JP2023505989A - 微細工学組織障壁システム - Google Patents
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Abstract
本発明は、生体内組織障壁の構造及び機能の模写のための微細流体装置に関する。具体的に、２次元－３次元結合組織障壁または３次元組織障壁の構造及び機能を模写することで、動物モデルに代えて新薬開発及び毒性評価などのためのモデルとして利用できる微細流体装置、微細流体装置内の細胞培養方法、及び微細流体装置を用いた器官または臓器の模写方法に関する。【選択図】図１
Description
本発明は、生体内組織障壁の構造及び機能の模写のための微細流体装置に関する。具体的に、２次元－３次元結合組織障壁または３次元組織障壁の構造及び機能を模写することで動物モデルに代えて新薬開発及び毒性評価などのためのモデルとして利用できる微細流体装置、微細流体装置内の細胞培養方法、及び微細流体装置を用いた器官または臓器の模写方法に関する。
薬物の効能及び副作用を検査するための実験動物モデルの使用による倫理的問題及び異種間の差異点による問題を解決するために、臓器組織をチップの形態で集積させた臓器チップ（Ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）が開発された。臓器チップは、小さいチップに特定の臓器を構成する細胞を培養することで、該当臓器の形態及び生理的特性を模写して所望の機能を実現する技術である。これを利用して特定の臓器の細胞挙動及び微細環境における物理化学的反応のメカニズムを詳細に研究することができ、新薬開発及び毒性評価などのためのモデルとして利用できる。
臓器チップの開発において、従来の２次元（ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ（２Ｄ））細胞培養を用いた細胞培養モデルは、培養皿（ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）を利用して皿の底に細胞を２次元で培養させるので、多くの細胞タイプの組織特異的な分化機能（ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）を説明できなかったり、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の組織機能と薬物活性度を正確に予測できないといった問題点を有する。
特に、生体内で３次元接触をしているニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）などを有する脳組織細胞の場合、前記２次元細胞培養モデルの限界によって、生きている組織の空間的構造と生化学的複雑性をよく模写する３次元細胞培養モデルへの必要性が高まっている。
３次元細胞培養モデルは、生体内の状態（ｓｉｔｕａｔｉｏｎ）をよく模倣するので、生体外の実験で方向的成長と細胞間連結の複雑性を実現することができ、分子ベース（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ）の組織機能を研究するのにおいて２次元細胞培養モデルに対比して様々な疾病状態の信号機序（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）と薬物反応（ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）をよく捕らえるのに役立つ。
一方、半導体工程技術と共に発達してきた微細流体工学技術は、マイクロ単位の規格を有した構造体を高精度で大量生産することを可能にした。特に、フォトリソグラフィ及びソフトリソグラフィ技術は、半永久的なモールドを用いたスタンピング（Ｓｔａｍｐｉｎｇ）によって容易に微細チャンネル構造の生産を可能にし、それによって人体の血管や臓器の細胞層などの微細構造を生体外で模写しようとする試みがあった。
従来の研究は、フォトリソグラフィまたはソフトリソグラフィ技術を利用してポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）微細チャンネルと多孔性膜からなったチップを製作し、チップ内部における細胞培養によって臓器の細胞層の構造を実現する形態で行われた。しかしながら、ＰＤＭＳ材質で製作した微細流体装置を用いた臓器チップは、薬物またはタンパク質がＰＤＭＳの表面に吸着されて消失する場合が多く発生し、実際の製薬産業に適用し難い限界点が存在した。
従って、本発明者らは従来の微細流体装置を用いた臓器チップの問題点を改善し、生体内の２次元－３次元結合組織障壁または３次元組織障壁の構造及び機能をさらに類似に模写するための微細流体装置を開発して本発明の完成に至った。
Ｃｈｏ、Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５、１５２２２（２０１５）。
Ｂｏｏｔｈ、Ｒ．＆Ｋｉｍ、Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ（ｍｕ ＢＢＢ）．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １２、１７８４－１７９２（２０１２）。
本発明は、実験動物モデルの使用による倫理的問題及び異種間の差異点による問題を解決し、２次元－３次元結合組織障壁または３次元組織障壁の構造を形成させることで、従来の臓器チップ（Ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）と比較して生体内の組織障壁とさらに類似した構造及び機能を示す微細流体装置を提供することを目的とする。
本発明は、第１の中心チャンネルを含むインサートと、第２の中心チャンネル、第３の側面チャンネル、第４の側面チャンネル、第２の中心チャンネルと第３の側面チャンネルを連結する第５の通路チャンネル、及び第２の中心チャンネルと第４の側面チャンネルを連結する第６の通路チャンネルを含むベースと、前記インサートとベースとの間に位置する多孔性膜とを含む微細流体装置を提供する。
本発明は、前記微細流体装置を組み立てるステップと、第２の細胞を第２の中心チャンネルに注入し、その後、微細流体装置をひっくり返して培養するステップと、第３の細胞を含むハイドロゲルを第２の中心チャンネルに注入し、その後培養するステップと、及び微細流体装置をひっくり返し、その後第１の細胞を第１の中心チャンネルに注入して培養するステップを含む、微細流体装置内の細胞培養方法を提供する。
また、本発明は、前記微細流体装置を利用して器官または臓器の構造及び機能を模写する方法であって、第１の流体を第１の中心チャンネルに灌流させるステップと、及び第２の流体を第３の側面チャンネル、第２の中心チャンネル及び第４の側面チャンネルに灌流させるステップを含む、器官または臓器の模写方法を提供する。
本発明の微細流体装置は、血液－脳障壁を含む生体内の様々な組織障壁の主な構造及び物質移動現象を模写して薬物の効能評価に用いられてもよい。
本発明の微細流体装置は、組織障壁周辺のナノ粒子の分布に対する精密な定量化が可能であり、インサートがベースから脱着可能であるので、微細流体装置内に含まれた細胞を損傷なく選択的に分離して分析に利用することができる。また、インサートをベースから分離して薬物塗布などの必要な処理を加え、それから再び組み立てて細胞反応を観察することができる。
本発明の微細流体装置は、細胞の３次元培養が可能であり、生体内細胞の空間的構造と生化学的複雑性を実現して組織障壁の構造及び機能をよりよく模写することができる。
以下、添付図面を参照して、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本願の実施形態及び実施例について詳しく説明する。しかしながら、本願は、様々な形態で実施され得るので、以下に説明する実施形態及び実施例に限定されるものではない。
本願明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは特に断らない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。
本発明は、第１の中心チャンネルを含むインサートと、第２の中心チャンネル、第３の側面チャンネル、第４の側面チャンネル、前記第２の中心チャンネルと前記第３の側面チャンネルを連結する第５の通路チャンネル、及び前記第２の中心チャンネルと前記第４の側面チャンネルを連結する第６の通路チャンネルを含むベースと、前記インサートと前記ベースとの間に位置する多孔性膜とを含む、微細流体装置を提供する。
本願に用いられた「微細流体装置」なる用語は、有機高分子物質を含むプラスチック、ガラス、金属またはシリコンを含む様々な素材で製造された基板上に流体が流れることができるように備えられた微細チャンネルなどを含んでいる装置を意味する。
本願に用いられた「微細チャンネル」なる用語は、流体が流れることができるミリメートル（ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒ）、マイクロメータ（ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ）またはナノメートル（ｎａｎｏｍｅｔｅｒ）の次元を有する微細な大きさのチャンネルを意味する。
本願に用いられた「インサート」なる用語は、他の物体に形成された溝に挿入できる形態の物体を意味することができるが、これに制限されるものではない。
一実施態様において、前記インサートは、前記ベースから脱着可能なものであってもよく、前記ベースは、前記インサートが挿入できる溝を含んでもよい。好ましくは、前記インサートは、第１の締結ヘッドを含み、前記ベースは、第２の締結ヘッドを含み、前記第１の締結ヘッドと前記第２の締結ヘッドが互いに引っ掛けられて前記インサートと前記ベースがスナップフィット（ｓｎａｐ ｆｉｔ）脱着されてもよい。この時、前記第１の中心チャンネルと前記第２の中心チャンネルとの間の漏水を防止するために、前記多孔性膜は、前記インサートと前記ベースとの間で強い圧力を受けてガスケット（ｇａｓｋｅｔ）の役割を行うことができる。
本願に用いられた「締結ヘッド」なる用語は、プラスチック、ゴム、シリコンなどの弾性を有する材質で構成されてもよく、それぞれ弾性変形されてスナップフィット脱着を達成することができるが、これらに限定されるものではない。
本願に用いられた「スナップフィット」なる用語は、追加の部品や締結機構なしに、互いに引っかかる溝の相互作用により締結力が形成される締結方式を意味する。
