WO2020148475A2 - Métodos para el diagnóstico de enfermos atópicos sensibles a componentes alergénicos del polen de olea europaea (olivo) - Google Patents

Métodos para el diagnóstico de enfermos atópicos sensibles a componentes alergénicos del polen de olea europaea (olivo) Download PDF

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WO2020148475A2
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eapo
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scp2
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José Antonio CORNEJO GARCÍA
Miguel BLANCA GÓMEZ
Antonio VEGA RIOJA
Virginia BELLIDO LINARES
Pedro CHACÓN FERNÁNDEZ
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Universidad de Sevilla
Servicio Andaluz de Salud
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Universidad de Sevilla
Servicio Andaluz de Salud
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to the field of precision medicine, and more specifically, to the field of molecular diagnostics.
  • the present invention describes the use of biomarkers for the diagnosis and prognosis of individuals affected or at risk of developing susceptibility to olive pollen allergens, a kit or device, and their uses.
  • Allergic diseases have increased in recent decades worldwide, constituting a great burden in terms of loss of quality of life, and assuming a great economic cost for the family and administrations.
  • ADs Allergic diseases
  • a prevalence of the disease was observed reaching 25-30% of the population in Western European countries.
  • WAO World Allergy Organization
  • WHO World Health Organization
  • the olive tree (Olea europaea) is one of the most important crops in the Mediterranean area, where it has been cultivated for millennia. Extensive cultivation of this plant has led to the appearance of an extremely broad and varied germplasm, with at least 262 cultivars identified only in Spain. Until very recently, the characterization of olive cultivars has been carried out primarily according to morphological and agronomic parameters. However, the use of molecular techniques is emerging in order to make this varietal characterization much more reliable, fast and simple.
  • Olive pollen allergic disease hereinafter EAPO, is one of the most prevalent ADs, given that olive pollen is one of the most important causal agents of seasonal allergy phenomena in humans, more specifically type I allergies. in those countries where this plant is widely distributed.
  • the major allergen in this pollen is a 20 kDa protein
  • An allergen is a non-body substance capable of inducing an IgE-mediated immune response. We can distinguish between major allergens, those against which specific IgE presents more than 50% of allergic patients, and minor allergens, which are recognized by less than 50% of allergic patients.
  • Natural extracts are currently being replaced by recombinant extracts, in which each component can be produced, after cloning them.
  • each component can be produced, after cloning them.
  • recombinant allergens do not always mimic the way of action of the natural ones.
  • microarray technology Since the completion of the human genome project, microarray technology has made it possible to register the genotype in millions of genetic variants simultaneously. These genome-wide variations, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs), have made it possible to establish statistical associations between genotype and phenotype (genome-wide association studies (GWAS)), which identify genetic loci and risk factors for asthma. and EAs. Most of the GWAS have been performed in asthma, where an association with the 17q21 locus has been established. This locus comprises 4 genes (ORMDL3, GSDMB, ZPBP2, and IKZF3), related to calcium homeostasis in the reticulum and protein folding.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • GWAS gene-wide association studies
  • ADAM33 is associated with asthma and bronchial hyperresponsiveness in some populations but not in others. These discrepancies may be due to the fact that up to now it has been attempted to identify a “universal genetic profile” common to all allergic patients, for which a too heterogeneous population of individuals has been studied. Therefore, much more specific clinical and population process studies.
  • Fig. 1 Correlation between significant variants of SNP interactions following a codominant model.
  • Fig. 4. Manhattan representation. Select the most significant markers on the human chromosome.
  • the authors of the present invention have developed a tool for the early diagnosis, follow-up stratification, prognosis, prevention and / or treatment of individuals affected or at risk of developing allergic diseases related to olive pollen, from now on EAPO.
  • the present invention is the result of the search for new single nucleotide polymorphisms associated with EAPO and evaluated through GWAS, which has allowed the identification of effective biomarkers and targets for this disease that allow: 1) to discriminate between healthy individuals, diagnosed patients of EAPO and people at high risk of developing EAPO, 2) clinically stratify individuals based on clinical parameters and specific biomarkers in complex biological samples, 3) facilitate clinical follow-up of these individuals, allowing clinically forecasting to individuals diagnosed with EAPO and contributing to the development of personalized medicine; 4) prevent the appearance of EAPO in individuals previously identified as susceptible or at risk of suffering the disease and 5) treat individuals diagnosed with EAPO.
  • the inventors propose the standardized evaluation of a panel of biomarkers, in this case EAPO related, in complex biological samples from individuals, eg blood samples.
  • EAPO related a panel of biomarkers
  • This information would allow, for example, the development of a chip or array for the stratification of individuals in various risk groups and the definition of their specific needs for clinical monitoring and therapeutic management.
  • a first aspect of the invention relates to the use of at least one of the SCP2, CTNND2 and / or ZNF252P genes or any of their combinations, to diagnose, classify, predict or forecast if an individual has developed or is likely to develop EAPO.
  • SCP2 refers to the Sterol Carrier Protein 2 [Homo sapiens] gene, a gene that encodes two proteins: the stere X-bearing protein (SCPx) and the stere transporter 2 (SCP2), as a result of the initiation of transcription of 2 independently regulated promoters. Transcription initiated from the proximal promoter encodes the longest SCPx protein, and transcription initiated from the distal promoter encodes the shorter SCP2 protein, with the 2 proteins sharing a common C-terminal end.
  • SCPx the stere X-bearing protein
  • SCP2 stere transporter 2
  • SCPx protein is a peraxisome-associated thiolase that is involved in the oxidation of branched-chain fatty acids, while the SCP2 protein is believed to be an intracellular lipid transfer protein.
  • This gene is highly expressed in organs involved in lipid metabolism. Alternative splicing of this gene produces multiple transcription variants, some encoding different isoforms.
  • SCP2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the protein coding sequence "SCP2" and "SCPx”, and which would comprise various variants derived from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and the structural characteristics of the SCP2 protein.
  • SEQ ID NO: 2 is, but is not limited to, SEQ ID NO: 2.
  • CTNND2 refers to the Catenin Delta 2 gene [homo sapiens], a gene that encodes a protein associated with the adhesive bond of the armadillo / beta-catenin superfamily and is involved in brain and eye development and cancer formation.
  • the protein encoded by this gene promotes the breakdown of the E-cadherin-based adherent junctions to favor the propagation of cells after stimulation by hepatocyte growth factor.
  • This gene resides in a region of the short arm of chromosome 5. Alternative splicing results in multiple transcription variants encoding different isoforms.
  • CTNND2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence for the '' CTNND2 '' protein, and which would comprise various variants derived from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
  • nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 1. in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and the structural characteristics of the CTNND2 protein.
  • SEQ ID NO: 4 nucleotide sequences encoding CTNND2 is, but is not limited to, SEQ ID NO: 4.
  • ZNF252P refers to the Zinc Finger Protein 252 gene.
  • Pseudogene homo sapiens
  • ZnF zinc finger
  • ZnF zinc finger
  • a wide and diverse family of proteins that comprise a “zinc finger” domain referring to secondary protein structures (helix and leaf b) that are held together by a Zn ion, these domains that typically serve to interact with DNA, RNA, proteins or small molecules.
  • ZNF252P is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence for the protein" ZNF252P ", and which would comprise various variants derived from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a) are nucleic acid molecules whose hybrid complementary chain with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 5. in that the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the ZNF252P protein.
  • SEQ ID NO: 6 nucleotide sequences encoding ZNF252P is, but is not limited to, SEQ ID NO: 6.
  • rs10437066 [G / A] and rs7544995 [A / G] polymorphisms of the SCP2 gene the rs6867416 [C / T] polymorphisms, rs6554641 [T / C] of the CTNND2 gene, and the rs7817276 polymorphisms [ G / A],> rs2272715 [T / C], rs6599548 [C / T] and rs3866997 [A / C] of the ZNF252P gene.
  • the first is the reference allele and the second is the alternative allele, it is the susceptibility allele.
  • variant refers to a sequence substantially homologous to the sequence of the genes containing the described variants.
  • a variant includes nucleotide additions, deletions, or substitutions. More preferably, the described variants refer to the change or substitution of a nucleotide of the sequence in the reference human genome at the described positions.
  • polymorphism refers to a variation in the nucleotide sequence of a nucleic acid where each possible sequence is present in a proportion equal to or greater than 1% in a population; in a particular case, when said variation is the nucleotide sequence it occurs in a single nucleotide (A, C, T or G) it is called SNP.
  • allelic variant or “allele” are used interchangeably in the present description and refer to a polymorphism that occurs at the same locus in the same population.
  • gene variation or “gene variant”, as used herein Description includes mutations, polymorphisms, and allelic variants. A gene variation or variant is found between individuals within populations and between populations within species.
  • SNP genotyping methods there are more than 100 different SNP genotyping methods, any applicable in the present invention. For example, without limitation, it can be detected using restriction enzymes or by simple sequencing using PCR, ASO probes and hybridization in DNA microarrays or spheres.
  • SNP amplification methods include PCR, the Invader method, rolling circle DNA amplification, etc.
  • allelic discrimination methods allele specific hybridization, allele specific oligonucleotide ligation, minisequencing or probe extension (SBE), allele specific invasive disruption (Invader), etc. can be used, but are not limited to.
  • SBE probe extension
  • Invader allele specific invasive disruption
  • DNA biochips and microarrays or other methods that use particles, such as Luminex 100, BeadArray, etc.
  • mass detection methods such as pyrosequencing, or miniaturization.
  • a second aspect of the invention refers to a method of obtaining useful data for the diagnosis, stratification and prognosis of the evolution of the EAPO in an individual, hereinafter the first method of the invention, comprising:
  • a) Determine the single nucleotide polymorphisms rs10437066 [G / A] and rs7544995 [A / G] of the SCP2 gene, the rs6867416 [C / T] polymorphisms, rs6554641 [T / C] of the CTNND2 gene, and the rs7817276 polymorphisomes [ G / A],> rs2272715 [T / C], rs6599548 [C / T] and rs3866997 [A / C] of the ZNF252P gene in an isolated biological sample, or any combination thereof.
  • a third aspect of the invention relates to a method for the diagnosis, stratification and prognosis of the evolution of EAPO in an individual, hereinafter the second method of the invention, comprising comprising step (a) of the first method of the invention, and additionally:
  • b) include individuals with variant A of rs10437066 and / or variant G of rs7544995 of the SCP2 gene, variant T of rs6867416 and / or variant C of rs6554641 [T / C] of the CTNND2 gene, and / or A of rs7817276 the C variant of rs2272715 [T / C] and / or the T variant of rs6599548 and / or the rs3866997 variant of the ZNF252P gene, or any combination thereof , in the group of individuals most likely to develop EAPO.
  • biological sample refers to, but is not limited to, biological cells, tissues and / or fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art. matter, which serves to carry out any of the methods provided by the present invention.
