WO2020171052A1 - 共培養用デバイス、運動神経細胞培養用デバイス、マルチウェルプレート、神経筋疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法、および、神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents

共培養用デバイス、運動神経細胞培養用デバイス、マルチウェルプレート、神経筋疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法、および、神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法 Download PDF

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本多　裕之
奈央 山岡
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Definitions

  • the disclosure in the present application relates to a device for co-culture, a device for culturing motor neurons, a multi-well plate, a method for preparing an in vitro evaluation model for neuromuscular disease, and a method for screening a therapeutic agent for neuromuscular disease. More specifically, a device for co-culture and a device for culturing motoneurons for producing an in vitro evaluation model for neuromuscular diseases closer to the structure of the human body, a multi-well plate in which the device is placed in a well, and a neuromuscular
  • the present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for neuromuscular disease using an in vitro evaluation model of disease.
  • NMJ neuromuscular junction
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • SBMA spinal and bulbar muscular atrophy
  • a device for conducting research on the mechanism of onset of neuromuscular diseases and screening of therapeutic agents in vitro.
  • a technique is known in which skeletal muscle cells are first cultured to prepare skeletal muscle tissue, and then motor neurons are cultured (see Non-Patent Document 1).
  • the method described in Non-Patent Document 1 has a problem that the structure is different from the actual structure in the human body because the skeletal muscle tissue and the motor nerve cells are in a mixed state.
  • FIG. 1 is a diagram showing another example of the conventional technology of the device (evaluation model) (see Non-Patent Document 2).
  • PDMS is used to separate the skeletal muscle tissue formation compartment and the motor neuron compartment.
  • skeletal muscle cells are cultured in a skeletal muscle tissue forming compartment to prepare skeletal muscle tissue (reference A).
  • a motor neuron spheroid containing collagen gel is put into the motor neuron compartment (reference B).
  • the motor neuron compartment is provided with a plurality of pillars (symbol P) for disposing the motor neuron spheroid at a predetermined position.
  • the axon (symbol C) extending from the motor nerve cell is combined with the skeletal muscle tissue to form a neuromuscular junction.
  • Y. Morimoto et al. "Three-dimensional neuronemuscle constructs with neuromuscular junctions", Biomaterials 34 (2013) 9413-9419 T. Osaki et al. , "Microphysiological 3D model of amyotropic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derivated muscle cells and optogeneric neurones.” Adv. 2018; 4: eaat5847.
  • ALS amyotropic lateral sclerosis
  • Non-Patent Document 2 arranges motor nerve cells and skeletal muscle tissue in three dimensions and uses collagen gel as a scaffold for axon extension. Therefore, it is necessary to add the collagen gel to the skeletal muscle tissue forming section, the motor nerve cell section, and the flow channel that connects the skeletal muscle tissue forming section and the motor nerve cell section.
  • the periphery of the motor neuron and the skeletal muscle tissue needs to be covered with a collagen gel serving as a scaffold. Therefore, even if an evaluation model in which a neuromuscular junction is formed using the device described in Non-Patent Document 2, as shown in FIG. 2, the motor neuron spheroid overcomes the pillar with time, as shown in FIG. As described above, the skeletal muscle tissue also grows and spreads, so that there is a problem that the motor nerve cells and the skeletal muscle tissue are fused. In the evaluation model described in Non-Patent Document 2, skeletal muscle tissue and the like are formed in collagen gel.
  • the disclosure in the present application was made in order to solve the above problems, and when the device (evaluation model) not using collagen gel as a scaffold was earnestly studied, (1) a first culture to which a medium can be added A first unit for skeletal muscle tissue formation having a tank, (2) a second unit for motoneuron cell culture having a second culture tank to which a medium can be added, and (3) a first unit for communicating the second unit (4)
  • the third unit is provided by providing (4) the third unit with an opening having an axon passage hole through which a motor neuron and a skeletal muscle cell cannot pass but an axon can pass. It was newly found that an in vitro evaluation model of neuromuscular disease used as a scaffold through which axons can pass can be created.
  • the purpose of the disclosure in the present application is to provide a device for co-culturing, a device for culturing motor neurons, a multi-well plate, a method for preparing an in vitro evaluation model of neuromuscular disease, and a method for screening a therapeutic agent for neuromuscular disease. Is to provide.
  • the disclosure in the present application relates to a co-culture device, a motor neuron culture device, a multi-well plate, a method for preparing an in vitro evaluation model for neuromuscular disease, and a method for screening a therapeutic agent for neuromuscular disease, which are described below. ..
  • a device for co-culturing motor neurons and skeletal muscle cells The device is A first unit for forming skeletal muscle tissue, A second unit for culturing motor neurons, A third unit for connecting the first unit and the second unit, Pillars that serve as scaffolds for skeletal muscle tissue formation, Including, The first unit is A first substrate, A first culture tank formed on the first substrate, Including, The second unit is A second substrate, A second culture tank formed on the second substrate; Including, The third unit is A third substrate, An axon channel formed in the third base material, through which the bundle of axons passes, Including, One end portion of the third unit can be connected to the second unit, and when the one end portion of the third unit and the second unit are connected, the axon channel and the second culture tank can be connected to each other, A first opening is formed in the other end portion of the third unit so as to contact the axon flow path, and one or more first axon passage holes are formed in the first opening.
  • the first axon passage hole cannot pass through motor neurons and skeletal muscle cells, but has a size through which axons can pass, At least a portion of the pillars can be located in the first fermentor, device.
  • the axon flow path A first flow path, A second flow path formed inside the first flow path; Including, The first opening is formed so as to be in contact with the first flow path, The second channel is One end can communicate with the second culture tank, The other end is formed so as to come into contact with the second opening, In the second opening, One or more second axon passage holes are formed, The second axon passage hole has a size that allows the axon to pass though it cannot pass motor neurons and skeletal muscle cells.
  • the first opening and the second opening are spaced apart, The device according to (1) above.
  • Two or more third units are stacked, The device according to (1) or (2) above.
  • the positional relationship among the first unit, the second unit, the third unit, and the pillar is When two or more pillars are included, they are arranged so that one of the virtual planes connecting the two or more pillars intersects with the virtual axon channel that virtually extends the axon channel to the first culture tank. , When the number of pillars is one, the virtual surface formed by one pillar or the virtual surface formed by the other end portion of the pillar and the third unit and the axon flow path are virtually extended to the first culture tank.
  • Two pillars are included, one end of each pillar is connected to the first substrate 21, and the other end is arranged in a cantilever manner in the first culture tank, The device according to (4) above.
  • the size of the first axon passage hole is Minimum distance is 0.5 ⁇ m or more, 2.5 ⁇ m or less, or The minimum distance is 0.5 ⁇ m or more and the cross-sectional area is 60 ⁇ m 2 or less, The device according to any one of (1) to (5) above.
  • a device for motor neuron culture is produced by connecting the second unit and the third unit, Two or more motor neuron cell culture devices are arranged for one first unit, The device according to any one of (1) to (6) above.
  • a motor neuron culture device is produced by connecting two or more third units to one second unit, The first unit is arranged at the other end of the optional third unit, The device according to any one of (1) to (6) above.
  • a device for culturing motor neurons which is used as a device for co-culturing motor neurons and skeletal muscle cells
  • the device is A second unit for culturing motor neurons, A third unit connected to the second unit, Including,
  • the second unit is A second substrate, A second culture tank formed on the second substrate;
  • the third unit is A third substrate, An axon channel formed in the third base material, through which the bundle of axons passes, Including, One end of the third unit is connected to the second unit, and one end of the axon channel is connected to the second culture tank, A first opening is formed in the other end portion of the third unit so as to contact the axon flow path, and one or more first axon passage holes are formed in the first opening.
  • the first axon passage hole is large enough for the axon to pass through, although it cannot pass through motor neurons and skeletal muscle cells.
  • device. (10) having at least two wells, The device according to any one of (1) to (9) above is arranged in at least one of the wells, Multi-well plate.
  • the manufacturing method is A motor neuron culture step of culturing motor neurons in the second unit;
  • An axon extending from the cell body of the cultured motor neuron passes through the axon channel of the third unit and joins with the produced skeletal muscle tissue to produce a neuromuscular junction;
  • a method for producing an in vitro evaluation model for neuromuscular disease comprising: (12) A method for screening a therapeutic agent for neuromuscular disease, which uses the in vitro evaluation model for neuromuscular disease produced by the production method described in (11) above,
  • the screening method is Motor neuron of the evaluation model produced, axon extending from the cell body of the motor neuron, a test substance administration step of administering the test substance to any one of skeletal muscle tissues, Motor neurons, axons
  • the collagen is not used as a scaffold in the evaluation model produced using the co-culture device disclosed in the present application. Therefore, it becomes easy to observe the movement of the skeletal muscle tissue.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a conventional technique of a device (evaluation model).
  • FIG. 2 is a drawing-substituting photograph, and the evaluation model produced using the device of the prior art shows that, as time elapses, motor neurons and skeletal muscle tissue are fused.
  • 3A to 3H are schematic diagrams of the device 1a.
  • FIG. 4A to FIG. 4C are diagrams showing an example of another embodiment of connection of one end portions of the second unit and the third unit of the device 1a.
  • 5A to 5C are views for explaining the third unit in more detail.
  • 6A and 6B are diagrams for explaining the first opening surface and the second opening surface of the device 1a in more detail.
  • FIG. 7A and 7B are schematic cross-sectional views for explaining the device 1b according to the second embodiment.
  • 8A and 8B are schematic top views for explaining the device 1c according to the third embodiment.
  • FIG. 9A is a schematic top view for explaining the device 1d according to the fourth embodiment.
  • 9B(a) and 9B(a) and 9(b) are views for explaining the outline of the embodiment of the multi-well plate.
  • FIG. 10 is a flowchart of an embodiment of a method for producing an evaluation model.
  • FIG. 11 is a flowchart of an embodiment of the screening method.
  • FIG. 12 is a photograph as a substitute for a drawing, which is a photograph of the mold produced in Example 1.
  • FIG. 13 is a photograph as a substitute for a drawing, which is a photograph of the device for culturing motor neurons prepared in Example 1.
  • FIG. 14 is a mold drawing for producing the first unit of the first embodiment.
  • FIG. 15 is a photograph as a substitute of a drawing, which is a photograph of the device manufactured in Example 1.
  • FIG. 16 is a diagram showing an outline of differentiation induction in the production of the evaluation model of Example 2.
  • FIG. 17 is a diagram showing the procedure of co-culturing in the production of the evaluation model of Example 2.
  • FIG. 18 is a photograph as a substitute for a drawing, which is an enlarged photograph in the vicinity of the first opening of the third unit of the evaluation model manufactured in Example 2.
  • FIG. 19 is a drawing-substitute photograph, in which the neuromuscular junction of the evaluation model prepared in Example 2 was stained and imaged with a confocal microscope.
  • FIG. 20 is a graph showing contraction of skeletal muscle tissue before and after adding a drug to the evaluation model prepared in Example 2.
  • FIG. 21 is a drawing-substituting photograph, which is a microscopic photograph after staining the axons of the evaluation model produced in Example 2.
  • FIG. 22 is a photograph as a substitute for a drawing, which is a microscopic photograph confirming the rupture and regeneration of the axon of Example 3.
  • a device for co-culturing hereinafter sometimes simply referred to as a “device”
  • a device for culturing motor neurons hereinafter, it may be simply referred to as a “method for producing an evaluation model”.
  • a screening method for a therapeutic agent for neuromuscular disease hereinafter, simply referred to as a “screening method”.
  • screening method for a therapeutic agent for neuromuscular disease
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the device 1a.
  • the device 1a according to the first embodiment includes a first unit 2 for forming skeletal muscle tissue, a second unit 3 for culturing motor neuron cells, and a first unit 2 for communicating the first unit 2 and the second unit. It includes 3 units 4 and pillars 23.
  • 3A is a diagram showing an outline of the first unit 2
  • FIG. 3B is a diagram showing an outline of the third unit 4
  • FIG. 3C is a diagram showing an outline of the second unit 3. Further, FIG.
  • 3D is a schematic cross-sectional view in the XX′ direction when the device 1a is manufactured by combining the first unit 2, the second unit 3, and the third unit 4.
  • 3E and 3F are schematic cross-sectional views showing another embodiment of the pillar 23, and are cross-sectional views in a direction orthogonal to the XX′ direction of FIG. 3A.
  • FIGS. 3G and 3H are schematic views showing another embodiment of the pillar 23, and are top views (views in the R direction of FIG. 3A) of the first unit 2.
  • the first unit 2 will be described in more detail with reference to FIGS. 3A and 3D.
  • the first unit 2 includes a first base material 21 and a first culture tank 22. Further, FIGS. 3A and 3D show an example in which the pillar 23 is attached to the first unit 2.
  • the first culture tank 22 is used for culturing skeletal muscle cells and forming skeletal muscle tissue from the cultured skeletal muscle cells.
  • the 1st culture tank 22 is formed in the 1st base material 21, and has the 1st culture medium input hole 221 in the surface above the 1st base material 21 of a substantially rectangular parallelepiped shape in the example shown to FIG. 3A and FIG. 3D. It is formed in a substantially concave shape.
  • the pillar 23 is used to form skeletal muscle tissue from skeletal muscle cells cultured in the first culture tank 22.
  • One end 231 of the pillar 23 is connected to the wall surface of the first substrate 21 forming the first culture tank 22, and the other end 232 is arranged in the first culture tank 22.
  • the pillar 23 is arranged in a cantilever state. Therefore, skeletal muscle cells are cultured in the first culture tank 22, and the skeletal muscle tissue formed on the other end 232 of the pillar 23 is three-dimensionally formed in the first culture tank 22, in other words, the first culture tank 22. It is formed in a floating state.
  • FIGS. 3A and 3D show an example in which two pillars 23 are provided.
  • the formed skeletal muscle tissue can be oriented in the direction in which the pillars 23 are connected, and a tissue closer to the human skeletal muscle tissue can be formed.
  • three or more pillars 23 may be provided. At that time, when it is desired to orient the produced skeletal muscle tissue in the same direction, three or more pillars 23 may be arranged linearly.
  • the distance between the pillars 23 is not particularly limited as long as skeletal muscle tissue can be formed between the pillars 23, and can be, for example, 0.5 mm to 5 mm, 1 mm to 3.5 mm, and 1.5 mm to 2.6 mm.
  • ⁇ m to ⁇ m it means "more than OO ⁇ m and ⁇ m or less”.
  • one end 231 of the pillar 23 has a bottom surface 211 of the first base material 21 (a wall surface of the first base material 21 opposite to the first culture medium input hole 221 of the first culture tank 22 ). ) Is formed.
  • the other end 232 of the pillar 23 is formed in a cantilever shape so that the other end 232 is arranged in the first culture tank 22, one end 231 may be formed on the side wall surface 212 of the first base material 21 other than the bottom surface 211. It may be formed.
  • the pillar 23 when the lid is closed is formed.
  • the other end 232 may be arranged in the first culture tank 22.
  • FIGS. 3A to 3D an example in which two pillars 23 are arranged is shown, but one pillar 23 is formed, and one pillar 23 and the other end portion of the third unit 4 are formed.
  • the skeletal muscle tissue may be formed between the skeletal muscles and the tissue 44 (the portion corresponding to the virtual axon flow path 42a in FIG. 3D).
  • the one end 231 of the pillar 23 is formed on the first base material 21 or the lid 6 so that the other end 232 of the pillar 23 is arranged in the first culture tank 22.
  • the arrangement and number of the pillars 23 are not particularly limited.
  • both ends of one substantially U-shaped pillar 23 may be attached to the lid 6.
  • both ends of one substantially U-shaped pillar 23 may be attached to the side wall surface 212 of the first base member 21.
  • FIG. 3F both ends of one substantially U-shaped pillar 23 may be attached to the side wall surface 212 of the first base member 21.
  • both ends of each of the two pillars 23 may be connected to the first base material 21 so as to cross the first culture tank 22. If the pillars 23 are made of a flexible material, the pillars 23 can bend in accordance with the contraction of the skeletal muscle tissue formed between the pillars 23 even in the examples shown in FIGS. 3F to 3H.
  • the other end 232 of the pillar 23 may be made larger than the other portions, if necessary. By making the other end 232 larger than the other portions, the formed skeletal muscle tissue is less likely to come off the pillar 23.
  • the first base material 21 and the first culture tank 22 are formed in a substantially rectangular parallelepiped shape, but if the first culture tank 22 is formed in the first base material 21.
  • the shapes of the first base material 21 and the first culture tank 22 are not particularly limited.
  • the pillar 23 is not particularly limited in shape as long as it can form a skeletal muscle tissue, and examples thereof include a cylindrical shape and a polygonal pillar shape.
  • the notch 24 for mounting the second unit 3 described later is formed on the first base material 21, but as described later, the formation of the notch 24 is essential. is not.
  • the first base material 21 and the pillar 23, or the lid 6 and the pillar 23 may be formed integrally or separately. When they are formed separately, the pillars 23 may be adhered to the wall surface of the first base material 21 or the lid 6. In addition, when the other end 232 of the pillar 23 is made large, the pillar 23 may be formed in advance so that the other end 232 becomes large, or it may be made larger by attaching another member to the other end 232 of the pillar 23. Good.
  • the method of forming the first base material 21 and the pillars 23 is not particularly limited.
  • a material for forming the first base material 21 is prepared and formed by cutting, and formed by a 3D printer.
  • a mold may be first produced using a photolithography technique, and then the material forming the first base material 21 may be transferred.
  • the material is not particularly limited as long as it can cut or transfer the mold.
  • the material is not particularly limited as long as it can cut or transfer the mold.
  • a resin having a light transmitting property is desirable.
  • the resin in that case include cycloolefin polymer (COP), polydimethylsiloxane (PDMS), polymethylmethacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), plastic such as hard polyethylene, and silicon. Further, metal may be used instead of resin.
  • COP cycloolefin polymer
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • PC polycarbonate
  • plastic such as hard polyethylene
  • silicon silicon
  • metal may be used instead of resin.
  • the second unit 3 includes the second base material 31, the second culture tank 32, and the third unit insertion portion 33 into which the one end portion 43 of the third unit 4 is inserted.
  • the second culture tank 32 is used for culturing motor neurons and extending axons from the cell bodies of the cultured motor neurons.
  • the 2nd culture tank 32 is formed in the 2nd base material 31, and has the 2nd culture medium input hole 321 in the upper surface of the substantially rectangular parallelepiped-shaped 2nd base material 31 in the example shown to FIG. 3C and FIG. 3D. It is formed in a substantially concave shape.
  • the axon channel opening 421 is formed on the side surface 431 of the one end portion 43 of the third unit. Therefore, when the one end portion 43 of the third unit 4 is inserted into the third unit insertion portion 33, the axon channel opening 421 of the axon channel 42 and the second culture tank 32 communicate with each other. Therefore, the axon extending from the cell body of the motor neuron cultured in the second culture tank 32 can extend in the direction of the first unit 2 through the axon channel 42.
  • the axon is a part of the motor neuron, but in the following, when focusing on the axon portion for description, it may be simply referred to as “axon”.