一実施態様において、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルは、前記多孔性膜に接触しなくてもよい。好ましくは、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルは、前記第２の中心チャンネルに比べて高さが低くてもよく、さらに好ましくは、前記第２の中心チャンネルの高さと前記第３の側面チャンネル及び第４の側面チャンネルの高さの比が１：０．１～１：０．９であってもよい。
一実施態様において、前記第１の中心チャンネル、前記第２の中心チャンネル、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルは、液剤の灌流を誘導且つ調節できる入口及び出口を含んでもよい。前記灌流を誘導及び調節できる方法は、前記入口と出口の静水圧差（Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を利用する方法、外部ポンプを前記入口及び出口に連結する方法を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
一実施態様において、前記第５の通路チャンネル及び前記第６の通路チャンネルは、前記第２の中心チャンネル、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルに比べてチャンネルの高さが低くてもよい。好ましくは、前記第２の中心チャンネルと前記第５の通路チャンネル及び前記第６の通路チャンネルの高さの比が１：０．０３～１：０．２であってもよく、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルと前記第５の通路チャンネル及び前記第６の通路チャンネルの高さの比が１：０．０３～１：０．７であってもよい。
一実施態様において、前記ベースは、第１の流体リザーバ及び第２の流体リザーバを含んでもよい。また、前記ベースは、前記第３の側面チャンネルと前記第１の流体リザーバを連結する第７の通路チャンネル及び前記第４の側面チャンネルと前記第２の流体リザーバを連結する第８の通路チャンネルを含んでもよい。好ましくは、前記第７の通路チャンネル及び前記第８の通路チャンネルは、前記第２の中心チャンネル、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルに比べてチャンネルの高さが低くてもよい。好ましくは、前記第２の中心チャンネルと前記第７の通路チャンネル及び前記第８の通路チャンネルの高さの比が１：０．０２～１：０．０５であってもよく、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルと前記第７の通路チャンネル及び前記第８の通路チャンネルの高さの比が１：０．０２～１：０．５であってもよい。さらに好ましくは、前記第７の通路チャンネル及び前記第８の通路チャンネルの高さは５０μｍ以下であってもよい。
一実施態様において、前記第７の通路チャンネル及び前記第８の通路チャンネルは、前記第２の中心チャンネルの方向に垂直に形成されてもよい。
一実施態様において、前記微細流体装置は、プラスチック、ガラス、金属またはシリコンで製造できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、射出成型（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｍｏｌｄｉｎｇ）技術を利用してプラスチックで製造できる。
一実施態様において、前記第１の中心チャンネルは、組織障壁細胞を含んでもよい。前記組織障壁細胞は、血管内皮細胞；皮膚細胞；癌細胞；分泌腺細胞；筋肉細胞；及び気管支、大腸、小腸、膵臓及び腎臓の上皮細胞を含んでもよい。好ましくは、血管内皮細胞であってもよい。さらに好ましくは、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）であってもよい。
本願に用いられた「細胞」なる用語は、植物細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、バクテリア細胞及びかび細胞などを含む生物学的細胞を意味する。
本願に用いられた「組織障壁細胞」なる用語は、組織の特定の構造を維持する役割をし、組織を外部刺激から保護する役割をする細胞を意味する。それだけでなく、組織障壁細胞間あるいは細胞外基質との強い結合力を利用して、選択的に物質を透過させ組織内の物質濃度が恒常性を維持する役割をする細胞を意味する。組織障壁細胞は上皮組織細胞（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌ）及び血管内皮細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を含む。
一実施態様において、前記第２の中心チャンネルは内部組織細胞及びハイドロゲルを含んでもよい。
前記内部組織細胞は、星状細胞、周皮細胞、神経細胞、神経幹細胞、グリア細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、腸上皮細胞、角化細胞、皮膚線維芽細胞、足細胞及び糸球体内皮細胞を含んでもよい。好ましくは、星状細胞及び周皮細胞であってもよい。さらに好ましくは、ヒト星状細胞（ＨＡ；ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）及びヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ）であってもよい。
本願に用いられた「内部組織細胞」なる用語は、人体の臓器及び組織を構成している細胞を意味し、上皮組織（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ）、筋肉組織（Ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅ）、神経組織（Ｎｅｒｖｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ）または結合組織（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ）を意味するが、これらに限定されることなく、人体組職をなしているすべての細胞が含まれる。
前記ハイドロゲルは、コラーゲン、ラミニン、ヒアルロン酸、ミネラル、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチン、ペプチド、ポリエチレングリコール及びアルジネートからなる群より選ばれる少なくとも１つであってもよい。好ましくは、前記ハイドロゲルは、コラーゲンゲル、フィブリンゲル、ラミニンゲル、マトリゲル、動物由来腫瘍基底膜抽出物ゲル、組織脱細胞化細胞外基質ゲル、ペプチドゲル、ポリエチレングリコールゲルまたはアルジネートゲルであってもよいが、これらに限定されるものではない。さらに好ましくは、ラミニンゲルまたはマトリゲルである。
前記ハイドロゲルは、前記第２の中心チャンネルと前記第５の通路チャンネルの高さの差及び前記第２の中心チャンネルと前記第６の通路チャンネルの高さの差によって表面張力によって前記第２の中心チャンネル内に空間的に閉じ込められるものであり得る。
本願に用いられた「ハイドロゲル」なる用語は、共有結合、水素結合、ｖａｎ ｄｅｒ ｗａａｌｓ結合または物理的な結合などのような凝集力によって架橋された親水性高分子であって、水溶液上で多量の水を内部に含有して膨潤できる３次元高分子ネットワーク構造を有する物質を意味する。
一実施態様において、前記インサートを前記ベースから分離し、前記第１の中心チャンネルに含まれた細胞、前記第２の中心チャンネルに含まれた細胞、及び前記多孔性膜に付着された細胞からなる群より選ばれる少なくとも１つの細胞をそれぞれ分離することができ、前記分離された細胞を利用して遺伝子分析などの細胞分析を行うことができる。
一実施態様において、前記インサートを前記ベースから分離し、前記第１の中心チャンネルに薬物塗布などの必要な処理を施し、その後再び前記インサートを前記ベースに組み立てて細胞反応を観察することができる。
本発明は、第１の中心チャンネルを含むインサートと、第２の中心チャンネル、第３の側面チャンネル及び第４の側面チャンネルを含むベースと、前記インサートと前記ベースとの間に位置する多孔性膜とを含み、前記インサートは、前記ベースから脱着可能であることを特徴とする微細流体装置を組み立てるステップと、第２の細胞を前記第２の中心チャンネルに注入し、その後、前記微細流体装置をひっくり返して培養するステップと、第３の細胞を含むハイドロゲルを前記第２の中心チャンネルに注入し、その後培養するステップと、前記微細流体装置をひっくり返し、その後第１の細胞を前記第１の中心チャンネルに注入して培養するステップを含む、微細流体装置内の細胞培養方法を提供する。
一実施態様において、前記第１の中心チャンネル、前記第２の中心チャンネル、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルは、液剤の灌流を誘導且つ調節できる入口及び出口を含み、前記第２の細胞及び前記第３の細胞を含む前記ハイドロゲルは、前記第２の中心チャンネルの入口から注入され、前記第１の細胞は、前記第１の中心チャンネルの入口から注入されてもよい。
一実施態様において、前記第１の細胞は、血管内皮細胞；皮膚細胞；癌細胞；分泌腺細胞；筋肉細胞；及び気管支、大腸、小腸、膵臓または腎臓の上皮細胞からなる群より選ばれ、前記第２の細胞は、周皮細胞、グリア細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、腸上皮細胞、角化細胞、皮膚線維芽細胞、足細胞及び糸球体内皮細胞からなる群より選ばれ、前記第３の細胞は、星状細胞、神経細胞、及び神経幹細胞からなる群より選ばれてもよい。好ましくは、前記第１の細胞は血管内皮細胞、前記第２の細胞は周皮細胞、前記第３の細胞は星状細胞であってもよい。さらに好ましくは、前記第１の細胞はヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、前記第２の細胞はヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ）、前記第３の細胞はヒト星状細胞（ＨＡ；ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）であってもよい。
