WO2020153463A1 - 顕微鏡の液浸液体、及び該液浸液体を用いた試料の観察方法 - Google Patents

顕微鏡の液浸液体、及び該液浸液体を用いた試料の観察方法 Download PDF

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Definitions

  • the immersion liquid adjusts the refractive index difference existing between the sample and the objective lens (mainly, the refractive index difference at the interface between the cover glass on the sample and the air) to suppress total reflection at the interface, It is used to guide more light from the sample to the objective lens. Therefore, in order to match the refractive index of the immersion liquid that is generally used with the refractive index of the cover glass (mainly composed of borosilicate glass) used for microscopic observation, N D should be around 1.515. It is set. However, an optical system including these immersion liquid and objective lens can cause chromatic aberration in the microscopic observation in the deep part of the sample.
  • An object of one embodiment of the present invention is to realize an immersion liquid capable of reducing chromatic aberration in microscopic observation.
  • the present invention includes the following modes.
  • ⁇ 2> The sample is placed by arranging the immersion liquid according to ⁇ 1> between a surface of the translucent sample arranging member, which surface is opposite to the surface on the sample arranging side, and the immersion objective lens.
  • a method for observing a sample including a step of observing.
  • (201) A graph showing the change in refractive index depending on the mixing ratio of TDE and PEG600 in the immersion liquid of the present embodiment.
  • (202) A graph showing the relationship between the refractive index and the Abbe number of the immersion liquid of this embodiment.
  • 6 is a graph showing changes in the refractive index and Abbe number of the immersion liquid of this embodiment due to the addition of water. It is a graph which shows the change of the refractive index of the immersion liquid of this embodiment according to humidity.
  • 7 is a graph showing changes in the refractive index of the immersion liquid of the present embodiment placed on the objective lens at a temperature of 40° C. and a humidity of 35%. It is a figure which shows the result of the imaging of the mouse
  • Immersion liquid of microscope The immersion liquid of the microscope according to the embodiment of the present invention (hereinafter, also referred to as “immersion liquid” in some cases) has an Abbe number of 50 or more and 60 or less.
  • the Abbe number is within the above range, the influence of the immersion liquid on the occurrence of chromatic aberration can be reduced.
  • the alignment is easy.
  • the Abbe number is within the above range, the entire optical path length does not change even if the focus position in the depth direction in the sample to be observed changes, so that the chromatic aberration changing in the depth direction disappears.
  • the lower limit of the Abbe number may be, for example, preferably 51 or more, or 52 or more, and more preferably 53 or more.
  • the upper limit of the Abbe number may be preferably 59 or less, or 58 or less, and more preferably 57 or less, or 56 or less, for example.
  • the Abbe number can be measured using, for example, a known Abbe refractometer.
  • the refractive index means any one of N C , N D, and N F.
  • the refractive index of the immersion liquid is preferably 1.32 or more and 1.52 or less from the viewpoint that the difference from the refractive index of a general cover glass can be made small and samples of various forms can be observed. , 1.35 or more and 1.51 or less are more preferable.
  • the lower limit of the refractive index of the immersion liquid may be preferably 1.45 or more, or 1.46 or more, and more preferably 1.47 or more, 1.48 or more, or 1.49 or more. There are cases.
  • the immersion liquid according to an embodiment of the present invention may preferably have an Abbe number in the range of 50 or more and 60 or less and a refractive index in the range of 1.32 or more and 1.52 or less. ..
  • the lower limit of the Abbe number may be, for example, preferably 51 or more, or 52 or more, and more preferably 53 or more.
  • the upper limit of the Abbe number may be preferably 59 or less, or 58 or less, and more preferably 57 or less, or 56 or less, for example.
  • the refractive index is more preferably 1.35 or more and 1.51 or less.
  • the lower limit of the refractive index of the immersion liquid may be preferably 1.45 or more, or 1.46 or more, and more preferably 1.47 or more, 1.48 or more, or 1.49 or more. There are cases.
  • the refractive index is high, but the Abbe number ( ⁇ D ) is higher than the Abbe number (around 55) of the cover glass which is one of the light-transmitting sample placement members. Is also low.
  • the Abbe number of the immersion liquid described in Non-Patent Document 1 is about 47
  • the Abbe number of the immersion liquid described in Non-Patent Document 3 is 33.2 (SeeDB2S (Non-Patent Document 2)) or 36.5 (SeeDB2G( Non-Patent Document 2)).
  • the immersion liquid of this embodiment has an Abbe number within a specific range, the occurrence of chromatic aberration caused by the immersion liquid is suppressed. Therefore, the immersion liquid of the present embodiment can enable high-resolution observation, in particular, deep observation of a sample, which has been difficult so far, as compared with the conventional immersion liquid.
  • the immersion liquid of the present embodiment is affected by drying and moisture absorption, so that the refractive index of the immersion liquid is affected.
  • the Abbe number of the immersion liquid does not change. That is, it can be said that the immersion liquid has moisture resistance and dry resistance with respect to light dispersion. Therefore, by using the immersion liquid, chromatic aberration is reduced, and long-term microscopic observation is possible.
