レプリカモールディング、切削による直接機械加工、レーザー加工、電子線直接描画、立体造形、３次元光造形、ウェットエッチング、ドライエッチング、エンボシング、インプリンティング、などの各種手法を用いることができる。
　微細加工技術を用いて導入流路Ｅおよび回収流路Ｆを作製する場合、図１ａ～図１ｃに示した基板Ｂを構成する基材としては、様々な材質を用いることができる。その例として、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を始めとするシリコーン樹脂、熱可塑性エラストマー、アクリル等の各種ポリマー材料、ガラスを含むセラミクス材料、ステンレスなどの各種金属素材、などが適用でき、また、これらの材料のうちの任意の複数種類の基板を組み合わせて用いることも可能である。さらに、流路表面への微粒子吸着を防ぐために、これらの基材に対し、ポリエチレングリコール、リン脂質極性基を有するポリマー、ポリメトキシエチルアクリレートなどによって表面改質を行うことも可能であり、また、これらのポリマーを混合した樹脂基材や、これらのポリマーを化学的に結合させた樹脂を混合した基材などを用いることも可能である。なお、使い捨てのクロスフローろ過システムとするためには、比較的安価なポリマー材料を用いることが好適である。
　図１ａ～図１ｃに示すクロスフローろ過装置において、基板Ｂが多孔性材料によって形成されていても良い。ただし、基板Ｂに細孔が形成されていたとしても、その効果は限定的であるため、必ずしも多孔性材料によって形成されている必要はない。
　基板Ａの材質としては、基板Ｂと同様の、多種多様な材料を用いることができる。なお、領域Ｃおよび領域Ｄが異なる材質によって構成されていても良く、また、同じ材料によって構成されていても良い。さらにまた、基板Ａおよび基板Ｂをそれぞれ構成する材料が同じであっても、部分的に異なっても、あるいは全体として異なっていても良い。
　領域Ｃについては、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆが効率的に接することができれば、どのような形状およびサイズであっても良い。ただし、平板を接合させるという観点から、少なくとも部分的に平面的に構成されていることが好ましい。また、領域Ｃについて、接合面Ｓと接触している部分以外が領域Ｄによって取り囲まれるようにすることで、入口Ｉから導入された溶液が出口Ｋおよび出口Ｊからのみ流出するようにできるため、そのようにすることが好ましい。
　多孔性の領域Ｃの作製において、ゴム状の樹脂材料に対して、その重合前あるいはその溶融状態において、溶解可能な微粒子を混合し、樹脂材料を重合あるいは固化した後に、微粒子を溶解する、という手法を用いることも可能である。そのようにすることによって、連通した細孔を有する領域Ｃのマトリックスを、安価、簡便、かつ再現性良く作製することができる。ゴム状の樹脂材料としては、シリコーン樹脂や熱可塑性エラストマーが適している。また、樹脂材料に混入する微粒子の体積割合については、連通する細孔を形成できさえすれば、どのような値でも構わないが、一般的には３０～６０％の範囲であることが好ましい。
　特に、基板Ａおよび基板Ｂがシリコーン樹脂によって形成されている場合、これらを酸素プラズマ等によって化学的に活性化することで、容易かつ強固に接合することができるという利点があるため、これらの基板の材質として、シリコーン樹脂を用いることは好ましい。
　領域Ｃにおいて連通孔を形成するために、水にあるいは有機溶媒に溶解可能な様々な微粒子を用いることができる。たとえば水に可溶な粒子としては、塩化ナトリウム粒子、塩化カリウム粒子、リン酸塩粒子、ショ糖粒子、グルコース粒子など、どのようなものを用いても良い。さらに有機溶媒に溶解可能な微粒子としては、ポリメチルメタクリレート粒子、ポリスチレン粒子など、様々な微粒子を用いることができる。またこれら微粒子の径を制御することによって、分離対象となる微粒子の分離挙動を制御することができる。溶解させる微粒子の大きさは、平均直径に換算して、０．１マイクロメートルから１ミリメートル程度の範囲とすることが想定されるが、サブマイクロメートル～数マイクロメートルの対象を分離する上では、１０マイクロメートル～５００マイクロメートル程度の微粒子を選択することが好ましい。このような微粒子を用いることで、その径に応じたサイズの連通孔を形成することができる。なお、有機溶媒に溶解可能な微粒子を用いる場合の有機溶媒としては、領域Ｃを溶解しない有機溶媒を選択する、あるいは当該有機溶媒によって溶解しない材料を用いて領域Ｃを形成することが好ましい。