一実施態様において、本発明は、第１の中心チャンネルを含むインサートと、第２の中心チャンネル、第３の側面チャンネル及び第４の側面チャンネルを含むベースと、前記インサートと前記ベースとの間に位置する多孔性膜とを含み、前記インサートは、前記ベースから脱着可能であることを特徴とする微細流体装置を組み立てるステップと、１０4細胞／ｍＬ以上の濃度のヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ）１～５０μＬを前記第２の中心チャンネルに注入し、その後、前記微細流体装置をひっくり返して培養するステップと、１０3細胞／ｍＬ以上の濃度のヒト星状細胞（ＨＡ；ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）１～５０μＬを含むハイドロゲルを前記第２の中心チャンネルに注入し、その後培養するステップと、前記微細流体装置をひっくり返し、その後１０5細胞／ｍＬ以上の濃度のヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）１～５０μＬを前記第１の中心チャンネルに注入して培養するステップを含む、微細流体装置内の細胞培養方法を提供する。
本発明は、第１の中心チャンネルを含むインサートと、第２の中心チャンネル、第３の側面チャンネル、第４の側面チャンネル、第１の流体リザーバ、及び第２の流体リザーバを含むベースと、前記インサートと前記ベースとの間に位置する多孔性膜とを含み、前記インサートは、前記ベースから脱着可能であることを特徴とする微細流体装置内の器官または臓器の模写方法であって、第１の流体を前記第１の中心チャンネルに灌流させるステップと、及び第２の流体を前記第１の流体リザーバに注入し、前記第３の側面チャンネル、前記第２の中心チャンネル、前記第４の側面チャンネル及び前記第２の流体リザーバまで順に到達させるステップを含む、器官または臓器の模写方法を提供する。前記器官または臓器は血液－脳障壁、肺、肝、心臓、網膜、大腸、小腸、膵臓及び腎臓を含んでもよいが、これに制限されるものではない。好ましくは、前記器官または臓器は血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）である。
一実施態様において、前記ベースは、前記第２の中心チャンネルと前記第３の側面チャンネルを連結する第５の通路チャンネル、前記第２の中心チャンネルと前記第４の側面チャンネルを連結する第６の通路チャンネル、前記第３の側面チャンネルと前記第１の流体リザーバを連結する第７の通路チャンネル、及び前記第４の側面チャンネルと前記第２の流体リザーバを連結する第８の通路チャンネルを含んでもよい。
一実施態様において、前記第１の流体は、１～１０ｄｙｎｅ／ｃｍ2のせん断応力で灌流させることができ、好ましくは、４～６ｄｙｎｅ／ｃｍ2のせん断応力で灌流させることができる。前記第１の流体の流れは生体内の血液の流れを模写する役割を行うことができる。
一実施態様において、前記第２の流体の流速は、前記第１の流体リザーバと前記第２の流体リザーバの静水圧差を利用して１２時間以上にかけて１～１００μＬ／ｈで維持されてもよく、好ましくは、１０～１５μＬ／ｈで維持されてもよい。前記第２の流体の流れは生体内のてんかん液の流れ（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｌｏｗ）を模写する役割を行うことができる。
本発明は、ａ）第１項による微細流体装置を提供するステップと、ｂ）前記微細流体装置に物質を導入するステップと、及びｃ）前記物質の生理学的、薬理学的または毒性学的効果を評価するステップを含む物質の生理学的、薬理学的または毒性学的効果の分析方法を提供する。前記物質は、薬物（ｄｒｕｇ）、毒素（ｔｏｘｉｎ）または病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）であってもよいが、これに制限されるものではない。
以下、図面を参照して本発明の微細流体装置について詳細に説明することとする。本発明は、図１ないし２５の形態で具体化された微細流体装置を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。特に、図１２ないし２５に本発明の微細流体装置の具体的な実施例を示したが、本発明は、特定の実施例に限定されず、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって様々な変形実施が可能であることを含む。
本発明の一実施例による微細流体装置は、インサート１００、ベース２００及びインサート１００とベース２００との間に位置する多孔性膜３００を含む。
図１を参照すると、前記インサート１００は、第１の中心チャンネル１１０を含み、前記ベース２００は、第２の中心チャンネル２１０、第３の側面チャンネル２２０、第４の側面チャンネル２３０、第２の中心チャンネル２１０と第３の側面チャンネル２２０を連結する第５の通路チャンネル２４０及び第２の中心チャンネル２１０と第４の側面チャンネル２３０を連結する第６の通路チャンネル２５０を含む。一実施態様において、前記ベース２００の下段に底部４００が付着されてもよい。
図２及び３を参照すると、前記微細流体装置のベース２００は、第１の流体リザーバ２８０及び第２の流体リザーバ２９０を含んでもよく、第３の側面チャンネル２２０と第１の流体リザーバ２８０を連結する第７の通路チャンネル２６０及び第４の側面チャンネル２３０と第２の流体リザーバ２９０を連結する第８の通路チャンネル２７０を含んでもよい。
図４及び５を参照すると、前記微細流体装置の多孔性膜３００は、第１の中心チャンネル１１０及び第２の中心チャンネル２１０の間に存在し、第７の通路チャンネル２６０及び第８の通路チャンネル２７０は、第２の中心チャンネル２１０の方向と垂直に形成されてもよい。
図６及び７を参照すると、前記微細流体装置の第１の中心チャンネル１１０は、第１の細胞１１１を含んでもよく、第２の中心チャンネル２１０は、第２の細胞２１１、第３の細胞２１２及び／またはハイドロゲル２１３を含んでもよい。一実施態様において、前記第１の細胞１１１は、多孔性膜３００の上段表面に付着されて培養されてもよく、前記第２の細胞２１１は、多孔性膜３００の下段表面に付着されて培養されてもよく、前記第３の細胞２１２は、ハイドロゲル２１３の内部で３Ｄ培養されてもよい。
図８ないし１０及び図１８を参照すると、前記微細流体装置のベース２００は、インサート１００が挿入できるインサート挿入溝２０１を含み、インサート１００はベース２００から脱着可能なものであってもよい。また、前記インサート１００は、第１の締結ヘッド１０１を含み、前記ベース２００は、第２の締結ヘッド２０２を含み、前記第１の締結ヘッド１０１と第２の締結ヘッド２０２が互いに引っ掛けられてインサート１００とベース２００がスナップフィット（ｓｎａｐ ｆｉｔ）脱着されてもよい。
図１２及び１３を参照すると、前記微細流体装置のインサート１００は、第１の中心チャンネルの入口１１２、出口１１３、第２の中心チャンネルの入口２１４、出口２１５、第３の側面チャンネルの入口２２１、出口２２２、第４の側面チャンネルの入口２３１及び出口２３２を含んでもよい。前記第１の中心チャンネルの入口１１２及び出口１１３は、第１の中心チャンネル１１０と菅形態で連結でき、前記菅によって電極を一定の位置及び深さで挿入してＴＥＥＲ値の精密な測定が可能であり得る。
図１４ないし１６及び図１９を参照すると、前記微細流体装置のベース２００は少なくとも１つのインサート１００が脱着可能な構造であってもよい。好ましくは、４つのインサート１００が脱着可能な構造であってもよい。
図１７及び２３を参照すると、前記微細流体装置はカバー５００を含んでもよい。前記カバー５００は、カバー内の第１の中心チャンネルの入口５０１及び出口５０２を含んでもよい。前記カバー内の第１の中心チャンネルの入口５０１及び出口５０２は、流体の漏水を防止するために開閉可能な形態であってもよい。
図２４を参照すると、前記微細流体装置のインサート１００に含まれた第１の中心チャンネルの入口１１２によって流体を注入し、第１の中心チャンネル１１０を経て第１の中心チャンネルの出口１１３方向へ流体を灌流させることができる。
図１１及び２５を参照すると、前記微細流体装置のベース２００に含まれた第１の流体リザーバ２８０に流体を注入し、第３の側面チャンネル２２０、第２の中心チャンネル２１０、第４の側面チャンネル２３０及び第２の流体リザーバ２９０まで順に前記流体を灌流させることができる。好ましくは、前記微細流体装置のベース２００に含まれた第１の流体リザーバ２８０に流体を注入し、第７の通路チャンネル２６０、第３の側面チャンネル２２０、第５の通路チャンネル２４０、第２の中心チャンネル２１０、第６の通路チャンネル２５０、第４の側面チャンネル２３０、第８の通路チャンネル２７０及び第２の流体リザーバ２９０まで順に前記流体を灌流させることができる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、下記の実施例は説明を目的とするものに過ぎず、本願発明の範囲を限定しようとする意図ではない。
［実施例１］内皮細胞、周皮細胞及び星状細胞の培養及び生存度
ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ）及びヒト星状細胞（ＨＡ；ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の共同培養のための培養条件を最適化するために、６つの培地条件でＭＴＳ（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）分析法を利用してそれぞれの細胞代謝活性度を比較した。６つの培地条件は次のとおりであり、グリア細胞培地（Ｇ、ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉｕｍ）は、星状細胞培地（Ａ）及び微細にかわ培地（Ｍ）の１：１混合物を意味する。
（ｉ）Ｅ：内皮培地（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）
（ｉｉ）Ａ：星状細胞培地（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）
（ｉｉｉ）Ｐ：周皮細胞培地（ｐｅｒｉｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）
（ｉｖ）Ｍ：微細にかわ培地（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｍｅｄｉｕｍ）
（ｖ）Ｅ＋Ｇ（Ｅ＋Ａ＋Ｍ）：内皮培地（Ｅ）、星状細胞培地（Ａ）及び微細にかわ培地（Ｍ）の１：１：１混合物
（ｖｉ）Ｅ＋Ｇ＋Ｐ（Ｅ＋Ａ＋Ｍ＋Ｐ）：内皮培地（Ｅ）、星状細胞培地（Ａ）、微細にかわ培地（Ｍ）及び周皮細胞培地（Ｐ）の１：１：１：１混合物
ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ；ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｉｃｙｔｅ）及びヒト星状細胞（ＨＡ；ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の共同培養のための培養条件を最適化するために、６つの培地条件でＭＴＳ（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）分析法を利用してそれぞれの細胞代謝活性度を比較した。６つの培地条件は次のとおりであり、グリア細胞培地（Ｇ、ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉｕｍ）は、星状細胞培地（Ａ）及び微細にかわ培地（Ｍ）の１：１混合物を意味する。
（ｉ）Ｅ：内皮培地（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）
（ｉｉ）Ａ：星状細胞培地（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）
（ｉｉｉ）Ｐ：周皮細胞培地（ｐｅｒｉｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）
（ｉｖ）Ｍ：微細にかわ培地（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｍｅｄｉｕｍ）
（ｖ）Ｅ＋Ｇ（Ｅ＋Ａ＋Ｍ）：内皮培地（Ｅ）、星状細胞培地（Ａ）及び微細にかわ培地（Ｍ）の１：１：１混合物
（ｖｉ）Ｅ＋Ｇ＋Ｐ（Ｅ＋Ａ＋Ｍ＋Ｐ）：内皮培地（Ｅ）、星状細胞培地（Ａ）、微細にかわ培地（Ｍ）及び周皮細胞培地（Ｐ）の１：１：１：１混合物
ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を前記６つの培地条件で３日間培養し、その後それぞれの細胞にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を添加した。４時間にかけて培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）し、その後Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を利用して４９０ｎｍで各サンプルの光学吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定した。実験結果のデータは、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ－ｔｅｓｔを利用してｎ＝６の平均±ｓ．ｄ．と示した（*ｐ＜０．０５、****ｐ＜０．００１）。
図２６に示したように、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）またはヒト星状細胞（ＨＡ）をそれぞれの培養培地である内皮培地（Ｅ）、周皮細胞培地（Ｐ）または星状細胞培地（Ａ）で培養した場合より混合培地であるＥ＋Ｇ（Ｅ＋Ａ＋Ｍ）培地で培養した場合に細胞培養がさらに優れていることを確認した。
また、図２７及び２８に示したように、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）及びヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）は、Ｅ＋Ｇ及びＥ＋Ｇ＋Ｐ培地で生存度が全て優れており、ヒト星状細胞（ＨＡ）はＥ＋Ｇ培地で生存度が優れていることを確認した。
前記実験結果に応じて、以下の実施例においては、内皮培地（Ｅ）、星状細胞培地（Ａ）及び微細にかわ培地（Ｍ）の１：１：１混合物であるＥ＋Ｇ（Ｅ＋Ａ＋Ｍ）培地を利用して細胞培養を行った。
［実施例２］血液－脳障壁（ＢＢＢ）模写の微細流体装置の製作
組み立てられた微細流体装置を利用して次のような方法により、血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置を製作した。
組み立てられた微細流体装置を利用して次のような方法により、血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置を製作した。
図２９に示したように、１０6～１０7細胞／ｍＬ濃度のヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）１０μＬを第２の中心チャンネルに注入し、微細流体装置をひっくり返して多孔性膜の表面に周皮細胞が等しく付着できるように１時間にかけて培養し、その後培養液を交替した。６時間以上が過ぎた後、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）にエンベディングされた１０5～１０6細胞／ｍＬ濃度のヒト星状細胞（ＨＡ）１０μＬを第２の中心チャンネルに注入した。マトリゲルが固まるように１時間にかけて培養し、第３の側面チャンネル及び第４の側面チャンネルに培養液を注入し、その後、６時間以上培養した。微細流体装置を再びひっくり返し、その後７×１０7細胞／ｍＬ濃度のヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）１５μＬを第１の中心チャンネルに注入して１時間にかけて培養し、その後培養液を交替した。
［実施例３］血液－脳障壁（ＢＢＢ）の特異的なタンパク質の発現水準の確認
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の３次元組織障壁機能を試験するために、血液－脳障壁の特異的なタンパク質の発現水準をｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって確認した。比較のために、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）のみを単一培養した場合のタンパク質発現を共に確認した。
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の３次元組織障壁機能を試験するために、血液－脳障壁の特異的なタンパク質の発現水準をｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって確認した。比較のために、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）のみを単一培養した場合のタンパク質発現を共に確認した。
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍＢＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用してヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）からＲＮＡを単離及び収集し、収集したＲＮＡサンプルの量をＣｙｔａｔｉｏｎ ５ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを利用して測定した。８００ｎｇのＨＢＭＥＣ ＲＮＡ及び２８０ｎｇのＨＡ ＲＮＡをＨｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用してＴ１００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともにｃＤＮＡで逆転写させた。その後、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）（ｎ＝３）における内皮特異的な遺伝子の発現を分析するために、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｂｉｏｍａｒｋ ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を用いてＦｌｅｘ Ｓｉｘ ＩＦＣ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で微細流体ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。それぞれの標的遺伝子は、商業的に入手可能なプライマを用いて評価し、実験に用いられたプライマを下記の表１に示した。
図３０に示したように、血液－脳障壁における接合形成（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）調節、運搬体媒介輸送（ｃａｒｒｉｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、活性流出（ａｃｔｉｖｅ ｅｆｆｌｕｘ）またはアミロイドベータ（Ａβ；ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ）輸送を調節するタンパク質を含み、評価に利用された全ての血液－脳障壁の特異的なタンパク質がヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）のみを単一培養した場合より、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置で発現が増加したことを確認した。特に、図３１及び３２に示したように、血液－脳障壁の特異的な接合タンパク質（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）及び受容体タンパク質（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の遺伝子の発現水準が内皮細胞単一培養に比べて顕著に増加したことを確認した。
［実施例４］ＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値の比較
