ES2611759B1

ES2611759B1 - Uso de variantes alélicas (SNPs) en la región 6p21.33 para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la Enfermedad de Ménière.

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Publication number: ES2611759B1
Application number: ES201531458A
Authority: ES
Inventors: José Antonio LÓPEZ ESCÁMEZ; Sonia CABRERA MARTÍNEZ; Marta Eugenia ALARCÓN RIQUELME; María Teresa REQUENA NAVARRO
Original assignee: Servicio Andaluz de Salud; Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud
Current assignee: Servicio Andaluz de Salud; Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud
Priority date: 2015-10-09
Filing date: 2015-10-09
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2035-10-09
Also published as: WO2017060555A1; US20190062835A1; ES2611759A1

Abstract

Uso de variantes alelicas (SNPs) en el cromosoma 6 para el diagnóstico, pronostico y tratamiento en la enfermedad de Ménière.#La presente invención describe el uso de un grupo de polimorfismos o variantes de nucleótido simple (SNP) en el cromosoma 6 para la obtención de datos útiles en el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial, kit o dispositivos y usos.

Description

la presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la

5 biotecnología, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el pronóstico y la clasificación de pacientes que sufren hipoacusia neurosensorial, y especialmente de aquellos que presentan la enfermedad de Méniere con afectación bilateral.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

la enfermedad de Méniere (EM) es un trastorno crónico que afecta el oído interno 10 caracterizado por episodios recurrentes de vértigo, inestabilidad progresiva, presión auditiva, acúfenos y pérdida de la audición. La EM no es una sola enfermedad sino un

síndrome clínico común con varias causas tales con la herencia genética, la respuesta inmune o la respuesta alérgica, entre otras. Así, la EM puede afectar ambos oídos entre el 10-40% de los pacientes, lo que determina un impacto significativo sobre la audición, el 15 desequilibrio crónico y la calidad de vida relacionada con la salud. Por este motivo, la EM bilateral se considera la forma más incapacitante de la EM, y su abordaje terapéutico es diferente, incluyendo el empleo de inmunosupresores, el implante coclear, evitando la neurectomia vestibular. Dado que se observa un incremento en el número de autoanticuerpos y una mejoría clínica con la terapia con esteroides, se ha propuesto una

20 etiología autoinmune para esta enfermedad. Algunas va riantes genéticas en genes del sistema inmune como MICA, TLR10 Y NFKB1 parecen modificar el curso clínico de la enfermedad, posiblemente como resultado de una respuesta inmune innata alterada.

las moléculas de clase I y moléculas de clase 1I del Complejo Mayor de Histocompatibidad Humano se han descrito como marcadores genéticos de muchas enfermedades 25 autoinmunes. A su vez, la EM ha sido asociada con el HLA-B*27, HLA-B*44, HLA-B*13, HLA-Cw*07, HLA-DBR1*1602 Y HLA-DRB1*1101 en diferentes poblaciones, sin embargo

estas asociaciones diagnóstica.: no se han replicado en otras poblaciones y no tienen uti lidad

S: Varios estudios muestran una elevada prevalencia de enfermedades autoimmunes como son la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico, la espondilitis anquilosante o la psoriasis en pacientes con EM, lo que sugiere una posible respuesta autoinmune alterada. Por este motivo, el estudio sistemático mediante un microarray de genotipado (ImmunoChip) de variantes localizadas en 186 loei previamente asociados con 12 enfermedades autoinmunes parece ser una forma de investigar el máximo número de variantes por muestra, lo que mejora el rendimiento diagnóstico.

10: Se han propuesto una gran variedad de tratamientos, tanto médicos como quirúrgicos, para la enfermedad de Méniere. Todos ellos con distintos resultados respecto a la remisión de los síntomas y efectos secundarios.

lS: Dentro de los tratamientos médicos se encuentran la dieta hiposódica, antihistamínicos, diuréticos, histamina subcutánea, drogas antivertiginosas, benzodiazepinas y la terapia trans-timpánica, que ha ganado alguna popularidad en el último tiempo, especialmente en aquel grupo de pacientes que no presentan respuesta a las terapias habituales.

20: En algunos centros se practica desde hace algún tiempo la inyección intratimpánica de medicamentos ototóxicos, como la gentamicina, en la cavidad del oído medio. El objetivo de este procedimiento sería producir una laberintectomía médica, lo que causaría la disminución o la desaparición de los síntomas. El riesgo de este procedimiento es el deterioro de la capacidad auditiva del paciente, descrito especialmente en aquellos pacientes sometidos a regímenes de tratamiento en plazos cortos de tiempo. Los agentes más utilizados han sido, inicialmente, estreptomicina y, actualmente, la gentamicina.

2S: En casos muy graves se ha recurrido a la cirugía, tales como la laberintectomia o la neurectomia vestibular, pero este recurso empeora la calidad de vida del enfermo porque elimina no sólo los síntomas, sino también la información sensorial de los receptores vestibulares y provoca un desequilibrio crónico. Por tanto, los tratamientos actualmente

disponibles para la hipoacusia pueden ser excesivamente agresivos y pueden poner el riesgo la audición del paciente. Sería, por tanto, importante disponer de algún marcador diagnóstico y pronóstico que permitiera evaluar la idoneidad del tratamiento.

S: Sin embargo, hasta el momento no se dispone de un método o marcador biológico que nos permita un diagnóstico precoz o establecer un pronóstico sobre la pérdida de audición a largo plazo, que sea de utilidad para realizar una clasificación de los pacient es y facilite la toma de decisiones sobre el tratamiento y el seguimiento de la evolución de la enfermedad.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

10: los ejemplos de la inve nción muestran que las va riantes de nucleótido simple rs9380217, rs4947296 V/o rs886424 en la región 6p21.33 son marcadores útiles para determinar el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial, preferiblemente para el pronóstico de la progresión de la enfermedad de Méniere hacia la enfermedad de Méniere con afectación bilateral.

15: Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de las variantes de nucleótido simple rs9380217, rs4947296 V/o rs886424 para la obtención de datos útiles en el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere.