  • the immersion liquid of the present embodiment is preferably hydrophilic in that the contact angle on the objective lens (front lens) can be increased. That is, since the immersion liquid is hydrophilic, it is easy to hold the immersion liquid on the front lens without spilling it even when the WD (working distance) is large, and the immersion liquid can be removed from the front lens. It also becomes easy to remove (drains well). This is advantageous for deep observation and multipoint observation of the sample, and also for switching the objective lens and keeping the objective lens clean. From the viewpoint of preventing the immersion liquid from drying, it is more preferable that the immersion liquid of the present embodiment has a low vapor pressure (in one example, the vapor pressure is lower than that of water).
  • the immersion liquid of this embodiment may include two or more types of hydrophilic liquids. Typically, two or more hydrophilic liquids mix with each other to form a uniform liquid (solution).
  • the “hydrophilic liquid” refers to a compound that is soluble in water and takes a liquid form near room temperature. By including two or more hydrophilic liquids, it becomes easy to adjust the physical properties of the immersion liquid so that they fall within desired ranges.
  • At least one of the two or more hydrophilic liquids is preferably a liquid having a low Abbe number ( ⁇ D ), more preferably a liquid having an Abbe number of 50 or less, and a liquid having an Abbe number of 48 or less. It is more preferable that there is. From the viewpoint of refractive index, the liquid is 1.44 or more, 1.45 or more, 1.46 or more, 1.47 or more, 1.48 or more, 1.49 or more, 1.50 or more, 1.51 or more, Alternatively, it may be preferably 1.515 or more.
  • liquids having a low Abbe number include dimethyl sulfoxide (DMSO), formamide, and thiodiethanol (TDE). These liquids can use 1 type or multiple types. Each of these specifically exemplified liquids has a vapor pressure sufficiently low as compared with water.
  • Each of these specifically exemplified liquids has a vapor pressure sufficiently low as compared with water.
  • glycols are preferable, polyethylene glycol is more preferable, and polyethylene glycol having a molecular weight of 200 to 1000 is further preferable as the liquid having a high Abbe number.
  • the total amount (% by weight) of two or more hydrophilic liquids in the immersion liquid is 85% by weight, 90% by weight or more, 95% by weight or more, 96% by weight or more, 97% by weight or more, 98% by weight. As described above, 99% by weight or more and 100% by weight may be preferable.
  • ScaleCUBIC-2 Reagent-2
  • SCALEVIEW-SMt manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the content of water is preferably 50% by weight or less, 5% by weight or less, 4% by weight or less from the viewpoint of preventing volatilization of the immersion liquid. It may be more preferable that it is 3% by weight or less. If the water content is within the above range, even if water is volatilized by drying, the effect on the immersion liquid (for example, fluctuations in the volume and refractive index of the immersion liquid, and components that cannot be completely dissolved in water) Precipitation) is reduced. In some cases it may be particularly preferred not to add water to the immersion liquid.
  • the immersion liquid of the present embodiment may contain a surfactant, nanoparticles, metal oxide, or the like, if necessary.
  • the liquid immersion liquid preparation method of the present embodiment can be prepared, for example, by mixing two or more hydrophilic liquids.
  • the procedure and means for mixing are not particularly limited.
  • the transparent sample placement member 3 is preferably made of glass (mainly composed of borosilicate glass).
  • Examples of the sample placement member 3 include a cover glass, a glass plate, and a glass petri dish.
  • sample examples include biological materials and the like.
  • the type of biological material is not particularly limited, but a plant-derived material or an animal-derived material is preferable, an animal-derived material such as fish, amphibian, reptile, bird or mammal (mammal) is more preferable, and a mammal-derived material Is particularly preferable.
  • the type of mammal is not particularly limited, but experimental animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, primates other than humans such as marmosets; pets such as dogs, cats, ferrets (pets); pigs, cattle , Livestock such as horses; humans.
  • the above biological material may be a material that has been fixed with paraformaldehyde or the like for microscopic observation, or a material that has not been immobilized.
  • the immobilization treatment can be performed by a conventionally known method, for example.
  • the thickness of the biological material is not particularly limited, but can be, for example, 1 ⁇ m to 10 mm, preferably 100 ⁇ m to 2 mm.
  • the observation method of the present embodiment enables imaging of a deeper portion while suppressing the occurrence of chromatic aberration, so that the present invention can be applied even if the thickness is 0.1 mm or more.
  • ⁇ 8> The immersion liquid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, containing 50% by weight or less of water.
  • the immersion liquid according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8> is provided between a surface of the translucent sample placement member, which surface is opposed to the surface on the sample placement side, and the immersion objective lens.
  • a method for observing a sample the method including arranging and observing the sample.
  • ⁇ 11> The observation method according to ⁇ 10>, wherein the sample is cells or tissues or organs derived from animals or plants, or animals or plants other than humans.
