KR102313280B1 - 미세공학 조직 장벽 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 내 조직 장벽의 구조 및 기능의 모사를 위한 미세유체장치에 관한 것이다. 구체적으로, 2차원-3차원 결합 조직 장벽 또는 3차원 조직 장벽의 구조 및 기능을 모사함으로써 동물 모델을 대체하여 신약개발 및 독성평가 등을 위한 모델로 이용될 수 있는 미세유체장치, 미세유체장치 내 세포 배양 방법, 및 미세유체장치를 이용한 기관 또는 장기의 모사 방법에 관한 것이다.

Description

미세공학 조직 장벽 시스템{MICROENGINEERED TISSUE BARRIER SYSTEM}
본 발명은 생체 내 조직 장벽의 구조 및 기능의 모사를 위한 미세유체장치에 관한 것이다. 구체적으로, 2차원-3차원 결합 조직 장벽 또는 3차원 조직 장벽의 구조 및 기능을 모사함으로써 동물 모델을 대체하여 신약개발 및 독성평가 등을 위한 모델로 이용될 수 있는 미세유체장치, 미세유체장치 내 세포 배양 방법, 및 미세유체장치를 이용한 기관 또는 장기의 모사 방법에 관한 것이다.
약물의 효능 및 부작용을 검사하기 위한 실험 동물 모델 사용에 따른 윤리적 문제 및 이종 간의 차이점으로 인한 문제점을 해결하기 위해, 장기 조직을 칩 형태로 집적시킨 장기칩 (Organ-on-a-chip)이 개발되었다. 장기칩은 작은 칩에 특정 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써, 해당 장기의 형태 및 생리적 특성을 모사하여 원하는 기능을 구현하는 기술이다. 이를 이용하여 특정 장기의 세포 거동 및 미세환경에서의 물리 화학적 반응의 메커니즘을 상세하게 연구할 수 있으며, 신약개발 및 독성평가 등을 위한 모델로 이용될 수 있다.
장기칩의 개발에 있어서, 기존의 2차원(two-dimensional (2D)) 세포 배양을 이용한 세포 배양 모델은 배양 접시(petri dish)를 이용하여 접시 바닥에 세포를 2차원으로 배양시키므로 많은 세포 타입의 조직 특이적 분화 기능들(tissue-specific differentiated functions)을 설명하지 못하거나 생체 내(in vivo)의 조직 기능과 약물 활성도를 정확하게 예측하지 못하는 문제점을 가진다.
특히, 생체 내에서 3차원 접촉을 하고 있는 뉴런(neuron), 성상세포(astrocyte) 등을 가지는 뇌조직 세포의 경우 상기 2차원 세포 배양 모델의 한계로 인해서, 살아있는 조직의 공간적 구조와 생화학적 복잡성을 잘 모사하는 3차원 세포 배양 모델에 대한 필요성이 높아지고 있다.
3차원 세포 배양 모델은 생체내 상태(situation)를 잘 모방하므로 생체외 실험에서 방향적 성장과 세포간 연결의 복잡성을 구현할 수 있고, 분자 기반(molecular basis)의 조직 기능을 연구하는데 있어서 2차원 세포 배양 모델 대비 다양한 질병 상태의 신호기전(signaling pathway)과 약물 반응(drug responsiveness)을 잘 포착하는데 유용하다.
한편, 반도체 공정 기술과 함께 발달한 미세유체공학 기술은 높은 정확도로 마이크로 단위의 규격을 가진 구조체를 대량 생산할 수 있도록 하였다. 특히 포토리소그래피 및 소프트리소그래피 기술은 반영구적몰드를 이용한 스탬핑 (Stamping)을 통해 손쉽게 미세채널 구조를 생산할 수 있도록 하였고, 이를 통해 인체의 혈관이나 장기의 세포층 등 미세 구조를 생체 외에서 모사하려는 시도가 있었다.
기존의 연구는 포토리소그래피 또는 소프트리소그래피 기술을 이용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 미세채널과 다공성 막으로 이루어진 칩을 제작하고, 칩 내부에서의 세포 배양을 통해 장기의 세포층 구조를 구현하는 형태로 수행되었다. 그러나, PDMS 재질로 제작한 미세유체장치를 이용한 장기칩은 약물 또는 단백질들이 PDMS 표면에 흡착되어 소실되는 경우가 많이 발생하여, 실제 제약산업에 적용하기 힘든 한계점이 존재하였다.
따라서 본 발명자들은 기존의 미세유체장치를 이용한 장기칩의 문제점을 개선하고, 생체내 2차원-3차원 결합 조직 장벽 또는 3차원 조직 장벽의 구조 및 기능을 더욱 유사하게 모사하기 위한 미세유체장치를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
Cho, H. et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci. Rep. 5, 15222 (2015). Booth, R. & Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip 12, 1784-1792 (2012).
본 발명은 실험 동물 모델 사용에 따른 윤리적 문제 및 이종 간 차이점으로 인한 문제점을 해결하고, 2차원-3차원 결합 조직 장벽 또는 3차원 조직 장벽의 구조를 형성시킴으로써 기존의 장기칩 (Organ-on-a-chip)과 비교하여 생체 내 조직 장벽과 더욱 유사한 구조 및 기능을 나타내는 미세유체장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널, 제4 측면채널, 제2 중심채널과 제3 측면채널을 연결하는 제5 통로채널 및 제2 중심채널과 제4 측면채널을 연결하는 제6 통로채널을 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하는 미세유체장치를 제공한다.
본 발명은 상기 미세유체장치를 조립하는 단계; 제2 세포를 제2 중심채널에 주입한 후, 미세유체장치를 뒤집어 배양하는 단계; 제3 세포를 포함하는 하이드로젤을 제2 중심채널에 주입한 후 배양하는 단계; 및 미세유체장치를 뒤집은 후, 제1 세포를 제1 중심채널에 주입하여 배양하는 단계를 포함하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 미세유체장치를 이용하여 기관 또는 장기의 구조 및 기능을 모사하는 방법으로서, 제1 유체를 제1 중심채널에 관류시키는 단계; 및 제2 유체를 제3 측면채널, 제2 중심채널, 및 제4 측면채널에 관류시키는 단계를 포함하는, 기관 또는 장기의 모사 방법을 제공한다.
본 발명의 미세유체장치는 혈액-뇌 장벽을 포함하는 생체 내 다양한 조직장벽의 주요 구조 및 물질이동 현상을 모사하여 약물 효능평가에 사용될 수 있다.
본 발명의 미세유체장치는 조직 장벽 주변의 나노 입자 분포에 대한 정밀한 정량화가 가능하며, 인서트가 베이스로부터 탈부착 가능하므로, 미세유체장치 내 포함된 세포를 손상없이 선택적으로 분리하여 분석에 이용할 수 있다. 또한, 인서트를 베이스로부터 분리하여 약물 도포 등 필요한 처리를 가한 후, 다시 조립하여 세포 반응을 관찰할 수 있다.
본 발명의 미세유체장치는 세포의 3차원 배양이 가능하여, 생체 내 세포의 공간적 구조와 생화학적 복잡성을 구현하여 조직 장벽의 구조 및 기능을 보다 잘 모사할 수 있다.
도 1 및 2는 미세유체장치의 단면도이다.
도 3은 미세유체장치의 투시도이다.
도 4 및 5는 미세유체장치의 분해도 및 결합도이다.
도 6 및 7은 세포 및 하이드로젤을 포함하는 미세유체장치의 단면도이다.
도 8 내지 10은 인서트와 베이스의 탈부착을 위한 구성 및 탈부착 방법을 나타낸 단면도이다.
도 11은 미세유체장치의 베이스 내 유체흐름을 나타낸 단면도이다.
도 12 및 13은 인서트의 사시도이다.
도 14는 베이스의 사시도이다.
도 15는 베이스의 평면도이다.
