WO2020162125A1 - 細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法 - Google Patents

細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020162125A1
WO2020162125A1 PCT/JP2020/001094 JP2020001094W WO2020162125A1 WO 2020162125 A1 WO2020162125 A1 WO 2020162125A1 JP 2020001094 W JP2020001094 W JP 2020001094W WO 2020162125 A1 WO2020162125 A1 WO 2020162125A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
diaphragm
thickness
cell
point
angle
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/001094
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
高橋　直人
真一 中居
弘 作山
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to JP2020571060A priority Critical patent/JP7270657B2/ja
Priority to EP20752524.7A priority patent/EP3922710A4/en
Priority to CN202080012318.5A priority patent/CN113396212B/zh
Priority to SG11202108093UA priority patent/SG11202108093UA/en
Publication of WO2020162125A1 publication Critical patent/WO2020162125A1/ja
Priority to US17/387,091 priority patent/US20210355430A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F04—POSITIVE - DISPLACEMENT MACHINES FOR LIQUIDS; PUMPS FOR LIQUIDS OR ELASTIC FLUIDS
    • F04B—POSITIVE-DISPLACEMENT MACHINES FOR LIQUIDS; PUMPS
    • F04B43/00—Machines, pumps, or pumping installations having flexible working members
    • F04B43/0009—Special features
    • F04B43/0054—Special features particularities of the flexible members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F04—POSITIVE - DISPLACEMENT MACHINES FOR LIQUIDS; PUMPS FOR LIQUIDS OR ELASTIC FLUIDS
    • F04B—POSITIVE-DISPLACEMENT MACHINES FOR LIQUIDS; PUMPS
    • F04B43/00—Machines, pumps, or pumping installations having flexible working members
    • F04B43/02—Machines, pumps, or pumping installations having flexible working members having plate-like flexible members, e.g. diaphragms
    • F04B43/06—Pumps having fluid drive
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present disclosure relates to a cell culture device, a cell culture method, and a product manufacturing method.
  • the culture fluid When culturing cells, the culture fluid may be withdrawn from the culture vessel with a pump for various purposes.
  • a culture solution is extracted from the culture container for the purpose of collecting contaminated microorganisms.
  • Patent Document 2 US Pat. No. 6,544,424 (Patent Document 2) describes that a tangential flow method is used to filter a culture solution extracted from the culture container using a diaphragm pump.
  • the problem to be solved by the embodiment of the present invention is to provide a cell culture device and a cell culture that can achieve both good cell growth property and suppression of diaphragm damage when extracting a cell suspension by a small capacity diaphragm pump.
  • a method and a method for producing a product using the cell culture method are provided.
  • a culture container containing a cell suspension A diaphragm pump for extracting the cell suspension from the culture container,
  • the volume of the space defined by the diaphragm of the diaphragm pump and the plane F including the surface of the outer edge portion of the diaphragm far from the apex of the diaphragm is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less, For each point on the diaphragm, when the angle formed by the straight line connecting the foot of the perpendicular drawn from the apex of the diaphragm to the plane F and the above point is the perpendicular A, the angle A is 0.
  • the thickness H of the diaphragm is in the range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less at any point in the range from ° to 75°, Cell culture in which the thickness H of the diaphragm satisfies the following formula 1 at any point in the region where the angle A is 0° to 75°, where H T is the thickness of the diaphragm at the apex of the diaphragm. apparatus.
  • ⁇ 3> of the points in the region of up to 88 ° from the angle A is 75 ° in the above diaphragm, the thickness of the diaphragm most thickness of the thick points when the H Y, angle A is from 0 ° to 75 °
  • ⁇ 5> The cell culture device according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, in which a tensile stress ⁇ at an elongation rate of 50% of the diaphragm satisfies the following Expression 3. 0.4 MPa ⁇ 1.5 MPa (Formula 3) ⁇ 6> culturing cells in a cell suspension housed in a culture container, Withdrawing the cell suspension from the culture vessel by a diaphragm pump, The volume of the space defined by the diaphragm of the diaphragm pump and the plane F including the surface of the outer edge portion of the diaphragm far from the apex of the diaphragm is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less, For each point on the diaphragm, when the angle formed by the straight line connecting the foot of the perpendicular drawn from the apex of the diaphragm to the plane F and the above point is the perpendicular A, the angle A is 0.
  • the thickness H of the diaphragm is in the range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less at any point in the range from ° to 75°, Cell culture in which the thickness H of the diaphragm satisfies the following formula 1 at any point in the region where the angle A is 0° to 75°, where H T is the thickness of the diaphragm at the apex of the diaphragm.
  • ⁇ 7> of the angle A is a point in the region of up to 88 ° from 75 ° in the above diaphragm, the thickness of the diaphragm and H Y most thickness at thick point, the angle A of the diaphragm at a point 90 °
  • the thickness is H Z , H Z ⁇ H Y , and the thickness H of the diaphragm is H ⁇ H Z at any point in the region where the angle A is 0° to 75°.
  • ⁇ 8> of the points in the region of up to 88 ° from the angle A is 75 ° in the above diaphragm, the thickness of the diaphragm most thickness of the thick points when the H Y, angle A is from 0 ° to 75 °
  • Atmospheric pressure-0.1 MPa ⁇ P ⁇ atmospheric pressure + 0.1 MPa (Equation 4) ⁇ 12> The cell culture method according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 11>, wherein the cells are CHO cells.
  • ⁇ 13> The cell suspension extracted from the culture container, a first solution having a cell concentration higher than the cell concentration in the cell suspension, and a cell concentration in the cell suspension A second solution having a lower cell concentration than that, and a separation treatment for separating by a tangential flow filtration method using a separation membrane, Returning the first solution into the culture vessel, Adding a new medium in the culture vessel, The cell culture method according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 12>, further comprising: ⁇ 14> culturing the product-producing cells using the cell culture method according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 13>, Recovering the product from the cell suspension, A method of manufacturing a product, comprising: ⁇ 15> The method for producing the product according to ⁇ 14>,
  • a cell culture device and a cell culture method capable of achieving both good cell growth properties and suppression of diaphragm damage, and A method for producing a product using a cell culture method is provided.
  • the numerical range indicated by using “to” means a range including the numerical values before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the upper limit value or the lower limit value described in a certain numerical range may be replaced with the upper limit value or the lower limit value of another numerical range described in stages.
  • the upper limit value or the lower limit value described in a certain numerical range may be replaced with the values shown in the examples.
  • a combination of two or more preferable aspects is a more preferable aspect.
  • the amount of each component means the total amount of a plurality of types of substances when there are a plurality of types of substances corresponding to each component, unless otherwise specified.
  • the term “process” includes not only an independent process but also a process that cannot be clearly distinguished from other processes as long as the intended purpose of the process is achieved.
  • the cell culture device is A culture container containing a cell suspension, With a diaphragm pump for extracting the cell suspension from the culture container,
  • the volume of the space defined by the diaphragm of the diaphragm pump and the plane F including the surface of the outer edge of the diaphragm far from the apex of the diaphragm is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less,
  • the angle A is from 0° to 75°.
  • the diaphragm thickness H is within a range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less at any point in the region,
  • the thickness H of the diaphragm satisfies the following expression 1 at any point in the region where the angle A is 0° to 75°. .. 1 ⁇ H T /H ⁇ 1.75 (Formula 1)
  • a pump may be used for the purpose of withdrawing a culture solution from the culture container.
  • a diaphragm pump may be used for this purpose
  • a conventional diaphragm pump for cell culture is a diaphragm pump having a relatively large capacity, and the volume of the space defined by the diaphragm (described later) is small, for example, 20 cm 3 or less.
  • the culture scale be smaller from the viewpoint of cost reduction such as reduction of the medium. Thought.
  • the present inventors also considered to downsize the diaphragm pump as the culture scale is reduced.
  • the present inventors have found that when the diaphragm pump is simply downsized, the thickness of the diaphragm is also reduced, and as a result, the strength of the diaphragm is reduced and the diaphragm is damaged during the culture.
  • the present inventors when the thickness of the diaphragm is increased in order to secure the strength of the small diaphragm, the present inventors have found that the shock when the diaphragm is inverted may stress the cells and adversely affect the proliferation of the cells. Found. Then, the present inventors have found that by performing a specific design for the thickness distribution in the diaphragm, while suppressing the proliferation of the cells, it is also possible to achieve the suppression of damage to the diaphragm, the cell culture according to the present disclosure A device, a cell culture method, and a product manufacturing method have been invented.
  • the culture container may be a culture container of a general culture device (also referred to as a bioreactor) or another suitable container.
  • a general culture device also referred to as a bioreactor
  • the culture device fermenter type tank culture device, air lift type culture device, culture flask type culture device, spinner flask type culture device, microcarrier type culture device, fluidized bed type culture device, holofiber type culture device, Examples thereof include a roller bottle type culture device and a filled tank type culture device.
  • a diaphragm pump is a pump that sucks and discharges liquid by the reciprocating motion of a diaphragm called a diaphragm.
  • a typical example of a diaphragm pump that can be used in the cell culture device according to the present disclosure is shown in FIG.
  • the diaphragm pump shown in FIG. 2 is a reciprocating flow generation type diaphragm pump having no check valve, but the diaphragm pump usable in the cell culture device according to the present disclosure is not limited to this, and the check valve is not limited thereto. It may be a diaphragm pump capable of forming a unidirectional flow.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view showing a cross section of the diaphragm pump 37.
  • the diaphragm pump 37 shown in FIG. 2 is connected to a flow path (pipe) 58 through which a liquid flows and a flow path (tube) 59 through which a gas flows.
  • the diaphragm pump 37 has a housing including a portion 304a and a portion 304b, and a diaphragm 302, and both ends of the diaphragm 302 are fixed in the housing portion 304b. Therefore, both ends of the diaphragm 302, which are housed in the housing portion 304b, do not move during operation of the diaphragm pump.
  • the both ends actually form the outer edge (outer circumference) of the diaphragm in the radial direction, and are annular outer edge portions.
  • the housing including the portions 304a and 304b may be made of any material such as iron, stainless steel, and plastic as long as the material has the strength required for the diaphragm pump.
  • the diaphragm 302 divides the space inside the diaphragm pump 37 into two chambers, a chamber 301 and a chamber 303.
  • the chamber 301 is filled with the liquid from the channel 58
  • the chamber 303 is filled with the gas from the channel 59.
  • the pressure inside the chamber 303 also decreases, so that the diaphragm 302 draws an arc toward the chamber 303 side due to the pressure difference between the chamber 301 and the chamber 303.
  • the center of the diaphragm is the farthest point from the plane including the lower surface of the ring at the outer edge of the diaphragm in FIG. 2, and is sometimes called the apex of the diaphragm. it can. This is because the center of the diaphragm is located at the apex of the arc formed by the diaphragm when viewed in cross section as shown in FIG.
  • the diaphragm repeats reciprocating motion as described above, it is preferably an elastic body.
  • the elastic body refers to a member that deforms in response to a force and returns to its original shape when the force is removed, and particularly, a member made of a material having rubber elasticity.
  • Rubber elasticity refers to a material having a smaller elastic modulus than a metal and a larger displacement amount with respect to a force, and an elastic modulus (Young's modulus) at 25° C. of several MPa to several hundred MPa. Is about 1 MPa to 60 MPa.
  • the Young's modulus is, for example, using the product name “TGI 100 kN” (manufactured by Minebea) and conforming to JIS K7161 (2014) (test piece size: length 5 cm ⁇ width 1.5 cm ⁇ thickness 0.1 cm, test The speed can be measured at 0.5 mm/min).
  • the volume of the space defined by the diaphragm and the plane F including the surface of the outer edge of the diaphragm on the side far from the apex of the diaphragm is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less,
  • the angle A is from 0° to 75°.
  • the diaphragm thickness H is within a range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less at any point in the region,
  • the diaphragm thickness H satisfies the following formula 1 at any point in the region where the angle A is 0° to 75°. 1 ⁇ H T /H ⁇ 1.75 (Formula 1)
  • various regions of the diaphragm, the volume of the space, or the thickness of the points will be described. Unless otherwise specified, the regions of the diaphragm, the volume of the space, or the thickness of the points will be described unless otherwise specified.
  • any of the above means the area of the diaphragm, the volume of the space, or the thickness of a point measured in a state where no external pressure is applied to the diaphragm (elastic body forming the diaphragm).
  • a pressure difference is generated between the pressures applied to both sides of the diaphragm, which causes the diaphragm to repeat behaviors such as inversion.
  • the areas of the diaphragm, volume of space or thickness of points described in this disclosure are measured in the presence of such a pressure differential, i.e. under pressure from either side of the diaphragm.
  • the diaphragm has a flat ring-shaped outer edge portion excluding a protrusion for strengthening fixation to the housing, and a movable portion having a dome-like protruding shape from the outer edge portion.
  • the center of the diaphragm is the apex T of the dome-shaped raised shape.
  • the movable portion can be inverted by the pressure difference between the chambers partitioned by the diaphragm.
  • the outer edge portion of the diaphragm is fixed to the housing of the diaphragm pump, and the lower surface (first surface) of the outer edge portion in FIGS. 3A and 3B is for fixing the housing firmly. Except for the protrusions, they belong to the same plane.
  • This lower surface actually has an annular shape.
  • the upper surface (second surface) of the outer edge portion in FIGS. 3A and 3B is also annular, and is on the same plane except for a protrusion for firmly fixing the housing. belong to.
  • the plane including the lower surface (excluding the protrusion) in FIGS. 3A and 3B of the outer edge portion of the diaphragm is referred to as plane F in the present disclosure.
  • the plane F is a virtual plane formed by extending the plane to which the lower surface of the outer edge of the diaphragm belongs to the space below the movable portion.
  • the lower surface of the outer edge portion in FIGS. 3A and 3B is the surface of the outer edge portion that is farther from the apex (that is, the center point) T of the diaphragm.
  • the apex T is bulged upward from the outer edge portion, of the upper surface and the lower surface of the outer edge portion, the lower surface is farther from the apex T.
  • the diaphragm When the diaphragm is inverted from the apex T, the diaphragm has a shape shown by an imaginary line in FIG. 3A, but even in this case, the shape itself becomes the same only by reversing the arc drawing direction.
  • the space defined by the diaphragm and the plane F including the surface of the outer edge portion of the diaphragm on the side far from the apex of the diaphragm means the lower surface in the arc-shaped portion of the diaphragm in FIG.
  • the cross section of this closed space is shown as a stippled portion in FIG. 3B.
  • the volume of this closed space is about a half of the volume change of the liquid side chamber (chamber 301 in FIG. 2) caused by the inversion of the diaphragm, and flows into the diaphragm pump or is discharged from the diaphragm pump. It is an indicator of the amount of liquid that is stored.
  • the volume of the closed space is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less, which is smaller than the volume of the diaphragm pump that has been conventionally used for culture.
  • the volume of the space defined by the diaphragm and the plane F including the surface of the outer edge of the diaphragm far from the apex of the diaphragm can be set to 1 cm 3 or more.
  • a sufficient amount of the cell suspension can be obtained from the culture container. It is possible to pull it out.
  • the waste products of the cells can be sufficiently discharged to the outside of the system by filtration, etc., and the proliferative ability of the cells can be enhanced, resulting in cell survival. It will be easier to maintain the rate.
  • the volume of the space defined by the diaphragm and the plane F including the surface of the outer edge of the diaphragm far from the apex of the diaphragm is set to 20 cm 3 or less, whereby the retention time of the culture solution outside the cell container is excessive. It is easy to avoid becoming too long. Compared to the inside of the cell container, the conditions outside the cell container such as oxygen supply and temperature maintenance are more likely to deteriorate.Therefore, by avoiding excessive retention of the culture solution outside the cell container, cell growth Can be increased to maintain cell viability. As a result, it is possible to support, for example, small-scale culture for experiments, and the culture cost can be reduced.
  • the volume of the space defined by the diaphragm and the plane F including the surface of the outer edge portion of the diaphragm that is far from the apex of the diaphragm is preferably 2 cm 3 or more and 15 cm 3 or less, and 2.5 cm 3 It is more preferably 10 cm 3 or less and more preferably 3 cm 3 or more and 5 cm 3 or less.
  • the relative position on the diaphragm can be represented by an angle.
  • the apex is at a position where the angle from the perpendicular line Pr is 0°.
  • an arbitrary point for example, point Pt in FIG.
  • the arbitrary point included in the arc-shaped portion of the diaphragm is set on the lower surface (the surface on the side far from the apex) of the diaphragm in FIG. 3A.
  • the dome-shaped raised shape of the movable portion of the diaphragm is preferably circularly symmetric with respect to the perpendicular Pr.
  • the shape of the ridge-shaped cross section (the cross section including the perpendicular Pr as shown in FIG. 3A) (excluding the connection point with the outer edge portion) may be a hemisphere or an ellipse, or a rule such as a hemisphere or an ellipse.
  • the shape does not necessarily have to be a regular shape. For example, in FIG.
  • the coordinate in the vertical direction (direction of the perpendicular Pr) of the lower surface of the movable portion of the diaphragm is the coordinate in the horizontal direction (direction orthogonal to the perpendicular Pr) (in FIG. 3A).
  • the value obtained by performing the second-order differentiation with the right side as positive may be any shape that is 0 or less, except for the connection point with the outer edge portion.
  • the thickness H of the diaphragm is in the range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less at any point in the region where the angle A is 0° to 75°.
  • the diaphragm thickness H is a variable determined at each point, but the minimum and maximum values of this variable in the region where the angle A of the diaphragm is 0° to 75° (region X in FIG. 3A) are both. It is in the range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less.
  • the diaphragm pump forms an arc shape, but the thickness H at each point means the dimension of the diaphragm in the direction perpendicular to the tangent to the lower surface of the diaphragm at each point. Further, H indicates the thickness of the diaphragm at each point in the region where the angle A is 0° to 75°, unless otherwise specified.
  • the diaphragm at each point in the region where the angle A is 0° to 75° is 0.5 mm or more, the diaphragm can be effectively prevented from being damaged during the culture, and the culture can be easily continued. .. Further, since the thickness of the diaphragm at each point in the region where the angle A is 0° to 75° is 1.5 mm or less, it is possible to avoid difficulty in reversing the diaphragm, and by reversing the diaphragm, the diaphragm pump The function can be fully exerted.
  • the thickness at each point in the region where the angle A of the diaphragm is 0° to 75° is preferably 0.6 mm or more and 1.4 mm or less, and 0.7 mm or more and 1.3 mm or less. More preferably, it is 0.8 mm or more and 1.2 mm or less.
  • the area where the angle A of the diaphragm is from 0° to 75° is the area around the apex of the diaphragm.
  • the thickness is uniform in the region where the angle A is 0° to 75°, or the thickness at the apex of the diaphragm is slightly thicker than the peripheral region, so that the durability of the diaphragm is improved and the diaphragm is less likely to break.
  • the thickness of the apex of the diaphragm is too large as compared with the thickness of the peripheral region, stress tends to concentrate on a relatively thin portion and the diaphragm is likely to break.
  • the thickness of the diaphragm at the apex of the diaphragm is H T
  • the thickness H of the diaphragm at any point in the range of the angle A from 0° to 75° is Formula 1 below is satisfied.