  • the present invention can suppress the occurrence of chromatic aberration during microscopic observation, particularly during high-resolution observation, and can provide an immersion liquid for a microscope and its use.

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Abstract

顕微鏡観察において色収差を低減することができる浸液、及びその利用等を提供する。本発明である顕微鏡の液浸液体は、アッベ数が５０以上６０以下の範囲内である。

Description

顕微鏡の液浸液体、及び該液浸液体を用いた試料の観察方法
　本発明は、顕微鏡の液浸液体、及び該液浸液体を用いた試料の観察方法に関する。
　顕微鏡を用いた高解像度観察において、試料と対物レンズとの間を液体（浸液）で満たす手法がよく用いられている。浸液の例が非特許文献１及び２に開示されている。
Staudt, T. et al.，Microsc Res Tech. 2007 Jan;70(1):1-9 Ke, M.T. et al., Cell Rep. 2016 Mar 22; 14(11):2718-32.
　浸液は、試料と対物レンズとの間に存在する屈折率差（主に、試料上のカバーガラスと空気との界面における屈折率差）を調整して当該界面での全反射を抑制し、試料からの光をより多く対物レンズに導く目的で用いられている。
　したがって、一般に使用されている浸液の屈折率は、顕微鏡観察で使用されるカバーガラス（硼珪酸ガラスから主に構成されている）の屈折率に合わせるために、ＮＤが１．５１５前後に設定されている。
　しかしながら、これらの浸液や対物レンズを含む光学系では、試料深部での顕微鏡観察において色収差をもたらし得る。特に近年、顕微鏡観察に関連する様々な手法が生み出されていることから、顕微鏡観察において色収差の発生が重大な問題となり得る局面が増大する傾向にあると考えられる。例えば、色収差の発生は、試料深部における高解像度観察を困難にし得る。
　本発明の一態様は、顕微鏡観察において色収差を低減することができる浸液を実現することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明は、以下に示す態様を含む。
＜１＞アッベ数が５０以上６０以下の範囲内である、顕微鏡の液浸液体。
＜２＞＜１＞に記載の液浸液体を、透光性の試料配置部材における、試料配置側の面に背向する面と、液浸対物レンズとの間に、配置して、試料を観察する工程を含む、試料の観察方法。
　本発明の一態様によれば、顕微鏡観察において色収差を低減することができる。
本実施形態の試料の観察方法を示す模式図である。 （２０１）本実施形態の液浸液体中のＴＤＥとＰＥＧ６００の混合比による、屈折率の変化を示すグラフである。（２０２）本実施形態の液浸液体の屈折率とアッベ数の関係を示すグラフである。 水分の添加による、本実施形態の液浸液体の屈折率とアッベ数の変化を示すグラフである。 湿度別による、本実施形態の液浸液体の屈折率の変化を示すグラフである。 温度４０℃／湿度３５％における、対物レンズ上に配置した本実施形態の液浸液体の屈折率の変化を示すグラフである。 本実施形態の液浸液体を用いたマウス脳切片のイメージングの結果を示す図である。 本実施形態の液浸液体を用いたマウス脳切片のイメージングの結果を示す図である。
　〔１．顕微鏡の液浸液体〕
　本発明の一実施形態に係る顕微鏡の液浸液体（以下、「液浸液体」と称する場合もある）は、アッベ数が５０以上６０以下の範囲内である。アッベ数が上記範囲内であると、液浸液体が色収差の発生に与える影響を低減できる。また、観察対象となる試料（特に生物材料）および当該試料の周囲の溶液（液体媒体）のアッベ数が比較的高い場合でも、合わせ込みが容易である。また、アッベ数が上記範囲内であると、観察対象となる試料内における深さ方向の焦点位置が変化しても、全体の光路長は変化しないため、深さ方向に変化する色収差はなくなる。それによって、色収差をなくすように対物レンズを設計することが可能になる。
　アッベ数の下限は、例えば、５１以上、又は５２以上であることが好ましい場合があり、５３以上がより好ましい場合がある。アッベ数の上限は、例えば、５９以下、又は５８以下であることが好ましい場合があり、５７以下、又は５６以下がより好ましい場合がある。
　（アッベ数）
　アッベ数（νＤ）は、以下の式により求めることができる。
　νＤ＝（ＮＤ－１）／（ＮＦ－ＮＣ）
　式中、ＮＣ、ＮＤ及びＮＦはそれぞれ、フラウンホーファーのＣ線（波長６５６ｎｍ）、Ｄ線（波長５８９ｎｍ）及びＦ線（波長４８６ｎｍ）に対する屈折率である。
　アッベ数は、例えば、公知のアッベ屈折計を用いて測定することができる。
　（屈折率）