  • isolated biological sample is peripheral blood
  • the term "individual” as used in the description refers to animals, preferably mammals, and more preferably, humans.
  • the term “individual” in this memory is synonymous with “patient”, and is not intended to be limiting in any way, as it may be of any age, sex and physical condition.
  • the terms "human subject”, “subject” and “patient” are therefore used interchangeably in this specification.
  • a “nucleic acid sequence” or “polynucleotide” can comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine, and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit degradation of the probe; or as junction points for detectable debris or shielding debris.
  • a polynucleotide of the invention may contain one or more derivatized, non-standard, modified base moieties, including, but not limited to a4-acetylcytidine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uridine, 2'-0-methylcytidine, 5-carboxymethylaminomethyl- 2- thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluridine, dihydrouridine, 2'-0-methylpseudouridine, D-galactosylqueosine, 2'-0-methylguanosine, inosine, N6-isopentenyladenosine, 1- methyladenosine, 1-methylpseudouridine, 1-methylguanosine 2,2-dimethylguanosine, 2-methyladenosine, 2-methylguanosine, 3-methylcytidine, 5-methylcytidine, N6-methyladenosine, 7-methylguanosine, 5-methylaminomethyluridine, 5-me
  • the first method of the invention may comprise an additional step, prior to step (a), comprising a pretreatment of the complex biological sample.
  • the term “pretreatment”, referring to a complex biological sample, includes any change or transformation that the sample may undergo since it is extracted from the individual or reaches the laboratory until it has a measurable form in order to guarantee its utility and adequacy with respect to analysis, analyte and sample, in one or more stages.
  • this manipulation include the change of physical state, change of chemical properties (salinity, pH, redox potential, ...) change of concentration (by dilution or concentration), processes of elimination or masking of the effect of interferers present in the matrix, matrix change, addition of preservative components, analyte extraction techniques (eg DNA, RNA or protein extraction) or modifications in the dimension or staining of tissues or solid samples.
  • both the first and the second method of the invention described above can be fully or partially automated and / or computerized, for example, by means of robotic liquid dispensing equipment in step (a), an equipment robotic sensor for the detection of the quantity in step (b), or the computerized comparison in step (c) and / or (e).
  • a “diagnostic method” refers to a procedure where a patient (or a sample obtained from him) is examined or analyzed to obtain differential knowledge of a disease through the signs and symptoms that This discrimination, as understood by a person skilled in the art, is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed, however, it requires that a statistically significant amount of the samples analyzed be classified correctly. Statistically significant can be established by a person skilled in the art through the use of different statistical tools, for example, but without limitation, by determining confidence intervals, determination of the p-value, Student's test or Fisher's discriminant functions. confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.
  • the p value is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, or 0.0001.
  • the present The invention makes it possible to correctly detect the disease differentially in at least 60%, in at least 70%, in at least 80%, or in at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • a “prognostic method” refers to a procedure where, from clinical analyzes, the disease or illness, such as EAPO, that the person suffers from is identified, and, based on experiences with others Patients afflicted with the same disease or condition, EAPO, predicts what the individual's health status will be like in the future, that is, the evolution of the disease or condition over time.
  • the term “prognosis” in the present invention is also refers to the ability to detect asymptomatic patients or subjects who have a high probability of suffering from a disease or illness, EAPO, even when at the time of diagnosis they do not present such pathologies or their obvious manifestations.
  • Such an assessment while preferred to be, may not normally be correct for 100% of the subjects to be predicted.
  • the term requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as suffering from or predisposing to the disease. Whether a part is statistically significant can be readily determined by the person skilled in the art using various well-known statistical evaluation tools, for example, confidence interval determination, p-value determination, Student's t-test, Mann-Whitney test. , etc.
  • the preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%.
  • P values are preferably but not limited to 0.2, 0.1, 0.05.
  • One or more as also used herein includes one and the individualized specification of any number that is more than one, such as two, three, four, five, six, etc.
  • “More than one” or “some” as used in the present specification includes the individualized specification of any number that is more than one, such as two, three, four, five, six, etc.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of a composition, hereinafter the composition of the invention, comprising at least one nucleotide with the correct sequence of the SCP2, CTNND2 and / or ZNF252P gene, for the prevention, improvement and / or treatment of EAPO.
  • the individual to be treated can be identified as an individual with greater susceptibility to EAPO by any of the methods of the invention described above.
  • composition comprising at least one nucleotide with the correct sequence of the SCP2, CTNND2 and / or ZNF252P gene, for the prevention, improvement and / or treatment of EAPO in an individual who has been identified by the first or second method of the invention.
  • the composition of the invention is a pharmaceutical composition that further comprises an acceptable vector for implementation in replacement gene therapy.
  • vector refers to a system that aids in the process of transferring an exogenous gene to the cell, facilitating its intracellular entry and bioavailability, so that it can function properly. Both viral and non-viral vectors are included in this definition.
  • the success of any gene therapy protocol requires the existence of a gene susceptible to therapeutic manipulation, a vector that facilitates the delivery of the genetic material in the appropriate cells, and a method that allows access of that vector to the corresponding tissue.
  • the genetic material used can be DNA, ribonucleic acid (RNA), synthetic oligonucleotides, or ribozymes (catalytic RNAs).
  • the methods available for introducing DNA into desired cells are widely used and include viral vectors (adenoviruses, replication-deficient retroviruses, herpes viruses, etc.) and non-viral vectors (liposomes, DNA-protein conjugates).
  • the administration of the DNA to the somatic cells can be done ex vivo (the vector with DNA is introduced into the cells of interest in culture and administered to the patient) or in vivo (where the DNA associated with the vector is administered directly to the individual, using methods that allow it to reach the target tissue or cell).
  • the protocols under development use viral vectors to introduce DNA into cells or tissues and it is expected that a significant improvement in Efficiency and selectivity of vectors are key in the future development and diffusion of gene therapy.
  • a fifth aspect of the present invention relates to a kit or device, hereinafter kit or device of the invention, comprising the elements and / or reagents necessary to quantify the single nucleotide polymorphisms rs10437066 [G / A] and rs7544995 [A / G] of the SCP2 gene, the rs6867416 [C / T] polymorphisms, rs6554641 [T / C] of the CTNND2 gene, and the rs7817276 [G / A] polymorphisms,> rs2272715 [T / C], rs6599548 [C / T] and rs3866997 [A / C] of the ZNF252P gene, individually or any of its combinations, from a biological sample isolated from an individual.
  • the kit or device of the invention provides sufficient data to carry out the diagnosis, stratification, monitoring and / or prognosis of the evolution of EAPO in an individual, so that these data allow performing step (b) , (c) and / or (e) of any of the methods of the invention detailed above.
  • kit or device of the invention may comprise instructions for automatically performing (c) and / or (e) of any of the methods of the invention detailed above.
  • kit or device of the invention may comprise the tools necessary to make a manipulation, conditioning, storage or pretreatment of the complex biological sample from the study individual, allowing an instrumental analysis that results in the data from the step (a) of any of the methods of the invention detailed above.
  • Another aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions for causing a computer to carry out the method according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier can be constituted by said cable or other device or medium.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be embedded in a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk. Lasted.
  • the programs could be supported on a transmittable carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be transported through an electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can carry out the methods of the invention.
  • Such programs may take the form of source code, object code, an intermediate source of code, and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in implementing the processes according to the invention.
  • Computer programs also encompass cloud applications based on this procedure.
  • Another aspect of the invention relates to a computer readable storage medium comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a transmittable signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • Example 1 Study for the identification of key components to develop clinical methods in olive pollen allergic disease (EAPO).
  • EAPO olive pollen allergic disease
  • HWE Hardy-Weinberg equilibrium
  • the significance data for each model can be viewed in the results Excel, inside the results folder.
  • the present study carried out the functional study of significant variants using the information provided by the Ensembl, dSNPs, Interpro, ClinVar and uniprot.
  • the information was supplemented by the SIFT algorithms, PolyPhen.
  • the 1000 Genomes and ExAC databases were used.
  • the algorithms proposed by For the prediction studies of splicing events and regulatory motives, the algorithms proposed by.
  • the algorithm proposed by For the evolutionary conservation of the position of each variant, the algorithm proposed by.
  • the initial dataset is contained by two different populations, from Seville and Malaga.
  • pValue was added, stratifying by population and a PCA study was performed.
  • the Wilcoxon non-parametric test was performed between the two populations and the pValue were normalized by fdr. The result was negative, so the influence of the population does not seem significant in the so-called significant markers.

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Abstract

Biomarcadores y método para el diagnostico, estratificación, seguimiento y pronostico de la evolución de la enfermedad alérgica a polen del olivo, kit o dispositivo y usos.

Description

Métodos para el diagnóstico de enfermos atópicos sensibles a componentes aleroénicos del polen de Olea euro paea (olivo).
La presente invención se refiere al campo de la medicina de precisión, y más concretamente, al campo del diagnóstico molecular. La presente invención describe el uso de biomarcadores para el diagnostico y pronostico de individuos afectados o con riesgo de desarrollar susceptibilidad a alérgenos del polen de olivo, un kit o dispositivo y sus usos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las enfermedades alérgicas (EAs) han aumentado en las últimas décadas en todo el mundo, constituyendo una gran carga en cuanto a pérdida de calidad de vida se refiere, y suponiendo un gran coste económico para la familia y administraciones. En los años ochenta se observó una prevalencia de la enfermedad que alcanzaba el 25-30% de la población en países de Europa occidental. En diez años se calcula que aproximadamente el 50% de la población general, con un aumento del 2% anual, puede verse afectada por un problema alérgico. La organización Mundial de la Alergia (WAO) estima que 334 millones de personas en el mundo padecen asma alérgico y según la organización mundial de la salud (WHO) 250,000 personas mueren prematuramente cada año a causa de la misma.
La factura económica que originan las EAs crece a la par que su frecuencia. Los cálculos de 2013 estiman que en la Unión Europea los costes directos originados por el asma ascendieron a 20.000 millones de euros. A éstos hay que añadir los indirectos, estimados en unos 14.000 millones de euros y los generados por la pérdida de horas de asistencia a clases, horas de trabajo, molestias para los pacientes y familiares, etc., estimados en 38.000 millones de euros, lo que suma un total de 72.000 millones de euros. En España se estima que el coste anual del asma en 2009 fue de 1.480 millones de euros considerando la prevalencia basada en el diagnóstico sintomático asociado a la hiperreactividad bronquial, y de 3.022 millones de euros si se considera únicamente el diagnóstico sintomático del asma.