도 16은 베이스의 저면도 및 확대 저면도이다.
도 17은 커버의 사시도이다.
도 18은 인서트와 베이스의 탈부착을 위한 구성 및 탈부착 방법을 나타낸 사시도 및 단면도이다.
도 19는 인서트와 베이스가 부착된 형태의 미세유체장치의 평면도이다.
도 20은 도 19의 인서트와 베이스가 부착된 형태의 미세유체장치의 A-A'단면도 및 확대 단면도이다.
도 21은 인서트와 베이스가 부착된 형태의 미세유체장치의 정면도이다.
도 22는 인서트와 베이스가 부착된 형태의 미세유체장치의 저면도 및 확대 저면도이다.
도 23은 커버를 포함하는 미세유체장치의 사시도이다.
도 24는 인서트에 포함된 미세채널 내의 유체 흐름을 나타내는 사시도이다.
도 25는 베이스에 포함된 미세채널 내의 유체 흐름을 나타내는 단면도이다.
도 26은 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 또는 인간 성상세포 (HA)를 각각의 배양배지인 내피 배지 (E), 주피세포 배지 (P) 또는 성상세포 배지 (A)에서 배양한 경우와 혼합 배지인 E+G (E+A+M) 배지에서 배양한 경우의 세포 형태를 나타낸 것이다.
도 27은 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 또는 인간 성상세포 (HA)를 각각 내피 배지 (E), 성상세포 배지 (A), 주피세포 배지 (P), 미세아교 배지 (M), E+G+P (E+A+M+P) 배지 또는 E+G (E+A+M) 배지에서 배양한 경우의 세포 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 28은 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 또는 인간 성상세포 (HA)를 각각 혼합 배지인 E+G (E+A+M) 배지 또는 E+G+P (E+A+M+P) 배지에서 배양한 경우의 세포 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 29는 미세유체장치 내 세포 배양방법을 나타낸 모식도이다.
도 30은 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 단일 배양과 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치에서의 혈액-뇌 장벽 특이적 단백질의 발현 수준을 나타내는 RT-qPCR 결과를 나타낸 히트맵 (Heat map)이다 (n=3).
도 31은 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 단일 배양과 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치에서의 혈액-뇌 장벽 특이적 접합 단백질 (junctional proteins)의 유전자 발현 수준을 나타내는 그래프이다 (n=3, *p < 0.05 by student t-test).
도 32는 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 단일 배양과 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치에서의 혈액-뇌 장벽 특이적 수용체 단백질 (receptor proteins)의 유전자 발현 수준을 나타내는 그래프이다 (n=3, *p < 0.05 by student t-test).
도 33은 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 단일 배양과 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치에서 측정한 TEER 값을 나타내는 그래프이다 (n =11 (EC), n = 12 (BBB), **p < 0.01 by student t-test).
도 34는 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치에서 측정한 혈액 모사 흐름의 전단응력 차이에 따른 TEER 값을 나타내는 그래프이다 (n = 5 (No shear), n= 4 (0.4 dyne cm-2), n = 12 (4 dyne cm-2), *p < 0.05 by student t-test).
도 35는 무세포, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 단일 배양, 및 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치에서 측정한 투과 계수 (P)를 나타내는 그래프이다 (n = 4, *p < 0.05, ****p < 0.001 vs. No cell, #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. EC, student t-test).
도 36은 2D 마트리젤(Matrigel) 코팅 표면 위에서 배양한 인간 성상세포 (HA)의 형태 및 3D 마트리젤 내부에서 배양한 인간 성상세포 (HA)의 형태를 나타낸다.
도 37 및 38은 2D 마트리젤(Matrigel) 코팅 표면 및 3D 마트리젤 내부에서 배양한 인간 성상세포 (HA)의 세포체 크기 및 돌기의 길이를 비교한 그래프이다.
도 39는 2D 마트리젤(Matrigel) 코팅 표면 및 3D 마트리젤 내부에서 배양한 인간 성상세포 (HA)에서의 GFAP, VIM, 및 LCN2의 발현 수준을 비교한 그래프이다 (n = 4, ***p < 0.005, ****p < 0.001 by student t-test).
도 40 및 41은 2D 마트리젤(Matrigel) 코팅 표면 및 3D 마트리젤 내부에서 배양한 인간 성상세포 (HA)에 처리한 IL-1β농도에 따른 LCN2 발현 수준을 비교한 그래프이다.
도 42 및 43은 성상세포를 2D 마트리젤(Matrigel) 코팅 표면 및 3D 마트리젤 내부에서 배양한 경우의 AQP-4 및 α-syn 발현을 나타낸 것이다 (Scale bars = 50 μm (2D), 20 μm (3D)).
도 44는 인간 성상세포 (HA)만을 배양한 경우 (A), 인간 성상세포 (HA)와 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)를 배양한 경우 (E+A), 및 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 함께 배양 (E+P+A)한 경우의 AQP-4 국소화 수준을 나타낸 그래프이다 (n =4, *p < 0.05 by student t-test).
도 45는 합성된 eHNP-A1의 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 46은 생체내 각 기관에서의 상대적 eHNP-A1 분포를 정량화하여 나타낸 그래프이다 (mean ± s.e.m, n = 4).
도 47은 뇌에서의 eHNP-A1 분포를 나타낸다.
도 48 및 49는 제1 중심채널 (vascular channel) 및 제2 중심채널 (perivascular channel) 각각으로부터 샘플링된 eHNP-A1을 포함하는 배양 배지의 상대적 형광 강도를 나타낸 그래프이다 (vascular: n = 12; perivascular: n =5, **p < 0.01 by student t-test, mean ± s.e.m.).
도 50은 제1 중심채널 (vascular), 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 및 제2 중심채널 (perivascular)의 eHNP-A1 분포을 나타낸 그래프이다.
도 51 및 52는 eHNP-A1 양성을 나타내는 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 성상세포 (HA), 및 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP)의 수에 대한 FACS (fluorescence-activated cell sorting) plot 및 이를 정량화한 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널, 제4 측면채널, 상기 제2 중심채널과 상기 제3 측면채널을 연결하는 제5 통로채널 및 상기 제2 중심채널과 상기 제4 측면채널을 연결하는 제6 통로채널을 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하는, 미세유체장치를 제공한다.
본원에 사용된 용어 "미세유체장치"는 유기 고분자 물질을 포함하는 플라스틱, 유리, 금속 또는 실리콘을 포함하는 다양한 소재로 제조된 기판 위에 유체가 흐를 수 있도록 구비된 미세채널 등을 포함하고 있는 장치를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "미세채널"는 유체가 흐를 수 있는 밀리미터 (millimeter), 마이크로미터 (micrometer), 또는 나노미터 (nanometer)의 차원을 갖는 미세한 크기의 채널을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "인서트"는 다른 물체에 형성된 홈에 삽입될 수 있는 형태의 물체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것일 수 있고, 상기 베이스는 상기 인서트가 삽입될 수 있는 홈을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 인서트는 제1 체결 헤드를 포함하고, 상기 베이스는 제2 체결 헤드를 포함하여, 상기 제1 체결 헤드와 상기 제2 체결 헤드가 서로 걸려져서 상기 인서트와 상기 베이스가 스냅핏(snap fit) 탈부착되는 것일 수 있다. 이 때, 상기 제1 중심채널과 상기 제2 중심채널 사이의 누수를 방지하기 위해 상기 다공성 막은 상기 인서트와 상기 베이스 사이에서 강한 압력을 받아 개스킷 (gasket) 역할을 수행할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "체결 헤드"는 플라스틱, 고무, 실리콘 등의 탄성을 갖는 재질로 구성될 수 있고, 각각 탄성 변형되어 스냅핏 탈부착을 달성할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "스냅핏"은 추가적인 부품이나 체결 기구 없이, 서로 걸리는 홈의 상호작용으로 체결력이 형성되는 체결 방식을 의미한다.