　本明細書において、屈折率はＮＣ、ＮＤ及びＮＦのいずれかをいう。液浸液体の屈折率は、一般的なカバーガラスの屈折率との差を小さくして、様々な形態の試料の観察が可能になる等の点で、１．３２以上１．５２以下が好ましく、１．３５以上１．５１以下がより好ましい。液浸液体の屈折率の下限は、１．４５以上、又は１．４６以上であることが好ましい場合があり、１．４７以上、１．４８以上、又は１．４９以上であることがより好ましい場合がある。
　（アッベ数と屈折率との組合せ）
　本発明の一実施形態に係る液浸液体は、アッベ数が５０以上６０以下の範囲内であって、かつ屈折率が１．３２以上１．５２以下の範囲内であることが好ましい場合がある。この液浸液体では、アッベ数の下限は、例えば、５１以上、又は５２以上であることが好ましい場合があり、５３以上がより好ましい場合がある。アッベ数の上限は、例えば、５９以下、又は５８以下であることが好ましい場合があり、５７以下、又は５６以下がより好ましい場合がある。この液浸液体では、屈折率は、１．３５以上１．５１以下がより好ましい。液浸液体の屈折率の下限は、１．４５以上、又は１．４６以上であることが好ましい場合があり、１．４７以上、１．４８以上、又は１．４９以上であることがより好ましい場合がある。
　（従来の浸液との比較）
　例えば、非特許文献１及び２に記載の浸液について、屈折率は高いが、アッベ数（νＤ）が透光性の試料配置部材の１つであるカバーガラスのアッベ数（５５前後）よりも低い。非特許文献１に記載の浸液のアッベ数は約４７であり、非特許文献２に記載の浸液のアッベ数は３３．２（ＳｅｅＤＢ２Ｓ（非特許文献２））又は３６．５（ＳｅｅＤＢ２Ｇ（非特許文献２））である。その結果、顕微鏡観察時に色収差が生じる。特に、観察点がカバーガラス表面から離れる程、色収差が大きくなる。よって、例えば、試料深部におけるタンパク質の共局在に関する多色イメージング等の高解像度観察が困難である。
　本実施形態の液浸液体は、特定の範囲のアッベ数を有することにより、液浸液体を原因とした色収差の発生は抑制される。したがって、本実施形態の液浸液体は、従来の液浸液体と比較して、高解像度観察、特にこれまで困難であった、試料深部の観察を可能にし得る。
　また、本実施形態の液浸液体は、実施例に示すとおり、乾燥や吸湿により、当該液浸液体の屈折率は影響を受ける。ただし、実施例に示すとおり、例えば室温付近での観察において、一定時間乾燥条件下又は高湿度条件下にさらしても、当該液浸液体のアッベ数は変化しない。すなわち、当該液浸液体は光分散性に関しては耐湿性及び耐乾燥性を有するといえる。したがって、当該液浸液体を使用することにより、色収差が低減し、長時間の顕微鏡観察が可能である。
　本実施形態の液浸液体は、対物レンズ（先玉レンズ）上で接触角を大きくできる点から、親水性であることが好ましい。すなわち、液浸液体が親水性であることによって、ＷＤ（working distance）が大きな場合でも、先玉上の液浸液体をこぼさずに保持することが容易で、かつ、先玉から液浸液体を除去することも容易（水はけが良い）となる。このことは、試料の深部観察及び多点観察に有利であり、また対物レンズの切替えや対物レンズを清浄に保つ上でも有利である。また、液浸液体の乾燥防止の点で、本実施の液浸液体は、蒸気圧が低い（一例では水よりも蒸気圧が低い）ことがより好ましい。
　（親水性の液体）
　本実施形態の液浸液体は、２種以上の親水性の液体を含んでいてもよい。典型的には、２種以上の親水性の液体は互いに混ざり合って均一な液体（溶液）となる。本明細書において、「親水性の液体」とは、水に可溶であって、室温近傍において液体の形態をとる化合物をいう。２種以上の親水性の液体を含むことによって、液浸液体の諸物性が所望の範囲内となるように調製することが容易となる。
　２種以上の親水性の液体の少なくとも一種は、アッベ数（νＤ）が低い液体であることが好ましく、アッベ数が５０以下の液体であることがより好ましく、アッベ数が４８以下の液体であることがさらに好ましい。当該液体は、屈折率の観点では、１．４４以上、１．４５以上、１．４６以上、１．４７以上、１．４８以上、１．４９以上、１．５０以上、１．５１以上、又は１．５１５以上であることが好ましい場合がある。アッベ数が低い液体の例として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、及びチオジエタノール（ＴＤＥ）等が挙げられる。これらの液体は１種又は複数種を用いることができる。具体的に例示したこれらの液体は何れも、水と比較して充分に小さい蒸気圧を有する。
　また、本実施形態の液浸液体において、２種以上の親水性の液体の少なくとも一種は、アッベ数（νＤ）が高い液体であることが好ましく、アッベ数が５０超の液体であることがより好ましく、アッベ数が５５以上、５６以上、５７以上、５８以上、５９以上、又は６０を超える液体であることがさらに好ましい。アッベ数が高い液体の例として、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）等のグリコール類；グリセロール；ブタンジオール（ブチレングリコール）；ブタントリオール；等が挙げられる。これらの液体は１種又は複数種を用いることができる。具体的に例示したこれらの液体は何れも、水と比較して充分に小さい蒸気圧を有する。液浸液体の乾燥抑制や吸湿によるアッベ数の変動の抑制等の点で、アッベ数が高い液体として、グリコール類が好ましく、ポリエチレングリコールがより好ましく、分子量が２００～１０００のポリエチレングリコールがさらに好ましい。