  • 1 ⁇ H T /H ⁇ 1.75 (Formula 1)
  • Expression 1 in addition to the effect of suppressing the breakage of the diaphragm, the effect of making the reversal behavior of the diaphragm more supple can be obtained.
  • the inversion behavior of the diaphragm tends to be more supple as the thickness at the apex and the thickness around the apex become more uniform.
  • the inversion behavior of the diaphragm is supple, it is possible to avoid an increase in shear in the cell suspension in the chamber 301 due to a rapid increase in flow velocity, and damage to cells is reduced.
  • H is a variable indicating the thickness of each point, but from the above viewpoint, the value of H T /H is 1 or more at any point in the region where the angle A of the diaphragm is 0° to 75°. It is preferably 1.5 or less, more preferably 1 or more and 1.3 or less, still more preferably 1 or more and 1.2 or less.
  • the thickness of the diaphragm at the thickest point is H Y, and the point where the angle A is 90° (see FIG.
  • H Z it is preferable that H Z ⁇ H Y , and the thickness of the diaphragm at any point in the region where the angle A is 0° to 75°.
  • the height H is preferably H ⁇ H Z.
  • a region where the angle A is 0° to 75° a region where the angle A is 75° to 88°, and a point where the angle A is 90°.
  • stress concentrates on the thinnest part of the diaphragm and that point tends to break, but just increasing the thickness of all areas will increase the impact at the time of diaphragm reversal and cell proliferation May be reduced. Therefore, it is preferable to make the maximum thickness of the region where the angle A is 75° to 88°, which is the region where stress is most likely to concentrate when the diaphragm is inverted, to be thicker than the thickness of other regions. It is preferable that Z ⁇ H Y.
  • the thickness H of the diaphragm is H at any point in the region where the angle A is 0° to 75°. is preferably H ⁇ H S.
  • the stress applied to the region where the angle A is from 75° to 88° is larger, so that HY can be made larger (larger than H Z ).
  • the better to restrict the upper limit of the ratio of H Y for H Z as described above inversion behavior of the diaphragm can be more supple, to further reduce damage to the cells due to the reversal behavior of the diaphragm It is possible to increase the proliferation of cells and to further suppress the decrease in cell viability.
  • the angle A is the point of 90 ° is located in a circle on the line, if there are variations in the thickness of if the diaphragm in this line, as the thickness used for comparison with the H Y is , Use the maximum thickness on the above line.
  • the thickness H at any point in the region where the angle A of the diaphragm is 0° to 75° is preferably H ⁇ H Z , and more preferably H Z ⁇ H Y is also satisfied.
  • the point where the angle A is 90° is actually located on a circular line, but if there is variation in the thickness of the diaphragm on this line, the region where the angle A is 0° to 75° As the thickness used for comparison with the thickness H at an arbitrary point in, the minimum thickness on the above line is used.
  • angle A in the diaphragm is H ⁇ H Z for any thickness H in the region from 0° to 75°, and H Z ⁇ H Y is also satisfied at the same time, the angle A in the diaphragm is 0°. since it is also H ⁇ H Y the thickness H of any point in the region from to 75 °, angle a is effective in suppressing the diaphragm breaking in the region of up to 88 ° from 75 °.
  • the value of Hz is not particularly specified, it is preferably 0.5 mm or more and 2 mm or less, more preferably 0.7 mm or more and 1.9 mm or less, and further preferably 0.9 mm or more and 1.8 mm or less. Most preferably, it is 1 mm or more and 1.7 mm or less.
  • the value of H Z /H is preferably 1 or more and 3 or less, and 1.1 or more and 2.5 or more.
  • the ratio is more preferably not more than 1.2, further preferably not less than 1.2 and not more than 2.0, and most preferably not less than 1.3 and not more than 1.8.
  • the upper limit of the ratio of H Z to the thickness H at each point in the region where the angle A in the diaphragm is 0° to 75° is limited as described above, in the region where the angle A is 75° to 88° Since it is easy to avoid the diaphragm from becoming excessively thick, the inversion behavior of the diaphragm tends to be more supple, and the damage to the cells due to the inversion behavior of the diaphragm is further reduced and the proliferation of cells is further enhanced. Therefore, the cell survival rate tends to be improved.
  • the region where the angle A of the diaphragm is more than 88° and less than 90° is a region that moves only slightly when the diaphragm is inverted, as can be seen from FIG. 3A.
  • the region where the angle A is more than 88° and less than 90° it can be considered in the same manner as the point where the angle A is 90°, and thus the matters described for H Z may be similarly applied.
  • any point in the region where the angle A in the diaphragm is from 0° to 75° with respect to the diaphragm thickness H Y at the thickest point it is preferable that the diaphragm thickness H satisfies the following expression 2. 1 ⁇ H Y /H ⁇ 3 (Formula 2)
  • the region where the angle A is 75° to 88° is set by setting HY /H to be greater than 1.
  • the diaphragm has a thickness sufficient to withstand the stress when the diaphragm is reversed, and the diaphragm is less likely to be broken in the region where the angle A is 75° to 88°.
  • the inversion behavior of the diaphragm is more flexibly maintained, damage to cells due to the inversion behavior of the diaphragm is further reduced, cell proliferation is further improved, and cell survival is improved. The rate tends to be lowered.
  • HY /H is preferably more than 1 and 3 or less, and 1.2 or more 2 It is more preferably 0.8 or less, still more preferably 1.4 or more and 2.6 or less, and even more preferably 1.6 or more and 2.4 or less.
  • the value of H Y is not particularly limited, but is preferably 1 mm or more and 3 mm or less, more preferably 1.2 mm or more and 2.8 mm or less, and further preferably 1.4 mm or more and 2.6 mm or less. It is preferably 1.6 mm or more and 2.4 mm or less.
  • a rubber material eg, chloroprene rubber, nitrile rubber, ethylene propylene diene rubber, silicone rubber
  • an elastomer eg, thermoplastic polyester elastomer, vinyl chloride resin-based thermoplastic elastomer
  • a fluororesin eg, polytetraene
  • the material of the diaphragm is not particularly limited as long as it can function as a diaphragm, and any elastic body may be used.
  • the material of the diaphragm is preferably silicone rubber, more preferably a silicone rubber having a hardness of 45 or more and 54 or less, a silicone rubber having a hardness of 45 or more and 54 or less, and a tensile strength of 5 MPa or more and 8 MPa or less. Is more desirable.
  • An example of the silicone rubber is TSE3457T manufactured by Momentive Performance Materials Japan LLC.
  • the hardness of rubber can be measured with a durometer type A according to JIS K6253:2012. Further, the tensile strength of rubber can be measured according to JIS K6249:2003 using a dumbbell specified in the JIS.
  • the hardness of the silicone rubber is 45 or more and 54 or less, the balance between the rupture of the diaphragm and the flexibility of the reversal behavior becomes better.
  • the tensile strength of the silicone rubber is 5 MPa or more and 8 MPa or less, the balance between the rupture resistance of the diaphragm and the flexibility of the reversal behavior becomes better.
  • the hardness of the silicone rubber is 45 or more and 54 or less and the tensile strength of the silicone rubber is 5 MPa or more and 8 MPa or less, the balance between the rupture resistance of the diaphragm and the suppleness of the reversal behavior is further improved.
  • the supple reversal behavior leads to reduction of damage to cells, improvement of cell proliferation, and improvement of cell viability.
  • the tensile stress ⁇ at 50% elongation of the diaphragm preferably satisfies the following expression 3. 0.4 MPa ⁇ 1.5 MPa (Formula 3)
  • the tensile stress ⁇ at an elongation of the diaphragm of 50% can be obtained by the following method.
  • ⁇ Method of measuring tensile stress at 50% elongation of diaphragm> A test piece having a width of 10 mm and a length of 40 mm is cut out from the diaphragm, and a tensile test is performed on the test piece by using a tensile tester Strograph R2 (trade name) manufactured by Toyo Seiki Seisakusho. Before the tensile test, the thickness of the test piece is measured using a high precision Digimatic Micrometer MDH-25M (trade name) manufactured by Mitutoyo Corporation. In the tensile test, the distance between chucks is 10 mm, the tensile speed is 10 mm/min, and the tensile test is performed in the length direction of the test piece.
  • the tensile stress at the elongation rate of 50% is calculated by dividing the load at the elongation rate of 50%, that is, when the chuck gap is 15 mm, by the thickness of the test piece. Three test pieces are cut out from one diaphragm, and the tensile test is repeated three times using the three test pieces, and the average value of the three tensile stresses thus obtained is used as the tensile stress at a diaphragm elongation of 50%.
  • the tensile stress ⁇ at a diaphragm elongation of 50% By setting the tensile stress ⁇ at a diaphragm elongation of 50% to 0.4 MPa or more, it is possible to avoid more violent inversion of the diaphragm at low pressure, and it is possible to further reduce damage to cells. Since the tensile stress ⁇ at the diaphragm elongation rate of 50% is 1.5 MPa or less, the pressure required to invert the diaphragm can be controlled in a more appropriate range, and the inversion behavior of the diaphragm can be controlled. It tends to reduce the damage to the cells due to the momentum.
  • the inversion behavior of the diaphragm can be made more supple, and damage to the cells can be reduced to reduce the damage to the cells. Maintaining high survival rates tends to be easier.
  • the tensile stress ⁇ when the elongation of the diaphragm is 50% is preferably 0.4 MPa or more and 1.5 MPa or less, more preferably 0.5 MPa or more and 1.3 MPa or less, and is 0.1. It is more preferably 6 MPa or more and 1.1 MPa or less.
  • the cell culture method Culturing the cells in a cell suspension contained in a culture vessel, Withdrawing the cell suspension from the culture container by a diaphragm pump,
  • the volume of the space defined by the diaphragm of the diaphragm pump and the plane F including the surface of the outer edge of the diaphragm far from the apex of the diaphragm is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less,
  • the angle A is from 0° to 75°.
  • the diaphragm thickness H is within a range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less at any point in the region,
  • the diaphragm thickness H satisfies the following formula 1 at any point in the region where the angle A is 0° to 75°. .. 1 ⁇ H T /H ⁇ 1.75 (Formula 1)
  • the matters described in the description of the cell culture device according to the present disclosure apply as they are.
  • the cells to be cultured in the cell culture method according to the present disclosure are not particularly limited, and examples thereof include animal cells, plant cells, eukaryotic cells such as yeast, and prokaryotic cells such as Bacillus subtilis and Escherichia coli.
  • the cells may be ES cells, IPS cells, various stem cells and the like.
  • the cells cultured in the cell culture method according to the present disclosure may be cells that produce a product. When the cells that produce the product are cultured, the product is produced by the cells, and by collecting this, the substance production using the cells can be performed.
  • the cells used as cells for producing the product are not particularly limited, and may be animal cells, plant cells, eukaryotic cells such as yeast, and prokaryotic cells such as Bacillus subtilis and E. coli.
  • Animal cells such as CHO cells, BHK-21 cells, C127 cells, hybridoma cells, NS0 cells, and SP2/0-Ag14 cells are preferred, and CHO cells have been established because of many analyzes and established genetic engineering techniques. Is more preferable. Even when the cell does not originally produce the desired product or the production amount is small, for example, by introducing an expression vector such as a plasmid encoding a protein necessary for producing the product into the cell, The product can be efficiently produced.
  • the product produced by the cells in the present disclosure is not particularly limited as long as it is a substance produced by the cells in the culture medium, and examples thereof include alcohols, enzymes, antibiotics, nucleic acids, recombinant proteins, and antibodies. Substances. Among them, the product is preferably a recombinant protein or antibody, more preferably an antibody.
  • the concentration of cells in the cell suspension contained in the culture container is not particularly limited. However, the higher the concentration of cells in the cell suspension contained in the culture container, the greater the amount of cells, and when the cells produce the product, the greater the amount of product produced. Therefore, it is preferable that the cell concentration is high.
  • the concentration of cells in the cell suspension housed in the culture container increases after seeding the cells, but for example, the concentration of cells within the range of 20 ⁇ 10 6 cells/mL or more and 150 ⁇ 10 6 cells/mL or less. May increase up to.
  • the concentration of cells in the cell suspension contained in the culture container may be increased to a cell concentration in the range of 30 ⁇ 10 6 cells/mL or more and 120 ⁇ 10 6 cells/mL or less, 40 May be increased to a cell concentration in the range of ⁇ 10 6 cells/mL or more and 100 ⁇ 10 6 cells/mL or less, or cells in the range of 50 ⁇ 10 6 cells/mL or more and 100 ⁇ 10 6 cells/mL or less It may be increased to a concentration.
  • the “concentration” of cells refers to the number density, that is, the number of cells per unit volume.
  • a liquid medium usually used for cell culture can be used.
  • OptiCHO Lifetechnologies, 12681011
  • medium Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Eagle minimum essential medium (MEM), RPMI-1640 medium, RPMI-1641 medium, F-12K medium, Ham's F12 medium, Iscove modified method Dulbecco's medium (IMDM), McCoy's 5A medium, Leibovitz L-15 medium, and EX-CELL (trademark) 300 series (JRH Biosciences)
  • CHO-S-SFMII Invitrogen
  • CHO-SF Sigma-Aldrich
  • CD-CHO Invitrogen
  • IS CHO-V Irvine Scientific
  • PF-ACF-CHO Sigma-Aldrich
  • Serum such as fetal calf serum (FCS) may be added to the medium.
  • the medium may be serum-free medium, such as fully synthetic medium.
  • the medium may be supplemented with additional components such as amino acids, salts, sugars, vitamins, hormones, growth factors, buffers, antibiotics, lipids, trace elements, hydrolysates of plant proteins.
  • the pH of the medium varies depending on the cells to be cultivated, but it is generally pH 6.0 to 8.0, preferably pH 6.8 to 7.6, and more preferably pH 7.0 to 7.4.
  • the culture temperature is generally 30°C to 40°C, preferably 32°C to 37°C, more preferably 36°C to 37°C, and the culture temperature may be changed during the culture.
  • the culturing may be performed in an atmosphere having a CO 2 concentration of 0 to 40%, and is preferably performed in an atmosphere having a CO 2 concentration of 2 to 10%.
  • the medium can be replaced, aeration and stirring can be added as necessary.
  • the total volume of cell suspension being cultivated is It is not particularly limited as long as the diaphragm pump in the disclosure can be used, but is preferably 50 mL or more and 500 mL or less, more preferably 60 mL or more and 400 mL or less, further preferably 70 mL or more and 300 mL or less, and 80 mL. Most preferably, it is 250 mL or less.
  • the diaphragm has a diaphragm in which the volume of the space defined by the diaphragm and the plane F including the surface of the outer edge portion of the diaphragm on the side far from the apex of the diaphragm is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less.
  • Culture using a pump As described above, since the capacity of the diaphragm pump according to the present disclosure is limited, it is preferable that the amount of the cell suspension is a small-scale culture as small as the above range.
  • the culture solution volume By setting the culture solution volume to the above-mentioned lower limit value or more, it becomes difficult to be affected by disturbances such as liquid volume reduction and volatilization due to sampling, and it becomes easier to continue the culture, and the culture solution volume is set to the above-mentioned upper limit value or less. As a result, the volume of the culture solution can be suppressed to a small scale and the experiment cost tends to be suppressed.
  • the cell culture method according to the present disclosure may include stirring the cell suspension in the culture container with a stirring blade, and may include gas-gassing the cell suspension with a sparger.
  • the cell culture is preferably perfusion culture.
  • Perfusion culture is a culture method in which fresh medium is added and at the same time spent medium is removed. With perfusion cultures, it is possible to achieve high cell concentrations in excess of 1 ⁇ 10 8 cells/mL.
  • a typical perfusion culture begins with a batch culture start-up lasting 1 or 2 days, after which fresh culture medium is continuously, stepwise and/or intermittently added to the culture and spent medium is removed simultaneously. To do. In perfusion culture, methods such as sedimentation, centrifugation or filtration can be used to remove spent medium while maintaining cell concentration.
  • Perfusion may be in the form of continuous, stepwise, intermittent or a combination thereof.
  • the diaphragm pump draw out the cell suspension from the culture container. Withdrawal of the cell suspension from the culture vessel may be performed intermittently or continuously, but it is preferably continuously performed from the viewpoint of keeping the system state stable.
  • operating the diaphragm pump will remove the cell suspension from the culture vessel and return the extracted cell suspension to the culture vessel. Both will be alternated.
  • the extraction position of the cell suspension is not particularly limited as long as it is a position below the liquid surface, and may be, for example, near the bottom of the culture container.
  • a cross-flow type filter may be provided between the culture container and the diaphragm pump to perform the cross-flow type filtration. By such filtration, it is possible to recover the product of the cells from the cell suspension, remove waste products, and the like.
  • the purpose of extracting the cell suspension from the culture container in the cell culture method according to the present disclosure is not particularly limited, and the extracted cell suspension is simply discarded to control the cell concentration and waste products. May be removed, or may be subjected to a treatment for collecting cells by centrifugation or the like, or the product may be collected by the cells by a filter other than the cross-flow method, waste products may be removed. ..
  • the diaphragm pump may be a type that generates a reciprocating flow or a type that generates a unidirectional flow.
  • any items described in the description of the cell culture device according to the present disclosure can be applied, and the cell culture method according to the present disclosure includes the following embodiments, for example.
  • the thickness of the diaphragm in the most thickness is thick point and H Y
  • the angle A is 90 °
  • the diaphragm thickness H is H ⁇ H Z Is preferred.
  • the angle A of the diaphragm when the thickness of the diaphragm at the thickest point is H Y , the angle A is 0. It is preferable that the diaphragm thickness H satisfies the following Expression 2 at any point in the range from ° to 75°. 1 ⁇ H Y /H ⁇ 3 (Formula 2)
  • the material of the diaphragm is preferably silicone rubber.
  • the tensile stress ⁇ at the diaphragm elongation rate of 50% preferably satisfies the following expression 3. 0.4 MPa ⁇ 1.5 MPa (Formula 3)
  • the pressure P inside the diaphragm pump that drives the diaphragm satisfies Expression 4 below when the diaphragm pump is operating.
  • Atmospheric pressure-0.1 MPa ⁇ P ⁇ Atmospheric pressure + 0.1 MPa (Equation 4)
  • the pressure P inside the diaphragm pump refers to the pressure in the space inside the diaphragm pump on the opposite side of the cell suspension from the diaphragm, in other words, the pressure of the medium for driving the diaphragm pump.
  • the pressure P inside the diaphragm pump refers to the pressure inside the chamber 303 filled with gas in FIG.
  • the above-mentioned formula indicates that the absolute value of the difference between the atmospheric pressure and the pressure P is maintained at 0.1 MPa or less during the operation of the diaphragm pump, that is, the maximum absolute value of the difference between the atmospheric pressure and the pressure P. It means that the value is 0.1 MPa or less.
  • the pressure P inside the diaphragm pump can also be measured in a flow path or the like that communicates with the space, for example, in the flow path 59 in FIG.
  • the pressure difference between the pressure P and the atmospheric pressure is the driving force for reversing the diaphragm.
  • the absolute value of the pressure difference is 0.1 MPa or less, the inversion behavior of the diaphragm can be performed at an appropriate speed, the damage to the cells can be further reduced, and the tearing of the diaphragm can be further suppressed.
  • the atmospheric pressure is preferably [atmospheric pressure-0.1 MPa] or more and [atmospheric pressure +0.1 MPa] or less, more preferably [atmospheric pressure-0.08 MPa] or more and [atmospheric pressure +0.08 MPa] or less, and It is more preferable that the atmospheric pressure is ⁇ 0.06 MPa or more and [atmospheric pressure+0.06 MPa] or less, and it is further preferable that the atmospheric pressure is ⁇ 0.05 MPa or more and [atmospheric pressure +0.05 MPa] or less.
  • maintaining the pressure difference between the pressure P and the atmospheric pressure above a certain level is effective in promoting complete inversion of the diaphragm and avoiding retention of the cell suspension.
  • the maximum value of the absolute value of the pressure difference between the pressure P and the atmospheric pressure is preferably 1 kPa or more, more preferably 5 kPa or more, and more preferably 8 kPa or more. More preferably, it is more preferably 10 kPa (0.01 MPa) or more.
  • the cells contained in the cell suspension may be CHO cells.
  • the cell culture method according to the present disclosure, The cell suspension extracted from the culture vessel has a first solution having a cell concentration higher than that of the cell suspension and a cell concentration lower than that of the cell suspension. Performing a separation treatment for separating the second solution by a tangential flow filtration method using a separation membrane for the second solution; Returning the first solution into the culture vessel, Adding a new medium in the culture vessel, May be further included.
