WO2020162442A1 - サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）由来の抗菌活性物質 - Google Patents

サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）由来の抗菌活性物質 Download PDF

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実人 佐藤
昭一 天野
初美 ▲高▼野
賢志 上田
一夫 降旗
庄平 作田
明 横田
修平 矢部
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Definitions

  • the present invention relates to a novel compound having antibacterial activity and a method for producing the same.
  • Thermosporothrix hazakensis (Thermosporothrix hazakensis, hereinafter also referred to as "T. hazakensis”) is a bacterium belonging to the order of the phytochlorophyllous phylum Cteddonobacteria and is an aerobic gram-positive bacterium.
  • the present invention aims to provide a novel compound having antibacterial activity and a method for producing the same.
  • the present invention includes the following inventions.
  • Thermosporothrix hazakensis is Thermosporothrix hazakensis SK20-1 T strain.
  • This specification includes the disclosure content of International Application No. PCT/JP2019/003813 and Japanese Patent Application No. 2019-138058 which are the basis of priority of the present application.
  • FIG. 1-1 is a chart showing 1 H-NMR spectrum of HK-1.
  • FIG. 1-2 is a chart showing 13 C-NMR spectrum of HK-1.
  • FIG. 1-3 is a diagram showing a COZY spectrum of HK-1.
  • FIG. 1-4 is a diagram showing an HSQC spectrum of HK-1.
  • FIG. 1-5 is a diagram showing an HMBC spectrum of HK-1.
  • Fig.1-6(a) is a diagram showing the 1D-ROESY spectrum of HK-1 when 2.19 ppm is irradiated, and Fig.1-6(b) is an enlarged diagram thereof.
  • FIG. 1-7(a) shows the 1D-ROESY spectrum of HK-1 when irradiated with 6.21 ppm
  • FIG. 1-7(b) is an enlarged view.
  • FIG. 1-8 is a diagram showing the result of NMR spectrum analysis of HK-1.
  • FIG. 1-9 is a diagram showing a 13 C-NMR spectrum in which isotope shifts of HK-1 due to deuterium substitution are observed.
  • FIG. 2 is a diagram showing the monomer structure of HK-1.
  • FIG. 3 is a diagram showing a planar structure of HK-1.
  • FIG. 4-1 is a diagram showing the results of highly heat-treated HK-1 antibacterial activity measurement after pH fluctuation.
  • FIG. 4-2 is a diagram showing the results of measuring the antibacterial activity against B. subtilis with changes in pH, storage temperature, and the passage of time.
  • FIG. 4-3 is a diagram showing the results of antibacterial activity measurement against G. stearothermophilus with pH changes and storage temperature and the passage
  • the present invention provides formula (I): And a salt or ester thereof (hereinafter, also referred to as a compound of the present invention).
  • the compounds of the present invention have high antibacterial activity.
  • the compounds of the invention have a high antibacterial activity, especially against Gram-positive bacteria.
  • the compound of formula (I) has the following structure: Has a dimeric structure. The dimer is due to peroxide formation via oxygen at the C-6 position. When the compound of formula (I) has an asymmetric carbon, all enantiomers and mixtures thereof are included, and when stereoisomers are present, all stereoisomers and mixtures thereof are included. ..
  • the compounds of formula (I) may form hydrates, solvates or crystalline polymorphs.
  • the glycosidic bond at the C-10 position may be either an ⁇ bond or a ⁇ bond.
  • the present invention also has the following physicochemical properties: Has an absorption maximum at 340 nm in the UV spectrum and a molar absorption coefficient of 30630;
  • the molecular formula is C 74 H 58 Cl 8 O 26 from analysis by ESI/TOF/MS spectrum and high resolution mass spectrum;
  • the compound having the above-mentioned physicochemical properties, or a salt or ester thereof has high antibacterial activity.
  • the compound having the above physicochemical properties, or a salt or ester thereof has a particularly high antibacterial activity against Gram-positive bacteria.
  • the compound having the above physicochemical properties, or a salt or ester thereof has an asymmetric carbon atom, all enantiomers and mixtures thereof are included, and when the stereoisomer is present, all stereoisomers. And mixtures thereof.
  • the compound having the above physicochemical properties, or a salt or ester thereof may form a hydrate, a solvate or a crystalline polymorph.
  • the compound of formula (I), the compound having the above-mentioned physicochemical properties, or a salt or ester thereof is also collectively referred to as the compound of the present invention.
  • the salt of the compound of formula (I) or the compound having the above-mentioned physicochemical properties is not particularly limited, and various salts can be used. Examples thereof include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium, ammonium salts, organic amine salts such as triethanolamine salts and triethylamine salts. Furthermore, these salts may form hydrates, solvates or crystalline polymorphs.
  • the ester of the compound of formula (I) or the compound having the above physicochemical properties is not particularly limited, and examples thereof include esters with fatty acids such as acetic acid and aromatic carboxylic acids such as benzoic acid.
  • Fatty acids include saturated fatty acids and unsaturated fatty acids, short chain for the chain length, including medium and long chains, specifically acetic acid, propionic acid, butyric acid, caproic acid, caprylic acid, lauric acid, myristylic acid, Examples thereof include, but are not limited to, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid, lignoceric acid, decenoic acid, oleic acid, erucic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, and eicosapentaenoic acid.
  • the aromatic fatty acid includes those having a substituent such as benzoic acid, ortho, meta and/or para position of benzoic acid, such as amino group and hydroxyl group, and also includes polycyclic aromatic carboxylic acid such as naphthoic acid. ..
  • the compound of formula (I) has 1 to 12 positions among the hydroxyl groups in formula (I), preferably C-3′, C-6′, C-8′, C-10′, C-2.
  • An ester can be formed at the hydroxyl group attached to at least one carbon selected from the "" and C-3" positions. These esters can be obtained by a conventional method, for example, by reacting a corresponding carboxylic acid with a compound of formula (I) or a compound having the above physicochemical properties under an acidic catalyst.
  • the present invention comprises culturing Thermosporothrix hazakensis in a medium, and collecting the compound of formula (I) or the compound having the physicochemical properties, or a salt or ester thereof from the culture, It also relates to a method for producing the compound of formula (I), the compound having the above-mentioned physicochemical properties, or a salt or ester thereof (hereinafter, also referred to as the production method of the present invention). According to the production method of the present invention, the compound of the present invention can be obtained in a high yield.
  • a normal microbial culture method is used.
  • the medium either a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it appropriately contains an assimilable carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and necessary growth/production promoting substances.
  • an assimilable carbon source glucose, starch, dextrin, mannose, fructose, maltose, lactose, molasses, etc. may be used alone or in combination.
  • hydrocarbons, alcohols, organic acids, amino acids (tryptophan, etc.) and the like are also used.
  • ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, sodium nitrate, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, soybean powder, cottonseed meal, casamino acid, etc. may be used alone or in combination. ..
  • inorganic salts such as sodium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, calcium carbonate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, ferrous sulfate, calcium chloride, manganese sulfate, and zinc sulfate may be added as necessary.
  • trace components that promote the growth of the microorganism used and the production of the compound of the present invention can be added appropriately, and those skilled in the art can select appropriate components.
  • Culturing T. hazakensis in such a nutrient medium can be performed according to the method usually used in the production of antibiotics by general microorganisms. Usually, it is suitable to culture under aerobic conditions, and usually, it can be performed with stirring and/or aeration.
  • the culture method any of static culture, shaking culture, and liquid culture accompanied by aeration and stirring can be used, and shaking culture is suitable.
  • the culture temperature that can be used is not particularly limited and can be appropriately selected as long as the growth of T. hazakensis is not substantially inhibited and the antibiotic can be produced.
  • Particularly preferable is a culture temperature in the range of 35 to 50°C.
  • the medium can be cultured at a pH of 3 to 11, preferably 6 to 10. Culturing can usually be continued until the antibiotic is fully accumulated.