일 실시태양에서, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 상기 다공성 막에 접촉하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 상기 제2 중심채널에 비해 높이가 낮을 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 제2 중심채널의 높이와 상기 제3 측면채널 및 제4 측면채널의 높이비가 1:0.1 내지 1:0.9 일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제1 중심채널, 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함할 수 있다. 상기 관류를 유도 및 조절할 수 있는 방법은 상기 입구와 출구의 정수압차 (Hydrostatic pressure difference)를 이용하는 방법, 외부 펌프를 상기 입구 및 출구에 연결하는 방법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 제5 통로채널 및 상기 제6 통로채널은 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널에 비해 채널의 높이가 낮을 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 중심채널과 상기 제5 통로채널 및 상기 제6 통로채널의 높이비가 1:0.03 내지 1:0.2일 수 있으며, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널과 상기 제5 통로채널 및 상기 제6 통로채널의 높이비가 1:0.03 내지 1:0.7일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 베이스는 제1 유체 저장소 및 제2 유체 저장소를 포함할 수 있다. 또한, 상기 베이스는 상기 제3 측면채널과 상기 제1 유체 저장소를 연결하는 제7 통로채널 및 상기 제4 측면채널과 상기 제2 유체 저장소를 연결하는 제8 통로채널을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제7 통로채널 및 상기 제8 통로채널은 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널에 비해 채널의 높이가 낮을 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 중심채널과 상기 제7 통로채널 및 상기 제8 통로채널의 높이비가 1:0.02 내지 1:0.05일 수 있으며, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널과 상기 제7 통로채널 및 상기 제8 통로채널의 높이비가 1:0.02 내지 1:0.5일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 제7 통로채널 및 상기 제8 통로채널의 높이는 50μm 이하일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제7 통로채널 및 상기 제8 통로채널은 상기 제2 중심채널의 방향과 수직으로 형성된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 미세유체장치는 플라스틱, 유리, 금속 또는 실리콘으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 사출 성형 (Injection molding) 기술을 이용하여 플라스틱으로 제조될 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제1 중심채널은 조직 장벽 세포를 포함할 수 있다. 상기 조직 장벽 세포는 혈관내피세포; 피부세포; 암세포; 분비샘 세포; 근육 세포; 및 기관지, 대장, 소장, 췌장 및 신장의 상피세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 혈관내피세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC, human brain microvascular endothelial cell)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포"는 식물 세포, 동물 세포 (예컨대, 포유동물 세포), 박테리아 세포 및 곰팡이 세포 등을 포함하는 생물학적 세포를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "조직 장벽 세포"는 조직의 특정한 구조를 유지하는 역할을 하며, 조직을 외부 자극으로부터 보호하는 역할을 하는 세포를 의미한다. 뿐만 아니라, 조직 장벽 세포간 혹은 세포외 기질과의 강한 결합력을 이용하여, 선택적으로 물질을 투과시키며 조직 내 물질 농도가 항상성을 유지하는 역할을 하는 세포를 의미한다. 조직 장벽 세포는 상피조직세포 (Epithelial tissue cell) 및 혈관내피세포 (Vascular endothelial cell)을 포함한다.
일 실시태양에서, 상기 제2 중심채널은 내부 조직 세포 및 하이드로젤을 포함할 수 있다.
상기 내부 조직 세포는 성상세포, 주피세포, 신경세포, 신경줄기세포, 아교세포, 심근세포, 평활근세포, 창자 상피세포, 각질형성 세포, 피부섬유아세포, 다리세포 및 사구체 내피세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 성상세포 및 주피세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 인간 성상세포 (HA, human astrocyte) 및 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP, human brain vascular pericyte)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "내부 조직 세포"는 인체의 장기 및 조직을 구성하고 있는 세포를 의미하며, 상피조직 (Epithelial tissue), 근육조직 (Muscle tissue), 신경조직 (Nervous tissue), 또는 결합조직 (Connective tissue)을 의미하나, 이에 한정되지 않는, 인체 조직을 이루고 있는 모든 세포를 포함한다.
상기 하이드로젤은 콜라겐, 라미닌, 히알루론산, 미네랄, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 펩타이드, 폴리에틸렌글리콜 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 하이드로젤은 콜라겐젤, 피브린젤, 라미닌젤, 마트리젤, 동물 유래 종양 기저막 추출물젤, 조직 탈세포화 세포외 기질젤, 펩타이드젤, 폴리에틸렌글리콜젤 또는 알지네이트젤일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 바람직하게는, 라미닌젤 또는 마트리젤이다.
상기 하이드로젤은 상기 제2 중심채널과 상기 제5 통로채널의 높이 차이 및 상기 제2 중심채널과 상기 제6 통로채널의 높이 차이로 인하여 표면장력에 의해 상기 제2 중심채널 내에 공간적으로 가두어지는 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "하이드로젤"은 공유 결합, 수소결합, van der waals 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질을 의미한다.
일 실시태양에서, 상기 인서트를 상기 베이스로부터 분리하여, 상기 제1 중심채널에 포함된 세포, 상기 제2 중심채널에 포함된 세포, 및 상기 다공성 막에 부착된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 각각 분리할 수 있으며, 상기 분리된 세포를 이용하여 유전자 분석 등의 세포 분석을 수행할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 인서트를 상기 베이스로부터 분리하여, 상기 제1 중심채널에 약물 도포 등 필요한 처리를 가한 후, 다시 상기 인서트를 상기 베이스에 조립하여 세포 반응을 관찰할 수 있다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고, 상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 조립하는 단계; 제2 세포를 상기 제2 중심채널에 주입한 후, 상기 미세유체장치를 뒤집어 배양하는 단계; 제3 세포를 포함하는 하이드로젤을 상기 제2 중심채널에 주입한 후 배양하는 단계; 상기 미세유체장치를 뒤집은 후, 제1 세포를 상기 제1 중심채널에 주입하여 배양하는 단계를 포함하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법을 제공한다.
일 실시태양에서, 상기 제1 중심채널, 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함하고, 상기 제2 세포 및 상기 제3 세포를 포함하는 상기 하이드로젤은 상기 제2 중심채널 입구를 통해 주입되며, 상기 제1 세포는 상기 제1 중심채널 입구를 통해 주입되는 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제1 세포는 혈관내피세포; 피부세포; 암세포; 분비샘 세포; 근육 세포; 및 기관지, 대장, 소장, 췌장 또는 신장의 상피세포로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 제2 세포는 주피세포, 아교세포, 심근세포, 평활근세포, 창자 상피세포, 각질형성 세포, 피부섬유아세포, 다리세포 및 사구체 내피세포로 이루어진 군으로부터 선택되며; 상기 제3 세포는 성상세포, 신경세포, 및 신경줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 세포는 혈관내피세포, 상기 제2 세포는 주피세포, 상기 제3 세포는 성상세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 제1 세포는 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC, human brain microvascular endothelial cell), 상기 제2 세포는 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP, human brain vascular pericyte), 상기 제3 세포는 인간 성상세포 (HA, human astrocyte)일 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널 및 제4 측면채널을 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고, 상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 조립하는 단계; 104 cells/ml 이상의 농도의 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP, human brain vascular pericyte) 1 내지 50μl를 상기 제2 중심채널에 주입한 후, 상기 미세유체장치를 뒤집어 배양하는 단계; 103 cells/ml 이상의 농도의 인간 성상세포 (HA, human astrocyte) 1 내지 50μl를 포함하는 하이드로젤을 상기 제2 중심채널에 주입한 후 배양하는 단계; 상기 미세유체장치를 뒤집은 후, 105 cells/ml 이상의 농도의 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC, human brain microvascular endothelial cell) 1 내지 50μl를 상기 제1 중심채널에 주입하여 배양하는 단계를 포함하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널, 제4 측면채널, 제1 유체 저장소, 및 제2 유체 저장소를 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고, 상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것을 특징으로 하는 미세유체장치 내 기관 또는 장기의 모사 방법으로서, 제1 유체를 상기 제1 중심채널에 관류시키는 단계; 및 제2 유체를 상기 제1 유체 저장소에 주입하여, 상기 제3 측면채널, 상기 제2 중심채널, 상기 제4 측면채널 및 상기 제2 유체 저장소까지 차례대로 도달시키는 단계를 포함하는, 기관 또는 장기의 모사 방법을 제공한다. 상기 기관 또는 장기는 혈액-뇌 장벽, 폐, 간, 심장, 망막, 대장, 소장, 췌장 및 신장을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 기관 또는 장기는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier)이다.