  • 3B to 3D show an example in which the third unit insertion portion 33 is formed in the second unit 3, but if the axon flow path 42 and the second culture tank 32 communicate with each other,
  • the connection between the second unit 3 and the one end portion 43 of the third unit 4 may be in another form.
  • 4A to 4C are diagrams showing an example of another embodiment of coupling the second unit 3 and the one end portion 43 of the third unit 4.
  • 4A is a top view of the third unit 4 (view from the R1 direction of FIG. 3B)
  • FIG. 4B is a top view of the second unit 3 (view from the R1 direction of FIG. 3C)
  • FIG. 4C is the third unit.
  • 4 is a schematic cross-sectional view (a view in the YY′ direction of FIGS. 4A and 4B) when the second unit 3 is stacked on the upper surface of FIG.
  • the second culture tank 32 is formed so as to penetrate the second base material 31.
  • the axon channel opening 421 is formed so as to penetrate the upper surface of the third base material 41 of the one end portion 43 of the third unit. Therefore, by connecting the second culture tank 32 of the second unit 3 and the axon flow path opening 421 so as to overlap with each other, the axon flow path 42 and the second culture tank 32 can be communicated with each other.
  • the axon extending from the cell body of the motor neuron cultured in the second culture tank 32 passes through the axon flow path opening 421 and the other end portion 44 of the third unit. It is desirable to extend only to the side (on the side where the first unit 2 is arranged). Therefore, as shown in FIG. 4C, a flow channel may not be formed in a portion of the one end portion 43 of the third unit 4 in the side surface 431 direction from the axon flow channel opening 421. Further, as is clear from the above description, in the present specification, the “one end portion 43” of the third unit 4 means a portion which is inserted into the second unit 3 or overlaps with the second unit 3.
  • the second substrate 31 and the second culture tank 32 are formed in a substantially rectangular parallelepiped shape, but the second culture is performed on the second substrate 31.
  • the shapes of the second base material 31 and the second culture tank 32 are not particularly limited as long as the tank 32 is formed. Further, the production and material of the second unit 3 may be the same as those of the first unit 2.
  • the third unit 4 includes a third base material 41 and an axon flow path 42.
  • the third unit 4 includes one end portion 43 that is a portion that is inserted into the second unit 3 or that overlaps the second unit 3, and the other end portion 44 that is opposite to the one end portion 43 and that is disposed toward the first unit 2. Contains.
  • a first opening 45 is formed in the other end portion 44 so as to contact the axon flow path 42.
  • first axon passage holes 451 are formed in the first opening 45.
  • the first axon passage hole 451 is not particularly limited as long as it is 1 or more, and may be appropriately determined in consideration of 2 or more, 3 or more, 4 or more, the size of the third unit 4, and the like.
  • the first axon passage hole 451 is smaller than the cross-sectional area of the axon flow path 42 and has a size that allows at least one axon extending in the axon flow path 42 to pass therethrough. It only needs to be large enough to pass through.
  • the “cross-sectional area” of the axon flow path 42 means a plane orthogonal to the direction in which the axon extends (direction toward the first opening 45, arrow direction in FIG. 5A).
  • the size of the first axon passage hole 451 means the first opening surface 451a of the first axon passage hole 451 on the side of the axon flow path 42, or the second opening surface on the side opposite to the first opening surface 451a. It means 451b.
  • FIG. 6A is a diagram showing the shape of the first opening surface 451a or the second opening surface 451b. Further, FIG. 6B is a diagram for explaining the sizes of the first opening surface 451a and the second opening surface 451b.
  • the first axon passage hole 451 does not pass motor neurons and skeletal muscle cells, but needs to have a size that allows at least one axon to pass. There is no particular limitation on the shape or the like.
  • the first axon passage hole 451 is, for example, a columnar structure such as a cylinder, an ellipse, a triangular prism, and a quadrangular prism, in other words, a tubular body in which the first opening surface 451a and the second opening surface 451b have the same shape and size. Is mentioned.
  • the first axon passage hole 451 has at least one of the shape and size of a cone such as a cone, a triangular pyramid, and a quadrangular pyramid, in other words, the first opening surface 451a and the second opening surface 451b. It may be a different tubular body.
  • the shapes of the first opening surface 451a and the second opening surface 451b are not particularly limited, such as a circle, an ellipse, and a polygon.
  • the definition of the case where the “size” of the first opening surface 451a and the second opening surface 451b is described will be described with reference to FIG. 6B.
  • the “size” is the diameter.
  • the size is not uniquely determined. Therefore, as shown in FIG.
  • the shortest distance d among the plurality of distances d obtained when the first opening surface 451a (second opening surface 451b) is sandwiched by parallel lines is referred to as “minimum distance.
  • minimum distance the longest distance d among the plurality of distances d.
  • the first opening surface 451a where the motor nerve cells may infiltrate needs to have a size that cannot pass through the motor nerve cells.
  • the motor neuron is a non-spherical cell having a size of approximately 5 ⁇ m to 30 ⁇ m, although it varies depending on culture conditions and the like. In addition, motor neurons deform to some extent. Therefore, if the “minimum distance” of the first opening surface 451a is set to a size of, for example, less than 2.5 ⁇ m or 2.0 ⁇ m or less, the motor nerve cells are not deformed to be smaller than the “minimum distance”. .. Therefore, when the “minimum distance” is set to less than 2.5 ⁇ m, the “maximum distance” is not particularly limited.
  • the “minimum distance” becomes a certain size, for example, 2.5 ⁇ m or more, whether or not the motor nerve cell passes is not limited to the “minimum distance” but the cross-sectional area of the first opening surface 451a (cross section). It is also necessary to consider the shape. For example, when the motor neurons do not pass when the cross-sectional area is 60 ⁇ m 2, the “maximum distance” is 24 ⁇ m or less when the “minimum distance” is 2.5 ⁇ m, and the “maximum distance” is when the “minimum distance” is 3 ⁇ m.
  • the above-mentioned example of the cross-sectional area is a value obtained from the general size of motor neurons, and the cross-sectional area is not limited to 60 ⁇ m 2 .
  • the cross-sectional area for example, 58 .mu.m 2 or less, 56 .mu.m 2 or less, 54 .mu.m 2 or less, 52 .mu.m 2 or less, 50 [mu] m 2 or less or the like, may be appropriately changed.
  • the second opening surface 451b in which skeletal muscle cells may infiltrate needs to have a size that does not allow passage of skeletal muscle cells.
  • the size of the skeletal muscle cells is approximately 5 ⁇ m to 30 ⁇ m, like the motor neurons. Therefore, the size of the second opening surface 451b may be adjusted so as to have the same “minimum distance” or “cross-sectional area” as that of the first opening surface 451a.
  • the “minimum distance” between the first opening surface 451a and the second opening surface 451b can be 0.5 ⁇ m or more, 1 ⁇ m or more, 1.5 ⁇ m or more, 2 ⁇ m or more.
  • the length of the first axon passage hole 451 is not particularly limited from the viewpoint of passage of the axon.
  • the length may be appropriately determined from the viewpoints of manufacturing convenience, handling convenience, and the like.
  • the lower limit may be, for example, 1 ⁇ m or more, 50 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more.
  • the upper limit can be, for example, 1000 ⁇ m or less, 750 ⁇ m or less, and 500 ⁇ m or less.
  • the circumference of the axon flow path 42 is covered with the third base material 41 (in the case of the example shown in FIG. 4, there may be a part that is not covered), and the other end portion 44 has the first opening portion.
  • the shape and size are not particularly limited as long as 45 is formed and one end portion 43 can communicate with the second culture tank 32.
  • the cross-sectional shape may be a substantially rectangular parallelepiped, a polygonal shape, or a circular shape.
  • the width of the axon flow path 42 (the length in the direction substantially orthogonal to the line connecting the one end portion 43 and the other end portion 44) is not particularly limited.
  • the width of the axon flow path 42 is from 10 ⁇ m to
  • the thickness can be 1000 ⁇ m, 100 ⁇ m to 750 ⁇ m, 250 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the height of the axon channel 42 (the length in the vertical direction in FIG. 3B) can be 10 ⁇ m to 200 ⁇ m, 30 ⁇ m to 100 ⁇ m, and 50 ⁇ m to 75 ⁇ m.
  • both the width and height of the axon channel 42 are made sufficiently larger than the motor nerve cells, the motor neurons may enter the axon channel 42.
  • a slit for preventing the passage of motor neurons may be provided in the portion where the second culture tank 32 and the axon channel 42 are joined, or in the axon channel 42. More specifically, for example, as shown in FIG. 4C, when the second unit 3 is overlaid on the third unit 4, if the size of the axon channel opening 421 is set to a size through which motor neurons cannot pass. Good.
  • FIG. 4C when the second unit 3 is overlaid on the third unit 4, if the size of the axon channel opening 421 is set to a size through which motor neurons cannot pass. Good.
  • the size of the axon channel opening 421 is adjusted, but alternatively, a hole is formed in the bottom portion of the second culture tank 32, and the size is adjusted by the size of the hole. May be.
  • a slit 423 having a size that does not allow motor neurons to pass may be formed at a position separated from the first opening 45 of the axon channel 42.
  • the first axon passage holes 451 are arranged in a horizontal row, but as shown in FIG. 5C, the first axon passage holes 451 may be arranged in two rows. Alternatively, although not shown, the first axon passage holes 451 may be arranged in three or more rows.
  • the first opening 45 and the axon flow path 42 are shown as being manufactured separately, but the first opening 45 and the axon flow path 42 are integrated. It may be prepared as desired. The production and material of the third unit may be the same as those of the first unit 2.
  • the device 1a according to the first embodiment may be provided in a state in which the first to third units are separated or in a combined state. Further, when the pillar 23 is provided on the lid 6, the lid 6 may be provided in a separated state.
  • FIG. 3D shows an example of the positional relationship when the first to third units are combined.
  • the axon extending from the first axon passage hole 451 of the first opening 45 of the third unit 4 into the first culture tank 22 is a skeleton formed between the pillars 23 (for example, between the other ends 232). Reach muscle tissue and create a neuromuscular junction. Therefore, it is desirable that the third unit 4 is arranged so that the axon can easily reach the skeletal muscle tissue. In the example shown in FIG.
  • a virtual axon flow path 42a obtained by virtually extending the axon flow path 42 into the first culture tank 22 is an extension line connecting the other ends 232 of two or more pillars 23 (or, It is arranged so as to intersect with any one of (a virtual surface connecting two or more pillars 23).
  • the skeletal muscle tissue is organized so that the pillars 23 are connected to each other by using the pillars 23 as scaffolds. Therefore, by arranging the other end portion 44 of the third unit 4 and the first unit 2 as described above, it becomes easy to form the neuromuscular junction. Further, as shown in FIGS.
  • the third device 4 is connected in a direction substantially orthogonal to the gravity direction of the second culture tank 32. Therefore, in order to intersect the virtually extended virtual axon channel 42a in the direction of the skeletal muscle tissue formed in a state of floating in the medium described later, the first unit 2 is provided with the second unit 3. It is preferable to form a notch 24 for placement.
  • the bottom surface of the second device 3 is Even if it is placed on the upper surface portion of the first substrate 21 of the one device 2, the virtually extended virtual axon channel 42a can be arranged so as to intersect with any one of the virtual surfaces formed by the two or more pillars 23. .. Therefore, the notch 24 may be formed as needed.
  • FIGS. 7A and 7B are schematic cross-sectional views (same direction as FIG. 5A) of the device 1b of the second embodiment
  • FIG. 7B is a bb′ cross-sectional view of FIG. 7A.
  • the device 1b according to the second embodiment is different from the device 1a according to the first embodiment in that a channel is further formed inside the axon channel 42 of the third unit 4, but other points. Is the same as the device 1a according to the first embodiment. Therefore, in the second embodiment, points different from the first embodiment will be mainly described, and repetitive description of the items already described in the first embodiment will be omitted. Therefore, it is needless to say that the items described in the first embodiment can be adopted in the second embodiment even if they are not explicitly described in the second embodiment.
  • the axon flow channel 42 shown in FIG. 7A includes a first flow channel 42b and a second flow channel 42c formed inside the first flow channel 42b.
  • the first opening 45 is formed so as to be in contact with the first flow path 42b.
  • One end 42c1 of the second flow channel 42c communicates with the second culture tank 32, and the other end 42c2 of the second flow channel 42c is formed so that the second opening 45a is in contact therewith.
  • One or more second axon passage holes 451' are formed in the second opening 45a.
  • the second axon passage hole 451 ′ has a size that allows the axon to pass though it cannot pass the motor neuron and the skeletal muscle cell. Further, the first opening 45 and the second opening 45a are arranged apart from each other.
  • the axon extending from the cell body of the motor neuron cultured in the second culture tank 32 passes through the second opening 45a, then the first flow path 42b, and further the first opening 45.
  • the first flow path 42b To form a neuromuscular junction with skeletal muscle tissue.
  • one end 42b1 and the other end 42b2 of the first flow path 42b are not in communication with the second culture tank 32. Therefore, since motor neurons and skeletal muscle cells do not infiltrate into the first flow path 42b, by flowing a culture medium containing a test substance of a therapeutic agent for neuromuscular disease into the first flow path 42b, only axons Can be selectively stimulated.
  • the "second axon passage hole 451'" is the “first axon passage hole 451”
  • the "first opening surface 451a'” is the “first opening surface 451”
  • “451b'” may be read as “second opening surface 451b”.
  • the second opening 45a is smaller in size than the first opening 45, but the axon passage hole, the first opening surface, and the second opening 45a formed in the first opening 45 and the second opening 45a are formed.
  • the shape and size of the opening surface may be the same.
  • the first opening portion 45 and the second opening portion 45a may be different.
  • the device 1b according to the second embodiment is made of the same material as that of the third base material 41, and the second unit is provided inside the first flow path 42b.
  • the flow path wall surface 42c3 may be formed.
  • the fabrication and material of the third unit 4 of the device 1b according to the second embodiment may be the same as those of the third unit 4 of the device 1a according to the first embodiment.
  • FIGS. 8A and 8B are schematic top views of the device 1c according to the third embodiment.
  • a device 5 for culturing a motor neuron is produced by connecting the second unit 3 and the third unit 4, and two or more devices are prepared for one first unit 2.
  • the device 5 for culturing motor neurons is different from the device 1a according to the first embodiment and the device 1b according to the second embodiment in that the device 5 for culturing motor neurons is arranged, but other points are the device 1a according to the first embodiment. And the same as the device 1b according to the second embodiment.
  • FIG. 8A shows that two motor neuron cell culture devices 5 are arranged in the same skeletal muscle tissue formed between two pillars 23, and axons extending from each motor neuron cell culture device 5 are arranged.
  • 11 shows an example in which the neuromuscular junction is formed by 11 and the skeletal muscle tissue 10.
  • two axons 11 are connected to the same skeletal muscle tissue. Therefore, when screening therapeutic agents for neuromuscular diseases, it is possible to observe the effects of changing the type of test substance to be put into each motor neuron cell culture device 5 or changing the concentration of the same type. it can.
  • FIG. 8A shows that two motor neuron cell culture devices 5 are arranged in the same skeletal muscle tissue formed between two pillars 23, and axons extending from each motor neuron cell culture device 5 are arranged.
  • 11 shows an example in which the neuromuscular junction is formed by 11 and the skeletal muscle tissue 10.
  • two axons 11 are connected to the same skeletal muscle tissue. Therefore, when screening therapeutic agents for neuromuscular diseases,
  • two motor neuron cell culture devices 5 are arranged, but the axon 11 extending from the motor neuron cell culture device 5 has skeletal muscle tissue 10 and nerve muscles. If the junction can be formed, the number of the motor neuron cell culture devices 5 to be arranged may be three or more.
  • FIG. 8B two motoneuron cell culture devices 5 are arranged for the skeletal muscle tissues formed between the three pillars 23, and axes extending from the respective motoneuron cell culture devices 5 are arranged.
  • An example is shown in which the cord 11 and the skeletal muscle tissue 10 form a neuromuscular junction.
  • the example shown in FIG. 8B can simultaneously screen a plurality of test substances.
  • three or more motor neuron cell culture devices 5 may be arranged for one skeletal muscle tissue 10.
  • the example shown in FIG. 8B for example, when one skeletal muscle tissue 10 is stimulated and contracted, the other skeletal muscle tissue 10 can be stretched. Since the muscles move in pairs in the living body, the example shown in FIG. 8B can reproduce a phenomenon closer to the living body.
  • FIG. 9A is a schematic top view of the device 1d according to the fourth embodiment.
  • a motor neuron culture device 5a is produced by connecting two or more third units 4 to one second unit 3, and the second unit 3 has a second unit 3 at the other end.
  • 1 unit 2 is arranged, which is different from the device 1a according to the first embodiment and the device 1b according to the second embodiment, but the other points are different from the device 1a according to the first embodiment and the device 1a according to the second embodiment. It is the same as the device 1b according to the embodiment.
  • the device 1d according to the fourth embodiment can form a neuromuscular junction by joining axons 11 extending from the cell bodies of motor neurons cultured in one second unit 3 to different skeletal muscle tissues 10. .. Even when the first unit 2 and the second unit 3 are provided one by one, it is of course possible to prepare an evaluation model and screen a test substance as a therapeutic agent for neuromuscular disease. However, for example, when the formation of skeletal muscle tissue from skeletal muscle cells is insufficient or the formation of the neuromuscular junction is insufficient, even a useful test substance can be used during screening. May be overlooked.
  • the axon 11 extending from the mass of motor neurons cultured in the second culture tank 32 can form a neuromuscular junction with different skeletal muscle tissues. Therefore, for example, when screening a test substance for a therapeutic agent for a neuromuscular disease that stimulates motor neurons, it is possible to confirm whether the skeletal muscle tissue 10 moves in the same manner. The accuracy of can be improved.
  • the above-described first to fourth embodiments are examples of the device 1 disclosed in the present specification, and the present invention is not limited to the above embodiments. It is possible to freely combine the above-described embodiments, modify any constituent element of each embodiment, or omit any constituent element.
  • the third unit 4 has a single-layer structure in which the third base material 41 covers the periphery of the axon flow path 42, but by stacking the third unit 4, It may have a multilayer structure.
  • the axon extending from the first opening 45 to the skeletal muscle tissue 10 has a three-dimensional structure, which facilitates formation of the neuromuscular junction.
  • the device 5 for culturing motor neurons has already been described in the third and fourth embodiments of the device 1. Therefore, the description will be duplicated, and the description of the device 5 for culturing motor neurons will be omitted.
  • the second unit 3 and the third unit 4 may be integrated, or the second unit 3 and the third unit 4 may be combined.
  • the device 5 for culturing motor neurons may be produced by using parts common to the unit 4 and combining the parts. For example, a part of the second base material 31 and the third base material 41 may be configured by one part.
  • the motor neuron cell culture device 5 is combined with the first unit 2 to fabricate the coculture device 1
  • the third unit 4 includes the first flow channel 42b and the second flow channel 42c formed inside the first flow channel 42b shown in FIG. 7A
  • the device 5 for culturing motor neurons is , May be used alone as a model device for reproducing axon tear and regeneration.