20: Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial en un individuo afectado por dicha enfermedad, de ahora en adelante primer método de la invención, que com prende:

25: al detectar los polimorfismos o variantes de nucleótido simple rs9380217, rs4947296 V/o rs886424, en una muestra biológica aislada del individuo afectado.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende el paso del primer método de la invención, y además comprende:

5: b) Incluir al individuo (a) en el grupo de individuos con progresión hacia enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial bilateral cuando presenta el alelo con menor frecuencia en homocigosis para rs9380217, rs4947296 V/o rs886424.

10: En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere o la enfermedad autoinmune del oído interno. Más preferiblemente la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere.

lS: En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra aislada en (a) es sangre periférica, y aún más preferiblemente es el ADN genómico obtenido de sangre periférica.

En otra realización preferida de la invención, el individuo pertenece a una población de ascendencia europea, V aún más preferiblemente, de ascendencia española.

20 2S: Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método, de ahora en adelante tercer método de la invención, para clasificar un individuo que padece o tiene la probabilidad de padecer una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial, preferiblemente la enfermedad de Méniere o la enfermedad autoinmune del oído interno, en uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende los individuos identificables mediante el procedimiento de acuerdo con el primer método de la invención por presentar el alelo con menor frecuencia en homocigosis para rs9380217, rs4947296 V/o rs886424, V en el que el grupo 2 representa al resto de los individuos.

Una realización particular de este aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende uno o más compuestos moduladores, inhibidores o antagonistas de la vía

TWEAK/Fn14, tal y como una anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse al

ligando TWEAK (NF-related weak inducer of apoptosis) o bien un anticuerpo o un

fragmento del mismo capaz de unirse a Fn-14 (receptor de TWEAK), para su uso en el

tratamiento profiláctico o terapéutico de la hipoacusia neurosensorial, preferiblemente

5: en la enfermedad de Méniere, y más preferiblementeen aquellos pacientes

pertenecientes o clasificados como grupo 1 de acuerdo al tercer aspecto de la invención.

Preferiblemente, dicho anticuerpo es el anticuerpo 8118023 {Humanized mAb against

tumor necrosis factor {TNF)-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)

(http://www.biocentury.com/products/biib023l. Más preferiblemente, la administración

10: de este fármaco se realiza de forma sistémica o transtimpanica.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, preferiblemente un

microarray de dos canales, un chip de oligonucleótidos de AON, un GeneChip o un chip de

AON para genotipado, adecuado para llevar a cabo el método descrito en cua lquiera de

los aspectos anteriores, que comprende una superficie sólida, preferiblemente de vidrio,

lS: plástico o silicio, al que se la une o diseña al menos un oligonucleótido complementa rio a

la secuencia SEQ ID NO: loa un fragmento del mismo que comprenda la variante de

nucleótido simple para rs9380217 y opcionalmente oligonucleótidos complementarios a

las secuencias SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3 o fragmentos de los mismos que

comprendan la variante de nucleótido simple para rs4947296 y/o para rs886424.

20: Preferiblemente, dicho kit es un microarray que comprende oligonuleótidos o

microarreglos de canal único diseñados a partir de las secuencias oligonucleotídicas

descritas en el párrafo anterior. Más preferiblemente, dicho kit es un chip de AON para

genotipado.

Un aspecto adicional de la presente invención, se refiere al uso de un kit o un dispositivo

2S: según el cuarto aspecto de la invención, para el pronóstico de una enfermedad que cursa

con hipoacusia neurosensorial. Preferiblemente, la enfermedad que cursa con hipoacusia

neurosensorial es la enfermedad de Méniere o la enfermedad autoinmune del oído

interno. Más preferiblemente, la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere unilateral.

S: Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

10: DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

15 20: Fig. 1. Diagrama de dispersión que muestra el análisis de componentes principales (peA) de los marcadores genéticos en nuestras muestras españolas en comparación con las diferentes poblaciones de HapMap. Los valores propios correspondientes a los tres primeros componentes principales explicaron la mayor parte de la subestructura de la población en este análisis (77,5%). Todas las personas que no estaban incluidas con el grupo principal (>3 desviaciones estándar de la agrupación centro) se excluyeron del análisis posterior. Con este método se identificaron un total de 48 individuos atípicos en nuestra cohorte de casos y controles. El eje X representa Componente Principal 1 (PC1) y el eje Y representa Com ponentes Principales 3 (PC3) en nuestras muestras españolas (d iamantes), y las principales poblaciones del HapMap: CEU (cuadrados), CHB + JPB (triángulos), MEX (cruces), T51 (asteriscos) y YRI (círculos).

Fig. 2. Datos de las variantes rs9380217 y rs4947296 que muestran desequilibrio de ligamiento (r2 y distancia en bases entre 5NPs).: que están en

25: Fig. 3. Intensidad normalizada de la señal correspondiente a los genotipos de las variantes rs9380217, rs4947296 y rs886424 mediante el microarray de genotipado empleado en el ¡SCAN.

Fig. 4. Curvas Característica Operativa del Receptor (ROe) para predecir HNS bilateral con las variantes rs9380217, rs886424 y la historia de enfermedad autoinmune.

Fig. 5. Heat map para la vía TWEAK/Fn14, que representa el perfil de expresión génica (fald change) de los genes implicados para cada individuo.

S: Fig. 6. Heat map para la vía de ubiquitinación de proteínas, que representa el perfil de expresión génica (fald change) de los genes implicados para cada individuo.

Fig. 7. Perfil individuo.: de expresión génica (fald change) de los genes implicados para cada

10: DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

15 20: la presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles para el pronóstico de la enfermedad de Méniere, así como para evaluar el riesgo genético de la progresión de la enfermedad de unilateral hacia bilateral permitiendo optimizar el seguimiento, la planificación del tratamiento V el consejo genético. Los autores de la presente invención son los primeros en demostrar la asociación de tres variantes en el cromosoma 6 situadas en coordenadas genómicas específicas, que determinan un riesgo de progresión bilateral en la enfermedad de Méniere. Dichas variantes tienen una frecuencia baja (0,09 para rs9380217 V rs4947296, 0,05 para rs886424) en la población general V en los pacientes tienen una gran utilidad para establecer el pronóstico de progresión de la hipoacusia con una elevada rentabilidad diagnóstica. Por tanto, la presencia de las variantes alélicas determina un riesgo elevado para el desarrollo de hipoacusia bilateral en la enfermedad de Méniere en la población española V en la población de descendencia europea.