　また、２種以上の親水性の液体の少なくとも一種はアッベ数が高い液体であり、別の一種はアッベ数が低い液体であることがより好ましい。
　本実施形態の液浸液体が、アッベ数が高い液体とアッベ数が低い液体とを混ぜた溶液である場合、アッベ数が高い液体とアッベ数が低い液体の割合（アッベ数が高い液体の重量：アッベ数が低い液体の重量）は、２０～８０：８０～２０が好ましく、３０～７０：７０～３０がより好ましく、４０～６０：６０～４０がさらに好ましい。
　液浸液体における、２種以上の親水性の液体の合計量（重量％）は、８５重量％以上、９０重量％以上、９５重量％以上、９６重量％以上、９７重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、１００重量％が好ましい場合がある。
　上記で列挙した親水性の液体の屈折率（ＮＤ、ＮＦ、およびＮＣ）及びアッベ数（νＤ）を、以下の表１に示す。表１中の温度（℃）は、屈折率およびアッベ数を測定したときの温度である。上記で列挙した親水性の液体同士は互いによく混じり合い溶液を形成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表２は、観察対象となる生物試料に使用される溶液（試料溶液）の屈折率（ＮＤ、ＮＦ、およびＮＣ）及びアッベ数（νＤ）を示す。表２中の温度（℃）は、屈折率およびアッベ数を測定したときの温度である。ＳｃａｌｅＡ２（Hama, H. et al., Nat. Neurosci., 14:1481-1488 (2011)）、ＳｃａｌｅＳ４Ｄ２５（０）（Hama, H. et al., Nat. Neurosci., 18:1518-1529 (2015)）、ＳｃａｌｅＣＵＢＩＣ－２（Ｒｅａｇｅｎｔ－２）（Susaki, E.A. et al., Cell, 157:726-739 (2014)）、およびＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－ＳＭｔ（富士フィルム和光純薬株式会社製）はいずれも透明化の最終段階で使用され、マウンティング溶液として作用する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本実施形態の液浸液体は、液浸液体の乾燥防止、及び、液浸液体のアッベ数と屈折率とのバランス等の点から、グリセロールを含むことが好ましい場合がある。また、本実施形態の液浸液体は、グリセロール以外のアッベ数が高い液体と、アッベ数が低い液体と、グリセロールと、を含むことがより好ましい。液体の均一性、相溶性の保持、又は取扱い性等の点で、液浸液体に対して、グリセロールの量は５０重量％以下が好ましい場合があり、４０重量％以上がより好ましい場合があり、３０重量％以下または２０重量％以下がさらに好ましい場合がある。グリセロールの量は一例では、１０重量％以上５０重量％以下の範囲内であり、他の一例では、０．５重量％以上で１０重量％以下の範囲内であり、さらに他の一例では、０．５重量％以上で５重量％以下の範囲内である。
　また、本実施形態の液浸液体が水を含む場合、液浸液体の揮発防止の点で、水の含有量は５０重量％以下であることが好ましく、５重量％以下、４重量％以下又は３重量％以下であることがより好ましい場合がある。水の含有量が上記の範囲内にあれば、乾燥によって水が揮発した場合でも液浸液体に及ぼす影響（例えば、液浸液体の体積及び屈折率の変動、並びに、水に溶けきれなくなった成分の析出など）が低減される。液浸液体に水を添加しないことが特に好ましい場合が有る。
　一方で、本実施形態の液浸液体を湿潤な環境下で用いる場合には、少量の水（例えば、５重量％以下の水）を含んでいることによって、環境からの吸湿を防止することができる場合もある。
　液浸液体から水が揮発すること、及び、液浸液体が環境から吸湿することは、液浸液体の屈折率には影響を及ぼし得るが、そのアッベ数に及ぼす影響は相対的に非常に小さい（実施例も参照のこと）。
　なお、水はアッベ数が５０超の、アッベ数が高い液体である。
　（その他の成分）
　本実施形態の液浸液体は、必要に応じて、界面活性剤、ナノ粒子、または金属酸化物等を含むことができる。
　（液浸液体の調製）
　本実施形態の液浸液体の調製方法は、例えば、２種以上の親水性の液体を混合することによって調製することができる。混合する手順や手段は特に限定されない。
　本実施形態の液浸液体（液浸液体１）は、例えば、図１に示すように、透光性の試料配置部材３における、試料配置側の面（試料配置側面３ａ）に背向する面（背向面３ｂ）と、液浸対物レンズ２との間に配して、試料（図示せず）を観察してもよい。
　図１において、液浸対物レンズ２はレンズが上向きになるように配置されている。液浸対物レンズ２のレンズ上に液浸液体１が配置されている。液浸液体１の上に試料配置部材３の試料配置側面３ａが配置されている。
　これによって、液浸対物レンズ２と試料配置部材３とが液浸液体１を介して接触をする。試料の詳細は、後述の〔２．試料の観察方法〕の欄において説明する。
　透光性の試料配置部材３はガラス製（硼珪酸ガラスから主に構成されている）であることが好ましい。試料配置部材３の例として、例えば、カバーガラス、ガラスプレート及びガラスシャーレ等が挙げられる。
