WO2020178469A1 - Uso de la reelina como biomarcador de enfermedades intestinales - Google Patents

Uso de la reelina como biomarcador de enfermedades intestinales Download PDF

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WO2020178469A1
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reelin
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quantification
gene
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Maria Anunciación Ana ILUNDAIN LARRAÑETA
Mª José PERAL RUBIO
Mª Luisa CALONGE CASTRILLO
Pablo GARCÍA MIRANDA
Mª Dolores VÁZQUEZ CARRETERO
José Manuel SERRANO MORALES
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Universidad de Sevilla
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Universidad de Sevilla
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention refers to reelin as the only biomarker for the diagnosis and identification of different intestinal pathologies and as a biomarker of the transition from inflammatory bowel disease to tumorigenesis.
  • the intestinal epithelium is part of one of the largest surfaces that separates our internal environment from the exterior, participates in the digestion and absorption of nutrients and is a key component in the intestinal barrier, preventing the passage to the internal environment of a wide spectrum of microorganisms and potentially carcinogenic substances present in the lumen of the intestine.
  • the epithelium together with its paracellular pathway sealed by the occluding junctions, is the main physical barrier of the intestinal barrier.
  • the epithelium produces components of the intestinal barrier such as the mucus layer and antimicrobial peptides, and secretes IgA from the subepithelial environment to the lumen of the intestine.
  • Other components of the intestinal barrier are the microbiota, located above the mucus layer, and the immune system associated with the intestine (Viggiano d conducted duringet al. Eur. Rev. Med Pharmacol Sci 19 (2015) 1077-1085).
  • the constant aggression of the epithelium by the luminal content poses a threat to its integrity if there were no mechanisms to prevent it.
  • the intestinal epithelium is renewed every 3-5 days from stem cells located in the intestinal crypts, which are continually dividing and, as they migrate along the villi (small intestine) or towards the surface (colon) , differentiate into enteradlos (small intestine) or colonodtos (colon), mucus-producing cells (goblet cells), and enteroendocrine cells that eventually die and are released into the lumen of the intestine (Sellers RS., et al. Toxicol Pathol 42 (2014 ) 67-81).
  • Paneth cells In the small intestine there is an additional population of differentiated cells, Paneth cells, which migrate to the bottom of the crypts and are the producers of most antimicrobial peptides. (Viggiano d., Et al. Eur. Rev. Med Pharmacol Sd 19 (2015) 1077-1085).
  • a dysregulation of epithelial homeostasis compromises the integrity of the intestinal barrier and if it is not re-established it will cause intestinal pathologies such as inflammation and cancer (Viggiano d., et al. Eur. Rev. Med Pharmacol Sci 19 (2015) 1077-1085).
  • Inflammatory bowel disease is a chronic inflammatory disorder of the intestinal tract suffered by millions of patients around the world and is made up of two main types of diseases: ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD). In both forms of inflammation, gut microbes can initiate disease in genetically susceptible individuals.
  • UC ulcerative colitis
  • CD Crohn's disease
  • Ulcerative colitis is an inflammatory disease of the colon and rectum. It is characterized by inflammation and ulceration of the inner wall of the colon. Typical symptoms include diarrhea (sometimes bloody) and often abdominal pain. Its typical presentation age is before the first 40 years of life; however, the diagnosis has been established in the elderly. The diagnosis is established by performing a lower digestive endoscopy (rectoscopy or colonoscopy) that allows the examination of the colon mucosa using a camera. In the case of ulcerative colitis, the mucosa is seen with obvious inflammatory signs such as mucosal redness, ulcerations, presence of mucus and fibrinoid material, and so-called pseudopolyps. For its definitive confirmation, biopsies must be taken, which must be examined by a pathologist.
  • Crohn's disease is a chronic inflammatory disease with intermittent manifestations that mainly affect the entire gastrointestinal tract ("from the mouth to the anus"). Along with ulcerative colitis, it is part of the so-called inflammatory bowel diseases. The exact origin of the disease is unknown, but immunological, microbiological, environmental and genetic factors that increase the risk of suffering from it have been recognized. The most widely accepted hypothesis, regarding the importance of these factors, indicates that there is a genetically determined individual susceptibility, but that the incidence of environmental factors is required for the disease to develop. Among them, the deregulation of the microbiota is becoming increasingly important. The diagnosis of Crohn's disease is made with clinical suspicion and compatible radiological, endoscopic, and histological (biopsy) findings.
  • the blood analysis is altered in the acute phases of the disease with elevation of the sedimentation rate (ESR and C-reactive protein), increased numbers of white blood cells and platelets.
  • Radiological studies reveal the possible complications of these entities (abscesses, fistulas, stenosis). Labeled leukocyte scintigraphy can allow assessment of the extent of inflammation. At the time of the onset of symptoms, the doctor must differentiate from other diseases that can also cause outbreaks of diarrhea, bloody abdominal pain and / or fever.
  • the proteins calprotectin, lactoferrin and S100A12 are used as fecal markers of intestinal inflammation (Galgut BJ., Et al. Front Pediatr 19. 5- 292. (2016) Review).
  • the presence of occult blood in feces and the protein vimentin and the proteins CEA (cartinoembryonic antigen) and CA19-9 (carbohydrate antigen 19-9) in blood is currently used, among others (González-Pons M., et al. Biomed Res Int. (2015) 149014. Review).
  • intestinal diseases more particularly inflammatory diseases and tumorigenesis
  • inflammatory diseases and tumorigenesis based on blood tests, biopsies, endoscopies or radiological studies is limiting for an early and reliable detection.
  • one of the reasons for the appearance of tumorigenesis is a chronic inflammatory process that is prolonged over time, because the repair mechanisms activated to counteract the injury caused by inflammation become ineffective and the tissue begins to proliferate uncontrollably.
  • Reelin is an extracellular matrix protein known for about 70 years for its role in the development of the central nervous system. Until now, the study of the expression and function of reelin in peripheral tissues has been scarcely addressed.
  • the inventors have shown that, in response to tissue damage such as inflammation, the intestine increases the expression of reelin to strengthen the intestinal barrier and facilitate tissue repair. If inflammation progresses, conditions are established that reduce or suppress reelin expression, where said absence favors the formation of an unfavorable microenvironment that would aggravate inflammation and / or induce tumorigenesis.
  • the inventors determined the expression levels of reelin by isolating RNA the samples, reverse transcription and subsequent PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • RNA reelin messenger RNA
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • reelin can be used as a single biomarker in the diagnosis and identification of different intestinal pathologies, and as a biomarker of the transition from inflammatory bowel disease to tumorigenesis.
  • first method of the invention or “method of prognosis of the invention ”, which comprises
  • step (b) comparing the expression levels obtained in step (a) with a reference level
  • determining the prognosis is understood to determine the probability that a patient has a specific clinical result, be it good / positive / mild or bad / negative / severe, that is, an anticipation of the progress of a disease, for example, the likelihood, duration and / or extent of recovery.
  • prediction and “forecast” are equivalent.
  • the prognostic method of the invention can be used clinically to make decisions about the choice of the most appropriate treatment for each individual patient.
  • the term “good” prognosis encompasses the anticipation of a partial or complete recovery and the non-worsening of intestinal pathology within a given period of time.
  • a "bad" prognosis encompasses the anticipation of poor recovery and / or unsatisfactorily slow recovery, or substantially no recovery.
  • intestinal diseases or "intestinal pathology” are understood as those diseases that affect the intestine, both the large and small intestines or any of their parts (colon, rectum, ileum, duodenum and / or jejunum ), and prevents it from performing its function correctly
  • small intestine refers to the portion of the digestive tract that begins in the stomach and reaches the colon. It is the longest and the final part of digestion and absorption of the nutritive substances from food takes place in it.
  • colon refers to the part of the large intestine that has an inverted U shape and that, in the abdominal cavity, is located in front of the small intestine. Like the small intestine, the colon contains microorganisms (bacteria, viruses and fungi) that constitute the intestinal flora, much more abundant in the colon than in the small intestine. This flora ferments the food waste that is not digested by our intestine, obtaining from them substances usable by the human being.
  • intestinal diseases include, but are not limited to, inflammatory diseases, carcinogenic diseases, constipation, diverticular disease, polyps, s adenomas, irritable bowel syndrome, and ulcers.
  • the intestinal disease is an inflammatory bowel disease, intestinal polyps, an adenoma or an intestinal adenocarcinoma.
  • the term "inflammatory bowel disease” refers to diseases that affect the intestine and that are characterized by producing chronic inflammation.
  • inflammatory bowel diseases include, but are not limited to, diarrhea, peritonitis, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome, and Crohn's disease.
  • the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • intestinal polyp or “non-adenomatous polyp” refers to a benign mass in the lining of the colon or rectum, so it does not progress to cancer or spread.
  • adenomatous polyp or “adenoma” is understood to mean the non-invasive proliferation of epithelial cells. It is a malignant mass in the lining of the colon or rectum that, although non-invasive, can evolve into cancer and eventually spread
  • adenoma includes, but is not limited to, be limited to a tubular adenoma (protruding into the lumen of the colon), a tubulovillous adenoma and a villous adenoma.
  • adenocarcinoma refers to that carcinogenic disease that begins in the glandular cells of the intestine or in the crypts.
  • carcinogenic diseases or “cancer” refers to the disease that occurs as a consequence of an uncontrolled process in the body's cell division, generating an abnormal mass (tumor) of tissue whose growth exceeds that of normal tissues, is uncoordinated, and that persists in the same excessive way even after the end of the stimulus that gave rise to it.
  • adenocarcinomas include, but are not limited to, carcinoid tumors, colorectal cancer, and gastrointestinal cancer.
  • the term "subject” or “individual” refers to any animal that has a digestive system, in particular, intestine.
  • the subject can be an invertebrate or a vertebrate animal.