  • the culturing time varies depending on the composition of the medium, the culturing temperature, the working temperature, the used producing strain, etc., but usually the desired antibiotic is produced and accumulated in the culture solution and the microbial cells by culturing for 2 to 8 days.
  • the amount of new antibiotics accumulated in the culture should be quantified by the paper disc method used in ordinary antibiotic activity tests, using Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 strain and/or Bacillus subtilis NBRC 3134 T strain as the test bacteria. You can
  • novel antibiotics accumulated in the culture and cells, collect them from the culture. After culturing, if necessary, after separating the bacterial cell and the supernatant by a separation method known per se such as filtration or centrifugation, the supernatant is subjected to solvent extraction using an organic solvent, particularly acetone or the like, adsorption or ion exchange ability.
  • the novel antibiotics can be isolated and purified from the culture supernatant and collected by using the chromatography utilizing the above, the gel filtration, the chromatography utilizing the liquid-liquid partition, alone or in combination.
  • activated carbon As a carrier for chromatography having adsorption or ion exchange ability, activated carbon, silica gel, porous polystyrene/divinylbenzene resin or various ion exchange resins can be used.
  • the cells are extracted with 50% acetone and then isolated and purified by using various chromatographies alone or in combination as in the case of the supernatant.
  • the novel antibiotic is preferably obtained by treating an acetone aqueous solution extract of the culture with ethyl acetate and water to obtain an ethyl acetate extract, and treating the extract with a silica gel column. Further, it is preferable to use ethyl acetate as the mobile phase of the silica gel column.
  • ethyl acetate as the mobile phase of the silica gel column.
  • Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 strain Bacillus subtilis NBRC 3134 T strain, Streptomyces griseus NBRC 15744 T strain, Escherichia coli NBRC 102203 T strain , Thermosporothrix hazakensis SK20-1 T /NBRC 105916 T strain, Thermosporothrix narukonensis F4 T strain, Streptomyces sp. AGRN-7 strain, Streptomyces sp. AGRN-8 strain, and Streptomyces sp. It was found to have activity.
  • the present invention also relates to an antibacterial agent containing the compound of formula (I) or the compound having the above-mentioned physicochemical properties, or a salt or ester thereof as an active ingredient (hereinafter, also referred to as an antibacterial agent of the present invention).
  • the antibacterial agent of the present invention is obtained by mixing the compound of formula (I) or the compound having the above-mentioned physicochemical properties as an active ingredient, or a salt or ester thereof with a conventional liquid or solid carrier such as ethanol, water or starch. It may be used by being prepared in the form of the following composition.
  • the effective concentration is not particularly limited as long as it can exert antibacterial properties, and can be, for example, 1 to 1000 ⁇ g/ml.
  • Example 1 Purification of antibacterial active substance "HK-1" produced by Thermosporothrix hazakensis SK20-1 T ⁇ Used strain> Thermosporothrix hazakensis SK20-1 T /NBRC 105916 T ⁇ Use medium>
  • T. hazakensis 1.1 Inoculation of bacteria, 250 ml of YS medium was prepared in a 300 ml Erlenmeyer flask, and sterilized (121°C, 20 min) in an autoclave. After cooling to 50°C or lower, 25 ml was dispensed into a petri dish (10 plates were prepared). A piece of ice from a glycerol stock of T. hazakensis stored at -80°C was radially inoculated on one YS medium with a toothpick. Static culture was carried out at 50°C for 4 days.
  • Seed culture 100 ml of LB(+M) medium was prepared in a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave (121°C, 20 min). After cooling to 50°C or lower, 1 cm 2 of toothpick was used to extract T. hazakensis from the plate inoculated with "1.1 Inoculation” and inoculated. It was cultured in a shaking incubator at 45° C. and 135 rpm for 24 hours.
  • the supernatant obtained from the centrifugation was suction-filtered with a Kiriyama funnel, the filtrate was transferred to Nascoruben (for evaporator), and then distilled by an evaporator to remove acetone in the sample. A total of 2.8 L of concentrated solution was stored in a 4°C room.
  • Example 2 Structural analysis of HK-1 [1. Physical and chemical properties of HK-1] ⁇ Experimental method> 1. MS A small amount of HK-1 was dissolved in methanol. It was subjected to ESI(-)/TOF-MS spectrum analysis. The analytical equipment is as follows. Agilent 1110 series (pump) The Accu TOF JMC-T100LC(MS)
  • HK-1 is a light yellow powder, and its methanol solution also showed similar color.
  • UV spectrum of HK-1 measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer, an absorption maximum was observed at 340 nm, and the molar extinction coefficient was 30630.
  • HRMS The lyophilized hydrochloric acid hydrolyzate was requested to be measured by the National Institute of Health Sciences. HRMS is (MH) - the analysis of the profile in the vicinity of the ion.
  • the analytical equipment is as follows. Agilent 1200 series (pump) Agilent 6530 Q-TOF (MS)
  • HK-1 was hydrolyzed by heating under reflux in 50% acetonitrile containing hydrochloric acid at a concentration of 0.5 M, and then the hydrolyzate was directly analyzed by negative mode Q-TOF/MS.
  • an ion having a maximum intensity of m/z 1413 was observed, and HRMS revealed that the molecular formula of the hydrolyzate was C 64 H 42 Cl 8 O 20 .
  • the molecular formula of this hydrolyzate was consistent with that of the aglycone that results when the two 5-deoxyfuranosides of HK-1 are removed by hydrolysis. Therefore, it was shown that a hydroxyl group is bonded to the 3-position carbon of 5-deoxyfuranoside of HK-1.
  • HK-1 has a structure in which a hydroxyl group is bonded to C-3′′ of the partial structure in FIG. 1-8 to form a dimer.
  • the molecular formula of the monomer structure part of HK-1 is satisfied.
  • carbons to which a chlorine atom can be bonded are C-2, C-4, C-6, C-. 2'and C-5', but since oxygen is bound to C-6, a chlorine atom can be bound to C-2, C-4, C-2' and C-5'. It became clear.
  • HK-1 has a dimer structure shown in FIG. 3 which forms a peroxide between oxygen at the C-6 position of the monomer structure shown in FIG. Table 2 shows the attribution of each signal in the 1 H-NMR and 13 C-NMR spectra.
  • Natural products with diphenyl peroxide structure are rare and known only in bungein A isolated as a plant component (Hui Yang, Ai-Jun Hou, Shuang-Xi Mei, Han-Dong Sun and Chun-Tao Che, 2002 , Constituents of Clerodendrum Bungei, Journal of Asian Natural Products Research, 4 165-169).
  • HK-1 activity measurement test [1. Antibacterial spectrum test] The antibacterial activity of HK-1 was assayed for the following cells using a paper disc.
  • One paper disk was placed on an exposed paper, 50 ⁇ l of HK-1 solution adjusted to 1000 ⁇ with methanol was dropped, dried and then placed on an agar medium coated with bacterial cells. After culturing at 60° C. for 18 hours, the diameter of the inhibition circle was measured.
  • B. subtilis, E. coli antibacterial assay Assay was performed in the same manner as in 1 above except that the culture temperature was changed to 37°C.
  • S. griseus antibacterial assay One piece of ice from S. griseus glycerol stock stored at -80°C on YMPD agar was inoculated on one side with a toothpick. It was cultured at 28°C for 5 days. After culturing, a small amount of spores were scraped off with a cotton swab and the whole surface was inoculated in YMPD medium. One paper disk was placed on an exposed paper, 50 ⁇ l of HK-1 solution adjusted to 1000 ⁇ with methanol was dropped, dried and then placed on an agar medium coated with bacterial cells. After culturing at 28°C for 4 days, the diameter of the inhibition circle was measured.
  • T. hazakensis, T. narukonensis antibacterial assay YS medium was assayed in the same manner as 3 above except that the culture was changed to 50°C for 2 days.
  • Streptomyces sp. AGRN-7 antibacterial assay Assay was carried out in the same manner as 3 above except that the culture was changed to ISP2 medium at 45°C for 2 days.