  • the liquid to be subjected to the membrane separation process is caused to flow along the membrane surface of the separation membrane to move the small-sized components together with the liquid components to the permeation side of the separation membrane.
  • the non-permeation side of the separation membrane that is, the supply side is also referred to as a primary side
  • the permeation side of the separation membrane is also referred to as a secondary side.
  • the membrane separation treatment by the tangential flow filtration system is performed even if the cell suspension extracted from the culture container forms a parallel unidirectional flow along the membrane surface of the separation membrane.
  • the reciprocating flow may be formed by reversing the direction of the flow of the cell suspension extracted from the culture container every predetermined time.
  • the extraction of the cell suspension from the culture container can be performed using a diaphragm pump.
  • the cell suspension extracted from the culture container is sent to a filter section for performing tangential flow filtration.
  • the cell suspension may be extracted from the culture container to the filter portion intermittently or continuously, but it is preferably continuously extracted from the viewpoint of keeping the system state stable.
  • the filter unit includes, for example, a container and a separation membrane that separates the space inside the container into a supply side and a permeation side and performs a membrane separation process on the cell suspension extracted from the culture container.
  • the filter section On the supply side of the separation membrane, the filter section has an inlet and an outlet connected to the flow channel, respectively.
  • the membrane separation process using the tangential flow filtration method if the flow direction of the cell suspension extracted from the culture vessel is reversed every predetermined time, the flow direction of the inlet and outlet is Will be replaced by the reversal of.
  • the separation membrane may be a mesh filter formed by weaving a fibrous member in a mesh or a hollow fiber membrane.
  • a microfiltration membrane (MF membrane) or an ultrafiltration membrane (UF membrane) can be used as the hollow fiber membrane.
  • the separation membrane does not allow live cells in the cell suspension to permeate, but allows small molecules such as the desired product in the cell suspension to permeate.
  • the size of the antibody is about 1 nm to 5 nm, whereas the size of the animal cell is on the order of 10 ⁇ m. Therefore, for example, a microfiltration membrane or an ultrafiltration membrane as a separation membrane is used.
  • the filtration membrane By using the filtration membrane, the antibody can be transferred to the secondary side through the separation membrane while keeping the living cells on the primary side.
  • the size of the liquid component for example, water molecules, is small, a part of the liquid component moves to the secondary side together with the antibody.
  • the cell concentration in the liquid remaining on the non-permeable side of the separation membrane increases.
  • the cell suspension liquid sent to the filter portion does not pass through the separation membrane and stays on the primary side, which is higher than that of the cell suspension liquid. It is separated into a return liquid having a high cell concentration and a permeate having a cell concentration lower than that of the cell suspension, which has passed through the separation membrane and moved to the secondary side.
  • the permeate contains small molecules such as those produced by cells.
  • the cell concentration in the cell suspension as used herein means the concentration of living cells in the cell suspension in the culture container.
  • “cell concentration” refers to “live cell concentration” unless otherwise specified.
  • the return liquid remaining on the primary side flows out of the filter and returns to the culture vessel.
  • the cell suspension is discharged from the outlet by the delivery pressure by a diaphragm pump having a check valve. It may be allowed to flow out and returned to the inside of the culture container through a flow path that connects the outflow port and the culture container.
  • the return liquid returns to the inside of the culture container through a channel different from the channel through which the cell suspension in the culture container moves to the inlet of the filter section, and circulates. A stream is formed.
  • the permeated liquid that has passed through the separation membrane contains small molecules such as products produced by cells.
  • the product in the permeated liquid can be recovered and used for various purposes such as manufacturing of pharmaceuticals and food.
  • the product may be recovered simply by collecting the permeated liquid, for example, collecting the permeated liquid in the tank.
  • the permeate can be subjected to further processing if it is desired to improve the purity of the product, change the solvent or change the form, eg by pulverizing.
  • the amount of the return liquid is smaller than the amount of the cell suspension sent to the filter part.
  • Fresh medium is supplied into the culture container in order to at least make up for the difference between the amount of cell suspension sent to the filter and the amount of return liquid.
  • the amount of cell suspension in the culture container does not always have to be completely constant, and may be substantially constant, for example, ⁇ 10%, ⁇ 5%, or ⁇ 1%. ..
  • the amount of cell suspension in the culture container does not always have to be measured at all times, and may be measured intermittently. Even slight variations in cell suspension volume can still benefit from perfusion culture.
  • the manufacturing method of the product according to the present disclosure Culturing cells that produce the product using the cell culture method according to the present disclosure, Recovering the product from the cell suspension, And a method for producing a product.
  • the productivity of the product can be increased because the cells that produce the product have good cell growth properties. Moreover, damage to the diaphragm can be suppressed.
  • the cell that produces the product the cell that produces the product exemplified above can be used, and as the product, the product exemplified above can be used.
  • the product is preferably an antibody.
  • the product may be collected collectively from the cell suspension at the end of the culture, but it is preferred to recover the product from the cell suspension at a predetermined frequency or continuously during the culture.
  • the cell culture method used in the production method of the product The cell suspension extracted from the culture container has a first solution having a cell concentration higher than that of the cell suspension and a cell concentration lower than that of the cell suspension.
  • the products are generally significantly smaller in size than cells.
  • the product contained in the cell suspension is also extracted, but in the separation treatment by the tangential filtration method, the product is smaller than the cells. Since it has a size, it is contained in the second solution as it is without being greatly reduced in concentration, while the cells mainly remain on the side of the first solution. Therefore, the product can be recovered from the second liquid.
  • recovering the product from the cell suspension means that the product is obtained from the processed product obtained by processing the cell suspension (for example, the second solution obtained by filtration). It also includes the case of collecting.
  • the product may be recovered by simply collecting the cell suspension, simply collecting the second solution, or the like.
  • the cell suspension, the second solution, or the like may be, for example, Can be collected in the tank.
  • the collected cell suspension is preferably subjected to a treatment for separating the product from the cells, and the cells may be removed from the solution by, for example, a filter or centrifugation. it can.
  • the second solution may be subjected to a further process such as a filter or centrifugation in order to further remove the cells.
  • the solution can be subjected to further treatment for the purpose of improving the purity of the product, changing the solvent, or changing the form such as powdering.
  • the product contained in the solution can be purified by a purification treatment.
  • the product obtained can be purified to high purity.
  • separation and purification of the product may be carried out by using the separation and purification method used for ordinary polypeptides.
  • a polypeptide can be separated and purified by appropriately selecting and combining a chromatography column such as affinity chromatography, a filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing.
  • a chromatography column such as affinity chromatography, a filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing.
  • the concentration of the obtained polypeptide can be measured by measuring the absorbance or by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a configuration of a cell culture device applicable to the cell culture method and the product manufacturing method according to the present disclosure.
  • the cell culture device 100 includes a culture container 10 for accommodating and culturing cells together with a medium, a diaphragm pump 37 for extracting a cell suspension contained in the culture container 10 through a flow path 57, and a medium supply container 20.
  • An air supply container 32 for supplying and an O 2 supply container 33 for supplying O 2 gas into the culture container 10 are provided.
  • the cell suspension L1 is housed in the culture container 10, and a stirring blade 11 for stirring the cell suspension L1 is provided. By rotating the stirring blade 11, the cell suspension L1 contained in the culture container 10 is stirred, and the homogeneity of the cell suspension L1 is maintained.
  • the culture container is provided with a sampling port 35.
  • the CO 2 gas in the CO 2 supply container 31 is sent to the flow meter 34 through the flow path 51 and further supplied into the culture container 10 through the flow path 54.
  • a regulator R1 and a pressure gauge M1 are provided in the flow path 51 to control the flow rate and monitor the pressure.
  • a filter F1 is provided in the flow path 54 to clean the supplied gas.
  • the air in the air supply container 32 is sent to the flow meter 34 through the flow path 52 and further supplied into the culture container 10 through the flow path 54.
  • a regulator R2 and a pressure gauge M2 are provided in the flow path 52 to control the flow rate and monitor the pressure.
  • the O 2 gas in the O 2 supply container 33 is sent to the flow meter 34 through the flow path 53 and further supplied into the culture container 10 through the flow path 55.
  • a regulator R3 and a pressure gauge M3 are provided in the flow path 53 to control the flow rate and monitor the pressure.
  • a filter F2 is provided in the flow path 55 to clean the supplied gas.
  • the cell suspension extracted through the flow path 57 is sent to the tangential flow filtration type hollow fiber membrane filter 36.
  • the liquid that has passed through the hollow fiber membrane filter 36 is discharged from the hollow fiber membrane filter 36 by the pump P2 through the flow path 60.
  • the product can be recovered by subjecting the liquid discharged from the hollow fiber membrane filter 36 to the flow channel 60 to a purification treatment.
  • the diaphragm pump 37 generates a flow that reciprocates in the flow path 57, the non-permeable side of the hollow fiber membrane filter 36, and the flow path 58.
  • the chamber (gas-side chamber) on the side opposite to the chamber (liquid-side chamber) on the flow channel 58 side of the diaphragm pump 37 is filled with gas and connected to the flow channel 59.
  • the air in the air supply container 38 flows into the gas side chamber of the diaphragm pump 37 through the flow path 59 by closing the electromagnetic valve V2 and opening the electromagnetic valve V1.
  • the pressure inside the gas side chamber becomes a pressure exceeding the atmospheric pressure
  • the diaphragm of the diaphragm pump 37 has a substantially hemispherical shape with its apex in the liquid side chamber.
  • the pressure gauge M4 Since the pressure gauge M4 is provided in the flow path 59 and there is almost no pressure loss in the filter F3, the pressure in the gas side chamber of the diaphragm pump 37 can be monitored by the pressure gauge M4.
  • the arrow in FIG. 1 indicates the moving direction of the liquid or gas, or the movement of the diaphragm of the diaphragm pump 37.
  • the channels other than the channel 59 through which the gas passes may be pipes formed of metal, plastic, or the like, and the channel 59 through which the gas may be a pipe formed of metal, plastic, or the like. It may be a tube formed of the like.
  • CHO cells were cultured.
  • medium Able Co. culture vessel having an overall 250 mL (trade name CD OptiCHO, manufactured by Thermo Fisher Scientific) 90 mL and kept at 37 ° C. Put, 3.8 mL / min of air from the culture container top, CO 2 was aerated with 0.2 mL/and left for 1 day.
  • the CHO cells were seeded so that the cell concentration in the culture container was 2.0 ⁇ 10 5 cells/mL and the liquid amount in the culture container was 100 mL.
  • the reciprocal flow of the cell suspension by the diaphragm pump of the test object was set to the predetermined pressure at which the maximum pressure (maximum absolute value of the difference from the atmospheric pressure) of the diaphragm gas side chamber was shown in Table 2. Then, filtration was carried out by the tangential flow filtration method by the reciprocating flow.
  • a hollow fiber membrane filter (T04-P20U-10-N) manufactured by Repligen was used for filtration.
  • a fresh medium (a medium represented by Thermo Fisher Scientific Co., trade name CD OptiCHO, and a GE Healthcare product name Cell Boost 7a and 7b (Mixture with the culture medium) (supply of fresh culture medium into the culture vessel) was also performed in parallel. The above filtration and supply of fresh medium were performed at a rate of 1.2 L/day.
  • the cell suspension is separated into a return liquid having a cell concentration higher than that of the cell suspension and a permeate having a cell concentration lower than that of the cell suspension.
  • the return liquid was returned to the culture container (returning the return liquid to the culture container). From the same day (3 days after seeding), oxygen was supplied into the culture container from the lower surface side of the culture container at a flow rate of 1 mL/min using a single tube having an inner diameter of 2 mm with one end inserted in the culture container.
  • the average cell concentration (the average value of the cell concentration at two time points by the twice-daily cell concentration measurement described below) was An operation (cell bleeding operation) of extracting a predetermined amount of cell suspension from the culture container was performed once a day so that the cell density was about 80 ⁇ 10 6 cells/mL, and the culture was continued until 28 days after seeding. .. If the reciprocating flow of the cell suspension by the diaphragm pump is stopped during the culture, increase the maximum absolute value of the pressure in the diaphragm gas side chamber to 0.1 MPa, and if the reciprocating flow does not resume, continue the culture. Stopped. After the culture was stopped, it was visually confirmed whether or not the diaphragm was broken.
  • Viability means the ratio of the number of living cells to the total number of dead cells and living cells.
  • Comparative Example 1 the XCell ATF2 manufactured by Repligen was used as the diaphragm pump to be tested.
  • a diaphragm pump having a diaphragm made of the following materials in a metal container made of SUS316 was used.
  • silicone rubber (TSE3457T) manufactured by Momentive Performance Materials Japan LLC and in Example 12 silicone rubber (TSE3478T) manufactured by Momentive Performance Materials Japan LLC.
  • a diaphragm obtained by molding silicone rubber (KE-951-U) manufactured by Co., Ltd. and having the sizes and characteristics shown in Tables 1 and 2 is housed in the metal container, and an air and vacuum pump and a solenoid valve are housed.
  • a device capable of switching the pressure in the pump (pressure in the gas side chamber) to positive pressure or negative pressure at regular intervals was used.
  • the thickness of each position of the diaphragm was measured with a thickness meter (Mitsutoyo Corporation, trade name Thickness Gauge 547-31) before using the diaphragm pump for the above culture.
  • the tensile stress at the diaphragm elongation of 50% was measured according to the following procedure.
  • a test piece E1 having a width of 10 mm and a length of 40 mm was cut out from the diaphragm, and a tensile test was performed on the test piece E1 using a tensile tester Strograph R2 (trade name) manufactured by Toyo Seiki Seisakusho.
  • the thickness of the test piece E1 was measured using a high precision Digimatic Micrometer MDH-25M (trade name) manufactured by Mitutoyo Corporation.
  • the distance between chucks was 10 mm
  • the tensile speed was 10 mm/min
  • the tensile test was performed in the length direction of the test piece E1.
  • the tensile stress at an elongation rate of 50% was derived by dividing the load at an elongation rate of 50%, that is, when the chuck gap was 15 mm, by the thickness of the test piece E1.
  • test piece E1 Three pieces of the test piece E1 were cut out from one diaphragm, and the tensile test was repeated three times using the three test pieces, and the average value of the obtained three tensile stresses was used as the tensile stress at an elongation rate of 50% of the diaphragm. ..
  • FIG. 4 shows a concrete example of the specific state of the diaphragm state evaluation.
  • FIG. 4A shows the state of the diaphragm in the state A according to the above determination criteria
  • FIG. 4B shows the state of the diaphragm in the state B according to the above determination criteria.
  • ) Represents the state of the diaphragm in the state C according to the above determination criteria
  • FIG. 4D represents the state of the diaphragm in the state D according to the above determination criteria.
  • FIGS. 4A to 4D there are obvious abnormalities in the states B, C, and D, but in the states B and C, the diaphragm itself can be operated. Therefore, it can be said that the states A to C are within the allowable range.
  • FIG. 5 shows a specific example of evaluation of cell proliferation and average viability.
  • the change curve shown as proliferation in FIG. 5 represents the relationship between the number of culture days after seeding and the cell concentration (viable cell concentration).
  • the cell proliferation property is evaluated as B, the cell concentration typically reaches a maximum at a relatively low cell concentration and then decreases as shown in FIG.
  • cell viability the number of viable cells/(the number of viable cells+the number of dead cells)
  • the viability after sowing tends to decrease gradually, the decreasing tendency becomes more remarkable as the rank of the average viability evaluation goes down.
  • the average viability of C is within the allowable range.
  • the permissible range in the evaluation of cells is premised on that the cell proliferative property is within the permissible range (proliferative property A), and high viability indicates a more preferable range.
  • the volume of the space defined by the diaphragm and the plane including the surface of the outer edge portion of the diaphragm that is far from the apex of the diaphragm is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less, and the angle A is in the range of 0° to 75°.
  • the thickness H of the diaphragm is also in the range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less at the point of, and the thickness H of the diaphragm is calculated at any point in the range of the angle A from 0° to 75°.
  • the volume of the space exceeds 20 cm 3
  • the maximum value of the diaphragm thickness H in the region of the angle A from 0° to 75° exceeds 1.5 mm
  • the maximum value of H T /H is In Comparative Example 1 exceeding 1.75, the increase in cell concentration stopped at a low cell concentration, and sufficient cell growth properties were not obtained. The culture was stopped because the cell concentration began to decrease. Therefore, the diaphragm state after 28 days of culture and the average viability for 28 days could not be measured. This result shows that even if the conventional diaphragm pump for culture is used, cell proliferation cannot be maintained in the culture on a small scale.
  • Comparative Example 2 in which the minimum value of the thickness H of the diaphragm in the region where the angle A is 0° to 75° is less than 0.5 mm, the cell concentration is 80 ⁇ 10 before 10 days after seeding. Before reaching 6 cells/mL, the diaphragm was torn during the culture. Therefore, cell proliferation and average viability for 28 days could not be measured.
  • Comparative Example 3 in which the maximum value of the diaphragm thickness H in the region where the angle A is from 0° to 75° exceeds 1.5 mm, the increase in cell concentration stops at a low cell concentration, resulting in sufficient cell proliferation. Was not obtained. The culture was stopped because the cell concentration began to decrease.
  • Comparative Example 5 corresponds to the diaphragm of Comparative Example 1 for the XCell ATF2 manufactured by Repligen, which is reduced in a similar shape.
  • Comparative Example 6 in which the minimum value of H T /H was less than 1, the diaphragm was torn during the culture. Therefore, the average viability for 28 days could not be measured.
  • the volume of the space defined by the outer edge of the diaphragm and the plane including the surface far from the apex of the diaphragm is 1 cm 3 or more and 20 cm 3 or less, and the angle A is from 0° to 75°.
  • the diaphragm thickness H is in the range of 0.5 mm or more and 1.5 mm or less at any point, and the diaphragm thickness H is H at any point in the region where the angle A is 0° to 75°. Only by using the diaphragm pump satisfying the formula 1 is it possible to achieve both high cell growth property and suppression of diaphragm breakage in small-scale culture.
  • Example 4 Furthermore, by comparing the results of Example 4 with the results of Examples 7 to 9, by satisfying H Z ⁇ H Y and H Z ⁇ H, the damage of the diaphragm tends to be further suppressed. I know there is. Further, by comparing the results of Example 10 with the results of Example 11, by setting the value of HY /H to a value in the range of more than 1 and 3 or less, a higher cell viability tends to be obtained. I know there is. By comparing the results of Examples 12 and 14 with the results of Examples 13 and 15, the tensile stress ⁇ at an elongation rate of 50% of the diaphragm is within a range of 0.4 MPa or more and 1.5 MPa or less.