일 실시태양에서, 상기 베이스는 상기 제2 중심채널과 상기 제3 측면채널을 연결하는 제5 통로채널, 상기 제2 중심채널과 상기 제4 측면채널을 연결하는 제6 통로채널, 상기 제3 측면채널과 상기 제1 유체 저장소를 연결하는 제7 통로채널, 및 상기 제4 측면채널과 상기 제2 유체 저장소를 연결하는 제8 통로채널을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제1 유체는 1 내지 10 dyne/cm2의 전단응력으로 관류시킬 수 있으며, 바람직하게는, 4 내지 6 dyne/cm2의 전단응력으로 관류시킬 수 있다. 상기 제1 유체의 흐름은 생체 내 혈액의 흐름을 모사하는 역할을 수행할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 제2 유체의 유속은 상기 제1 유체 저장소와 상기 제2 유체 저장소의 정수압 차이를 이용하여 12시간 이상 동안 1 내지 100 μl/h로 유지되는 것일 수 있으며, 바람직하게는, 10 내지 15 μl/h로 유지되는 것일 수 있다. 상기 제2 유체의 흐름은 생체 내 간질액의 흐름 (Interstitial flow)을 모사하는 역할을 수행할 수 있다.
이하, 도면들을 참조하여 본 발명의 미세유체장치에 대해 상세히 설명하기로 한다. 본 발명은 도 1 내지 25의 형태로 구체화된 미세유체장치를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 특히, 도 12 내지 25에 본 발명의 미세유체장치의 구체적인 실시예를 도시하였으나, 본 발명은 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치는 인서트(100), 베이스(200), 및 인서트(100)와 베이스(200) 사이에 위치하는 다공성 막(300)을 포함한다.
도 1을 참조하면, 상기 인서트(100)는 제1 중심채널(110)을 포함하고, 상기 베이스(200)는 제2 중심채널(210), 제3 측면채널(220), 제4 측면채널(230), 제2 중심채널(210)과 제3 측면채널(220)을 연결하는 제5 통로채널(240) 및 제2 중심채널(210)과 제4 측면채널(230)을 연결하는 제6 통로채널(250)을 포함한다. 일 실시태양에서, 상기 베이스(200)의 하단에 바닥부(400)가 부착될 수 있다.
도 2 및 3을 참조하면, 상기 미세유체장치의 베이스(200)는 제1 유체 저장소(280) 및 제2 유체 저장소(290)를 포함할 수 있고, 제3 측면채널(220)과 제1 유체 저장소(280)를 연결하는 제7 통로채널(260) 및 제4 측면채널(230)과 제2 유체 저장소(290)를 연결하는 제8 통로채널(270)을 포함할 수 있다.
도 4 및 5를 참조하면, 상기 미세유체장치의 다공성 막(300)은 제1 중심채널(110) 및 제2 중심채널(210) 사이에 존재하며, 제7 통로채널(260) 및 제8 통로채널(270)은 제2 중심채널(210)의 방향과 수직으로 형성될 수 있다.
도 6 및 7을 참조하면, 상기 미세유체장치의 제1 중심채널(110)은 제1 세포(111)를 포함할 수 있고, 제2 중심채널(210)은 제2 세포(211), 제3 세포(212), 및/또는 하이드로젤(213)을 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 제1 세포(111)는 다공성 막(300)의 상단 표면에 부착되어 배양될 수 있고, 상기 제2 세포(211)는 다공성 막(300)의 하단 표면에 부착되어 배양될 수 있으며, 상기 제3 세포(212)는 하이드로젤(213) 내부에서 3D 배양된 것일 수 있다.
도 8 내지 10, 및 도 18을 참조하면, 상기 미세유체장치의 베이스(200)는 인서트(100)가 삽입될 수 있는 인서트 삽입 홈(201)을 포함하여 인서트(100)는 베이스(200)로부터 탈부착 가능한 것일 수 있다. 또한 상기 인서트(100)는 제1 체결 헤드(101)를 포함하고, 상기 베이스(200)는 제2 체결 헤드(202)를 포함하여, 상기 제1 체결 헤드(101)와 제2 체결 헤드(202)가 서로 걸려져서 인서트(100)와 베이스(200)가 스냅핏(snap fit) 탈부착되는 것일 수 있다.
도 12 및 13을 참조하면, 상기 미세유체장치의 인서트(100)는 제1 중심채널 입구(112), 출구(113), 제2 중심채널 입구(214), 출구(215), 제3 측면채널 입구(221), 출구(222), 제4 측면채널 입구(231), 및 출구(232)를 포함할 수 있다. 상기 제1 중심채널 입구(112) 및 출구(113)는 제1 중심채널(110)과 관 형태로 연결될 수 있으며, 상기 관을 통해 전극을 일정한 위치 및 깊이로 삽입하여 TEER 값의 정밀한 측정이 가능할 수 있다.
도 14 내지 16, 및 도 19를 참조하면, 상기 미세유체장치의 베이스(200)는 하나 이상의 인서트(100)가 탈부착 가능한 구조일 수 있다. 바람직하게는, 4개의 인서트(100)가 탈부착 가능한 구조일 수 있다.
도 17 및 23을 참조하면, 상기 미세유체장치는 커버(500)를 포함할 수 있다. 상기 커버(500)는 커버 내 제1 중심채널 입구(501) 및 출구(502)를 포함할 수 있다. 상기 커버 내 제1 중심채널 입구(501) 및 출구(502)는 유체의 누수를 방지하기 위해 개폐 가능한 형태일 수 있다.
도 24를 참조하면, 상기 미세유체장치의 인서트(100)에 포함된 제1 중심채널 입구(112)를 통해 유체를 주입하여 제1 중심채널(110)을 거쳐 제1 중심채널 출구(113) 방향으로 유체를 관류시킬 수 있다.
도 11 및 25를 참조하면, 상기 미세유체장치의 베이스(200)에 포함된 제1 유체 저장소(280)에 유체를 주입하여, 제3 측면채널(220), 제2 중심채널(210), 제4 측면채널(230) 및 제2 유체 저장소(290)까지 차례대로 상기 유체를 관류시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 미세유체장치의 베이스(200)에 포함된 제1 유체 저장소(280)에 유체를 주입하여, 제7 통로채널(260), 제3 측면채널(220), 제5 통로채널(240), 제2 중심채널(210), 제6 통로채널(250), 제4 측면채널(230), 제8 통로채널(270) 및 제2 유체 저장소(290)까지 차례대로 상기 유체를 관류시킬 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1] 내피세포, 주피세포 및 성상세포의 배양 및 생존도
인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC, human brain microvascular endothelial cell), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP, human brain vascular pericyte) 및 인간 성상세포 (HA, human astrocyte)의 공동 배양을 위한 배양 조건을 최적화하기 위해, 여섯 가지의 배지 조건에서 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 분석법을 이용하여 각각의 세포 대사 활성도를 비교하였다. 여섯 가지 배지 조건은 다음과 같으며, 아교 세포 배지 (G, glial cell medium)는 성상세포 배지 (A) 및 미세아교 배지 (M)의 1:1 혼합물을 의미한다.