　試料配置側面３ａは、試料が直接接していてもよいし、試料を含む媒体４（試料溶液４）が直接接していてもよい（すなわち、試料は、媒体４を介して間接的に、試料配置側面３ａに接していてもよい）。媒体４の一例は、液体媒体である。
　なお、アクロマート、アポクロマート、及びスーパーアポクロマート等と称される、色収差の発生を抑制した対物レンズが市販されてはいる。ただし、これらのレンズはＷＤが短いことが多く、使用できる試料が限定される。また、液浸液体に起因する色収差のために、これら対物レンズの性能が充分に発揮できない場合もある。一般に、液浸液体はその屈折率の調整が最優先課題であるところ、本実施形態に記載のように色収差の発生を抑制するという着想に基づけば、使用できる試料や対物レンズに関しても自由度が増す。
　〔２．試料の観察方法〕
　本実施形態の一実施形態に係る試料の観察方法（以下、「観察方法」と称する場合もある）は、本実施形態の液浸液体を、透光性の試料配置部材における、試料配置側の面に背向する面と、液浸対物レンズとの間に、配置して、試料を観察する工程を含む（図１も参照のこと）。
　（試料）
　試料の例として、生物材料等が挙げられる。生物材料の種類は特に限定されないが、植物由来の材料又は動物由来の材料が好ましく、魚類、両生類、爬虫類、鳥類又は哺乳類（哺乳動物）等の動物由来の材料がより好ましく、哺乳動物由来の材料が特に好ましい。また、哺乳動物の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、マーモセット等のヒトを除く霊長類、等の実験動物；イヌ、ネコ、フェレット等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられる。
　また、生物材料は、個体そのものであってもよく（生きているヒト個体そのものは除く）、植物若しくは動物の個体から取得した器官、組織、又は細胞であってもよい。また、細胞は培養細胞であってもよい。
　本実施形態の観察方法では、例えば高解像顕微鏡又は超解像顕微鏡を用いると５０～２００μｍ程度の深度まで超解像イメージングが可能である。この深度は対物レンズの作動距離（ＷＤ）によって制約されるため、対物レンズのＷＤを調整することによってさらに深部での観察も可能になる。
　また、上記の生物材料は、顕微鏡観察用にパラホルムアルデヒド等で固定化（fixed）処理された材料であってもよく、固定化されていない材料であってもよい。固定化処理は、例えば、従来公知の方法で行うことができる。
　生物材料の厚みは特に限定されないが、例えば、１μｍ～１０ｍｍとすることができ、１００μｍ～２ｍｍであることが好ましい。本実施形態の観察方法によって、色収差の発生を抑制しながらより深部のイメージングが可能となるため、０．１ｍｍ以上の厚みであっても本発明を適用し得る。
　上記生物材料は、具体的には例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織、又は蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。
　本実施形態の観察方法によって、特に、透明化処理された試料の観察を好適に行うことができる。透明化処理とは、例えば、ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ（登録商標）による処理等をいう。
　本実施形態の観察方法は、あらゆる種類の光学顕微鏡を用いて行うことができる。例えば、３次元超分解顕微鏡技術（例えば、ＳＴＥＤ、３Ｄ　ＰＡＬＭ、ＦＰＡＬＭ、３Ｄ　ＳＴＯＲＭ、及びＳＩＭ）を適用して、本実施形態の観察方法を行うこともできる。また、多光子励起型（一般的には２光子励起型）の光学顕微鏡技術を適用して、本実施形態の観察方法を行うこともできる。一光子励起型の光学顕微鏡技術でも充分な観察が可能である。
　また、本実施形態の観察方法により、上記顕微鏡を用いた多色イメージングや３次元イメージング、特に試料の透明化技術を組み合わせた３次元多色イメージング等において色収差の発生を抑制することができる。また、本実施形態の観察方法は、これまで困難であった、試料深部の多色イメージングや３次元イメージング、特に試料の透明化技術を組み合わせた試料深部の３次元多色イメージングに有効である。また、本実施形態の観察方法によって、培地中の培養細胞塊等をそのまま観察することができる。
　図１では、液浸対物レンズ２が上方を向いている、いわゆる倒立型の顕微鏡の例を図示しているが、図１に示す配置関係を上下逆転した顕微鏡（例えば、ハンギングドロップに保持された試料を上方から観察する顕微鏡）にも、本発明を適用可能である。ただし、本発明は、倒立型の顕微鏡に適用することがより好ましい。
　倒立型の顕微鏡での透明化処理された試料の観察に液浸液体を使用するときに、液浸液体と透明化試薬のアッベ数を合わせることが好ましい。これにより、深さに応じて生じ得る色収差の変化を低減することができる。特に、多色イメージングや厚みのある試料の測定時に有用である。本実施形態の液浸液体を使用する場合、アッベ数が５０以上６０以下の範囲内である透明化試薬を使用することが好ましい。