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

細胞懸濁液を収容する培養容器と、培養容器内から細胞懸濁液を抜き出すためのダイアフラムポンプとを備え、ダイアフラムポンプのダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、ダイアフラムにおける各点について、ダイアフラムの頂点から平面Ｆに下ろした垂線の足と各点とを結ぶ直線が垂線となす角度を各点の角度Ａとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、ダイアフラムの頂点におけるダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５の関係を満たす、細胞培養装置。前記細胞培養装置を用いた細胞培養方法及び生産物の製造方法も提供される。

Description

細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法
　本開示は、細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法に関する。
　細胞を培養する際には、種々の目的で培養液を培養容器内からポンプを用いて抜き出す場合がある。例えば、特開２０１０－２９１０９号公報（特許文献１）では汚染微生物を捕集する目的で、培養容器内から培養液の抜き出しを行っている。
　米国特許第６５４４４２４号明細書（特許文献２）は、培養容器内から抜き出した培養液に対してタンジェンシャルフロー方式による濾過を、ダイアフラムポンプを用いて行うことを記載している。
　本発明の実施形態が解決しようとする課題は、容量の小さいダイアフラムポンプにより細胞懸濁液の抜き出しをする場合に、良好な細胞増殖性とダイアフラムの破損抑制とを両立できる細胞培養装置及び細胞培養方法、並びに前記細胞培養方法を用いた生産物の製造方法を提供することである。
　上記課題を解決するための手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞　細胞懸濁液を収容する培養容器と、
　上記培養容器内から上記細胞懸濁液を抜き出すためのダイアフラムポンプとを備え、
　上記ダイアフラムポンプのダイアフラムと、上記ダイアフラムの外縁部の上記ダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、
　上記ダイアフラムにおける各点について、上記ダイアフラムの頂点から上記平面Ｆに下ろした垂線の足と上記各点とを結ぶ直線が上記垂線となす角度を上記各点の角度Ａとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても上記ダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、
　上記ダイアフラムの頂点における上記ダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても上記ダイアフラムの厚さＨが下記の式１を満たす、細胞培養装置。
　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　（式１）
＜２＞　上記ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点における上記ダイアフラムの厚さをＨＹとし、角度Ａが９０°の点における上記ダイアフラムの厚さをＨＺとしたとき、ＨＺ＜ＨＹであり、かつ、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても上記ダイアフラムの厚さＨがＨ≦ＨＺである、＜１＞に記載の細胞培養装置。
＜３＞　上記ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点における上記ダイアフラムの厚さをＨＹとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても上記ダイアフラムの厚さＨが下記の式２を満たす、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞培養装置。
　１＜ＨＹ／Ｈ≦３　（式２）
＜４＞　上記ダイアフラムの材質がシリコーンゴムである、＜１＞から＜３＞のいずれか１つに記載の培養装置。
＜５＞　上記ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力σが下記の式３を満たす、＜１＞から＜４＞のいずれか１つに記載の細胞培養装置。
　０．４ＭＰａ≦σ≦１．５ＭＰａ　（式３）
＜６＞　培養容器内に収容された細胞懸濁液中で細胞を培養することと、
　上記培養容器内からダイアフラムポンプにより上記細胞懸濁液を抜き出すこととを含み、
　上記ダイアフラムポンプのダイアフラムと、上記ダイアフラムの外縁部の上記ダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、
　上記ダイアフラムにおける各点について、上記ダイアフラムの頂点から上記平面Ｆに下ろした垂線の足と上記各点とを結ぶ直線が上記垂線となす角度を上記各点の角度Ａとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても上記ダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、
　上記ダイアフラムの頂点における上記ダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても上記ダイアフラムの厚さＨが下記の式１を満たす、細胞培養方法。
　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　（式１）
＜７＞　上記ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点における上記ダイアフラムの厚さをＨＹとし、角度Ａが９０°の点における上記ダイアフラムの厚さをＨＺとしたとき、ＨＺ＜ＨＹであり、かつ、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても上記ダイアフラムの厚さＨがＨ≦ＨＺである、＜６＞に記載の細胞培養方法。
＜８＞　上記ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点における上記ダイアフラムの厚さをＨＹとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても上記ダイアフラムの厚さＨが下記の式２を満たす、＜６＞又は＜７＞に記載の細胞培養方法。
　１＜ＨＹ／Ｈ≦３　（式２）
＜９＞　上記ダイアフラムの材質がシリコーンゴムである、＜６＞から＜８＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１０＞　上記ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力σが下記の式３を満たす、＜６＞から＜９＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
　０．４ＭＰａ≦σ≦１．５ＭＰａ　（式３）
＜１１＞　上記ダイアフラムポンプの運転時において、上記ダイアフラムを駆動させる上記ダイアフラムポンプの内部の圧力Ｐが下記の式４を満たす、＜６＞から＜１０＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
　大気圧－０．１ＭＰａ≦Ｐ≦大気圧＋０．１ＭＰａ　（式４）
＜１２＞　上記細胞がＣＨＯ細胞である、＜６＞から＜１１＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１３＞　上記培養容器内から抜き出された上記細胞懸濁液を、上記細胞懸濁液中の細胞濃度よりも高い細胞濃度を有する第一の溶液と、上記細胞懸濁液中の細胞濃度よりも低い細胞濃度を有する第二の溶液と、に分離膜を用いてタンジェンシャルフローフィルトレーション方式により分離する分離処理を行うことと、
　上記第一の溶液を上記培養容器内に戻すことと、
　上記培養容器内に新たに培地を添加することと、
　をさらに含む、＜６＞から＜１２＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１４＞　生産物を生産する細胞を＜６＞～＜１３＞のうちいずれか１つに記載の細胞培養方法を用いて培養することと、
　上記細胞懸濁液から生産物を回収することと、
　を含む、生産物の製造方法。
＜１５＞　上記生産物が抗体である、＜１４＞に記載の生産物の製造方法。
　本発明の実施形態によれば、容量の小さいダイアフラムポンプにより細胞懸濁液の抜き出しをする場合に、良好な細胞増殖性とダイアフラムの破損抑制とを両立できる細胞培養装置及び細胞培養方法、並びに前記細胞培養方法を用いた生産物の製造方法が提供される。
本開示に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 本開示に係る細胞培養装置におけるダイアフラムポンプの構成の一例を示す図である。 ダイアフラム上の各点の角度Ａを説明するための図である。 ダイアフラムにより規定される体積を説明するための図である。 （Ａ）～（Ｄ）は、実施例及び比較例におけるダイアフラムの状態の判定基準を示す図面である。 実施例及び比較例における増殖性及びバイアビリティの判定基準を示すグラフである。 実施例１における細胞濃度及びバイアビリティの推移を表すグラフである。
　以下、本開示に係る細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法について説明する。但し、本開示に係る実施形態は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、適宜、変更を加えて実施することができる。
　本開示において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
　本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
　本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
　本開示において、各成分の量は、各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、複数種の物質の合計量を意味する。
　本開示において、「工程」との語は、独立した工程だけではなく、工程の所期の目的が達成される限りは、他の工程と明確に区別できない工程をも含む。
　本開示に係る細胞培養装置は、
　細胞懸濁液を収容する培養容器と、
　培養容器内から細胞懸濁液を抜き出すためのダイアフラムポンプとを備え、
　ダイアフラムポンプのダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、
　ダイアフラムにおける各点について、ダイアフラムの頂点から平面Ｆに下ろした垂線の足と各点とを結ぶ直線が垂線となす角度を各点の角度Ａとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、
　ダイアフラムの頂点におけるダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが下記の式１を満たす、細胞培養装置である。
　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　（式１）
　細胞培養においては培養容器内から培養液の抜き出すためなどの目的でポンプを用いる場合がある。この目的でダイアフラムポンプを用いることも考えられるが、従来の細胞培養用ダイアフラムポンプは容量の比較的大きいダイアフラムポンプであり、ダイアフラムによって規定される空間の体積（後述）が例えば２０ｃｍ３以下といった小型のダイアフラムポンプを細胞培養に用いた例はこれまで無かった。一方、例えば実験用の培養においては大量の細胞あるいは生産物を得ることは目的とされていないため、培養スケールを小さくした方が培地の削減等、コストカットの観点からは好ましいと本発明者らは考えた。本発明者らは、また、培養スケールを小さくするのに応じてダイアフラムポンプも小型化することを考えた。しかし、ダイアフラムポンプを単純に小型化した場合にはダイアフラムの厚さも小さくなり、この結果、ダイアフラムの強度が低下し、培養中にダイアフラムが破損することを本発明者らは見出した。
　一方、小型ダイアフラムの強度を確保するために、ダイアフラムの厚さを増すと、ダイアフラムの反転時の衝撃が細胞にストレスを与え、細胞の増殖性に悪影響を及ぼす場合があることを本発明者らは見出した。
　そして、本発明者らは、ダイアフラムにおける厚さ分布について特定の設計を行うことにより、細胞の増殖性を確保しつつ、ダイアフラムの破損抑制も達成することができることを見出し、本開示に係る細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法を発明した。
　本開示に係る細胞培養装置において、培養容器は、一般的な培養装置（バイオリアクターとも言う）の培養容器、又はそれ以外の好適な容器を培養容器とすることができる。培養装置の例としては、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等が挙げられる。
　ダイアフラムポンプとは、ダイアフラムと呼ばれる隔膜の往復運動により液体の吸引及び排出を行うポンプである。本開示に係る細胞培養装置において使用可能なダイアフラムポンプの典型的な一例を図２に示す。なお、図２に示したダイアフラムポンプは逆止弁を有しない往復流発生タイプのダイアフラムポンプであるが、本開示に係る細胞培養装置に使用可能なダイアフラムポンプはこれに限定されず、逆止弁を有して一方向の流れを形成可能なダイアフラムポンプであってもよい。
　図２はダイアフラムポンプ３７の断面を示す断面図である。図２に示すダイアフラムポンプ３７は、液体が流通する流路（配管）５８及び気体が流通する流路（チューブ）５９に連結している。ダイアフラムポンプ３７は、部分３０４ａ及び部分３０４ｂからなるハウジング、並びにダイアフラム３０２を有しており、ダイアフラム３０２の両端部はハウジングの部分３０４ｂの中に固定されている。このため、ダイアフラム３０２の、ハウジング部分３０４ｂの中に格納された両端部はダイアフラムポンプの運転時でも動かない。この両端部は、実際にはダイアフラムの半径方向の外縁（外周）を形成しており、円環状の外縁部となっている。部分３０４ａ及び部分３０４ｂからなるハウジングは、鉄、ステンレス、プラスチックなど、ダイアフラムポンプのために必要な強度を有する材料であれば任意の材料からなるものであってよい。
　ダイアフラム３０２は、ダイアフラムポンプ３７内部の空間をチャンバー３０１とチャンバー３０３の２つに区画している。チャンバー３０１は流路５８からの液体により満たされており、チャンバー３０３は流路５９からの気体によって満たされている。流路５９の内部が真空ポンプ等により減圧されると、チャンバー３０３内の圧力も低下するため、チャンバー３０１とチャンバー３０３との間の圧力差によりダイアフラム３０２はチャンバー３０３側に向かって弧を描く形状となる。一方、流路５９の内部が加圧ガス源等により加圧されると、チャンバー３０３内の圧力も上昇するため、チャンバー３０１とチャンバー３０３との間の圧力差によりダイアフラム３０２はチャンバー３０１側に向かって弧を描く形状となる。この２つの状態の間を往復することで、流路５８内に往復流を発生させることができる。このような往復流は、タンジェンシャルフローフィルトレーション方式による濾過などに用いることができる。
　一方、上記のとおりダイアフラムポンプにより一方向の流れを形成することも可能である。この場合には、チャンバー３０１内に流路５８以外にもう一本の流路を取り付け、それぞれの流路に逆止弁を取り付けることで、ダイアフラム３０２の往復動（反転）により一方向の流れを形成することができる。
　なお、図２に示されるように、ダイアフラムの中心は、ダイアフラムの外縁部の円環の図２における下面が含まれる平面からの距離が最も遠い点となっており、ダイアフラムの頂点と称することができる。図２に示すように断面で見た場合にダイアフラムの中心はダイアフラムが形成する弧の頂点部に位置するためである。
　ダイアフラムは上記のとおり往復動を繰り返すため、弾性体であることが好ましい。弾性体とは、力を受けるとそれに応じて変形し、力を除くと変形がもとに戻る部材のことを指し、特には、ゴム弾性を有する材料からなるものをいう。ゴム弾性とは、弾性率が金属と比較して小さく、力に対する変位量が大きいものを指し、２５℃における弾性率（ヤング率）が数ＭＰａ～数百ＭＰａ程度のものであり、具体的には、１ＭＰａから６０ＭＰａ程度のものをいう。ヤング率は、例えば、商品名「ＴＧＩ　１００ｋＮ」（ミネベア製）を使用し、ＪＩＳ　　Ｋ７１６１（２０１４年）に準拠した方法（試験片寸法：縦５ｃｍ×横１．５ｃｍ×厚さ０．１ｃｍ、試験速度：０．５ｍｍ／ｍｉｎ）で測定することができる。
　本開示に係る細胞培養装置においては、ダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、
　ダイアフラムにおける各点について、ダイアフラムの頂点から平面Ｆに下ろした垂線の足と各点とを結ぶ直線が垂線となす角度を各点の角度Ａとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、
　ダイアフラムの頂点におけるダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが下記の式１を満たす。
　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　　（式１）
　本開示中においては、ダイアフラムの種々の領域、空間の体積又は点の厚さについて説明されるが、特段の断りが無い限り、本開示中におけるダイアフラムの領域、空間の体積又は点の厚さについての記載はいずれも、ダイアフラム（ダイアフラムを構成する弾性体）に外からの圧力がかかっていない状態で測定されたダイアフラムの領域、空間の体積又は点の厚さを意味する。ダイアフラムポンプの運転中には、ダイアフラムの両面にかかる圧力には圧力差が生じ、それによってダイアフラムは反転等の挙動を繰り返す。しかし、本開示中に記載されるダイアフラムの領域、空間の体積又は点の厚さは、このような圧力差がある状態、つまりダイアフラムのいずれかの面から圧力を受けている状態、で測定されるものではなく、例えばダイアフラムをダイアフラムポンプから取り出す等することでダイアフラムに外からの圧力がかからない状態とすることで測定されるダイアフラムの領域、空間の体積又は点の厚さである。なお、ダイアフラムを支持台上に載置して厚さを測定するような場合、載置する向きによって異なる方向に自重を受けることになるが、ダイヤフラムの自重による変形は無視できる程度であるため、領域、空間体積、厚さの測定において特に影響しない。
　図３Ａ及び図３Ｂを参照しながら上記の空間及び角度Ａについて説明する。ダイアフラムは、図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、ハウジングへの固定を強固にするための突起部を除き平坦な円環状の外縁部と、外縁部からドーム状に隆起した形状の可動部を有している。このため、ダイアフラムの中心は、ドーム状の隆起形状の頂点Ｔとなっている。可動部は、図２において説明したとおり、ダイアフラムにより仕切られたチャンバーとチャンバーとの間の圧力差により、反転可能である。図３Ａ及び図３Ｂにおいて、ダイアフラムの外縁部はダイアフラムポンプのハウジングに固定されており、外縁部の図３Ａ及び図３Ｂにおける下面（第１の面）は、ハウジングへの固定を強固にするための突起部を除き、同一平面上に属している。この下面は実際には円環状の形状を有している。外縁部の図３Ａ及び図３Ｂにおける上面（第２の面）についても、下面と同様に、円環状であって、また、ハウジングへの固定を強固にするための突起部を除き同一平面上に属している。ダイアフラムの外縁部の図３Ａ及び図３Ｂにおける下面（上記突起部を除く）が含まれる平面を、本開示においては平面Ｆと称する。平面Ｆは、ダイアフラムの外縁部の下面が属する平面を可動部の下の空間にまで延伸して形成される仮想的な平面である。なお、外縁部の図３Ａ及び図３Ｂにおける下面とは、外縁部の面のうち、ダイアフラムの頂点（つまり中心点）Ｔから遠い側の面である。言い換えれば、図３Ａにおいて頂点Ｔは、外縁部から上方向に隆起しているため、外縁部の上面及び下面のうち頂点Ｔからより遠いのは下面である。