  • a pathological condition called neuropathy is known in which normal conduction of peripheral nerves is impaired.
  • axonal degenerative neuropathy due to traumatic or local axotomy is known.
  • shear stress is applied to the axon between the second opening 45a of the second channel 42c and the first opening 45 of the first channel 42b of the device 5 for culturing motor neurons. It can be expected to be applied to the axonal degenerative neuropathy model by rupturing due to such factors as, and then regenerating. Note that, of course, the model for reproducing the tearing and regeneration of the axon may be prepared using the coculture device 1.
  • the multi-well plate 500 will be described with reference to FIG. 9B.
  • 9B(a) is a top view showing the outline of the multi-well plate 500
  • FIG. 9B(b) is a sectional view taken along line XX′ of FIG. 9B(a).
  • the multi-well plate 500 has a base material 501 and at least two wells 502 formed in the base material 501. Then, in at least one of the wells 502, the device 1 described in the first to fourth embodiments and the device selected from the device 5 for culturing motor neurons are arranged.
  • a pair of electrodes 503 may be formed in any well 502 as necessary.
  • a circuit 504 for connecting the pair of electrodes 503 and a power supply device may be formed on the base material 501.
  • the multi-well plate 500 is not particularly limited in the number and shape of the wells 502 as long as the devices 1 and 5 can be arranged in the wells 502.
  • the well 502 is formed in the substrate 501 in a substantially columnar shape, but may have a hemispherical shape or a substantially polygonal pillar shape, for example.
  • the devices 1 and 5 arranged in the well 502 may all be of the same type, or may be arranged by combining different types. Further, the devices 1 and 5 may be arranged in a part of the well 502, or the devices may be arranged in all the wells 502. The devices 1 and 5 may be arranged so as to be attachable to and detachable from the well 502, in other words, may be only inserted into the well 502, or may be disposed so as not to be detachable. In the case where the devices 1 and 5 are arranged so as not to be detachable, the devices 1 and 5 may be fixed to the wall surface of the well 502 using an adhesive or the like.
  • the devices 1 and 5 By arranging the devices 1 and 5 in the well, the following effects are synergistically exhibited. (1) When the medium is introduced into the first medium introduction hole 221 or the second medium introduction hole 321, the medium remains in the well 502 even when the medium overflows from the first culture tank or the second culture tank. The convenience of adding the medium is improved. (2) By arranging the devices 1 and 5 on a Mullwell plate, it is possible to assay or screen a plurality of drugs at the same time, and it is possible to achieve high throughput. In the example shown in FIG. 9B, since the devices 1 and 5 are arranged in the well 502, the effect of (1) above and high throughput of drug assay and the like can be achieved at the same time.
  • the devices 1 and 5 may be arranged not on a multiwell plate but on a plate-like member having no wells such as a glass substrate and used. Good. (3) Further, when a pair of electrodes 503 is arranged in the well 502, it is possible to apply electrical stimulation to the produced evaluation model. In the example shown in FIG. 9B, the pair of electrodes 503 is provided in the well 502, but alternatively, the pair of electrodes may be provided on the inner wall surface of the culture tank of the devices 1 and 5 or the like. ..
  • a pair of electrodes is inserted into the well 502 of the well plate 500, the culture tank of the device 1 or 5, or the like, so that the evaluation model is electrically stimulated. May be given.
  • FIG. 10 is a flowchart of an embodiment of a method for producing an evaluation model.
  • the embodiment of the method for producing the evaluation model includes a motor neuron cell culture step (ST1), a skeletal muscle tissue preparation step (ST2), and a neuromuscular junction preparation step (ST3).
  • motor neurons are cultured in the second culture tank 32 of the second unit 3.
  • the motor neuron is not particularly limited as long as it can grow the axon 11 by culturing.
  • the motor nerve cells described in Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 can be used.
  • the motor neurons the dissociated motor neurons may be cultured in the second culture tank 32, or spheroids in which the motor neurons are agglomerated may be used.
  • the medium for culturing the motor neurons may be appropriately selected depending on the motor neurons used.
  • skeletal muscle cells are cultured in the first culture tank 22 of the first unit 2 to produce skeletal muscle tissue.
  • the skeletal muscle cells are not particularly limited as long as they can form the skeletal muscle tissue 10 between the pillars 23 by culturing.
  • the skeletal muscle cells for example, the skeletal muscle cells described in Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 may be used.
  • the medium for culturing skeletal muscle cells may be appropriately selected according to the skeletal muscle cells used.
  • the order of the step of culturing motor neurons (ST1) and the step of preparing skeletal muscle tissue (ST2) may be reversed or may be performed simultaneously.
  • the axon 11 extending from the cell body of the cultured motor neuron passes through the axon channel 42 of the third unit 4 and is produced in the first culture tank 22.
  • a neuromuscular junction is created by joining with tissue.
  • the skeletal muscle tissue is floating in the medium, and the skeletal muscle tissue and the cell body of the motor nerve cell are separated, so that both can be joined by the axon 11, so that the evaluation is closer to the actual human body.
  • a model can be created.
  • the device 1 disclosed in the present specification uses a medium for culturing motor neurons and skeletal muscle cells. Therefore, the axon flow path 42 of the third device 4 and the first axon passage hole 451 (second axon passage hole 451′) smaller than the axon flow path 42 can permeate the medium with a capillary force. it can.
  • the device described in Non-Patent Document 2 (method for producing an evaluation model) uses collagen gel as a scaffold for extending axons, but collagen gel has viscosity. Therefore, in the invention described in Non-Patent Document 2, if the channel through which the axon extends is simply thinned, the collagen gel containing the medium cannot penetrate into the channel.
  • the device 1 disclosed in the present specification and the method for producing an evaluation model using the device 1 include the axon channel 42 and the first axon passage hole 451 (the second axon passage hole) as a scaffold on which the axon 11 extends. 451'), and further based on a new finding combining a medium that permeates the scaffold.
  • the evaluation model produced by the device 1 disclosed in the present specification exhibits the following combined effects in addition to the effect of making it easy to observe the movement of skeletal muscle tissue by not using collagen as a scaffold.
  • a scaffold is formed from collagen gel
  • the drug needs to penetrate into the collagen gel in order to stimulate the motor nerve cells, axon, and skeletal muscle tissue with the drug. Therefore, rapid screening of drugs is not possible.
  • the drug diffuses when penetrating into the collagen gel, which makes it difficult to perform screening that specifies targets of motor neurons, axons extending from cell bodies of motor neurons, and skeletal muscle tissue.
  • the motor nerve cells, the skeletal muscle tissue, and the axons extending from the cell bodies of the motor nerve cells are separated. Therefore, targeted drug screening can be performed.
  • axons extending from the cell bodies of motor neurons, skeletal muscle tissue, and motor neurons are formed in the medium, respectively, the drug can be rapidly screened.
  • collagen gel is a gel derived from a living body, the characteristics differ from lot to lot.
  • the characteristics of the gel change when the conditions such as the temperature change, the variation among the manufactured evaluation models increases.
  • the evaluation model manufactured by the device 1 disclosed in the present specification uses the medium, the fluctuation of the manufactured evaluation model can be reduced.
  • Non-Patent Document 2 the entire device 1 is covered with collagen gel. Therefore, for example, even if an attempt is made to investigate the effect on the motor nerve cells when electrical stimulation is applied to skeletal muscle tissue, electricity leaks through the collagen gel and it is difficult to apply selective electrical stimulation.
  • the skeletal muscle tissue and the motor neuron communicate with each other through only the first axon passage hole 451 (second axon passage hole 451′). There is. Therefore, selective electrical stimulation of skeletal muscle tissue and motor neurons is possible.
  • Non-Patent Document 2 since the axons extend in random directions in the collagen gel and reach the skeletal muscle tissue, the axons toward the skeletal muscle tissue cannot be adjusted.
  • the evaluation model produced by the device 1 disclosed in the present specification since the axon needs to pass through the first axon passage hole 451, the number and intervals of the axons extending to the skeletal muscle tissue can be adjusted. .. Therefore, variations in the produced evaluation model can be reduced.
  • an evaluation model is produced using the device 1 including the third unit 4 having the first flow channel 42b and the second flow channel 42c. Then, a step of rupturing the axon between the second opening 45a of the second flow path 42c and the first opening 45 of the first flow path 42b and then regenerating the axon may be added.
  • the skeletal muscle tissue producing step (ST2) and the neuromuscular junction producing step (ST3) may be omitted.
  • the bone motor neuron cell culture step ( After performing ST1), the step of rupturing the axon between the second opening 45a of the second flow path 42c and the first opening 45 of the first flow path 42b, and then regenerating the axon may be added. Good.
  • FIG. 11 is a flowchart of an embodiment of the screening method.
  • the embodiment of the screening method includes a test substance administration step (ST11), an observation step (ST12), and a test substance evaluation step (ST13).
  • the test substance is administered to any one of motor neurons, axons extending from the cell body of the motor neurons of the evaluation model thus prepared, and skeletal muscle tissue.
  • the test substance is not particularly limited as long as it is a substance known as a drug such as a low molecular weight compound, a nucleic acid, an antibody and a protein.
  • the test substance may be administered to the second culture tank.
  • it may be dissolved in a medium and administered as necessary.
  • a test substance may be administered to the axons.
  • the test substance When the test substance is administered to the axon, the test substance may be passed through the first channel 42b of the third unit 4 shown in the second embodiment. Alternatively, when the length of the axon is relatively long, the test substance may be administered to the axon near the first opening 45 of the third unit 4 shown in the first embodiment. Alternatively, for example, a through hole penetrating the axon channel 42 may be formed in the third base material 41 of the third unit 4 shown in FIG. 3B, and the test substance may be administered into the axon channel 42.
  • the measurement step (ST12) at least one state of motor nerve cells, axons extending from the cell body of the motor nerve cells, and skeletal muscle tissue after the test substance is administered in the test substance administration step is measured.
  • the measuring step is not particularly limited as long as it can measure changes in the state of motor neurons, axons extending from the cell bodies of motor neurons, and skeletal muscle tissue before and after administration of the test substance.
  • the state of the skeletal muscle tissue 10 the movement of the skeletal muscle tissue 10 may be measured.
  • the movement of the skeletal muscle tissue may be measured directly or indirectly.
  • a direct measuring method an example of observing the motion of the skeletal muscle tissue 10 with a moving image using an image sensor is given.
  • a load is applied to the pillar 23. Therefore, as an indirect measurement method, an example in which a strain sensor is arranged inside or on the surface of the pillar 23 and the force related to the strain sensor is measured can be given.
  • the measurement of the state of axons includes, for example, the increase/decrease in the number of axons due to the influence of the test substance, the change in elongation, the cutting and regeneration status of axons, etc.
  • Examples of the measurement method include measurement using an image sensor.
  • the measurement of the state of the motor neuron includes, for example, the death or growth of the motor neuron due to the influence of the test substance and the change in the shape of the mass (spheroid) of the motor neuron due to the death or growth.
  • Examples of the measurement method include measurement using an image sensor.
  • test substance evaluation step (ST13) it is evaluated from the measurement result of the measurement step (ST12) whether the test substance acts as a therapeutic agent for neuromuscular disease.
  • a human may evaluate the measurement result, or the movement of the skeletal muscle tissue of the human body when the therapeutic agent is administered is stored in the memory means in advance, and the movement similar to that when the therapeutic agent is administered is performed.
  • the test substance may be evaluated as having a therapeutic effect.
  • the neuromuscular disease is not particularly limited as long as it is a disease relating to signal transduction between motor neurons and skeletal muscle tissue.
  • hereditary diseases caused by gene mutations such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and bulbar and spinal muscular atrophy (SBMA) can be mentioned.
  • Other than genetic diseases for example, brachial plexus damage, facial nerve palsy, and other diseases caused by axon extending from the cell body of motor neurons by physical shock or neurotoxic substances are mentioned. ..
  • a template for preparing a device was prepared by the following procedure.
  • Photolithography of the template was performed using laser lithography.
  • the device used was Heidelberg DWL66FS (Heidelberg Instruments, Heidelberg, Germany).
  • CS HARDMASK BLANKS CBL3006Cu-AZP, CLEAN SURFACE TECHNOLOGY, Kanagawa, Japan
  • This photomask has a layer of chromium on a glass plate, and a photosensitive material AZP1350 is applied thereon.
  • a laser designed pattern was drawn on a photomask and developed with NMD3.
  • a mold was prepared using the prepared photomask.
  • a mask aligner MA-6 (Suss Micro Tec AG) was used.
  • SU-8 3005 (Nippon Kayaku Co., Ltd., Tokyo, Japan.
  • SU-8 3005 to the extent that 80% of the whole is hidden in a silicon wafer (Polishing Wafer (4PTP-1-100, Global Wafers, Hsinchu, Taiwan)).
  • Is cyclopentanone (C0510, Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan), and the spin speed is increased to 500 rpm at 100 rpm/sec for 30 seconds.
  • the number of rotations was increased to 3000 rpm at 300 rpm/sec and spin coating was performed for 30 seconds. After that, heating was performed at 95° C.
  • the photomask on which the completed silicon wafer and flow path pattern were provided was set on MA-6, and exposed to ultraviolet rays for 40 seconds.
  • the exposure hardens the SU-8 into the same shape as the pattern on the photomask.
  • it was heated at 65° C. for 1 minute 50 seconds and at 95° C. for 20 seconds (Postbake).
  • SU-8 3050 Nippon Kayaku Co., Ltd., Tokyo, Japan was placed on the silicon wafer until 80% of the whole was hidden, and the speed was increased to 2000 rpm at 100 rpm/sec and spin-coated for 30 seconds. It was Then, it was heated at 95° C.
  • FIGS. 12A and 12B The produced mold is shown in FIGS. 12A and 12B.
  • FIG. 12A is a mold corresponding to the axon flow channel of the first embodiment, and FIG.
  • FIG. 12B is a mold corresponding to the axon flow channel (first flow channel+second flow channel) of the second embodiment.
  • a device manufactured using the mold shown in FIG. 12A may be described as “device a”
  • a device manufactured using the mold illustrated in FIG. 12B may be described as “device b”.
  • the surfaces to be bonded are plasma-treated so that the PDMSs can be bonded to each other.
  • PLASMA CLEANER PDC-32G, HARRICK PLASMA, New York, USA was used for the plasma treatment.
  • FIG. 13 is a photograph of the prepared motor neuron cell culture devices a and b.
  • the arrow portions of the device for culturing nerve cells b are a test substance input hole and a test substance recovery hole which are formed in the second base material 31 and communicate with the first flow path 42b.
  • PDMS was poured into a mold (see FIG. 14) and heated at 70° C. for 1 hour to solidify PDMS. After removing from the mold, a disk made of thin film PDMS was placed on the pillar of the first unit. The thin film disk was prepared by placing 0.2 g of PDMS on a Teflon sheet, increasing the rotation speed to 1000 rpm in 30 seconds, and spin-coating for 30 seconds. Then, PDMS was solidified by heating at 70° C. for 1 hour. Further, 0.2 g of PDMS was placed, the rotation speed was increased to 2000 rpm in 30 seconds, and spin coating was performed for 30 seconds.
  • a circle with a diameter of 1.5 mm is cut out from this thin film of PDMS with a biopsy (8-5845-02, kai industries, Japan), attached to the upper part of the pillar of the first unit, and heated at 70°C for 1 hour to the tip of the pillar.
  • the thin film disc was fixed.
  • FIG. 15 is a photograph of the manufactured devices a and b.
  • FIG. 15A is a photograph from above of the manufactured devices a and b
  • FIG. 15B is a photograph from above of the manufactured devices a and b.
  • Example 2 [Production of evaluation model] An evaluation model was prepared using the materials and methods described below.
  • Laminin coating was performed by adding 3 ml of PBS, adding 25 ⁇ l of iMatrix-511 (381-07363, Wako, Tokyo, Japan) thereto, and incubating for 1 hour or more in a CO 2 incubator.
  • iMatrix-511 381-07363, Wako, Tokyo, Japan
  • AK02N 2.5 ml of AK02N was added in a state where the iMatrix solution was contained to make the mixture acclimatize, and then the solution was removed, and 5 ml of AK02N was added.
  • 5 ⁇ l of ROCK inhibitor Y-27632 (08945-71, Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) was added and incubated in a CO 2 incubator until just before seeding.
  • TrypLE registered trademark
  • Select CTS registered trademark
  • UltraPure registered trademark 0 1 M trypsin solution prepared by mixing 1:5 M EDTA pH 8.0 (15575-038, Life Technologies, Calif., USA) was added, and the mixture was incubated in a CO 2 incubator for 4 minutes.
  • the trypsin solution was removed, and the cells were washed once with PBS, 2.5 ml of AK02N was added, and the cells were collected with a cell scraper (9902, TPP, Switzerland).
  • the collected cells were suspended 10 times with 1 ml Pipetman, and then the number of cells was calculated with a TC20 (registered trademark) fully automatic cell counter (California, USA). Then, the T25 flask was inoculated so as to have 32500 cells and incubated in a CO 2 incubator. The medium was changed 24 hours after seeding to remove Y-27632. Thereafter, the medium was replaced every 48 hours, and when the cells approached confluence, the medium was replaced every 24 hours.
  • the growth medium was DMEM (20% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-glutamine (073-05391, Wako, Tokyo, Japan), 0.5% penicillin/streptomycin, 2% Ultroser G serum New, 15P9, 10% substrate). City, USA) was used.
  • FIG. 17 is a diagram showing the procedure of co-culture.
  • the device prepared in Example 1 was fixed to the bottom of the well of a 12-well plate for convenience of experiments such as medium exchange. After fixing the device and the well, UV sterilization was performed for 1 hour. After that, plasma treatment (11 W, 30 sec) was performed to perform matrigel coating. Matrigel (354234, CORNING, New York City, USA) was added to serum-free DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) (042-30555, Wako, Jako, Tokyo).
  • DMEM/F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
  • the device Diluted and placed in the device.
  • the bottom surface of the device was completely filled with the Matrigel solution and allowed to stand at room temperature for 3 hours.
  • the matrigel solution was allowed to stand while being deaerated so that the Matrigel solution could be spread over the entire channel.
  • all Matrigel solutions were pulled out with an aspirator.
  • the protein contained in Matrigel is adsorbed to the second culture tank 32 and the axon channel 42, so that the motor neurons are easily adsorbed to the second culture tank 32 and the axons are easily adsorbed to the axon channel 42. ..
  • MN medium motor nerve medium containing the following medium additives was used in KBM Neural Stem Cell Kit (16050100, Kohjin bio, Saitama, Japan).
  • Media additives are 2% B-27 (17504-044, Thermofisher, Massachusetts, USA), 1% non-essential amino acids; NEAA (11140050, Lifetechnologies, California, USA, 60 g, USA), 1 ⁇ M-DAMc, USA, 1 ⁇ M.