El olivo ( Olea europaea) es uno de los cultivos de mayor importancia en el área Mediterránea, donde ha sido cultivado durante milenios. El cultivo extensivo de esta planta ha conducido a la aparición de un germoplasma extremadamente amplio y variado, con al menos 262 cultivares identificados solamente en España. Hasta muy recientemente, la caracterización de los cultivares de olivo se ha realizado primariamente de acuerdo a parámetros morfológicos y agronómicos. Sin embargo, está emergiendo la utilización de técnicas moleculares con la finalidad de hacer esta caracterización varietal mucho más fiable, rápida y sencilla. La enfermedad alérgica a polen del olivo, en adelante EAPO, es una de las EAs más prevalente, dado que el polen de olvio es de los más importantes agentes causales de fenómenos de alergia estacional en humanos, más concretamente de las alergias de tipo I, en aquellos países en los que esta planta está ampliamente distribuida. El alérgeno mayoritario de este polen, denominado Ole e1 , es una proteína de 20 kDa
En nuestro país, el 80% de todos los asmáticos lo son por causa alérgica, y la sensibilización a polen de Olivo, es la segunda causa de alergia respiratoria en España tras la sensibilización a las gramíneas. En Andalucía, es la causa más frecuente de alergia respiratoria siendo Jaén, Córdoba y Sevilla las provincias más afectadas, puesto que gran parte de su extensión está dedicada a su cultivo y el 75-90% por ciento de los alérgicos están sensibilizados al olivo.
Un alérgeno es una sustancia no propia del organismo capaz de inducir una respuesta inmunológica mediada por IgE. Podemos distinguir entre alérgenos mayoritarios, aquellos frente a los cuales presentan IgE específica más del 50% de los enfermos alérgicos, y los alérgenos minoritarios, que son reconocidos por menos del 50% de los pacientes alérgicos.
En los últimos cien años el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades alérgicas se han basado en el empleo de extractos alergénicos provenientes de fuentes naturales. Aunque se han conseguido grandes avances en la calidad y estandarización de los extractos alergénicos, éstos siguen siendo aún una fuente heterogénea de macromoléculas y su composición y cantidad de proteínas pueden variar notablemente entre los diferentes lotes. Así, algunos alérgenos mayoritarios pueden estar escasamente representados y algunos minoritarios pueden encontrarse en exceso, con las repercusiones diagnósticas y terapéuticas que ello conlleva. Por otra parte, los extractos naturales permiten únicamente identificar la fuente alergénica, pero no las moléculas concretas a las que un paciente se encuentra sensibilizado.
Actualmente los extractos naturales están siendo sustituidos por extractos recombinantes, en los que cada componente puede ser producido, tras la clonación de los mismos. Sin embargo no todos los componentes de cada extracto alergénico se han podido clonar y lo más importante es que no siempre los alérgenos recombinantes mimetizan el modo de acción de los naturales.
En los últimos 18 años se han descrito y caracterizado 13 alérgenos del polen de olivo, denominados de Ole e1a Ole e13. La respuesta IgE frente al polen de olivo es extremadamente compleja, debido a las diferentes frecuencias de sensibilización (o prevalencias de IgE) entre los alérgenos caracterizados, a la cosensibilización en un mismo individuo a los diferentes alérgenos y al impacto que ciertos factores ambientales tienen en la prevalencia de IgE. A modo de ejemplo, indicaremos que, algunos pacientes como por ejemplo los sensibilizados al Ole e2, presentan los cuadros más severos de asma. Por otra parte, los pacientes sensibilizados a Ole e7 y Ole e9 son menos tolerantes a las dosis habituales de ¡nmunoterapla con extractos de polen de olivo.
Debido a ello, resulta por tanto imprescindible el conocimiento de nuevos avances en el diagnóstico y tratamiento del asma en individuos con EAPO, lo que puede tener grandes repercusiones en su correcto diagnóstico, así como en la prevención y promoción de la salud de los ciudadanos.
Dada la complejidad y heterogeneidad del asma y las EAs, se hace necesario estudiar las mismas desde una aproximación global a distintos niveles; a nivel molecular, nivel celular y nivel fisiológico, acoplados a un análisis blolnformátlco y computaclonal que Identifique nuevos genes funcionales, elementos reguladores y metabolitos, en el contexto de redes moleculares que definen procesos biológicos asociados con sistemas fisiológicos.
Esta aproximación global, también conocida como biología de sistemas, permite modelar la multitud de conexiones e interdependencias entre la predisposición genética, perturbaciones ambientales e intermediarios moleculares y reguladores, que en última instancia conducen a la gran diversidad de fenotipos y diferentes respuestas a los tratamientos entre los Individuos alérgicos.
Desde la finalización del proyecto genoma humano, la tecnología de microarrays ha hecho posible el registro del genotipo en millones de variantes genéticas de forma simultánea. Estas variaciones a lo largo del genoma, como polimorfismos de un único nucleótido (SNPs), ha posibilitado el establecimiento de asociaciones estadísticas entre genotipo y fenotipo (genome-wide association studies, GWAS), que identifican loci genéticos y factores de riesgo para el asma y las EAs. La mayoría de los GWAS han sido realizados en asma, donde se ha establecido una asociación con el locus 17q21. Este locus comprende 4 genes (ORMDL3, GSDMB, ZPBP2, y IKZF3), relacionados con la homeostasis del calcio en el retículo y con el plegamiento proteico. Otras asociaciones han relacionado el asma con genes que participan en el reclutamiento de células inflamatorias (TSLP, IL33, IL1 RL), activación y diferenciación de células T (genes HLA, IL2RB), proteasas extracelulares (ADAM33, DPP10) o proteínas desconocidas (PHF1 1 ) . Pero algunos de estos estudios desembocan en resultados contradictorios; por ejemplo ADAM33 se encuentra asociado al asma y a la hlperreactlvldad bronquial en algunas poblaciones pero no en otras . Estas discrepancias pueden deberse a que hasta ahora se ha tratado de Identificar un “perfil genético universal” común a todos los pacientes alérgicos, para lo que se ha estado estudiando una población demasiado heterogénea de Individuos. Se necesitan, por tanto, estudios de procesos clínicos y poblacionales mucho más concretos.
Existe, por tanto, la necesidad de disponer de biomarcadores que permitan el diagnóstico de EAPO y de susceptibilidad para desarrollar esta enfermedad en la población general, así como su clasificación o estratificación en los diferentes estadios o niveles determinados, el pronóstico de la evolución de la enfermedad y la evaluación de su respuesta a un determinado tratamiento, mediante un método sencillo, eficaz y no invasivo.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Correlación entre las variantes significativas de interacciones SNPs siguiendo un modelo codominante.
Fig. 2. Correlación entre las variantes significativas de interacciones SNPs siguiendo un modelo dominante.
Fig. 3. Correlación entre las variantes significativas de interacciones SNPs siguiendo un modelo recesivo.
Fig. 4. Representación Manhattan. Seleccionde los marcadores mas significativos en cromosoma humano.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado una herramienta para el diagnóstico temprano, estratificación seguimiento, pronostico, prevención y/o tratamiento de individuos afectados o con riesgo a desarrollar enfermedades alérgicas relacionadas con el polen de olivo, de ahora en adelante EAPO.
La presente invención es el resultado de la búsqueda de nuevos polimorfismos de un único nucleótido asociados con EAPO y evaluados mediantes GWAS, lo cual ha permitido la identificación de biomarcadores y dianas efectivas para esta enfermedad que permiten: 1 ) discriminar entre individuos sanos, pacientes diagnosticados de EAPO y personas con alto riesgo de desarrollar EAPO, 2) estratificar clínicamente los individuos en base a parámetros clínicos y biomarcadores específicos en muestras biológicas complejas, 3) facilitar el seguimiento clínico de estos individuos, permitiendo pronosticar clínicamente a individuos diagnosticados de EAPO y contribuyendo al desarrollo de una medicina personalizada; 4) prevenir la aparición de EAPO en individuos previamente identificados como susceptibles o en riesgo de padecer la enfermedad y 5) tratar a los individuos diagnosticados con EAPO.
Como parte de la divulgación, los inventores proponen la evaluación estandarizada de un panel de biomarcadores, en este caso relacionados con EAPO, en muestras biológicas complejas de individuos, p.ej. muestras sanguíneas. Esta información permitiría, por ejemplo, el desarrollo de un chip o array para la estratificación de individuos en diversos grupos de riesgo y la definición de sus necesidades específicas de seguimiento clínico y manejo terapéutico.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de, al menos, uno de los genes SCP2, CTNND2 y/o ZNF252P o cualquiera de sus combinaciones, para diagnosticar, clasificar, predecir o pronosticar si un individuo ha desarrollado o es susceptible de desarrollar EAPO.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término "SCP2", (también llamado en literatura NLTP, SCPX, SCP-2, SCP-X, NSL-TP y SCP-CHI) se refiere al gen Sterol Carrier Protein 2 [Homo sapiens ], gen que codifica dos proteínas: la proteína portadora de esteral X (SCPx) y la proteína transportadora de esteral 2 ( SCP2 ), como resultado del inicio de la transcripción de 2 promotores regulados independientemente. La transcripción iniciada desde el promotor proximal codifica la proteína SCPx más larga, y la transcripción iniciada desde el promotor distal codifica la proteína SCP2 más corta, con las 2 proteínas compartiendo un extremo C-terminal común. La evidencia sugiere que la proteína SCPx es una tiolasa asociada con el peraxisoma que está involucrada en la oxidación de los ácidos grasos de cadena ramificada, mientras que la proteína SCP2 se cree que es una proteína de transferencia lipídica intracelular. Este gen está altamente expresado en órganos involucrados en el metabolismo de los lípidos. El splicing alternativo de este gen produce múltiples variantes de transcripción, algunas codifican diferentes isoformas.
En el contexto de la presente invención,“SCP2” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína“SCP2” y “SCPx”, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 ,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 . en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína SCP2. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican SCP2 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO:2.