  • Streptomyces sp. AGRN-8, 9 antibacterial assay Assay was carried out in the same manner as 3 above except that the culture was changed to BM medium at 45°C for 2 days.
  • the diameter of the inhibition circle in each Gram-positive bacterium is B. subtilis 32.0 mm, G. stearothermophilus 34.0 mm, S. griseus 38.0 mm, and the HK-1 producing bacterium T. hazakensis is 10.0 mm and its related strain T. narukonensis also had the same 10.0 mm.
  • Streptomyces sp. AGRN-7 (16S rRNA gene sequence 99% similar to Streptomyces thermodiastaticus), which is a thermophilic actinomycete isolated from the compost of Agora Landscaping Co., Ltd., is 22.0 mm, Streptomyces sp.
  • AGRN-8 Streptomyces mexicanus The 16S rRNA gene sequence was 99% similar
  • AGRN-9 Streptomyces leeuwenhoeckii 99% 16S rRNA gene sequence 99% similar
  • E. coli a gram-negative bacterium, formed a 14.0 mm stop circle.
  • HK-1 has high antibacterial activity against Gram-positive bacteria. In addition, it has been found that it exhibits antibacterial activity against various thermophilic actinomycetes. It is known that the group of actinomycetes that produce antibiotics is highly resistant to the drug, but the results show that HK-1 is an effective antibiotic against the actinomycetes. It was Moreover, since it also exhibits antibacterial activity at a high concentration against T. hazakensis, which is a producing bacterium, it is possible that the producing bacterium may control the production amount of HK-1 to be below the lethal concentration. ..
  • the minimum inhibitory concentration is one of the antibiotic susceptibility tests and means the minimum concentration of an antimicrobial substance that inhibits visible growth of microorganisms. In the field of research, MIC measurement is also used to compare the effects of new antibiotics and conventional substances and to verify the effects on several strains, and it is an important criterion for evaluating antibiotics.
  • the MIC of the antibacterial active substance "HK-1" obtained this time was measured by a dilution method using a liquid medium.
  • ⁇ Experimental method> 1 Preparation of G. stearothermophilus bacterium solution
  • One piece of LB agar medium was inoculated with a toothpick on a piece of ice from a glycerol stock of G. stearothermophilus stored at -80°C.
  • the cells were cultured at 60°C for 18 hours.
  • 1 cm 2 of the medium was cut out with a toothpick, placed in a long test tube containing 10 ml of liquid LB medium, and cultured by shaking at 60° C., 300 rpm for 18 hours.
  • the culture solution was diluted to about McF standard solution No. 1 with sterile water.
  • HK-1 supplemented medium 2 mg HK-1 was weighed into a 2 ml Eppendorf tube using an electronic balance. To an Eppendorf tube, 2 ml of methanol was added and dissolved to obtain a 10 k ⁇ HK-1 solution. It was passed through a sterile 0.22 ⁇ m filter. Using 100 ⁇ l of HK-1 solution, 50 ⁇ l of 2-fold dilution series (10 k ⁇ to 19 ⁇ ) was prepared using methanol. Each 1% was added to a test tube containing 5 ml of LB liquid medium. The culture solutions prepared in 1 and 2 above were added to the test tube in an amount of 1% each. The culture was performed at each temperature (G.
  • stearothermophilus 60°C, B. subtilis, 37°C
  • 135 rpm 18 h.
  • visual observation and OD 600 were measured using a test tube obtained by adding 1% methanol and sterilized water to a 5 ml LB liquid medium as a control.
  • HK-1 has a relatively strong antibacterial effect on Bacillus subtilis B. subtilis and food spoilage-causing bacterium G. stearothermophilus.
  • ⁇ Preparation of Bacillus subtilis antibacterial activity assay medium (1) 100 ml of NB medium was prepared in a 200 ml Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave (121°C, 20 min). (2) After cooling to 50° C. or lower, 100 ⁇ l of B. subtilis spore suspension was added. (3) After stirring lightly, 10 ml each was dispensed into a petri dish. (4) After coagulation, it was stored at 4°C.
  • Typical tests for measuring the stability of a compound include a pH stability test, a heat resistance test, and a storage test. This information is also important in evaluating the compound as described above. Using the sample of HK-1 prepared in the above "3. Antibacterial activity test when pH was changed", G. stearothermophilus and B. subtilis were used as an index to examine whether the compound is stable or not.