　頂点Ｔからダイアフラムが反転すると、図３Ａにおいて仮想線により示された形状をダイアフラムは有するようになるが、この場合でも弧を描く方向が逆になるだけで形状自体は同一となるため、図３Ａにおける実線で示された形状の場合について説明をする。
　「ダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間」とは、ダイアフラムの弧の形状の部分の図３Ｂにおける下面（平面Ｆに近い方の面）と、平面Ｆとに規定される（囲まれる）閉空間を指す。この閉空間は、その断面が図３Ｂにおける点描部として示されている。この閉空間の体積は、ダイアフラムが反転することにより引き起こされる液体側チャンバー（図２におけるチャンバー３０１）の容積変化のおよそ１／２の値であり、ダイアフラムポンプに流入する、又はダイアフラムポンプから吐出される液体の量の指標となる。本開示におけるダイアフラムポンプにおいては、上記閉空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、従来培養に用いられてきたダイアフラムポンプの体積よりも小さくなっている。
　ダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積を１ｃｍ３以上とすることで、培養容器内から十分な量の細胞懸濁液を引き抜くことが可能となる。特に、灌流培養における培地中の老廃物等の除去にダイアフラムポンプを用いている場合は、細胞の老廃物等を濾過等により十分に系外に排出でき、細胞の増殖性を高めて、細胞生存率を維持することが容易になる。また、ダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積を２０ｃｍ３以下とすることで、細胞容器外における培養液の滞留時間が過剰に長くなることを容易に回避できる。細胞容器外は細胞容器内と比べて酸素供給、温度維持等の条件が低下しやすい箇所であり、細胞容器外における培養液の滞留時間が過剰に長くなることを回避することで細胞の増殖性を高めて、細胞生存率を維持できる。これにより、例えば実験用の小スケールの培養に対応することが可能であり、培養コストを低減することができる。
　上記の観点から、ダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積は２ｃｍ３以上１５ｃｍ３以下であることが好ましく、２．５ｃｍ３以上１０ｃｍ３以下であることがより好ましく、３ｃｍ３以上５ｃｍ３以下であることがさらに好ましい。
　ダイアフラムの弧の形状の部分に含まれる各点については、ダイアフラムにおける相対的位置を角度により表現することができる。図３Ａに示されるように、ダイアフラムの頂点（中心）から平面Ｆに下ろした垂線Ｐｒを基準線とすると、頂点は垂線Ｐｒからの角度が０°の位置にある。ダイアフラムの弧の形状の部分（外縁部以外の部分）に含まれる任意の点（例えば図３Ａにおける点Ｐｔ）について、ダイアフラムの頂点（中心）から平面Ｆに下ろした垂線Ｐｒの足Ｆｔから当該任意の点に向けて引いた直線と、上記垂線Ｐｒとのなす角度（角度Ａとも称する）を規定することができる。この角度Ａは、方向によらず負の値は取らないものとし、このため角度Ａはダイアフラムの中心から離れるほど大きくなり、平面Ｆ上に属する点においては角度９０°となる。なお、ダイアフラムの弧の形状の部分に含まれる上記任意の点は、ダイアフラムの図３Ａにおける下面（頂点から遠い側の面）において設定する。
　なお、ダイアフラムの可動部が有するドーム状の隆起形状は、垂線Ｐｒを軸として円対称な形状であることが好ましい。隆起形状の断面（図３Ａに示されるような垂線Ｐｒを含む断面）の形状（外縁部との接続箇所を除く）、は、半球や楕円であってもよいが、半球や楕円のような規則的な形状である必要は必ずしも無い。例えば、図３Ａにおいて、ダイアフラムの可動部の下面の縦方向（垂線Ｐｒの方向）の座標（図３Ａにおける上方を正とする）を横方向（垂線Ｐｒに直交する方向）の座標（図３Ａにおける右側を正とする）で２階微分した値が、外縁部との接続箇所を除いて、０以下である任意の形状であってもよい。
　本開示におけるダイアフラムポンプにおけるダイアフラムでは、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨは０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内である。言い換えると、ダイアフラムの厚さＨは各点において決まる変数であるが、ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域（図３Ａにおける領域Ｘ）におけるこの変数の最小値及び最大値はいずれも０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内である。ここで、ダイアフラムポンプは弧の形状を形成しているが、各点における厚さＨは、各点におけるダイアフラムの下面への接線に垂直な方向におけるダイアフラムの寸法を意味する。また、Ｈは、特に断りが無ければ、角度Ａが０°から７５°までの領域における各点におけるダイアフラムの厚さを指す。
　角度Ａが０°から７５°までの領域における各点におけるダイアフラムの厚さが０．５ｍｍ以上であることにより、培養途中でのダイアフラムの破損を効果的に抑制でき、培養の継続が容易になる。また、角度Ａが０°から７５°までの領域における各点におけるダイアフラムの厚さが１．５ｍｍ以下であることにより、ダイアフラムの反転が困難となることを回避でき、ダイアフラムの反転によりダイアフラムポンプの機能を十分に発揮することができる。
　上記の観点から、ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域における各点における厚さは、０．６ｍｍ以上１．４ｍｍ以下であることが好ましく、０．７ｍｍ以上１．３ｍｍ以下であることがより好ましく、０．８ｍｍ以上１．２ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
　ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域は、ダイアフラムの頂点及びその周辺の領域である。角度Ａが０°から７５°までの領域における厚さが均一であるか、又はダイアフラムの頂点における厚さが周辺領域よりも若干厚いことによりダイアフラムの耐久性が向上し破れにくくなる。一方、ダイアフラムの頂点における厚さが周辺領域の厚さに比べ大きすぎると、相対的に薄い部分に応力が集中しやすくなり、ダイアフラムが破れやすくなる。
　これらの観点から、本開示におけるダイアフラムにおいては、ダイアフラムの頂点におけるダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨは下記の式１を満たす。
　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　（式１）
　式１を満たすことで、ダイアフラムの破損抑制における効果以外にも、ダイアフラムの反転挙動がよりしなやかになるという効果も得られる。なお、ダイアフラムの反転挙動は、頂点における厚さとその周辺の厚さとが均一に近くなるほどよりしなやかになる傾向がある。ダイアフラムの反転挙動がしなやかであると、チャンバー３０１内の細胞懸濁液における急激な流速上昇によるせん断増加を回避でき、細胞へのダメージが小さくなる。
　上記のとおりＨは各点の厚さを表す変数であるが、上記の観点から、ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいかなる点についても、ＨＴ／Ｈの値は１以上１．５以下であることが好ましく、１以上１．３以下であることがより好ましく、１以上１．２以下であることがさらに好ましい。
　ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域（図３Ａにおける領域Ｙ）における点のうち、最も厚さが厚い点におけるダイアフラムの厚さをＨＹとし、角度Ａが９０°の点（図３Ａにおける点Ｚ）におけるダイアフラムの厚さをＨＺとしたとき、ＨＺ＜ＨＹであることが好ましく、かつ、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨはＨ≦ＨＺであることが好ましい。ダイアフラムの破れに関係する領域としては、主に、角度Ａが０°から７５°までの領域、角度Ａが７５°から８８°までの領域、及び角度Ａが９０°の点の３つがある。基本的に、ダイアフラム中で最も厚さの薄い部分に応力が集中しその点が破れやすいが、かといって全ての領域の厚さを増すだけではダイアフラム反転時の衝撃が大きくなり、細胞増殖性を低下させてしまうおそれがある。このため、ダイアフラムが反転する際最も応力が集中しやすい領域である角度Ａが７５°から８８°の領域の最大の厚さを他の領域の厚さよりも厚くすることが好ましく、この意味でＨＺ＜ＨＹであることが好ましい。また、角度Ａが７５°から８８°までの領域におけるダイアフラムの厚さの最小値をＨＳとすると、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨはＨ≦ＨＳであることが好ましい。
　ＨＹ／ＨＺは１を超え３以下であることが好ましく、１を超え２以下があることがより好ましく、１を超え１．５以下であることがさらに好ましく、１を超え１．３以下であることがいっそう好ましい。角度Ａが９０°である点における厚さＨＺが大きいほど、角度Ａが７５°から８８°までの領域にかかる応力が大きくなるため、ＨＹをより大きく（ＨＺより大きく）することが好ましい。また、ＨＺに対するＨＹの比の上限値を上記のとおり制限した方が、ダイアフラムの反転挙動をよりしなやかにすることができ、ダイアフラムの反転挙動に起因する細胞へのダメージをより低減することができ、細胞の増殖性をより高めて、細胞生存率の低下をより抑制することができる傾向にある。なお、角度Ａが９０°の点は実際には円状の線上に位置しているが、この線上においてもしダイアフラムの厚さにばらつきがある場合は、ＨＹとの比較に用いる厚さとしては、上記線上における最大の厚さを用いる。
　ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点の厚さＨについてもＨ≦ＨＺであることが好ましく、ＨＺ＜ＨＹも同時に満たすことがより好ましい。角度Ａが０°から７５°までの領域におけるダイアフラムの厚さが厚いほど、角度Ａが９０°である点にかかる応力が大きくなる傾向があるため、角度Ａが９０°である点におけるダイアフラムの厚さＨＺをより大きく（角度Ａが０°から７５°までの領域における任意の点の厚さよりも大きく）することが好ましい。なお、角度Ａが９０°の点は実際には円状の線上に位置しているが、この線上においてもしダイアフラムの厚さにばらつきがある場合は、角度Ａが０°から７５°までの領域における任意の点の厚さＨとの比較に用いる厚さとしては、上記線上における最小の厚さを用いる。
　また、ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点の厚さＨについてもＨ≦ＨＺであり、かつＨＺ＜ＨＹも同時に満たす場合、ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点の厚さＨについてもＨ＜ＨＹとなるため、角度Ａが７５°から８８°までの領域におけるダイアフラムの破れを抑制する上で好ましい。
　Ｈｚの値は特に規定されないが、０．５ｍｍ以上２ｍｍ以下であることが好ましく、０．７ｍｍ以上１．９ｍｍ以下であることがより好ましく、０．９ｍｍ以上１．８ｍｍ以下であることがさらに好ましく、１ｍｍ以上１．７ｍｍ以下であることが最も好ましい。
　また、ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点の厚さＨについても、ＨＺ／Ｈの値が１以上３以下であることが好ましく、１．１以上２．５以下であることがより好ましく、１．２以上２．０以下であることがさらに好ましく、１．３以上１．８以下であることが最も好ましい。ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域における各点での厚さＨに対するＨＺの比の上限値を上記のとおり制限した方が、角度Ａが７５°から８８°までの領域におけるダイアフラムの厚さが過度に大きくなることを回避しやすいため、ダイアフラムの反転挙動をよりしなやかにできる傾向があり、ダイアフラムの反転挙動による細胞へのダメージをより減少し、細胞の増殖性をより高めて、細胞生存率をより向上できる傾向にある。
　また、ダイアフラムにおける角度Ａが８８°を超え９０°未満の領域については、図３Ａから分かるようにダイアフラム反転の際に僅かしか動かない領域である。角度Ａが８８°を超え９０°未満の領域については、角度Ａが９０°の点と同様に考えることができるため、ＨＺについて記載した事項を同様に適用してもよい。
　ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点におけるダイアフラムの厚さＨＹに対して、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨは下記の式２を満たすことが好ましい。
　１＜ＨＹ／Ｈ≦３　　（式２）
　角度Ａが０°から７５°までの領域におけるダイアフラムの厚さが厚いほど、Ｙにかかる応力が大きくなる傾向がある。ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点の厚さＨについても、ＨＹ／Ｈが１を超えるようにすることにより、角度Ａが７５°から８８°までの領域はダイアフラムの反転時の応力に耐えるだけの厚さを有し、角度Ａが７５°から８８°までの領域においてダイアフラムの破れがより生じにくくなる。ＨＹ／Ｈが３以下となるようにすることで、ダイアフラムの反転挙動をよりしなやかに維持し、ダイアフラムの反転挙動による細胞へのダメージをより低減し、細胞増殖性をより向上し、細胞生存率をより低下させることができる傾向にある。
　上記の観点から、ダイアフラムにおける角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点の厚さＨについても、ＨＹ／Ｈは１を超え３以下であることが好ましく、１．２以上２．８以下であることがより好ましく、１．４以上２．６以下であることがさらに好ましく、１．６以上２．４以下であることがいっそう好ましい。
　また、ＨＹの値は特に限定されないが、１ｍｍ以上３ｍｍ以下であることが好ましく、１．２ｍｍ以上２．８ｍｍ以下であることがより好ましく、１．４ｍｍ以上２．６ｍｍ以下であることがさらに好ましく、１．６ｍｍ以上２．４ｍｍ以下であることが最も好ましい。
　ダイアフラムの材質としては、ゴム材料（例えばクロロプレンゴム、ニトリルゴム、エチレンプロピレンジエンゴム、シリコーンゴム）、エラストマー（例えば、熱可塑性ポリエステルエラストマー、塩化ビニル樹脂系熱可塑性エラストマー）、フッ素樹脂（例えば、ポリテトラフルオロエチレン）などが挙げられる。
　ダイアフラムの材質はダイアフラムとしての働きが可能であれば特に限定されず、任意の弾性体であってよい。ダイアフラムの材質はシリコーンゴムであることが好ましく、硬度４５以上５４以下のシリコーンゴムであることがより好ましく、硬度４５以上５４以下であり、かつ引張強さが５ＭＰａ以上８ＭＰａ以下であるシリコーンゴムであることがさらに望ましい。シリコーンゴムの例としては、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製ＴＳＥ３４５７Ｔなどが挙げられる。ゴムの硬度は、ＪＩＳ Ｋ６２５３：２０１２に準拠して、デュロメータ　タイプＡにより測定できる。また、ゴムの引張強さはＪＩＳ　Ｋ６２４９：２００３に準拠して、当該ＪＩＳに規定のダンベルを用いて測定することができる。
　シリコーンゴムの硬度が４５以上５４以下であると、ダイアフラムの破れにくさと反転挙動のしなやかさのバランスがより良好になる。シリコーンゴムの引張強さが５ＭＰａ以上８ＭＰａ以下であると、ダイアフラムの破れにくさと反転挙動のしなやかさのバランスがより良好になる。シリコーンゴムの硬度が４５以上５４以下であり、加えて、シリコーンゴムの引張強さが５ＭＰａ以上８ＭＰａ以下であると、ダイアフラムの破れにくさと反転挙動のしなやかさのバランスがさらに良好になる。反転挙動がしなやかであることは、細胞へのダメージ低減、細胞増殖性の向上、細胞生存率の向上につながる。
　ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力σは下記の式３を満たすことが好ましい。
　０．４ＭＰａ≦σ≦１．５ＭＰａ　（式３）
　ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力σは、以下のやり方で求めることができる。
＜ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力の測定方法＞
　ダイアフラムから幅１０ｍｍ、長さ４０ｍｍの大きさの試験片を切り出し、試験片に対し、株式会社東洋精機製作所製の引張試験機ストログラフＲ２（商品名）を用いて引張試験を行う。引張試験の前に、試験片の厚さを、株式会社ミツトヨ製の高精度デジマチックマイクロメータＭＤＨ－２５Ｍ（商品名）を用いて測定する。引張試験は、チャック間距離を１０ｍｍとし、引張速度を１０ｍｍ／分として、試験片の長さ方向に引張試験を行う。伸び率５０％すなわちチャック間が１５ｍｍになったときの荷重を、試験片の厚さで割ることで、伸び率５０％のときの引張応力を算出する。試験片は１つのダイアフラムから３枚切り出し、３枚の試験片を用いて引張試験を３回繰り返し、得られた３つの引張応力の平均値をダイアフラムの伸び率５０％における引張応力として使用する。 
　ダイアフラムの伸び率５０％のときの引張応力σが０．４ＭＰａ以上であることで、ダイアフラムが低い圧力で勢いよく反転することをより回避でき、細胞へのダメージをより減少できる傾向がある。ダイアフラムの伸び率５０％のときの引張応力σが１．５ＭＰａ以下であることで、ダイアフラムを反転させるために必要な圧力をより適切な範囲に制御することができ、また、ダイアフラムの反転挙動の勢いによる細胞へのダメージをより減少できる傾向にある。したがって、ダイアフラムの伸び率５０％のときの引張応力σが０．４ＭＰａ以上１．５ＭＰａ以下であることで、ダイアフラムの反転挙動をよりしなやかにすることができ、細胞へのダメージを軽減して細胞生存率を高く維持することがより容易になる傾向にある。
　上記の観点から、ダイアフラムの伸び率５０％のときの引張応力σは、０．４ＭＰａ以上１．５ＭＰａ以下であることが好ましく、０．５ＭＰａ以上１．３ＭＰａ以下であることがより好ましく、０．６ＭＰａ以上１．１ＭＰａ以下であることがさらに好ましい。
　本開示に係る細胞培養方法は、
　培養容器内に収容された細胞懸濁液中で細胞を培養することと、
　培養容器内からダイアフラムポンプにより細胞懸濁液を抜き出すこととを含み、
　ダイアフラムポンプのダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、
　ダイアフラムにおける各点について、ダイアフラムの頂点から平面Ｆに下ろした垂線の足と各点とを結ぶ直線が垂線となす角度を各点の角度Ａとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、
　ダイアフラムの頂点におけるダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが下記の式１を満たす、細胞培養方法である。
　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　（式１）
　培養容器及びダイアフラムポンプについては、本開示に係る細胞培養装置の説明において記載した事項がそのまま当てはまる。
　本開示に係る細胞培養方法において培養する細胞は、特に限定されず、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、及び枯草菌、大腸菌などの原核細胞が挙げられる。細胞は、ＥＳ細胞、ＩＰＳ細胞、各種幹細胞などであってもよい。