　〔３．その他〕
　本実施形態の液浸液体のアッベ数及び屈折率等に対応させて、液浸対物レンズを設計することができる。透明化処理された試料の観察に液浸液体を使用するときに、液浸液体および透明化試薬の屈折率とアッベ数に対応する対物レンズを使用することによって色収差を低減することができる。
　（まとめ）
　以上をまとめると、上記の課題を解決するために、本発明は、以下の特徴を含む。
＜１＞アッベ数が５０以上６０以下の範囲内である、顕微鏡の液浸液体。
＜２＞屈折率が１．３５以上１．５２以下の範囲内である、＜１＞に記載の液浸液体。
＜３＞親水性である、＜１＞又は＜２＞に記載の液浸液体。
＜４＞２種以上の親水性の液体を含む、＜１＞～＜３＞の何れかに記載の液浸液体。
＜５＞前記２種以上の親水性の液体の少なくとも１種が、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、及びチオジエタノールからなる群より選ばれる少なくとも１つの液体である、＜４＞に記載の液浸液体。
＜６＞前記２種以上の親水性の液体の少なくとも１種が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ブタンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びブタントリオールからなる群より選ばれる少なくとも１つの液体である、＜４＞又は＜５＞に記載の液浸液体。
＜７＞５０重量％以下のグリセロールを含む、＜１＞～＜６＞の何れかに記載の液浸液体。
＜８＞５０重量％以下の水を含む、＜１＞～＜７＞の何れかに記載の液浸液体。
＜９＞透光性の試料配置部材における、試料配置側の面に背向する面と、液浸対物レンズとの間に配される、＜１＞～＜８＞の何れかに記載の液浸液体。
＜１０＞＜１＞～＜８＞の何れかに記載の液浸液体を、透光性の試料配置部材における、試料配置側の面に背向する面と、液浸対物レンズとの間に、配置して、試料を観察する工程を含む、試料の観察方法。
＜１１＞前記試料が、動物若しくは植物由来の細胞、組織若しくは器官、又はヒトを除く動物若しくは植物である、＜１０＞に記載の観察方法。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明の以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　＜実施例１：液浸液体１～５の調製＞
　２，２’－チオジエタノール（以下、ＴＤＥと略記する）と、表３に示す液体を混合させ、液浸液体１～５を調製した。調製した液浸液体１～５の屈折率とアッベ数の測定結果を表３に示す。屈折率及びアッベ数は２５℃で測定して得られた値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例２：ＴＤＥとＰＥＧ６００との混合比による屈折率とアッベ数の変化＞
　ＴＤＥとＰＥＧ６００との混合比を変化させて、調製した液浸液体の屈折率とアッベ数を２５℃で測定した。測定結果を図２に示す。
　図２の２０１は屈折率の測定結果を示す。縦軸は屈折率、横軸は液浸液体の全体を１０としたときのＰＥＧ６００の割合（重量比）を示す。
　図２の２０２は、縦軸をアッベ数（νＤ）、横軸を屈折率（ＮＤ）としてプロットしたグラフである。
　＜実施例３：液浸液体６～８の調製＞
　ＴＤＥとＰＥＧ６００を以下の表３に示す割合（重量比）で混合させ、液浸液体６～８を調製した。液浸液体６及び７には、調製時に表３に示す量の水を添加した。調製した液浸液体６～８の屈折率とアッベ数の測定結果を図３及び表４に示す。屈折率及びアッベ数は２５℃で測定して得られた値である。アッベ数の測定は実施例１と同様に行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図３に示すように、水の添加によって、液浸液体のアッベ数がほとんど変化しないことが分かった。また、この結果から、湿度の変化によって、液浸液体のアッベ数は影響を受けないことが示唆された。
　＜検討例１：環境試験＞
　液浸液体６～８と、透明化試薬である富士フィルム和光純薬株式会社製のＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－ＳＭｔ（＃１９１－１８５７１、Ｌｏｔ．ＰＴＭ０５０９）について、環境試験を行い、環境変化に伴う屈折率及びアッベ数の変化の有無を観察した。ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－ＳＭｔの２０℃におけるＮＤは１．４９３９（メーカー公称値）、２５℃におけるνＤは５２～５４（実測値）であった。
　まず、各液体を入れたチューブの蓋を開けた状態で、湿度２０％、湿度３５％、又は湿度５０％の環境下に１日放置した。温度はいずれの湿度環境下において２５℃に設定した。また、コントロールとして、外気に触れないようチューブの蓋を閉じ密閉した環境下でも行った。１日経過後、屈折率を測定した。環境試験前後の屈折率の測定結果を図４に示す。