  • invertebrate animals include, but are not limited to, arthropods such as insects and crustaceans.
  • vertebrate animals include, but are not limited to, fish, birds, amphibians, reptiles, and mammals.
  • mammals include, but are not limited to, farm animals (such as horses, pigs, rabbits, sheep, goats, cows, etc.), companion animals (such as dogs, cats, guinea pigs, rats, mice, etc.) , nonhuman primates, and humans.
  • farm animals such as horses, pigs, rabbits, sheep, goats, cows, etc.
  • companion animals such as dogs, cats, guinea pigs, rats, mice, etc.
  • nonhuman primates and humans.
  • the subject of the prognostic method of the invention is a mam
  • the prognostic method of the invention comprises quantifying the expression levels of the gene encoding reelin in a biological sample isolated from said subject.
  • Reelin or RELN, RL or PR01598 protein
  • RELN Reelin
  • PR01598 protein is an extracellular signaling protein that is involved in the regulation of neuronal migration and positioning processes in brain development, but that continues to work in the already developed brain by modulating synoptic plasticity and improving the induction and maintenance of long-term memory.
  • the gene encoding reelin is found on chromosome 7q22 and has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 (NCBI Reference Sequence NM_005045 version NM_005045.2).
  • the gene encoding reelin comprises a sequence of nudeotides with a sequence identity of at least 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% with the sequence SEO ID NO: 1.
  • the degree of identity is determined using algorithms and computer procedures which are widely known to the person skilled in the art.
  • the identity between two amino / nudeotide sequences is preferably determined using the BLASTP / BLASTN algorithm [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
  • the reelin comprises a nudeotide sequence with 100% identity with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • expression levels of the gene encoding reelin can be determined by measuring the levels of the mRNA encoding reelin or by measuring the levels of the reelin protein. To do this, it is first necessary to isolate the mRNA or protein from the biological sample isolated from the subject.
  • biological sample refers to any sample obtained or from an individual that comprises nucleic acid, that is, the genetic material of living organisms that controls inheritance and is located in the nucleus of cells.
  • biological samples include, but are not limited to, biopsy, tissue, solid feces and biofluids, such as urine, feces, serum, saliva, semen, sputum, cerebrospinal fluid (CSF), tears, mucus, sweat, milk, brain extracts and the like.
  • the biological sample is selected from the group consisting of blood, biopsy and urine.
  • Said sample can be obtained by conventional methods, including, but not limited to, splitting a tumor into pieces, or microdissection or other cell separation methods known in the technique.
  • Cells can be further obtained by fine needle aspiration cytology. To simplify the conservation and handling of the samples, they can be fixed in formalin and embedded in paraffin or frozen first and then embedded in a cryosolidifiable medium, by immersion in a highly cryogenic medium that allows rapid freezing.
  • the biological sample is obtained, it is treated to physically or mechanically disintegrate the structure of the tissue or cell in order to release the intracellular components in an aqueous or organic solution and prepare the nucleic acids for further analysis.
  • the degradation of the mRNA during the extraction process is avoided, for example, with a combination of denaturants and RNase inhibitors present in the aqueous or organic solution where cells and tissues are disrupted and in the subsequent separation of the mRNA.
  • the mRNA obtained from a tissue sample fixed in formalin and embedded in paraffin can be isolated.
  • the mRNA can be isolated from an archival pathological sample or a biopsy sample that is first deparaffinized.
  • An exemplary deparaffinization method involves washing the sample in paraffin with an organic solvent, such as xylene.
  • Deparaffinized samples can be rehydrated with alcohol solutions of decreasing concentration. Suitable alcohols include, for example; methanol, ethanol, propanols, and butanols. The rehydrated sample is then lysed and the mRNA is extracted from the sample.
  • the expression level of the gene of interest is determined with techniques that are widely known to a person skilled in the art.
  • Illustrative, non-limiting examples of methods that can be used to determine expression levels include hybridization-based methods, such as Northem-blot analysis and in situ hybridization, quantitative PCR (qPCR), reverse transcription or reverse transcription (RT-). PCR), single molecule detection, bead-based flow cytometry methods, serial analysis of gene expression, expression microarrays or TaqMan, and assays using nucleic acid arrays.
  • Expression levels are determined particularly by quantitative real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR), where the procedure is based on the reverse transcription of RNA to coding DNA (cDNA) and subsequent amplification of the cDNA by quantitative PCR, using cycles thermals and a thermostable DNA polymerase.
  • qRT-PCR quantitative real-time reverse transcription PCR
  • a probe or primer is an oligonucleotide of defined sequence capable of specifically hybridizing with a complementary sequence of a nucleic acid, thus it can be used to detect and identify complementary or substantially complementary sequences in nucleic acids.
  • the length of the probe of the invention can vary within a wide range, although, for practical reasons, small length probes of no more than 30 nudeotids are preferred, preferably no more than 25 nudeotides, and more preferably no more than 20 nudeotids.
  • the oligonudeotides used may contain modified bonds such as phosphodiester, phosphotriester, phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoroselenoate, phosphorodiselenoate, phosphoanilothioate, phosphoramidate, methylphosphonate, boranophosphonate type bonds, as well as nucleic acid peptides or peptide combinations themselves PNA), in which the various nudeotides are linked by amide bonds.
  • PNA nucleic acid peptides or peptide combinations themselves PNA
  • the specific primers are reelin sense primer: 5'-CCACGAGAACTGATTACCAC-3 '(SEQ ID NO: 2) and antisense primer: 5'-ATTGTGCTGACATTGGAAGG-3' (SEQ ID NO: 3).
  • a comparative method is necessary with an internal standard, for example, with the level of messenger RNA of a housekeepincf or housekeeping gene, present in the same sample, at control gene or normalizer gene mode.
  • the normalizing gene is a gene whose level of expression does not change in a cell, such as a housekeeping gene that encodes a constitutively expressed protein that performs essential cellular functions.
  • Housekeeping genes suitable for use as internal standards include, but are not limited to, myosin, b-2-microglobulin, ubiquitin, 18S ribosomal protein, cyclophilin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH), and b-actin.
  • an RNA including, without limitation, snRNA U6 or snRNA RNU48 can be taken as normalizer.
  • the control RNA is b-actin mRNA.
  • the level of expression of reelin is determined by calculating the number of cycles necessary to reach a threshold level of fluorescence (Ct) using the formula:
  • said comparative method was relativized with an internal standard, which is preferably b-actin, by the formula: DDCt - [(Ct reelin - Ct b-actin) pathological sample- (Ct reelin - Ct b- actin) healthy control]
  • the expression levels of the gene encoding reelin can also be determined by measuring the amount of protein present in the sample.
  • the expression levels of the gene encoding reelin are determined by measuring the expression levels of the protein encoded by the reelin gene, that is, the RELN protein.
  • the RELN protein comprises an amino acid sequence with a sequence identity of at least 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% with the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the RELN protein comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 7.
  • identity between two amino acid / nucleotide sequences is preferably determined using the BLASTP / BLASTN algorithm [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
  • the determination of the expression levels of the proteins can be carried out by immunological techniques such as, for example, ELISA, immunohistochemistry or western blot.
  • the westem-blot technique is based on the detection of proteins, previously separated by gel electrophoresis under denaturing conditions and immobilized on a membrane (generally nitrocellulose), by incubation with a specific antibody and a developing system (for example, chemiluminescence) .
  • Immunohistochemical analysis requires the use of an antibody specific to the target protein for expression analysis.
  • ELISA analysis is based on the use of enzyme-labeled antigens and antibodies, so that conjugates formed between the target antigen and the labeled antibody result in the formation of enzymatically active complexes.
  • one of the components (the antigen or the labeled antibody) is immobilized on a support, so are the antigen-antibody complexes and can be detected by adding a substrate that is converted by the enzyme into a product that is detectable. by, for example, spectrophotometry or fluorometry.
  • any antibody or reagent that binds to the target proteins with high affinity can be used to detect the amount of the target proteins.
  • an antibody is preferred, for example, polyclonal sera, hybridoma supernatants or monoclonal antibodies, antibody fragments, Fv, Fab, Fab 'and F (ab') 2, scFv, diabodies, tribodies, tetrabodies and humanized antibodies.
  • the determination of the protein expression levels can be carried out by constructing a tissue microarray (TMA) containing the assembled samples of the subjects, and determining the protein expression levels by means of immunohistochemical techniques, known in the state of the art.
  • TMA tissue microarray
  • the forecasting method of the Invention comprises a step (b) that comprises comparing the expression levels obtained in step (a) with a reference level.
  • the term "reference level" refers to a predetermined criterion used as a reference to evaluate the values or data obtained from samples collected from a subject.
  • the reference value or reference level can be an absolute value, a relative value, a value that has an upper or lower limit, a range of values, an average value, a median value, a mean value, or a value in comparison with a particular control or reference value.
  • the reference value can be based on an Individual sample value, such as, for example, a value obtained from a sample of the subject being tested, but at an earlier time. Also, the reference value can be based on a large number of samples, such as the population of subjects in the chronological age group, or on a group of samples that include or exclude the sample to be analyzed.
  • the reference level is the level of expression of refill in healthy intestine tissue. More preferably, said level of expression of refill is given the absolute value of one to evaluate and compare the values or data obtained from samples of sick subjects, resulting in Increase or decrease in number of times with respect to the reference value. .
  • higher expression levels with respect to a reference value refers to any statistically significant variation in the expression level of a gene above its corresponding reference level, in particular, to any variation in the expression level of it replenishes it above the expression level in a healthy control.
  • lower expression levels with respect to a reference value refers to any statistically significant variation in the expression level of a gene below its corresponding reference level, in particular, to any variation in the expression level of the reelin below the expression level in a healthy control.