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の３次元組織障壁機能を試験するためにＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を測定した。比較のためにヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）のみを単一培養した場合のＴＥＥＲ値を共に確認した。ＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓ－Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）は、オームの法則（Ｏｈｍ’ｓ ｒａｗ）を利用し、細胞層の電気抵抗を測定する方法であって、細胞層からなった細胞障壁がどれくらいよく機能しているかを示す要素のうちの１つである。細胞層が互いに強く結合するほど、細胞間の結合をなす接合タンパク質（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現が強くなり、細胞間（Ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）の物質輸送が制限されるので、電気抵抗値が高くなる。ヒト血液－脳障壁は物質輸送がきわめて制限されている障壁であって、ＴＥＥＲ値が５０００Ω．ｃｍ2と推定され［Ｌａｕｓｃｈｋｅ Ｋ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ Ｌ、Ｈａｌｌ ＶＪ（２０１７）Ｐａｖｉｎｇ ｔｈｅ ｗａｙ ｔｏｗａｒｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ ２６（１２）：８５７－８７４］、ラット血液－脳障壁は５９００Ω．ｃｍ2で測定されたことがある［Ｂｕｔｔ ＡＭ、Ｊｏｎｅｓ ＨＣ、Ａｂｂｏｔｔ ＮＪ（１９９０）Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ ｒａｔｓ：ａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４２９：４７－６２］。
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の３次元組織障壁機能を試験するためにＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を測定した。比較のためにヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）のみを単一培養した場合のＴＥＥＲ値を共に確認した。ＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓ－Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）は、オームの法則（Ｏｈｍ’ｓ ｒａｗ）を利用し、細胞層の電気抵抗を測定する方法であって、細胞層からなった細胞障壁がどれくらいよく機能しているかを示す要素のうちの１つである。細胞層が互いに強く結合するほど、細胞間の結合をなす接合タンパク質（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現が強くなり、細胞間（Ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）の物質輸送が制限されるので、電気抵抗値が高くなる。ヒト血液－脳障壁は物質輸送がきわめて制限されている障壁であって、ＴＥＥＲ値が５０００Ω．ｃｍ2と推定され［Ｌａｕｓｃｈｋｅ Ｋ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ Ｌ、Ｈａｌｌ ＶＪ（２０１７）Ｐａｖｉｎｇ ｔｈｅ ｗａｙ ｔｏｗａｒｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ ２６（１２）：８５７－８７４］、ラット血液－脳障壁は５９００Ω．ｃｍ2で測定されたことがある［Ｂｕｔｔ ＡＭ、Ｊｏｎｅｓ ＨＣ、Ａｂｂｏｔｔ ＮＪ（１９９０）Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ ｒａｔｓ：ａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４２９：４７－６２］。
血液－脳障壁（ＢＢＢ）模写の微細流体装置の障壁層及びヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）の単一培養層のＴＥＥＲ値は、Ｒｊ１１プラグ及びＡｇ、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極ワイヤー（直径３８１μｍ、長さ３ｃｍ、Ａ－Ｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｅｑｕｉｍ、ＷＡ、ＵＳＡ）で製造されたオーダーメード型電極アダプターを１２．５Ｈｚで１０μＡの一定のＡＣ電流を生成するＥＶＯＭ２ ｖｏｌｔ－ｏｈｍｍｅｔｅｒ（Ｗｏｒｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ、ＵＳＡ）に連結して測定した。背景抵抗及び誤差を減少させるために、電極ワイヤーを培養培地が満たされたｔｙｇｏｎ ｔｕｂｉｎｇ（１／３２“ＩＤ×３／３２“ＯＤ、Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）に入れてチャンネルに挿入した。１分間安定化させた後、５つの多重判読値が各装置に対して平均化された。ＴＥＥＲ値を計算するために、細胞がない状態での測定値を各装置の測定値から引き、層の表面積をかけた。
図３３に示したように、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）の単一培養に比べて血液－脳障壁（ＢＢＢ）模写の微細流体装置でのＴＥＥＲ値がさらに高く、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を共に培養した時、血液－脳障壁（ＢＢＢ）をよりよく模写できることを確認した。
［実施例５］血液模写の流れのせん断応力の差によるＴＥＥＲ値の比較
実施例２において製作した血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の第１の中心チャンネルに加えられる血液模写の流れのせん断応力による３次元組織障壁の機能の差を試験するために、第１の中心チャンネルにせん断応力が加えられない場合、０．４ｄｙｎｅ ｃｍ-2のせん断応力を加えた場合、４ｄｙｎｅ ｃｍ-2のせん断応力を加えた場合のそれぞれのＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を実施例４と同一の方法で測定した。
実施例２において製作した血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の第１の中心チャンネルに加えられる血液模写の流れのせん断応力による３次元組織障壁の機能の差を試験するために、第１の中心チャンネルにせん断応力が加えられない場合、０．４ｄｙｎｅ ｃｍ-2のせん断応力を加えた場合、４ｄｙｎｅ ｃｍ-2のせん断応力を加えた場合のそれぞれのＴＥＥＲ（Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）値を実施例４と同一の方法で測定した。
その結果、図３４に示したように、４ｄｙｎｅ ｃｍ-2のせん断応力を加えた場合、０．４ｄｙｎｅ ｃｍ-2のせん断応力を加えた場合、せん断応力を加えなかった場合の順に高いＴＥＥＲ値を示すことを確認した。
［実施例６］透過係数（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）の比較
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の３次元組織障壁機能を試験するために、４ｋＤａ及び４０ｋＤａ ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎの拡散から透過係数（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を測定した。比較のために細胞を培養しなかった場合及びヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）のみを単一培養した場合の透過係数を共に確認した。
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の３次元組織障壁機能を試験するために、４ｋＤａ及び４０ｋＤａ ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎの拡散から透過係数（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を測定した。比較のために細胞を培養しなかった場合及びヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）のみを単一培養した場合の透過係数を共に確認した。
微細流体装置内細胞を６０時間にかけて培養し、その後４ｋＤａまたは４０ｋＤａのＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を５００μｇ／ｍＬの濃度で含有する培養培地をＰｈＤ Ｕｌｔｒａ ｓｙｒｉｎｇｅ ｐｕｍｐ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて微細流体装置の第１の中心チャンネルに１６μＬ／ｍｉｎの流速で注入した。また、同時に一方の側面チャンネルの培養培地を１時間にかけて４μＬ／ｍｉｎの流速でｓｙｒｉｎｇｅ ｐｕｍｐを利用してサンプリングした。５００μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ溶液及びサンプル溶液の蛍光強度はＣｙｔａｔｉｏｎ ５ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ｎ＝４）を用いて測定した。溶液中のデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）の濃度（Ｃ）は標準補正曲線を用いて測定された蛍光強度値で計算し、透過係数（Ｐ）は次の式を利用して計算した。
図３５に示したように、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の３次元組織障壁は細胞を培養しなかった場合及びヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）のみを単一培養した場合に比べて４ｋＤａ及び４０ｋＤａの全てにおいて顕著に低い透過係数を示すことを確認することができた。すなわち、３つの細胞を全て培養した場合に血液－脳障壁と最も類似した機能を行うことを確認した。
［実施例７］培養方法による星状細胞の構造及び機能の比較
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の第２の中心チャンネル内の星状細胞培養において、２Ｄ培養と３Ｄ培養との間の差異点を比較した。健康な星状細胞の形態学的及び生理学的な特性を保存することは、血液－脳障壁の機能を模写することにおいて重要な役割を行う。