Gene ID: 6342
Localización del gen: 1 p32.3
SEQ ID NO: 1
GCGCCCCACCCCGCCCCCTCCTCCTGCCCCTACGCACGCGCACTCTCACGCGCCTGT
GTTGCCGCCCGCGGCCCTGGCTTCGGGCTTCAGGGAGCTCTGGTGCAGTCTCCGCCT
GTCAGTGCCGGCAGTCGTCCGCGGCGCCCGCCCCGGTCCCGCACTGGTGCAGCCATG
TCCTCTTCCCCGTGGGAGCCTGCGACCCTGCGCCGGGTGTTCGTGGTGGGGGTTGGC
AT GACCAAGTTTGT GAAGCCT GGAGCTGAGAATT CAAGAGACT ACCCTGACTTGGCAGA
AG AAG C AG G C AAG AAG G CTTT AG CTG ATG CAC AG AT CCCTT ATT CAG C AGT G G ACC AG
GCATGTGTTGGCTATGTTTTTGGTGACTCTACCTGTGGGCAGAGGGCTATCTATCACAG
TTTGGGAATGACTGGAATTCCTATAATCAATGTCAACAATAACTGTGCTACTGGTTCTAC
TGCTTTGTTTATGGCCCGCCAGCTGATTCAGGGTGGTGTGGCAGAATGTGTCTTGGCTC
TTGGGTTT GAGAAGAT GAGT AAGGGAAGCCTTGGAAT AAAATTTT CAGATAGAACCATT C
CCACTGATAAGCATGTTGACCTCCTGATCAATAAGTATGGATTGTCTGCTCACCCAGTTG
CTCCT C AG ATGTTT GGGTATGCTG G AAAAG AAC AT AT G G AAAAAT AT GG AACAAAAATT G
AACACTTTGCAAAAATTGGATGGAAAAATCATAAACATTCAGTTAATAACCCGTATTCCCA
GTTCCAAGAT GAAT ACAGTTT AGAT G AAGT GATGGCAT CT AAAG AAGTTTTT GATTTTTT G
ACTATCTTACAATGTTGTCCCACTTCAGATGGTGCTGCAGCAGCAATTTTGGCCAGTGAA
GCATTTGTACAGAAGTATGGCCTGCAATCCAAAGCTGTGGAAATTTTGGCACAAGAAAT
G AT G ACT G ATTT G CC AAG CT CGTTT G AAG AAAAAAG C ATT ATT AAAAT G GTTG G CTTT G A
T AT GAGT AAAGAAG CTGCAAGAAAATGCT AT GAGAAAT CTGGCCT G ACACCAAAT GAT AT
T G ACGT AAT AG AACTT CACGATTGCTTTT CT ACCAACGAACT CCTT ACTT AT G AAGCACT
GGGACTCTGTCCAGAAGGACAAGGTGCAACGCTGGTTGATAGAGGAGATAATACATAT
GGAGGAAAGTGGGTCATAAATCCTAGTGGTGGACTGATTTCAAAGGGACACCCACTAG
GCGCTACAGGTCTTGCTCAGTGTGCAGAACTCTGCTGGCAGCTGAGAGGGGAAGCCG
GAAAGAGGCAAGTTCCTGGTGCAAAGGTGGCTCTGCAGCATAATTTAGGCATTGGAGG
AGCTGTGGTTGTAACACTCTACAAGATGGGTTTTCCGGAAGCCGCCAGTTCTTTTAGAA CT CAT CAAATT G AAG CTGTT CCAACC AG CTCTG C AAG TG ATG G ATTT AAG G C AAAT CTTG TTTTT AAGG AG ATT GAGAAG AAACTT G AAG AGG AAGGGG AACAGTTTGTG AAGAAAAT C GGTGGTATTTTTGCCTTCAAGGTGAAAGATGGCCCTGGGGGTAAAGAGGCCACCTGGG TGGTGGATGTGAAGAATGGCAAAGGATCAGTGCTTCCTAACTCAGATAAGAAGGCTGAC T G C AC AAT CAC AAT G G CT G ACT C AG ACTT CCTG G CTTT AAT G ACT G GT AAAAT G AAT C CT CAGTCGGCCTTCTTTCAAGGCAAATTGAAAATCACTGGCAACATGGGTCTCGCTATGAA GTT ACAAAATCTT CAGCTTCAGCCAGGCAACGCT AAGCTCT GAAGAACTCCCTTT GGCT ACTTTT G AAAAT CAAG AT GAGAT AT AT AG AT AT AT ATCCAT ACATTTT ATTGTCAGAATTT A GACTGAAACTACACATTGGCAAATAGCGTGGGATAGATTTGTTTCTTAATGGGTGTGAC CAATCCT GTTTTT CCT ATGCTCTG GGT G AAT AG AG CCT GATGGTAT ACT ACTGCTTTGCG GAATTGCATACAACTGTGCATTACAAAGTTAATATGGTAATTATGGTCTGGGGTAAAATT G AG TTT CAG AAT AAAATT AG G AAC AGTAAAAT CC AAAG AACT ATGT AAACAAAAAAG CTT TT GTTTTGCTT ACAAAGT AT ATTT AAG GATT ATT CTGCT G AAG ATT CAGTTT AAGAGTTTT CCTTGGGAGAACTAAGTAAGAAACACAATGCCAACAGCTGGCCAGTAATTAGTGTTGTG C ACTT CAT GT CATT AAT CAATTT CT C AAT AG TT CTT AAAATT AGTG AG ATT AAAAAT CT AAA AATTTT G CATTT C AT G CTAT C AG AAAC AGTATTTT CTT CCCAAAT C AAAAT AAAAG AAAT A TG AT C AG AG CTT G AACAC AG G CTT ATTTTT AAAAT AAAAAT ATTTTT AACAT G G GTTTCCT T ATT G AAAAAT CAGT GT ATT AGTCAT AAAACACCAT CATT AAGAAT AATT G AACAAT AAAG TTT G CTTT CAG AT G C AGTTTT C AAATT AT AAT CT C ATTT CAATTT AT AACGTT CT CAGT CCT TT GTT AT AATTTT CCTTTTT CAT GTAAGTTT AATT AT CTGCATTT AT CTTTTTT CCT AGTTTT T CT AAT ACT AAT G TT ATTT CTT AAAATT CAGTG AG AT AT AG G AT AAAAT AAT G CTTT GAGA AG AAT GTTT AAT AG AAAATT AAAAT AACTTTTT CTGGCCTCTCTT
SEQ ID NO: 2
MSSSPWEPATLRRVFWGVGMTKFVKPGAENSRDYPDLAEEAGKKALADAQIPYSAVDQA
CVGYVFGDSTCGQRAIYHSLGMTGIPI INVNNNCATGSTALFMARQLIQGGVAECVLALGFE
KMSKGSLGIKFSDRTIPTDKHVDLLINKYGLSAHPVAPQMFGYAGKEHMEKYGTKIEHFAKIG
WKNHKHSVNNPYSQFQDEYSLDEVMASKEVFDFLTILQCCPTSDGAAAAILASEAFVQKYG
LQSKAVEILAQEMMTDLPSSFEEKSI IKMVGFDMSKEAARKCYEKSGLTPNDIDVIELHDCFS
TNELLTYEALGLCPEGQGATLVDRGDNTYGGKWVINPSGGLISKGHPLGATGLAQCAELCW
QLRGEAGKRQVPGAKVALQHNLGIGGAVWTLYKMGFPEAASSFRTHQIEAVPTSSASDGF
KANLVFKEIEKKLEEEGEQFVKKIGGIFAFKVKDGPGGKEATWVVDVKNGKGSVLPNSDKKA
DCTITMADSDFLALMTGKMNPQSAFFQGKLKITGNMGLAMKLQNLQLQPGNAKL
Asimismo, a no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término "CTNND2", (también llamado en literatura GT24, NPRAP, CTNND-2 y GT-24) se refiere al gen Catenin Delta 2 [homo sapiens ], gen que codifica una proteína asociada a la unión adhesiva de la superfamilia armadillo / beta-catenina y está implicada en el desarrollo del cerebro y los ojos y la formación de cáncer. La proteína codificada por este gen promueve la ruptura de la unión adherentes a base de E-cadherina para favorecer la propagación de las células tras la estimulación por el factor de crecimiento de hepatocitos. Este gen reside en una región del brazo corto del cromosoma 5. El splicing alternativo resulta en múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas.
En el contexto de la presente invención,“CTNND2" se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína ''CTNND2’’, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 3,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1 . en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CTNND2. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican CTNND2 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO:4.
Gene ID: 1501
Localización del gen: 5p15.2
SEQ ID NO: 3
GCGTCGGGAGCCGCCTCTCGCCCGCGGCGCTCGCCCCTGCCGCCCGCCAGCATCCCT
TGTCCCGCGGCCGCGCTCAGACAACAAAAGCGGAAGATGCTGCAGTTGGGCAAGGTCA
GGACCTTGCCCTGAAGCCGGGCGGCGCCGCGCACGCCTCTTCCCGGACTGAGGAGCT
GTCGCCGGCGGAGGGTGCATGTTTGCGAGGAAGCCGCCGGGCGCCGCGCCTTTGGG
AGCT AT G CCTGTTCCAGACCAGCCTT CAT CAGCCT CAG AGAAG ACGAGTT CCCT GAGCC
CCGGCTTAAACACCTCCAACGGGGATGGCTCTGAAACAGAAACCACCTCTGCCATCCTC
GCCTCAGTCAAAGAACAGGAATTACAGTTTGAAAGGCTGACCCGAGAGCTGGAGGCTG AACGGCAGATCGTAGCCAGCCAGCTGGAGCGATGCAAGCTCGGATCCGAGACTGGCA
GCAT GAGCAGCAT GAGTT CAGCAGAAGAGCAGTTT CAGT GGCAGTCACAAGATGGTCA
AAAAGATATCGAAGATGAGCTTACAACAGGTCTCGAGCTGGTGGACTCCTGTATTAGGT
CACT ACAGG AAT CAGG AAT ACTT G ACCCACAGG ATT ATT CT ACAG GT G AAAG GCCCAGC
CTGCTCTCCCAGAGTGCACTTCAGCTCAATTCCAAACCTGAAGGGTCTTTCCAGTATCC
GGCCAGCTACCATAGCAACCAGACCCTGGCCCTGGGGGAAACCACCCCTTCACAGCTC
CCGGCCCGAGGCACACAAGCCCGAGCTACGGGCCAGAGCTTCAGCCAGCTGGTTCCC
GAGCCTCATACAGCAGCCAGCATGGGCACCTGGGCCCAGAGTTGCGGGCCCTGCAGT
CCCCAGAACACCACATAGATCCCATCTATGAAGACCGCGTCTATCAGAAGCCCCCTATG
AGGAGTCTCAGCCAGAGCCAGGGGGACCCTCTGCCGCCAGCACACACCGGCACCTAC
CGCACGAGCACAGCCCCATCTTCCCCTGGTGTCGACTCCGTCCCCTTGCAGCGCACAG