25: Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso in vitro de las variantes de nucleótido simple rs9380217, rs4947296 vio rs886424 como indicador o como

biomarcador; en concreto este indicador o biomarcador se utilizará para la obtención de datos útiles en el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial.

S: la región donde se encuentran estas variantes corresponde a una zona de unión de los factores de transcripción CTCF y CEBPB, que actúan regulando la expresión de genes implicados en la respuesta inmune e inflamatoria.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensoria l es la enfermedad de Méniere.

10: En esta memoria se entiende por "hipoacusia neurosensorial" la disminución del nivel de audición por debajo de 30dB en al menos 2 frecuencias consecutivas en 250, 500, 1000, 2000,4000 o 8000 Hz en la audiometría tonal liminar.

En el estado del arte se conocen varios métodos para medir si existe o no pérdida del nivel de audición, y en qué grado, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, la audiometría tonal liminar o los potenciales evocados auditivos de tronco cerebral.

15: Se determina mediante audiometría con tonos puros. La hipoacusia puede presentarse en uno o ambos oídos y puede ser súbita o brusca, rápidamente progresiva (semanas o meses) o lentamente progresiva (meses o años). l a hipoacusia neurosensorial afecta al oído interno y, se produce cuando los elementos neurosensoriales cocleares o el nervio coclear se lesionan de algún modo, por medios físicos °de otra naturaleza.

20: En esta memoria se entiende por "hipoacusia neurosensorial unilateral" cuando el efecto se produce sólo en un oído e "hipoacusia neurosensorial bilateral" cuando el efecto se produce en ambos oídos.

25: la cóclea es el órgano fundamenta l de audición situado en el oído interno, con forma de conducto enrollado en espiral V, que contiene el órgano de Corti, donde se transforman las vibraciones mecánicas en impulsos nerviosos que, a través del nervio auditivo, llegan al cerebro para ser identificados. Cuando las células del órgano de Corti vio el nervio auditivo se ven afectadas, se interrumpe la transmisión de los sonidos. Cualquiera de

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estas delicadas estructuras pueden verse afectadas por diferentes procesos infecciosos, inflamatorios, tóxicos o degenerativos, siendo de todos ellos el ruido intenso y los procesos degenerativos, los responsables de la mayor parte de las sorderas de percepción.

S Según el órgano afectado pueden clasificarse en:

• Endococleares: Cuando está afectado el oído interno.

• Retrococleares: Cuando está afectado el nervio auditivo.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la hipoacusia neurosensorial se selecciona de la lista que consiste en: hipoacusia súbita, hipoacusia rápidamente

10 progresiva, hipoacusia lentamente progresiva, hipoacusia neurosensorial con afectación de bajas frecuencias, enfermedad inmuno-mediada del oído interno, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, la hipoacusia neurosensorial además se asocia a crisis de vértigo recurrente. En otra realización aún más preferida, la enfermedad asociada a la

15 hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere. En otra realización más preferida, las regiones del genoma que contienen las variantes alélicas de susceptibilidad son las que corresponden a las coordenadas genómicas de la Tabla 1.

Tabla 1. Coordenadas genómicas de las variantes que forman el panel diagnóstico de riesgo de la enfermedad de Méniere.

SNP: Cromosoma Posición Genoma Humano (GRCh38{hg38) Alelos (1) localización

rs9380217: 6 31083776 CfT Intergénica

rs4947296: 6 31090401 TIC Intergén¡ca

rs886424: 6 30814225 CfT Intergénica

(1) El primer alelo es el alelo mayor y la referencia en la secuencia de consenso, mientras que el segundo alelo es el alelo menor y la variante de susceptibilidad.

En el contexto de la presente invención, estas variantes se definen también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que se definen en las siguientes secuencias:

Chr6:31083776, rs9380217 = SEQ ID NO: 1

TCTTCTCTGCTCTGA TTCTTCCTA T[ C/TICCTCAGAAACCCAAGGCCTCCTT AG

S: SEQ ID NO 1: TCTTCTCTGCTCTGATTCTTCCTATTCCTCAGAAACCCAAGGCCTCCTTAG

chr6:31090401, rs4947296 = SEQ ID NO: 2

CACACAAGAGCAAAAAAGGACGCAA[T /CJGAAA TATGGAAACT AGTGAATGG AA

SEQ ID NO 2: CACACAAGAGCAAAAAAGGACGCAACGAAATATGGAAACTAGTGAATGGAA

Chr6: 3081422S, rs886424 = SEQ ID NO: 3

10: CAACTCCAATGTCACCTGCTCCTCA[C/TICTGTACCCAGTGGACIIIIIIGGCA

SEQID NO 3: CAACTCCAATGTCACCTGCTCCTCATCTGTACCCAGTGGACIIIIIIGGCA

Se hace notar que el polimorfismo rs886424 se encuentra en la hebra complementaria a la hebra de la cual hemos seleccionado la SEQ ID NO 3 (http://www.ncbLnlm.nih.gov/snp/?term=rs886424).

15 20: Secuencias variantes de cualquiera de las secuencias SEQ ID NO 1 a 3 que contengan el polimorfismo y que se encuentren acortadas o alargadas en algunos nucleótidos se encontrarían dentro del ámbito de la presente invención. En este sentido, preferiblemente las SEQ ID NO 1 a 3 se podría acortar en un máximo de 5 nucleótidos, preferiblemente la SEQ ID NO 1 Y 3 se podrían acortar en un máximo de 5 nucléotidos en el lado 3' y la secuencia 2 se podría acortar en un máximo de 5 nucleotídos en el lado S'.