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の第２の中心チャンネル内の星状細胞培養において、２Ｄ培養と３Ｄ培養との間の差異点を比較した。健康な星状細胞の形態学的及び生理学的な特性を保存することは、血液－脳障壁の機能を模写することにおいて重要な役割を行う。
２Ｄ及び３Ｄ培養におけるヒト星状細胞（ＨＡ）の構造及び機能を比較するために、ヒト星状細胞（ＨＡ）をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｄｕｃｅｄ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）でコーティングされた２４－ウェル（２４－ｗｅｌｌｓ）及び３Ｄマトリゲル（５ｍｇ ｍＬ－１）にそれぞれ１×１０6細胞／ｍＬの密度でシーディングした。一日にかけて培養し、その後細胞を組換えヒトインターロイキン－１β（ＩＬ－１β、Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）１ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬで刺激し、分析のために２０時間にかけてさらに培養した。
培養方法による星状細胞の構造の比較
図３６ないし３８に示したように、ヒト星状細胞（ＨＡ）を２Ｄマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コーティングの表面上で培養した場合、短い突起（ｐｒｏｃｅｓｓ）を有する平たい多角形状の拡大した細胞体の形態を示した。これに対し、ヒト星状細胞（ＨＡ）を３Ｄマトリゲルの内部で培養した場合、放射形に分布された薄くて長い突起を有する小さい細胞体の形態を示した。
図３６ないし３８に示したように、ヒト星状細胞（ＨＡ）を２Ｄマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）コーティングの表面上で培養した場合、短い突起（ｐｒｏｃｅｓｓ）を有する平たい多角形状の拡大した細胞体の形態を示した。これに対し、ヒト星状細胞（ＨＡ）を３Ｄマトリゲルの内部で培養した場合、放射形に分布された薄くて長い突起を有する小さい細胞体の形態を示した。
培養方法による星状細胞の機能の比較
２Ｄまたは３Ｄ培養されたヒト星状細胞（ＨＡ）で反応性神経膠症マーカーの遺伝子の発現水準をｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって確認した。２Ｄ及び３Ｄ培養システム（ｎ＝４）でヒト星状細胞（ＨＡ）の神経膠反応性を分析するために、標準ｑＲＴ－ＰＣＲをＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。それぞれの標的遺伝子は商業的に入手可能なプライマを用いて評価し、実験に用いられたプライマを下記の表２に示した。
２Ｄまたは３Ｄ培養されたヒト星状細胞（ＨＡ）で反応性神経膠症マーカーの遺伝子の発現水準をｑＲＴ－ＰＣＲ分析によって確認した。２Ｄ及び３Ｄ培養システム（ｎ＝４）でヒト星状細胞（ＨＡ）の神経膠反応性を分析するために、標準ｑＲＴ－ＰＣＲをＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。それぞれの標的遺伝子は商業的に入手可能なプライマを用いて評価し、実験に用いられたプライマを下記の表２に示した。
図３９に示したように、反応性神経膠症マーカーであるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＶＩＭ）及びリポカリン－２（ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２、ＬＣＮ２）の発現が２Ｄ培養と比較して３Ｄ培養されたヒト星状細胞（ＨＡ）で非常に減少することを確認した。ＬＣＮ２は前炎症反応を媒介することで神経炎症で重要な役割をする遺伝子であって、反応性星状細胞で発現が増加するものと知られている。これに対し、代表的な星状細胞マーカーである神経膠繊維質酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＡＰ）の発現水準には大きな差がなかった。
また、図４０及び４１に示したように、炎症性サイトカインであるインターロイキン－１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β；ＩＬ－１β）を処理した場合に、ＬＣＮ２の発現水準が２Ｄ及び３Ｄ培養において全て容量依存的に調節されることを確認した。
従って、３Ｄ培養されたヒト星状細胞（ＨＡ）が２Ｄ培養に比べて生体内の星状細胞と類似した形態及び遺伝子の発現を示すので、血液－脳障壁の構造及び機能を模写することにおいて適合した形態であることを確認した。
［実施例８］星状細胞の培養方法によるＡＱＰ－４及びα－ｓｙｎの発現の比較
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の第２の中心チャンネル内の星状細胞培養において、２Ｄ培養及び３Ｄ培養によるアクアポリン－４（ＡＱＰ－４；Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－４）及びα－ｓｙｎ（α－ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ）の発現を比較した。血管の周囲空間の星状細胞は末端突起の数でタンパク質であるＡＱＰ－４によって脳の水恒常性を調節するので、星状細胞末端突起におけるＡＱＰ－４の分極化は、血液－脳障壁の恒常性調節及び生理学的な条件を模写することにおいて重要な役割を行う。α－ｓｙｎはＡＱＰ－４の星状細胞末端への分極化を調節するアンカー（ａｎｃｈｏｒ）として知られている。
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置の第２の中心チャンネル内の星状細胞培養において、２Ｄ培養及び３Ｄ培養によるアクアポリン－４（ＡＱＰ－４；Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－４）及びα－ｓｙｎ（α－ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ）の発現を比較した。血管の周囲空間の星状細胞は末端突起の数でタンパク質であるＡＱＰ－４によって脳の水恒常性を調節するので、星状細胞末端突起におけるＡＱＰ－４の分極化は、血液－脳障壁の恒常性調節及び生理学的な条件を模写することにおいて重要な役割を行う。α－ｓｙｎはＡＱＰ－４の星状細胞末端への分極化を調節するアンカー（ａｎｃｈｏｒ）として知られている。
細胞の特異的なマーカーの発現を視角化するために、実施例７において培養した２Ｄ及び３Ｄ培養におけるヒト星状細胞（ＨＡ）のサンプルを室温で１５分の間２％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＦＡ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で固定させた。ＰＢＳのうち０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分の間透過させた後、サンプルをＰＢＳのうち２％の牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温で１時間にかけて遮断させた。その後、サンプルを４℃で１次抗体とともに一晩培養し、１％のＢＳＡで３回洗浄した。ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４及びα－ｓｙｎ抗体をそれぞれ６時間にかけて４℃で処理した。核を４，６－ｄｉａｍｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対照染色してイメージングの前までＰＢＳに保管した。共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＬＳＭ ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光可視化されたサンプルを検査した。
図４２及び４３に示したように、星状細胞を２Ｄ培養した場合、ＡＱＰ－４及びα－ｓｙｎが拡散された形態で発現されたのに対し、３Ｄで培養した場合、星状細胞末端（ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｅｎｄ－ｆｅｅｔ）に分極化されたことを確認した。
従って、３Ｄ培養されたヒト星状細胞（ＨＡ）が２Ｄ培養に比べて生体内の星状細胞と類似した機能を行うので、血液－脳障壁の機能を模写することにおいて適合した形態であることを確認した。
［実施例９］培養細胞によるＡＱＰ－４の発現の比較
実施例２で製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置でＡＱＰ－４の発現の分極化水準を確認した。比較のためにヒト星状細胞（ＨＡ）のみを培養した場合及びヒト星状細胞（ＨＡ）とヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）を培養した場合のＡＱＰ－４の発現を共に確認した。
実施例２で製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置でＡＱＰ－４の発現の分極化水準を確認した。比較のためにヒト星状細胞（ＨＡ）のみを培養した場合及びヒト星状細胞（ＨＡ）とヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）を培養した場合のＡＱＰ－４の発現を共に確認した。
それぞれのサンプルにおけるＡＱＰ－４の発現を実施例８と同一の方法で視角化し、その後ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて血管周囲チャンネルのｚスタックイメージでｚ－軸に沿って蛍光強度のプロファイルを測定することでＡＱＰ４の分布を定量化した。インサートに含まれたチャンネル（ｖａｓｃｕｌａｒ）及びベースに含まれたチャンネル（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）のそれぞれにおける蛍光強度の平均を計算し、その後インサートに含まれたチャンネル（ｖａｓｃｕｌａｒ）内の平均蛍光強度をベースに含まれたチャンネル（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）内の平均蛍光強度に分けてＡＱＰ－４の分極化指数（ＡＱＰ４ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）を計算した。