　領域Ｃを平面的に形成した場合、その厚みは、分離目的が達成される条件であれば、どのような値であっても良い。ただし、溶解させる微粒子の径よりも厚みが薄い場合には、連通孔を形成することが困難となるため、溶解させる微粒子の径の３倍程度の厚みを持たせることが好ましい。一般的には、０．１～５ミリメートル程度の範囲にあることが好ましい。
　図２ａ～図２ｄには、図１ａ～図１ｃに示したクロスフローろ過装置における流路構造と類似した流路構造を形成した３種類のクロスフローろ過装置の例を示した概略図が示されており、図２ａは、図２ｂ、図２ｃ、および図２ｄに共通する流路構造を示した図であり、かつ、図２ｂ、図２ｃ、および図２ｄにおけるＺ矢視図である。図２ｂは、基板Ａの全体が領域Ｃによって構成され、かつ流路構造が基板Ｂの下面に形成されたクロスフローろ過装置、図２ｃは、基板Ａの下面に存在する領域Ｃに流路構造が形成されたクロスフローろ過装置、図２ｄは、基板Ａの全体が領域Ｃによって構成され、かつ流路構造が基板Ａの下面に形成されたクロスフローろ過装置の、それぞれ図２ａにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。
　図２ａ～図２ｄに示されるように、領域Ｃを含む基板Ａ、基板Ｂ、および流路構造の位置関係としては、様々なパターンが想定されうる。導入流路Ｅおよび回収流路Ｆが、基板Ａ側に形成されていても良く、基板Ｂ側に形成されていても良く、また、基板Ａおよび基板Ｂの両方に形成されていても良い。また、基板Ａが領域Ｄを有せず、領域Ｃによって構成されていても良く、また、基板Ｂの少なくとも一部分が多孔性の材料によって形成されていても良い。
　図３ａ～図３ｃには、３種類のクロスフローろ過装置における、接合面Ｓに形成した流路構造を模式的に示した概略図が示されており、図３ａは直線的な導入流路Ｅと直線的な回収流路Ｆを１本ずつ有するクロスフローろ過装置、図３ｂは直線的な１本の導入流路Ｅと直線的な２本の回収流路Ｆを有するクロスフローろ過装置、図３ｃは流路部分Ｇを有する１本の導入流路Ｅと直線的な２本の回収流路Ｆを有するクロスフローろ過装置、をそれぞれ示している。
　図３ａ～図３ｃに示すように、導入流路Ｅと回収流路Ｆの構造としては、様々なパターンが想定されうる。このように、導入流路Ｅに入口Ｉと出口Ｊがそれぞれ少なくとも１つずつ、回収流路Ｆに出口Ｋが少なくとも１つ存在しさえすれば、導入流路Ｅと回収流路Ｆは複数本存在していても構わない。また、導入流路Ｅの両側に回収流路Ｆが存在する場合、それらの流路は必ずしも等間隔に配置されていなくとも良いが、導入流路Ｅの両側において、それぞれ等しい位置に回収流路Ｆが存在することが、分離の精度を制御しやすいという観点において、好ましい。
　流路部分Ｇは、形成されていてもされていなくても構わない。だたし、流路部分Ｇが存在することによって、出口Ｊへの流れの抵抗が増大するため、出口Ｋへの相対的な流量を増加させることができ、より効率的な分離が可能となる。そのため、流路部分Ｇが形成されていることが好ましい場合もある。なお、流路部分の長さ、幅、深さを適切に調整することによって、微粒子分離の挙動を制御することが可能となる。
　図４ａ～図４ｄには、導入流路Ｅと回収流路Ｆが互いに平行ならせん形状に配置された、２種類のクロスフローろ過装置について、それぞれ基板Ａの上面および基板Ｂの下面に形成した流路構造を示した概略図が示されており、図４ａは円形のらせん形状に配置された流路構造を有するクロスフローろ過装置における基板Ａの上面を示しており、図４ｂは円形のらせん形状に配置された流路構造を有するクロスフローろ過装置における基板Ｂの下面を示しており、図４ｃは矩形のらせん形状に配置された流路構造を有するクロスフローろ過装置における基板Ａの上面を示しており、図４ｄは矩形のらせん形状に配置された流路構造を有するクロスフローろ過装置における基板Ｂの下面を示している。
　図４ａ～図４ｄに示すように、中心から外側に広がるように、導入流路Ｅと回収流路Ｆを交互に配置することによって、これらの流路をそれぞれ１本ずつのみの配置としながらも、効率的な分離が可能となる。また、このようにすることによって、限られたスペースに流路構造を高密度かつコンパクトに配置することができるため、装置自体の小型化を達成することができ、好ましい。
　なお、図４ａ～図４ｄに示すように、この場合の「らせん形状」という文言は、円形だけでなく、矩形、多角形など、様々な形態をとりうる。ただし、円形あるいは矩形のらせん形状に流路構造を配置することで、流路の設計をよりスムーズに行うことが可能となる。
　また、図４ａ～図４ｄに示す流路構造とは異なり、入口Ｉが外側に存在し、出口Ｊおよび出口Ｋが中心側に存在するらせん形状の配置となっていても良い。