MÉTODOS DE LA INVENCiÓN

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos úti les para el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial en un

individuo que padece dicha enfermedad, de ahora en adelante primer método de la

invención, que comprende:

a) detectar la presencia o no de los polimorfismos o variantes de nucleótido simple

rs9380217, rs4947296 V/o rs886424 en una muestra biológica aislada de dicho individuo.

Es decir, el paso (a) consiste en detectar los polimorfismos o variantes de nucleótido simple que se seleccionan de la lista que consiste en rs9380217, rs4947296 V/o rs886424. la detección de la presencia de los polimorfismos o variantes de nucleótido simple del paso a), puede hacerse por cualquier método conocido en el estado de la técnica, por

ejemplo, pero sin limitarse a, mediante secuenciación de AON, electroforesis capilar, espectrometría de masas, polimorfismo de conformación de cadena simple (del inglés, "single-strand conformation polymorphism o SSCP"), análisis electroquímico, HPLC desnaturalizante en gel de electroforesis, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (en inglés, restriction fragment length polymorphism o RFLPs), y análisis de hibridación en microarrays de genotipado.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método, de ahora en adelante segundo método de la invención, de pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial que comprende e l paso (a) del primer método de la invención, y además comprende: b) Incluir al individuo (a) en el grupo de individuos con progresión de la enfermedad hacia hipoacusia neurosensorial bilateral cuando presenta el alelo con menor frecuencia en homocigosis para rs9380217, rs4947296 y/o rs886424. Es decir, serían los genotipos TI para rs9380217, CC para rs4947296 y/o TI para rs886424.

El paso (a) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótica sensor para la detección en el paso a) o la comparación computarizada en el paso (b).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere o la enfermedad autoinmune del oído interno.

5: Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos V/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es sangre periférica, V/o comprende células mononucleares de sangre periférica (peripheral blood mononuclear celis PBMCs), más preferiblemente mononucleares. Más preferiblemente, la muestra aislada es el AON genómico, y más preferiblemente obtenido de sangre periférica.

En otra realización preferida de la invención, el individuo pertenece a una ascendencia europea, y aún más preferiblemente, de ascendencia española.: población de

10: En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la hipoacusia neurosensorial es unilateral.

lS: En una realización preferida de este aspecto de la invención, la hipoacusia neurosensorial se selecciona de la lista que consiste en: hipoacusia súbita, hipoacusia rápidamente progresiva, hipoacusia lentamente progresiva, hipoacusia neurosensorial con afectación de bajas frecuencias, enfermedad inmuno-mediada del oído interno, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida, la hipoacusia neurosensorial además se asocia a crisis de vértigo recurrente.

20: El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente humanos. El término "individuo" no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

2S: En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una secuencia sustancialmente homóloga a la secuencia de los genes que contienen las variantes descritas. En general, una variante incluye adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos. Más preferiblemente, las variantes descritas hacen referencia al cambio o sustitución de un nucleótido de la secuencia en el genoma humano de referencia en las posiciones descritas.

El término "polimorfismo" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico donde cada secuencia posible está presente en una proporción igualo superior a un 1% en una población; en un caso particular, cuando dicha variación es la secuencia nucleotídica ocurre en un sólo nucleótido (A, e, T o G) se denomina SNP.

S: El término "mutación génica" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico donde cada secuencia posible está presente en una proporción inferior al 1% en una población.

10: los términos "variante alélica" o "alelo" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un polimorfismo que ocurre en un mismo locus en una misma población.

El término "variación génica" o "variante génica", tal y como se utiliza en la presente descripción, incluye a las mutaciones, polimorfismos y variantes alélicas. Una variación o variante génica se encuentra entre individuos dentro de las poblaciones y entre las poblaciones dentro de las especies.

15: El término "pronóstico", tal y como se utiliza en la presente invención, a la capacidad de discriminar entre individuos que presentan mayor o menor riesgo a padecer hipoacusia neurosensorial bilateral, y más preferiblemente, al mayor o menor riesgo a padecer la enfermedad de Méniere Bilateral o al mayor o menor riesgo a padecer la enfermedad autoinmune del oído interno.

20 25: A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor

paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de Roe (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos de 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la

predisposición a la enfermedad o la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%,

más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método, tercer método de la invención, para clasificar un individuo que padece o tiene la probabilidad de padecer una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial, preferiblemente la enfermedad de Méniere o la enfermedad autoinmune del oído interno, en uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende los individuos identificables mediante el procedimiento de acuerdo con el primer método de la invención por presentar el alelo con menor frecuencia en homocigosis para rs9380217, rs4947296 V/o rs886424, V en el que el grupo 2 representa al resto de los individuos.

Una realización particular de este aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende uno o más compuestos moduladores, inhibidores o antagonistas de la vía TWEAK/Fn14, tal V como una anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse al ligando TWEAK (NF-related weak inducer of apoptosis) o bien un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse a Fn-14 (receptor de TWEAK), para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de la hipoacusia neurosensorial, en aquellos pacientes pertenecientes o clasificados como pertenecientes al grupo 1 de acuerdo al tercer aspecto de la invención.

KIT O DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO Y USOS

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o en homocigosis para rs9380217, rs4947296 V/o rs886424. Es decir, capaz de detectar los genotipos TI para rs9380217, ce para rs4947296 V/o TI para rs886424. Preferiblemente dicho kit comprende al menos un oligonucleótido, que incluya la secuencia vio la complementaria, a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, preferiblemente el kit comprende al menos un oligonucleótido complementario por cada una de las secuencias SEQ. ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 V/o SEQ ID NO: 3.

Dicho kit o dispositivo puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar los polimorfismos o variantes de nucleótido simple de la invención por medio de

cualquiera de los métodos existentes en el estado de la técnica y/o descritos en este documento. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.

Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia conocida de los polimorfismos o variantes de nucleótido simple de la invención. En otra realización aún más preferida, la secuencia conocida de los polimorfismos o variantes de nucleótido

simple de la invención es la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO:3.