図４４に示したように、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を共に培養（Ｅ＋Ｐ＋Ａ）した時、ヒト星状細胞（ＨＡ）のみを培養した場合（Ａ）またはヒト星状細胞（ＨＡ）とヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）を培養した場合（Ｅ＋Ａ）に比べて、ＡＱＰ－４の分極化水準が増加することを確認した。
従って、ＡＱＰ－４の分極化は、周皮細胞の存在下で有意に誘導されることを確認し、ヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を共に培養した時、血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）の水輸送システムを模写できることを確認した。
［実施例１０］血液－脳障壁（ＢＢＢ）を通じたナノ粒子輸送の分析
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置で血液－脳障壁模写の構造を通じたナノ粒子の輸送をモニターして定量化した。中枢神経系における薬物伝達研究において、細胞及び分子水準で薬物を含む化合物の脳への輸送を定量化することは重要な課題である。
実施例２において製作したヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）及びヒト星状細胞（ＨＡ）を含む血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置で血液－脳障壁模写の構造を通じたナノ粒子の輸送をモニターして定量化した。中枢神経系における薬物伝達研究において、細胞及び分子水準で薬物を含む化合物の脳への輸送を定量化することは重要な課題である。
ＨＤＬ模倣ナノ粒子ｅＨＮＰ－Ａ１の合成
微細流体技術を利用して脂質（ｌｉｐｉｄ、ＤＭＰＣ）、アポリポ蛋白Ａ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１）及び蛍光マーカーで構成されたＨＤＬ模倣の円盤型ナノ粒子ｅＨＮＰ－Ａ１を生理学的に適切な大きさと構成で合成した。合成されたｅＨＮＰ－Ａ１の大きさの分布を測定して図４５に示した。
微細流体技術を利用して脂質（ｌｉｐｉｄ、ＤＭＰＣ）、アポリポ蛋白Ａ１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１）及び蛍光マーカーで構成されたＨＤＬ模倣の円盤型ナノ粒子ｅＨＮＰ－Ａ１を生理学的に適切な大きさと構成で合成した。合成されたｅＨＮＰ－Ａ１の大きさの分布を測定して図４５に示した。
全身投与されたｅＨＮＰ－Ａ１の生体分布の確認
尾静脈注射によって１ｍｇ／ｋｇのｅＨＮＰ－Ａ１をマウスに全身投与した。２００μＬの食塩水を注入したマウスを対照群とした。投与２４時間後、マウスを犠牲させて食塩水及び４％のＰＦＡに１５分の間保管した。その後、生体内の映像システム（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ＩＶＩＳ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて各器官（脳、心臓、肺、肝、腎臓及び脾臓）を得てＤｉＲの含量を可視化した。また、脳組織内部のｅＨＮＰ－Ａ１の分布を視角化するために、得た脳組織を１０μｍ切片で極低温保管し、ＤＡＰＩ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｆａｄｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ－１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＤＡＰＩで染色した。これを共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０）を利用して画像化した。
尾静脈注射によって１ｍｇ／ｋｇのｅＨＮＰ－Ａ１をマウスに全身投与した。２００μＬの食塩水を注入したマウスを対照群とした。投与２４時間後、マウスを犠牲させて食塩水及び４％のＰＦＡに１５分の間保管した。その後、生体内の映像システム（ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ＩＶＩＳ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて各器官（脳、心臓、肺、肝、腎臓及び脾臓）を得てＤｉＲの含量を可視化した。また、脳組織内部のｅＨＮＰ－Ａ１の分布を視角化するために、得た脳組織を１０μｍ切片で極低温保管し、ＤＡＰＩ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｆａｄｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｈ－１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＤＡＰＩで染色した。これを共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０）を利用して画像化した。
その結果、図４６に示したように、脳に蓄積されたｅＨＮＰ－Ａ１の量は全身蓄積量の最大３％であることを確認した。また、図４７に示したように、全身投与されたｅＨＮＰ－Ａ１は、脳の細胞核周辺で局所的な分布をなすことを確認した。
血液－脳障壁模写の微細流体装置におけるｅＨＮＰ－Ａ１の分布
実施例２において製作した血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置でｅＨＮＰ－Ａ１の分布を定量化し、物質運搬のメカニズムを確認するために、第１の中心チャンネル（ｖａｓｃｕｌａｒ）にｅＨＮＰ－Ａ１を２時間にかけて培養した。また、ｅＨＮＰ－Ａ１が脳内皮細胞のＨＤＬ受容体であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ｂ ｔｙｐｅ １（ＳＲ－Ｂ１）を利用してＨＤＬの主な輸送メカニズムのうちの１つであるトランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）によって血液－脳障壁を通過するか否かを試験するために、ＢＬＴ－１（ｂｌｏｃｋ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ－１）を処理してＳＲ－Ｂ１を遮断した。その後、第１の中心チャンネル（ｖａｓｃｕｌａｒ）及び第２の中心チャンネル（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ）のそれぞれからサンプリングされたｅＨＮＰ－Ａ１を含む培養培地の相対的な蛍光強度を測定した。また、ｅＨＮＰ－Ａ１の陽性を示すヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト星状細胞（ＨＡ）、及びヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）の分布に対するＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析を行った。
実施例２において製作した血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置でｅＨＮＰ－Ａ１の分布を定量化し、物質運搬のメカニズムを確認するために、第１の中心チャンネル（ｖａｓｃｕｌａｒ）にｅＨＮＰ－Ａ１を２時間にかけて培養した。また、ｅＨＮＰ－Ａ１が脳内皮細胞のＨＤＬ受容体であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ｂ ｔｙｐｅ １（ＳＲ－Ｂ１）を利用してＨＤＬの主な輸送メカニズムのうちの１つであるトランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）によって血液－脳障壁を通過するか否かを試験するために、ＢＬＴ－１（ｂｌｏｃｋ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ－１）を処理してＳＲ－Ｂ１を遮断した。その後、第１の中心チャンネル（ｖａｓｃｕｌａｒ）及び第２の中心チャンネル（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ）のそれぞれからサンプリングされたｅＨＮＰ－Ａ１を含む培養培地の相対的な蛍光強度を測定した。また、ｅＨＮＰ－Ａ１の陽性を示すヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト星状細胞（ＨＡ）、及びヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）の分布に対するＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析を行った。
図４８及び４９に示したように、ＳＲ－Ｂ１を遮断し、その後第１の中心チャンネルに残っているｅＨＮＰ－Ａ１の量は非常に増加したのに対し、第２の中心チャンネルへ移動したｅＨＮＰ－Ａ１の量は大して変わらなかった。また、図５０に示したように、ＢＬＴ－１の処理時のヒト脳微細血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）に吸収されるか、あるいは第２の中心チャンネルへ移動したｅＨＮＰ－Ａ１の量が約３倍減少することを確認し、図５１及び５２に示したように、ＢＬＴ－１の処理時の総ｅＨＮＰ－Ａ１の陽性細胞が減少したことを確認した。
従って、実施例２において製作した血液－脳障壁（ＢＢＢ；ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）模写の微細流体装置を利用して細胞とナノ粒子間の相互作用をモニターし、ナノ粒子の分布を定量化できることを確認した。
１００ インサート
１０１ 第１の締結ヘッド
１１０ 第１の中心チャンネル
１１１ 第１の細胞
１１２ 第１の中心チャンネルの入口
１１３ 第１の中心チャンネルの出口
２００ ベース
２０１ インサート挿入溝
２０２ 第２の締結ヘッド
２１０ 第２の中心チャンネル
２１１ 第２の細胞
２１２ 第３の細胞
２１３ ハイドロゲル