　図１ａ乃至図４ｄに示した流路構造に対して、入口Ｉから微粒子の懸濁液を連続的に導入すると、サイズあるいは変形能の違いによって、これらの微粒子は連続的に分離され、別々の出口から回収される。
　微粒子の懸濁液を連続的に導入する際には、様々な手段を利用することができる。最も簡単な手法は、シリンジ等を入口Ｉに接続し、手動あるいはポンプを用いて加圧することで、連続的に微粒子の懸濁液を導入することであるが、そのほかにも、多種多様なポンプシステムを使用することもできる。また、出口Ｊおよび出口Ｋより溶液を吸引することで、流路内に微粒子の懸濁液を連続的に導入しても良い。
　分離対象となる微粒子としては、各種合成微粒子、培養細胞、血液中に存在する細胞あるいは生体粒子、環境微粒子、リポソームやベシクル、などが想定される。溶液としては、これらの微粒子を安定的に分散できるものを用いることが好ましく、特に細胞あるいは生体粒子の分離を行う場合には、緩衝作用のある水溶液を用いることが好ましい。
　これらの分離対象を懸濁させた溶液を入口Ｉから導入すると、一定のサイズより小さな微粒子、あるいは、変形能の高い微粒子は、多孔性の領域Ｃを通過し、回収流路Ｆへと導入され、最終的に出口Ｋより排出される。一方で、ある一定のサイズより大きい微粒子、あるいは変形能の低い微粒子は、導入流路Ｅを下流へと流れ、最終的に出口Ｊより排出される。この際、一定のサイズより小さい微粒子も、その一定割合が、大きい微粒子と同時に出口Ｊより排出される。
　また、領域Ｃに形成された細孔のサイズが小さく、導入流路Ｅと回収流路Ｆの距離が長く、導入流路Ｅの深さの値が小さく、また、出口Ｊに分配される流量割合が多く、なればなるほど、分離のカットオフサイズが小さくなり、つまり、より小さい微粒子のみを分離することが可能となる。
　図５ａ及び図５ｂには、２つの入口ＩおよびＩ’を備えた導入流路Ｅを形成したクロスフローろ過装置の概略図が示されており、図５ａは基板Ａの上面を示しており、図５ｂは導入流路Ｅおよび回収流路Ｆを形成した基板Ｂの下面を示している。
　図５ａ及び図５ｂに示した導入流路Ｅに対し、入口Ｉから微粒子懸濁液を、入口Ｉ’から微粒子を含まない溶液を、それぞれ連続的に導入することで、入口を１つだけ有する導入流路Ｅと比較して、より高精度な分離が達成される。ここでの高精度とは、出口Ｊから回収される溶液中に混入する、小さい微粒子の割合が減少する、ということを意味している。
　上記実施形態に係るクロスフローろ過システムを実際に作製し、微粒子の分離実験を行うことで、本発明の効果を確認した。以下説明する。
　図６ａ～図６ｅは、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、クロスフローろ過装置の形態を示した概略図であり、図６ａは基板Ａ上面の図６ｃにおけるＺ矢視図であり、図６ｂは基板Ｂ下面の図６ｃにおけるＺ矢視図であり、図６ｃは、基板Ａと基板Ｂを接合して形成したクロスフローろ過装置の図６ａおよび図６ｂにおけるＸ－Ｘ’線における断面図であり、図６ｄおよび図６ｅはそれぞれ、図６ｂにおける領域ｄおよび領域ｅの拡大図である。
　図６ａ～図６ｅに示した基板Ｂ下面における流路構造は、ソフトリソグラフィーによってネガティブフォトレジスト製の鋳型を作製し、その鋳型に対して、シリコーン樹脂の一種であるＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）プレポリマーをキャストし、重合させることによって形成したものである。入口Ｉ、出口Ｊ、および出口Ｋは、パンチによって穴をあけることによって形成したものである。なお、基板Ｂの厚みは３ミリメートル程度であった。
　図６ａ～図６ｅに示した基板Ａは、ＰＤＭＳに塩化ナトリウム微粒子を体積割合５０％で混合し、平板状にキャストして重合させた後、その周囲に塩化ナトリウム微粒子を含まないＰＤＭＳをキャストして重合させ、さらにその後、形成した基材を蒸留水に浸漬することによって塩化ナトリウム微粒子を溶解させて、領域Ｃに相当する部分に連通する微細孔を形成することによって作製したものである。塩化ナトリウム微粒子としては、粒子径が３０－６０マイクロメートルの範囲にあるもの、および、９０－１４０マイクロメートルの範囲にあるものを用いた。領域Ｃの厚みは１ミリメートル、基板Ａ全体の厚みは２ミリメートル程度であった。
　図６ａ～図６ｅに示したクロスフローろ過システムは、これら基板Ａおよび基板Ｂを、酸素プラズマ処理によって活性化し、接合することによって形成した。