  • the present invention relates to an in vitro method for diagnosing an intestinal disease in a subject, hereinafter “diagnostic method of the invention” or “second method of the invention”, comprising
  • step (b) comparing the expression levels obtained in step (a) with a reference level, in which: if the expression levels of the gene encoding reelin are 5 times greater than or equal to the reference level, then the individual you have an inflammatory bowel disease,
  • the individual if the expression levels of the gene encoding reelin are up to 5 times lower than the reference level, then the individual suffers from an adenoma, or if the expression levels of the gene encoding reelin are at least 5 times lower or equal to the baseline level, then the individual has an adenocarcinoma.
  • intestinal disease and "subject”, as well as their corresponding particular embodiments, have been defined and explained in the previous inventive aspect and are applicable to the diagnostic method of the invention.
  • the subject is a mammal, preferably a primate, more preferably, a human.
  • diagnosis or “diagnose” is understood as the process or act of recognizing, deciding or concluding about a disease or condition in a subject, based on the symptoms, signs and / or results of different variables, such as, for example, knowing the presence, absence and / or quantity of one or more characteristic biomarkers of the disease or condition to be diagnosed.
  • diagnosis of intestinal diseases in a subject may mean, in particular, that the subject suffers or is suffering from an intestinal disease.
  • the diagnostic method of the invention comprises two stages:
  • step (b) comparing the expression levels obtained in step (a) with a reference level.
  • the gene encoding reelin comprises a nucleotide sequence with a sequence identity of at least 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 99% with the sequence SEQ ID NO: 1, and / or
  • the quantification of the expression levels of the gene that codes for reelin comprises the quantification of the messenger RNA (mRNA) of said gene or of the coding DNA (cDNA) of said gene, preferably, said quantification is carried out by means of a chain reaction of polymerase, in situ hybridization, or by means of a DNA or RNA array, and / or
  • the quantification of the expression levels of the gene that codes for reelin comprises the quantification of the levels of protein encoded by said gene, preferably, said quantification is carried out by western blot, ELISA or a protein array, and / or
  • the biological sample is selected from the group consisting of blood, biopsy, urine.
  • the individual if the expression levels of the gene encoding reelin are up to 5 times lower than the reference level, then the individual suffers from an adenoma, or if the expression levels of the gene encoding reelin are at least 5 times lower or equal to the baseline level, then the individual has an adenocarcinoma.
  • the individual if the expression levels of the gene encoding reelin are up to 5 times lower than the reference level, then the individual suffers from an adenoma, or if the expression levels of the gene encoding reelin are at least 5 times lower or equal to the baseline level, then the individual has an adenocarcinoma.
  • intermediate values are transitional states between the diseases that can be corrected with anatomo-pathological analyzes.
  • the implementation of the first and second methods of the invention comprises the use of a set of reagents that can be comprised within a kit.
  • kits of the invention that comprises the reagents necessary to determine the expression levels of the gene encoding reelin, hereinafter "kit of the invention", wherein said reagents comprise:
  • kit is understood as a product that comprises the different reagents necessary to carry out the methods of the invention adapted to allow the transport and storage of said reagents.
  • Suitable materials for packaging the kit components can be plastic (such as polyethylene, polypropylene, polycarbonate, and the like), glass, and can comprise bottles, jars, sachets, etc.
  • the kit of the invention may contain instructions for the simultaneous, sequential or separate use of the different components found in the kit. Said instructions can be in the form of printed material, or in the form of an electronic medium capable of storing instructions, such as storage discs (magnetic discs), optical methods (CD-ROM, DVD, etc.) and the like.
  • agents necessary to determine the levels of expression of a gene means a compound or group of compounds that make it possible to determine the level of expression of a gene, both by determining the level of mRNA of the gene that encodes reelin, such as by determining the protein level.
  • the pair of primers comprises the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the gene that encodes reelin comprises a nucleotide sequence with a sequence identity of at least 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 99% with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the kit can be used to practice the first and second methods of the invention.
  • the present invention relates to the in vitro use of the kit of the Invention to determine the prognosis of an intestinal disease in a subject.
  • the present invention relates to the in vitro use of the kit of the invention to diagnose an intestinal disease in a subject.
  • the present invention relates to the in vitro use of the kit of the invention for the implementation of the prognostic method of the invention or the diagnostic method of the invention.
  • Human tissue samples Human tissue samples were used from biopsies or colon resections of patients: i) with ulcerative colitis, ii) non-adenomatous polyps, iii) adenomas and iv) adenocarcinomas and v) from regions of the colon remote from the tumor (colon healthy). The samples were embedded in paraffin and 10 ⁇ m thick sections were used. They were provided by the Biobank of the Andalusian Public Health Service. Samples from 9 patients (men and women) of each pathology were used, aged between 25 and 65 years in the case of ulcerative colitis and between 45 and 80 years in the others.
  • RNA Isolation of RNA from biological samples
  • 2 and 5 sections (depending on their size) of each type of sample, previously deparaffinized, were used.
  • the sections were incubated in pre-heated xylene at 60 ° C for 15 min and then transferred to microtubes for washing, first twice with xylene and then twice with ethanol (96-100%), in this way improved insulation performance.
  • RNA was isolated, its purity, concentration and integrity were determined by: i) the ratio of absorbances measured, by spectrophotometry ("Nanodrop"), at wavelengths 260 nm (A260) and 280 nm (A280) (A260 / A280 ratio); being considered acceptable with a value of this ratio greater than or equal to 1, 8; ⁇ I) by performing 1% agarose gel electrophoresis and using the nucleic acid staining solution "RedSafe" (Intron Biotechnology, catalog no. 21141), which allows the visualization of the ribosomal RNA bands 28S and 18S, which they should appear in an approximate 2: 1 ratio; and iii) checking for the presence of genomic DNA whose presence would be detected in the upper part of the gel.
  • RNA into coding DNA cDNA
  • kit “QuantiTect Reverse Transcription” (Quiagen, catalog no. 205311) was used and the manufacturer's instructions were followed.
  • the possible genomic DNA present in the sample was first eliminated by a treatment with deoxyribonucleases (DNAses) and then the retro-transcription itself was carried out with the reverse transcriptase enzyme from the kit.
  • RNA was incubated with 1 mL of the reverse transcriptase enzyme, 1 mL of the mixture of kit primers and 4 mL of the kit reaction solution at 42 ° C for 15 minutes, followed by incubation at 95 ° C for 3 minutes to inactivate the enzyme.
  • the amplification reaction was performed in a MiniOpticon TM thermal cycler (Bio-Rad) according to the following protocol: a first denaturation step of the cDNA for 3 minutes at 95 ° C; subsequently, thirty-five cycles comprising: 40 seconds at 94 ° C, 40 seconds at 58 ° C and 40 seconds at 72 ° C and, finally, an elongation step of 3 minutes at 72 ° C.
  • Obtaining a single product in PCR was confirmed by the appearance of a single peak in the analysis of the dissociation curves. These were obtained by heating the sample from 65 ° C to 95 ° C at 1 ° C intervals and monitoring the fluorescence. This curve represents the temperature at which the DNA strands separate or the melting temperature versus the fluorescence emitted by the PCR product. The melting temperature is specific for each amplified DNA fragment.
  • the PCR reaction was done in triplicate for each cDNA and for each primer pair and a control that had no cDNA was included. The PCR reaction was considered valid when its efficiency was between 90 and 110%.
  • Colon cancer develops following a sequence that goes from the appearance of inflammation or precancerous lesions to the development of colon adenocarchonomas.
  • Results of our research group carried out in mice showed that during acute colitis there was an increase in the expression of reelin, which suggested the participation of reelin in the repair and / or regeneration of the tissues damaged in said pathology.
  • mouse colon adenocarcinoma we observed a decrease in reelin expression.
  • the absence of reelin increased the susceptibility of mice to the development of inflammation and cancer.
  • Figure 1 shows the number of times that the abundance of reelin mRNA changes in each pathology with respect to the healthy colon.
  • the results reveal that, with respect to the healthy colon, this abundance increases about 10 times in the ulcerative colitis samples (10.15 ⁇ 3.39 times), slightly in the polyps (2.78 ⁇ 0.30 times) and decreases progressively as the severity of the disease progresses in adenomas (-2.96 ⁇ 1.04 times) and adenocarcinomas (-12.74 ⁇ 5.29 times).
  • Table 1 shows the reference values for the number of times the reelin mRNA expression changes to diagnose each pathology.
  • an increase in reelin expression of more than 7 times would indicate that it is a sample with an inflammatory process; if the increase is up to 3 times, we find a non-adenomatous polyp; if it decreases with respect to the healthy colon, it would indicate a carcinogenic process; if the decrease is up to 4 times, it would be classified as a low grade dysplasia adenoma, and if it is greater than 7 times it would indicate an adenocarcinoma.
  • Intermediate values could be transitional states that can be corroborated with anatomopathological analyzes.
  • Table 1 Reference values for reelin mRNA expression levels.
  • reelin expression decreases with the severity of the disease. Without being bound by any theory, it is thought that in response to tissue damage, such as inflammation or precancerous lesions in the colon, reelin expression increases to re-establish the intestinal barrier and possibly facilitate tissue repair, but repression of the Reelin expression indicates that the microenvironment has changed to one that favors the development of more serious lesions such as adenomas or adenocarcinomas. Since the reelin expression is modifies as the pathology progresses, we propose reellna as a marker in the transition between Inflammatory Bowel disease and colon cancer, in addition to being useful for the evaluation of the clinical prognosis.

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Abstract

La reelina puede ser utilizada como un único biomarcador en el diagnóstico e identificación de diferentes patologías intestinales y como biomarcador de la transición desde una enfermedad inflamatoria intestinal hasta fumorogénesis. Los inventores han demostrado que, en respuesta a un daño tisular, como la inflamación, el intestino responde aumentando la expresión de reelina para reforzar la barrera intestinal y facilitar la reparación tisular. Si la inflamación progresa, se establecen las condiciones que reducen o suprimen la expresión de reelina, donde dicha ausencia favorece la formación de un microambiente desfavorable que agravaría la inflamación y/o induciría la tumorogénesis.