　本開示に係る細胞培養方法において培養する細胞は、生産物を生産する細胞であってもよい。生産物を生産する細胞を培養すると、細胞により生産物が生産され、これを回収すれば細胞を用いた物質生産を行うことができる。生産物を生産する細胞として用いられる細胞は、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、及び枯草菌、大腸菌などの原核細胞のいずれであってもよい。ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、Ｃ１２７細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＳ０細胞及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞などの動物細胞が好ましく、解析が多数行われ、遺伝子工学的な手法が確立している点でＣＨＯ細胞がより好ましい。所望の生産物を細胞が元々生産しない又は生産量が少ない場合であっても、例えば、生産物を生産するのに必要な蛋白質をコードするプラスミドなどの発現ベクターを細胞に導入することで、所望の生産物を効率よく生産させることができる。本開示における細胞によって生産される生産物は、上記の細胞が培養液中に生産する物質であれば、特に限定されず、例えば、アルコール、酵素、抗生物質、核酸、組換えタンパク質、抗体などの物質が挙げられる。中でも生産物として、好ましくは、組み換えタンパク質又は抗体であり、より好ましくは抗体である。
　培養容器内に収容された細胞懸濁液中における細胞の濃度は特に限定されない。ただし、培養容器内に収容された細胞懸濁液中における細胞の濃度が高い方が、細胞量が大きくなること、及び細胞が生産物を生産する場合には生産物の生産量が大きくなることから、細胞の濃度が高いことは好ましい。培養容器内に収容された細胞懸濁液中における細胞の濃度は、細胞を播種後に増大するが、例えば、２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の範囲内の細胞濃度まで増大してもよい。あるいは、培養容器内に収容された細胞懸濁液中における細胞の濃度は、３０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の範囲内の細胞濃度まで増大してもよく、４０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の範囲内の細胞濃度まで増大してもよく、又は５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の範囲内の細胞濃度まで増大してもよい。なお、本開示中において、細胞について「濃度」とは、個数密度、つまり単位容量当たりの細胞数を指す。
　細胞の培養に用いる培地としては、細胞の培養に通常使用されている液体培地を用いることができる。例えば、ＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１２６８１０１１）培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ－１５培地、及びＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＣＨＯ－ＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＣＤ－ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、　ＩＳ　ＣＨＯ－Ｖ（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＦ－ＡＣＦ－ＣＨＯ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）などを使用することができる。
　培地にはウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加してもよい。あるいは、培地は無血清培地、例えば完全合成培地であってもよい。
　培地には、アミノ酸、塩、糖類、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素、植物タンパク質の加水分解物などの追加成分を補充してもよい。
培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．０～８．０であり、好ましくはｐＨ６．８～７．６であり、より好ましくはｐＨ７．０～７．４である。
　培養温度は、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは３２℃～３７℃であり、より好ましくは３６℃～３７℃であり、培養中に培養温度を変更してもよい。
　培養は、ＣＯ２濃度が０～４０％の雰囲気下で行ってもよく、ＣＯ２濃度が２～１０％の雰囲気下で行うことが好ましい。
　培養においては、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加えることができる。
　培養されている細胞懸濁液の総量（培養容器内の細胞懸濁液量、並びにダイアフラムポンプ及び流路等の培養容器に液体連絡している要素内の細胞培養液量を含む）は、本開示におけるダイアフラムポンプが使用可能な量であれば特に限定されないが、５０ｍＬ以上５００ｍＬ以下であることが好ましく、６０ｍＬ以上４００ｍＬ以下であることがより好ましく、７０ｍＬ以上３００ｍＬ以下であることがさらに好ましく、８０ｍＬ以上２５０ｍＬ以下であることが最も好ましい。上述のとおり、本開示においては、ダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であるダイアフラムを有するダイアフラムポンプを用いて培養を行う。このように、本開示に係るダイアフラムポンプの能力は限定されるため、細胞懸濁液の量が上述の範囲のように小さい小規模培養であることが好ましい。培養液体積を上述の下限値以上とすることで、サンプリングによる液量減少、揮発等の外乱の影響を受けにくくなり、培養継続がより容易になり、培養液体積を上述の上限値以下とすることで、培養液体積が小規模に抑えられ、実験コストも抑えられる傾向にある。
　本開示に係る細胞培養方法は、培養容器内の細胞懸濁液を撹拌翼により撹拌することを含んでいてもよく、細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含んでいてもよい。
　細胞の培養は灌流培養であることが好ましい。灌流培養は、新鮮な培地を添加し、同時に使用済み培地を除去する培養法である。灌流培養によれば、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超える高い細胞濃度を達成することも可能である。典型的な灌流培養は、１日間又は２日間続くバッチ培養スタートアップで始まり、その後、培養物に新鮮な供給培地を連続的、段階的、及び／又は断続的に添加し、使用済み培地を同時に除去する。灌流培養においては、沈降、遠心分離又は濾過などの方法を用いて、細胞濃度を維持しながら使用済み培地を除去することができる。灌流は、連続的、段階的、断続的又はこれらの組み合わせの何れの形態でもよい。
　ダイアフラムポンプを用いて、培養容器内からの細胞懸濁液の抜き出しを行う。培養容器内からの細胞懸濁液の抜き出しは、間欠的に行っても連続的に行ってもよいが、系の状態を安定に保つ観点からは連続的に行うことが好ましい。逆止弁を用いない往復流タイプのダイアフラムポンプを用いる場合、ダイアフラムポンプを運転すると、培養容器内からの細胞懸濁液の抜き出し、及び抜き出された細胞懸濁液の培養容器への戻しの両方が交互に行われることになる。このような場合も、上記の「培養容器内からの細胞懸濁液の抜き出し」の表現が指す範囲に含まれる。細胞懸濁液の抜き出し位置は、液面よりも下の位置であれば特に限定されず、例えば培養容器の底部近辺とすることができる。
　ダイアフラムポンプを用いる場合、培養容器とダイアフラムポンプとの間にクロスフロー方式のフィルタを設け、クロスフロー方式による濾過を行ってもよい。このような濾過により、細胞懸濁液からの細胞による生産物の回収、老廃物の除去等を行うことが可能である。
　ただし、本開示に係る細胞培養方法において細胞懸濁液の培養容器内からの抜き出しを行う目的は特に限定されず、抜き出された細胞懸濁液は単に廃棄されて細胞濃度の調節、老廃物の除去を行ってもよく、あるいは遠心分離等により細胞を回収する処理に供されてもよく、あるいはクロスフロー方式以外のフィルタにより細胞による生産物の回収、老廃物の除去等を行ってもよい。これらの場合、ダイアフラムポンプは往復流を発生するタイプであっても、一方向の流れを発生するタイプであってもよい。
　本開示に係る細胞培養方法においては、本開示に係る細胞培養装置の説明において記載した任意の事項を適用することができ、本開示に係る細胞培養方法は、例えば、以下の実施形態を含む。
　本開示に係る細胞培養方法においては、ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点におけるダイアフラムの厚さをＨＹとし、角度Ａが９０°の点におけるダイアフラムの厚さをＨＺとしたとき、ＨＺ＜ＨＹであり、かつ、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨはＨ≦ＨＺであることが好ましい。
　本開示に係る細胞培養方法においては、ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点におけるダイアフラムの厚さをＨＹとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨは下記の式２を満たすことが好ましい。
　１＜ＨＹ／Ｈ≦３　（式２）
　本開示に係る細胞培養方法においては、ダイアフラムの材質がシリコーンゴムであることが好ましい。
　本開示に係る細胞培養方法においては、ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力σが下記の式３を満たすことが好ましい。
　０．４ＭＰａ≦σ≦１．５ＭＰａ　（式３）
　本開示に係る細胞培養方法においては、ダイアフラムポンプの運転時において、ダイアフラムを駆動させるダイアフラムポンプの内部の圧力Ｐが下記の式４を満たすことが好ましい。
　大気圧－０．１ＭＰａ≦Ｐ≦大気圧＋０．１ＭＰａ　（式４）
　ダイアフラムポンプの内部の圧力Ｐとは、ダイアフラムポンプ内の、ダイアフラムを境として細胞懸濁液とは逆側の空間における圧力を指し、言い換えればダイアフラムポンプを駆動するための媒体の圧力を指す。ダイアフラムポンプの内部の圧力Ｐは、図２においては、気体で満たされたチャンバー３０３内の圧力を指す。上記の式は、言い換えれば、大気圧と圧力Ｐとの差の絶対値が、ダイアフラムポンプの運転中０．１ＭＰａ以下に維持されること、つまり大気圧と圧力Ｐとの差の絶対値の最大値が０．１ＭＰａ以下であることを意味している。ダイアフラムポンプの内部の圧力Ｐは、上記空間に連絡した流路等において測定することも可能であり、例えば図２における流路５９において測定することも可能である。
　圧力Ｐと大気圧との間の圧力差は、ダイアフラムを反転させるための原動力となる。上記圧力差の絶対値を０．１ＭＰａ以下とすることで、ダイアフラムの反転挙動を適切な速度で行うことができ、細胞へのダメージをより軽減し、ダイアフラムの破れをより抑制できる傾向がある。
　Ｐは［大気圧－０．１ＭＰａ］以上［大気圧＋０．１ＭＰａ］以下であることが好ましく、［大気圧－０．０８ＭＰａ］以上［大気圧＋０．０８ＭＰａ］以下であることがより好ましく、［大気圧－０．０６ＭＰａ］以上［大気圧＋０．０６ＭＰａ］以下であることがさらに好ましく、［大気圧－０．０５ＭＰａ］以上［大気圧＋０．０５ＭＰａ］以下であることがいっそう好ましい。ただし、圧力Ｐと大気圧との間の圧力差をある程度以上に維持した方が、ダイアフラムの完全な反転を促し、細胞懸濁液の滞留を回避する上で有効である。このため、圧力Ｐと大気圧との間の圧力差の絶対値の最大値（ダイアフラム反転サイクルにおける最大値）は１ｋＰａ以上であることが好ましく、５ｋＰａ以上であることがより好ましく、８ｋＰａ以上であることがさらに好ましく、１０ｋＰａ（０．０１ＭＰａ）以上であることがいっそう好ましい。
　本開示に係る細胞培養方法において、細胞懸濁液に含まれる細胞はＣＨＯ細胞であってもよい。
　本開示に係る細胞培養方法は、
　培養容器内から抜き出された細胞懸濁液を、細胞懸濁液中の細胞濃度よりも高い細胞濃度を有する第一の溶液と、細胞懸濁液中の細胞濃度よりも低い細胞濃度を有する第二の溶液と、に分離膜を用いてタンジェンシャルフローフィルトレーション方式により分離する分離処理を行うことと、
　第一の溶液を培養容器内に戻すことと、
　培養容器内に新たに培地を添加することと、
　をさらに含んでいてもよい。
　タンジェンシャルフローフィルトレーション方式とは、膜分離処理の対象となる液体を分離膜の膜面に沿って流すことにより、サイズの小さい成分を液体成分と共に分離膜の透過側へと移動させ、サイズの大きい成分及び残りの液体成分を分離膜の未透過側に保持する方式である。本開示においては、分離膜の未透過側、つまり供給側を１次側とも称し、分離膜の透過側を２次側とも称する。
　本開示においては、タンジェンシャルフローフィルトレーション方式による膜分離処理は、培養容器内から抜き出された細胞懸濁液が分離膜の膜面に沿って平行な一方向の流れを形成してもよいし、培養容器内から抜き出された細胞懸濁液の流れの方向を所定の時間毎に逆転させて、往復する流れを形成してもよい。
　培養容器内からの細胞懸濁液の抜き出しは、ダイアフラムポンプを用いて行うことができる。培養容器内から抜き出された細胞懸濁液は、タンジェンシャルフローフィルトレーションを行うためのフィルタ部へと送液される。培養容器内からフィルタ部への細胞懸濁液の抜き出しは、間欠的に行っても連続的に行ってもよいが、系の状態を安定に保つ観点からは連続的に行うことが好ましい。
　フィルタ部は、例えば、容器と、容器内の空間を供給側と透過側とに隔て、培養容器内から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施す分離膜とを備える。分離膜の供給側においては、フィルタ部は流路にそれぞれ接続された流入口及び流出口とを有する。タンジェンシャルフローフィルトレーション方式による膜分離処理において、培養容器内から抜き出された細胞懸濁液の流れの方向を所定の時間毎に逆転させる場合は、流入口と流出口とは流れの方向の逆転により入れ替わることになる。
　分離膜は、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタであっても、中空糸膜であってもよい。中空糸膜としては、精密濾過膜（ＭＦ膜）あるいは限外濾過膜（ＵＦ膜）を用いることができる。
　分離膜は、細胞懸濁液中の生細胞は透過させないが、例えば、細胞懸濁液中の目的とする生産物などの小分子は透過させる。例えば、抗体を動物細胞に生産させる場合、抗体のサイズが１ｎｍ～５ｎｍ程度であるのに対して、動物細胞の大きさは１０μｍオーダー程度であるため、例えば分離膜としての精密濾過膜や限外濾過膜を用いることで、生細胞を１次側に留めつつ、抗体を分離膜を通して２次側に移行させることができる。また、液体成分、例えば水分子の大きさは微小であるため、液体成分も一部の量が抗体と共に２次側に移行する。この結果、分離膜の非透過側に残った液体中における細胞濃度は上昇する。このように、タンジェンシャルフローフィルトレーション方式による分離を行うことにより、フィルタ部に送液された細胞懸濁液は、分離膜を透過せずに１次側に留まり、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、分離膜を透過して２次側に移行した、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する透過液とに分離される。透過液には例えば細胞による生産物などの小分子が含まれる。なお、ここでいう細胞懸濁液中の細胞濃度とは、培養容器内の細胞懸濁液中の生細胞の濃度を意味する。また、本開示において「細胞濃度」とは特段の断りが無い限り「生細胞濃度」を指す。
　１次側に留まった戻り液は、フィルタ部から流出して培養容器内に戻る。例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーションにおけるフィルタ部供給側空間中の流れの向きを一方向に固定する場合には、細胞懸濁液を、逆止弁を有するダイアフラムポンプによる送液圧力により流出口から流出させ、流出口と培養容器とを連絡する流路を通して培養容器内に戻してもよい。この場合は、戻り液は、培養容器内の細胞懸濁液がフィルタ部の流入口に移動する際に通った流路とは異なる流路を通って、培養容器内に戻ることとなり、循環する流れが形成される。一方、逆止弁を有しないダイアフラムポンプによりタンジェンシャルフローフィルトレーションにおけるフィルタ部供給側空間中の流れの向きを、時間の経過と共に逆転させる、つまり流れを往復させる場合には、戻り液は、培養容器内の細胞懸濁液がフィルタ部の流入口に移動する際に通った流路と同じ流路を通して、培養容器内に戻ることとなり、また、流れの向きの逆転と共に、流入口と流出口は逆転する。
　分離膜を透過した透過液中には、細胞による生産物などの小分子が含まれている。透過液中の生産物を回収して医薬品の製造及び食品の製造など様々な用途に用いることができる。生産物の回収は、単に透過液の回収、例えば透過液をタンク中に回収することであってもかまわない。生産物の純度を向上したり、溶媒を変更したり、例えば粉末状にするなど形態を変更したい場合には、透過液をさらなる処理に供することができる。
　培養容器内からフィルタ部に送液された細胞懸濁液は透過液と戻り液とに分離されるため、戻り液の量は、フィルタ部に送液された細胞懸濁液の量よりも少なくなる。フィルタ部に送液された細胞懸濁液量と戻り液量との差を少なくとも補うために、新鮮培地を培養容器内に供給する。新鮮培地を培養容器内に供給することで、培養容器内の細胞濃度が過剰に上昇することを抑えることができ、また、培養容器内の細胞の状態を健康な状態に保つことができる。つまり、灌流培養による利益が得られる。
　なお、新鮮培地の培養容器内への供給は、間欠的に行っても連続的に行ってもよい。また、培養容器内の細胞懸濁液量は常時完全に一定である必要はなく、略一定、例えば±１０％、又は±５％、又は±１％程度の変動が生じるものであってもよい。培養容器内の細胞懸濁液量の測定も、常時行う必要は必ずしもなく、間欠的に行うものであってもよい。細胞懸濁液量に若干の変動があっても、灌流培養による利益を得ることができる。
　本開示に係る生産物の製造方法は、
　生産物を生産する細胞を本開示に係る細胞培養方法を用いて培養することと、
　上記細胞懸濁液から生産物を回収することと、
　を含む、生産物の製造方法である。
　本開示に係る生産物の製造方法においては、本開示に係る細胞培養方法を用いて培養を行うため、生産物を生産する細胞の細胞増殖性が良好であるため生産物の生産性を高くでき、また、ダイアフラムの破損も抑制できる。
　生産物を生産する細胞としては、先に例示した生産物を生産する細胞を用いることができ、また生産物としては先に例示した生産物とすることができる。生産物は抗体であることが好ましい。
　生産物は、培養の終了時に細胞懸濁液からまとめて回収してもよいが、生産物を培養中に所定の頻度で又は連続的に細胞懸濁液から回収することが好ましい。特に、生産物の製造方法において用いられる細胞培養方法が、
　培養容器内から抜き出された細胞懸濁液を、細胞懸濁液中の細胞濃度よりも高い細胞濃度を有する第一の溶液と、細胞懸濁液中の細胞濃度よりも低い細胞濃度を有する第二の溶液と、に分離膜を用いてタンジェンシャルフローフィルトレーション方式により分離する分離処理を行うことと、
　第一の溶液を培養容器内に戻すことと、
　培養容器内に新たに培地を添加することと、
　をさらに含み、生産物の製造方法において上記第二の溶液から生産物を回収する実施形態が好ましい。
　生産物は、一般に、細胞に比してサイズが大幅に小さい。培養容器から細胞懸濁液を抜き出す際には、細胞懸濁液に含まれる生産物も共に抜き出されるが、タンジェンシャルフィルトレーション方式による分離処理においては、生産物は細胞に比して小さいサイズを有しているため、大きく濃度減少することなくそのまま第二の溶液に含まれ、一方、細胞は主に第一の溶液の側に留まる。このため、第二の液体中から生産物を回収することができる。
　上記のように、「細胞懸濁液から生産物を回収する」ことは、細胞懸濁液を処理して得られた処理物（例えば、濾過により得られた第二の溶液）から生産物を回収する場合をも包含する。
　生産物の回収は、単に細胞懸濁液を回収すること、単に上記第二の溶液を回収すること等であっても構わず、この場合、細胞懸濁液、第二の溶液等は、例えばタンク中に回収することができる。細胞懸濁液を回収した場合、回収した細胞懸濁液に対しては生産物を細胞から分離するための処理を行うことが好ましく、例えばフィルタ又は遠心分離等により細胞を溶液から除去することができる。また、第二の溶液を回収した場合であっても、細胞をさらに除去するために、フィルタ又は遠心分離等によるさらなる処理に供しても構わない。その他、生産物の純度を向上したり、溶媒を変更したり、例えば粉末状にするなど形態を変更する目的で、溶液をさらなる処理に供することもできる。