　図６ａ～図６ｅに示した流路構造は、導入流路Ｅおよび回収流路Ｆのいずれも、その深さが約６０マイクロメートルであり、流路部分Ｇ以外の導入流路Ｅ、導入流路Ｅにおける流路部分Ｇ、回収流路Ｆ、の幅はそれぞれ、１００マイクロメートル、５０マイクロメートル、２００マイクロメートルであった。また、導入流路Ｅと回収流路Ｆは矩形のらせん形状に配置されており、これらの流路の間の距離は３５０マイクロメートルであった。さらに、流路部分Ｇ以外の導入流路Ｅの長さは１０センチメートルであり、流路部分Ｇの長さは１０あるいは３０センチメートルであった。流路部分Ｇについても、らせん形状にコンパクトに折りたたまれるような配置とした。
　図７ａ～図７ｃには、ＰＤＭＳおよび塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した、多孔性の領域Ｃの走査電子顕微鏡像が示されており、図７ａおよび図７ｂはそれぞれ、粒子径３０－６０マイクロメートルおよび粒子径９０－１４０マイクロメートルの塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した領域Ｃの断面の走査電子顕微鏡像であり、図７ｃは粒子径３０－６０マイクロメートルの塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した領域Ｃの表面の走査電子顕微鏡像である。
　図７ａ～図７ｃに示すように、これらサイズの異なる２種類の塩化ナトリウム微粒子を用いた場合、塩化ナトリウム微粒子が溶解することで細孔が形成され、さらに細孔同士が部分的に接触し、連通孔が形成される様子が観察された。さらに、多孔性の領域Ｃの表面には、多数の微細孔が形成されている様子が観察された。
　図８ａ及び図８ｂには、シリコーン樹脂および平均直径約５マイクロメートルのポリメチルメタクリレート微粒子を用いて形成した、多孔性の領域Ｃの走査電子顕微鏡像が示されており、図８ａはそれぞれ、領域Ｃの断面の走査電子顕微鏡像であり、図８ｂは領域Ｃの表面の走査電子顕微鏡像である。
　図８ａ及び図８ｂに示すように、有機溶媒を用いてポリメチルメタクリレート微粒子を除去および溶解することで、細孔が形成され、さらに細孔同士が部分的に接触し、連通孔が形成される様子が観察された。さらに、多孔性の領域Ｃの表面には、多数の微細孔が形成されている様子が観察された。
　図９ａ～図９ｄには、直径数マイクロメートルの微粒子を分離するために使用した、３枚の基板からなるクロスフローろ過装置の他の形態を示した概略図が示されており、図９ａは最上部に位置する基板下面の図９ｄにおけるＺ矢視図であり、図９ｂは基板Ａ下面の図９ｄにおけるＺ矢視図であり、図９ｃは基板Ｂ上面の図９ｄにおけるＺ矢視図であり、図９ｄは最上部に位置する基板、基板Ａ、および基板Ｂを接合して形成したクロスフローろ過装置の図９ａ、図９ｂ、および図９ｃにおけるＸ－Ｘ’線における断面図である。
　図９ａ～図９ｄに示したクロスフローろ過装置は、図６ａ～図６ｅに示したクロスフローろ過装置と同様に作製されたものである。図９ａ～図９ｄに示したクロスフローろ過装置における流路構造は、３枚の基板を接合することによって形成されており、基板Ａの下面に存在する導入流路Ｅは、途中で８本に分岐しており、その分岐が最終的に最上部に位置する基板下面において合流し、出口Ｊ－１あるいは出口Ｊ－２に接続されている。また基板Ａの下面において、８本に分岐した各導入流路の両側にそれぞれ回収流路が形成されており、それらは基板Ａの下面において合流し、流路部分Ｇをへて、出口Ｋ－１あるいはＫ－２に接続されている。
　この流路において、出口Ｊおよび出口Ｋがそれぞれ２個ずつ設けられているが、これらのうちそれぞれいずれか片方を用いることによって、出口の流量を調節することができ、分離サイズを制御できるものと期待される。
　基板Ａの下面において分岐した導入流路の幅は１００マイクロメートル、回収流路の幅は２００マイクロメートルであり、それらの深さはいずれも約５０マイクロメートルであった。
　図９ａ～図９ｄに示したクロスフローろ過装置に対して、ポリスチレンの標準蛍光微粒子を、１８％スクロースおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む水溶液に懸濁させ、シリンジポンプを用いて、その懸濁液を毎分１００マイクロリットルの流速で、入口Ｉから連続的に導入した。
　図１０は、図９ａ～図９ｄに示されるクロスフローろ過装置を用いた微粒子分離挙動を示したグラフであり、直径３０－６０マイクロメートルの塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した領域Ｃを有するクロスフローろ過装置に対し、出口Ｊ－２および出口Ｋ－２を塞いだ状態で、入口Ｉから、平均直径０．２９～３．２マイクロメートル標準ポリスチレン微粒子を含む懸濁液を導入し、出口Ｊ－１および出口Ｋ－１から回収された溶液に含まれる各微粒子の個数割合を示したグラフである。このグラフは、各出口から回収された各微粒子の個数を、回収液中の「微粒子濃度」×「液の体積」によって算出し、２つの出口から回収された粒子の合計を１００％として表示しているものである。