　図４中、「Ｐ６（６：４）Ｗ３．５」は液浸液体６、「Ｐ６（５．５：４．５）Ｗ２」は液浸液体７、「Ｐ６（５：５）Ｗ０」は液浸液体８、「ＳＭｔ」はＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－ＳＭｔの結果を示す。また、図４の４０２中の縦軸は、環境試験前の屈折率（ＮＤ）に対する環境試験後の屈折率（ＮＤ）の割合を示す。
　また、各液体を湿度３５％かつ温度４０℃の条件下で、透光性の試料配置部材であるカバーガラスと、液浸対物レンズとの間に配し、１日経過後、アッベ数を測定した。測定結果を表５と図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図４と５に示すように、湿度環境の変化により液浸液体６～８の屈折率が変化した。乾燥状態（湿度２０％）では屈折率が上昇し、吸湿状態（湿度３５％、５０％）では屈折率が低下する傾向が観察された。一方、アッベ数は、環境試験前後でほとんど変化しなかった。また、図４に示すように、乾燥状態に液浸液体６～８をさらしても、アッベ数はほとんど変化しなかった。屈折率の変動は、補正環により補正（球面収差補正）することができる。アッベ数が湿度環境によって変化しなかったことにより、顕微鏡の液浸液体として、液浸液体６～８の使用することによって、色収差が低減し、長時間の観察が可能であることがわかった。
＜実施例４：対物レンズの影響＞
　作動距離（ＷＤ）の長い新たな対物レンズＳＰＥ３０Ｘを設計し、液浸液体と組み合わせて用いた際の色収差に対する影響を調べた。対物レンズＳＰＥ３０ＸはＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－ＳＭｔ（ＮＤ＝１．４９２、νＤ＝５３）を設計対象溶液としてオリンパス株式会社によって作製され、その仕様は以下のとおりである：倍率：３０倍、ＮＡ：１．０５、ＷＤ：１ｍｍ、屈折率：Ｎｅ＝１．４９。
　ＴｅｔｒａＳｐｅｃｋ　Ｂｅａｄｓ（φ１．０μｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－ＳＭｔ（ＮＤ＝１．４９２、νＤ＝５３）で透明化されたマウス脳切片内に分散させ、カバーガラスとスライドガラスで挟んで包埋した。
　カバーガラス側を底面（レンズ側）にセットし、カバーガラスと対物レンズＳＰＥ３０Ｘとの間に液浸液体５（ＮＤ＝１．４９２、νＤ＝５３）を配し、共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ３０００ＲＳ（オリンパス株式会社製）を用いて表面直上付近（０μｍ）から深部（６００μｍ付近）までを、４０５、４８８、５６１、６４０ｎｍの４種類の波長でイメージングし、得られた画像をＸＺ面に変換した。結果を図６に示す。この過程で得られた４つの深さ（３０μｍ、１００μｍ、３００μｍ、５００μｍ）における画像をそれぞれＲＯＩ－１～４として示す（図７）。これらの結果から、液浸液体を使用して深部まで色収差のない画像が得られることが示された。
　本発明は、顕微鏡観察、特に、高解像度観察時に色収差の発生を抑制することができ、顕微鏡の液浸液体、及びその利用を提供することができる。
　１　　液浸液体（浸液）
　２　　液浸対物レンズ
　３　　試料配置部材
　３ａ　試料配置側面
　３ｂ　背向面
　４　試料および試料溶液

Claims (11)

  1. 　アッベ数が５０以上６０以下の範囲内である、顕微鏡の液浸液体。
  2. 　屈折率が１．３５以上１．５２以下の範囲内である、請求項１に記載の液浸液体。
  3. 　親水性である、請求項１又は２に記載の液浸液体。
  4. 　２種以上の親水性の液体を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の液浸液体。
  5. 　前記２種以上の親水性の液体の少なくとも１種が、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、及びチオジエタノールからなる群より選ばれる少なくとも１つの液体である、請求項４に記載の液浸液体。
  6. 　前記２種以上の親水性の液体の少なくとも１種が、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ブタンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びブタントリオールからなる群より選ばれる少なくとも１つの液体である、請求項４又は５に記載の液浸液体。
  7. 　５０重量％以下のグリセロールを含む、請求項１～６の何れか一項に記載の液浸液体。
  8. 　５０重量％以下の水を含む、請求項１～７の何れか一項に記載の液浸液体。
  9. 　透光性の試料配置部材における、試料配置側の面に背向する面と、液浸対物レンズとの間に配される、請求項１～８の何れか一項に記載の液浸液体。
  10. 　請求項１～８の何れか一項に記載の液浸液体を、透光性の試料配置部材における、試料配置側の面に背向する面と、液浸対物レンズとの間に、配置して、試料を観察する工程を含む、試料の観察方法。
  11. 　前記試料が、動物若しくは植物由来の細胞、組織若しくは器官、又はヒトを除く動物若しくは植物である、請求項１０に記載の観察方法。
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