  • ⁇ Experimental method> 1 Heat resistance test A 300 ⁇ l of the 1000 ⁇ HK-1 solution (pH 9 and unadjusted) prepared in “3. Antibacterial activity test when pH was changed” was dispensed into a 1 ml assist tube. The mouth of the tube was sealed with Parafilm, and the mixture was heated in a bath at 98°C for 5 minutes. The assay was carried out using the antibacterial activity assay medium prepared in "3. Antibacterial activity test when pH was changed”.
  • Heat resistance test B The two samples prepared in the above “3. Antibacterial activity test when pH was changed” were dispensed into 1-ml assist tubes in 1-ml aliquots. The mouths of a total of four tubes were sealed with parafilm, and each tube was stored in a freezer set at -28°C and an incubator set at 28°C and 50°C, protected from light with aluminum foil. Each sample was assayed using the antibacterial activity assay medium prepared in "3. Antibacterial activity test when pH was changed" 1, 3, 6, 12, 24 days after the start of storage.
  • the compound of the present invention is useful as an antibacterial agent.

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Abstract

抗菌活性を有する新規化合物、及びその製造方法を提供する。　式（Ｉ）：で表される化合物、又はその塩若しくはエステル。

Description

サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ　ｈａｚａｋｅｎｓｉｓ）由来の抗菌活性物質
　本発明は、抗菌活性を有する新規化合物、及びその製造方法に関する。
　サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Thermosporothrix hazakensis、以下「T. hazakensis」ともいう）は、クロロフレクサス門クテドノバクテリア綱クテドノバクテル目に属する細菌であり、好気性のグラム陽性細菌である。本発明者らにより、T. hazakensis SK20-1T株（= NBRC 105916T= JCM 16142T= ATCC BAA-1881T）が単離され、セルロース、キシラン、キチンを分解する能力を有することが示されている（非特許文献１）。これまでに、T. hazakensisに由来する抗菌活性物質は報告されているが（非特許文献２及び３）、さらなる抗菌活性物質が求められていた。
S. Yabe, et. al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2010), 60, 1794-1801 J.S. Park, et. al., Chem Bio Chem (2014), 15, 527-532 J.S. Park, et. al., The Journal of Antibiotics (2015), 68, 60-62
　本発明は、抗菌活性を有する新規化合物、及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、T. hazakensis SK20-1T株（= NBRC 105916T= JCM 16142T= ATCC BAA-1881T）より、新規抗菌活性物質を見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下の発明を包含する。
（１）式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 で表される化合物、又はその塩若しくはエステル。
（２）UVスペクトルにおいて340 nmに吸収極大を有し、モル吸光係数が30630であり；
　ESI/TOF/MSスペクトル及び高分解能マススペクトルによる解析から分子式がC74H58Cl8O26であり；
　1H NMRスペクトル（DMSO－d6）が、δ11.49、10.92、6.67、6.41、6.21、6.00、5.91、4.95、4.26、3.96、3.95、3.79、3.71、3.70、2.69、2.19、及び0.90にシグナルを有し；
　13C NMRスペクトル（DMSO－d6）が、δ 188.61、184.49、162.20、159.96、158.11、155.76、155.25、150.91、140.73、140.25、140.25、138.20、137.79、137.26、134.60、133.53、132.77、125.42、121.51、120.24、119.19、114.71、111.89、109.54、102.99、99.78、98.55、77.15、72.75、70.21、67.00、61.20、60.68、56.94、17.83、15.90、及び14.96にシグナルを有する化合物、又はその塩若しくはエステル。
（３）サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Thermosporothrix hazakensis）を培地に培養して、その培養物から採取することにより得られる、上記（２）に記載の化合物、又はその塩若しくはエステル。
（４）培養物のアセトン水溶液抽出物を酢酸エチルと水とで分配して得られた酢酸エチル抽出物を、シリカゲルカラムにより処理して採取する、上記（３）に記載の化合物、又はその塩若しくはエステル。
（５）サーモスポロスリックス・ハザケンシスが、サーモスポロスリックス・ハザケンシスSK20-1T株である、上記（３）又は（４）に記載の化合物、又はその塩若しくはエステル。
（６）サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Thermosporothrix hazakensis）を培地に培養し、その培養物から上記（１）～（５）のいずれかに記載の化合物、又はその塩若しくはエステルを採取することを含む、上記（１）～（５）のいずれかに記載の化合物、又はその塩若しくはエステルの製造方法。
（７）培養物のアセトン水溶液抽出物を酢酸エチルと水とで分配して得られた酢酸エチル抽出物を、シリカゲルカラムにより処理して上記（１）～（５）のいずれかに記載の化合物、又はその塩若しくはエステルを採取する、上記（６）に記載の方法。
（８）サーモスポロスリックス・ハザケンシスが、サーモスポロスリックス・ハザケンシスSK20-1T株である、上記（６）又は（７）に記載の方法。
（９）上記（１）～（５）のいずれかに記載の化合物、又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する抗菌剤。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる国際出願番号PCT/JP2019/003813号及び日本国特許出願番号2019-138058号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、T. hazakensis SK20-1T株（= NBRC 105916T= JCM 16142T= ATCC BAA-1881T）に由来する新規抗菌活性物質、及びその製造方法を提供することができる。
図１－１は、HK-1の1H-NMRスペクトルを示す図である。 図１－２は、HK-1の13C-NMRスペクトルを示す図である。 図１－３は、HK-1のCOSYスペクトルを示す図である。 図１－４は、HK-1のHSQCスペクトルを示す図である。 図１－５は、HK-1のHMBCスペクトルを示す図である。 図１－６（ａ）は2.19 ppmを照射した際のHK-1の1D-ROESYスペクトルを示す図、図１－６（ｂ）はその拡大図である。 図１－７（ａ）は6.21 ppmを照射した際のHK-1の1D-ROESYスペクトルを示す図、図１－７（ｂ）はその拡大図である。 図１－８は、HK-1のNMRスペクトル解析の結果を示す図である。 図１－９は、HK-1の重水素置換による同位体シフトを観測した13C-NMRスペクトルを示す図である。 図２は、HK-1のモノマー構造を示す図である。 図３は、HK-1の平面構造を示す図である。 図４－１は、pH変動後の高熱処理したHK-1抗菌活性測定の結果を示す図である。 図４－２は、pH変動及び保管温度と時間の経過に伴うB. subtilisに対する抗菌活性測定の結果を示す図である。 図４－３は、pH変動及び保管温度と時間の経過に伴うG. stearothermophilusに対する抗菌活性測定の結果を示す図である。
　本発明は、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で表される化合物、又はその塩若しくはエステルに関する（以下、本発明の化合物ともいう）。本発明の化合物は高い抗菌活性を有する。本発明の化合物は特にグラム陽性細菌に対して高い抗菌活性を有する。
　式（Ｉ）の化合物は、以下の構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 が二量体となった構造を有する。当該二量体はC-6位の酸素を介したペルオキシド形成によるものである。式（Ｉ）の化合物に不斉炭素が存在する場合は、全ての鏡像異性体及びそれらの混合物が含まれ、立体異性体が存在する場合は、全ての立体異性体及びそれらの混合物が含まれる。式（Ｉ）の化合物は、水和物、溶媒和物又は結晶多形を形成してもよい。C-10位のグリコシド結合はα結合及びβ結合のいずれであってもよい。
　また本発明は、以下の理化学的性質：
　UVスペクトルにおいて340 nmに吸収極大を有し、モル吸光係数が30630であり；