  • human skeletal muscle cells Hu5KD3 were seeded in the first culture tank. Specifically, cells cultured in a T-75 flask were collected in the same manner as in the passage procedure, the cell number was measured, and fibrinogen (F8630, Sigma-Aldrich, Missouri, USA), Matrigel, Thrombin from bovine plasma were collected. (Thrombin: T4648, Sigma-Aldrich, Missouri, USA) A solution containing 2 ⁇ DMEM was seeded in the first culture tank at 2 ⁇ 10 6 cells/ml. The composition of the final solution is shown in Table 2. Tissue formation/proliferation/differentiation was performed by adding 3 ml of MN medium so as to fill the entire well containing the device.
  • 6-Amino caproic Acid (A2504, Sigma-Aldrich, Missouri, USA) (6AA) was added at 2.0 mg/ml in order to prevent the degradation of muscle tissue.
  • the matrigel bonding is an auxiliary procedure and may be omitted.
  • the medium was exchanged once every two days with a half volume change. An evaluation model was produced by the above procedure.
  • FIG. 18A is an enlarged photograph near the first opening of the third unit of the evaluation model manufactured using device a.
  • FIG. 18B is an enlarged photograph near the first opening of the third unit of the evaluation model manufactured using the device b.
  • the evaluation model produced using the device a and the device b shows that the axon extends in the axon channel and that the axon passes through the first axon passage hole (second axon passage hole). confirmed.
  • Triton X-100 T8787-250 ml, Sigma Aldrich, Missouri, USA
  • PBS 0.3% Triton X-100 (T8787-250 ml, Sigma Aldrich, Missouri, USA)/PBS was added, and the membrane was allowed to pass through the membrane for 5 minutes at room temperature.
  • blocking was performed by washing three times with PBS, adding the primary antibody/basic solution, and leaving it to stand for 1 hour.
  • the composition of the basic solution was 10% Goat serum (S-1000, Vector Laboratories, Calif., USA)+0.01% Triton X-100/PBS.
  • a basic solution prepared by mixing the primary antibody so as to have a concentration of 2 ⁇ g/ml was added and reacted at 4° C. overnight.
  • the primary antibody used for immunostaining of myotubes is TUJ1 (845501, Biolegend, USA).
  • the solution was withdrawn, washed 3 times with PBS, and a basic solution containing a secondary antibody at a concentration of 4 ⁇ g/ml was added and reacted for 1 hour.
  • the secondary antibody used was CF543 (registered trademark) Goat anti-rabbit IgG (H+L), Highly Vross-adsorbed, 2 mg/ml (20300, BIOTIUM, California, USA).
  • Fluoredcein-alpha-bungarotoxin (PK-CA707-00011, PromoKine, Heidelberg, Germany), which is a fluorescent dye of ⁇ -bungarotoxin, which is an antagonist, is used at a final concentration of 4 ⁇ g/ml.
  • the cells were washed 3 times with PBS and observed with a confocal microscope.
  • FIG. 19 is a photograph taken with a confocal microscope, and the stained portion at the tip of the triangle in the figure shows that the aggregation of acetylcholine receptors was stained. Acetylcholine receptors are aggregated at the neuromuscular junction. Since staining of acetylcholine receptor aggregation was confirmed in the produced evaluation model, it was confirmed that a neuromuscular junction was formed in the produced evaluation model.
  • tetrodotoxin (TTX, 206-11071, Wako, Tokyo, Japan) is adjusted to a final concentration of 2 ⁇ M after about 20 seconds.
  • Tetrodotoxin selectively blocks Na channels in motor excitable membranes.
  • a moving image was photographed using BZ-X710, and the state of contraction was graphed using the moving image analysis software PV Studio 2D (OA Science, Miyazaki, Japan).
  • FIG. 20 is a graph showing contraction of skeletal muscle tissue before and after drug addition.
  • skeletal muscle tissue contracted by administering glutamic acid to the second culture vessel, that is, to the motor neurons.
  • the administration of tetrodotoxin stops the contraction of skeletal muscle tissue.
  • the evaluation model produced using the device disclosed in the present specification indicates that the axon extending from the cell body of the motor neuron is joined to the skeletal muscle tissue to form the neuromuscular junction. It was confirmed.
  • the therapeutic model for neuromuscular disease can be screened by using the evaluation model disclosed in this specification.
  • 21A and 21B are photographs observed with a microscope, in which the brightness is changed at the same place.
  • the bright part at the tip of the arrow in the photograph is the stained axon. It was confirmed that by introducing the staining reagent into the first channel, only the axon in the first channel can be selectively stained. Therefore, it was confirmed that if a test substance for a therapeutic drug for neuromuscular disease is used instead of the staining reagent, it can be used for screening for a therapeutic drug that specifically affects axons.
  • the evaluation model prepared by co-culturing the motor neurons and the skeletal muscle cells using the device prepared in Example 1 was used until another experiment on the 27th day until the motor neurons and the skeletal muscle cells were used. No fusion was seen.
  • the evaluation model produced using the device described in Non-Patent Document 2 shows that 14 days after the start of co-culture, the motor nerve cells crossed the pillar. Therefore, when an evaluation model is manufactured using a device disclosed in this specification, an axis extending from a motor neuron or a cell body of a motor neuron for a long period of time is compared with an evaluation model manufactured using a conventional device. It can be evaluated with the cord and skeletal muscle tissue separated.
  • Example 3> [Confirmation of axonal rupture and regeneration]
  • motor neurons were cultured in the same procedure as in (1) of ⁇ Example 2> above.
  • a syringe pump was used to flow the medium into the first flow passage 42b from one end 42b1 of the first flow passage 42b with a shear stress of about 60 Pa.
  • 22A to 22C are enlarged photographs of the vicinity of the second opening 45a of the third unit 4 after completion of the culture.
  • FIG. 22A is a photograph at the end of the culture of motor neurons, and confirmed axons (arrows in FIG.
  • FIG. 22A is a photograph after a lapse of about 30 seconds after flowing the medium with a shear stress of about 60 Pa, and confirmed that the axons were ruptured.
  • FIG. 22C is a photograph about 24 hours after the axonal rupture, and it was confirmed that the axons were regenerated (arrow in FIG. 22C). From the above results, it was confirmed that axon rupture and regeneration can be performed by using the device disclosed in the present application.
  • the evaluation model produced using the device, and the screening method using the evaluation model a therapeutic drug for neuromuscular disease can be screened. Therefore, it is useful for drug discovery in medical institutions, universities, companies, research institutions and the like.
  • Second axon passage hole 451a, 451'a... First opening surface, 451b, 451'b... Second opening surface, 500... Multi-well plate, 501... Substrate, 502... Well, 503... Pair of electrodes, 504... Circuit

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Abstract

コラーゲンゲルを足場に用いない運動神経細胞と骨格筋細胞の共培養用デバイスの提供を行うことを課題とする。　骨格筋組織形成用の第１ユニットと、運動神経細胞培養用の第２ユニットと、第１ユニットと第２ユニットとを連通するための第３ユニットと、骨格筋組織形成の足場となるピラーとを含み、第１ユニットは、第１基材と、第１基材に形成された第１培養槽とを含み、第２ユニットは、第２基材と、第２基材に形成された第２培養槽とを含み、第３ユニットは、３基材と、第３基材に形成され、軸索の束が通る軸索流路とを含み、第３ユニットの一端部分は第２ユニットに連結することができ、第３ユニットの一端部分と第２ユニットとを連結した時には、軸索流路と第２培養槽とを連通することができ、第３ユニットの他端部分には第１開口部が軸索流路に接するように形成され、第１開口部には、第１軸索通過孔が１以上形成され、第１軸索通過孔は、運動神経細胞の細胞体および骨格筋細胞は通過できないが、軸索が通過できる大きさであり、ピラーの少なくとも一部は、第１培養槽内に配置できる、デバイスにより、課題を解決できる。

Description

共培養用デバイス、運動神経細胞培養用デバイス、マルチウェルプレート、神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法、および、神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法
　本出願における開示は、共培養用デバイス、運動神経細胞培養用デバイス、マルチウェルプレート、神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法、および、神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法に関する。より具体的には、人体の構造により近い神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルを作製するための共培養用デバイスおよび運動神経細胞培養用デバイス、デバイスをウェルに配置したマルチウェルプレート、並びに、神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルを用いた神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法に関する。
　様々な神経筋疾患に於いて、運動神経細胞や骨格筋細胞の変性、あるいは、運動神経細胞と骨格筋組織の接合部である神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ：ＮＭＪ）の異常により、生命も脅かされる進行性の運動機能障害がもたらされる。神経筋疾患の例としては、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｌａｔｅｒａｌ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）、球脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ　ａｎｄ　Ｂｕｌｂａｒ　Ｍｕｓｃｕｌａｒ　Ａｔｒｏｐｈｙ：ＳＢＭＡ）、等が知られている。
　神経筋疾患の発症メカニズムの研究や治療薬のスクリーニングをｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うための、デバイス（評価モデル）が知られている。例えば、骨格筋細胞を先ず培養して骨格筋組織を作製し、その上に運動神経細胞を培養する技術が知られている（非特許文献１参照）。しかしながら、非特許文献１に記載された方法では、骨格筋組織と運動神経細胞が混合した状態になるため、実際の人体中での構造と異なるという問題がある。
　図１は、デバイス（評価モデル）の従来技術のその他の例を示す図である（非特許文献２参照）。図１に示すデバイスの例では、ＰＤＭＳを用い、骨格筋組織形成用区画と運動神経細胞区画とを分けている。図１に示す例では、先ず、骨格筋組織形成用区画で骨格筋細胞を培養し、骨格筋組織（符号Ａ）を作製する。次に、運動神経細胞区画にコラーゲンゲルを含む運動神経細胞スフェロイドを投入する（符号Ｂ）。なお、運動神経細胞区画には、運動神経細胞スフェロイドを所定の位置に配置するための複数のピラー（符号Ｐ）が設けられている。そして、培養を続けることで、運動神経細胞から伸びた軸索（符号Ｃ）が骨格筋組織と結合することで、神経筋接合部を形成することができる。
Ｙ．Ｍｏｒｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｎｅｕｒｏｎｅｍｕｓｃｌｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ　ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ"，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　３４　（２０１３）　９４１３－９４１９ Ｔ．Ｏｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　３Ｄ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　（ＡＬＳ）　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｏｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎｓ"，　Ｓｃｉ．　Ａｄｖ．２０１８；４：ｅａａｔ５８４７
　非特許文献２に記載されているデバイス（評価モデル）は、運動神経細胞と骨格筋組織を３次元に配置し、更に、軸索が伸びるための足場として、コラーゲンゲルを用いている。そのため、コラーゲンゲルは、骨格筋組織形成用区画、運動神経細胞区画、および骨格筋組織形成用区画と運動神経細胞区画とを繋ぐ流路に添加する必要がある。