Description

D E S C R I P C I Ó N
Uso de la reelina como biomarcador de enfermedades intestinales
La presente invención se refiere a la reelina como único biomarcador para el diagnóstico e identificación de diferentes patologías intestinales y como biomarcador de la transición desde una enfermedad inflamatoria intestinal hasta tumorogénesis.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El epitelio intestinal forma parte de una de las mayores superficies que separa nuestro medio intemo del exterior, participa en la digestión y absorción de nutrientes y es un componente clave en la barrera intestinal, impidiendo el paso al medio interno de un amplio espectro de microorganismos y sustancias potencialmente cancerígenas presentes en la luz del intestino. El epitelio, junto a su vía paracelular sellada por las uniones ocluyentes, supone la principal barrera física de la barrera intestinal. Además, el epitelio, produce componentes de la barrera intestinal como son la capa de moco y los péptidos antimicrobianos, y secreta IgA desde el medio subepitelial a la luz del intestino. Otros componentes de la barrera intestinal son la microbiota, situada por encima de la capa de moco y el sistema inmune asociado al intestino (Viggiano d„ et al. Eur. Rev. Med Pharmacol Sci 19 (2015) 1077-1085).
La agresión constante del epitelio por parte del contenido luminal supone una amenaza para su integridad si no existieran mecanismos que lo eviten. El epitelio intestinal se renueva cada 3-5 días a partir de células madre localizadas en las criptas intestinales, que continuamente se están dividiendo y que, a medida que migran a lo largo de las vellosidades (intestino delgado) o hacia la superficie (colon), se diferencian en enteradlos (intestino delgado) o colonodtos (colon), células productoras de moco (células goblet) y células enteroendocrinas que eventualmente mueren y se liberan a la luz del intestino (Sellers RS., et al. Toxicol Pathol 42 (2014) 67-81). En el intestino delgado hay una pobladón adicional de células diferendadas, las células de Paneth, que migran hada el fondo de las criptas y son las productoras de la mayor parte de péptidos antimicrobianos. (Viggiano d., et al. Eur. Rev. Med Pharmacol Sd 19 (2015) 1077-1085). Una desreguladón de la homeostasis epitelial (por ejemplo, un desequilibrio entre producdón, diferendadón y eliminadón celular) compromete la integridad de la barrera intestinal y si no se re-establece provocará patologías intestinales como la inflamación y el cáncer (Viggiano d., et al. Eur. Rev. Med Pharmacol Sci 19 (2015) 1077-1085). La enfermedad inflamatoria del intestino es un trastorno inflamatorio crónico del tracto intestinal padecido por millones de pacientes en todo el mundo y se compone de dos tipos de enfermedades principales: colitis ulcerosa (UC) y enfermedad de Crohn (CD). En ambas formas de inflamación, los microbios intestinales pueden iniciar la enfermedad en individuos genéticamente susceptibles.
La colitis ulcerosa es una enfermedad inflamatoria del colon y del recto. Está caracterizada por la inflamación y ulceración de la pared interior del colon. Los síntomas típicos Incluyen diarrea (algunas veces con sangre) y con frecuencia dolor abdominal. Su edad de presentación típica es antes de los primeros 40 años de vida; sin embargo, se ha llegado a establecer el diagnóstico en personas de edad avanzada. El diagnóstico se establece realizando una endoscopia digestiva baja (rectoscopia o colonoscopia) que permite el examen de la mucosa del colon mediante una cámara. En el caso de la colitis ulcerosa, la mucosa se observa con evidentes signos inflamatorios como enrojecimiento mucoso, ulceraciones, presencia de moco y material fibrinoide y los llamados pseudopólipos. Para su confirmación definitiva se deben tomar biopsias, que deben ser examinadas por un patólogo.
La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria crónica con manifestaciones intermitentes que afectan principalmente al tracto gastrointestinal, en toda su extensión («desde la boca hasta el ano»). Junto con la colitis ulcerosa forma parte de las llamadas enfermedades inflamatorias intestinales. El origen exacto de la enfermedad es desconocido, pero se han reconocido factores inmunológicos, microbiológicos, ambientales y genéticos que aumentan el riesgo de padecerla. La hipótesis más aceptada, en cuanto a la importancia de estos factores, señala que existe una susceptibilidad individual determinada genéticamente, pero que se requieren la incidencia de factores ambientales para que se desarrolle la enfermedad. Entre ellos, la desregulación de la microbiota está cobrando cada vez mayor importancia. El diagnóstico de la enfermedad de Crohn se realiza con la sospecha clínica y los hallazgos radiológicos, endoscópicos e histológicos (biopsia) compatibles. La analítica de sangre se altera en las fases agudas de la enfermedad con elevación de la velocidad de sedimentación (VSG y de la proteína C reactiva), aumento de las cifras de glóbulos blancos y de plaquetas. Los estudios radiológicos (TAC, ecografía, tránsito intestinal) ponen de manifiesto las posibles complicaciones de estas entidades (abscesos, fístulas, estenosis). La gammagrafía con leucocitos marcados puede permitir valorar la extensión de la inflamación. En el momento de la aparición de los síntomas, el médico debe diferenciar de otras enfermedades que pueden también cursar con brotes de diarrea, dolor abdominal con sangre y/o fiebre.
Existen biomarcadores para determinar la presencia de una patología intestinal y/o su pronóstico. Las proteínas calprotectina, lactoferrina y S100A12 se utilizan como marcadores fecales de la inflamación intestinal (Galgut BJ., et al. Front Pediatr 19. 5- 292. (2018) Review). Para la prognosis del cáncer colorectal actualmente se utiliza la presenda en heces de sangre ocultay de la proteína vimentina y de las proteínas CEA (antígeno cartinoembrionico) y CA19-9 (antígeno de carbohidrato 19-9) en sangre, entre otras (González-Pons M., et al. Biomed Res Int. (2015) 149014. Review). Se han propuesto diferentes proteínas como biomarcadores de la progresión de la patología intestinal (Rubio CA., et al. Anticancer Res 35 (7). (2015):4139-44; Gerecke C., et al. J Cáncer Res Clin Oncol. 141(2015) 2097-107; Altobelli E., et al. Oncol Rep. 38(1) (2017) 418-426), pero la correladón de la expresión de las proteínas estudiadas con el grado de gravedad de la lesión no es buena y los métodos propuestos para su detecdón no son eficaces.
La detecdón de enfermedades intestinales, más particularmente de las inflamatorias y la tumorogénesis, basándose en analíticas de sangre, biopsias, endoscopias o estudios radiológicos es limitante para una detecdón precoz y fiable. Adicionalmente, uno de los motivos para la aparidón de tumorogénesis es un proceso inflamatorio crónico prolongado en el tiempo, debido a que los mecanismos reparadores activados para contrarrestar la lesión ocasionada por la inflamación se vuelven ineficaces y el tejido comienza a proliferar sin control.
Por tanto, se hace necesario proporcionar nuevos biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y la monitorizadón de la transidón desde una enfermedad inflamatoria intestinal hasta la tumorogénesis de manera efectiva y rápida. El tiempo y un diagnóstico correcto para la elecdón eficaz del tratamiento son determinantes para evitar el agravamiento de la patología, que de lo contrario, podría llegar a ser irreversible.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se ha demostrado el uso de los niveles de expresión de reclina como biomarcador de diagnóstico, pronóstico y/o monitorización de patologías intestinales.
La reelina es una proteína de la matriz extracelular conocida desde hace unos 70 años por su función en el desarrollo del sistema nervioso central. El estudio de la expresión y función de la reelina en tejidos periféricos ha sido, hasta ahora, escasamente abordado.
Los inventores han demostrado que, en respuesta a un daño tisular como la inflamación, el intestino aumenta la expresión de reelina para reforzar la barrera intestinal y facilitar la reparación tisular. Si la inflamación progresa, se establecen las condiciones que reducen o suprimen la expresión de reelina, donde dicha ausencia favorece la formación de un microambiente desfavorable que agravaría la inflamación y/o induciría la tumorogénesis.
En muestras de tejido humano procedentes de biopsias o resecciones de colon enfermo procedente de pacientes con colitis ulcerosa, con pólipos no adenomatosos, con adenomas o con adenocarcinomas, y de colon sano, los inventores determinaron los niveles de expresión de reelina mediante aislamiento de ARN de las muestras, retrotranscripción y posterior PCR ( Reacción en Cadena de la Polimerasa). Así, los inventores observaron que la expresión del ARN mensajero ( ARNm ) de la reelina aumenta más de 5 veces, respecto al control sano, en estados de inflamación intestinal, disminuyendo progresivamente conforme va avanzando la gravedad de la enfermedad, siendo el nivel de expresión del ARN mensajero en adenocarcinomas más de 5 veces inferior al control sano.
Por lo tanto, la reelina puede ser utilizada como un único biomarcador en el diagnóstico e identificación de diferentes patologías intestinales, y como biomarcador de la transición desde una enfermedad inflamatoria intestinal hasta la tumorogénesis. A la vista de lo anterior, en un aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para determinar el pronóstico de una enfermedad intestinal en un sujeto, de aquí en adelante“primer método de la invención" o“método de pronóstico de la invención”, que comprende
a) cuantificar los niveles de expresión del gen que codifica la reelina en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia,
de manera que unos niveles de expresión del gen que codifica la reelina mayores que el de referencia, indican que la enfermedad intestinal es leve y el pronóstico es bueno, mientras que unos niveles de expresión del gen que codifica la reelina menores que el de referencia indican que la enfermedad intestinal es grave y el pronóstico es malo.