　ESI/TOF/MSスペクトル及び高分解能マススペクトルによる解析から分子式がC74H58Cl8O26であり；
　1H NMRスペクトル（DMSO－d6、J＝Hz）が、δ11.49、10.92、6.67、6.41、6.21、6.00、5.91、4.95（d， 4．7）、4.26、3.96、3.95、3.79、3.71、3.70、2.69、2.19、及び0.90（d， 5．7）にシグナルを有し；
　13C NMRスペクトル（DMSO－d6）が、δ 188.61、184.49、162.20、159.96、158.11、155.76、155.25、150.91、140.73、140.25、140.25、138.20、137.79、137.26、134.60、133.53、132.77、125.42、121.51、120.24、119.19、114.71、111.89、109.54、102.99、99.78、98.55、77.15、72.75、70.21、67.00、61.20、60.68、56.94、17.83、15.90、及び14.96にシグナルを有する化合物、又はその塩若しくはエステルにも関する。当該理化学的性質を有することは以下の実施例において実証されている。上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルは高い抗菌活性を有する。上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルは特にグラム陽性細菌に対して高い抗菌活性を有する。上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルに不斉炭素が存在する場合は、全ての鏡像異性体及びそれらの混合物が含まれ、立体異性体が存在する場合は、全ての立体異性体及びそれらの混合物が含まれる。上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルは、水和物、溶媒和物又は結晶多形を形成してもよい。また式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルをまとめて本発明の化合物ともいう。
　式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物の塩としては、特に限定されることなく種々の塩を用いることができる。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリエチルアミン塩等の有機アミン塩等を挙げることができる。さらに、これらの塩は、水和物、溶媒和物又は結晶多形を形成してもよい。
　式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物のエステルとしては、特に制限はなく、例えば、酢酸等の脂肪酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸とのエステル等を挙げることができる。脂肪酸とは飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を含み、鎖長については短鎖、中鎖及び長鎖を含み、具体的には酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリル酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、デセン酸、オレイン酸、エルシン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、及びエイコサペンタエン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。また芳香族脂肪酸とは、安息香酸、安息香酸のオルト、メタ及び／又はパラ位にアミノ基、水酸基等の置換基を有するものも含まれ、ナフトエ酸等の多環芳香族のカルボン酸も含む。式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）中の水酸基の内１～１２個の位置、好ましくは、C-3’、C-6’、C-8’、C-10’、C-2”、及びC-3”位から選択される少なくとも１つの炭素に結合する水酸基においてエステルを形成しうる。これらのエステルは、常法に従い、例えば、酸性触媒下、対応するカルボン酸と式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物とを反応させることで得ることができる。
　本発明は、サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Thermosporothrix hazakensis）を培地に培養し、その培養物から式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルを採取することを含む、式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルの製造方法にも関する（以下、本発明の製造方法ともいう）。本発明の製造方法によれば、本発明の化合物を高い収率で得ることができる。
　本発明の製造方法におけるT. hazakensisの培養は、通常の微生物の培養方法が用いられる。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機物及び必要な生育・生産促進物質を適宜含有する培地であれば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜等を単独又は組み合わせて用いられる。さらに、必要に応じて炭化水素、アルコール類、有機酸、アミノ酸（トリプトファン等）等も用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実かす、カザミノ酸等が単独又は組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等の無機塩類を加える。さらに使用する微生物の生育や本発明の化合物の生産を促進する微量成分を適当に添加することができ、そのような成分は当業者であれば適当なものを選択することができる。
　かかる栄養培地でのT. hazakensisの培養は、一般の微生物による抗生物質の製造において通常使用されている方法に準じて行なうことができる。通常は好気条件下に培養するのが好適であり、通常は攪拌しながら及び／又は通気しながら行なうことができる。また、培養方法としては静置培養、振盪培養、通気攪拌をともなう液体培養のいずれも使用可能であるが、振盪培養が適している。
　使用しうる培養温度はT. hazakensisの発育が実質的に阻害されず、該抗生物質を生産しうる範囲であれば、特に制限されるものではなく、適宜選択できる。特に好ましいのは３５～５０℃の範囲内の培養温度を挙げることができる。培地のｐＨは３～１１で培養することができ、６～１０が望ましい。培養は通常は抗生物質が十分に蓄積するまで継続することができる。その培養時間は培地の組成や培養温度、使用温度、使用生産菌株等により異なるが、通常２～８日間の培養で目的の抗生物質が培養液中及び菌体中に生成蓄積される。
　培養物中の新規抗生物質の蓄積量は検定菌としてGeobacillus stearothermophilus ATCC 7953株及び／又はBacillus subtilis NBRC 3134T株を使用して、通常の抗生物質の活性試験に用いられるペーパーディスク法により定量することができる。
　培養物及び菌体中に蓄積された新規抗生物質は、これを培養物から採取する。培養後、必要により、濾過、遠心分離等のそれ自体公知の分離方法によって菌体と上清を分離後、その上清は有機溶媒、特にアセトン等を用いた溶媒抽出や、吸着やイオン交換能を利用したクロマトグラフィー、ゲルろ過、液液分配を利用したクロマトグラフィーを単独で又は、組み合わせて使用することにより培養上清から新規抗生物質を単離精製して採取することができる。吸着やイオン交換能を有するクロマトグラフィー用担体としては、活性炭、シリカゲル、多孔性ポリスチレン・ジビニルベンゼン樹脂若しくは各種のイオン交換樹脂を用いることができる。菌体は50％アセトン抽出後、上清と同様各種クロマトグラフィーを単独で又は、組み合わせて使用することにより単離精製する。新規抗生物質は、培養物のアセトン水溶液抽出物を酢酸エチルと水とで分配して得られた酢酸エチル抽出物を、シリカゲルカラムにより処理して得ることが好ましい。また、シリカゲルカラムの移動相としては酢酸エチルを用いることが好ましい。かくして、前記した特性を有する新規抗生物質が得られる。
　式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物の抗菌活性について検討を行った結果、Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953株、Bacillus subtilis NBRC 3134T株、Streptomyces griseus NBRC 15744T株、Escherichia coli NBRC 102203T株、Thermosporothrix hazakensis SK20-1T/NBRC 105916T株、Thermosporothrix narukonensis F4T株、Streptomyces sp. AGRN-7株、Streptomyces sp. AGRN-8株、及びStreptomyces sp. AGRN-9株に対して特に優れた抗菌活性を有することを見出した。
　本発明は、式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する抗菌剤にも関する（以下、本発明の抗菌剤ともいう）。本発明の抗菌剤は、有効成分としての式（Ｉ）の化合物又は上記理化学的性質を有する化合物、又はその塩若しくはエステルを常用の液体又は固体担体、例えばエタノール、水、デンプン等と混和してなる組成物の形で調合して使用してもよい。有効濃度は、抗菌性を発揮できる範囲内であれば特に限定されないが、例えば、1～1000μg/mlとすることができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］Thermosporothrix hazakensis SK20-1Tが生産する抗菌活性物質「HK-1」の精製
＜使用菌株＞
　Thermosporothrix hazakensis SK20-1T/NBRC 105916T