　しかしながら、上記のとおり、非特許文献２に記載されているデバイス（評価モデル）は、運動神経細胞と骨格筋組織の周囲は、足場となるコラーゲンゲルで覆われる必要がある。そのため、非特許文献２に記載されたデバイスを用いて神経筋接合部が形成された評価モデルを作製しても、時間の経過とともに、図２に示すように、運動神経細胞スフェロイドがピラーを乗り越えるように成長し、骨格筋組織も成長して広がることから、運動神経細胞と骨格筋組織とが融合してしまうという問題がある。また、非特許文献２に記載されている評価モデルは、骨格筋組織等がコラーゲンゲル中に形成される。そのため、骨格筋組織の動きがコラーゲンゲルにより抑制されるという問題がある。更に、骨格筋組織の動きを観察する際にはコラーゲンゲルを介して観察する必要があることから、骨格筋組織の動きを観察しにくいという問題がある。
　本出願における開示は、上記問題点を解決するためになされたものであり、コラーゲンゲルを足場に用いないデバイス（評価モデル）の鋭意研究を行ったところ、（１）培地を添加できる第１培養槽を有する骨格筋組織形成用の第１ユニット、（２）培地を添加できる第２培養槽を有する運動神経細胞培養用の第２ユニット、（３）第１ユニットと第２ユニットを連通する第３ユニット、を含み、（４）第３ユニットに、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過できないが、軸索は通過できる軸索通過孔が形成された開口部を設けることで、第３ユニットを軸索が通過できる足場として用いた神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルを作製できること、を新たに見出した。
　すなわち、本出願における開示の目的は、共培養用デバイス、運動神経細胞培養用デバイス、マルチウェルプレート、神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法、および、神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することである。
　本出願における開示は、以下に示す、共培養用デバイス、運動神経細胞培養用デバイス、マルチウェルプレート、神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法、および、神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法に関する。
（１）運動神経細胞と骨格筋細胞の共培養用デバイスであって、
　デバイスは、
　　骨格筋組織形成用の第１ユニットと、
　　運動神経細胞培養用の第２ユニットと、
　　第１ユニットと第２ユニットとを連通するための第３ユニットと、
　　骨格筋組織形成の足場となるピラーと、
を含み、
　第１ユニットは、
　　第１基材と、
　　第１基材に形成された第１培養槽と、
を含み、
　第２ユニットは、
　　第２基材と、
　　第２基材に形成された第２培養槽と、
を含み、
　第３ユニットは、
　　第３基材と、
　　第３基材に形成され、軸索の束が通る軸索流路と、
を含み、
　　第３ユニットの一端部分は第２ユニットに連結することができ、第３ユニットの一端部分と第２ユニットとを連結した時には、軸索流路と第２培養槽とを連通することができ、
　　第３ユニットの他端部分には第１開口部が軸索流路に接するように形成され、第１開口部には、第１軸索通過孔が１以上形成され、
　　第１軸索通過孔は、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過できないが、軸索が通過できる大きさであり、
　　ピラーの少なくとも一部は、第１培養槽内に配置できる、
デバイス。
（２）軸索流路が、
　　第１流路と、
　　第１流路の内側に形成された第２流路と、
を含み、
　第１開口部は、第１流路に接するように形成され、
　第２流路は、
　　一端が第２培養槽に連通することができ、
　　他端には、第２開口部が接するように形成され、
　第２開口部には、
　　第２軸索通過孔が１以上形成され、
　　第２軸索通過孔は、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過できないが、軸索が通過できる大きさであり、
　第１開口部と第２開口部は離間して配置されている、
上記（１）に記載のデバイス。
（３）２以上の第３ユニットが、積層されている、
上記（１）または（２）に記載のデバイス。
（４）第１ユニット、第２ユニット、第３ユニット、および、ピラーの位置関係は、
　　ピラーが２本以上含まれる場合は、２本以上のピラーを結んだ仮想面の何れかと、軸索流路を第１培養槽に仮想的に延長した仮想軸索流路が交わるように配置され、
　　ピラーが１本の場合は、１本のピラーが形成する仮想面、または、ピラーと第３ユニットの他端部分で形成する仮想面と、軸索流路を第１培養槽に仮想的に延長した仮想軸索流路が交わるように配置される、
上記（１）～（３）の何れか一つに記載のデバイス。
（５）ピラーが２本含まれ、各々のピラーの一端は第１基材２１に連結し、他端は第１培養槽内に片持ち状に配置される、
上記（４）に記載のデバイス。
（６）第１軸索通過孔の大きさが、
　　最小距離が０．５μｍ以上、２．５μｍ以下、または、
　　最小距離が０．５μｍ以上で、断面積が６０μｍ2以下である、
上記（１）～（５）の何れか一つに記載のデバイス。
（７）第２ユニットと第３ユニットを連結することで運動神経細胞培養用デバイスを作製し、
　一つの第１ユニットに対して、２以上の運動神経細胞培養用デバイスが配置される、
上記（１）～（６）の何れか一つに記載のデバイス。
（８）一つの第２ユニットに２以上の第３ユニットを連結することで運動神経細胞培養用デバイスを作製し、
　任意の第３ユニットの他端に第１ユニットが配置される、
上記（１）～（６）の何れか一つに記載のデバイス。
（９）運動神経細胞と骨格筋細胞の共培養用デバイスに用いられる運動神経細胞培養用デバイスであって、
　デバイスは、
　　運動神経細胞培養用の第２ユニットと、
　　第２ユニットに連結した第３ユニットと、
を含み、
　第２ユニットは、
　　第２基材と、
　　第２基材に形成された第２培養槽と、
を含み、
　第３ユニットは、
　　第３基材と、
　　第３基材に形成され、軸索の束が通る軸索流路と、
を含み、
　　第３ユニットの一端と第２ユニットは連結し、軸索流路の一端は第２培養槽に連通し、
　　第３ユニットの他端部分には第１開口部が軸索流路に接するように形成され、第１開口部には、第１軸索通過孔が１以上形成され、
　　第１軸索通過孔は、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過できないが、軸索が通過できる大きさである、
デバイス。
（１０）少なくとも２以上のウェルを有し、
　前記ウェルの少なくとも１つに、上記（１）～（９）の何れか一つに記載のデバイスが配置されている、
マルチウェルプレート。
（１１）上記（１）～（８）の何れか一つに記載のデバイスを用いた神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法であって、
　作製方法は、
　　第２ユニットで運動神経細胞を培養する運動神経細胞培養工程と、
　　第１ユニットで骨格筋細胞を培養し、骨格筋組織を作製する骨格筋組織作製工程と、
　　培養した運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索が、第３ユニットの軸索流路を通り、作製した骨格筋組織と接合することで神経筋接合部を作製する神経筋接合部作製工程と、
を含む、神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法。
（１２）上記（１１）に記載の作製方法で作製した神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルを用いた神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、
　スクリーニング方法は、
　　作製した評価モデルの運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織の何れか一つに被験物質を投与する被験物質投与工程と、
　　運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織の少なくとも一つの状態を測定する測定工程と、
　　測定工程の結果より、被験物質が神経筋疾患の治療薬として作用するのか評価する被験物質評価工程と、
を含む、
スクリーニング方法。
　本出願で開示する共培養用デバイスを用いて作製した評価モデルは、コラーゲンを足場として用いていない。したがって、骨格筋組織の動き等の観察がしやすくなる。
図１は、デバイス（評価モデル）の従来技術の一例を示す図である。 図２は図面代用写真で、従来技術のデバイスを用いて作製した評価モデルは、時間の経過とともに、運動神経細胞と骨格筋組織とが融合することを示している。 図３Ａ乃至図３Ｈは、デバイス１ａの概略を示す図である。 図４Ａ乃至図４Ｃは、デバイス１ａの第２ユニットと第３ユニットの一端部分の連結の、他の実施形態の一例を示す図である。 図５Ａ乃至図５Ｃは、第３ユニットについてさらに詳しく説明するための図である。 図６Ａおよび図６Ｂは、デバイス１ａの第１開口面および第２開口面について、より詳しく説明するための図である。 図７Ａおよび図７Ｂは、第２の実施形態に係るデバイス１ｂについて説明するための概略断面図である。 図８Ａおよび図８Ｂは、第３の実施形態に係るデバイス１ｃについて説明するための概略上面図である。 図９Ａは、第４の実施形態に係るデバイス１ｄについて説明するための概略上面図である。 図９Ｂ（ａ）および（ｂ）は、マルチウェルプレートの実施形態の概略を説明するための図である。 図１０は、評価モデルの作製方法の実施形態のフローチャートである。 図１１は、スクリーニング方法の実施形態のフローチャートである。 図１２は図面代用写真で、実施例１で作製した鋳型の写真である。 図１３は図面代用写真で、実施例１で作製した運動神経細胞培養用デバイスの写真である。 図１４は、実施例１の第１ユニットを作製するための鋳型図面である。 図１５は図面代用写真で、実施例１で作製したデバイスの写真である。 図１６は、実施例２の評価モデルの作製において、分化誘導の概要を示す図である。 図１７は、実施例２の評価モデルの作製において、共培養の手順を示す図である。 図１８は図面代用写真で、実施例２で作製した評価モデルの第３ユニットの第１開口部付近の拡大写真である。 図１９は図面代用写真で、実施例２で作製した評価モデルの神経筋接合部を染色し、共焦点顕微鏡で撮像した写真である。 図２０は、実施例２で作製した評価モデルに薬剤を添加した前後の骨格筋組織の収縮を示すグラフである。 図２１は図面代用写真で、実施例２で作製した評価モデルの軸索を染色した後の顕微鏡写真である。 図２２は図面代用写真で、実施例３の軸索の断裂と再生を確認した顕微鏡写真である。
　以下、図面を参照しつつ、共培養用デバイス（以下、単に「デバイス」と記載することがある。）、運動神経細胞培養用デバイス、マルチウェルプレート、神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法（以下、単に「評価モデルの作製方法」と記載することがある。）、および、神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法（以下、単に「スクリーニング方法」と記載することがある。）の各実施形態について、詳しく説明する。なお、本明細書において、同種の機能を有する部材には、同一または類似の符号が付されている。そして、同一または類似の符号の付された部材について、繰り返しとなる説明が省略される場合がある。
（デバイスの第１の実施形態）
　図３を参照して、第１の実施形態に係るデバイス１ａについて説明する。図３は、デバイス１ａの概略を示す図である。第１の実施形態に係るデバイス１ａは、骨格筋組織形成用の第１ユニット２と、運動神経細胞培養用の第２ユニット３と、第１ユニット２と第２ユニットとを連通するための第３ユニット４と、ピラー２３と、を含んでいる。図３Ａは第１ユニット２の概略を示す図、図３Ｂは第３ユニット４の概略を示す図、図３Ｃは第２ユニット３の概略を示す図である。また、図３Ｄは、第１ユニット２、第２ユニット３、第３ユニット４を組み合わせてデバイス１ａを作製した際の、Ｘ－Ｘ’方向の概略断面図である。図３Ｅおよび図３Ｆは、ピラー２３のその他の実施形態を示すための概略断面図で、図３ＡのＸ－Ｘ’方向と直交する方向の断面図である。図３Ｇおよび図３Ｈは、ピラー２３のその他の実施形態を示すための概略図で、第１ユニット２の上面図（図３ＡのＲ方向の図）である。
　図３Ａおよび図３Ｄを参照して、第１ユニット２についてさらに詳しく説明する。第１ユニット２は、第１基材２１、第１培養槽２２を含んでいる。また、図３Ａおよび図３Ｄでは、第１ユニット２にピラー２３を取り付けた例が示されている。第１培養槽２２は、骨格筋細胞を培養し、培養した骨格筋細胞から骨格筋組織を形成するために用いられる。第１培養槽２２は、第１基材２１に形成されており、図３Ａおよび図３Ｄに示す例では、略直方体状の第１基材２１の上方の面に第１培地投入孔２２１を有する略凹部状に形成されている。
　図３Ａおよび図３Ｄに示す例では、ピラー２３は、第１培養槽２２で培養した骨格筋細胞から、骨格筋組織を形成するために用いられる。ピラー２３は、一端２３１が第１基材２１の第１培養槽２２を形成する壁面に連結し、他端２３２が第１培養槽内２２に配置されている。換言すると、ピラー２３は片持ち状態で配置される。そのため、第１培養槽２２内で骨格筋細胞を培養し、ピラー２３の他端２３２に形成した骨格筋組織は、第１培養槽２２内で３次元に形成、換言すると、第１培養槽２２内で浮いた状態で形成される。つまり、平面上に骨格筋組織を形成、換言すると、骨格筋組織を２次元で形成した場合と異なる。したがって、図３Ａおよび図３Ｄでは、ピラー２３を２本設けた例が示されている。ピラー２３を２本設けた場合、形成した骨格筋組織はピラー２３を結んだ方向に配向することができ、人体の骨格筋組織により近い組織を形成できる。なお、ピラー２３は３本以上設けてもよい。その際、作製した骨格筋組織を同じ方向に配向させたい場合は、３本以上のピラー２３を直線状に配置すればよい。また、ピラー２３の間隔は、ピラー２３間で骨格筋組織を形成できれば特に制限はなく、例えば、０．５ｍｍ～５ｍｍ、１ｍｍ～３．５ｍｍ、１．５ｍｍ～２．６ｍｍとすることができる。なお本明細書において、〇〇μｍ～◎◎μｍと記載した場合、「〇〇μｍ以上、◎◎μｍ以下」を意味する。
　図３Ａおよび図３Ｄに示す例では、ピラー２３の一端２３１は、第１基材２１の底面２１１（第１培養槽２２の第１培地投入孔２２１とは反対側の第１基材２１の壁面）に形成されている。代替的に、ピラー２３は、他端２３２が第１培養槽２２内に配置するように片持ち状に形成されれば底面２１１以外、例えば、第１基材２１の側壁面２１２に一端２３１が形成されていてもよい。或いは、図３Ｅに示すように第１基材２１の第１培地投入孔２２１側に配置できる蓋６を設け、蓋６にピラー２３の一端２３１を形成することで、蓋をした際にピラー２３の他端２３２が第１培養槽２２内に配置するようにしてもよい。また、図３Ａ乃至Ｄに示す例では、ピラー２３が２本配置された例が示されているが、形成するピラー２３を１本とし、１本のピラー２３と第３ユニット４の他端部分４４との間で骨格筋組織を形成（図３Ｄの仮想軸索流路４２ａに相当する部分）するようにしてもよい。
　また、上述のピラー２３の実施形態は、ピラー２３の他端２３２が第１培養槽２２内に配置されるように、ピラー２３の一端２３１は、第１基材２１または蓋６に形成する例が示されているが、骨格筋組織が形成できれば、ピラー２３の配置および数に特に制限はない。例えば、図３Ｆに示すように、略Ｕ字状の１本のピラー２３の両端を蓋６に取り付けてもよい。また、図３Ｇに示すように、略Ｕ字状の１本のピラー２３の両端を、第１基材２１の側壁面２１２に取り付けてもよい。或いは、図３Ｈに示すように、第１培養槽２２を横切るように、２本のピラー２３の夫々の両端を、第１基材２１に連結してもよい。ピラー２３を可撓性の材料で形成すれば、図３Ｆ乃至図３Ｈに示す例においても、ピラー２３の間に形成した骨格筋組織の収縮に応じて、ピラー２３は撓むことができる。
　また、ピラー２３を片持ち状に形成する場合、図示は省略するが、必要に応じて、ピラー２３の他端２３２を他の部分より大きくしてもよい。他端２３２を他の部分より大きくすることで、形成した骨格筋組織がピラー２３から抜けにくくなる。
　図３Ａおよび図３Ｄに示す例では、第１基材２１および第１培養槽２２は、略直方体状に形成されているが、第１基材２１に第１培養槽２２が形成されていれば、第１基材２１および第１培養槽２２の形状に特に制限はない。また、ピラー２３も、骨格筋組織を形成できれば形状に特に制限はなく、例えば、円柱状、多角柱状等が挙げられる。
　図３Ａおよび図３Ｄに示す例では、第１基材２１に、後述する第２ユニット３を載置するための切欠部２４が形成されているが、後述するとおり、切欠部２４の形成は必須ではない。
　第１基材２１とピラー２３、或いは、蓋６とピラー２３は、一体的に形成してもよいし、別々に形成してもよい。別々に形成した場合は、ピラー２３を第１基材２１の壁面または蓋６に接着すればよい。また、ピラー２３の他端２３２を大きくする場合は、予め他端２３２が大きくなるようにピラー２３を形成してもよいし、ピラー２３の他端２３２に別部材を貼り付けることで大きくしてもよい。
　第１基材２１およびピラー２３（必要に応じて切欠部２４）の形成方法は、特に制限はない。例えば、第１基材２１を形成する材料を準備し切削加工で形成、３Ｄプリンタで形成等が挙げられる。また、フォトリソグラフィ技術を用いて先ず鋳型を作製し、次いで、第１基材２１を形成する材料を転写してもよい。なお、鋳型を転写して作製する場合は、必要に応じて複数の鋳型を用いて、第１ユニット２のパーツを作製し、該パーツを組み合わせることで第１ユニット２を作製してもよい。
　第１基材２１およびピラー２３を切削または鋳型を転写する方法で作製する場合、材料としては切削または鋳型を転写できるものであれば特に制限はない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリルブタジエンスチレン）樹脂、ＡＳ（アクリロニトリルスチレン）樹脂、テフロン（登録商標）等のフッ素樹脂、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、シリコンゴム等の熱硬化性樹脂が挙げられる。なお、第１ユニット２に形成した骨格筋組織を染色して観察する場合は、光透過性がある樹脂が望ましい。その場合の樹脂としては、例えば、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、シリコン等が挙げられる。また、樹脂に代え、金属を用いてもよい。なお、蓋にピラー２３を形成する場合は、第１基材２１と同様の材料および製造方法で作製すればよい。
　また、３Ｄプリンタを用いて作製する場合は、３Ｄプリンタ用に市販されている造形用樹脂を用いればよい。
　次に、図３Ｂ乃至図３Ｄを参照して、第２ユニット３についてさらに詳しく説明する。図３Ｂ乃至図３Ｄに示す例では、第２ユニット３は、第２基材３１、第２培養槽３２、第３ユニット４の一端部分４３を挿入するための第３ユニット挿入部３３を含んでいる。第２培養槽３２は、運動神経細胞を培養し、培養した運動神経細胞の細胞体から軸索を伸ばすために用いられる。第２培養槽３２は、第２基材３１に形成されており、図３Ｃおよび図３Ｄに示す例では、略直方体状の第２基材３１の上方の面に第２培地投入孔３２１を有する略凹部状に形成されている。
　図３Ｂに示す例では、軸索流路開口４２１は第３ユニットの一端部分４３の側面４３１に形成されている。したがって、第３ユニット４の一端部分４３を第３ユニット挿入部３３に挿入した時に、軸索流路４２の軸索流路開口４２１と、第２培養槽３２が連通する。そのため、第２培養槽３２で培養した運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索は、軸索流路４２を通り、第１ユニット２の方向に伸長できる。なお、軸索は運動神経細胞の一部であるが、以下において、軸索部分に着目して説明をする場合には、単に「軸索」と記載することがある。
　なお、図３Ｂ乃至図３Ｄには、第２ユニット３に第３ユニット挿入部３３が形成された例が示されているが、軸索流路４２と第２培養槽３２とが連通すれば、第２ユニット３と第３ユニット４の一端部分４３の連結は、他の形態であってもよい。図４Ａ乃至図４Ｃは、第２ユニット３と第３ユニット４の一端部分４３の連結の、他の実施形態の一例を示す図である。図４Ａは第３ユニット４の上面図（図３ＢのＲ１方向から見た図）、図４Ｂは第２ユニット３の上面図（図３ＣのＲ１方向から見た図）、図４Ｃは第３ユニット４の上面に第２ユニット３を重ねた時の概略断面図（図４Ａおよび図４ＢのＹ－Ｙ’方向の図）である。
　図４Ａ乃至図４Ｃに示す例では、第２培養槽３２が、第２基材３１を貫通するように形成されている。そして、軸索流路開口４２１は、図３Ｂに示す例と異なり、第３ユニットの一端部分４３の第３基材４１の上面を貫通するように形成されている。したがって、第２ユニット３の第２培養槽３２と軸索流路開口４２１が重なるように連結することで、軸索流路４２と第２培養槽３２を連通することができる。なお、図４Ａ乃至図４Ｃに示す例では、第２培養槽３２で培養した運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索は、軸索流路開口４２１を通り、第３ユニットの他端部分４４（第１ユニット２に配置される側）のみに伸びることが望ましい。したがって、図４Ｃに示すように、第３ユニット４の一端部分４３の軸索流路開口４２１より側面４３１方向の部分には、流路が形成されなくてよい。また、上記の説明から明らかなように、本明細書において、第３ユニット４の「一端部分４３」は、第２ユニット３に挿入または第２ユニット３と重ねる部分を意味する。
　図３Ｃおよび図３Ｄ、並びに、図４Ａ乃至図４Ｃに示す例では、第２基材３１および第２培養槽３２は、略直方体状に形成されているが、第２基材３１に第２培養槽３２が形成されていれば、第２基材３１および第２培養槽３２の形状に特に制限はない。また、第２ユニット３の作製および材料は、第１ユニット２と同様でよい。
　次に、図３Ｂおよび図３Ｄ、並びに、図５Ａおよび図５Ｂを参照して、第３ユニット４についてさらに詳しく説明する。図５Ａは、図３ＢのＺ－Ｚ’方向の断面図で、図５Ｂは図５Ａのａ－ａ’方向の断面図で、第３ユニット４の他端部分４４のより詳しい構造を説明するための該略断面図である。図３Ｂおよび図３Ｄに示す例では、第３ユニット４は、第３基材４１、軸索流路４２を含んでいる。第３ユニット４は、第２ユニット３に挿入または第２ユニット３に重なる部分である一端部分４３と、一端部分４３と反対側であって第１ユニット２に向けて配置する他端部分４４を含んでいる。そして、他端部分４４には、軸索流路４２に接するように第１開口部４５が形成されている。