　例えば、溶液に含まれる生産物は、精製処理により精製することができる。得られた生産物は、高い純度にまで精製することができる。生産物が抗体又はその断片などのポリペプチドである場合、生産物の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、ポリペプチドを分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られたポリペプチドの濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）等により行うことができる。
　本開示に係る細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法の一例について、図１においてまとめて説明する。図１は、本開示に係る細胞培養方法及び生産物の製造方法に適用可能な細胞培養装置の構成の一例を示す図である。
　細胞培養装置１００は、細胞を培地とともに収容し培養する培養容器１０と、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液を流路５７を通して抜き出すためのダイアフラムポンプ３７と、培地供給容器２０に収容された新鮮培地Ｌ２を流路５６を通して培養容器１０内に供給するためのポンプＰ１と、ＣＯ２ガスを培養容器１０内に供給するためのＣＯ２供給容器３１と、空気を培養容器１０内に供給するための空気供給容器３２と、Ｏ２ガスを培養容器１０内に供給するためのＯ２供給容器３３と、を備える。培養容器１０内には、細胞懸濁液Ｌ１が収容され、細胞懸濁液Ｌ１を撹拌するための撹拌翼１１が備えられている。撹拌翼１１を回転させることで、培養容器１０の内部に収容された細胞懸濁液Ｌ１が撹拌され、細胞懸濁液Ｌ１の均質性が保たれる。また、培養容器にはサンプリング口３５が備えられている。
　ＣＯ２供給容器３１内のＣＯ２ガスは、流路５１を通してフローメーター３４に送られ、さらに流路５４を通して培養容器１０内に供給される。流路５１にはレギュレータＲ１及び圧力計Ｍ１が設けられ、流量の制御及び圧力のモニターを行っている。流路５４にはフィルタＦ１が設けられ、供給される気体の清浄化を行っている。空気供給容器３２内の空気は、流路５２を通してフローメーター３４に送られ、さらに流路５４を通して培養容器１０内に供給される。流路５２にはレギュレータＲ２及び圧力計Ｍ２が設けられ、流量の制御及び圧力のモニターを行っている。Ｏ２供給容器３３内のＯ２ガスは、流路５３を通してフローメーター３４に送られ、さらに流路５５を通して培養容器１０内に供給される。流路５３にはレギュレータＲ３及び圧力計Ｍ３が設けられ、流量の制御及び圧力のモニターを行っている。流路５５にはフィルタＦ２が設けられ、供給される気体の清浄化を行っている。
　流路５７を通して抜き出された細胞懸濁液は、タンジェンシャルフローフィルトレーション方式の中空糸膜フィルタ３６に送られる。中空糸膜フィルタ３６を透過した液体は、流路６０を通して、ポンプＰ２により中空糸膜フィルタ３６から排出される。培養される細胞が生産物を生産する細胞の場合は、中空糸膜フィルタ３６から流路６０へと排出された液体を精製処理に供することで、生産物を回収することができる。ダイアフラムポンプ３７は、流路５７、中空糸膜フィルタ３６の非透過側、及び流路５８に往復する流れを生成する。ダイアフラムポンプ３７の流路５８側のチャンバー（液体側チャンバー）とは反対側のチャンバー（気体側チャンバー）は気体で満たされ、流路５９に連結している。空気供給容器３８内の空気は、電磁弁Ｖ２を閉め、電磁弁Ｖ１を開くことにより流路５９を介してダイアフラムポンプ３７の気体側チャンバーに流入する。これにより、気体側チャンバー内の圧力は大気圧を超える圧力となり、ダイアフラムポンプ３７のダイアフラムは液体側チャンバーに頂点を置く略半球状形状を取る。逆に、電磁弁Ｖ２を開き、電磁弁Ｖ１を閉めた場合には、真空ポンプＰ３によりダイアフラムポンプ３７の気体側チャンバー内の空気の一部は気体側チャンバーから排出され、気体側チャンバー内は大気圧よりも低い圧力となり、ダイアフラムポンプ３７のダイアフラムは気体側チャンバーに頂点を置く略半球状形状へと反転する。電磁弁Ｖ１とダイアフラムポンプ３７との間にはレギュレータＲ４及びフィルタＦ３が設けられ、気体流量の制御及び気体の清浄化を行っている。同様に電磁弁Ｖ２とフィルタＦ３との間にはレギュレータＲ５が設けられ、気体流量の制御を行っている。流路５９には圧力計Ｍ４が設けられており、フィルタＦ３の圧力損失はほとんど無いため、圧力計Ｍ４によりダイアフラムポンプ３７の気体側チャンバー内の圧力をモニターすることができる。なお、図１中の矢印は、液体若しくは気体の移動方向、又はダイアフラムポンプ３７のダイアフラムの移動を示している。なお、気体が通る流路５９以外の流路は金属、プラスチック等で形成された配管とすることができ、気体が通る流路５９については金属、プラスチック等で形成された配管としてもよく、ゴム等で形成されたチューブであってもよい。
　図１に示した細胞培養装置を用いて、ＣＨＯ細胞の培養を行った。
　まず、全容２５０ｍＬのエイブル株式会社製培養容器に培地（商品名ＣＤ　ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）９０ｍＬを入れ３７℃で保持し、培養容器上面から空気を３．８ｍＬ／分、ＣＯ２を０．２ｍＬ／で通気し１日間放置した。次に、ＣＨＯ細胞を培養容器内の細胞濃度が２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養容器内の液量が１００ｍＬになるように播種した。播種から３日後に試験対象のダイアフラムポンプによる細胞懸濁液の往復流を、ダイアフラム気体側チャンバーの最大圧力（大気圧からの差異の絶対値の最大値）が表２に示された所定圧力となるようにして生じさせ、この往復流によりタンジェンシャルフローフィルトレーション方式による濾過を行った。濾過には、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製の中空糸膜フィルター（Ｔ０４－Ｐ２０Ｕ－１０－Ｎ）を用いた。濾過により培養系から失われる液量を補充するため、新鮮培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製の商品名ＣＤ　ＯｐｔｉＣＨＯで表される培地と、ＧＥヘルスケア製の商品名Ｃｅｌｌ　Ｂｏｏｓｔ　７ａ及び７ｂで表される培地との混合物）の供給（培養容器内に新鮮培地を供給すること）も並行して行った。上記の濾過及び新鮮培地の供給は、１．２Ｌ／日の割合で行った。タンジェンシャルフローフィルトレーション方式による濾過においては、細胞懸濁液を、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する透過液とに分離し、戻り液は培養容器内に戻した（戻り液を培養容器内に戻すこと）。また同日（播種から３日後）から、培養容器内に一端が挿入された内径２ｍｍの単管を用いて、培養容器下面側から酸素を１ｍＬ／分の流量で培養容器内に供給した。
　上記の培養において、細胞濃度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達した日からは、平均細胞濃度（以下に記載の１日２回の細胞濃度測定による２時点での細胞濃度の平均値）が約８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように１日に１回、培養容器内から所定量の細胞懸濁液を抜き出す操作（セルブリーディング操作）を行い、播種から２８日目まで培養を継続した。なお、培養途中でダイアフラムポンプによる細胞懸濁液の往復流が停止した場合、ダイアフラム気体側チャンバーの圧力の絶対値の最大値を０．１ＭＰａまで増加させ、それでも往復流が再開しないときは培養を停止させた。培養停止後に、ダイアフラムの破れの有無を目視で確認した。
　播種した日からセルブリーディング操作を開始した日の前までは１日１回、セルブリーディング操作を開始した日の後からはセルブリーディング操作前後の１日２回、培養容器内の細胞懸濁液をサンプリングして、ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社の商品名Ｖｉ－Ｃｅｌｌ　ＸＲを用いて細胞濃度及びバイアビリティを測定した。バイアビリティは死細胞と生細胞との合計数に対する生細胞の数割合を意味する。
　試験対象のダイアフラムポンプとして、比較例１ではＲｅｐｌｉｇｅｎ製ＸＣｅｌｌ　ＡＴＦ２を用いた。それ以外の実施例及び比較例では、ＳＵＳ３１６製の金属容器内に以下の素材で形成されたダイアフラムを有するダイアフラムポンプを用いた。実施例１～１１、１６、１７では、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製シリコーンゴム（ＴＳＥ３４５７Ｔ）、実施例１２ではモメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製シリコーンゴム（ＴＳＥ３４７８Ｔ）、実施例１３ではモメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製シリコーンゴム（ＴＳＥ２２１－５Ｕ）、実施例１４ではモメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製シリコーンゴム（ＴＳＥ３４６６）、実施例１５では信越化学工業株式会社製シリコーンゴム（ＫＥ－９５１－Ｕ）、を成形して得た、表１及び表２に記載のサイズ及び特性を有するダイアフラムを上記金属容器内に収容し、空気及び真空ポンプと電磁弁にてポンプ内の圧力（気体側チャンバー内の圧力）を一定時間毎に正圧又は負圧に切り替え制御できる装置を用いた。
　ダイアフラムの各位置の厚さは、ダイアフラムポンプを上記培養に使用する前に、厚み計（ミツトヨ株式会社製、商品名シックネスゲージ５４７－３１）を用いて測定した。ダイアフラムの伸び率５０％のときの引張り応力は、以下の手順に沿って測定した。ダイアフラムから幅１０ｍｍ、長さ４０ｍｍの大きさの試験片Ｅ１を切り出し、試験片Ｅ１に対し、株式会社東洋精機製作所製の引張試験機ストログラフＲ２（商品名）を用いて引張試験を行った。引張試験の前に、試験片Ｅ１の厚さを株式会社ミツトヨ製の高精度デジマチックマイクロメータＭＤＨ－２５Ｍ（商品名）を用いて測定した。引張試験は、チャック間距離を１０ｍｍとし、引張速度を１０ｍｍ／分として、試験片Ｅ１の長さ方向に引張試験を行った。伸び率５０％すなわちチャック間が１５ｍｍになったときの荷重を、試験片Ｅ１の厚さで割ることで、伸び率５０％のときの引っ張り応力を導出した。試験片Ｅ１は１つのダイアフラムから３枚切り出し、３枚の試験片を用いて引張試験を３回繰り返し、得られた３つの引張応力の平均値をダイアフラムの伸び率５０％における引張応力として使用した。
　上記で観察したダイアフラムの破れの有無、細胞濃度、及びバイアビリティを基に以下の評価基準でように評価を行った。
＜ダイアフラムの状態＞
　Ａ　使用後に破れ、亀裂、及び変色が無かった。
　Ｂ　使用後にダイアフラムの一部が白く変色していた。
　Ｃ　使用後にダイアフラムの一部に亀裂が生じていた。
　Ｄ　培養の途中でダイアフラムが破れた。
＜細胞増殖性＞
　Ａ　播種後１０日以内に細胞濃度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上に増加した。
　Ｂ　播種後１０日以内には、細胞濃度は８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達しなかった。
＜平均バイアビリティ＞
　Ａ　２８日間の培養期間中におけるバイアビリティの平均値が９５％以上であった。
　Ｂ　２８日間の培養期間中におけるバイアビリティの平均値が９０％以上９５％未満であった。
　Ｃ　２８日間の培養期間中におけるバイアビリティの平均値が８５％以上９０％未満であった。
　ダイアフラムの状態の評価について、具体的な状態の具体例を図４に示す。図４（Ａ）は、上記の判定基準における状態Ａにおけるダイアフラムの状態を表しており、図４（Ｂ）は、上記の判定基準における状態Ｂにおけるダイアフラムの状態を表しており、図４（Ｃ）は、上記の判定基準における状態Ｃにおけるダイアフラムの状態を表しており、図４（Ｄ）は、上記の判定基準における状態Ｄにおけるダイアフラムの状態を表している。図４（Ａ）～（Ｄ）において、状態Ｂ、状態Ｃ及び状態Ｄでは明らかな異常が見られるが、状態Ｂ及び状態Ｃにおいてはダイアフラムの運転自体は可能である。このため、状態Ａ～状態Ｃは許容範囲内であるといえる。しかし、状態Ｄのように培養の途中でダイアフラムが破れてしまうと、ダイアフラムポンプとしての機能（往復流の発生）を果たせなくなるため、培養を継続できない。また、細胞増殖性及び平均バイアビリティの評価についての具体的な例を図５に示す。図５において増殖性として示される変化曲線は、播種後の培養日数と細胞濃度（生細胞濃度）との関係を表している。図５における増殖性Ａの場合のように、細胞増殖が順調に進む場合には、高い細胞濃度に達することが可能で、また、当該高い細胞濃度を維持することができる。一方、細胞増殖性の評価がＢの場合は、典型的には図５に示すように、細胞濃度は比較的低い細胞濃度で極大に達し、その後減少してしまう。図５におけるバイアビリティとして示される変化曲線は、播種後の培養日数とバイアビリティ（細胞生存率＝生細胞数／（生細胞数＋死細胞数））との関係を示している。播種後のバイアビリティは徐々に減少する傾向は見られるものの、減少傾向は平均バイアビリティ評価のランクが下に行くにつれてより顕著になる。とはいえ、平均バイアビリティについてはＣであっても許容範囲内である。細胞についての評価における許容範囲は、細胞増殖性が許容範囲内（増殖性Ａ）であることが前提となり、バイアビリティが高いことは、より好ましい範囲を示している。
　各例の構成を評価結果とともに以下の表１及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 
　ダイアフラムと、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面とにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、かつ、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが式１
　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　（式１）
　を満たす、本願実施例１～実施例１７においては、ダイアフラムの破損が抑制され、良好な細胞増殖性が得られ、かつ、良好な細胞生存率が得られた。例えば、実施例１においては培養後のダイアフラムに異常が見られなかったことに加え、図６に示す良好な細胞増殖性及びバイアビリティを示した。図６において白抜き菱形はバイアビリティの変化を表し、黒塗り菱形は細胞濃度（生細胞濃度）の変化を表す。図６において１０日目以降、細胞濃度に振動的変動が見られるのは、セルブリーディング操作のために細胞濃度が下がり、その後の増殖によって細胞濃度が再び上昇したためである。
　これに対して、上記空間の体積が２０ｃｍ３を超え、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるダイアフラムの厚さＨの最大値が１．５ｍｍを超え、ＨＴ／Ｈの最大値が１．７５を超える比較例１においては、細胞濃度の上昇が低い細胞濃度で止まってしまい、十分な細胞増殖性が得られなかった。細胞濃度が減少を始めてしまったため、培養を停止させた。このため、２８日培養後のダイアフラム状態及び２８日間の平均バイアビリティは測定できなかった。この結果は、従来の培養用ダイアフラムポンプを用いても、小規模での培養においては細胞増殖性を維持できないことを示している。
　また、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるダイアフラムの厚さＨの最小値が０．５ｍｍ未満である比較例２においては、播種から１０日目より前、かつ細胞濃度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達する前に、ダイアフラムが培養途中に破れてしまった。このため、細胞増殖性及び２８日間の平均バイアビリティは測定できなかった。
　角度Ａが０°から７５°までの領域におけるダイアフラムの厚さＨの最大値が１．５ｍｍを超える比較例３においては、細胞濃度の上昇が低い細胞濃度で止まってしまい、十分な細胞増殖性が得られなかった。細胞濃度が減少を始めてしまったため、培養を停止させた。このため、２８日培養後のダイアフラム状態及び２８日間の平均バイアビリティは測定できなかった。
　角度Ａが０°から７５°までの領域におけるダイアフラムの厚さＨの最大値が１．５ｍｍを超え、ＨＴ／Ｈの最大値が１．７５を超える比較例４においては、ダイアフラムが培養途中に破れてしまった。このため、２８日間の平均バイアビリティは測定できなかった。
　ＨＴ／Ｈの最大値が１．７５を超える比較例５においては、ダイアフラムが培養途中に破れてしまった。このため、２８日間の平均バイアビリティは測定できなかった。なお、比較例５は、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製ＸＣｅｌｌ　ＡＴＦ２に対する比較例１のダイアフラムを相似形で小さくしたものに対応する。このように、従来の培養用ダイアフラムポンプをそのまま小さくしても、ダイアフラム破損の抑制と高い細胞増殖性との両立はできないことが示された。
　ＨＴ／Ｈの最小値が１未満の比較例６においては、ダイアフラムが培養途中に破れてしまった。このため、２８日間の平均バイアビリティは測定できなかった。
　以上の結果から、ダイアフラムの外縁部のダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面とにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、かつ、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においてもダイアフラムの厚さＨが式１を満たすダイアフラムポンプを用いることによってはじめて、小規模の培養において高い細胞増殖性と、ダイアフラム破れの抑制とを両立させることができることが分かる。
　さらに、実施例４の結果と、実施例７から実施例９の結果とを比較することにより、ＨＺ＜ＨＹ及びＨＺ≧Ｈを満たすことにより、ダイアフラムの破損がより抑制される傾向であることが分かる。また、実施例１０の結果と実施例１１の結果との比較により、ＨＹ／Ｈの値を１を超え３以下の範囲内の値とすることで、より高い細胞生存率が得られる傾向であることが分かる。実施例１２及び実施例１４の結果と、実施例１３及び実施例１５の結果とを比較することで、ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力σを０．４ＭＰａ以上１．５ＭＰａ以下の範囲内の値とすることで、より高い細胞生存率が得られる傾向であることが分かる。実施例１及び実施例１６の結果と、実施例１７の結果とを比較することにより、ダイアフラムポンプの内部の圧力Ｐと大気圧との間の圧力差の絶対値を０．１ＭＰａ以下に制御することでより高い細胞生存率が得られる傾向であることが分かる。
　以上説明したように、本開示によれば、容量の小さいダイアフラムポンプにより細胞懸濁液の抜き出しをする場合に、良好な細胞増殖性とダイアフラムの破損抑制とを両立できる細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法を提供することができる。
　日本出願特願２０１９－０１８２４５号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
１０ 培養容器
１１ 撹拌翼
２０ 培地供給容器
３１ ＣＯ２供給容器
３２ 空気供給容器
３３ Ｏ２供給容器
３４ フローメーター
３５ サンプリング口
３６ 中空糸膜フィルタ
３７ ダイアフラムポンプ
３８ 空気供給容器
５１～６０　流路
１００　細胞培養装置
３０１　チャンバー
３０２　ダイアフラム
３０３　チャンバー
３０４ａ　ハウジングの部分
３０４ｂ　ハウジングの部分
Ａ　角度
Ｆ　平面
Ｆｔ　垂線の足
Ｆ１～Ｆ３　フィルタ
Ｌ１　細胞懸濁液
Ｌ２　新鮮培地
Ｍ１～Ｍ４　圧力計
Ｐ１　ポンプ
Ｐ２　ポンプ
Ｐ３　真空ポンプ
Ｐｒ　垂線
Ｐｔ　任意の点
Ｒ１～Ｒ５　レギュレータ
Ｔ　頂点
Ｖ１、Ｖ２　電磁弁
Ｘ　領域
Ｙ　領域
Ｚ　角度Ａが９０°の点
 