S: Otro aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende oligonuleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 V/o SEQ ID NO: 3.

10: Así, por ejemplo, las secuencias de oligonuleótidos son construidas en la superficie de un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleétidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. la fotomáscara puede ser física o virtual.

lS: Así, las sondas oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos. Para la cuantificación de la expresión génica, preferiblemente se emplean aproximadamente unos 40 oligonucleótidos por gen.

20: la síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría flace rse mediante tecnología chorro de tinta link-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehídos o epoxy. la sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.

2S: las "condiciones de amplificación" o "condiciones de extensión" se refieren indistintamente a condiciones bajo las cuales una polimerasa puede añadir nucleótidos al extremo 3' de un polinucleótido. Dichas condiciones de amplificación o extensión son muy conocidas en la técnica (Sambrook y Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 32 Edición, Cold Spring Harbor l aboratory Press; Ausubel et al., Current Protocols in Mo lecular Biology, 1987-2007, John Wiley & Sons.)

El término "cebador" tal y como se utiliza en la presente memoria, es conocido por el experto en la materia y se refiere a "compuestos oligoméricos", principalmente "oligonucleótidos" aunque también "oligonucleótidos modificados", que son capaces de "cebar" la síntesis del ADN mediante una ADN polimerasa dependientes de molde, es

decir, el extremo 3' del, por ejemplo, oligonucleótido, proporciona un grupo 3'-OH libre en el que pueden unirse "nucleótidos" adicionales por una ADN polimerasa dependiente

de molde, estableciendo un enlace 3' a 5' fosfodiéster en el que se utilizan desoxinucleósidos-trifosfato y en el que se libera pirofosfato. Por lo tanto, no existe, excepto para la función pretendida, ninguna diferencia fundamental entre un "cebador", un "oligonucleótido" o una "sonda" según la invención.

Según la invención, un "compuesto oligomérico" es un compuesto que consiste de "unidades monoméricas" que pueden ser "nucleótidos" solos o "compuestos no naturales" (ver posteriormente), más específicamente "nucleótidos modificados" (o "análogos de nucleótidos") o "compuestos no nucleótidos", solos o en combinaciones de los mismos. los "oligonucleótidos" y "oligonucleótidos modificados" (o "análogos oligonucleótidos") son subgrupos de "compuestos oligoméricos" en el contexto de la invención.

En el contexto de la presente invención, el término "oligonucleótido" se refiere a "polinucleótidos" formados a partir de una pluralidad de "nucleótidos" a modo de la "unidad monomérica", es decir, un "oligonucleótido" pertenece a un subgrupo específico de un "compuesto oligomérico" o "compuesto polimérico" de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (AON) con "unidades monoméricas". Se hace referencia comúnmente a los grupos fosfato como formadores del esqueleto internucleósido del "oligonucleótido". El enlace normal del esqueleto de ARN o ADN es un enlace 3' a 5' fosfodiéster.

los "oligonucleótidos" y "oligonucleótidos modificados" según la invención pueden sintetizarse tal como se describe principalmente en la técnica y que resulta conocido para el experto en la materia. l os métodos para preparar compuestos oligoméricos de secuencias específicas son conocidos de la técnica, y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa. Entre los

métodos de síntesis química pueden incluirse, por ejemplo, el método del fosfotriéster descrito por Narang S.A. et al., 1979, Methods in Enzymology 68,90-98, el método del fosfodiéster de Brown E.L. et al., 1979, Methods in Enzymology 68, 109-151, el método de la fosforamidita dado a conocer en Beaucage et al., 1981, Tetrahedron letters 22:1859, y el método del H-fosfonato dado a conocer en Garegg et al., 1985, Chem. Ser. 25:280-282, y el método del soporte sólido dado a conocer en la patente US n2 4.458.066.

Tal como se ha indicado anteriormente, un "ácido nucleico", así como el "ácido nucleico diana ", es un compuesto polimérico de "nucleótidos", tal como es conocido por el experto en la materia. Se utiliza en la presente memoria para referirse a un "ácido nucleico" en una muestra que debe analizarse, es decir, la presencia, no presencia o cantidad del cu al

debe analizarse en una muestra.

La expresión "secuencia (de ácidos nucleicos) complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que la secuencia (de ácidos nucleicos) complementaria a la que se hace referencia es exactamente el complemento (inverso) de la secuencia de ácidos nucleicos.

Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de bases modificadas, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2tiouridina, 5-ca rboxi meti la minometiluracilo, d ihid rou racilo, beta-D-ga lactosilq ueosina, inosina, N6-isopenteniladenina,l-metilguanina, l-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-Disopenteniladenina, ácido uracil-S-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-S-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2carboxipropil)uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.611; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; Y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a,

arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.

"Temperatura de fusión de la hibridación" o "Tm" se refiere a la temperatura bajo condiciones especificadas a la que un dúplex de polinucleótido está en un 50% en forma de cadena única y 50% en forma de cadena doble. Hay programas informáticos fácilmente disponibles para ca Icular Tm.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un kit o un dispositivo de la invención, o de un microarray de la invención, para el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Meniere. En otra realización preferida de este aspecto de la invención la hipoacusia neurosensorial es unilateral.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la hipoacusia neurosensorial se selecciona de la lista que consiste en: hipoacusia súbita, hipoacusia rápidamente progresiva, hipoacusia lentamente progresiva, hipoacusia neurosensorial con afectación de bajas frecuencias, enfermedad inmunomediada del oído interno, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida, la hipoacusia neurosensorial además se asocia a crisis de vértigo recurrente.

Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención (del primer o del segundo método de la invención).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medio de almacenamiento legible comprende al menos una secuencia comprendida en las sondas de secuencia SEQ ID NO, 1, SEQ ID NO, 2 V SEQ ID NO, 3.

S: En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el medio de almacenamiento legible además comprende los elementos necesarios para detectar las variantes rs9380217, rs4947296 V/o rs886424.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de al menos una secuencia conocida o un ARNm comprendido cualquiera de las sondas de la invención.

10: Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

15: Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un solo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.