＜使用培地＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜実験方法＞
１．T. hazakensisの培養
　１．１　菌起こし
　300 ml三角フラスコにYS培地を250 ml作成し、オートクレーブで滅菌処理(121℃、20 min)を行った。50℃以下に冷ました後、シャーレに25 mlずつ分注した(プレート10枚作成)。YS培地1枚に-80℃保管のT. hazakensisのグリセロールストックから氷一かけら分を爪楊枝で放射状に植菌した。50℃で4日間静置培養した。
　１．２　シード培養
　500 mlバッフル付き三角フラスコにLB(+M)培地を100 ml作成し、オートクレーブで滅菌処理(121℃、20 min)を行った。50℃以下に冷ました後、「１．１　菌起こし」で植菌したプレートからT. hazakensisを1 cm2爪楊枝で抜き取り植菌した。振盪培養器にて45℃、135 rpmで24時間培養した。
　１．３　ジャーファーメンターによる培養
　DIAION HP-20(日本錬水株式会社)を4 Lミニジャー(ABLE株式会社)2つと5 Lミニジャー(株式会社丸菱バイオエンジン)1つにそれぞれ10 g、15 g加えた。R2A(+L)培地を10 Lプラスチックビーカーにて7 L作成し、4 Lミニジャーにそれぞれ2 Lずつ、5 Lミニジャーに3 L添加し、オートクレーブで滅菌処理した(121℃、15 min)。滅菌処理後、1日静置し、培地を冷ました。各ミニジャーにおける培地量の0.1%のシード培養したT. hazakensisを植菌した。制御装置に接続後、培地量の半分の空気を入れ、45℃で、回転数は4 Lミニジャーでは160 rpm、5 Lミニジャーでは135 rpmで4日間振盪培養を行った。
２．抽出実験
　２．１　抽出
　各ミニジャーにおけるHP-20添加培養液28 L全量を合併し、DIAMETER 315・OPENING 200 μm、DIAMETER 200・OPENING 300 μmの篩にあけ、菌体とHP-20を回収した。500 ml遠心管4本に等量分注し、サンプルと等量の100%アセトンを加えた。激しく撹拌した後、往復振盪培養器(135 rpm)で30分間振盪した。遠心管を冷却遠心機(4℃、6,000 rpm、10 min)で遠心した。遠心から得られた上清を桐山ロートで吸引濾過し、ろ液をナスコルベン(エバポレーター用)に移し替えた後、エバポレーターで蒸留し、試料中のアセトンを除去した。濃縮液計 2.8 Lを4℃室で保存した。
　２．２　液液分配
(１)アセトン水溶液抽出試料をエバポレーターで800 mlまで濃縮し、アセトンを完全に飛ばした。
(２)得られた試料を6 N塩酸を用いてpH 5.7に調整した。
(３)3,000 ml分液ロートに全量入れ、400 mlの酢酸エチルを加えた。
(４)分液ロートを15～30秒間激しく撹拌し、口を上に向け、栓を開放しガスを排出した。
(５)上記(４)の動作を5、6回繰り返した後、溶液が分離するまで静置した。
(６)下層と上層を2,000 ml三角フラスコに分け、上層を酢酸エチル抽出液とした。
(７)下層を上記(３)～(６)と同様手順で2回繰り返した。
(８)酢酸エチル抽出液を全量合併し、3,000 ml分液ロートに入れ、500 mlの5％炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。
(９)上記(４)～(５)の動作を行った後、下層を抽出液とし、500 ml分取した。
(１０)上層を上記(８)～(９)と同様手順で再度繰り返した。
(１１)得られた下層1,000 mlを6 N塩酸でpH 5.7に調整した。
(１２)下層全量を3,000 ml分液ロートに入れ、等量の酢酸エチルを加えた。
(１３)上記(４)～(６)の動作を行った後、上層を抽出液とし、500 ml分取した。
(１４)下層を上記(３)～(６)と同様手順で2回繰り返した。
(１５)酢酸エチル抽出液を全量合併し、無水硫酸ナトリウムを適量加え(水分がなくなり固形になる程度)、15分室温放置した。
(１６)露紙で濾過した後、エバポレーターを用いて乾固した。
(１７)電子天秤を用いて収量を測定した。
３．シリカゲルカラムクロマトグラフィー
　50 gのC-200シリカゲル(Wakogel(R) C-200、富士フィルム和光純薬)を100 mlの酢酸エチルで懸濁し、カラムに流し込んだ。カラムを外側から軽くたたき、シリカゲル懸濁液を滴下した。乾固した酢酸エチル抽出物を6 mlの酢酸エチルで溶かし、カラムに充填した。上部から酢酸エチルを追加し、目的物の色(黄色)が下部に到達した時点から、溶出液を試験管に15 mlずつ分取した。分取したフラクションに呈色を示さなくなったら溶媒を酢酸エチル：メタノール=1：1に変更し、溶出液に色がなくなるまで分取した。
４．薄層クロマトグラフィー
　分取した酢酸エチル溶出液を一つおきにキャピラリーを用いてTLCプレート(Silica gel 60 F254、MERCK KGaK)上にスポットした。ドライアーで乾燥させた後、展開液(酢酸エチル：酢酸=4 ml：0.5 ml)を用いて展開した。展開液がTLCプレート上部1 cm程度に達した後、展開層から取り出し、ドライアーで乾燥させた。TLCプレートをUV254 nm及びUV325 nm照射下でスポットを検出した。夾雑スポットの少ないフラクションをエバポレーターを用いて濃縮した後、デシケーターで乾固した。電子天秤を用いて収量を測定した。
＜結果＞
　培養液に添加したHP-20及び菌体の50%アセトン抽出液を濃縮後、酢酸エチルで抽出したところ1.0 gの抽出物が得られた。得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、酢酸エチルで溶出した。溶出液は分画し、各画分をTLCで分析した結果、18～25番目のフラクションに単一スポット(Rf=0.74、以下、HK-1という)が確認された。18～25番目のフラクションからHK-1は240 mg得られた。
［実施例２］HK-1の構造解析
［１．HK-1の物性及び化学的性質］
＜実験方法＞
１．MS
　少量のHK-1をメタノールに溶解させた。ESI(-)/TOF-MSスペクトル解析に供した。分析機器は以下の通りである。
　　Agilent 1110 series(ポンプ)
　　The Accu TOF JMC-T100LC(MS)
２．HRMS
　国立医薬品食品研究所へ測定を依頼した。HRMSは(M-H)-イオンのプロファイルを解析した。分析機器は以下の通りである。
　　Agilent 1200 series（ポンプ）
　　Agilent 6530 Q-TOF（MS）
３．UV
　少量のHK-1をメタノールに溶解させJASCO V-630 Spectrophotometerで吸収極大を測定した。
４．pH安定性
　50 mlファルコンチューブに20 mgのHK-1を電子天秤で測り取り、20 mlのメタノールを加え軽く撹拌した(1000 γ)。15 mlファルコンチューブに3.3 mlずつ計2本に分注した。そのうちの1本に1 Nの水酸化ナトリウムを20 μl加え軽く撹拌した。pH試験紙でpHを確認した。各試料を10 μlずつHPLCに供した。HPLC分析条件は以下の通りである。
　　カラム：CAPCELL PAK C185 μm 4.6 mm l.D×150 mm
　　移動相A：0.1％トリフルオロ酢酸水溶液
　　移動相B：アセトニトリル
　　カラム恒温槽の温度：40℃
　　流速：1 ml/min
　　UV：254 nm
　　溶出方法：濃度勾配 0分～18分 B濃度50%～100%
　　　　　　　　　　　18.1分～23分 B濃度100%
　　　　　　　　　　　23.1分～25分 B濃度50% 
＜結果・考察＞
　HK-1は薄い黄色を呈する粉末で、そのメタノール溶液も同様の呈色を示した。HK-1を紫外可視分光光度計で測定したUVスペクトルでは、340 nmに吸収極大が認められ、モル吸光係数は30630であった。ネガティブモードで測定したESI/TOF/MSスペクトルでは、m/z 1645付近に(M-H)-イオンと考えられるイオンが観測され、シグナルパターンからハロゲン原子が含まれていることが示唆された。またm/z 822付近に(M-2H)2-イオンと考えられるイオンが観測された。さらに、HRMSでm/z 1645付近のイオンのプロファイルを解析した結果、HK-1は8つの塩素原子を持つ分子式C74H58Cl8O26の化合物であることが判明した。HK-1をpH無調整、pH 9に調製した溶液はHPLCにおいて分解物ピークが観測されず、安定であることがわかった。また比旋光度は[α]24 D-49 (c= 1.0, DMSO)であった。
［２．HK-1のNMRスペクトル］
＜実験方法＞
　80 mgのHK-1を0.75 mlのジメチルスルホキシド-d6,99.9%D(NMR用、関東化学株式会社)に溶解した。パスツールピペットに石英綿を詰め、溶解したHK-1溶液を通し、NMR管に充填した。キャップを閉め、パラフィルムで密閉し、遮光して測定した(NMR機器、Varian Inova 500)。
＜結果・考察＞
　HK-1の1H-NMR、13C-NMR、COSY、HSQC、及びHMBCスペクトルを図１－１～図１－５に示す。さらに、2.19 ppm及び6.21 ppmでそれぞれ照射した際のHK-1の1D-ROESYスペクトルを図１－６及び図１－７に示す。1D-ROESYスペクトル（図１－６）において、H-11位（2.19 ppm）を照射した際にメトキシプロトン(H-13位)でROEが観測されたことから、メトキシ基(C-13位)の位置はC-8位であると決定した。これらのNMRスペクトルの解析により、HK-1には図１－８に示した部分構造が存在することが明らかになった。この部分構造には13C-NMR スペクトルで観測される炭素シグナル37本が全て含まれていることより、この部分構造が二量体となった構造をHK-1は有することが示唆された。
［３．塩酸による加水分解反応］
＜実験方法＞
１．加水分解
　1 mgのHK-1をスターラーバー入り20 ml容ナスフラスコに入れた。1 mlのアセトニトリルを加えゆっくり撹拌しながら、1 mlの1 M塩酸を数滴ずつゆっくり加えた。混合液をオイルバス上で30分間加熱還流し、室温へ戻した後、凍結乾燥した。
２．HRMS
　凍結乾燥後の塩酸加水分解物について、国立医薬品食品衛生研究所へ測定を依頼した。HRMSは(M-H)-イオン付近のプロファイルを解析した。分析機器は以下の通りである。
　　Agilent 1200 series（ポンプ）