Claims (15)

  1. 　細胞懸濁液を収容する培養容器と、
    　前記培養容器内から前記細胞懸濁液を抜き出すためのダイアフラムポンプとを備え、
    　前記ダイアフラムポンプのダイアフラムと、前記ダイアフラムの外縁部の前記ダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、
    　前記ダイアフラムにおける各点について、前記ダイアフラムの頂点から前記平面Ｆに下ろした垂線の足と前記各点とを結ぶ直線が前記垂線となす角度を前記各点の角度Ａとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても前記ダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、
    　前記ダイアフラムの頂点における前記ダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても前記ダイアフラムの厚さＨが下記の式１を満たす、細胞培養装置。
    　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　（式１）
  2. 　前記ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点における前記ダイアフラムの厚さをＨＹとし、角度Ａが９０°の点における前記ダイアフラムの厚さをＨＺとしたとき、ＨＺ＜ＨＹであり、かつ、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても前記ダイアフラムの厚さＨがＨ≦ＨＺである、請求項１に記載の細胞培養装置。
  3. 　前記ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点における前記ダイアフラムの厚さをＨＹとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても前記ダイアフラムの厚さＨが下記の式２を満たす、請求項１又は請求項２に記載の細胞培養装置。
    　１＜ＨＹ／Ｈ≦３　（式２）
  4. 　前記ダイアフラムの材質がシリコーンゴムである、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  5. 　前記ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力σが下記の式３を満たす、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
    　０．４ＭＰａ≦σ≦１．５ＭＰａ　（式３）
  6. 　培養容器内に収容された細胞懸濁液中で細胞を培養することと、
    　前記培養容器内からダイアフラムポンプにより前記細胞懸濁液を抜き出すこととを含み、
    　前記ダイアフラムポンプのダイアフラムと、前記ダイアフラムの外縁部の前記ダイアフラムの頂点から遠い側の面を含む平面Ｆとにより規定される空間の体積が１ｃｍ３以上２０ｃｍ３以下であり、
    　前記ダイアフラムにおける各点について、前記ダイアフラムの頂点から前記平面Ｆに下ろした垂線の足と前記各点とを結ぶ直線が前記垂線となす角度を前記各点の角度Ａとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても前記ダイアフラムの厚さＨが０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下の範囲内であり、
    　前記ダイアフラムの頂点における前記ダイアフラムの厚さをＨＴとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても前記ダイアフラムの厚さＨが下記の式１を満たす、細胞培養方法。
    　１≦ＨＴ／Ｈ≦１．７５　（式１）
  7. 　前記ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点における前記ダイアフラムの厚さをＨＹとし、角度Ａが９０°の点における前記ダイアフラムの厚さをＨＺとしたとき、ＨＺ＜ＨＹであり、かつ、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても前記ダイアフラムの厚さＨがＨ≦ＨＺである、請求項６に記載の細胞培養方法。
  8. 　前記ダイアフラムにおける角度Ａが７５°から８８°までの領域における点のうち、最も厚さが厚い点における前記ダイアフラムの厚さをＨＹとしたとき、角度Ａが０°から７５°までの領域におけるいずれの点においても前記ダイアフラムの厚さＨが下記の式２を満たす、請求項６又は請求項７に記載の細胞培養方法。
    　１＜ＨＹ／Ｈ≦３　（式２）
  9. 　前記ダイアフラムの材質がシリコーンゴムである、請求項６から請求項８のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  10. 　前記ダイアフラムの伸び率５０％における引張応力σが下記の式３を満たす、請求項６から請求項９のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
    　０．４ＭＰａ≦σ≦１．５ＭＰａ　（式３）
  11. 　前記ダイアフラムポンプの運転時において、前記ダイアフラムを駆動させる前記ダイアフラムポンプの内部の圧力Ｐが下記の式４を満たす、請求項６から請求項１０のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
    　大気圧－０．１ＭＰａ≦Ｐ≦大気圧＋０．１ＭＰａ　（式４）
  12. 　前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６から請求項１１のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  13. 　前記培養容器内から抜き出された前記細胞懸濁液を、前記細胞懸濁液中の細胞濃度よりも高い細胞濃度を有する第一の溶液と、前記細胞懸濁液中の細胞濃度よりも低い細胞濃度を有する第二の溶液と、に分離膜を用いてタンジェンシャルフローフィルトレーション方式により分離する分離処理を行うことと、
    　前記第一の溶液を前記培養容器内に戻すことと、
    　前記培養容器内に新たに培地を添加することと、
    　をさらに含む、請求項６から請求項１２のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  14. 　生産物を生産する細胞を請求項６～請求項１３のうちいずれか一項に記載の細胞培養方法を用いて培養することと、
    　前記細胞懸濁液から生産物を回収することと、
    　を含む、生産物の製造方法。
  15. 　前記生産物が抗体である、請求項１４に記載の生産物の製造方法。
     
PCT/JP2020/001094 2019-02-04 2020-01-15 細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法 WO2020162125A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020571060A JP7270657B2 (ja) 2019-02-04 2020-01-15 細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法
EP20752524.7A EP3922710A4 (en) 2019-02-04 2020-01-15 CELL CULTURE DEVICE, CELL CULTURE METHOD AND PRODUCT PREPARATION METHOD
CN202080012318.5A CN113396212B (zh) 2019-02-04 2020-01-15 细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法
SG11202108093UA SG11202108093UA (en) 2019-02-04 2020-01-15 Cell culture device, method for culturing cells, and method for producing product
US17/387,091 US20210355430A1 (en) 2019-02-04 2021-07-28 Cell culture device, method for culturing cells, and method for producing product

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-018245 2019-02-04
JP2019018245 2019-02-04

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/387,091 Continuation US20210355430A1 (en) 2019-02-04 2021-07-28 Cell culture device, method for culturing cells, and method for producing product

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020162125A1 true WO2020162125A1 (ja) 2020-08-13

Family

ID=71947435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/001094 WO2020162125A1 (ja) 2019-02-04 2020-01-15 細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210355430A1 (ja)
EP (1) EP3922710A4 (ja)
JP (1) JP7270657B2 (ja)
CN (1) CN113396212B (ja)
SG (1) SG11202108093UA (ja)
WO (1) WO2020162125A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
JP2010029109A (ja) 2008-07-29 2010-02-12 Ihi Corp サンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法
JP2012147678A (ja) * 2009-05-14 2012-08-09 Otake:Kk 一検体用多重培養装置
WO2016002847A1 (ja) * 2014-07-01 2016-01-07 株式会社ニコン 流体デバイス、流体の制御方法、検査デバイス、検査方法、及び流体デバイスの製造方法
JP2019018245A (ja) 2017-07-12 2019-02-07 株式会社神戸製鋼所 電磁成形コイルユニット、及びこれを用いた成形体の製造方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2566846B1 (fr) * 1984-06-27 1986-12-12 Clextral Membrane pour pompe a commande ou actionnement hydraulique
US6158327A (en) * 1998-09-15 2000-12-12 Westinghouse Air Brake Company Extended wear pump diaphragm
US7284966B2 (en) * 2003-10-01 2007-10-23 Agency For Science, Technology & Research Micro-pump
US7875448B2 (en) * 2004-01-12 2011-01-25 Single Use Brx, Llc Bioreactor systems and disposable bioreactor
US8197231B2 (en) * 2005-07-13 2012-06-12 Purity Solutions Llc Diaphragm pump and related methods
US7779746B1 (en) * 2007-01-11 2010-08-24 Robert Asher Eiermann Stress limiting diaphragm for diaphragm and bellows pumps and actuators
US8042563B2 (en) * 2007-02-27 2011-10-25 Deka Products Limited Partnership Cassette system integrated apparatus
JP6249816B2 (ja) * 2013-03-28 2017-12-20 アークレイ株式会社 細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法
US10799816B2 (en) * 2017-12-28 2020-10-13 Repligen Corporation Plunger pumping arrangement for a hollow fiber filter
EP3843884A1 (en) * 2018-08-29 2021-07-07 Cytiva Sweden AB System for filtration and associated method thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
JP2010029109A (ja) 2008-07-29 2010-02-12 Ihi Corp サンプリング装置およびこれを用いたサンプリング方法
JP2012147678A (ja) * 2009-05-14 2012-08-09 Otake:Kk 一検体用多重培養装置
WO2016002847A1 (ja) * 2014-07-01 2016-01-07 株式会社ニコン 流体デバイス、流体の制御方法、検査デバイス、検査方法、及び流体デバイスの製造方法
JP2019018245A (ja) 2017-07-12 2019-02-07 株式会社神戸製鋼所 電磁成形コイルユニット、及びこれを用いた成形体の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3922710A4

Also Published As

Publication number Publication date
US20210355430A1 (en) 2021-11-18
CN113396212B (zh) 2023-12-12
EP3922710A1 (en) 2021-12-15
CN113396212A (zh) 2021-09-14
SG11202108093UA (en) 2021-08-30
JPWO2020162125A1 (ja) 2021-11-25
JP7270657B2 (ja) 2023-05-10
EP3922710A4 (en) 2022-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2459697T3 (en) Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture
Werner et al. Innovative, non-stirred bioreactors in scales from milliliters up to 1000 liters for suspension cultures of cells using disposable bags and containers–a Swiss contribution
US10988725B2 (en) Perfusion filtration systems
KR20220110865A (ko) 교번 접선 유동식의 신속한 수확
ES2842350T3 (es) Un procedimiento para la producción de un producto (por ejemplo, polipéptido) en un proceso de fermentación de cultivo celular continuo
WO2020162125A1 (ja) 細胞培養装置、細胞培養方法、及び生産物の製造方法
JPS6332484A (ja) 生物学的に活性なプラスミノ−ゲン活性化因子の製造方法
WO2012045769A1 (en) Process for protein production
AU2019201507B2 (en) A high cell density fill and draw fermentation process
US20210147781A1 (en) Cell culture method, product producing method, and cell culture device
Rausch et al. Increase of protein yield in High Five cells in a single‐use perfusion bioreactor by medium replacement
AU2015218193A1 (en) Enhancement of recombinant protein expression using a membrane-based cell retention system
RU2800874C1 (ru) Система перфузионной фильтрации для непрерывного культивирования культур клеток
RU2794425C1 (ru) Способ перфузионной фильтрации для непрерывного культивирования культур клеток
CN110892056B (zh) 用于培养细胞的装置和方法
WO2019239780A1 (ja) 細胞培養方法、細胞培養装置、及び生産物の製造方法
Swiech et al. Comparison of the cultivation of wild and transfected Drosophila melanogaster S2 cells in different media
JP2023006419A (ja) 不純物の除去性が高い細胞培養液のろ過方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20752524

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020571060

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020752524

Country of ref document: EP

Effective date: 20210906