　図１０に示すように直径３０－６０マイクロメートルの塩化ナトリウム微粒子を用いて形成した領域Ｃを有するクロスフローろ過装置を用いた場合、３．２マイクロメートルの粒子は、そのほとんどが出口Ｊから回収された。この際、出口Ｋから流出した溶液量は、全体の５０～６０％程度であった。導入する粒子径が小さくなるほど、回収流路に導入され、出口Ｋ－１から回収される粒子の割合は増加し、０．２９マイクロメートルの粒子の場合には、ほぼ流量の分配に従って２つの出口より回収されることが確認された。つまり、この装置は、マイクロメートルからサブマイクロメートルサイズの微粒子分離に適用可能であることを示している。
　なお、３．２マイクロメートルの微粒子はそのほとんどが出口Ｊ－１から回収された。領域Ｃの表面に形成された孔のサイズが５マイクロメートル程度であったが、この３．２マイクロメートルの微粒子が多孔性部を通過しなかったことから、本発明におけるクロスフローろ過装置は、連通孔の物理的な孔径だけではなく、流れの分配などを含む水力学的な作用が、分離される微粒子のサイズを決定することが示唆された。このことは、本発明におけるクロスフローろ過装置が、目詰まりの影響を受けにくい分離装置であることを示唆している。
　本発明は、以上に述べられたように構成されているため、「微粒子懸濁液を導入する、という簡単な操作によって」、「高い精度で」、「少なくとも毎分０．１ｍＬ程度以上の分離処理量を達成でき」、「一定サイズよりも大きい対象も回収でき」、「目詰まりの影響をうけにくく」、「サブマイクロメートル程度の微小な対象にも適用可能である」、連続的分離装置として極めて有用である。そのため、各種合成微粒子の調製、抗体生産などのバイプロセスにおける微粒子状の不純物の除去、各種細胞の分離、疾病診断のための血液等の体液サンプルの前処理、など、様々な産業上の応用が期待される。
　また本発明は、以上に述べられたように構成されているため、「分離装置やシステムを比較的簡便かつ低コストに作製でき」、「使い捨てのシステムにできる」、という優れた効果を発揮する。そのため、シリンジフィルターと同様の使い勝手で使用できる、安価かつ汎用的な使い捨てのフィルター装置として、生化学研究や環境分析など、様々な研究開発分野において有用な新規装置としての利用が期待できる。

Claims (8)

  1. 　それぞれ平板状の基板Ａおよび基板Ｂを接合することによって構成されており、
    　基板Ａは内部に連通した細孔が形成された領域Ｃを備えており、
    　領域Ｃは基板Ａと基板Ｂの接合面Ｓに対して少なくとも部分的に接しており、
    　それぞれ少なくとも部分的に接合面Ｓにおいて領域Ｃに接しておりかつ少なくとも部分的に同一平面に存在する導入流路Ｅおよび回収流路Ｆが形成されており、
    　導入流路Ｅおよび回収流路Ｆは互いに直接的に接触しないように配置されており、
    　導入流路Ｅは液体を導入できる少なくとも１つの入口Ｉおよび液体を排出できる少なくとも１つの出口Ｊを有しており、
    　回収流路Ｆは液体を排出できる少なくとも１つの出口Ｋを有しており、
    　基板Ｂに接した領域Ｃにおいてろ過を行う、
    クロスフローろ過装置。
  2. 　基板Ａは、内部に連通した細孔が形成されておらず、接合面Ｓに少なくとも部分的に接する領域Ｄを備えており、
    　導入流路Ｅは、接合面Ｓに接し、かつ領域Ｃと出口Ｊの間において領域Ｄに接する流路部分Ｇを備えている、
    請求項１に記載のクロスフローろ過装置。
  3. 　導入流路Ｅおよび回収流路Ｆは、少なくとも部分的に、互いに平行ならせん形状に配置されている、
    請求項１乃至２のいずれか１項に記載のクロスフローろ過装置。
  4. 　導入流路Ｅは、液体を導入できる少なくとも２つの入口Ｉおよび入口Ｉ’を備えている、
    請求項１乃至３のいずれか１項に記載のクロスフローろ過装置。
  5. 　導入流路Ｅの直径、幅、あるいは深さの値は、少なくとも部分的に５００マイクロメートル以下である、
    請求項１乃至４のいずれか１項に記載のクロスフローろ過装置。
  6. 　導入流路Ｅと回収流路Ｆの間の距離は、最も短い部分においても２００マイクロメートル以上である、
    請求項１乃至５のいずれか１項に記載のクロスフローろ過装置。
  7. 　領域Ｃは、ゴム状の樹脂材料に対して、その重合前あるいはその溶融状態において、水に溶解可能な微粒子を混合し、前記樹脂材料を重合あるいは固化した後に、前記微粒子を溶解することによって形成されている、