20: La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehídos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la m uestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.

25: Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cua lquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (AON ó ONA). Los términos "secuencia aminoacídica", " péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y

"proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser cedificantes o no cedificantes, química o bioquímica mente modificados.

S: A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

10

EJEMPLOS DE LA INVENCiÓN

A continuación inventores.: se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los

Materiales y Métodos

15: Sujetos y muestras

El presente estudio incluyó una cohorte inicial de un total de 716 pacientes con la enfermedad de Méniere y 898 controles de España. la segunda cohorte de replicación estaba formada por 218 pacientes con enfermedad de Méniere Bilateral y 898 controles españoles. Las muestras fueron reclutadas entre enero de 2007 y Mayo de 2015.

20: Criterios de inclusión: los pacientes fueron diagnosticados después de la escala de diagnóstico de la Academia Americana de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello (AAO-HNS) (Committee en Hearing and Equilibrium guidelines fer the diagnosis and evaluation of therapy in Meniere's disease. American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Foundation, Inc. Otolaryngol Head Neck Surg. 1995. 113, 181-185).

25: Se utilizaron controles de calidad sobre las muestras de los individuos para excluir aquellos que no superaron los filtros de calidad (eliminación de muestras duplicadas o

de componente principal, va lores extremos en análisis de heterocigosidad, va lores bajos de call rate).: muy

S: Un examen básico neurotológico incluyendo la audiometría de tonos puros, nistagmo en posición primaria, nistagmo evocado por la mirada, nistagmo de agitación cefálica y prueba calórica estándar se realizó en todos los pacientes.

10: El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki para la investigación con seres humanos. El Comité de Etica de la Investigación Clinica de Almeria aprobó el protocolo de investigación. El ADN genómico se aisló de las células mononucleares de sangre periférica mediante el QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen). Todos los pacientes e individuos sanos dieron su consentimiento informado para el estudio.

Ejemplo 1. Genotipado mediante Inmunochio

15: El ImmunoChip es un microarray de genotipado que contiene 196524 variantes (718 inserciones/deleciones y 195806 SNPs). Estas variantes se concentran en 18610ci distintos que han sido confirmados en estudios de asociación genómica previos (p<1O-8) en una o varias enfermedades autoinmunes. Estas regiones contienen variantes comunes y raras (MAF<l%) e incluyen todas las variantes conocidas en la base de datos dbSNP, el proyecto 1000 Genomas (versión Febrero 2010) y datos adicionales de secuenciación proporcionados por los colaboradores.

20: las muestras fueron genotipadas mediante el array de alta densidad descrito de IlIumina 200K Infinium siguiendo el protocolo del fabricante en el Centro de Genómica e Investigación Oncológica (Genyo) Pfizer-Universidad de Granada-Junta de Andalucía.

25: las muestras se agruparon mediante el algoritmo de la plataforma Genome Studio de IlIumina. Los genotipos fueron revisados y validados manualmente y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) con indicadores de baja calidad (call frequency <0.98, separación de clusters < 0.4) fueron eliminados. Todos los SNPs con puntuaciones Gencall menores de 0,15 fueron excluidos. Los controles de calidad del genotipado fueron estrictos e incluyeron la eliminación de SNPs con frecuencia alélica (MAF) < 0,05, no ajustados al equilibrio Hardy-Weinberg (HWE) < 0,0001 o diferencias en call rate entre

casos y controles p<10-8. Después de los controles de calidad, se mantuvieron 96899 SNPs con MAF>O,OS.

S: El análisis genético para identificar las variantes asociadas se realizaron mediante el programa informático PLlNK v1.0.7. El análisis del componente principal (peA) ha permitido definir los grupos de poblaciones dentro de la subestructura de las muestras analizadas. Para esto, hemos empleado los programas STRUCTURE y EIGENSTRAT para definir los grupos principales entre los datos, las proporciones de individuos en cada clúster y los marginales. Todos los individuos que no se agruparon con el clúster ancestral principal europeo (desviación> 3) fueron excluidos del análisis posterior.

10 15: Para evaluar la inflación de las pruebas estadísticas, después de excluir los marginales, primero comparamos el valor de X2 del modelo genético aditivo con su distribución teórica, utilizando un gráfico cuantil-cuantil (Q-Q) para analizar los resultados observados frente a los esperados de la prueba estadística Z bajo la hipótesis nula de ausencia de asociación a lo largo del genoma. Entonces, procedimos con el análisis de datos. El modelo aditivo se utilizó como modelo primario de inferencia, a menos que la prueba de ajuste a este modelo fuese significativa. En este caso, utilizamos el valor de P más bajo para el modelo aditivo, dominante o recesivo.

20: la aproximación a la corrección por comparaciones múltiples combina métodos estadísticos para reducir la tasa de error tipo I con la replicación. El análisis de regresión logística se realizó para determinar la asociación empleando el PCA de la matriz de genotipos y la proporción de ancestría como covariables, teniendo en cuenta la estructura de la población.

la primera fase de estos análisis se realizó con los datos de genotipado.

Resultados

25: El análisis del componente principal (PCA) mostró que los casos y controles tenían una distribución similar de los dos principales vectores que se eligieron en ambos grupos, lo que indica un fondo genético común en los individuos de este estudio y ausencia de estratificación en la población analizada (Fig. 1).

24

Ningún marcador alcanzó una significación a nivel genómica (p<10-8) cuando todos los casos y controles fueron comparados. Si bien, dos regiones genómicas mostraron un elevado número de SNP con p<10-4 en el subgrupo de bilaterales. Estas regiones fueron utilizadas como loei candidatos para replicació n. Se utilizaron los siguientes criterios para seleccionar los SNPs para la replicación: p-value, odd ratio, e-QTl (expression quantitative trait loei), MAF (frecuencia alélica menor), información de la plataforma Regulome (http://regulomedb.org/) y datos de desequilibrio de unión. Para llevar a cabo la replicación se seleccionaron SNPs representativos de cada haplobloque: 3 SNPs

(rs4988957, rsl1465670 y rs4851589) en el cromosoma 2 y 3 5NPs (rs9380217, rs886424 y rs1150754) en el cromosoma 6. Los resultados de la replicación y del meta-análisis se describen en la tabla 2.