GCAGCCAGCACGGCCCACAGAATGCCGCCGCGGCCACCTTCCAGAGGGCCAGCTATG
CCGCCGGCCCAGCCTCCAATTACGCGGACCCCTACCGACAGCTGCAGTATTGTCCCTC
TGTTGAGTCTCCATACAGCAAATCCGGCCCTGCTCTCCCGCCTGAAGGCACCTTGGCC
AGGTCCCCGTCCATTGATAGCATTCAGAAAGATCCCAGAGAATTTGGATGGAGAGACCC
GGAACTGCCGGAAGTGATTCAGATGTTGCAGCACCAGTTTCCCTCGGTCCAGTCTAACG
CGGCAGCCTACTTGCAACACCTCTGTTTTGGAGACAACAAAATTAAAGCCGAGATAAGG
AGACAAGGAGGCATCCAGCTCCTGGTGGACCTGTTGGATCATCGGATGACCGAAGTCC
ACCGTAGTGCCTGTGGAGCTCTGAGAAACCTGGTGTATGGGAAGGCCAACGATGATAA
CAAAATTGCCCTGAAAAACTGTGGTGGCATCCCAGCACTGGTGAGGTTACTCCGCAAGA
CGACTGACCTGGAGATCCGGGAGCTGGTCACAGGAGTCCTTTGGAACCTCTCCTCATG
CGATGCACTCAAAATGCCAATCATCCAGGATGCCCTAGCAGTACTGACCAACGCGGTGA
TTATCCCCCACTCAGGCTGGGAAAATTCGCCTCTTCAGGATGATCGGAAAATACAGCTG
CATTCATCACAGGTGCTGCGTAACGCCACCGGGTGCCTAAGGAATGTTAGTTCGGCCG
GAGAGGAGGCCCGCAGAAGGATGAGAGAGTGTGATGGGCTTACGGATGCCTTGCTGTA
CGTGATCCAGTCTGCGCTGGGGAGCAGTGAGATCGATAGCAAGACCGTTGAAAACTGT
GTGTGCATTTTAAGGAACCTCTCGTACCGGCTGGCGGCAGAAACGTCTCAGGGACAGC
ACATGGGCACGGACGAGCTGGACGGGCTACTCTGTGGCGAGGCCAATGGCAAGGATG
CTGAGAGCTCTGGGTGCTGGGGCAAGAAGAAGAAGAAAAAGAAATCCCAAGATCAGTG
GGATGGAGTAGGACCTCTTCCAGACTGTGCTGAACCACCAAAAGGGATCCAGATGCTG
TGGCACCCAT CAAT AGTCAAACCCT ACCT CACACTGCT CT CT G AGTGCT CAAATCCAG A
CACGCTGGAAGGGGCGGCAGGCGCCCTGCAGAACTTGGCTGCAGGGAGCTGGAAGTG
GTCAGTATATATCCGAGCCGCTGTCCGAAAAGAGAAAGGCCTGCCCATCCTCGTGGAG
CTGCTCCGAATAGACAATGACCGTGTGGTGTGCGCGGTGGCCACTGCGCTGCGGAACA
TGGCCTTGGACGTCAGAAATAAGGAGCTCATCGGCAAATACGCCATGCGAGACCTAGT
CCACAGGCTTCCAGGAGGGAACAACAGCAACAACACTGCAAGCAAGGCCATGTCGGAT
G ACACAGT GACAG CTGTCTGCTGCACACTGCACG AAGT GATT ACCAAGAACATGGAG AA CGCCAAGGCCTTACGGGATGCCGGTGGCATCGAGAAGTTGGTCGGCATCTCCAAAAGC AAAG G AG AT AAAC ACT CT CC AAAAGT G GTCAAG G CTG C AT CT CAG G TCCT CAAC AG CAT GTGGCAGTACCGAGATCTGAGGAGTCTCTACAAAAAGGATGGATGGTCACAATACCACT TTGTAGCCTCGTCTTCAACCATCGAGAGGGACCGGCAAAGGCCCTACTCCTCCTCCCG CACGCCCTCCATCTCCCCTGTGCGCGTGTCTCCCAACAACCGCTCAGCAAGTGCCCCA GCTTCACCTCGGGAAATGATCAGCCTCAAAGAAAGGAAAACAGACTACGAGTGCACCG GCAGCAACGCCACCTACCACGGAGCTAAAGGCGAACACACTTCCAGGAAAGATGCCAT G ACAG CT CAAAACACTGGAATTT CAACTTT GTAT AG G AATT CTT ATGGT G CGCCCGCT G A AGACATCAAACACAACCAGGTTTCAGCACAGCCAGTCCCACAGGAGCCCAGCAGAAAA G ATT ACG AGACCT ACCAGCCATTT CAG AATT CCACAAG AAATT ACGAT GAGT CCTT CTT C GAGGACCAGGTCCACCATCGCCCTCCCGCCAGCGAGTACACCATGCACCTGGGTCTCA AGTCCACCGGCAACT ACGTT GACTT CT ACT CAGCTGCCCGT CCCT ACAGT G AACT G AAC TATGAAACGAGCCACTACCCGGCCTCCCCCGACTCCTGGGTGTGAGGAGCAGGGCACA GGCGCTCCGGGAACAGTGCATGTGCATGCATACCACAAGACATTTCTTTCTGTTTTGTTT TTTT CTCCTG CAAATTT AGTTTGTT AAAGCCT GTT CCAT AGGAAG GCT GTG AT AACCAGT AAG G AAAT ATT AAG AG CT ATTTT AG AAAG CT AAAT G AAT CG C AAGTT AACTT G G AAAT C A GTAGAAAGCTAAAGTGATCCTAAATATGACAGTGGGCAGCACCTTTCTAGCGTGAGCTG T AG AGT AACG AG AAGT G CTTT AT ACT G AACGT G GTT G AT G G G AG G AG AG AC G AG G CATT CGGGCCGGTGGGGCGTAAGGGTTATCGTTAAGCACAAGACACAGAATAGTTTACACAC TGTGTGGGGGACGGCTTCTCACGCTTTGTTTACTCTCTTCATCCGTTGTGACTCTAGGC TTCAGGTTGCATTGGGGTTCCTCTGTACAGCAAGATGTTTCTTGCCTTTTGTTAATGCAT TGTTGT AAAGTATTT GAT GT ACATT ACAGATT AAAGAAG AAAAGCGCGTT GTGTAT ATT AC ACCAATGCCGCCGTGTTTCCTCATCTATGGTTCTAAATATTGCTTCAATTTCAAACTTTTG AAAG ATGTAT GG ATTTCCAGTTTTT CTTT ACTTT CT CCCAGT ATGTTTT AACAAAAAAAAA AAAAAGCAGG AAAAAAGGAAT ATTT AGCAGT ATT GTTCGTTCT G AT AT GTG AATTTGTTT GT G ACAACT AAACAAGGCATT CAGCAGTTT CT G ACAATT AACAT ACAT CATTCCACACT C CTT GT CAACAAAGTGCTTTTTCACTGCCT AAAATTTT AGATGT AG AT ATTT G AAAT AG ATT TTTT CATTT AT ACCAGTTTT CTTT AT G AT G AT ACAGTGTT AAAAGAAAAT AAATT ACAATT G ATCT GTC AT C CAT ATTT G CT AAG AAT GTCT ATTT CCAAG AAC CTATATCTT AC AAAAT ACA CATT CTT G CTTGT GTGTCTGTGTGTGTGGGTGTATGT ATGTCCACGTACT AGAAAAATT A CCTGTGT G AG ATTTT ATTTT G ACAGAAGCT ATTT CATTTGCT GTT CAT CTTGT ACAAACTT T GTTTTT G GTTTTTTAGTAT AAAT GTACAT CAGTTT GTT CCTTTT GTACT GTATCT ATT CTT CT G ACCAT CT AGT G ACT CAGG AT ATT AGG CCAGTT G AAGT GG AGTT AT AG G ATTTT CACA C ATT CAC G C AT ACTT G G AT AT CAACCCT CTCT AC AG G TC CGTTT C CTT AC ACATTTT AT C CCCTCAG AACACG AT AAACCAT GGCCAATT CAGTTT CACTTT G GGGCCAATT ACTT GAA GT ATCCACAG AAAATGTAAACTGCT CGCCTT ATT CCCCCAAACTTTTT GTT CAT GTGGCA G G G AG C AGT AC ACAACT AT G G AAT AG ATT ATT AAAACT G AACTT G AAG CT AACGTT AG AA TAGTGGTTAACAGAGCTAAGAAATAAGGCTAACCATCGAAAAGAACATGGGCCGCGGGT AAACTAGCTTTGCTCTTTAGATGCAAGTGGCTGAGGCCAATAGGTGCCTAGTAAATGTTA ACT GTT CTT G GAAAAAAT AAAAACAT CAGTAACAAAA
SEQ ID NO:4
MRSLSQSQGDPLPPAHTGTYRTSTAPSSPGVDSVPLQRTGSQHGPQNAAAATFQRASYAA
GPASNYADPYRQLQYCPSVESPYSKSGPALPPEGTLARSPSIDSIQKDPREFGWRDPELPE
VIQMLQHQFPSVQSNAAAYLQHLCFGDNKIKAEIRRQGGIQLLVDLLDHRMTEVHRSACGAL
RNLVYGKANDDNKIALKNCGGIPALVRLLRKTTDLEIRELVTGVLWNLSSCDALKMPIIQDAL
AVLTNAVIIPHSGWENSPLQDDRKIQLHSSQVLRNATGCLRNVSSAGEEARRRMRECDGLT
DALLYVIQSALGSSEIDSKTVENCVCILRNLSYRLAAETSQGQHMGTDELDGLLCGEANGKD
AESSGCWGKKKKKKKSQDQWDGVGPLPDCAEPPKGIQMLWHPSIVKPYLTLLSECSNPDT
LEGAAGALQNLAAGSWKWSVYIRAAVRKEKGLPILVELLRIDNDRVVCAVATALRNMALDVR
NKELIGKYAMRDLVHRLPGGNNSNNTASKAMSDDTVTAVCCTLHEVITKNMENAKALRDAG
GIEKLVGISKSKGDKHSPKVVKAASQVLNSMWQYRDLRSLYKKDGWSQYHFVASSSTIERD
RQRPYSSSRTPSISPVRVSPNNRSASAPASPREMISLKERKTDYECTGSNATYHGAKGEHT
SRKDAMTAQNTGISTLYRNSYGAPAEDIKHNQVSAQPVPQEPSRKDYETYQPFQNSTRNY
DESFFEDQVHHRPPASEYTMHLGLKSTGNYVDFYSAARPYSELNYETSHYPASPDSWV
Igualmente, a no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término "ZNF252P, (también llamado en literatura ZNF252, ZNF-252, ZNF-252P y ZNF252-P) se refiere al gen Zinc Finger Protein 252 Pseudogene [homo sapiens ], gen que pertenece a la familia de proteínas Zinc Finger o dedo de zinc (ZnF), una familia amplia y diversa de proteínas que comprenden un dominio“dedo zinc”, referido a las estructuras proteicas secundarias (hélice a y hoja b) que se mantienen juntas por un ion Zn, estos dominios que típicamente sirven para interaccionar con ADN, ARN, proteínas o moléculas pequeñas.
En el contexto de la presente invención,“ZNF252P' se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína “ZNF252P”, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 5,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 5. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína ZNF252P. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican ZNF252P se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO:6.