(i) E : 내피 배지 (endothelial medium)
(ii) A : 성상세포 배지 (astrocyte medium)
(iii) P : 주피세포 배지(pericyte medium)
(iv) M : 미세아교 배지 (microglia medium)
(v) E+G (E+A+M): 내피 배지 (E), 성상세포 배지 (A) 및 미세아교 배지 (M)의 1:1:1 혼합물
(vi) E+G+P (E+A+M+P): 내피 배지 (E), 성상세포 배지 (A), 미세아교 배지 (M) 및 주피세포 배지(P)의 1:1:1:1 혼합물
인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 상기 여섯 가지의 배지 조건에서 3일 동안 배양한 후, 각각의 세포에 CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA)를 첨가하였다. 4시간 동안 인큐베이션한 후, Cytation 5 plate reader (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 490 nm에서 각 샘플의 광학 흡광도 (optical absorbance)를 측정하였다. 실험 결과 데이터는 student t-test를 이용하여 n=6의 평균 ± s.d.로 나타내었다 (*p < 0.05, ****p < 0.001).
도 26에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 또는 인간 성상세포 (HA)를 각각의 배양배지인 내피 배지 (E), 주피세포 배지(P) 또는 성상세포 배지 (A)에서 배양한 경우보다 혼합 배지인 E+G (E+A+M) 배지에서 배양한 경우에 세포 배양이 더욱 우수한 것을 확인하였다.
또한, 도 27 및 도 28에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 및 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP)는 E+G 및 E+G+P 배지에서 생존도가 모두 우수하였고, 인간 성상세포 (HA)는 E+G 배지에서 생존도가 우수한 것을 확인하였다.
상기 실험 결과에 따라, 이하 실시예에서는 내피 배지 (E), 성상세포 배지 (A) 및 미세아교 배지 (M)의 1:1:1 혼합물인 E+G (E+A+M) 배지를 이용하여 세포 배양을 수행하였다.
[실시예 2] 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치의 제작
조립된 미세유체장치를 이용하여 다음과 같은 방법으로 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치를 제작하였다.
도 29에 나타낸 바와 같이, 106 내지 107 cells/ml 농도의 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 10 μl를 제2 중심채널에 주입하고, 미세유체장치를 뒤집어 다공성 막의 표면에 주피세포가 고르게 부착될 수 있도록 1시간 동안 인큐베이션 (incubation)한 후, 배양액을 교체하였다. 6시간 이상이 지난 후에, 마트리젤 (Matrigel)에 임베딩된 105 내지 106 cells/ml 농도의 인간 성상세포 (HA) 10μl를 제2 중심채널에 주입하였다. 마트리젤이 굳도록 1시간 동안 배양하고, 제3 측면채널 및 제4 측면채널에 배양액을 주입한 후 6시간 이상 배양하였다. 미세유체장치를 다시 뒤집은 후, 7ⅹ107 cells/ml 농도의 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 15μl를 제1 중심채널에 주입하여 1시간 동안 배양한 후, 배양액을 교체하였다.
[실시예 3] 혈액-뇌 장벽 (BBB) 특이적 단백질의 발현 수준 확인
실시예 2에서 제작한 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치의 3차원 조직 장벽 기능을 시험하기 위해, 혈액-뇌 장벽 특이적 단백질의 발현 수준을 qRT-PCR 분석을 통해 확인하였다. 비교를 위해 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)만을 단일 배양한 경우의 단백질 발현을 함께 확인하였다.
RNeasy Mini kit (Qiagen GmBH, Hilden, Germany)를 이용하여 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 및 인간 성상세포 (HA)로부터 RNA를 단리 및 수집하고, 수집한 RNA 샘플의 양을 Cytation 5 plate reader를 이용하여 측정하였다. 800 ng의 HBMEC RNA 및 280 ng의 HA RNA를 High-capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)와 함께 cDNA로 역전사시켰다. 그 후, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) (n=3)에서의 내피 특이적 유전자 발현을 분석하기 위해 Fluidigm Biomark system (Fluidigm)을 사용하여 Flex Six IFC (Fluidigm, South San Francisco, CA, USA)로 미세유체 qRT-PCR을 수행하였다. 각각의 표적 유전자는 상업적으로 입수 가능한 프라이머를 사용하여 평가하였으며, 실험에 사용된 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.
Experiment Gene Symbol Gene Name TaqMan Assay ID #
Control GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Hs02786624_g1
HBMEC Fluidigm vWF von Willebrand factor Hs01109446_m1
SELE Selectin E Hs00174057_m1
PECAM1 Platelet and endothelial cell adhesion molecule 1 Hs01065279_m1
VECAD Cadherin 5 (CDH5) Hs00901465_m1
OCLN Occludin Hs00170162_m1
ZO-1 Tight junction protein 1 (TJP1) Hs01551861_m1
CAT1 Solute carrier family 7 member 1 (SLC7A1) Hs00931450_m1
LAT1 Solute carrier family 7 member 5 (SLC7A5) Hs00185826_m1
OCT1 Solute carrier family 22 member 1 (SLC22A1) Hs00427552_m1
GLUT1 Solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) Hs00892681_m1
CERP ATP binding cassette subfamily A member 1 (ABCA1) Hs01059137_m1
P-GP ATP binding cassette subfamily B member 1 (ABCB1) Hs00184500_m1
MRP1 ATP binding cassette subfamily C member 1 (ABCC1) Hs01561483_m1
LRP1 LDL receptor related protein 1 Hs00233856_m1
AGER Advanced glycosylation end-product receptor Hs00542584_g1
ICAM1 Intercellular adhesion molecule 1 Hs00164932_m1
VCAM1 Vascular cell adhesion molecule 1 Hs01003372_m1
도 30에 나타낸 바와 같이, 혈액-뇌 장벽에서의 접합 형성 (junctional formation) 조절, 운반체 매개 수송 (carrier-mediated transport), 활성 유출 (active efflux) 또는 아밀로이드 베타 (Aβ, amyloid beta) 수송을 조절하는 단백질을 포함하여, 평가에 이용된 모든 혈액-뇌 장벽 특이적 단백질이 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)만을 단일 배양한 경우보다, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치에서 발현이 증가한 것을 확인하였다. 특히, 도 31 및 32에 나타낸 바와 같이 혈액-뇌 장벽 특이적 접합 단백질 (junctional proteins) 및 수용체 단백질 (receptor proteins)의 유전자 발현 수준이 내피세포 단일 배양에 비해 현저히 증가한 것을 확인하였다.
[실시예 4] TEER (Transendothelial electrical resistance) 값의 비교
실시예 2에서 제작한 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치의 3차원 조직 장벽 기능을 시험하기 위해 TEER (Transendothelial electrical resistance) 값을 측정하였다. 비교를 위해 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)만을 단일 배양한 경우의 TEER 값을 함께 확인하였다. TEER (Trans-Endothelial Electrical Resistance)은 옴의 법칙(Ohm's raw)을 이용하여, 세포층의 전기저항을 측정하는 방법으로, 세포층으로 이루어진 세포장벽이 얼마나 잘 기능하고 있는지를 나타내는 요소 중의 하나이다. 세포층이 서로 강하게 결합할수록, 세포사이의 결합을 이루는 접합 단백질 (Junction protein)의 발현이 강해지며, 세포간 (Paracellular) 물질 수송이 제한되므로, 전기저항값이 높아진다. 인간 혈액-뇌 장벽은 물질 수송이 극히 제한되어 있는 장벽으로, TEER 값이 5000 Ω.cm2 으로 추정되며 [Lauschke K, Frederiksen L, Hall VJ (2017) Paving the way toward complex blood-brain barrier models using pluripotent stem cells. Stem Cells Dev 26(12):857-874], 랫 혈액-뇌장벽은 5900 Ω.cm2 으로 측정된 바 있다. [Butt AM, Jones HC, Abbott NJ (1990) Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. J Physiol 429:47-62]
혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치의 장벽층 및 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 단일 배양층의 TEER 값은 Rj11 플러그 및 Ag, Ag/AgCl 전극 와이어 (직경 381 μm, 길이 3 cm, A-M Systems, Sequim, WA, USA)로 제조된 맞춤형 전극 어댑터를 12.5Hz에서 10μA의 일정한 AC 전류를 생성하는 EVOM2 volt-ohmmeter (Word Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)에 연결하여 측정하였다. 배경 저항 및 오차를 감소시키기 위해, 전극 와이어를 배양 배지가 채워진 tygon tubing (1/32"ID x 3/32"OD, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA)에 넣고 채널에 삽입하였다. 1분 동안 안정화시킨 후, 5개의 다중 판독값이 각 장치에 대해 평균화되었다. TEER 값을 계산하기 위해, 세포가 없는 상태에서의 측정 값을 각 장치의 측정값에서 빼고, 층의 표면적을 곱하였다.