Se replicaron un total de 7 SNPs, de los que solo uno de ellos (rs9380217) presentaba asociación significativa en la cohorte de replicación, para validar este resultado se seleccionó y replicó otro SNP (rs4947296) localizado en el mismo haplobloque, confirmando la asociación con la región 6p21.33 (chr6: 31081878-31090401) de un tamaño aproximado de 10 kb.

El siguiente paso fue elaborar un modelo de regresión logística para predecir el riesgo de desarrollar EM bilateral. Pa ra decidir los posibles factores que deben ser incluidos como covariables en dicho modelo, utilizamos una muestra aleatoria incluyendo el 70% de los individuos para construir el modelo, y el 30 % de los pacientes restantes se utilizaron para su validación.

En primer lugar, se identificaron las variables clínicas asociadas significativamente con HNS bilateral mediante regresión logística univariante seguido de una regresión por pasos para seleccionar las variables que finalmente serían incluidas en el modelo. A continuación, la regresión logística binaria se utilizó para identificar las variables de forma independiente asociadas con HNS bilateral mediante el ajuste de bondad de HosmerLemeshow. El coeficiente de determinación R2 de Nagelkerke, resume la proporción de la varianza en la variable dependiente asociada con las variables. Se generaron curvas Roe para determinar la capacidad de predecir HNS bilateral en un modelo compuesto por rs9380217 y luego un modelo que incluye adicionalmente rs 886424 y la variable clínica

de presencia de enfermedad curvas para ambos modelos.: autoinmune. Finalmente, calculamos las áreas bajo las

S: El modelo de regresión final presenta las siguientes variables independientes: enfermedad autoinmune, las variantes alélicas rs9380217 y rs886424 (Hosmer-lemeshow test, p=O.980; Tabla 2). El coeficiente de determinación R2 de Nagelkerke, indica que un 3,7 % de la varianza en la variable dependiente está asociada con las variables. La validez del modelo predictivo se probó en el restante 30% de los pacientes. La precisión del modelo fue 59 % en los casos seleccionados para crear el modelo y 61% en los casos empleados para su validación.

10: la capacidad del modelo para predecir la evolución hacia HNS bilateral se evaluó mediante el trazado de curvas ROC utilizando la variables clínicas del modelo con o sin el SNPs rs9380217. El área bajo la curva (AUC) fue de 0,601 (IC 95%, 0,562-0,640) para el modelo que incluye rs9380217, rs886424 y presencia de enfermedad autoinmune.

15: También se evaluó la relación de los genotipos de cada variante con la variable caso bilateral! control mediante tablas de contingencia, los resultado se muestran en la tabla 3.

los resultados muestran que las variantes alélicas rs9380217, rs4947296, rs886424 situadas en la región 6p21.33 y la coexistencia de enfermedad autoinmune permiten predecir el pronóstico auditivo de los pacientes con enfermedad de Méniere unilateral hacia bilateral.

20: Estos hallazgos indican que los pacientes con enfermedad de Méniere e hipoacusia unilateral y bilateral tienen una arquitectura genética diferente yeso explica que los pacientes con hipoacusia neurosensorial bilateral y enfermedad de Méniere presenten más frecuentemente comorbilidad autoinmune.

25: la autoinmunidad ha sido propuesta como un mecanismo en los pacientes con enfermedad de Méniere bilateral y aunque los estudios de genes candidatos encontraron que la enfermedad bilateral estaba asociada con variantes alélicas de los genes HLA-DRB1, y PTPN22, estos hallazgos no han sido replicados en nuestro estudio que incluye 357

ES26 11759Al

pacientes con enfermedad de Méniere bilateral y es la mayor muestra estudiada hasta la fecha de hoy.

En general, los datos indican que variantes alélicas en algunos genes de la respuesta

inmune innata como TLRlO y NFKBl podrían actuar como genes reguladores capaces de S modificar la progresión clínica de la hipoacusia en la enfermedad de Meniere.

Tabla 2: Resultados de la replicación y del meta-análisis. Cohorte-IC (genotipado por ImmunoChip): 161 casos/898 controles. Cohorte-TO (genotipado por Taqman): 218 ca505/896 controles. Meta-análisis-IC+TQ: 357 ca505/ 1794 controles.

CASOS CONTROLES P _VALUE CR (95%)

rs4988957

chr2:102351615

rs11465670 chr2:102417980

rs4851589 chr2:102460685

rs9380217 chr6:31083776

rs4947296 chr6:31090401

rs886424 chr6:30814225

rs1150754 chr6:32082981

le

TQ

IC+TQ

le

TQ

IC+TQ

le

TQ

IC+TQ

le

TQ

IC+TQ

le

TQ

IC+TQ

le

TQ

IC+TQ

le

TQ

IC+TQ

0,4141 0,3801 0,4065

0,1564 0,0867 0,1203

0,3374 0,2474 0,2988

0,1389 0,1052 0,1291

0,1366 0,1071 0,1288

0,1019 0,0818 0,0949

0,1166 0,0892 0,0963 0,3576 0,3549 0,3503

0,0928 0,0831 0,0872

0,2792 0,2578 0,2665

0,0734 0,0767 0,0732

0,0716 0,0792 0,0741

0,0509 0,0703 0,0673

0,0607 0,0671 0,0706

27

5,24E-02 1,8SE-Ol 2,91E-03

5,02E-04 4,41E-0l 4,52E-03

3,35E-02 3,61E-01 4,53E-02

9,30E-05 3,52E-02 1,OOE-06

8,83E-05 4,73E-02 4,OOE-06

3,55E-04 2,S5E-Ol 7,73E-03

2,66E-04 2,35E-Ol 1,34E-02

1,27(0,997-1,617) 1,071 (0,930-1,233) 1,160(1,049-1,831)

1,812(1,291-2,543) 1,043(0,731-1,489) 1,380(1,099-1,734)