    請求項１乃至６のいずれか１項に記載のクロスフローろ過装置。
  8. 　領域Ｃは、ゴム状の樹脂材料に対して、その重合前あるいはその溶融状態において、前記樹脂材料を溶解しない有機溶媒に溶解可能な微粒子を混合し、前記樹脂材料を重合あるいは固化した後に、前記微粒子を溶解することによって形成されている、
    請求項１乃至６のいずれか１項に記載のクロスフローろ過装置。
PCT/JP2020/015114 2019-04-04 2020-04-01 クロスフローろ過装置 WO2020204108A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021512194A JP7417294B2 (ja) 2019-04-04 2020-04-01 クロスフローろ過装置

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-071899 2019-04-04
JP2019071899 2019-04-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020204108A1 true WO2020204108A1 (ja) 2020-10-08

Family

ID=72669034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/015114 WO2020204108A1 (ja) 2019-04-04 2020-04-01 クロスフローろ過装置

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP7417294B2 (ja)
WO (1) WO2020204108A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004042012A (ja) * 2001-10-26 2004-02-12 Nec Corp 分離装置、分析システム、分離方法および分離装置の製造方法
JP2005007352A (ja) * 2003-06-20 2005-01-13 Sharp Corp 粒子の分離方法及び分離装置並びに検出装置
CN101498630A (zh) * 2008-01-30 2009-08-05 中国科学院电子学研究所 一种样品预处理集成芯片
JP2012223683A (ja) * 2011-04-18 2012-11-15 Seiko Epson Corp 微粒子分離装置および微粒子分離方法
US20130175213A1 (en) * 2011-07-11 2013-07-11 Robert Bosch Gmbh System for Separating Bodily Fluid Constituents and Method for Producing such a System

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4226886A (en) * 1979-02-16 1980-10-07 Micro-Cel Systems, Inc. Self-metering liquid retentive pad and process for producing same
JP2006095515A (ja) 2004-08-30 2006-04-13 Toray Ind Inc 膜デバイスとその利用法
ES2657456T3 (es) 2008-06-12 2018-03-05 Avery Dennison Corporation Material y método para producirlo

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004042012A (ja) * 2001-10-26 2004-02-12 Nec Corp 分離装置、分析システム、分離方法および分離装置の製造方法
JP2005007352A (ja) * 2003-06-20 2005-01-13 Sharp Corp 粒子の分離方法及び分離装置並びに検出装置
CN101498630A (zh) * 2008-01-30 2009-08-05 中国科学院电子学研究所 一种样品预处理集成芯片
JP2012223683A (ja) * 2011-04-18 2012-11-15 Seiko Epson Corp 微粒子分離装置および微粒子分離方法