도 33에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC) 단일 배양에 비해 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모사 미세유체장치에서의 TEER 값이 더 높아, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 함께 배양하였을 때, 혈액-뇌 장벽 (BBB)를 보다 잘 모사할 수 있는 것을 확인하였다.
[실시예 5] 혈액 모사 흐름의 전단응력 차이에 따른 TEER 값의 비교
실시예 2에서 제작한 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치의 제1 중심채널에 가해지는 혈액 모사 흐름의 전단응력에 따른 3차원 조직 장벽 기능 차이를 시험하기 위해, 제1 중심채널에 전단응력이 가해지지 않는 경우, 0.4 dyne cm-2의 전단응력을 가한 경우, 4 dyne cm-2의 전단응력을 가한 경우 각각의 TEER (Transendothelial electrical resistance) 값을 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 34에 나타낸 바와 같이, 4 dyne cm-2의 전단응력을 가한 경우, 0.4 dyne cm-2의 전단응력을 가한 경우, 전단응력을 가하지 않은 경우 순으로 높은 TEER 값을 나타내는 것을 확인하였다.
[실시예 6] 투과 계수 (permeability coefficient)의 비교
실시예 2에서 제작한 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치의 3차원 조직 장벽 기능을 시험하기 위해 4 kDa 및 40 kDa FITC-dextran의 확산으로부터 투과 계수 (permeability coefficient)를 측정하였다. 비교를 위해 세포를 배양하지 않은 경우 및 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)만을 단일 배양한 경우의 투과 계수를 함께 확인하였다.
미세유체장치 내 세포를 60시간 동안 배양한 후, 4 kDa 또는 40 kDa의 FITC-dextran (Sigma-Aldrich)을 500 μg/mL의 농도로 함유하는 배양 배지를 PhD Ultra syringe pump (Harvard Apparatus)를 사용하여 미세유체장치의 제1 중심채널에 16 μL/min의 유속으로 주입하였다. 또한, 동시에 한쪽 측면채널의 배양 배지를 1시간 동안 4 μL/min의 유속으로 syringe pump를 이용하여 샘플링하였다. 500 μg/mL의 FITC-dextran 용액 및 샘플 용액의 형광 강도는 Cytation 5 plate reader (n = 4)를 사용하여 측정하였다. 용액 중 덱스트란 (dextran)의 농도 (C)는 표준 보정 곡선을 사용하여 측정된 형광 강도 값으로 계산하였으며, 투과 계수 (P)는 다음 식을 이용하여 계산하였다.
Figure 112020128375945-pat00001
(V : 샘플 용액의 부피,
Figure 112020128375945-pat00002
: 시간에 따른 베이스 내 채널에서의 농도 구배,
Figure 112020128375945-pat00003
:장벽층에서의 농도 구배)
도 35에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치의 3차원 조직 장벽은 세포를 배양하지 않은 경우 및 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)만을 단일 배양한 경우에 비해 4 kDa 및 40 kDa 모두에서 현저히 낮은 투과 계수를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 세 가지 세포를 모두 배양한 경우에 혈액-뇌 장벽과 가장 유사한 기능을 수행하는 것을 확인하였다.
[실시예 7] 배양 방법에 따른 성상세포의 구조 및 기능 비교
실시예 2에서 제작한 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치의 제2 중심채널 내의 성상세포 배양에 있어서, 2D 배양과 3D 배양 간의 차이점을 비교하였다. 건강한 성상세포의 형태학적 및 생리학적 특성을 보존하는 것은 혈액-뇌 장벽의 기능을 모사함에 있어서 중요한 역할을 수행한다.
2D 및 3D 배양에서의 인간 성상세포 (HA)의 구조 및 기능을 비교하기 위해, 인간 성상세포 (HA)를 마트리젤 (Matrigel, Growth factor-reduced; Corning, NY, USA)로 코팅된 24-웰 (24-wells) 및 3D 마트리젤 (5 mg mL-1)에 각각 1×106 cells/mL의 밀도로 시딩하였다. 하루 동안 배양한 후, 세포를 재조합 인간 인터루킨-1β (IL-1β, Gibco, Grand Island, NY, USA) 1 ng/mL 또는 10 ng/mL로 자극하고, 분석을 위해 20 시간 동안 추가로 배양하였다.
배양 방법에 따른 성상세포의 구조 비교
도 36 내지 38에 나타낸 바와 같이, 인간 성상세포 (HA)를 2D 마트리젤(Matrigel) 코팅 표면 위에서 배양한 경우 짧은 돌기 (process)를 갖는 평평한 다각형 모양의 확대된 세포체 형태를 나타내었다. 반면에, 인간 성상세포 (HA)를 3D 마트리젤 내부에서 배양한 경우 방사형으로 분포된 얇고 긴 돌기를 갖는 작은 세포체 형태를 나타내었다.
배양 방법에 따른 성상세포의 기능 비교
2D 또는 3D 배양된 인간 성상세포 (HA)에서 반응성 신경교증 마커의 유전자 발현 수준을 qRT-PCR 분석을 통해 확인하였다. 2D 및 3D 배양 시스템 (n=4)에서 인간 성상세포 (HA)의 신경교 반응성을 분석하기 위해, 표준 qRT-PCR을 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems)으로 수행하였다. 각각의 표적 유전자는 상업적으로 입수 가능한 프라이머를 사용하여 평가하였으며, 실험에 사용된 프라이머를 하기 표 2에 나타내었다.
Experiment Gene Symbol Gene Name TaqMan Assay ID #
Control GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Hs02786624_g1
HA RT-qPCR GFAP Glial fibrillary acidic protein Hs00909233_m1
VIM Vimentin Hs00958111_m1
LCN2 Lipocalin-2 Hs01008571_m1
도 39에 나타낸 바와 같이, 반응성 신경교증 마커인 비멘틴 (vimentin, VIM) 및 리포칼린-2 (lipocalin-2, LCN2)의 발현이 2D 배양과 비교하여 3D 배양된 인간 성상세포 (HA)에서 매우 감소하는 것을 확인하였다. LCN2는 전 염증반응을 매개함으로써 신경 염증에서 중요한 역할을 하는 유전자로, 반응성 성상세포에서 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 반면, 대표적인 성상세포 마커인 신경교 섬유질 산성 단백질 (glial fibrillary acidic protein, GFAP)의 발현 수준에는 큰 차이가 없었다.
또한, 도 40 및 41에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인인 인터루킨-1β (interleukin-1β, IL-1β)를 처리한 경우에 LCN2 발현 수준이 2D 및 3D 배양에서 모두 용량 의존적으로 조절됨을 확인하였다.
따라서, 3D 배양된 인간 성상세포 (HA)가 2D 배양에 비해 생체 내 성상세포와 유사한 형태 및 유전자 발현을 나타내므로, 혈액-뇌 장벽의 구조 및 기능을 모사함에 있어서 적합한 형태임을 확인하였다.