Gene ID: 286101
Localización del gen: 8q24.3
SEQ ID NO: 5
AGGCATTTCCGGCCCAGGGGGCTTGGCTCCCCGCGGCACGGGATTTAGCGTTCGCGC TCCTTCCCTTCCCGTGGTCGAGCCGAGTCCTGACCTGAGGGCTGCATCAAGATCTTGTC ATTCCACATCGTGGTTTCCTTTGAGGATGTGGCTGTACCCCTCTCCCAGGAGGAGTGGG ACTGTCTGATCCCTGCTCAGAGGGGCCTCTACAAGGATGTGATGATGGGGACCTATGG GAACCTACTCTCATTAGTAGGTGAATGGTTAAGCAAACTGTGGTACATCCATACCATGG G ATAC G ACT C AAC AAT CAAAAG G AACT G CCCAG ACTT C ACC ACG AT G CAAT AT AT G CAT G ACTT CAAG CTTCCAAACCT G ATGTCAT CT CCAGG CT GG AG CG GGGG G ACGAACCAT A G ACCCCT C ACAT CCT G AG AACT CAG G G G AG CTG G AG CTG G AG G CAC AAG AG AG AAG G CTGT G ATT CT AGGATT G AAAAAGAGG AAAT GATTCCAAAG CAGG ACATTT CT G AAG AATT G G AAT C CCAG AG AG C AAAAT CAG AAG AT C ATGT AAG G AAT ATTTTT AAG G AAACT G AAG AG AT G AG T AAAACT G AG G G AAAGTT AG AG AATT G CTG G AG AAAAT AT G CAGTAG AAG G A GTT AAG AACT CATT CT CCCAGAAG AGCAATTTCAG AG AAATT ACCAT G AG GT ATGT G AAA ACCCT CTCT AG AG AG AAT G G C CAG AAGTT CAAT G CTGTTG GAG AAAACT G CATT ACAGA CT CAAATCCTGCCAAACAT CTT AGAGG GT CT AG AG AGGAGAGTCTCCATCCAAGTGT GT CAAGTGTAGAAAACTTGCAACAACAT GAG G ACCT CATT AACCT CCAGAGTTT CCAATT AG G AG AAAG AGCCT AT CAG ACAG AT GTGTT AGT GAAAGTGCCCAG ACAG AGCT CAGTT CTT AGTG AG AAT CAG AG G AT GAAT AATCCAG AG AG AT GGTTT G AG AGTACT GGGTGTG G AAA AACTT ACAAT C AG AAC AG AG CTTTT AACC AG CACC AG AG ATTT CAT AG T G G AG AG AAG A CCT AT G AGCACAAT GAAT GTGG AAAAGCTTT CAGTTGG CCCT CT AT CCT CAGTAAACAT C AGAG AAT CCACACTGGT AAGAAACT CT ACACATGT GAG G ATTGTGGCAAAT CTTT CAGT GTT CACT CAT ACTTTATT CAGCATT GTAAAATTCACACT AGAGAAAAACCCT AT GAGT GTA TT AAATGT G G G AAAG CTTTT AGTACACATT CAT CTT AT GTT CAAC AT CT AAAAATT CAT AC AGG AG AG AAACAT CAT GAGT GTAAT CAGT GTGGGAAAG CCTTT AGTCAT AGCT CT AAT C T AATT CAT CAT CAGAGAATT CAT AGT GG AG AGAAACCTTACAAGTGCAAAG AATGTGGGA AAG CCTT CAACAG ACAAT CAAACCTT ATT CAGCAT CAG AG AATT CATT CT GG AG AGAAAC CTT AT G ACT GTAAG G AGTGTGGCAAAGCCTT CAGTACACAATT ATTT CT CATT CAGCAT C AGAGAATTCATACAGGAGAAAAGCCCTATGAATGTAATGAATGTGCAAAATCCTTTAGCC T G AACCGAACT CTT ACT GTCCAT CAG AG AATTCACACTGG 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AT AAG C AAAAGTTT GTCAAG G AAT AAG G T G AG T CTTTGT GT AG ATT AAAAT AG TT G AGACCTTGCT AAAAAGTCAGAT AACACT GT AATCCACCT CCAGGTTTCCAAG AGTT A AGACGCTGCCAGCAAGGAGCTTGCAGTCTTGTAGCTGGCCCAATATATCCAACTAATTC AAAAT G G G AAATTGTACATTTT ACTT AAACAG GATTT G GTAG AT GGGTCTTCT AG AT AT G TTGTCATGAAGAAAAATCAGGAAAATGTCCAAGGGTGGGAGCCTGTGGCTTATGGCTTC ACTT ACCCAT CACAGAT AGCT AT GTT ACACT GCAAG AACAG AGTT CATGG CTTTT CCT G A GGTGG CTGGAAACCTT AAT CTCCT GAAGTT AAGT CAAAACTT AAATGTCAATT CACCCAG CTCTCTTGCCTGCAGGCTGATCCAGGGACTTAGAGCTTGTTACCCAGTTACAACTTCTT CT AG AG AAG AACTTTT AAG AAG G AAG CAAAAAG AAATT C AGTTT C CCCCAAG G ATCTCTT CTTTGAGGTTCCATCAAGAGATGACAAAAGGAGGCTGGGCGCGGTGTCTCACACCTGT AATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAAGTGGGCAGATCACGAGGTCAAGAGATCAAGACC ATCCTGGCCAACATGGTGAAACCACATTTCTACAAAATGCAAAAATTAGCTGGGCATGG TGGTGCACGCCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAAC CCAGGAGGCGGAGGTAGCAGTGAGCCAAGATTGCACCACTGCATTCCAGCATGGCCAC AAAGCAAG ACT CCAAAAAAT AT AT AT AT AT AT GACAAAAG G GTT AGG AAG CTTTT CCT CT G AG GCCCACG ATT ACACAACCAAAT CAG AAAAT AAT ATTTTTTTTGTTTT AAACCT GTTT A CAT AAG AT GG AG GT GTTT ACTT AACT AAG AACCT CG GT ATTT ACT CAAATCCG GTTTTGG GTTTT ATGGCT AAAACATTT CT CCAGATT AACCTT AT CAGTTTGGAAT ATGTTTTT ATTTT C C ATT AAAT ATTT CAT CCAAAT CAT ACT G AATTTT ATTT AT C AT G G CTTTT AAT GTTCTCTAT TCAAGTCAAATTTCTGTTTCCTAATTACTTGGCTTGGTGATGGCATTAATATTGGTTGGG AGCT AG AT GGTCTCTG CTCT ATTT GAT GATTGGCAT AG AGCAAT CAT ACACTTGGT ACTT CCTAGCATTTTTTTTTGAGACAGTATCATGCTGTATCATGTTGCACAGGGTGGAGTGCAG TGGTGCAGTCATAGCTCACTGTAACCTTGAACTCCTGGGCTCAAGTGATTCCCCTGCCT CAACTTCATGAGTAGCAGGGACTACAGCTGTGTACCACCACACCGGCCTCTCCTGGCTT CTTAACCACTT ACATT AAAATTGAGAGGAGAAAGGCATTTT CAGTTT CTTTAGTT AAT AAA AAGAAGCCATTTCTGGAGGAGTTTTATGCCTGTACCAGCAGAGGTTCAGCCTTCCAGGA ATCT CAT CAT G ATCC AT ACT G CT G AC AC AG G CCTTTGT C ACCT G AAG C ATT CTT AAAAT A AGG AG ACT G ACATT AAACAG G ACAATTGTG AACT CCACTTT GT AAG CAT CAT ACAT AT CT T ACAACT CATT CT G AAG ACTCCTTTATT CTTGCT CTT CCCAG AG AGCT ACTGT GTTT AGT C AT G CT CACT G CACT C AC AAG AG AAAAAG AGTAAG TG G C AT ATTT G CAG GTGTT G ATG G TT AC AAG AG CATTTTT ACTTTTT CCT CCATGTTT GTTCTG CAG CATTTCCATT G AT G C AT G CTATTGTAGACTTCTTAGGTTGACCTTGGCCTTGACCTCCACCACTAGCTCATGACCCAA AACT G AAG AT GTG C AT C AG AAAG G G ACAG ATTT G GTCTTT CTG CTGTAAAAG AT ATT CT G CCTTAGTGCCTGCTAATTTGTTGTGCATAGTCCTGTGCTGCCAATCTTCCCCACCAATTG TTAAGGTTAATGTGTGTTTTATATGTGTATTCACAAACATTAAAATGTAATCAGTGGATTC CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID N0:6
MIPKQDISEELESQRAKSEDHVRNIFKETEEMSKTEGKLENCWRKYAVEGVKNSFSQKSNF
REITMRYVKTLSRENGQKFNAVGENCITDSNPAKHLRGSREESLHPSVSSVENLQQHEDLIN
LQSFQLGERAYQTDVLVKVPRQSSVLSENQRMNNPERWFESTGCGKTYNQNRAFNQHQR
FHSGEKTYEHNECGKAFSWPSILSKHQRIHTGKKLYTCEDCGKSFSVHSYFIQHCKIHTREK
PYECIKCGKAFSTHSSYVQHLKIHTGEKHHECNQCGKAFSHSSNLIHHQRIHSGEKPYKCKE
CGKAFNRQSNLIQHQRIHSGEKPYDCKECGKAFSTQLFLIQHQRIHTGEKPYECNECAKSFS LNRTLTVHQRIHTGEKPYRCNECGKSFSQCSQVIQHKRIHTGEKPYICNECGKSFGARLSLI
QHQRIHTGEKPYGCREKPYECSECGKAFSQSFNLIHHQRTHNGEKSYECNECDKAFSLLSS
LVQHQRIHNGDKPYECHKCGKAFSQGSHLIQHQRSHIGEKPYECNECGKTFGQISTLIKHER
THNGEKPYECSDCGKAFSQSAHLIHHQRIHTGENPYECSECGKAFNVCSSLIQHHRIHTGE
KPYECSDCGKAFSQHSQFIQHQRIHTGEKPYMCNECEKSFSACLSLIQHKRIHTGEKPYVCA
KCGKSF
Más prefriblemente se refiere al uso de los polimorfismos rs10437066[G/A] y rs7544995[A/G] del gen SCP2, los polimorfismos rs6867416[C/T], rs6554641 [T/C] del gen CTNND2, y los polimorfismos rs7817276[G/A], >rs2272715[T/C], rs6599548[C/T] y rs3866997[A/C] del gen ZNF252P.