　第１開口部４５には、第１軸索通過孔４５１が１以上形成されている。第１軸索通過孔４５１は１以上であれば特に制限はなく、２以上、３以上、４以上等、第３ユニット４のサイズ等を考慮し、適宜決めればよい。第１軸索通過孔４５１は軸索流路４２の断面積より小さく、軸索流路４２内を伸びてきた軸索の少なくとも１本が通過できる大きさで、運動神経細胞および骨格筋細胞が通れない大きさであればよい。なお、本明細書において、軸索流路４２の「断面積」とは、軸索が伸びる方向（第１開口部４５に向かう方向、図５Ａの矢印方向）に対して、直交する面を意味する。また、第１軸索通過孔４５１の大きさとは、第１軸索通過孔４５１の軸索流路４２側の第１開口面４５１ａ、または、第１開口面４５１ａと反対側の第２開口面４５１ｂを意味する。
　図６を参照して、第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂについて、より詳しく説明する。図６Ａは、第１開口面４５１ａまたは第２開口面４５１ｂの形状を示す図である。また、図６Ｂは第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂの大きさを説明するための図である。第１軸索通過孔４５１は、上記のとおり、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過しないが、軸索の少なくとも１本が通過できる大きさである必要があるが、当該大きさであれば、形状等については特に制限はない。第１軸索通過孔４５１は、例えば、円柱、楕円中、三角柱、４角柱等の柱状構造、換言すると、第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂが同じ形状および大きさである筒状体が挙げられる。第１軸索通過孔４５１は、また、円錐、３角錐、４角錐等の錐体の一部、換言すると、第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂの形状および大きさの、少なくとも一方が異なる筒状体であってもよい。
　図６Ａに示すように、第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂの形状は、円形、楕円、多角形等、特に制限はない。なお、本明細書において、第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂの「大きさ」と記載した場合の定義を、図６Ｂを参照して説明する。第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂの形状が円形の場合、「大きさ」は直径となる。一方、円形以外、例えば、楕円や多角形、或いは、曲線と直線を組み合わせた形状の場合は、一義的に大きさは決まらない。そのため、図６Ｂに示すように、平行となる線で第１開口面４５１ａ（第２開口面４５１ｂ）を挟んだ時に得られる複数の距離ｄの中で、もっとも短い距離ｄのことを「最小距離」と定義し、複数の距離ｄの中で、もっとも長い距離ｄのことを「最大距離」と定義する。第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂの形状が円形の場合は、「最大距離」と「最小距離」が同じになる。
　運動神経細胞が浸潤する可能性がある第１開口面４５１ａは、運動神経細胞を通過できない大きさである必要がある。運動神経細胞は、培養条件等により異なるものの、凡そ、５μｍ～３０μｍの大きさの非球形の細胞である。また、運動神経細胞はある程度は変形する。したがって、第１開口面４５１ａの「最小距離」を、例えば、２．５μｍ未満、２．０μｍ以下等の大きさにすれば、運動神経細胞が当該「最小距離」より小さくなるように変形はしない。したがって、「最小距離」を、例えば、２．５μｍ未満とした場合には、「最大距離」は特に制限はない。
　一方、「最小距離」がある程度の大きさ、例えば、２．５μｍ以上となると、運動神経細胞が通過するか否かは、「最小距離」のみではなく、第１開口面４５１ａの断面積（断面形状）も考慮する必要がある。例えば、断面積が６０μｍ2の時に運動神経細胞が通過しない場合、「最小距離」が２．５μｍの時は「最大距離」は２４μｍ以下、「最小距離」が３μｍの時は「最大距離」は２０μｍ以下、「最小距離」が４μｍの時は「最大距離」は１５μｍ以下、「最小距離」が５μｍの時は「最大距離」は１２μｍ以下、「最小距離」が６μｍの時は「最大距離」は１０μｍ以下にする等、適宜調整すればよい。
　なお、上記の断面積の例は、運動神経細胞の一般的な大きさから求めた値であり、断面積は６０μｍ2に限定されない。断面積としては、例えば、５８μｍ2以下、５６μｍ2以下、５４μｍ2以下、５２μｍ2以下、５０μｍ2以下等、適宜変更してもよい。
　同様に、骨格筋細胞が浸潤する可能性がある第２開口面４５１ｂは、骨格筋細胞を通過できない大きさである必要がある。骨格筋細胞の大きさは、運動神経細胞と同様、凡そ、５μｍ～３０μｍである。したがって、第２開口面４５１ｂの大きさは、第１開口面４５１ａと同様の「最小距離」或いは「断面積」となるように、調整すればよい。
　また、少なくとも軸索が１本通るためには、凡そ、０．５μｍが必要である。したがって、第１開口面４５１ａおよび第２開口面４５１ｂの「最小距離」は、０．５μｍ以上、１μｍ以上、１．５μｍ以上、２μｍ以上とできる。
　また、第１軸索通過孔４５１の長さ（第１開口面４５１ａと第２開口面４５１ｂの距離）は、軸索の通過との観点では、特に制限はない。製造上の利便性、取扱の利便性等の観点から適宜長さを決めればよい。下限としては、例えば、１μｍ以上、５０μｍ以上、１００μｍ以上とできる。また、上限としては、例えば、１０００μｍ以下、７５０μｍ以下、５００μｍ以下とできる。
　軸索流路４２は、周囲が第３基材４１で覆われ（図４に示す例の場合は、一部覆われていない部分があってもよい）、他端部分４４に第１開口部４５が形成され、一端部分４３が第２培養槽３２に連通できれば、形状や大きさに特に制限はない。図３Ｂに示すように断面形状が略直方体であってもよいし、多角形、円形であってもよい。また、軸索流路４２の幅（一端部分４３と他端部分４４を結んだ線に略直直交する方向の長さ）は特に制限はない例えば、軸索流路４２の幅は、１０μｍ～１０００μｍ、１００μｍ～７５０μｍ、２５０μｍ～５００μｍとすることができる。また、軸索流路４２の高さ（図３Ｂの鉛直方向の長さ）は、１０μｍ～２００μｍ、３０μｍ～１００μｍ、５０μｍ～７５μｍとすることができる。
　なお、軸索流路４２の幅および高さの何れも、運動神経細胞より十分大きくする場合、運動神経細胞が軸索流路４２に入り込む恐れがある。その場合、第２培養槽３２と軸索流路４２の接合する部分、或いは、軸索流路４２に運動神経細胞の通過を防止するためのスリットを設けてもよい。より具体的には、例えば、図４Ｃに示すように、第３ユニット４上に第２ユニット３を重ねる場合、軸索流路開口４２１の大きさを、運動神経細胞が通過できない大きさとすればよい。なお、図４Ｃに示す例では、軸索流路開口４２１の大きさを調整しているが、代替的に、第２培養槽３２の底部に孔を形成し、当該孔の大きさで調整してもよい。或いは、図５Ａに示すように、軸索流路４２の第１開口部４５と離間した位置に、運動神経細胞が通過しない大きさのスリット４２３を形成してもよい。
　図５Ｂに示す例では、第１軸索通過孔４５１は横一列に配置されているが、図５Ｃに示すように、第１軸索通過孔４５１を２列に配置してもよい。或いは、図示は省略するが、第１軸索通過孔４５１を３列以上配置してもよい。また、図５に示す例では、第１開口部４５と軸索流路４２とは、別体で作製した例が示されているが、第１開口部４５と軸索流路４２は、一体的に作製してもよい。また、第３ユニットの作製および材料は、第１ユニット２と同様でよい。
　第１の実施形態に係るデバイス１ａは、第１～第３ユニットを分離した状態で提供してもよいし、組み合した状態で提供してもよい。また、ピラー２３を蓋６に設ける場合は、蓋６を分離した状態で提供してもよい。図３Ｄは、第１～第３ユニットを組み合わせた時の位置関係の一例を示している。第３ユニット４の第１開口部４５の第１軸索通過孔４５１から第１培養槽２２内に伸びた軸索は、ピラー２３の間（例えば、他端２３２の間）に形成された骨格筋組織に到達し、神経筋接合部を作製する。そのため、第３ユニット４は、軸索が骨格筋組織に到達し易い配置にすることが望ましい。図３Ｄに示す例では、軸索流路４２を第１培養槽２２内に仮想的に延長した仮想軸索流路４２ａが、２以上のピラー２３の他端２３２を結んだ延長線（或いは、２以上のピラー２３を結んだ仮想面）の何れかと交わるように配置されている。骨格筋組織はピラー２３を足場にピラー２３を繋ぐように組織化される。したがって、第３ユニット４の他端部分４４と第１ユニット２を上記のように配置することで、神経筋接合部を形成しやすくなる。また、図３Ｆおよび図３Ｇに示すように、ピラー２３が１本の場合は、１本のピラー２３が形成する仮想面と、仮想軸索流路４２ａが交わるように配置することが望ましい。また、１本のピラー２３と第３ユニット４の他端部分で骨格筋組織を形成する場合は、１本のピラー２３と第３ユニット４の他端部分で形成する仮想面と、仮想軸索流路４２ａが交わるように配置することが望ましい。
　なお、図３Ｄに示す例は、第２培養槽３２の重力方向に対して、略直交する方向に第３デバイス４を連結している。そのため、後述する培地中に浮いた状態で形成した骨格筋組織の方向に、仮想的に延長した仮想軸索流路４２ａが交わるようにするためには、第１ユニット２に第２ユニット３を配置するための切欠部２４を形成することが好ましい。一方、第３ユニット４の他端部分４４が重力方向で下側となるように、傾いた状態で第３デバイス４を第２デバイス３に連結した場合は、第２デバイス３の底面を、第１デバイス２の第１基材２１の上面部分に載置しても、仮想的に延長した仮想軸索流路４２ａが、２以上のピラー２３が形成する仮想面の何れかと交わるように配置できる。したがって、切欠部２４は必要に応じて形成すればよい。
（デバイスの第２の実施形態）
　次に、図７Ａおよび図７Ｂを参照して、第２の実施形態に係るデバイス１ｂについて説明する。図７Ａは、第２の実施形態のデバイス１ｂの概略断面図（図５Ａと同じ方向）、図７Ｂは、図７Ａのｂ－ｂ’断面図である。第２の実施形態に係るデバイス１ｂは、第３ユニット４の軸索流路４２の内側に更に流路が形成されている点で第１の実施形態に係るデバイス１ａと異なるが、その他の点は第１の実施形態に係るデバイス１ａと同じである。したがって、第２の実施形態では、第１の実施形態と異なる点を中心に説明し、第１の実施形態において説明済みの事項についての繰り返しとなる説明は省略する。よって、第２の実施形態において明示的に説明されなかったとしても、第２の実施形態において、第１の実施形態で説明済みの事項を採用可能であることは言うまでもない。
　図７Ａに示す軸索流路４２は、第１流路４２ｂと、第１流路４２ｂの内側に形成された第２流路４２ｃとを含んでいる。第１開口部４５は、第１流路４２ｂに接するように形成されている。第２流路４２ｃの一端４２ｃ１は、第２培養槽３２に連通し、第２流路４２ｃの他端４２ｃ２には、第２開口部４５ａが接するように形成されている。第２開口部４５ａには、第２軸索通過孔４５１’が１以上形成されている。第２軸索通過孔４５１’は、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過できないが、軸索が通過できる大きさである。また、第１開口部４５と第２開口部４５ａは離間して配置されている。そのため、第２培養槽３２で培養した運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索は、第２開口部４５ａを通過し、次いで、第１流路４２ｂを通過し、更に、第１開口部４５を通過し、骨格筋組織と神経筋接合部を形成する。一方、第１流路４２ｂの一端４２ｂ１と他端４２ｂ２は、第２培養槽３２に連通していない。したがって、第１流路４２ｂには、運動神経細胞と骨格筋細胞が浸潤しないことから、第１流路４２ｂに神経筋疾患の治療薬の被験物質を混ぜた培地を流すことで、軸索のみを選択的に刺激できる。
　図７Ａに示す例では、「第２軸索通過孔４５１’」は「第１軸索通過孔４５１」、「第１開口面４５１ａ’」は「第１開口面４５１」、「第２開口面４５１ｂ’」は「第２開口面４５１ｂ」と読み替えてもよい。換言すると、第２開口部４５ａは第１開口部４５よりサイズは小さくなるが、第１開口部４５および第２開口部４５ａに形成する、軸索通過孔、第１開口面、および、第２開口面の形状および大きさは、同じであってもよい。勿論、第１の実施形態で記載した、軸索通過孔、第１開口面、および、第２開口面の形状および大きさの範囲内であれば、第１開口部４５および第２開口部４５ａに形成する、軸索通過孔、第１開口面、および、第２開口面の形状および大きさは、異なっていてもよい。
　第２の実施形態に係るデバイス１ｂ、より具体的には、第３ユニット４は、図７Ｂに示すように、第３基材４１と同じ材料で、第１流路４２ｂの内側に、第２流路用壁面４２ｃ３を形成すればよい。また、第２の実施形態に係るデバイス１ｂの第３ユニット４の作製および材料は、第１の実施形態に係るデバイス１ａの第３ユニット４と同様でよい。
（デバイスの第３の実施形態）
　次に、図８Ａおよび図８Ｂを参照して、第３の実施形態に係るデバイス１ｃについて説明する。図８Ａおよび図８Ｂは、第３の実施形態に係るデバイス１ｃの概略上面図である。第３の実施形態に係るデバイス１ｃは、第２ユニット３と第３ユニット４とを連結することで運動神経細胞培養用デバイス５を作製し、一つの第１ユニット２に対して、２以上の運動神経細胞培養用デバイス５が配置される点で、第１の実施形態に係るデバイス１ａおよび第２の実施形態に係るデバイス１ｂと異なるが、その他の点は第１の実施形態に係るデバイス１ａおよび第２の実施形態に係るデバイス１ｂと同じである。したがって、第３の実施形態では、第１の実施形態および第２の実施形態と異なる点を中心に説明し、第１の実施形態および第２の実施形態において説明済みの事項についての繰り返しとなる説明は省略する。よって、第３の実施形態において明示的に説明されなかったとしても、第３の実施形態において、第１の実施形態および第２の実施形態で説明済みの事項を採用可能であることは言うまでもない。
　図８Ａは、２本のピラー２３の間に形成した同一の骨格筋組織に対して、２つの運動神経細胞培養用デバイス５を配置し、夫々の運動神経細胞培養用デバイス５から伸びた軸索１１と骨格筋組織１０とで神経筋接合部を形成する例を示している。図８Ａに示す例では、同一の骨格筋組織に対して、２つの軸索１１が接続している。したがって、神経筋疾患の治療薬のスクリーニングをする際に、夫々の運動神経細胞培養用デバイス５に投入する被験物質の種類を変えたり、同じ種類で濃度を変えた時の効果を観察することができる。なお、図８Ａに示す例では、運動神経細胞培養用デバイス５を２個配置した例が示されているが、運動神経細胞培養用デバイス５から伸びた軸索１１が骨格筋組織１０と神経筋接合部を形成できれば、配置する運動神経細胞培養用デバイス５は３個以上であってもよい。
　図８Ｂは、３本のピラー２３の間にそれぞれ形成した骨格筋組織に対して、夫々、２つの運動神経細胞培養用デバイス５を配置し、夫々の運動神経細胞培養用デバイス５から伸びた軸索１１と骨格筋組織１０とで神経筋接合部を形成した例を示している。図８Ｂに示す例も図８Ａに示す例と同様、複数の被験物質のスクリーニングを同時に実施することができる。また、図８Ｂに示す例においても、一か所の骨格筋組織１０に対して、３個以上の運動神経細胞培養用デバイス５を配置してもよい。なお、図８Ｂに示す例では、例えば、一方の骨格筋組織１０に刺激を与えて収縮させた場合、他方の骨格筋組織１０を伸ばすことができる。生体では筋肉はペアで動くので、図８Ｂに示す例では、より生体に近い現象を再現できる。
（デバイスの第４の実施形態）
　次に、図９Ａを参照して、第４の実施形態に係るデバイス１ｄについて説明する。図９Ａは、第４の実施形態に係るデバイス１ｄの概略上面図である。第４の実施形態に係るデバイス１ｄは、一つの第２ユニット３に２以上の第３ユニット４を連結することで運動神経細胞培養用デバイス５ａを作製し、第３ユニット４の他端に第１ユニット２が配置される点で、第１の実施形態に係るデバイス１ａおよび第２の実施形態に係るデバイス１ｂと異なるが、その他の点は第１の実施形態に係るデバイス１ａおよび第２の実施形態に係るデバイス１ｂと同じである。したがって、第４の実施形態では、第１の実施形態および第２の実施形態と異なる点を中心に説明し、第１の実施形態および第２の実施形態において説明済みの事項についての繰り返しとなる説明は省略する。よって、第４の実施形態において明示的に説明されなかったとしても、第４の実施形態において、第１の実施形態および第２の実施形態で説明済みの事項を採用可能であることは言うまでもない。
　第４の実施形態に係るデバイス１ｄは、一つの第２ユニット３で培養した運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索１１を、異なる骨格筋組織１０に接合して神経筋接合部を形成できる。第１ユニット２と第２ユニット３が一つずつの場合でも、勿論、評価モデルを作製し、神経筋疾患の治療薬の被験物質のスクリーニングは可能である。しかしながら、例えば、骨格筋細胞からの骨格筋組織の形成が不十分であったり、神経筋接合部の形成が不十分であった場合には、有用な被験物質であっても、スクリーニングの際に見落とす可能性がある。一方、第４の実施形態に係るデバイス１ｄは、第２培養槽３２で培養した運動神経細胞の塊から伸びた軸索１１を異なる骨格筋組織と神経筋接合部を形成できる。したがって、例えば、運動神経細胞に刺激を与える神経筋疾患の治療薬の被験物質のスクリーニングを実施する際に、骨格筋組織１０が同じ動きをするのか確認をすることができるので、被験物質のスクリーニングの精度を向上できる。
　上述の第１～第４の実施形態は、本明細書で開示するデバイス１の例を示したものであって、本発明は、上記の実施形態に限定されない。上記の各実施形態の自由な組み合わせ、あるいは各実施形態の任意の構成要素の変形、または、任意の構成要素の省略が可能である。例えば、第１～第４の実施形態では、第３ユニット４は軸索流路４２の周囲を第３基材４１が覆う一層構造となっているが、第３ユニット４を積層することで、多層構造としてもよい。多層構造にした場合は、第１開口部４５から骨格筋組織１０に伸びる軸索が立体的になることから、神経筋接合部を形成し易くなる。
（運動神経細胞培養用デバイスの実施形態）
　運動神経細胞培養用デバイス５は、デバイス１の第３および第４の実施形態で説明済みである。よって、重複する記載となるので、運動神経細胞培養用デバイス５の説明は省略する。なお、第２ユニット３と第３ユニット４を組み合せて運動神経細胞培養用デバイス５を提供する場合には、第２ユニット３と第３ユニット４を一体的、或いは、第２ユニット３と第３ユニット４に共通するパーツを用い、当該パーツを組み合すことで、運動神経細胞培養用デバイス５を作製してもよい。例えば、第２基材３１と第３基材４１の一部を、一つのパーツで構成してもよい。
　第３および第４の実施形態では、運動神経細胞培養用デバイス５を第１ユニット２と組み合わせて共培養用デバイス１を作製する例が説明された。代替的に、第３ユニット４が、図７Ａに示す、第１流路４２ｂと第１流路４２ｂの内側に形成された第２流路４２ｃとを含む場合、運動神経細胞培養用デバイス５は、軸索の断裂および再生を再現させるモデル用デバイスとして、単独で使用されてもよい。例えば、末梢神経の正常な伝導に障害が発生するニューロパチーという病態が知られている。そして、ニューロパチーの中でも、外傷性や局所的軸索切断による軸索変性性ニューロパチーが知られている。後述する実施例に示す通り、運動神経細胞培養用デバイス５の第２流路４２ｃの第２開口部４５ａと第１流路４２ｂの第１開口部４５との間の軸索にせん断応力をかける等により断裂し、その後再生することで、軸索変性性ニューロパチーモデルへの応用が期待できる。なお、軸索の断裂および再生を再現させるモデルの作製は、勿論、共培養用デバイス１を用いて作製してもよい。
（マルチウェルプレートの実施形態）
　図９Ｂを参照して、マルチウェルプレート５００について説明する。図９Ｂ（ａ）は、マルチウェルプレート５００の概略を示す上面図、図９Ｂ（ｂ）は図９Ｂ（ａ）のＸ－Ｘ’断面図である。マルチウェルプレート５００は、基材５０１、基材５０１に形成された少なくとも２以上のウェル５０２を有している。そして、ウェル５０２の少なくとも１つに、第１～第４の実施形態に記載のデバイス１、および、運動神経細胞培養用デバイス５から選択されるデバイスが配置されている。また、必要に応じて、任意のウェル５０２に、一対の電極５０３を形成してもよい。また、基材５０１に、一対の電極５０３と電源装置（図示は省略）とを連結するための回路５０４を形成してもよい。
　マルチウェルプレート５００は、ウェル５０２にデバイス１，５を配置できれば、ウェル５０２の個数や形状に特に制限はない。図９Ｂに示す例では、ウェル５０２は基板５０１に略円柱状に形成されているが、例えば、半球状あるいは略多角柱状等の形状であってもよい。
　ウェル５０２に配置されるデバイス１，５は、全て同じ種類であってもよいし、異なる種類を組み合わせて配置してもよい。また、ウェル５０２の一部にデバイス１，５を配置してもよいし、全てのウェル５０２にデバイスを配置してもよい。デバイス１，５は、ウェル５０２に着脱自在となるように配置、換言すると、ウェル５０２に挿入するのみでもよいし、着脱不能に配置してもよい。着脱不能に配置する場合は、接着剤等を用いて、デバイス１，５をウェル５０２の壁面に固定すればよい。
　ウェルにデバイス１、５を配置することで、以下の効果を相乗的に奏する。
（１）第１培地投入孔２２１や第２培地投入孔３２１に培地を投入する際に、第１培養槽や第２培養槽から培地が溢れた場合でもウェル５０２内に培地が留まることから、培地添加の利便性が向上する。
（２）デバイス１、５をマルウェルプレートに配置することで、複数の薬剤等について同時にアッセイ又はスクリーニングすることが可能になり、ハイスループット化が可能となる。なお、図９Ｂに示す例では、ウェル５０２にデバイス１，５を配置していることから、上記（１）の効果と薬剤アッセイ等のハイスループット化を同時に達成できる。代替的に、薬剤アッセイ等のハイスループット化に特に着目した場合には、デバイス１，５をマルチウェルプレートではなく、ガラス基板等のウェルを有しない板状部材の上に配置して用いてもよい。
（３）また、ウェル５０２に一対の電極５０３を配置した場合には、作製した評価モデルに電気刺激を与えることもできる。なお、図９Ｂに示す例では、ウェル５０２に一対の電極５０３を設けた例を示しているが、代替的に、デバイス１、５の培養槽の内壁面等に一対の電極を設けてもよい。更に代替的に、評価モデルに電気刺激を与えたい場合のみ、ウェルプレート５００のウェル５０２、あるいは、デバイス１，５の培養槽等に、一対の電極を挿入することで、評価モデルに電気刺激を与えてもよい。