US20130175213A1 (en) * 2011-07-11 2013-07-11 Robert Bosch Gmbh System for Separating Bodily Fluid Constituents and Method for Producing such a System

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2020204108A1 (ja) 2020-10-08
JP7417294B2 (ja) 2024-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dalili et al. A review of sorting, separation and isolation of cells and microbeads for biomedical applications: microfluidic approaches
US20210370298A1 (en) Microfluidic Device For Cell Separation And Uses Thereof
US9157839B2 (en) Separation and concentration of biological cells and biological particles using a one-dimensional channel
JP5684224B2 (ja) マイクロチャネルにおける粒子集束のためのシステムおよび方法
US10596522B2 (en) Hemolysis-free blood plasma separation
CN111615552B (zh) 用于颗粒纯化和分馏的微流体芯片
TW201818983A (zh) 用於分離或富集化細胞的方法及組合物
WO2008130618A1 (en) Method and apparatus for separating particles, cells, molecules and particulates
JP2007503597A (ja) 血液から赤血球および血小板をサイズに基づいて除去するための微少流体システム
JP4982768B2 (ja) 粒子処理用マイクロ流路システムおよび粒子処理方法
US8354075B1 (en) Streamline-based microfluidic device
TW201226046A (en) Blood separation method
JP7289128B2 (ja) クロスフローろ過装置の作製方法
WO2020204108A1 (ja) クロスフローろ過装置
JP2005505770A (ja) 分散体からの粒子、とくに血液からの血球の分離方法および分離モジュール
Bayareh et al. Cancer cell separation using passive mechanisms: A review
TWI498135B (zh) 液體樣本過濾裝置
JP2006115775A (ja) バイオセパレーション用キットおよびその使用方法
Mohammadali et al. Cancer Cell Separation Using Passive Mechanisms: a Review.
Castro Micron–and Submicron-Scale High Porosity Polymer Membranes and Their Use for Cell Isolation
Chen et al. Microfluidics chips for blood cell separation
Zhou et al. The design and fabrication of thermoplastic microfluidic chips with integrated micropillars for particle separation
CN114395463A (zh) 基于微流控与微光镊阵列的ctc富集释放系统及制备方法
Crowley Blood separation with passive microfluidic devices for lab-on-a-chip applications

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20783409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021512194

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20783409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1