En la presente invención se entiende por“determinar el pronóstico” a determinar la probabilidad de que un paciente tenga un resultado clínico concreto, ya sea bueno/positivo/leve o malo/negativo/grave, es decir, a una anticipación del progreso de una enfermedad, por ejemplo, la probabilidad, la duración y/o la extensión de la recuperación. Tal como se usa en el presente documento, los términos“predicción” y “pronóstico” son equivalentes. El método de pronóstico de la invención puede ser utilizado clínicamente para tomar decisiones sobre la elección del tratamiento más adecuado para cada paciente en particular. En general, el término pronóstico“bueno” abarca la anticipación de una recuperación parcial o completa y el no empeoramiento de la patología intestinal dentro de un periodo de tiempo dado. Por el contrario, un pronóstico “malo” abarca la anticipación de una recuperación deficiente y/o recuperación insatisfactoriamente lenta, o sustancialmente la no recuperación.
El método de pronóstico de la presente invención es aplicable a enfermedades intestinales. En la presente invención se entiende por“enfermedades intestinales”, o “patología intestinal", a aquellas enfermedades que afectan al intestino, tanto al intestino grueso como al delgado o cualquiera de sus partes (colon, recto, íleon, duodeno y/o yeyuno), e impide que éste desempeñe su función de forma correcta. El término“intestino delgado" se refiere a la porción del tubo digestivo que se inicia en el estómago y llega hasta el colon. Es el más largo y en él se lleva a cabo la parte final de la digestión y la absorción de las sustancias nutritivas de los alimentos. Tiene vellosidades intestinales para aumentar el número de células epiteliales, y microvellosidades para aumentar la superficie de contacto entre las sustancias nutritivas y las células del epitelio intestinal, que son las encargadas de absorberlas. El término“colon", se refiere a la parte de intestino grueso que tiene forma de U invertida y que, en la cavidad abdominal, está situado por delante del intestino delgado. Al igual que el intestino delgado, el colon contiene microorganismos (bacterias, virus y hongos) que constituyen la flora intestinal, mucho más abundante en el colon que en el intestino delgado. Esta flora fermenta los residuos alimenticios que no son digeridos por nuestro intestino, obteniendo de ellos sustancias aprovechables por el ser humano. Además, a lo largo del intestino se absorbe una gran cantidad de agua y la que se absorbe en el colon hace que los residuos de los que no se pueden obtener sustancias nutritivas queden deshidratados formando heces, que se acumulan y se evacúan finalizando el proceso de la digestión. Ejemplos de enfermedades intestinales incluyen, pero no se limitan a, las enfermedades inflamatorias, las enfermedades carcinogénicas, la constipación, la enfermedad diverticular, los pólipos, los adenomas, el síndrome del intestino irritable y las úlceras. En una realización particular del método de pronóstico de la invención, la enfermedad intestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal, pólipos intestinales, un adenoma o un adenocarcinoma intestinal.
En la presente invención, el término“enfermedad inflamatoria intestinal” (Eli) se refiere a enfermedades que afectan al intestino y que se caracterizan por producir una inflamación crónica. Ejemplos de enfermedades inflamatorias intestinales incluyen, sin limitar, a diarreas, peritonitis, colitis ulcerosa, síndrome del colon irritable y la enfermedad de Crohn. En una realización particular del método de pronóstico de la invención, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
Tal como se usa en la presente invención, el término“pólipo intestinal” o“pólipo no adenomatoso" se refiere a una masa benigna en el revestimiento del colon o del recto, por lo que no evoluciona a cáncer ni se disemina.
En la presente invención se entiende por“pólipo adenomatoso" o“adenoma” a la proliferación no invasiva de células epiteliales. Se trata de una masa maligna en el revestimiento del colon o del recto que, aun siendo no invasiva, puede evolucionar a cáncer y, eventualmente, diseminarse. Dentro del término“adenoma” se incluyen, sin limitarse, a un adenoma tubular (sobresale en el lumen del colon), un adenoma tubulovelloso y adenoma velloso.
En el contexto de la presente invención, el término“adenocarcinoma” se refiere a aquella enfermedad carcinogénica que empieza en las células glandulares del intestino o en las criptas. El término“enfermedades carcinogénicas” o“cáncer” se refiere a la enfermedad que se produce como consecuencia de un proceso descontrolado en la división celular del cuerpo, generando una masa anormal (tumor) de tejido cuyo crecimiento excede el de los tejidos normales, está descoordinado, y que persiste del mismo modo excesivo aún después de finalizar el estímulo que le dio origen. Ejemplos de adenocarcinomas incluyen, sin limitar, a tumores carcinoides, cáncer colorrectal y cáncer gastrointestinal
Tal como se usa en la presente Invención, el término“sujeto” o“Individuo” se refiere a cualquier animal que tenga aparato digestivo, en concreto, intestino. El sujeto puede ser un animal invertebrado o vertebrado. Ejemplo de animales invertebrados incluyen, sin limitar a, los artrópodos tales como insectos y crustáceos. Ejemplos de animales vertebrados incluyen, sin limitar a, peces, aves, anfibios, reptiles y mamíferos. Ejemplos de mamíferos incluyen, sin limitar a, animales de granja (tales como caballos, cerdos, conejos, ovejas, cabras, vacas, etc.), animales de compañía (tales como perros, gatos, cobayas, ratas, ratones, etc.), primates no humanos, y humanos. El término no indica una edad o sexo particular. En una realización particular, el sujeto del método de pronóstico de la invención es un mamífero, preferiblemente un primate, más preferiblemente, un ser humano de cualquier raza, sexo o edad.
En una primera etapa, el método de pronóstico de la invención comprende cuantificar los niveles de expresión del gen que codifica la reelina en una muestra biológica aislada de dicho sujeto. La reelina (o proteína RELN, RL o PR01598) es una proteína de señalización extracelular que interviene en la regulación de los procesos de migración neuronal y posicionamiento en el desarrollo del cerebro, pero que continúa trabajando en el cerebro ya desarrollado modulando la plasticidad sinóptica y mejorando la inducción y el mantenimiento de la memoria a largo plazo. En el ser humano, el gen que codifica la reelina se encuentra en cromosoma 7q22 y presenta la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 (NCBI Reference Sequence NM_005045 versión NM_005045.2). En la presente Invención, dentro del término“reellna” están contemplados todas aquellas variantes de la reellna que, aun teniendo diferentes secuencias de nudeótidos debido a mutaciones neutras de los nudeótidos (sustituciones conservativas), desempeñan la misma fundón que la reelina en el ser humano. Así, en una realizadón particular de la invendón, el gen que codifica la reelina comprende una secuencia de nudeótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la secuenda SEO ID NO: 1. El grado de identidad se determina usando algoritmos y procedimientos informáticos que son ampliamente conoddos para el experto en la materia. La identidad entre dos secuendas de aminoáddos/nudeótidos se determina preferentemente usando el algoritmo BLASTP/BLASTN [BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894, Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]. En otra realización más particular, la reelina comprende una secuenda de nudeótidos con un 100% de identidad con la secuenda SEQ ID NO: 1. Dentro del contexto de la presente invendón, también se encuentran aquellos fragmentos de la secuenda de nudeótidos del gen de la reelina que, aun caredendo de parte de los extremos 5’ o 3’, son capaces de desempeñar su fundón. Como entiende el experto en la materia, los niveles de expresión del gen que codifica la reelina se pueden determinar midiendo los niveles del ARNm que codifica la reelina o midiendo los niveles de la proteína reelina. Para ello, primero es necesario aislar el ARNm o la proteína de la muestra biológica aislada del sujeto.
El término "muestra biológica", como se usa en la presente invendón, se refiere a toda muestra obtenida o procedente de un individuo que comprende el áddo nucleico, es decir, el material genético de los organismos vivos que controla la herenda y se localiza en el núdeo de las células. Ejemplos de muestras biológicas induyen, sin limitar, a biopsia, tejido, heces sólidas y biofluidos, tales como orina, heces, suero, saliva, semen, esputo, líquido cefalorraquídeo (LCR), lágrimas, moco, sudor, leche, extractos de cerebro y similares. En una realización particular del método de pronóstico de la invendón, la muestra biológica se selecdona del grupo que consiste en sangre, biopsia y orina. Dicha muestra se puede obtener mediante métodos convendonales, entre los que se induyen, sin limitar a, partidón de un tumor en trozos, o microdisecdón u otros métodos de separadón de células conoddos en la técnica. Las células se pueden obtener de forma adicional mediante citología por aspiración con una aguja fina. Para simplificar la conservación y el manejo de las muestras, estas se pueden fijar en formalina y embeber en parafina o congelar primero y después embeber en un medio criosolidificable, mediante inmersión en un medio altamente criogénico que permite la congelación rápida.
Una vez obtenida la muestra biológica se trata para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o célula para así liberar los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica y preparar los ácidos nucleicos para análisis adicionales. La degradación del ARNm durante el proceso de extracción se evita, por ejemplo, con una combinación de desnaturalizantes e inhibidores de ARNasas presentes en la solución acuosa u orgánica donde se rompen las células y tejidos y en la posterior separación del ARNm.
En una forma de realización particular, se puede aislar el ARNm obtenido de una muestra de tejido fijada en formalina y embebida en parafina. El ARNm se puede aislar de una muestra patológica de archivo o una muestra de biopsia que primero se desparafiniza. Un método de desparafinización de ejemplo implica lavar la muestra en parafina con un solvente orgánico, tal como xileno. Las muestras desparafinizadas se pueden rehidratar con soluciones de alcoholes de concentración decreciente. Los alcoholes adecuados, incluyen, por ejemplo; metanol, etanol, propanoles, y butanoles. La muestra rehidratada se lisa después y se extrae el ARNm de la muestra.