En esta memoria se definen los siguientes polimorfismos
>rs6867416[C/T]
ACTT GGG CATTT G AATT G AC G AAAATT GG A[C/T] AT AAAATT CTCTTCT G CC AC AT ATT AG CTA
>rs6554641 [T/C]
GGG CTTTTCCT CAATT G CAAAT G AACT AAT[T /C]T G AAT AGG CACAG AG AT GTGT AAAGG CAAC
ZNF252P
>rs7817276[G/A]
CTACAAGACTGCAAGCTCCTTGCTGGCAGC[G/A]TCTTAACTCTTGGAAACCTGGAGGTG
GATT
>rs2272715[T/C]
CTATATTGGCTCATCTTGGTGTGCCCCAAC[T/C]CTGACCTCTACTGTACCTGGTCCAGG
GACA
>rs6599548[C/T]
CAGGAAT GAGAG ACTT AGAAG AG AACGTCT[C/T]TCT AATT GGT ATTTCCCAGCAGCCAA AACA
>rs3866997[A/C]
TT CT CT G ATGTT G AACAAG G G AAG AAAG C A[A/C] ACT G AAG G CTTT AT C ACATT C ATT ACA TTC
SCP2
>rs10437066[G/A]
T ATTT CATT ATGGATTTTAGAT CT G AG ACC_T AT AAG GCAT GGTT ACAG CCAT AAT CACAA
>rs7544995[A/G]
CTTCACATAAAATGTAGAAGCCTTGCAACC_TATAGGTCCATTCACTGACTCCCCTTTGC
C
El primero es el alelo de referencia y el segundo alelo es el alternativo, es el alelo de susceptibilidad.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una secuencia sustancialmente homologa a la secuencia de los genes que contienen las variantes descritas. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos. Más preferiblemente, las variantes descritas hacen referencia al cambio o sustitución de un nucleótido de la secuencia en el genoma humano de referencia en las posiciones descritas.
El término“polimorfismo” se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico donde cada secuencia posible está presente en una proporción igual o superior a un 1 % en una población; en un caso particular, cuando dicha variación es la secuencia nucleotídica ocurre en un sólo nucleótido (A, C, T o G) se denomina SNP.
Los términos“variante alélica” o“alelo" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un polimorfismo que ocurre en un mismo locus en una misma población.
El término “variación génica” o “variante génica”, tal y como se utiliza en la presente descripción, incluye a las mutaciones, polimorfismos y variantes alélicas. Una variación o variante génica se encuentra entre individuos dentro de las poblaciones y entre las poblaciones dentro de las especies.
Existen más de 100 métodos distintos de genotipado de SNPs, siendo cualquiera aplicable en la presente invención. Por ejemplo, sin limitarnos, puede detectarse empleando desde enzimas de restricción o por secuenciación simple mediante PCR, sondas ASO e hibridación en Micromatrices de ADN o esferas. Así, por ejemplo, como métodos de amplificación de SNPs se encuentran la PCR, el método Invader, la amplificación por ADN de círculo rodante, etc. Como métodos de discriminación alélica, pueden emplearse, pero sin limitarnos, hibridación específica de alelo, ligamiento de oligonucleótidos específicos de alelo, minisecuenciación o extensión de sondas (SBE, Single Base Extensión), rotura invasiva específica de alelo (Invader), etc. Según el formato de detección, podemos citar, también sin limitarnos, el uso de sondas Taqman, de molecular beacons, scorpion, etc. Respecto a reacciones en un soporte sólido, tenemos, por ejemplo, biochips y microarrays de ADN, u otros métodos que emplean partículas, como por ejemplo, Luminex 100, BeadArray, etc. También existen métodos de detección masiva, como la pirosecuenciación, o la miniaturización.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnostico, estratificación y pronostico de la evolución de la EAPO en un individuo, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
a) determinar los polimorfismos de un solo nucleótido rs10437066[G/A] y rs7544995[A/G] del gen SCP2, los polimorfismos rs6867416[C/T], rs6554641 [T/C] del gen CTNND2, y los polimorfisomos rs7817276[G/A], >rs2272715[T/C], rs6599548[C/T] y rs3866997[A/C] del gen ZNF252P en una muestra biológica aislada, o cualquiera de sus combinaciones.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para el diagnostico, estratificacióny pronostico de la evolución de EAPO en un individuo, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende que comprende el paso (a) del primer método de la invención, y adicionalmente:
b) incluir a los individuos que presentan la variante A del rs10437066 y/o la variante G del rs7544995 del gen SCP2, la variante T del rs6867416 y/o la variante C del rs6554641 [T/C] del gen CTNND2, y/o la A del rs7817276 la variante C del rs2272715[T/C] y/o la variante T del rs6599548 y/o la variante rs3866997 del gen ZNF252P, o cualquiera de sus combinaciones, en el grupo de individuos con mayor probabilidad de desarrollar EAPO..
El término "muestra biológica" o "muestra biológica aislada”, tal como aquí se utiliza, se refiere, pero no se limita, a células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia, que sirva para llevar a cabo cualquiera de los métodos proporcionados por la presente invención. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es sangre periférica
El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" en esta memoria, es sinónimo de "paciente", y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física. Los términos "sujeto humano", "sujeto" y "paciente" se usan por tanto de manera indistinta en esta memoria descriptiva.
Una“secuencia de ácido nucleico” o“polinucleótido” puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a4- acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, 2'-0-metilcitidina, 5-carboximetilaminometil-2- tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, dihidrouridina, 2'-0-metilpseudouridina, D- galactosilqueosina, 2'-0-metilguanosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1- metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, N6- metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, beta, D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5- metoxiuridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, N-((9-beta-D-ribofuranosil-2-metiltiopurin- 6-ilo)carbamoil)treonina, N-((9-beta-D-ribofuranosil purin-6-ilo)N-metilcarbamoil)treonina, 5- metoxicarbonilmetoxiuridina, 5-carboximetoxiuridina, Wybutoxosina, Pseudouridina, Queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, N-((9- beta-D-ribofuranosilpurin-6-ilo)-carbamoil)treonina, 2'-0-metil-5-metiluridina, 2'-0- metiluridina, Wybutosina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina.
En otra realización preferida, el primer método de la invención puede comprender un paso adicional, previo al paso (a), que comprenda un pretatamiento de la muestra biologiaca compleja.
A efectos de la presente invención el término“pretratamiento”, referido a una muestra biológica compleja, incluye cualquier cambio o transformación que pueda sufrir la muestra desde que sea extraida del individuo o llegue al laboratorio hasta que tiene una forma medible con objeto de garantizar su utilidad y adecuación con respecto al análisis, al analito y a la muestra, en uno o mas etapas. Los ejemplos de esta manipulación incluye el cambio de estado físico, cambio de propiedades quimicas (salinidad, pH, potencial redox,...) cambio de concentración (por dilución o concentración), procesos de eliminación o enmascaramiento del efecto de interferentes presentes en la matriz, cambio de la matriz, adición de componentes conservantes, técnicas de extracción del analito (p.ej. extracción de ADN, ARN o proteínas) o modificaciones en la dimensión o coloración de tejidos o muestras solidas.
En una realización preferida, tanto el primer como el segundo método de la invención descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados y/o computerizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico de dispensación de líquidos en el paso (a), un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b), o la comparación computerizada en el paso (c) y/o (e).
Un“método diagnóstico" (o "método de diagnóstico") se refiere a un procedimiento donde se examina o analiza a un paciente (o a una muestra obtenida del mismo) para obtener un conocimiento diferencial de una enfermedad a través de los signos y síntomas que la caracterizan. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90 %, al menos del 95 %, al menos del 97 %, al menos del 98 % o al menos del 99 %. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0.1 , de 0.05, de 0.01 , de 0.005 o de 0.0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60 %, en al menos el 70 %, en al menos el 80 %, o en al menos el 90 % de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
Un“método pronóstico" (o "método de pronóstico") se refiere a un procedimiento donde, a partir de análisis clínicos, se identifica la enfermedad o dolencia, como la EAPO, que sufre la persona y, a partir de las experiencias con otros pacientes aquejados por la misma enfermedad o dolencia, EAPO, se predice cómo será el estado de salud del individuo en el futuro; es decir, la evolución de la enfermedad o dolencia en el tiempo. El término “pronóstico" en la presente invención también se refiere a la capacidad de detectar pacientes o sujetos asintomáticos que presentan una alta probabilidad de padecer una enfermedad o dolencia, EAPO, aun cuando en el momento del diagnóstico no presenten dichas patologías o manifestaciones evidentes de las mismas. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a pronosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente pero sin limitarse, 0,2, 0,1 , 0,05.
"Uno o más" tal como se usa también en la presente memoria descriptiva incluye uno y la especificación individualizada de cualquier número que sea más de uno, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc. "Más de uno" o "algunos" tal como se usa en la presente memoria descriptiva incluye la especificación individualizada de cualquier número que sea más de uno, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc.
USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende al menos un nucleótido con la secuencia correcta del gen SCP2, CTNND2 y/o ZNF252P, para la prevención, mejora y/o tratamiento de la EAPO.
El Individuo a tratar puede Identificarse como un individuo con mayor susceptibilidad a padecer EAPO mediante cualquiera de los métodos de la invención anteriormente descritos.
Por tanto, más preferiblemente se refiere al uso de una composición que comprende al menos un nucleótido con la secuencia correcta del gen SCP2, CTNND2 y/o ZNF252P, para la prevención, mejora y/o tratamiento de la EAPO en un individuo que ha sido identificado por el primer o segundo método de la invención.
Preferiblemente, la composición de la invención es una composición farmacéutica que comprende, además, un vector aceptable para su implementacion en terapia genica de sustitución.
El término "vector", se refiere a un sistema que ayuda en el proceso de transferencia de un gen exógeno a la célula, facilitando la entrada y biodisponibilidad intracelular del mismo, de tal modo que este pueda funcionar correctamente. En esta definición se incluyen vectores tanto virales como no virales.
Por secuencia correcta se entiende en esta invención aquella que no presenta el polimorfismo identificado como de mayor riesgo para un individuo de padecer EAPO y que se han descrito anteriormente.
El éxito de cualquier protocolo de terapia génica exige la existencia de un gen susceptible de manipulación terapéutica, un vector que facilite la entrega del material genético en las células apropiadas y un método que permita el acceso de ese vector al tejido correspondiente. El material genético utilizado puede ser ADN, ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos sintéticos o ribozimas (ARN catalíticos). Los métodos disponibles para la introducción del ADN en las células deseadas son vahados e incluyen vectores virales (adenovirus, retrovirus deficientes en replicación, virus herpes, etc) y vectores no virales (liposomas, conjugados ADN-proteína). La administración del ADN a las células somáticas se puede hacer ex vivo (el vector con ADN se introduce en las células de interés en cultivo y se administran al paciente) o in vivo (donde el ADN asociado al vector se administra directamente al individuo, empleando métodos que permitan su llegada al tejido o célula blanco). Actualmente, la mayoría de los protocolos en desarrollo utilizan vectores virales para introducir ADN en células o tejidos y se espera que una mejoría significativa en la eficiencia y la selectividad de los vectores sea clave en el futuro desarrollo y difusión de la terapia génica.
KIT O DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO Y USOS
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos y/o reactivos necesarios para cuantificar los polimorfismos de un solo nucleótido rs10437066[G/A] y rs7544995[A/G] del gen SCP2, los polimorfismos rs6867416[C/T], rs6554641 [T/C] del gen CTNND2, y los polimorfisomos rs7817276[G/A], >rs2272715[T/C], rs6599548[C/T] y rs3866997[A/C] del gen ZNF252P, de forma individual o cualquiera de sus combinaciones, a partir de una muestra biológica aislada de un individuo.