[실시예 8] 성상세포 배양 방법에 따른 AQP-4 및 α-syn의 발현 비교
실시예 2에서 제작한 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치의 제2 중심채널 내의 성상세포 배양에 있어서, 2D 배양 및 3D 배양에 따른 아쿠아포린-4 (AQP-4, Aquaporin-4) 및 α-syn (α-syntrophin)의 발현을 비교하였다. 혈관 주위 공간의 성상세포는 말단 돌기의 수로 단백질인 AQP-4를 통해 뇌의 물 항상성을 조절하므로, 성상세포 말단 돌기에서의 AQP-4의 국소화는 혈액-뇌 장벽의 항상성 조절 및 생리학적 조건을 모사함에 있어서 중요한 역할을 수행한다. α-syn는 AQP-4의 성상세포 말단으로의 국소화를 조절하는 앵커 (anchor)로 알려져 있다.
세포 특이적 마커 발현을 시각화하기 위하여 실시예 7에서 배양한 2D 및 3D 배양에서의 인간 성상세포 (HA) 샘플을 실온에서 15 분 동안 2 % 파라 포름 알데히드 (paraformaldehyde, PFA; Santa Cruz Biotechnology, San Diego, CA, USA)로 고정시켰다. PBS 중 0.1 % Triton X (Sigma-Aldrich)에서 15 분 동안 투과시킨 후, 샘플을 PBS 중 2 % 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA; Sigma-Aldrich)으로 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다. 그 후, 샘플을 4 ℃에서 1 차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하고, 1 % BSA로 3 회 세척하였다. GFAP, AQP4, 및 α-syn 항체를 각각 6 시간 동안 4 ℃에서 처리하였다. 핵을 4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI; Invitrogen)로 대조염색하고 이미징 전까지 PBS에 보관하였다. 공초점 현미경 (confocal microscope, LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 형광 가시화된 샘플을 검사하였다.
도 42 및 도 43에 나타낸 바와 같이, 성상세포를 2D 배양한 경우 AQP-4 및 α-syn가 확산된 형태로 발현된 반면, 3D로 배양한 경우 성상세포 말단 (astrocytic end-feet)에 국소화된 것을 확인하였다.
따라서, 3D 배양된 인간 성상세포 (HA)가 2D 배양에 비해 생체 내 성상세포와 유사한 기능을 수행하므로, 혈액-뇌 장벽의 기능을 모사함에 있어서 적합한 형태임을 확인하였다.
[실시예 9] 배양 세포에 따른 AQP-4 발현 비교
실시예 2에서 제작한 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치에서 AQP-4 발현 국소화 수준을 확인하였다. 비교를 위해 인간 성상세포 (HA)만을 배양한 경우 및 인간 성상세포 (HA)와 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)를 배양한 경우의 AQP-4 발현을 함께 확인하였다.
각각의 샘플에서의 AQP-4 발현을 실시예 8과 동일한 방법으로 시각화한 후, ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 혈관 주위 채널의 z 스택 이미지에서 z-축을 따라 형광 강도 프로파일을 측정함으로써 AQP4의 분포를 정량화하였다. 인서트에 포함된 채널 (vascular) 및 베이스에 포함된 채널 (parenchymal) 각각에서의 형광 강도 평균을 계산한 후, 인서트에 포함된 채널 (vascular) 내의 평균 형광 강도를 베이스에 포함된 채널 (parenchymal) 내의 평균 형광 강도로 나누어 AQP-4 국소화 지수 (AQP4 polarization index)를 계산하였다.
도 44에 나타낸 바와 같이, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 함께 배양 (E+P+A)하였을 때, 인간 성상세포 (HA)만을 배양한 경우 (A) 또는 인간 성상세포 (HA)와 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)를 배양한 경우 (E+A)에 비해 AQP-4의 국소화 수준이 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, AQP-4의 국소화는 주피세포의 존재 하에 유의하게 유도됨을 확인하였으며, 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 함께 배양하였을 때, 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier)의 물 수송 시스템을 모사할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 10] 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통한 나노 입자 수송 분석
실시예 2에서 제작한 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP) 및 인간 성상세포 (HA)를 포함하는 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치에서 혈액-뇌 장벽 모사 구조를 통한 나노 입자의 수송을 모니터링하고 정량화하였다. 중추신경계에서의 약물 전달 연구에 있어서, 세포 및 분자 수준에서 약물을 포함하는 화합물의 뇌로의 수송을 정량화하는 것은 중요한 과제이다.
HDL 모방 나노 입자 eHNP-A1 합성
미세유체 기술을 이용하여 지질 (lipid, DMPC), 아포지단백 A1 (apolipoprotein A1), 및 형광 마커로 구성된 HDL 모방 원반형 나노 입자 eHNP-A1를 생리학적으로 적절한 크기와 구성으로 합성하였다. 합성된 eHNP-A1의 크기 분포를 측정하여 도 45에 나타내었다.
전신투여된 eHNP-A1의 생체 분포 확인
꼬리 정맥 주사를 통해 1mg/kg의 eHNP-A1을 마우스에 전신 투여하였다. 200 μL 식염수를 주입한 마우스를 대조군으로 하였다. 투여 24 시간 후, 마우스를 희생시키고 식염수 및 4 % PFA에 15 분 동안 보관하였다. 그 후, 생체 내 영상 시스템 (in vivo imaging system, IVIS; Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 각 기관 (뇌, 심장, 폐, 간, 신장 및 비장)을 수득하여 DiR 함량을 가시화하였다. 또한, 뇌 조직 내부의 eHNP-A1 분포를 시각화하기 위해, 수득한 뇌 조직을 10 μm 절편으로 극저온 보관하고 DAPI-containing antifade mounting medium (H-1200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 DAPI로 염색하였다. 이를 공초점 현미경 (confocal microscope, Zeiss LSM 780)을 이용하여 이미지화하였다.
그 결과, 도 46에 나타낸 바와 같이, 뇌에 축적된 eHNP-A1의 양은 전신 축적량의 최대 3%임을 확인하였다. 또한, 도 47에 나타낸 바와 같이, 전신투여된 eHNP-A1는 뇌의 세포핵 주변으로 국소적 분포를 이루는 것을 확인하였다.
혈액-뇌 장벽 모사 미세유체장치에서의 eHNP-A1 분포
실시예 2에서 제작한 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치에서 eHNP-A1 분포를 정량화하고, 물질 운반 메커니즘을 확인하기 위해, 제1 중심채널 (vascular)에 eHNP-A1을 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 또한, eHNP-A1가 뇌 내피세포의 HDL 수용체인 scavenger receptor class B type 1 (SR-B1)을 이용하여 HDL의 주요 수송 메커니즘 중 하나인 트랜스사이토시스 (transcytosis)를 통해 혈액-뇌 장벽을 통과하는지 여부를 시험하기 위해 BLT-1 (block lipid transporter-1)을 처리하여 SR-B1을 차단하였다. 그 후, 제1 중심채널 (vascular) 및 제2 중심채널 (perivascular) 각각으로부터 샘플링된 eHNP-A1을 포함하는 배양 배지의 상대적 형광 강도를 측정하였다. 또한, eHNP-A1 양성을 나타내는 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC), 인간 성상세포 (HA), 및 인간 뇌혈관 주피세포 (HBVP)의 분포에 대한 FACS (fluorescence-activated cell sorting) 분석을 수행하였다.
도 48 및 도 49에 나타낸 바와 같이, SR-B1을 차단한 후, 제1 중심채널에 남아있는 eHNP-A1의 양은 상당히 증가한 반면, 제2 중심채널로 이동된 eHNP-A1의 양은 크게 변하지 않았다. 또한, 도 50에 나타낸 바와 같이, BLT-1 처리시 인간 뇌 미세혈관 내피세포 (HBMEC)에 흡수되거나 제2 중심채널로 이동한 eHNP-A1의 양이 약 3배 감소하는 것을 확인하였으며, 도 51 및 52에 나타낸 바와 같이, BLT-1 처리시 총 eHNP-A1 양성 세포가 감소한 것을 확인하였다.