２１４ 第２の中心チャンネルの入口
２１５ 第２の中心チャンネルの出口
２２０ 第３の側面チャンネル
２２１ 第３の側面チャンネルの入口
２２２ 第３の側面チャンネルの出口
２３０ 第４の側面チャンネル
２３１ 第４の側面チャンネルの入口
２３２ 第４の側面チャンネルの出口
２４０ 第５の通路チャンネル
２５０ 第６の通路チャンネル
２６０ 第７の通路チャンネル
２７０ 第８の通路チャンネル
２８０ 第１の流体リザーバ
２９０ 第２の流体リザーバ
３００ 多孔性膜
４００ 底部
５００ カバー
５０１ カバー内の第１の中心チャンネルの入口
５０２ カバー内の第１の中心チャンネルの出口
１０１ 第１の締結ヘッド
１１０ 第１の中心チャンネル
１１１ 第１の細胞
１１２ 第１の中心チャンネルの入口
１１３ 第１の中心チャンネルの出口
２００ ベース
２０１ インサート挿入溝
２０２ 第２の締結ヘッド
２１０ 第２の中心チャンネル
２１１ 第２の細胞
２１２ 第３の細胞
２１３ ハイドロゲル
２１４ 第２の中心チャンネルの入口
２１５ 第２の中心チャンネルの出口
２２０ 第３の側面チャンネル
２２１ 第３の側面チャンネルの入口
２２２ 第３の側面チャンネルの出口
２３０ 第４の側面チャンネル
２３１ 第４の側面チャンネルの入口
２３２ 第４の側面チャンネルの出口
２４０ 第５の通路チャンネル
２５０ 第６の通路チャンネル
２６０ 第７の通路チャンネル
２７０ 第８の通路チャンネル
２８０ 第１の流体リザーバ
２９０ 第２の流体リザーバ
３００ 多孔性膜
４００ 底部
５００ カバー
５０１ カバー内の第１の中心チャンネルの入口
５０２ カバー内の第１の中心チャンネルの出口
Claims (27)
- 第１の中心チャンネルを含むインサートと、
第２の中心チャンネル、第３の側面チャンネル、第４の側面チャンネル、前記第２の中心チャンネルと前記第３の側面チャンネルを連結する第５の通路チャンネル、及び前記第２の中心チャンネルと前記第４の側面チャンネルを連結する第６の通路チャンネルを含むベースと、
前記インサートと前記ベースとの間に位置する多孔性膜とを含む、微細流体装置。 - 前記インサートが、前記ベースから脱着可能であることを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 前記ベースは、前記インサートが挿入できる溝を含むことを特徴とする、請求項２に記載の微細流体装置。
- 前記インサートが、第１の締結ヘッドを含み、
前記ベースが、第２の締結ヘッドを含み、
前記第１の締結ヘッドと前記第２の締結ヘッドが互いに引っ掛けられて前記インサートと前記ベースがスナップフィット（ｓｎａｐ ｆｉｔ）脱着されることを特徴とする、請求項２に記載の微細流体装置。 - 前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルは、前記多孔性膜に接触しないことを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 前記第１の中心チャンネル、前記第２の中心チャンネル、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルが、液剤の灌流を誘導且つ調節できる入口及び出口を含むことを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 前記第５の通路チャンネル及び前記第６の通路チャンネルは、前記第２の中心チャンネル、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルに比べてチャンネルの高さが低いことを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 前記ベースが、第１の流体リザーバ及び第２の流体リザーバをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 前記ベースが、前記第３の側面チャンネルと前記第１の流体リザーバを連結する第７の通路チャンネル、及び前記第４の側面チャンネルと前記第２の流体リザーバを連結する第８の通路チャンネルを含むことを特徴とする、請求項８に記載の微細流体装置。
- 前記第７の通路チャンネル及び前記第８の通路チャンネルは、前記第２の中心チャンネル、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルに比べてチャンネルの高さが低いことを特徴とする、請求項９に記載の微細流体装置。
- 前記第７の通路チャンネル及び前記第８の通路チャンネルが、前記第２の中心チャンネルの方向に垂直に形成されたことを特徴とする、請求項９に記載の微細流体装置。
- 前記微細流体装置が、プラスチック、ガラス、金属またはシリコンで製造されることを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 前記第１の中心チャンネルが、組織障壁細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 前記組織障壁細胞が、血管内皮細胞；皮膚細胞；癌細胞；分泌腺細胞；筋肉細胞；及び気管支、大腸、小腸、膵臓または腎臓の上皮細胞からなる群より選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１３に記載の微細流体装置。
- 前記第２の中心チャンネルが、内部組織細胞及びハイドロゲルを含むことを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 前記内部組織細胞が、星状細胞、周皮細胞、神経細胞、神経幹細胞、グリア細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、腸上皮細胞、角化細胞、皮膚線維芽細胞、足細胞及び糸球体内皮細胞からなる群より選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１５に記載の微細流体装置。
- 前記ハイドロゲルが、コラーゲン、ラミニン、ヒアルロン酸、ミネラル、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチン、ペプチド、ポリエチレングリコール及びアルジネートからなる群より選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１５に記載の微細流体装置。
- 前記インサートを前記ベースから分離し、前記第１の中心チャンネルに含まれた細胞、前記第２の中心チャンネルに含まれた細胞、及び前記多孔性膜に付着された細胞からなる群より選ばれる少なくとも１つの細胞をそれぞれ分離できることを特徴とする、請求項１に記載の微細流体装置。
- 第１の中心チャンネルを含むインサートと、第２の中心チャンネル、第３の側面チャンネル及び第４の側面チャンネルを含むベースと、前記インサートと前記ベースとの間に位置する多孔性膜とを含み、前記インサートが、前記ベースから脱着可能であることを特徴とする、微細流体装置を組み立てるステップと、
第２の細胞を前記第２の中心チャンネルに注入し、その後、前記微細流体装置をひっくり返して培養するステップと、
第３の細胞を含むハイドロゲルを前記第２の中心チャンネルに注入し、その後培養するステップと、
前記微細流体装置をひっくり返し、その後第１の細胞を前記第１の中心チャンネルに注入して培養するステップと、を含む、微細流体装置内の細胞培養方法。 - 前記第１の中心チャンネル、前記第２の中心チャンネル、前記第３の側面チャンネル及び前記第４の側面チャンネルが、液剤の灌流を誘導且つ調節できる入口及び出口を含み、
前記第２の細胞及び前記第３の細胞を含む前記ハイドロゲルが、前記第２の中心チャンネルの入口から注入され、
前記第１の細胞が、前記第１の中心チャンネルの入口から注入されることを特徴とする、請求項１９に記載の微細流体装置内の細胞培養方法。 - 前記第１の細胞が、血管内皮細胞；皮膚細胞；癌細胞；分泌腺細胞；筋肉細胞；及び気管支、大腸、小腸、膵臓または腎臓の上皮細胞からなる群より選ばれ、
前記第２の細胞が、周皮細胞、グリア細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、腸上皮細胞、角化細胞、皮膚線維芽細胞、足細胞及び糸球体内皮細胞からなる群より選ばれ、
前記第３の細胞が、星状細胞、神経細胞、及び神経幹細胞からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載の微細流体装置内の細胞培養方法。 - 第１の中心チャンネルを含むインサートと、第２の中心チャンネル、第３の側面チャンネル、第４の側面チャンネル、第１の流体リザーバ、及び第２の流体リザーバを含むベースと、前記インサートと前記ベースとの間に位置する多孔性膜とを含み、前記インサートが、前記ベースから脱着可能であることを特徴とする微細流体装置内の器官または臓器の模写方法であって、
第１の流体を前記第１の中心チャンネルに灌流させるステップと、
第２の流体を前記第１の流体リザーバに注入し、前記第３の側面チャンネル、前記第２の中心チャンネル、前記第４の側面チャンネル及び前記第２の流体リザーバまで順に到達させるステップと、を含む、器官または臓器の模写方法。 - 前記ベースが、前記第２の中心チャンネルと前記第３の側面チャンネルを連結する第５の通路チャンネル、前記第２の中心チャンネルと前記第４の側面チャンネルを連結する第６の通路チャンネル、前記第３の側面チャンネルと前記第１の流体リザーバを連結する第７の通路チャンネル、及び前記第４の側面チャンネルと前記第２の流体リザーバを連結する第８の通路チャンネルをさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載の器官または臓器の模写方法。
- 前記第１の流体が、１～１０ｄｙｎｅ／ｃｍ2のせん断応力で灌流させることを特徴とする、請求項２２に記載の器官または臓器の模写方法。
- 前記第２の流体の流速が、前記第１の流体リザーバと前記第２の流体リザーバの静水圧の差を利用し１２時間以上にかけて１～１００μＬ／ｈで維持されることを特徴とする、請求項２２に記載の器官または臓器の模写方法。
- 下記ステップを含む物質の生理学的、薬理学的または毒性学的効果の分析方法：
ａ）請求項１に記載の微細流体装置を提供するステップと、
ｂ）前記微細流体装置に物質を導入するステップと、
ｃ）前記物質の生理学的、薬理学的または毒性学的効果を評価するステップ。 - 前記物質が、薬物、毒素または病原体であることを特徴とする、請求項２６に記載の分析方法。
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