Una vez aislado el ARNm de la muestra biológica, se determina el nivel de expresión del gen de interés con técnicas que son ampliamente conocidas por un experto en la materia. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de métodos que pueden ser empleados para determinar los niveles de expresión incluyen métodos basados en hibridación, como análisis por Northem-blot e hibridación in situ, PCR cuantitativa (qPCR), PCR con transcripción reversa o retrotranscripción ( RT-PCR ), detección de moléculas individuales, métodos de citometría de flujo a base de perlas, análisis en serie de la expresión génica, microarrays de expresión o TaqMan y ensayos que usan matrices de ácidos nucleicos.
Mientras que todas las técnicas de determinación del perfil de expresión génica son adecuadas para determinar el nivel de expresión de reelina de la presente invención, los niveles de expresión se determinan particularmente mediante PCR con transcripción reversa cuantitativa en tiempo real ( qRT-PCR ), donde el procedimiento se basa en la retrotranscripción de ARN a ADN codificante (ADNc) y posterior amplificación del ADNc mediante una PCR cuantitativa, usando ciclos térmicos y una ADN polimerasa termoestable.
Para la determinación del nivel de expresión mediante qRT-PCR es necesario el empleo de sondas o cebadores. Una sonda o cebador es un oligonucleótido de secuencia definida capaz de hibridar de forma específica con una secuencia complementaria de un ácido nucleico, por lo que puede utilizarse para detectar e identificar secuencias complementarias o sustancialmente complementarias en ácidos nucleicos. La longitud de la sonda de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo, aunque, por razones prácticas, se prefieren sondas de longitud pequeña de no más de 30 nudeótidos, preferiblemente de no más de 25 nudeótidos y más preferiblemente de no más de 20 nudeótidos. Adidonalmente, los oligonudeótidos empleados pueden contener enlaces modificados tales como enlaces tipo fosfodiester, fosfotriéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoamidato, metilfosfonato, boranofosfonato, así como combinadones de los mismos o bien son péptidos áddos nudeicos (peptide nucleic acids, PNA), en los que los distintos nudeótidos están unidos por enlaces amida. El empleo de sondas de mayor o menor longitud no afectaría a la sensibilidad o espedfiddad de la técnica, pero podría predsar de la realizadón de una serie de modificadones de las condidones sobre las que se realiza la misma al variar la temperatura de fusión de las mismas y su contenido en GC, lo cual afectaría a la temperatura y tiempo de hibridación fundamentalmente.
En una realización preferida, los cebadores específicos para la reelina son cebador sentido: 5'-CCACGAGAACTGATTACCAC-3' (SEQ ID NO: 2) y cebador antisentido: 5'-ATTGTGCTGACATTGGAAGG-3' (SEQ ID NO: 3).
Para la cuantificación del nivel de expresión de la reelina mediante qRT-PCR, es necesario un método comparativo con un estándar intemo, por ejemplo, con el nivel de ARN mensajero de un gen de mantenimiento o“ housekeepincf , presente en la misma muestra, a modo de gen de control o gen normalizador. Preferiblemente, el gen normalizador es un gen cuyo nivel de expresión no cambia en una célula, tal como un gen de mantenimiento que codifica una proteína que se expresa de forma constitutiva y que lleva a cabo funciones celulares esenciales. Genes de mantenimiento adecuados para su uso como estándares intemos incluyen, aunque no se limitan, a miosina, b-2-microglobulina, ubiquitina, proteína ribosómica de 18S, ciclofilina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH) y b-actina. Alternativamente, puede tomarse como normalizador un ARN incluyendo, sin limitación, el snRNA U6 o el snRNA RNU48. En una realización preferida, el ARN control es el ARNm de la b- actina. En dicho método comparativo, el nivel de expresión de la reelina se determina con el cálculo de número de ciclos necesarios para alcanzar un nivel umbral de fluorescencia (Ct) mediante la fórmula:
2-DDCt
Donde DDCt es = (Ct muestra patológica— Ct control sano)
En una realización más preferida, se relativizó dicho método comparativo con un estándar interno, que preferiblemente es la b-actina, mediante la fórmula: DDCt — [(Ct reelina— Ct b-actina) muestra patológica- (Ct reelina— Ct b-actina) control sano]
Tal como se ha explicado anteriormente, los niveles de expresión del gen que codifica la reelina también pueden determinarse midiendo la cantidad de proteína presente en la muestra. Así, en una realización particular, los niveles de expresión del gen que codifica la reelina se determinan midiendo los niveles de expresión de la proteína codificada por el gen de reelina, es decir, la proteína RELN.
En una realización particular de la invención, la proteína RELN comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 7. En otra realización más particular, la proteína RELN comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7. Como se ha indicado anteriormente, la identidad entre dos secuencias de aminoácidos/nucleótidos se determina preferentemente usando el algoritmo BLASTP/BLASTN [BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894, Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]. La determinación de los niveles de expresión de las proteínas se puede realizar mediante técnicas inmunológicas tales como, por ejemplo, ELISA, inmunohistoquímica o westem-blot. La técnica de westem-blot se basa en la detección de proteínas, previamente separadas mediante electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes e inmovilizadas en una membrana (generalmente nitrocelulosa), mediante incubación con un anticuerpo específico y un sistema de revelado (por ejemplo, quimioluminiscencia). El análisis mediante inmunohistoquímica requiere el uso de un anticuerpo específico para la proteína diana para el análisis de la expresión. El análisis mediante ELISA está basado en el uso de antígenos y anticuerpos marcados con enzimas, de modo que los conjugados formados entre el antígeno diana y el anticuerpo marcado dan como resultado la formación de complejos enzimáticamente activos. Puesto que uno de los componentes (el antígeno o el anticuerpo marcado) está inmovilizado sobre un soporte, también lo están los complejos antígeno-anticuerpo y se pueden detectar mediante la adición de un sustrato que es convertido por la enzima en un producto que es detectadle mediante, por ejemplo, espectrofotometría o fluorometría.
Cuando se usa un método inmunológico, se puede usar cualquier anticuerpo o reactivo que se une a las proteínas diana con alta afinidad para detectar la cantidad de proteínas diana. Sin embargo, se prefiere el uso de un anticuerpo, por ejemplo, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados. Por otra parte, la determinación de los niveles de expresión de proteínas se puede llevar a cabo construyendo una micromatríz de tejidos (TMA) que contenga las muestras ensambladas de los sujetos, y determinar los niveles de expresión de las proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica, conocidas en el estado de la técnica. Una vez determinados los niveles de expresión, éstos tienen que ser correlacionados con un nivel de referencia. Los términos "correlacionar" o "correlación" o equivalentes de los mismos se refieren a una asociación entre expresión de un gen y otro suceso, tal como, pero no se limita a, fenotipo o característica fisiológica, tal como tipo de tumor. Así, el método de pronóstico de la Invención comprende una etapa (b) que comprende comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia.
El término "nivel de referencia" se refiere a un criterio predeterminado utilizado como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos de las muestras recopiladas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior o Inferior, un rango de valores, un valor promedio, un valor de mediana, un valor medio o un valor en comparación con un control particular o valor de referencia. El valor de referencia puede basarse en un valor de muestra Individual, como, por ejemplo, un valor obtenido de una muestra del sujeto que se está evaluando, pero en un momento anterior. También, el valor de referencia se puede basar en un gran número de muestras, como la población de sujetos del grupo de edad cronológica, o en un grupo de muestras que incluyen o excluyen la muestra a analizar.
En la presente Invención, el nivel de referencia es el nivel de expresión de reellna en tejido de Intestino sano. Más preferiblemente, a dicho nivel de expresión de reellna se le otorga el valor absoluto de uno para evaluar y comparar los valores o datos obtenidos de las muestras de sujetos enfermos, dando como resultado Incremento o disminución en número de veces con respecto al valor de referencia.
A partir de la correlación entre el nivel de expresión del gen que codifica la reellna y el nivel de referencia, se puede concluir que:
- unos niveles de expresión del gen que codifica la reellna mayores que el nivel de referencia, indican que la enfermedad Intestinal es leve y el pronóstico es bueno, mientras que
- unos niveles de expresión del gen que codifica la reellna menores que el nivel de referencia Indican que la enfermedad Intestinal es grave y el pronóstico es malo.
La expresión “unos niveles de expresión mayores con respecto a un valor de referencia” se refiere a cualquier variación estadísticamente significativa del nivel de expresión de un gen por encima de su correspondiente nivel de referencia, en particular, a cualquier variación del nivel de expresión de la reellna por encima del nivel de expresión en un control sano. La expresión “unos niveles de expresión menores con respecto a un valor de referencia” se refiere a cualquier variación estadísticamente significativa del nivel de expresión de un gen por debajo de su correspondiente nivel de referencia, en particular, a cualquier variación del nivel de expresión de la reelina por debajo del nivel de expresión en un control sano.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar una enfermedad intestinal en un sujeto, de aquí en adelante“método de diagnóstico de la invención” o“segundo método de la invención”, que comprende
a) cuantificar los niveles de expresión del gen que codifica la reelina en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia, en el que: si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son 5 veces mayores o iguales que el nivel de referencia, entonces el individuo padece una enfermedad intestinal Inflamatoria,
si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son hasta 5 veces mayores que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un pólipo intestinal,
si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son hasta 5 veces menores que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un adenoma, o si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son, al menos, 5 veces menores o iguales que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un adenocarcinoma.
Los términos “enfermedad intestinal” y “sujeto", así como sus correspondientes realizaciones particulares, han sido definidos y explicados en el anterior aspecto inventivo y son aplicables al método de diagnóstico de la invención.
Así, en una realización particular del método de diagnóstico de la invención, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un primate, más preferiblemente, un humano.