（評価モデルの作製方法の実施形態）
　次に、図１０を参照して、評価モデルの作製方法の実施形態について説明する。評価モデルの作製方法の実施形態は、上述したデバイス１を用いて実施される。図１０は、評価モデルの作製方法の実施形態のフローチャートである。評価モデルの作製方法の実施形態は、運動神経細胞培養工程（ＳＴ１）と、骨格筋組織作製工程（ＳＴ２）と、神経筋接合部作製工程（ＳＴ３）と、を含んでいる。
　運動神経細胞培養工程（ＳＴ１）では、第２ユニット３の第２培養槽３２で運動神経細胞を培養する。運動神経細胞は、培養することで軸索１１を伸ばすことができれば特に制限はない。例えば、非特許文献１や非特許文献２に記載の運動神経細胞を用いることができる。また、運動神経細胞は、第２培養槽３２でバラバラの運動神経細胞を培養してもよいし、運動神経細胞が塊となったスフェロイドを用いてもよい。また、運動神経細胞を培養する培地は、用いる運動神経細胞に応じて、適宜選択すればよい。
　骨格筋組織作製工程（ＳＴ２）では、第１ユニット２の第１培養槽２２で骨格筋細胞を培養して、骨格筋組織を作製する。骨格筋細胞は、培養することでピラー２３の間で骨格筋組織１０を形成できれば特に制限はない。骨格筋細胞も、例えば、非特許文献１や非特許文献２に記載の骨格筋細胞を用いればよい。また、骨格筋細胞を培養する培地は、用いる骨格筋細胞に応じて、適宜選択すればよい。なお、運動神経細胞培養工程（ＳＴ１）と骨格筋組織作製工程（ＳＴ２）の順番は、逆であってもよいし、同時に行ってもよい。
　神経筋接合部作製工程（ＳＴ３）では、培養した運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索１１が、第３ユニット４の軸索流路４２を通り、第１培養槽２２で作製した骨格筋組織と接合することで神経筋接合部を作製する。上記工程により、骨格筋組織が培地中に浮いた状態で、且つ、骨格筋組織と運動神経細胞の細胞体が分離した状態で、両者を軸索１１で接合できることから、実際の人体により近い評価モデルを作製できる。
　ところで、本明細書で開示するデバイス１は、運動神経細胞および骨格筋細胞の培養に、培地を用いている。したがって、第３デバイス４の軸索流路４２、軸索流路４２よりさらに小さな第１軸索通過孔４５１（第２軸索通過孔４５１’）には、毛管力で培地を浸透することができる。一方、非特許文献２に記載のデバイス（評価モデルの作製方法）は、軸索を伸ばすための足場としてコラーゲンゲルを用いているが、コラーゲンゲルは粘度がある。したがって、非特許文献２に記載の発明において、軸索が伸びる流路を単純に細くすると、流路内に培地を含んだコラーゲンゲルを浸透することはできない。本明細書で開示するデバイス１、および、デバイス１を用いた評価モデルの作製方法は、軸索１１が伸びる足場として軸索流路４２および第１軸索通過孔４５１（第２軸索通過孔４５１’）を用い、更に、当該足場に浸透する培地を組み合わせた新たな知見に基づくものである。
　更に、本明細書で開示するデバイス１で作製した評価モデルは、コラーゲンを足場として用いないことで、骨格筋組織の動き等が観察しやすくなる効果に加え、以下の複合的な効果を奏する。
（１）コラーゲンゲルで足場を形成した場合、運動神経細胞、軸索、骨格筋組織に薬剤で刺激を与えるためには、薬剤がコラーゲンゲル中に浸透する必要がある。したがって、薬剤の迅速なスクリーニングができない。また、薬剤がコラーゲンゲルに浸透する際に拡散し、運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織のターゲットを特定したスクリーニングが難しくなる。
　一方、本明細書で開示するデバイス１で作製した評価モデルは、運動神経細胞、骨格筋組織、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索のそれぞれが分離した状態となる。したがって、ターゲットを絞って薬剤のスクリーニングができる。また、運動神経細胞、骨格筋組織、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索は、夫々培地中に形成されていることから、薬剤の迅速なスクリーニングができる。
（２）コラーゲンゲルは生体由来のゲルのため、ロット毎の特性が異なる。また、温度等の条件が異なるとゲルの特性も変わることから、作製した評価モデル間のばらつきが大きくなる。
　一方、本明細書で開示するデバイス１で作製した評価モデルは、培地を用いていることから、作製した評価モデルのばらつきを小さくできる。
（３）非特許文献２の場合、コラーゲンゲルでデバイス１の全体を覆っている。したがって、例えば、骨格筋組織に電気刺激を与えた際の運動神経細胞への影響を調べようとしても、コラーゲンゲルを通して電気がリークすることから、選択的な電気刺激を与えにくい。
　一方、本明細書で開示するデバイス１で作製した評価モデルは、骨格筋組織と運動神経細胞は、第１軸索通過孔４５１（第２軸索通過孔４５１’）のみを介して連通している。したがって、骨格筋組織と運動神経細胞の選択的な電気刺激が可能である。
（４）非特許文献２の場合、軸索はコラーゲンゲルの中でランダム方向に伸びて骨格筋組織に到達するので、骨格筋組織に向かう軸索の調整をすることができない。
　一方、本明細書で開示するデバイス１で作製した評価モデルは、軸索は第１軸索通過孔４５１を通過する必要があることから、骨格筋組織に伸びる軸索の本数や間隔を調整できる。したがって、作製した評価モデルのばらつきを小さくできる。
　作製した評価モデルを軸索変性性ニューロパチーモデルとして使用する場合は、第１流路４２ｂおよび第２流路４２ｃを具備する第３ユニット４を含むデバイス１を用いて、評価モデルを作製する。そして、第２流路４２ｃの第２開口部４５ａと第１流路４２ｂの第１開口部４５との間の軸索を断裂し、その後、軸索を再生する工程を追加すればよい。なお、軸索を断絶し再生した箇所に特に着目したモデルを作製する場合は、骨格筋組織作製工程（ＳＴ２）および神経筋接合部作製工程（ＳＴ３）は省略してもよい。また、第１流路４２ｂおよび第２流路４２ｃを具備した第３ユニット４を含む運動神経細胞培養用デバイスを用いて軸索変性性ニューロパチーモデルを作製する場合は、骨運動神経細胞培養工程（ＳＴ１）を実施後に、第２流路４２ｃの第２開口部４５ａと第１流路４２ｂの第１開口部４５との間の軸索を断裂し、その後、軸索を再生する工程を追加すればよい。
（スクリーニング方法の実施形態）
　次に、図１１を参照して、スクリーニング方法の実施形態について説明する。スクリーニング方法の実施形態は、上述した評価モデルの作製方法で作製した評価モデルを用いて実施される。図１１は、スクリーニング方法の実施形態のフローチャートである。スクリーニング方法の実施形態は、被験物質投与工程（ＳＴ１１）と、観察工程（ＳＴ１２）と、被験物質評価工程（ＳＴ１３）と、を含んでいる。
　被験物質投与工程（ＳＴ１１）では、作製した評価モデルの運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織の何れか一つに被験物質を投与する。被験物質としては、低分子化合物、核酸、抗体、タンパク質等、医薬品として知られている物質であれば特に制限はない。作製した評価モデルを用いて、運動神経細胞を刺激することで骨格筋組織への影響を調べる場合には、第２培養槽に被験物質を投与すればよい。被験物質を投与する際には、必要に応じて培地に溶解して投与すればよい。軸索を刺激することで骨格筋組織への影響を調べる場合には、軸索に被験物質を投与すればよい。軸索に被験物質を投与する場合には、第２の実施形態に示す第３ユニット４の第１流路４２ｂに被験物質を流せばよい。代替的に、軸索の長さが比較的長い場合は、第１の実施形態に示す第３ユニット４の第１開口部４５付近の軸索に、被験物質を投与してもよい。或いは、例えば、図３Ｂに示す第３ユニット４の第３基材４１に、軸索流路４２に貫通する貫通孔を形成し、軸索流路４２内に被験物質を投与してもよい。
　測定工程（ＳＴ１２）では、被験物質投与工程で被験物質を投与した後の運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織の少なくとも一つの状態を測定する。測定工程は、被験物質の投与前と投与後で、運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織の状態の変化を測定できれば、測定方法に特に制限はない。例えば、骨格筋組織１０の状態を測定する場合は、骨格筋組織１０の動きを測定すればよい。骨格筋組織の動きは、直接的に測定してもよいし、間接的に測定してもよい。直接的な測定方法としては、撮像素子を用いて骨格筋組織１０の動きを動画観察する例が挙げられる。また、骨格筋組織１０はピラー２３の間に形成されることから、骨格筋組織１０が収縮すると、ピラー２３に負荷がかかる。したがって、間接的な測定方法としては、ピラー２３の内部または表面に歪センサを配置し、歪センサに係る力を測定する例が挙げられる。
　軸索の状態の測定は、例えば、被験物質の影響による軸索の本数の増減、伸長の変化、軸索の切断と再生状況等の測定が挙げられる。測定方法としては、撮像素子を用いた測定が挙げられる。また、運動神経細胞の状態の測定は、例えば、被験物質の影響による運動神経細胞の死滅または成長、死滅または成長による運動神経細胞の塊（スフェロイド）の形状の変化等の測定が挙げられる。測定方法としては、撮像素子を用いた測定が挙げられる。
　被験物質評価工程（ＳＴ１３）では、測定工程（ＳＴ１２）の測定結果より、被験物質が神経筋疾患の治療薬として作用するのか評価する。評価は、測定結果を人間が評価してもよいし、予め治療薬を投与した時の人体の骨格筋組織の動きを記憶手段に記憶しておき、治療薬を投与した時と類似の動きを測定した場合には、被験物質が治療効果ありと評価してもよい。神経筋疾患としては、運動神経細胞と骨格筋組織との間のシグナル伝達に関する疾患であれば特に制限はない。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）等の遺伝子変異が原因となる遺伝性疾患が挙げられる。また、遺伝子疾患以外には、例えば、腕神経叢損傷や顔面神経麻痺等、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索が、物理的衝撃や神経毒性物質によって変性して引き起こされる疾患が挙げられる。
　以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
〔デバイスの作製〕
［１］鋳型の作製
　先ず、以下の手順で、デバイスを作製するための鋳型を作製した。
（１）鋳型のフォトマスク作製は、レーザーリソグラフィを用いて行った。装置はハイデルベルグ　ＤＷＬ６６ＦＳ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。フォトマスクは、ＣＳ　ＨＡＲＤＭＡＳＫ　ＢＬＡＮＫＳ（ＣＢＬ３００６Ｃｕ－ＡＺＰ，ＣＬＥＡＮ　ＳＵＲＦＡＣＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）を使用した。このフォトマスクには、ガラス板上にクロムの層があり、その上に感光性材料であるＡＺＰ１３５０が塗布されている。フォトマスク上にレーザーで設計したパターンを描写し、ＮＭＤ３で現像した。
（２）次に、作製したフォトマスクを使って鋳型の作製を行った。露光装置は、マスクアライナーＭＡ－６（Ｓｕｓｓ　Ｍｉｃｒｏ　Ｔｅｃ　ＡＧ）を用いた。シリコンウエハー（Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ　Ｗａｆｅｒ（４ＰＴＰ－１－１００，ＧｌｏｂａｌＷａｆｅｒｓ，Ｈｓｉｎｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ））に、全体の８割が隠れる程度までＳＵ－８　３００５（日本化薬株式会社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ。なお、ＳＵ－８　３００５は、シクロペンタノン（Ｃ０５１０，東京化成工業，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で２倍に希釈したものを用いた。）をのせて、１００ｒｐｍ／ｓｅｃで５００ｒｐｍまで回転数を上げて３０秒スピンコートを行い、続けて３００ｒｐｍ／ｓｅｃで３０００ｒｐｍまで回転数を上げて３０秒スピンコートした。そのあと、９５℃で５０分加熱を行い（Ｐｒｅｂａｋｅ）、出来上がったシリコンウエハーと流路のパターンが施されたフォトマスクをＭＡ－６にセットして４０秒紫外線を露光した。露光により、フォトマスク上のパターンと同じ形にＳＵ－８が固まる。露光後、６５℃で１分５０秒、９５℃で２０秒加熱した（Ｐｏｓｔｂａｋｅ）。その後、そのシリコンウエハーの上から、全体の８割が隠れる程度までＳＵ－８　３０５０（日本化薬株式会社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）をのせて、１００ｒｐｍ／ｓｅｃで２０００ｒｐｍまで上げて３０秒スピンコートを行った。その後、９５℃で１時間加熱して、今度はチャンバーのパターンが施されたフォトマスクと一緒にＭＡ－６にセットして流路とチャンバーの位置を合わせるアライメントを行い、５分露光した。露光後、９５℃で８分加熱してＳＵ－８　ｄｅｖｅｌｏｐｐｅｒ（日本化薬株式会社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に４０分ほど浸して余分なＳＵ－８を取り除いた後、イソプロパノール（１６６－０４８３６，Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に浸した。作製した鋳型を図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。図１２Ａは第１の実施形態の軸索流路に相当する鋳型、図１２Ｂは第２の実施形態の軸索流路（第１流路＋第２流路）に相当する鋳型である。以下、明細書および図面に於いて、図１２Ａに示す鋳型を用いて作製したデバイスは「デバイスａ」、図１２Ｂに示す鋳型を用いて作製したデバイスは「デバイスｂ」と記載することがある。
［２］運動神経細胞培養用デバイスの作製
（３）まず、モノマー：触媒＝１０：１の割合で混合したＰＤＭＳ（東レ・ダウコーニング株式会社製、Ｓｙｌｇａｒｄ　１８４）を鋳型にのせ、３００ｒｐｍで３０秒スピンコートを行い、７０℃で１時間加熱してＰＤＭＳを固化させた。
（４）上記（３）で固まったＰＤＭＳ（ｉ）を鋳型から外すことで、軸索流路４２および第１開口部４５（第２開口部４５ａ）の一つの面が開口した第３ユニットを作製した。次に、第２培養槽３２を形成したＰＤＭＳ（ｉｉ）と、底面作製用のＰＤＭＳ薄膜（ｉｉｉ）を準備した。（ｉ）の開口している面を下側に向けて、底面作製用のＰＤＭＳ薄膜（ｉｉｉ）に貼り合わせた。また、（ｉ）の上側の面に、第２培養槽３２を形成したＰＤＭＳ（ｉｉ）を貼り合わせた。なお、（ｉ）～（ｉｉｉ）のＰＤＭＳを貼り合わす前に、貼り合わす面をプラズマ処理することで、ＰＤＭＳ同士が接着できるようにした。プラズマ処理には、ＰＬＡＳＭＡ　ＣＬＥＡＮＥＲ　（ＰＤＣ－３２Ｇ，ＨＡＲＲＩＣＫ　ＰＬＡＳＭＡ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を用いた。
（５）上記（４）で貼り合わせたＰＤＭＳの出っ張り等をナイフで切除することで、デバイスを作製した。図１３は、作製した運動神経細胞培養用デバイスａおよびｂの写真である。なお、動神経細胞培養用デバイスｂの矢印部分は、第２基材３１に形成され、第１流路４２ｂに連通する被験物質投入孔と被験物質回収孔である。
［３］第１ユニットの作製
（６）第１ユニット２は、テフロンで作製した鋳型（図１４参照）を使用し、ＰＤＭＳを流し込み７０℃で１時間加熱してＰＤＭＳを固化した。型から外した後、第１ユニットのピラー上に薄膜ＰＤＭＳで作製した円盤をのせた。薄膜円盤は、テフロンシートの上にＰＤＭＳを０．２ｇのせ、３０秒で回転数を１０００ｒｐｍにあげ、３０秒スピンコートした。その後７０℃で１時間加熱してＰＤＭＳを固化した。さらにＰＤＭＳを０．２ｇのせ、３０秒で回転数を２０００ｒｐｍにあげ、３０秒スピンコートした。このＰＤＭＳの薄膜から直径１．５ｍｍの円をバイオプシー（８－５８４５－０２，ｋａｉ　ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ）でくりぬき、第１ユニットのピラー上部に貼り付け、７０℃で一時間加熱してピラーの先端に薄膜円盤を固定した。
［４］デバイスの作製
　上記［２］で作製した運動神経細胞培養用デバイスと、上記［３］で作製した第１ユニット２を、ＰＤＭＳを薄く塗られた状態で接合して加熱することによって固化させた。図１５は、作製したデバイスａおよびｂの写真である。図１５Ａは作製したデバイスａおよびｂの上方からの写真、図１５Ｂは作製したデバイスａおよびｂの斜め上方からの写真である。
＜実施例２＞
〔評価モデルの作製〕
　以下に示す材料および方法により、評価モデルを作製した。
（１）ｉＰＳ細胞の培養
（１－１）未分化ｉＰＳ細胞の培養
　先ずは、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）の培養法について示す。細胞増殖の培地にはＳｔｅｍｆｉｔ（登録商標）（ＡＫ０２Ｎ，味の素，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた。３７℃、５％ＣＯ2、９５％Ａｉｒ下のＣＯ2インキュベーター内にて細胞培養Ｔ２５フラスコ（４３０６３９，ＣＯＲＮＩＮＧ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）で培養した。用いたフラスコには、ラミニンコーティングを行った。ラミニンコーティングは、ＰＢＳを３ｍｌ加え、そこにｉＭａｔｒｉｘ－５１１（３８１－０７３６３，Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を２５μｌ加え、ＣＯ2インキュベーター内で１時間以上インキュベートする手法で行った。継代操作については、コーティングを行った後ｉＭａｔｒｉｘ溶液が入った状態でＡＫ０２Ｎを２．５ｍｌ加えて馴染ませた後に溶液を除去し、ＡＫ０２Ｎを５ｍｌ加えた。その後、ＲＯＣＫインヒビター　Ｙ－２７６３２（０８９４５－７１，ナカライテスク株式会社，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を５μｌ加え、播種を行う直前までＣＯ2インキュベーター内にてインキュベートした。サブコンフルエント状態になった細胞の培地を除き、ＰＢＳで１度洗い流した後、ＴｒｙｐＬＥ（登録商標）　Ｓｅｌｅｃｔ　ＣＴＳ（登録商標）（Ａ１２８５９－０１，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）とＵｌｔｒａＰｕｒｅ（登録商標）０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　８．０（１５５７５－０３８，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を、１：１で混合させたトリプシン溶液を１ｍｌ加え、ＣＯ2インキュベーター内にて４分間インキュベートした。トリプシン溶液を除去し、ＰＢＳで１度洗い流した後、ＡＫ０２Ｎを２．５ｍｌ加えてセルスクレーパー（９９００２，ＴＰＰ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で細胞を回収した。回収した細胞は、１ｍｌピペットマンで１０回懸濁した後に、ＴＣ２０（登録商標）全自動セルカウンター（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で細胞数を算出した。その後、３２５００ｃｅｌｌｓとなるようにＴ２５フラスコに播種し、ＣＯ2インキュベーター内でインキュベートした。Ｙ－２７６３２を除去するため、播種から２４時間後に培地交換した。以後培地交換は４８時間毎に交換し、細胞がコンフルに近づいてきたら２４時間毎に培地を交換した。
（１－２）ｉＰＳ細胞の運動神経細胞への分化誘導
　未分化ｉＰＳ細胞をＳｔｅｍｆｉｔ　１０ｍｌに懸濁して、６０ｍｍディッシュでスフェロイドができるまで１～２日間３７℃，５％ＣＯ2のインキュベーターで培養した。スフェロイドが形成したら、自然沈降によって細胞を沈降させて上清の培地を抜き取った後、ＥＢ培地に懸濁して、１００ｍｍディッシュで培養した。神経の分化誘導開始（ＤＡＹ　０）から分化誘導終了（ＤＡＹ　１４）までの分化培地における各培地添加物の終濃度を表１に示す。また分化誘導の概要を図１６に示す。なお、図１６は、“Ｓｈｉｍｏｊｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｂｒａｉｎ．　２０１５　Ｄｅｃ　１；８（１）：７９”からの引用である。図１６に記載の日程で分化培地の交換を行い、明記された培地添加物をそれぞれＤＭＥＭ／Ｆ－１２に５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，１０８２８０２８，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を混合した培地に添加して培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）骨格筋細胞の継代培養
　骨格筋細胞には、ヒト骨格筋Ｈｕ５ＫＤ３（国立長寿医療研究センターから譲渡）を用い、以下の手順で培養を行った。この細胞を培養する際は、底面のコラーゲンコーティングを行った。０．０２Ｎ酢酸にコラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅＩ－Ｃ：新田ゼラチン株式会社，Ｏｓａｋａ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を溶かし、濃度５０μｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を作製した。この溶液を入れて、底面がコラーゲン溶液で満たされた状態のまま常温で１時間静置した。増殖培地はＤＭＥＭ（２０％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ，２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（０７３－０５３９１，Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ），０．５％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，２％Ｕｌｔｒｏｓｅｒ　Ｇ　ｓｅｒｕｍ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ（１５９５０－０１７，Ｐａｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を使用した。