따라서, 실시예 2에서 제작한 혈액-뇌 장벽 (BBB, blood-brain barrier) 모사 미세유체장치를 이용하여 세포와 나노 입자 간 상호작용을 모니터링하고, 나노 입자의 분포를 정량화할 수 있음을 확인하였다.
100: 인서트
101: 제1 체결 헤드
110: 제1 중심채널
111: 제1 세포
112: 제1 중심채널 입구
113: 제1 중심채널 출구
200: 베이스
201: 인서트 삽입 홈
202: 제2 체결 헤드
210: 제2 중심채널
211: 제2 세포
212: 제3 세포
213: 하이드로젤
214: 제2 중심채널 입구
215: 제2 중심채널 출구
220: 제3 측면채널
221: 제3 측면채널 입구
222: 제3 측면채널 출구
230: 제4 측면채널
231: 제4 측면채널 입구
232: 제4 측면채널 출구
240: 제5 통로채널
250: 제6 통로채널
260: 제7 통로채널
270: 제8 통로채널
280: 제1 유체 저장소
290: 제2 유체 저장소
300: 다공성 막
400: 바닥부
500: 커버
501: 커버 내 제1 중심채널 입구
502: 커버 내 제1 중심채널 출구

Claims (25)

  1. 제1 중심채널을 포함하는 인서트;
    제2 중심채널, 제3 측면채널, 제4 측면채널, 상기 제2 중심채널과 상기 제3 측면채널을 연결하는 제5 통로채널 및 상기 제2 중심채널과 상기 제4 측면채널을 연결하는 제6 통로채널을 포함하는 베이스; 및
    상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고,
    상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 상기 다공성 막에 접촉하지 않고,
    상기 제5 통로채널 및 상기 제6 통로채널은 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널에 비해 채널의 높이가 낮은 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 베이스는 상기 인서트가 삽입될 수 있는 홈을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  4. 제2항에 있어서, 상기 인서트는 제1 체결 헤드를 포함하고,
    상기 베이스는 제2 체결 헤드를 포함하여,
    상기 제1 체결 헤드와 상기 제2 체결 헤드가 서로 걸려져서 상기 인서트와 상기 베이스가 스냅핏(snap fit) 탈부착되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 중심채널, 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 베이스는 제1 유체 저장소 및 제2 유체 저장소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  9. 제8항에 있어서, 상기 베이스는 상기 제3 측면채널과 상기 제1 유체 저장소를 연결하는 제7 통로채널 및 상기 제4 측면채널과 상기 제2 유체 저장소를 연결하는 제8 통로채널을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제7 통로채널 및 상기 제8 통로채널은 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널에 비해 채널의 높이가 낮은 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  11. 제9항에 있어서, 상기 제7 통로채널 및 상기 제8 통로채널은 상기 제2 중심채널의 방향과 수직으로 형성된 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  12. 제1항에 있어서, 상기 미세유체장치는 플라스틱, 유리, 금속 또는 실리콘으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제1 중심채널은 조직 장벽 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조직 장벽 세포는 혈관내피세포; 피부세포; 암세포; 분비샘 세포; 근육 세포; 및 기관지, 대장, 소장, 췌장 또는 신장의 상피세포로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  15. 제1항에 있어서, 상기 제2 중심채널은 내부 조직 세포 및 하이드로젤을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 내부 조직 세포는 성상세포, 주피세포, 신경세포, 신경줄기세포, 아교세포, 심근세포, 평활근세포, 창자 상피세포, 각질형성 세포, 피부섬유아세포, 다리세포 및 사구체 내피세포로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  17. 제15항에 있어서, 상기 하이드로젤은 콜라겐, 라미닌, 히알루론산, 미네랄, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 펩타이드, 폴리에틸렌글리콜 및 알지네이트로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  18. 제1항에 있어서, 상기 인서트를 상기 베이스로부터 분리하여, 상기 제1 중심채널에 포함된 세포, 상기 제2 중심채널에 포함된 세포, 및 상기 다공성 막에 부착된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 각각 분리할 수 있는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치.
  19. 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널, 제4 측면채널, 상기 제2 중심채널과 상기 제3 측면채널을 연결하는 제5 통로채널 및 상기 제2 중심채널과 상기 제4 측면채널을 연결하는 제6 통로채널을 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고,
    상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 상기 다공성 막에 접촉하지 않고,
    상기 제5 통로채널 및 상기 제6 통로채널은 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널에 비해 채널의 높이가 낮으며,
    상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 조립하는 단계;
    제2 세포를 상기 제2 중심채널에 주입한 후, 상기 미세유체장치를 뒤집어 배양하는 단계;
    제3 세포를 포함하는 하이드로젤을 상기 제2 중심채널에 주입한 후 배양하는 단계; 및
    상기 미세유체장치를 뒤집은 후, 제1 세포를 상기 제1 중심채널에 주입하여 배양하는 단계
    를 포함하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 중심채널, 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 액제의 관류를 유도 및 조절할 수 있는 입구 및 출구를 포함하고,
    상기 제2 세포 및 상기 제3 세포를 포함하는 상기 하이드로젤은 상기 제2 중심채널 입구를 통해 주입되며,
    상기 제1 세포는 상기 제1 중심채널 입구를 통해 주입되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 제1 세포는 혈관내피세포; 피부세포; 암세포; 분비샘 세포; 근육 세포; 및 기관지, 대장, 소장, 췌장 또는 신장의 상피세포로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 제2 세포는 주피세포, 아교세포, 심근세포, 평활근세포, 창자 상피세포, 각질형성 세포, 피부섬유아세포, 다리세포 및 사구체 내피세포로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    상기 제3 세포는 성상세포, 신경세포, 및 신경줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 미세유체장치 내 세포 배양 방법.
  22. 제1 중심채널을 포함하는 인서트; 제2 중심채널, 제3 측면채널, 제4 측면채널, 상기 제2 중심채널과 상기 제3 측면채널을 연결하는 제5 통로채널, 상기 제2 중심채널과 상기 제4 측면채널을 연결하는 제6 통로채널, 제1 유체 저장소, 및 제2 유체 저장소를 포함하는 베이스; 및 상기 인서트와 상기 베이스 사이에 위치하는 다공성 막을 포함하고,
    상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널은 상기 다공성 막에 접촉하지 않고,
    상기 제5 통로채널 및 상기 제6 통로채널은 상기 제2 중심채널, 상기 제3 측면채널 및 상기 제4 측면채널에 비해 채널의 높이가 낮으며,
    상기 인서트는 상기 베이스로부터 탈부착 가능한 것을 특징으로 하는 미세유체장치 내 기관 또는 장기의 모사 방법으로서,
    제1 유체를 상기 제1 중심채널에 관류시키는 단계; 및
    제2 유체를 상기 제1 유체 저장소에 주입하여, 상기 제3 측면채널, 상기 제2 중심채널, 상기 제4 측면채널 및 상기 제2 유체 저장소까지 차례대로 도달시키는 단계
    를 포함하는, 기관 또는 장기의 모사 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 베이스는 상기 제3 측면채널과 상기 제1 유체 저장소를 연결하는 제7 통로채널, 및 상기 제4 측면채널과 상기 제2 유체 저장소를 연결하는 제8 통로채널을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 기관 또는 장기의 모사 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 제1 유체는 1 내지 10 dyne/cm2의 전단응력으로 관류시키는 것을 특징으로 하는, 기관 또는 장기의 모사 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 제2 유체의 유속은 상기 제1 유체 저장소와 상기 제2 유체 저장소의 정수압 차이를 이용하여 12시간 이상 동안 1 내지 100 μl/h로 유지되는 것을 특징으로 하는, 기관 또는 장기의 모사 방법.

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