En la presente invención se entiende por“diagnóstico” o“diagnosticar" al proceso o acto de reconocer, decidir o concluir sobre una enfermedad o afección en un sujeto, basándose en los síntomas, signos y/o resultados de diferentes variables, tales como, por ejemplo, conocer la presencia, ausencia y/o cantidad de uno o más biomarcadores característicos de la enfermedad o afección que se va a diagnosticar. En la presente invención, el "diagnóstico de enfermedades intestinales” en un sujeto puede significar, en particular, que el sujeto sufre o padece una enfermedad intestinal.
El método de diagnóstico de la invención comprende dos etapas:
a) cuantificar los niveles de expresión del gen que codifica la reelina en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia.
La puesta en práctica de estas etapas, así como sus realizaciones particulares y términos empleados, han sido explicados anteriormente para el método de pronóstico de la invención, e igualmente son aplicables al método de diagnóstico de la invención.
Así, realizaciones particulares del método de diagnóstico de la invención, incluyen, sin limitarse a: el gen que codifica la reelina comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 1, y/o
la cuantificación de los niveles de expresión del gen que codifica la reelina comprende la cuantificación del ARN mensajero (ARNm) de dicho gen ó del ADN codificante (ADNc) de dicho gen, preferiblemente, dicha cuantificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa, hibridación in situ, o mediante un array de ADN o ARN, y/o
la cuantificación de los niveles de expresión del gen que codifica la reelina comprende la cuantificación de los niveles de proteína codificada por dicho gen, preferiblemente, dicha cuantificación se realiza mediante western blot, ELISA o un array de proteínas, y/o
la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, biopsia, orina.
Una vez llevados a cabo las etapas (a) y (b) del método de diagnóstico de la invención, se puede concluir que: si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son 5 veces mayores o iguales que el nivel de referencia, entonces el individuo padece una enfermedad intestinal inflamatoria,
si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son hasta 5 veces mayores que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un pólipo intestinal,
si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son hasta 5 veces menores que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un adenoma, o si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son, al menos, 5 veces menores o iguales que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un adenocarcinoma. En una realización más particular,
- si los niveles de expresión del gen que codifica la reclina son 7 veces mayores o iguales que el nivel de referencia, entonces el individuo padece una enfermedad intestinal inflamatoria,
- si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son hasta 3 veces mayores que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un pólipo intestinal,
- si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son hasta 4 veces menores que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un adenoma, o
- si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son, al menos, 7 veces menores o iguales que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un adenocarcinoma,
en donde los valores intermedios son estados transicionales entre las enfermedades que pueden corrotxirar con análisis anatomo-patológicos.
La puesta en práctica del primer y segundo métodos de la invención comprende el uso de un conjunto de reactivos que pueden estar comprendidos dentro de un kit.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un kit que comprende los reactivos necesarios para determinar los niveles de expresión del gen que codifica la reelina, de aquí en adelante“kit de la invención”, en donde dichos reactivos comprenden:
- una pareja de cebadores que híbrida de forma específica con la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la reelina, y/o
- una sonda que híbrida de forma especifica con la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la reelina, y/o
- uno o varios anticuerpos que reconocen de forma específica la proteína codificada por el gen que codifica la reelina. En la presente invención se entiende por“kit” como un producto que comprende los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de la invención adaptado para permitir el transporte y almacenamiento de dichos reactivos. Los materiales adecuados para el embalaje de los componentes del kit pueden ser de plástico (tales como polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), de cristal, y pueden comprender botellas, frascos, sobres, etc. Además, el kit de la invención puede contener instrucciones para el uso simultáneo, secuencial o separado de los diferentes componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden ser en forma de material impreso, o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones, tales como los discos de almacenamiento (discos magnéticos), métodos ópticos (CD-ROM, DVD, etc.) y similares.
La expresión“reactivos necesarios para determinar los niveles de expresión de un gen” significa un compuestos o grupo de compuestos que permiten determinar el nivel de expresión de un gen, tanto por medio de la determinación del nivel de ARNm del gen que codifica la reelina, como por medio de la determinación del nivel de proteína.
En una realización particular del kit de la invención, la pareja de cebadores comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. En otra realización particular, el gen que codifica la reelina comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 1.
Una vez que los reactivos están comprendidos dentro del kit, éste puede emplearse para poner en práctica el primer y segundo métodos de la invención. Así, en un aspecto, la presente invención se relaciona con el uso in vitro del kit de la Invención para determinar el pronóstico de una enfermedad intestinal en un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso in vitro del kit de la invención para diagnosticar una enfermedad intestinal en un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso in vitro del kit de la invención para la puesta en práctica del método de pronóstico de la invención o el método de diagnóstico de la invención.
Los términos“pronóstico", “diagnóstico”, “sujeto" y“enfermedad intestinal" han sido definidos previamente en la presente descripción y son aplicables a los presentes aspectos inventivos. Igualmente, las diferentes realizaciones particulares descritas para aspectos inventivos anteriores también son aplicables a los presentes aspectos inventivos.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 describe las variaciones relativas de los niveles de expresión de ARNm de reelina durante la progresión del cáncer de colon humano desde la inflamación intestinal comparado con un colon sano como control. Los valores representan el n° de veces que cambia la expresión en cada patología en relación al colon sano. Medias ± EEM (n=9). t de Student: *p<0,05; **p<0,01, patología vs. colon sano. El ANOVA reveló un efecto de la progresión de la enfermedad sobre la expresión de reelina (p<0,001). Test de Newman-Keuls: # p<0,01 patología vs. colitis ulcerosa. EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
I. MATERIAL Y MÉTODOS
Muestras de tejido humano Se utilizaron muestras de tejido humano procedente de biopsias o resecciones de colon de pacientes: i) con colitis ulcerosa, ii) pólipos no adenomatosos, iii) adenomas y iv) adenocarcinomas y v) de regiones del colon alejadas del tumor (colon sano). Las muestras estaban incluidas en parafina y se emplearon secciones de 10 pm de grosor. Fueron cedidas por el Biobanco del Servicio Sanitario Público de Andalucía. Se utilizaron muestras de 9 pacientes (hombres y mujeres) de cada patología, con edades comprendidas entre 25 y 65 años en el caso de las de colitis ulcerosa y entre 45 y 80 años en las demás. El estudio histopatológico, para confirmar el diagnóstico de las diferentes patologías y su ausencia en colon sano (control), se realizó en el Hospital Universitario Virgen del Rocío. El estudio que aquí se presenta fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Virgen del Rocío y los pacientes firmaron un consentimiento informado.
Aislamiento de ARN de las muestras biológicas Para extraer el ARN total se utilizaron entre 2 y 5 secciones (dependiendo de su tamaño) de cada tipo de muestra, previamente desparafinadas. Para la desparafinización las secciones se incubaron en xilol pre-calentado a 60°C durante 15 min y después se pasaron a microtubos para su lavado primero dos veces con xilol y después dos veces con etanol (96-100%), de esta forma se mejoró el rendimiento del aislamiento.
Tras este primer paso de desparafinado se continuó con el protocolo del fabricante del kit comercial “FFPE RNeasy” (Quiagen, n° catálogo 73504) para la extracción del ARN. Una vez aislado el ARN total se determinó su pureza, concentración e Integridad mediante: i) la relación de absorbencias medidas, mediante espectrofotometría (“nanodrop”), a las longitudes de onda de 260 nm (A260 ) y 280 nm (A280) (relación A260/A280); considerándose aceptable con un valor de esta relación mayor o igual a 1 ,8; ¡I) realizando una electroforesis en gel de agarosa al 1% y utilizando la solución de tinción de ácidos nucleicos“RedSafe” (Intron Biotechnology, n° catálogo 21141), que permite la visualización de las bandas de ARN ribosómico 28S y 18S, que deben aparecer en una proporción aproximada 2:1 ; y iii) comprobando la presencia de ADN genómico cuya presencia se detectaría en la parte superior del gel.
Retro-transcripción (RT)
En la retro-transcripción o transcripción reversa (conversión del ARN en ADN codificante, ADNc) se utilizó el kit comercial “QuantiTect Reverse Transcription” (Quiagen, n° catálogo 205311) y se siguieron las instrucciones del fabricante. En este protocolo, primero se eliminó el posible ADN genómico presente en la muestra mediante un tratamiento con enzimas desoxirribonucleasas (DNAsas) y después se realizó la retro-transcripción propiamente dicha con la enzima transcriptasa reversa del kit. Brevemente, tras incubar 1 mg del ARN con 2 mL de la solución de DNAsas del kit a 42°C durante 2 minutos, se realizó la retro-transcripción incubando el ARN con 1 mL de la enzima transcriptasa reversa, 1 mL de la mezcla de cebadores del kit y 4 mL de la solución de reacción del kit a 42°C durante 15 minutos, seguido de una incubación a 95°C durante 3 minutos para inactivar a la enzima.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real
Para la reacción de amplificación por PCR en tiempo real se utilizó: 1 mL del ADNc obtenido de cada muestra, 1 mL de cebadores específicos para la reelina (Gene bank ID: NM_005045, versión NM_005045.2); sentido:
Figure imgf000021_0004
[SEQ ID NO: 2] y antisentido: [SEQ ID NO: 3]), 10
Figure imgf000021_0003
mL de la enzima“SsoFast EvaGreen Supermix” (BioRad, n° catálogo 1725200) y se completó con agua destilada estéril para un volumen final de 20 mL. La concentración final de los cebadores en la reacción fue de 0,4 mM. Para normalizar los valores de ARN mensajero (ARNm) de las diferentes muestras se utilizó como gen de referencia la b-actina con secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 (Gene bank ID: NM_007393.3) y los cebadores: sentido [SEQ ID NO: 5] y
Figure imgf000021_0002
antisentido: [SEQ ID NO: 6], previamente validado en
Figure imgf000021_0001
nuestro laboratorio.