En una realización preferida, el kit o dispositivo de la invención proporciona datos suficientes para llevar a cabo el diagnostico, estratificación, seguimiento y/o pronostico de la evolución de EAPO en un individuo, de forma que estos datos permitan realizar el paso (b), (c) y/o (e) de cualquiera de los métodos de la invención detallados anteriormente.
En una realización adicional, el kit o dispositivo de la invención puede comprender instrucciones para realizar automáticamente (c) y/o (e) de cualquiera de los métodos de la invención detallados anteriormente.
En otra realización, el kit o dispositivo de la invención puede comprender las herramientas necesarias para hacer una manipulación, acondicionamiento, almacenamieto o pretratamietno de la muestra biologiaca compleja procedente del individuo de estudio, que permita un análisis instrumental que de como resultado los datos del paso (a) de cualquiera de los métodos de la invención detallados anteriormente.
AUTOMATIZACIÓN DEL MÉTODO DE LA INVENCIÓN IMPLEMENTÁNDOLO EN UN PROGRAMA DE ORDENADOR
Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Los signos numéricos relativos a los dibujos y colocados entre paréntesis en una reivindicación, son solamente para intentar aumentar la comprensión de la reivindicación, y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la protección de la reivindicación. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
EXPOSICION DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN / EJEMPLOS
Ejemplo 1. Estudio para la identificación de componentes clave para desarrollar métodos clínicos en la enfermedad alérgica al polen de olivo (EAPO).
En el presente estudio se analizó la posible asociación entre 306670 SNPs usando la comparación“CONTROL”“CASE”, con un número total de muestras de 670, siendo 135 controles y 535 casos. En dicho estudio se utilizó la plataforma estadística R , junto a librerías altamente especializadas en estudios de asociación genotípico, “genetics” y “SNPassoc".
- Número de sujetos estudiados: Número total de sujetos estudiados de 670, siendo 135 controles y 535 casos.
- Criterios de inclusión en el estudio:
A. Historia clínica compatible.
B. Tests cutáneos e IgE específica positivos al polen de olivo.
C. IgE específica positiva por lo menos a uno de los siguientes componentes del polen de olivo: Ole e 1 , Ole e 2, Ole e 7 y Ole e 9.
D. Edad entre 18-60 años.
E. Sin tratamiento previo con inmunoterapia alérgeno específica.
F. Se excluirán del estudio aquellos sujetos que no cumplan la totalidad de los requisitos anteriores.
- Número de muestras empleadas: Número total de muestras de 670, siendo
135 controles y 535 casos.
- Tipo de muestra: DNA obtenido de 15 mi de sangre periférica.
- Procedimiento de obtención y preparación de muestras: Una vez que el individuo otorgue su consentimiento informado, se obtendrán 15 mi de sangre periférica mediante venopunción periférica. Esta intervención la realizará personal cualificado del Hospital Universitario Virgen Macarena. Los viales para esta extracción están pre-codificados. Es decir, incluyen un código de barras coincidente con el código de la hoja de recogida de datos de cada individuo. Mediante este sistema de pre-codificación el personal del laboratorio nunca tiene acceso a los datos personales de los individuos incluidos en el estudio. Por tanto, se garantiza que las muestras obtenidas están anonimizadas antes de su envío al laboratorio.
Pre-procesado y control de calidad:
Para el estudio de pre-procesado y control de calidad, tanto de las muestras como de las variantes a analizar, fue basado por el artículo usando el paquete estadístico snpsStast, SNPRelate y plyr.
Tal como indican en se utilizó como umbrales óptimos para la selección de variantes aquellas con una frecuencia alélica mínimo de 0.01 y máxima de 0.95, estos umbrales permite eliminar la mayor fuente de errores en el genotipado y baja variabilidad . Respecto a las muestras, se realizó diferentes evaluaciones para medir el grade de contaminación y correlación poblacional . Después de este paso quedaron 251.952 variantes y 668 muestras.
Posteriormente se analizó el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) para cada variante. Este equilibrio establece que la composición genética de una población permanece en equilibrio mientras o actúe la selección natural ni ningún otro factor y no se produzca ninguna mutación, este principio es básico y sobre él se basa es resto del estudio estadístico de asociación, por lo tanto, es considerado como un paso importante para el filtrado de variantes. Las variantes que no cumplen los requerimientos mínimos para el estudio de asociación. En el presente estudio se analizó HWE considerando todas las muestras y mediante estratificación por sexo y fenotipo. Se tomó como referencia aquellas variantes que cumplían con el HWE en todas las inferencias, utilizando el valor 0.1 como valor umbral de significancia estadística. La información sobre el equilibrio de HWE puede ser visualizado en el excel de resultados,
Estudio genético descriptivo:
Tanto el estudio de significancia estadística como el descriptivo está contenido en el Excel de resultados, dentro de la carpeta resultados. Allí está contenida la descripción sobre los alelos descritos, la frecuencia del alelo mayoritario y el porcentaje de datos perdidos o que no se han podido evaluar.
Análisis de asociación y Odds ratio:
Partiendo de las variantes que cumplían con los requisitos de HWE descritos en 2.1 , se realizó un estudio de Asociación Fenotipo-Genotipo, tanto a nivel global como estratificando por sexo, aplicando en cada caso diferentes modelos genéticos. Estos fueron:
• Codominante
• Dominante
• Recesivo
• Log-Aditive
Los datos de significancia para cada modelo pueden ser visualizados en el Excel de resultados, dentro de la carpeta de resultados.
Posteriormente se realizó el estudio de los Odds ratio para cada variante, este valor es un indicador del aumento o disminución del riego de padecer el fenotipo a estudio asociado a las variantes estudiadas. Dicho análisis se aplicó a todas las variantes iniciales que cumplían los requisitos de HWE.
Estudio de Epistasia:
Para el estudio de epistasia se tomaron las variantes significativas estadísticamente con un umbral mínimo de 0.005 de pValue. Se estudió la posible epistasia utilizando los modelos, codominante, dominante y recesivo. Los resultados para el modelo codominante pueden ser visualizados en la Fig. 1 , el modelo dominante en la Fig.2 y en la Fig. 3 el modelo recesivo.
Para considerar una correlación significativa se realizó el 95 percentil para cada modelo. Las variantes con epistasis significativas en cada modelo están descritas en el Excel de resultados.
Estudio Funcional de las variantes estadísticamente significativas:
El presente estudio se realizó el estudio funcional de variantes significativas mediante la información proporcionada por la base de datos Ensembl , dSNPs , Interpro , ClinVar y uniprot . La información fue complementada por los algoritmos SIFT , PolyPhen . Para los estudios de frecuencia poblacional se utilizó las bases de datos 1000 Genomas y ExAC . Para estudios de predicción de eventos de splicing y motivos regulatorios se utilizó los algoritmos propuesto por . Para la conservación evolutiva de la posición de cada variante se utilizó el algoritmo propuesto por .
Selección de variantes más significativas:
Para la selección de variantes significativas se utilizó un umbral de pValue de 0.00001. Este umbral ha sido observado en otros trabajos similares. Se puede observar el mahattan plot en la Fig. 4.
Influencia de diferentes poblaciones:
El dataset inicial está contendido por dos poblaciones diferentes, de Sevilla y Málaga. Para poder corroborar que no existe desplazamiento y que las variantes significativas lo son en ambas poblaciones se añadió el pValue estratificando por población y se realizó un estudio de PCA. Para todas las dimensiones de PCA se realizó el test no paramétrico wilcoxon entre las dos poblaciones y los pValue fueron normalizados por fdr. El resultado fue negativo, por lo que la influencia de la población no parece significativa en los marcadores denominados significativos.
Variantes más significativas en modelo dominante:
A. SCP2
B. CTNND2
C. ZNF252P

Claims

REIVINDICACIONES
1.- El uso de, al menos, uno de los genes SCP2, CTNND2 y/o ZNF252P o cualquiera de sus combinaciones, para diagnosticar, clasificar, predecir o pronosticar si un individuo ha desarrollado o es susceptible de desarrollar la enfermedad alérgica a polen del olivo (EAPO).
2.- El uso de los polimorfismos rs10437066[G/A] y rs7544995[A/G] del gen SCP2, los polimorfismos rs6867416[C/T], rs6554641 [T/C] del gen CTNND2, y los polimorfismos rs7817276[G/A], rs2272715[T/C], rs6599548[C/T] y rs3866997[A/C] del gen ZNF252P.
3.- Un método de obtención de datos útiles para el diagnostico, estratificación, seguimiento y pronostico de la evolución de la EAPO en un individuo, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
a) determinar los polimorfismos de un solo nucleótido rs10437066[G/A] y rs7544995[A/G] del gen SCP2, los polimorfismos rs6867416[C/T], rs6554641 [T/C] del gen CTNND2, y los polimorfisomos rs7817276[G/A], >rs2272715[T/C], rs6599548[C/T] y rs3866997[A/C] del gen ZNF252P en una muestra biológica aislada, o cualquiera de sus combinaciones.
4 - Un método para el diagnostico, estratificación, seguimiento y pronostico de la evolución de EAPO en un individuo, que comprende que comprende el paso (a) del primer método de la invención, y adicionalmente:
b) incluir a los individuos que presentan la variante A del rs10437066 y/o la variante G del rs7544995 del gen SCP2, la variante T del rs6867416 y/o la variante C del rs6554641 [T/C] del gen CTNND2, y/o la A del rs7817276 la variante C del rs2272715[T/C] y/o la variante T del rs6599548 y/o la variante rs3866997 del gen ZNF252P, o cualquiera de sus combinaciones, en el grupo de individuos con mayor probabilidad de desarrollar EAPO.
5.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, donde la muestra biológica es sangre.
6.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, donde la determinación de los polimorfismos se realiza mediante PCR.
7.- Uso de una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende al menos un nucleótido con la secuencia correcta del gen SCP2, CTNND2 y/o ZNF252P, para la prevención, mejora y/o tratamiento de la EAPO
8.- Uso de una composición según la reivindicación anterior, donde el individuo se ha ientificado como susceptible de padecer EAPO mediante un método según las reivindciaciones 3-6.
9.- Un kit o dispositivo que comprende una o varias secuencias nucleotídicas necesarias para detectar los polimorfismos rs10437066[G/A] y rs7544995[A/G] del gen SCP2, los polimorfismos rs6867416[C/T], rs6554641 [T/C] del gen CTNND2, y los polimorfismos rs7817276[G/A], rs2272715[T/C], rs6599548[C/T] y rs3866997[A/C] del gen ZNF252P.
10.- El uso de un kit o dispositivo según la reivindicación 7 para el diagnostico, estratificación, seguimiento y pronostico de la evolución de EAPO en un individuo
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