　　Agilent 6530 Q-TOF（MS）
＜結果・考察＞
　HK-1を0.5 Mの濃度で塩酸を含む50%アセトニトリル中、加熱還流により加水分解した後、加水分解物をそのままネガティブモードのQ-TOF/MSにより分析した。得られたマススペクトルでは、m/z 1413を最大強度とするイオンが観測され、HRMSにより、加水分解物の分子式はC64H42Cl8O20であることが分かった。この加水分解物の分子式は、HK-1の2つの5-デオキシフラノサイドが加水分解により除去された場合に生じるアグリコンのものと一致した。したがって、HK-1の5-デオキシフラノサイドの3位の炭素には水酸基が結合することが示された。
［４．13C-NMRスペクトル解析］
　これまでの解析により、HK-1は図１－８の部分構造のC-3”に水酸基が結合したものが二量体となった構造を有すると考えられた。モノマー部分に塩素原子を4個加えると、HK-1のモノマー構造部分の分子式を満たすことになる。図１－８において、塩素原子が結合することができる炭素は、C-2、C-4、C-6、C-2’及びC-5’であるが、C-6には酸素が結合していることより、塩素原子はC-2、C-4、C-2’及びC-5’に結合することが明らかとなった。
［５．水酸基の結合位置の確認］
　HK-1に存在する6個の水酸基の結合位置を、水酸基が結合した炭素の13C-NMRスペクトルでのケミカルシフトが、D2O中とH2O中で同位体シフトにより異なることで水酸基が結合した炭素を決定する手法を用いて確認した。D2O及びH2O溶液がそれぞれ入った二重管NMRチューブを用いて測定したところ図１－９の13C-NMRスペクトルが得られ、水酸基が結合したC-3’、C-6’、C-8’、C-10’、C-2”及びC-3”ではシグナルが2本観察され、６個の水酸基の結合位置が確認された。
［６．HK-1の構造］
　以上よりHK-1は、図２に示すモノマー構造のC-6位の酸素間でペルオキシドを形成する、図３に示す二量体構造であることが判明した。表２には1H-NMR及び13C-NMRスペクトルにおける各シグナルの帰属を示した。ジフェニルパーオキサイド構造を持つ天然物は珍しく、植物成分として単離されたbungein Aにおいてのみ知られる(Hui Yang, Ai-Jun Hou, Shuang-Xi Mei, Han-Dong Sun and Chun-Tao Che, 2002年, Constituents of Clerodendrum Bungei, Journal of Asian Natural Products Research, 4 165-169)。5-デオキシフラノサイドの5つの炭素のケミカルシフト（99.78(C-1”)、72.75(C-2”)、70.21(C-3”)、77.15(C-4”)及び15.90(C-5”)）から、C-10位にグリコシド結合しているのは、5-デオキシ-β-リキソフラノース(5-deoxyl-β-lyxofuranose)であるとした(Joseph R, Snyder and Anthony S. Serianni, 1987 年, Synthesis and N.M.R.-spectral analysis of unenriched and [1-13C]-enriched 5-deoxypentoses and 5-O-methylpentoses, Carbohydrate Research, 163(1987) 169-188)。5-デオキシリキソース(5-deoxylyxose)はこれまで天然物として得られた報告はなく、HK-1において初めてとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例３］HK-1の活性測定試験
［１．抗菌スペクトラム試験］
　HK-1の抗菌活性を下記の菌体についてペーパーディスクを用いてアッセイした。
＜使用菌株＞
　Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953
　Bacillus subtilis NBRC 3134T
　Streptomyces griseus NBRC 15744T
　Escherchia coli NBRC 102203T
　Thermosporothrix hazakensis SK20-1T/NBRC 105916T
　Thermosporothrix narukonensis F4T
　Streptomyces sp. AGRN-7
　Streptomyces sp. AGRN-8
　Streptomyces sp. AGRN-9
＜使用培地＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜実験方法＞
１．G. stearothermophilus抗菌アッセイ
　LB寒天培地(実施例１参照)に-80℃保管のG. stearothermophilusグリセロールストックから氷1かけらを爪楊枝で一面植菌した。60℃、18 h培養した。培養後、500 μlの滅菌水に1/2白金耳採取して懸濁した。懸濁した菌液を滅菌水で10 倍に希釈した。LB寒天培地に希釈液100 μl滴下し、スプレッターで乾くまで塗布した。露紙上にペーパーディスク1枚を置き、メタノールで1000 γに調整したHK-1溶液を50 μl滴下し、乾燥させた後、菌体を塗布した寒天培地上に置いた。60℃、18 h培養した後、阻止円の直径を測定した。
２．B. subtilis、E. coli抗菌アッセイ
　培養温度を37℃に変更した以外は、上記１と同様にしてアッセイした。
３．S. griseus抗菌アッセイ
　YMPD寒天培地に-80℃保管のS. griseusグリセロールストックから氷1かけらを爪楊枝で一面植菌した。28℃、5日間培養した。培養後、胞子を綿棒で少量かきとり、YMPD培地に一面植菌した。露紙上にペーパーディスク1枚を置き、メタノールで1000 γに調整したHK-1溶液を50 μl滴下し、乾燥させた後、菌体を塗布した寒天培地上に置いた。28℃、4日間培養した後、阻止円の直径を測定した。
４．T. hazakensis、T. narukonensis抗菌アッセイ
　YS培地(実施例１参照)、50℃、2日間培養に変更した以外は、上記３と同様にしてアッセイした。
５．Streptomyces sp. AGRN-7抗菌アッセイ
　ISP2培地、45℃、2日間培養に変更した以外は、上記３と同様にしてアッセイした。
６．Streptomyces sp. AGRN-8、9抗菌アッセイ
　BM培地、45℃、2日間培養に変更しした以外は、上記３と同様にしてアッセイした。
＜結果・考察＞
　各グラム陽性細菌における阻止円の直径は、B. subtilis 32.0 mm、G. stearothermophilus 34.0 mm、S. griseus 38.0 mmであり、HK-1生産菌T. hazakensisは10.0 mm、その類縁株であるT. narukonensisも同じ10.0 mmであった。また、アゴラ造園株式会社の堆肥から分離された好熱性放線菌であるStreptomyces sp. AGRN-7(Streptomyces thermodiastaticus に16S rRNA遺伝子配列が99%類似)は22.0 mm、Streptomyces sp. AGRN-8(Streptomyces mexicanus に16S rRNA遺伝子配列が99%類似)は16.0 mm、Streptomyces sp. AGRN-9(Streptomyces leeuwenhoeckiiに16S rRNA遺伝子配列が99%類似)は19.0 mmの阻止円を形成した。また、グラム陰性細菌であるE.coli は14.0 mmの阻止円を形成した。
　阻止円の大きさから、HK-1はグラム陽性細菌に対し高い抗菌活性能力を保持していることが示された。また、種々の好熱性放線菌に対しても抗菌活性を示すことが判明した。抗生物質を生産する放線菌群は薬剤に対し高い耐性を有することが知られているが、今回の結果より、HK-1はその放線菌に対しても有効な抗生物質であることが示された。そして、生産菌であるT. hazakensis自身に対しても高濃度で抗菌作用を示すことから、生産菌はHK-1の生産量を致死濃度を下回るように制御している可能性が考えられた。
［２．最小生育阻止濃度の測定］
　最小発育阻止濃度(MIC)とは抗生物質感受性試験の一つで、微生物の視認できる発育を阻止する抗微生物物質の最小濃度を意味する。研究現場において、新しい抗生物質と従来の物質との効果の比較や数種の菌株に対する作用の検証にもMIC測定が用いられ、抗生物質の評価する上で重要な判断基準とされている。今回得られた抗菌活性物質「HK-1」について液体培地による希釈法を用いてMICを測定した。
＜使用菌株＞
　Geobacillus stearothermophilus 111499　　　MERCK (ATCC 7953)
　Bacillus subtilis NBRC 3134T
＜使用培地＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜実験方法＞
１．G. stearothermophilus菌液の調製
　LB寒天培地1枚に-80℃保管のG. stearothermophilusのグリセロールストックから氷一かけらを爪楊枝で一面植菌した。60℃、18 h培養した。培地1 cm2を爪楊枝でくり抜き、液体LB培地10 ml入り長試験管に入れ、60℃、300 rpm、18 h振盪培養した。培養液を滅菌水でMcF標準液 No.1程度に希釈した。
２．B. subtilis菌液の調製
　温度のみ37℃に変更した以外は、上記１と同様にして調製アッセイした。
３．HK-1添加培地の作成
　2 mlエッペンチューブに電子天秤で2 mgのHK-1を量り取った。エッペンチューブに2 mlのメタノールを加え溶解し、10 kγのHK-1溶液とした。滅菌済み0.22 μmのフィルターに通した。100 μlのHK-1溶液を使用し、メタノールを用いて50 μlの2倍希釈系列(10 kγから19 γ)を作成した。LB液体培地5 mlの入った試験管に各1%ずつ添加した。上記１及び２で作成した培養液を各1%ずつ試験管に加えた。各温度(G. stearothermophilus、60℃、B. subtilis、37℃)、135 rpm、18 hで培養した。培養後、目視観察及びOD600を5 ml LB液体培地に1%のメタノールと滅菌水を加えた試験管をコントロールとして測定した。
＜結果・考察＞