La reacción de amplificación se realizó en un termociclador MiniOpticonTM (Bio-Rad) según el siguiente protocolo: una primera etapa de desnaturalización del ADNc de 3 minutos a 95°C; posteriormente, treinta y cinco ciclos que comprendían: 40 segundos a 94°C, 40 segundos a 58°C y 40 segundos a 72°C y, por último, una etapa de elongación de 3 minutos a 72°C. La obtención de un único producto en la PCR se confirmó por la aparición de un único pico en el análisis de las curvas de disociación. Éstas se obtuvieron calentando la muestra desde los 65°C hasta los 95°C a intervalos de 1°C y monitorizando la fluorescencia. Esta curva representa la temperatura a la que las cadenas de ADN se separan o la temperatura de fusión frente a la fluorescencia emitida por el producto de la PCR. La temperatura de fusión es específica para cada fragmento de ADN amplificado.
La reacción de PCR se hizo por triplicado para cada ADNc y para cada pareja de cebadores y se incluyó un control que no tenía ADNc. La reacción de PCR se consideró válida cuando la eficiencia de la misma estaba comprendida entre el 90 y el 110%.
En cada muestra se determinó el número de ciclos necesarios para alcanzar un nivel de fluorescencia umbral (Ct). Los resultados se analizaron con el método 2-Delta- Delta-Ct (2 DDCt) en una hoja de cálculo“Gene Expression Macro” proporcionada por BioRad. Mediante este método, el valor de Ct obtenido para el gen reelina en cada una de las muestras se normalizó con el obtenido para el gen de referencia b-actina, y después se relativizaron frente al valor de la condición control (en nuestro caso el colon sano).
La fórmula matemática que utiliza este método para obtener los valores de expresión de ARNm de reelina en cada patología respecto al valor del colon sano es:
Valores de expresión del ARNm relativizados = 2-DDCt
donde:
DDCt — [(Ct reelina— Ct b-actina) patología ~ (Ct reelina - Ct p-actina) colon sano]
Los resultados representan el número de veces que cambiaba la abundancia del ARNm de reelina en cada patología respecto al colon sano:
Presentación de resultados y análisis estadístico
Los resultados se presentan como la media acompañada de su error estándar (EEM). Se utilizaron 9 muestras de cada patología y 9 muestras de colon sano (45 muestras) que corresponde con el número de experimentos Independientes (n=9). La comparación entre los distintos grupos experimentales (datos pareados) se realizó estadísticamente mediante el test de la“t de Student”. Para comparaciones múltiples se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) de una sola vía, seguido del test de Newman-Keuls. En todos los test las diferencias se consideraron significativas cuando p<0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa Informático “GraphPad Prism 6”. II. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El cáncer de colon se desarrolla siguiendo una secuencia que va desde la aparición de Inflamación o lesiones precancerosas al desarrollo de adenocarclnomas de colon. Resultados de nuestro grupo de Investigación realizados en ratón mostraron que durante la colitis aguda se producía un aumento en la expresión de reelina, lo que sugería la participación de la reelina en la reparación y/o regeneración de los tejidos dañados en dicha patología. Sin embargo, en el adenocarcinoma de colon de ratón observamos una disminución en la expresión de reelina. Además, la ausencia de reelina aumentaba la susceptibilidad de los ratones al desarrollo de la Inflamación y el cáncer. En conjunto, los resultados sugerían que, si bien la reelina aumenta en la
Inflamación como mecanismo de defensa frente a la lesión tisular, el cáncer reprime su expresión, eliminando así un mecanismo de defensa. Por ello nos planteamos determinar en humanos en qué etapa de la transición desde la enfermedad Inflamatoria Intestinal al cáncer de colon se reprime la expresión de reelina y, por tanto, uno de los mecanismos de defensa.
Para ello se evaluaron los cambios en el grado de expresión del gen reelina en la transición de la enfermedad Inflamatoria y la progresión hacia el desarrollo del cáncer de colon, midiendo la abundancia del ARNm de la reelina en muestras humanas de colon sano (reglones alejadas de los adenocarclnomas), de colon de pedentes con colitis ulcerosa, pólipos, adenomas y adenocarcinomas.
La figura 1 muestra el número de veces que cambia la abundancia de ARNm de reelina en cada patología respecto al colon sano. Los resultados revelan que, con respecto al colon sano, dicha abundancia aumenta como 10 veces en las muestras de colitis ulcerosa (10,15 ± 3,39 veces), ligeramente en los pólipos (2,78 ± 0,30 veces) y disminuye progresivamente conforme avanza la gravedad de la enfermedad en los adenomas (-2,96 ± 1 ,04 veces) y adenocarcinomas (-12,74 ± 5,29 veces). En la tabla 1 se muestran los valores de referencia del número de veces que cambia la expresión del ARNm de reelina para diagnosticar cada patología. Por tanto, un aumento de la expresión de reelina de más de 7 veces Indicaría que se trata de una muestra con un proceso inflamatorio; si el aumento es de hasta 3 veces, nos encontramos con un pólipo no adenomatoso; si disminuye con respecto al colon sano, indicaría un proceso carcinogénico; si la disminución es de hasta 4 veces, sería clasificado como un adenoma de bajo grado de displasia, y si es mayor de 7 veces indicaría un adenocarcinoma. Valores intermedios podrían ser estados transicionales que se pueden corroborar con los análisis anatomo-patológicos.
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Tabla 1. Valores de referencia de niveles de expresión del ARNm de reelina.
Estos resultados indican que la expresión de reelina disminuye con la gravedad de la enfermedad. Sin estar vinculado a ninguna teoría, se piensa que, en respuesta a un daño tisular, como la inflamación o lesiones precancerosas en el colon, aumenta la expresión de reelina para reestablecer la barrera intestinal y posiblemente facilitar la reparación tisular, pero la represión de la expresión de reelina indica que el microambiente ha cambiado a otro que favorece el desarrollo de lesiones más graves como los adenomas o los adenocarcinomas. Dado que la expresión de reelina se modifica a medida que la patología progresa proponemos a la reellna como blomarcador en la transición entre la enfermedad Inflamatoria Intestinal y el cáncer de colon, además de ser útil para la evaluación del pronóstico clínico.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para determinar el pronóstico de una enfermedad intestinal en un sujeto que comprende
a) cuantificar los niveles de expresión del gen que codifica la reelina en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia,
en el que unos niveles de expresión del gen que codifica la reelina mayores que el nivel de referencia, son indicativos de que la enfermedad intestinal es leve y el pronóstico es bueno, mientras que unos niveles de expresión del gen que codifica la reelina menores que el nivel de referencia son indicativos de que la enfermedad intestinal es grave y el pronóstico es malo.
2. Método según la reivindicación 1 , en el que la enfermedad intestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal, pólipos intestinales, un adenoma o un adenocarcinoma.
3. Método según la reivindicación 2, en el que la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el gen que codifica la reelina comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 1.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cuantificación de los niveles de expresión del gen que codifica la reelina comprende la cuantificación del ARN mensajero (ARNm) de dicho gen ó del ADN codificante (ADNc) de dicho gen.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cuantificación de los niveles de expresión del gen que codifica la reelina se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa, hibridación in situ, o mediante un array de ADN o ARN.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cuantificación de los niveles de expresión del gen que codifica la reelina comprende la cuantificación de los niveles de proteína codificada por dicho gen.
8. Método según la reivindicación 7, en el que la cuantificación de los niveles de proteína se realiza mediante western blot, ELISA o un array de proteínas.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, biopsia y orina.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el sujeto es un mamífero, preferiblemente un primate, más preferiblemente, un humano.
11. Un método in vitro para diagnosticar una enfermedad intestinal en un sujeto que comprende
a) cuantificar los niveles de expresión del gen que codifica la reelina en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con un nivel de referencia,
en el que
si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son 5 veces mayores o iguales que el nivel de referencia, entonces el individuo padece una enfermedad intestinal inflamatoria,
si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son hasta 5 veces mayores que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un pólipo intestinal,
si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son hasta 5 veces menores que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un adenoma, o si los niveles de expresión del gen que codifica la reelina son, al menos, 5 veces menores o iguales que el nivel de referencia, entonces el individuo padece un adenocarcinoma.
12. Método según la reivindicación 11 , en el que el gen que codifica la reelina comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 1.
13. Método según la reivindicación 11 o 12, en el que la cuantificación de los niveles de expresión del gen que codifica la reelina comprende la cuantificación del ARN mensajero (ARNm) de dicho gen ó del ADN codificante (ADNc) de dicho gen.
14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la cuantificación de los niveles de expresión del gen que codifica la reelina se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa, hibridación in situ, o mediante un array de ADN o ARN.
15. Método según la reivindicación 11 o 12, en el que la cuantificación de los niveles de expresión del gen que codifica la reelina comprende la cuantificación de los niveles de proteína codificada por dicho gen.
16. Método según la reivindicación 15, en el que la cuantificación de los niveles de proteína se realiza mediante western blot, ELISA o un array de proteínas.
17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, biopsia y orina.
18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en el que el sujeto es un mamífero, preferiblemente un primate, más preferiblemente, un humano.
19. Un kit que comprende los reactivos necesarios para determinar los niveles de expresión del gen que codifica la reelina, en donde dichos reactivos comprenden
- una pareja de cebadores que híbrida de forma específica con la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la reelina, y/o
- una sonda que híbrida de forma específica con la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la reelina, y/o
- uno o varios anticuerpos que reconocen de forma específica la proteína codificada por el gen que codifica la reelina.
20. Kit según la reivindicación 19, en la pareja de cebadores comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
21. Kit según la reivindicación 19 o 20, en el que el gen que codifica la reelina comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 1.
22. Uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para determinar el pronóstico de una enfermedad intestinal en un sujeto, y/o para diagnosticar una enfermedad intestinal en un sujeto.
23. Uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para la puesta en práctica de un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o de un método según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18.
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