（３）デバイスを用いた運動神経細胞と３次元骨格筋細胞の共培養
　実施例１で作製したデバイスを用いて、以下の手順で共培養を行った。図１７は、共培養の手順を示す図である。なお、培地交換等の実験の利便性のため、実施例１で作製したデバイスは１２穴プレートのウェルの底面に固定した。デバイスとウェルを固定後、１時間ＵＶ滅菌を行った。その後、プラズマ処理（１１Ｗ，３０ｓｅｃ）を行って、マトリゲルコートを行った。マトリゲル（３５４２３４，ＣＯＲＮＩＮＧ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を、無血清のＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ－１２）（０４２－３０５５５，Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に３０倍に希釈し、デバイスに入れた。デバイスの底面が全面マトリゲル溶液で満たされた状態で、３時間常温で静置した。このとき、流路全体までマトリゲル溶液が行き渡るように、脱気しながら静置した。そのあと、すべてのマトリゲル溶液をアスピレーターで抜いた。当該処理により、マトリゲルに含まれるタンパク質が第２培養槽３２や軸索流路４２に吸着するため、運動神経細胞は第２培養槽３２に、軸索は軸索流路４２に吸着しやすくなる。
　マトリゲルコートが終わった後、ヒトｉＰＳ細胞から誘導した運動神経細胞をスフェロイドの状態でデバイスの第２培養槽に数個播種した。播種してから運動神経の培養には、ＫＢＭ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（１６０５０１００，Ｋｏｈｊｉｎ　ｂｉｏ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）に、以下に示す培地添加物をくわえた運動神経培地（ＭＮ培地）を用いた。培地添加物は、２％　Ｂ－２７（１７５０４－０４４，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）、１％　ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；ＮＥＡＡ（１１１４００５０，Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、１μＭ　ｃＡＭＰ（Ｄ－０２６０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂｒａｉｎ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＢＤＮＦ（２４８－ＢＤ－０２５，Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）、１０ｎｇ　Ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ；ＧＤＮＦ（２１２－ＧＤ－０５０，Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ－１；ＩＧＦ－１（２９１－Ｇ１－０５０，Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）、５０ｎＭ　ＲＡ，５００ｎＭ　Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ，２００ｎｇ／ｍｌ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ（０１２－０４８０２，Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）である。このとき、第１培養槽には細胞が入っていないＭＮ培地を添加した。
　運動神経細胞播種２日目に、ヒト骨格筋細胞Ｈｕ５ＫＤ３を第１培養槽に播種した。具体的には、Ｔ－７５フラスコで培養してある細胞を継代操作と同様に回収し、細胞数を測定し、フィブリノーゲン（Ｆ８６３０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）、マトリゲル、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　ｐｌａｓｍａ（トロンビン：Ｔ４６４８，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）、２×ＤＭＥＭを含む溶液に２×１０6　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように第１培養槽に播種した。最終的な溶液の組成を表２に示す。デバイスを入れたウェル全体を満たすように３ｍｌのＭＮ培地を入れ、組織形成・増殖・分化させた。筋組織の分解を防ぐために６－Ａｍｉｎｏ　ｃａｐｒｏｉｃ　Ａｃｉｄ（Ａ２５０４，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）（６ＡＡ）を、２．０ｍｇ／ｍｌとなるように加えた。運動神経細胞播種７日目に形成した３次元骨格筋組織と第３ユニット４の他端部分４４とをマトリゲルで接合することで、骨格筋組織と他端部分４４が衝撃等によりずれないようにした。なお、マトリゲルの接合は補助的な手順で、省略してもよい。培地交換は２日に１回半量交換を行った。以上の手順で評価モデルを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図１８Ａは、デバイスａを用いて作製した評価モデルの第３ユニットの第１開口部付近の拡大写真である。また、図１８Ｂは、デバイスｂを用いて作製した評価モデルの第３ユニットの第１開口部付近の拡大写真である。デバイスａおよびデバイスｂを用いて作製した評価モデルは、軸索流路に軸索が伸び、そして、第１軸索通過孔（第２軸索通過孔）を軸索が通過していることを確認した。
［神経筋接合部の染色］
　運動神経細胞と骨格筋細胞を共培養することで作製した評価モデルにおいて、神経筋接合部の形成の有無を、筋管細胞の蛍光染色によって確認した。まず、骨格筋細胞の培養に使用した培地と４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（１６１－２０１４１，ＷＡＫＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を半量ずつまぜた溶液をウェル入れて常温で５分静置した。その後、溶液を抜き取って４％ＰＦＡ／ＰＢをウェルに入れて常温で１５分静置して固定化を行った。４％ＰＦＡ／ＰＢを抜き取り、ＰＢＳを入れて常温で１０分おき、それを３回繰り返して洗浄した。その後ＰＢＳを抜き取って、０．３％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｔ８７８７－２５０ｍｌ，Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）／ＰＢＳを入れ、常温で５分間膜貫通させた。ここでもまた、ＰＢＳで３回洗浄して１次抗体／基本液を入れて１時間静置してブロッキングを行った。基本液の組成は、１０％Ｇｏａｔ　ｓｅｒｕｍ（Ｓ－１０００，Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）＋０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳを用いた。ブロッキング後は、１次抗体を２μｇ／ｍｌの濃度になるように混ぜた基本液を入れて４℃で一晩反応させた。筋管細胞の免疫染色に用いた１次抗体は、ＴＵＪ１（８４５５０１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＵＳＡ）である。次の日に溶液を抜き取ってＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体を４μｇ／ｍｌの濃度になるように混ぜた基本液を入れて１時間反応させた。用いた２次抗体は、ＣＦ５４３（登録商標）　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｖｒｏｓｓ－ａｄｓｏｒｂｅｄ，２ｍｇ／ｍｌ（２０３００，ＢＩＯＴＩＵＭ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）である。アセチルコリンレセプターの染色には、拮抗剤であるα－ブンガロトキシンに蛍光色素をつけたＦｌｕｏｒｅｄｃｅｉｎ－ａｌｐｈａ－ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ（ＰＫ－ＣＡ７０７－０００１１，ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、終濃度４μｇ／ｍｌになるように添加した。ＰＢＳで３回洗浄を行って、共焦点顕微鏡で観察した。
　図１９は、共焦点顕微鏡で撮像した写真で、図中の三角の先端の染色部分は、アセチルコリンレセプターの凝集が染色されたことを示している。神経筋接合部にはアセチルコリンレセプターが凝集して存在する。作製した評価モデルでアセチルコリンレセプターの凝集の染色が確認されたことから、作製した評価モデルには、神経筋接合部が形成されていることを確認した。
［神経筋接合部のフェノタイプの確認］
　次に、神経筋接合部の形成を機能的に確認するため、運動神経細胞の単独刺激による骨格筋組織の収縮の確認を、デバイスａを用いて作製した評価モデルで行った。運動神経細胞の刺激にはグルタミン酸（０７０－００５０２，Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）用いた。グルタミン酸は、下位運動神経へ作用することで、神経発火を促すことができる神経伝達物質であることが知られている。先ず、最終濃度４００μＭになるようにグルタミン酸を溶かしたＭＮ培地を、第２培養槽に添加した。運動神経からの刺激が骨格筋組織に伝わって収縮を起こしていることを確認するため、約２０秒後に、テトロドトキシン（ＴＴＸ，２０６－１１０７１，Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を、最終濃度２μＭになるように第２培養槽に添加した。テトロドトキシンは、運動神経の興奮性膜のＮａチャンネルを選択的に阻害する。薬剤添加前後の骨格筋組織の収縮はＢＺ－Ｘ７１０を用いて動画を撮影し、動画分析ソフトウェアＰＶ　Ｓｔｕｄｉｏ　２Ｄ（ＯＡ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて収縮の様子をグラフ化した。
　図２０は、薬剤添加前後の骨格筋組織の収縮を示すグラフである。図２０から明らかなように、グルタミン酸を第２培養槽、つまり、運動神経細胞に投与することで、骨格筋組織が収縮することを確認した。そして、テトロドトキシンを投与することで、骨格筋組織の収縮が停止することを確認した。以上の結果より、本明細書で開示するデバイスを用いて作製した評価モデルは、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索が骨格筋組織に接合し、神経筋接合部を形成していることを確認した。また、薬剤の添加により、骨格筋組織の収縮の程度が変化したことから、本明細書で開示する評価モデルを用いて、神経筋疾患の治療薬のスクリーニングができることを確認した。
〔軸索の染色〕
　デバイスｂを用いて作製した評価モデルを用い、以下の手順で軸索の染色を行った。染色試薬には、Ｃｅｌｌ　Ｂｒｉｔｅ（登録商標）　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｄｙｅｓ（３００２１，ＢＩＯＴＩＵＭ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いた。試薬：培地＝５μｍ：１ｍｌの割合で混ぜた溶液を被験物質投入孔から投入し、第１流路内に染色試薬を流して３０分以上反応させた。その後、使用している培地で第１流路内を洗浄し、顕微鏡で観察した。
　図２１ＡおよびＢは、顕微鏡で観察した写真で、同じ場所で明度を変えた写真である。写真中の矢印の先の明るくなっている部分が、染色された軸索である。第１流路に染色試薬を投入することで、第１流路内の軸索のみ選択的に染色できることを確認した。したがって、染色試薬に代え、神経筋疾患の治療薬の被験物質を用いれば、軸索に特異的に影響を与える治療薬のスクリーニングに使用できることを確認した。また、実施例１で作製したデバイスを用い、運動神経細胞と骨格筋細胞を共培養することで作製した評価モデルは、２７日目に別の実験に使用するまで、運動神経細胞と骨格筋細胞の融合は見られなかった。図２に示す通り、非特許文献２に記載のデバイスを用いて作製した評価モデルは、共培養開始後１４日目には、運動神経細胞がピラーを乗り越えたことが示されている。したがって、本明細書で開示するデバイスを用いて評価モデルを作製すると、従来のデバイスを用いて作製した評価モデルと比較して、長期間、運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織が分離した状態で評価ができる。
＜実施例３＞
［軸索の断裂と再生の確認］
　＜実施例１＞で作製したデバイス１ｂを用い、上記＜実施例２＞の（１）と同様の手順で運動神経細胞を培養した。培養終了後、シリンジポンプを用い、第１流路４２ｂの一端４２ｂ１から、約６０Ｐａのせん断応力で培地を第１流路４２ｂに流した。図２２Ａ乃至Ｃは、培養終了後の第３ユニット４の第２開口部４５ａ付近の拡大写真である。図２２Ａは運動神経細胞の培養終了時の写真で、第２開口部４５ａから第１流路４２ｂを通り、第１開口部４５に伸長する軸索（図２２Ａの矢印）を確認した。図２２Ｂは、約６０Ｐａのせん断応力で培地を流した後、約３０秒経過後の写真で、軸索が断裂したことを確認した。図２２Ｃは、軸索断裂後、約２４時間経過した後の写真で、軸索が再生（図２２Ｃの矢印）したことを確認した。以上の結果より、本出願で開示するデバイスを用いることで、軸索の断裂と再生ができることを確認した。
　本出願で開示するデバイス、デバイスを用いて作製した評価モデル、評価モデルを用いたスクリーニング方法を用いることで、神経筋疾患の治療薬のスクリーニングができる。したがって、医療機関、大学、企業、研究機関等における創薬に有用である。
１、１ａ～１ｄ…共培養用デバイス、２…第１ユニット、３…第２ユニット、４…第３ユニット、５…運動神経細胞培養用デバイス、５ａ…運動神経細胞培養用デバイス、６…蓋、１０…骨格筋組織、１１…軸索、２１…第１基材、２２…第１培養槽、２３…ピラー、２４…切欠部、３１…第２基材、３２…第２培養槽、３３…第３ユニット挿入部、４１…第３基材、４２…軸索流路、４２ａ…仮想軸索流路、４２ｂ…第１流路、４２ｂ１…第１流路の一端、４２ｂ２…第１流路の他端、４２ｃ…第２流路、４２ｃ１…第２流路の一端、４２ｃ２…第２流路の他端、４２ｃ３…第２流路用壁面、４３…第３ユニットの一端部分、４４…第３ユニットの他端部分、４５…第１開口部、４５ａ…第２開口部、２１１…第１基材の底面、２１２…第１基材の側壁面、２２１…第１培地投入孔、２３１…ピラーの一端、２３２…ピラーの他端、３２１…第２培地投入孔、４１１…第３基材開口部、４２１…軸索流路開口、４２２…軸索流路の他端、４２３…スリット、４３１…一端部分の側面、４５１…第１軸索通過孔、４５１’…第２軸索通過孔、４５１ａ、４５１’ａ…第１開口面、４５１ｂ、４５１’ｂ…第２開口面、５００…マルチウェルプレート、５０１…基材、５０２…ウェル、５０３…一対の電極、５０４…回路

Claims (12)

  1. 　運動神経細胞と骨格筋細胞の共培養用デバイスであって、
    　デバイスは、
    　　骨格筋組織形成用の第１ユニットと、
    　　運動神経細胞培養用の第２ユニットと、
    　　第１ユニットと第２ユニットとを連通するための第３ユニットと、
    　　骨格筋組織形成の足場となるピラーと、
    を含み、
    　第１ユニットは、
    　　第１基材と、
    　　第１基材に形成された第１培養槽と、
    を含み、
    　第２ユニットは、
    　　第２基材と、
    　　第２基材に形成された第２培養槽と、
    を含み、
    　第３ユニットは、
    　　第３基材と、
    　　第３基材に形成され、軸索の束が通る軸索流路と、
    を含み、
    　　第３ユニットの一端部分は第２ユニットに連結することができ、第３ユニットの一端部分と第２ユニットとを連結した時には、軸索流路と第２培養槽とを連通することができ、
    　　第３ユニットの他端部分には第１開口部が軸索流路に接するように形成され、第１開口部には、第１軸索通過孔が１以上形成され、
    　　第１軸索通過孔は、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過できないが、軸索が通過できる大きさであり、
    　　ピラーの少なくとも一部は、第１培養槽内に配置できる、
    デバイス。
  2. 　軸索流路が、
    　　第１流路と、
    　　第１流路の内側に形成された第２流路と、
    を含み、
    　第１開口部は、第１流路に接するように形成され、
    　第２流路は、
    　　一端が第２培養槽に連通することができ、
    　　他端には、第２開口部が接するように形成され、
    　第２開口部には、
    　　第２軸索通過孔が１以上形成され、
    　　第２軸索通過孔は、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過できないが、軸索が通過できる大きさであり、
    　第１開口部と第２開口部は離間して配置されている、
    請求項１に記載のデバイス。
  3. 　２以上の第３ユニットが、積層されている、
    請求項１または２に記載のデバイス。
  4. 　第１ユニット、第２ユニット、第３ユニット、および、ピラーの位置関係は、
    　　ピラーが２本以上含まれる場合は、２本以上のピラーを結んだ仮想面の何れかと、軸索流路を第１培養槽に仮想的に延長した仮想軸索流路が交わるように配置され、
    　　ピラーが１本の場合は、１本のピラーが形成する仮想面、または、ピラーと第３ユニットの他端部分で形成する仮想面と、軸索流路を第１培養槽に仮想的に延長した仮想軸索流路が交わるように配置される、
    請求項１～３の何れか一項に記載のデバイス。
  5. 　ピラーが２本含まれ、各々のピラーの一端は第１基材２１に連結し、他端は第１培養槽内に片持ち状に配置される、
    請求項４に記載のデバイス。
  6. 　第１軸索通過孔の大きさが、
    　　最小距離が０．５μｍ以上、２．５μｍ以下、または、
    　　最小距離が０．５μｍ以上で、断面積が６０μｍ2以下である、
    請求項１～５の何れか一項に記載のデバイス。
  7. 　第２ユニットと第３ユニットを連結することで運動神経細胞培養用デバイスを作製し、
    　一つの第１ユニットに対して、２以上の運動神経細胞培養用デバイスが配置される、
    請求項１～６の何れか一項に記載のデバイス。
  8. 　一つの第２ユニットに２以上の第３ユニットを連結することで運動神経細胞培養用デバイスを作製し、
    　任意の第３ユニットの他端に第１ユニットが配置される、
    請求項１～６の何れか一項に記載のデバイス。
  9. 　運動神経細胞と骨格筋細胞の共培養用デバイスに用いられる運動神経細胞培養用デバイスであって、
    　デバイスは、
    　　運動神経細胞培養用の第２ユニットと、
    　　第２ユニットに連結した第３ユニットと、
    を含み、
    　第２ユニットは、
    　　第２基材と、
    　　第２基材に形成された第２培養槽と、
    を含み、
    　第３ユニットは、
    　　第３基材と、
    　　第３基材に形成され、軸索の束が通る軸索流路と、
    を含み、
    　　第３ユニットの一端と第２ユニットは連結し、軸索流路の一端は第２培養槽に連通し、
    　　第３ユニットの他端部分には第１開口部が軸索流路に接するように形成され、第１開口部には、第１軸索通過孔が１以上形成され、
    　　第１軸索通過孔は、運動神経細胞および骨格筋細胞は通過できないが、軸索が通過できる大きさである、
    デバイス。
  10. 　少なくとも２以上のウェルを有し、
    　前記ウェルの少なくとも１つに、請求項１～９の何れか一項に記載のデバイスが配置されている、
    マルチウェルプレート。
  11. 　請求項１～８の何れか一項に記載のデバイスを用いた神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法であって、
    　作製方法は、
    　　第２ユニットで運動神経細胞を培養する運動神経細胞培養工程と、
    　　第１ユニットで骨格筋細胞を培養し、骨格筋組織を作製する骨格筋組織作製工程と、
    　　培養した運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索が、第３ユニットの軸索流路を通り、作製した骨格筋組織と接合することで神経筋接合部を作製する神経筋接合部作製工程と、
    を含む、神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルの作製方法。
  12. 　請求項１１に記載の作製方法で作製した神経筋疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価モデルを用いた神経筋疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、
    　スクリーニング方法は、
    　　作製した評価モデルの運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織の何れか一つに被験物質を投与する被験物質投与工程と、
    　　運動神経細胞、運動神経細胞の細胞体から伸びた軸索、骨格筋組織の少なくとも一つの状態を測定する測定工程と、
    　　測定工程の結果より、被験物質が神経筋疾患の治療薬として作用するのか評価する被験物質評価工程と、
    を含む、
    スクリーニング方法。
     
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