　HK-1は両菌株ともに0.78 μg/mlの濃度まで生育を阻害した。OD600測定結果からは、混濁が観察された0.78 μg/ml以下の試験管では顕著な差は観られなかった。高濃度のHK-1添加培地は通常のLB培地と比較すると若干の黄色を呈していた。培養後も色は変化しなかった。
　上記結果より、枯草菌B. subtilis及び食料腐敗原因菌G. stearothermophilusにおいてHK-1は比較的強い抗菌効果を有することが示された。
［３．pH変更時の抗菌活性試験］
　化合物の安定性は物質を評価する上で重要な情報の一つとされている。外部環境に変化が生じても化合物自体が安定であれば、様々な場面での応用が可能となり、またその情報から生物学的知見の獲得にも繋がるからである。よって上記「１．抗菌スペクトラム試験」で調製した溶液を用いてG. stearothermophilus及びB. subtilisによる抗菌活性測定を行い活性の安定性を調べた。
＜使用菌株＞
　Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953
　Bacillus subtilis NBRC 3134T
＜使用培地＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
＜実験方法＞
１．抗菌活性検定用培地の作成及びアッセイ
　１．１　Bacillus subtilis 抗菌活性検定用培地 (プレート10枚分)
　＜ Bacillus subtilis 芽胞懸濁液の作成＞
(１)300 ml三角フラスコにLB培地を250 ml作成し、オートクレーブで滅菌処理(121℃、20 min)を行った。
(２)50℃以下に冷ました後、シャーレに25 mlずつ分注した(プレート10枚作成)。
(３)LB寒天培地(実施例１参照)10枚に各30 μlずつB. subtilis胞子液を綿棒で一面植菌した。
(４)37℃で1週間静置培養した。
(５)滅菌した脱脂綿1枚に滅菌水を3 ml加え、プレート1枚分の胞子をかきとった。
(６)1 mlシリンジで脱脂綿から約3 mlの菌液を吸い取り、滅菌した50 mlファルコンチューブに移した。
(７)上記(５)及び(６)を計10回行った。
(８)約30 mlの菌液が入った50 mlファルコンチューブを30分、60℃の浴槽で加温した。
(９)冷却遠心機で遠心(6,000 rpm、10 min、4℃)し、上清を捨てた。
(１０)沈殿に30 mlの滅菌水を加え、撹拌した。
(１１)上記(９)及び(１０)を計2回行った。
(１２)冷却遠心機で遠心(6,000 rpm、10 min、4℃)し、上清を捨てた後、沈殿が溶ける程度少量の滅菌水を加えた。
(１３)30分間、60℃の浴槽で加温した。
(１４)4℃で保存し、これをB. subtilis芽胞懸濁液とした。
　＜ Bacillus subtilis 抗菌活性検定用培地の作成＞
(１)200 ml三角フラスコにNB培地を100 ml作成し、オートクレーブで滅菌処理(121℃、20 min)を行った。
(２)50℃以下に冷ました後、B. subtilis芽胞懸濁液を100 μl添加した。
(３)軽く撹拌したのち10 mlずつシャーレに分注した。
(４)凝固後、4℃で保存した。
　アッセイ時、37℃で18時間インキュベートした。
　１．２　Geobacillus stearothermophilus抗菌活性検定用培地 (プレート10枚分)
(１)長試験管2本にLB培地(実施例１参照)(オートクレーブ済み)を10 ml分注した。
(２)各長試験管に市販のG. stearothermophilus芽胞懸濁液を50 μl植菌した。
(３)各長試験管を60℃、300 rpmで24時間振盪培養した。
(４)200 ml三角フラスコにAM2培地を100 ml作成し、オートクレーブで滅菌処理(121℃、20 min)した。
(５)上記培地を50℃以下に冷ました後、G. stearothermophilus培養液を20 ml添加した。
(６)軽く撹拌したのち10 mlずつシャーレに分注した。
(７)凝固後、4℃で保存した。
　アッセイ時、50℃で18時間インキュベートした。
　１．３　各抗菌活性検定用培地の活性測定方法：ペーパーディスクアッセイ
　各菌体重層培地(B. subtilis、G. stearothermophilus)の上に50 μlの試料を浸したペーパーディスクを置いた。培地をインキュベートした。インキュベーターから培地を取り出し、阻止円の直径をノギス(kanon hardened stainless 150 mm)で測定した。
＜結果・考察＞
　B. subtilisでは、pH 無調整の溶液の阻止円直径は18.5 mmであったのに対し、pH 9に調整した溶液は20.2 mmであった。G. stearothermophilusでは、pH 無調整の溶液の阻止円直径は21.9 mmであったのに対し、pH 9に調整した溶液は22.6 mmであった。塩基性に調整した溶液はコントロールと比較して阻止円が多少大きくなった。
［４．温度変動時の安定性試験］
　化合物の安定性を測定する上で代表的な試験は、pH安定性試験のほかに耐熱性試験、保存試験等が挙げられる。これらの情報も上述したように化合物を評価する上で重要とされている。上記「３．pH変更時の抗菌活性試験」で調製したHK-1の試料を用い、化合物が安定であるか抗菌活性を指標に、G. stearothermophilus及びB. subtilisを使用し実験を行った。
＜使用菌株＞
　Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953
　Bacillus subtilis NBRC 3134T
＜実験方法＞
１．耐熱性試験Ａ
　上記「３．pH変更時の抗菌活性試験」で調製した1000 γHK-1溶液(pH 9及び無調整)を1 ml容アシストチューブに300 μl分注した。チューブの口をパラフィルムで密閉し、98℃で5分間温浴させた。上記「３．pH変更時の抗菌活性試験」で作成した抗菌活性検定用培地を用いてアッセイした。
２．耐熱性試験Ｂ
　上記「３．pH変更時の抗菌活性試験」で調製した2つの試料を1 ml容アシストチューブに1 mlずつ各2本に分注した。計4つのチューブの口をパラフィルムで密閉し、それぞれ-28℃設定したフリーザー及び28℃、50℃に設定したインキュベーター内に各1本ずつアルミホイルで遮光し保管した。各試料を保管開始日から1、3、6、12、24日経過後に上記「３．pH変更時の抗菌活性試験」で作成した抗菌活性検定用培地を用いてアッセイした。
＜結果・考察＞
　上記耐熱性試験Ａについて、HK-1をpH 9に調整し高温で加熱した結果、2つの試料に関しては数値に多少の差異があるものの抗菌作用は失われなかった(図４－１)。
　上記耐熱性試験Ｂについて、2本の試料について、24日経過後にも抗菌活性が失われなかったことから、高温に耐性がある化合物であることが示された。無調整のHK-1であっても保存温度による顕著な差は観られなかった(図４－２及び図４－３)。
　本発明の化合物は抗菌剤として有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表される化合物、又はその塩若しくはエステル。
  2. 　UVスペクトルにおいて340 nmに吸収極大を有し、モル吸光係数が30630であり；
    　ESI/TOF/MSスペクトル及び高分解能マススペクトルによる解析から分子式がC74H58Cl8O26であり；
    　1H NMRスペクトル（DMSO－d6）が、δ11.49、10.92、6.67、6.41、6.21、6.00、5.91、4.95、4.26、3.96、3.95、3.79、3.71、3.70、2.69、2.19、及び0.90にシグナルを有し；
    　13C NMRスペクトル（DMSO－d6）が、δ 188.61、184.49、162.20、159.96、158.11、155.76、155.25、150.91、140.73、140.25、140.25、138.20、137.79、137.26、134.60、133.53、132.77、125.42、121.51、120.24、119.19、114.71、111.89、109.54、102.99、99.78、98.55、77.15、72.75、70.21、67.00、61.20、60.68、56.94、17.83、15.90、及び14.96にシグナルを有する化合物、又はその塩若しくはエステル。
  3. 　サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Thermosporothrix hazakensis）を培地に培養して、その培養物から採取することにより得られる、請求項２に記載の化合物、又はその塩若しくはエステル。
  4. 　培養物のアセトン水溶液抽出物を酢酸エチルと水とで分配して得られた酢酸エチル抽出物を、シリカゲルカラムにより処理して採取する、請求項３に記載の化合物、又はその塩若しくはエステル。
  5. 　サーモスポロスリックス・ハザケンシスが、サーモスポロスリックス・ハザケンシスSK20-1T株である、請求項３又は４に記載の化合物、又はその塩若しくはエステル。
  6. 　サーモスポロスリックス・ハザケンシス（Thermosporothrix hazakensis）を培地に培養し、その培養物から請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、又はその塩若しくはエステルを採取することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、又はその塩若しくはエステルの製造方法。
  7. 　培養物のアセトン水溶液抽出物を酢酸エチルと水とで分配して得られた酢酸エチル抽出物を、シリカゲルカラムにより処理して請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、又はその塩若しくはエステルを採取する、請求項６に記載の方法。
  8. 　サーモスポロスリックス・ハザケンシスが、サーモスポロスリックス・ハザケンシスSK20-1T株である、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物、又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する抗菌剤。
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