1,315(1,021-1,693) 0,960(0,794-1,160) 1,121 (0,988-1,272)

2,034(1,416-2,923) 1,371 (0,998-1,884) 1,763(1,411-2,202)

2,05( 1,423-2,954) 1,352(0,976-1,874) 1,741(1,388-2,185)

2,111(1,389-3,208) 1,143(0,807-1,619) 1,410(1,086-1,832)

2,04( 1,381-3,014) 1,159(0,813-1,653) 1,364(1,053-1,765)

ES2611759Al

Tabla 3: Modelo de regresión que presenta las siguientes variables independientes: enfermedad autoinmune, las variantes alelicas de rs9380217 y rs886424 (Hosmerlemeshow test, p=O.980)

B S.E. Wald Exp(B) 95% C.lJor EXP(B) p value

lower: Upper

rs9380217: 0,765 0,181 17,884 2,149 1,508 3,064 2,30E-OS

rs8864Z4: 0,584 0,202 8,358 1,793 1,207 2,664 4,OOE-03

Historia: de enfermedad 0,522 0,197 6,996 1,685 1,145 2,48 8,OOE-03

autoinmune

Tabla 4: Frecuencias genotípicas, odd ratios (OR) con intervalo de confianza (le) del 95% y tamaño de muestra (N) de las variantes rs9380217, rs4947296 y rs886424 .

1rs9380217: CONTROL (N=1613) CASO (N=335) CONTROL (N=1410) CASO (N=266)

ee: 0,866 (1397) 0,77 (258) ee 0,991 (1397) 0,97 (258)

CT: 0,134 (216) 0,23 (77) TT 0,009 (13) 0,03 (8)

OR (95% CI)-_1,930 (1,441 2,585) OR (95% CI)_ -3,332(1,3978,120)

p-value = 8,OOE-06 p-value=5,OOE-3

CONTROl (N=1613)

CASO (N=335)

CONTROl (N=1410)

CASO (N=266)

Irs4947296

TT

0,861 (1396)

0,77 (258)

TT

0,991 (1396)

0,97 (258)

CT

0,134 (217)

0,23 (77)

ee

0,009 (13)

0,03 (8)

-

OR (95% CI)-_1,920 (1,434 2,571) OR (95% CI)_3,332(1,397_8,120)

p-value = 8,OOE-06 p-value=5,OOE-3

CONTROL (N=1618)

CASO (N=339)

CONTROL (N=1423)

CASO (N=286)

Irs8864Z4

ee

0,875 (1415)

0,832 (282)

ee

0,994 (1415)

0,986 (282)

CT

0,125 (203)

0,168 (57)

TT

0,006 (8)

0,014 (4)

OR (95% CI)-1-,409 (1,023-1,941) OR (95% CI)-2,509(0,75-8,388)

p-value = 3,50E-02 p-value=0,122

Ejemplo 2. Perfil de expresión génica en células mononucleares condicionadas por el

haplotipo de riesgo/protector.

Se ha comparado el perfil de expresión génica en células mononucleares obtenidas de 5

pacientes y un control en base al haplotipo definido por los SNPs r59380217 y r54947296 ( S ver t abla S), utilizando ellllumina Gene expression array.

Tabla 5. Individuos seleccionados y sus correspondientes haplotipos, para llevar a cabo el perfil de expresión génica en células mononucleares utilizando el IlIumina Gene expression array.

HAPlOTlPO

SAMPlE rs9380217 rs4947296 Control ce TT Casal ce TT Casa2 ce TT Caso3 TT ce Caso4 TT ce CasoS TT ce

Posteriormente con los genes que mostraban expresión diferencial en base al haplotipo se

realizó un análisis de redes de interacción génica mediante el software bioinformático IPA (Ingenuity Pathway Analysis) y se identificaron varias rutas (Figura 5 y 6). La vía del inductor débil de apoptosis similar al factor de necrosis tumoral (TWEAK)/Fn14 fue 15 significativamente asociada, con 11 genes (32% de los genes de la ruta TWEAK/Fn14) que se encuentran sobre o infra-expresados. (p=3.8x10-8). También se encuentra asociada la vía de ubiquitinación de proteínas con 30 genes implicados (12% de los genes de la ruta;

p=7.9xlO-8).

Los genes que mostraban expresión diferencial en la vía TWEAK/Fn14 (NFKB1, Fn14,

20 BIRC2, FADD,NFKBIE y FOs) fueron validados por PCR en tiempo real (qPCR) (Tabla 6 y figura 7).

Tabla 6. Correlación entre los resultados de expresión génica obtenidos por array y su validación por qPCR.

qPCR EKpression Array

GEN: Fold Change p-value Fold Change p-value

NKFBl: 2,19 3,53E-04 2,62 2,47E-04

FN14: 1,78 2,06E-03 2,75 6,4IE-03

BIRC2: 1,66 8,56E-03 2,86 1,OSE-03

FOS: -2,27 2,57E-02 -2,46 2,17E-03

FADO: 1,70 2,57E-02 2,45 2,35E-03

NFKBI E: 4,81 3,98E-04 2,30 1,97E-03

Niveles elevados de TWEAK V/o Fn14 se han asociado con otras patologías autoinmunes

5 como artritis reumatoide, lupus eritromatoso sistémico y esclerosis múltiple.

En base a estos resultados se propone el uso de una composición farmacéutica que comprende un agente bloqueante de la vía TWEAK/ Fn14, tal y como una anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse al ligando TWEAK (NF-related weak inducer of apoptosis) o bien un anticuerpo o un fragmento de mismo capaz de unirse a Fn-14

10 (receptor de TWEAK), para tratar o reducir la gravedad o los efectos de pacientes que sufren hipoacusia neurosensorial, y especialmente de aquellos que presentan la enfermedad de Méniere con afectación bilateral.

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Uso in vitro de la presencia de la variante de nucleótido simple rs9380217 del cromosoma 6, cuya posición en el genoma humano (GRCh38jhg38) es la 31083776, en una muestra biológica aislada de un individuo, como indicador para el

pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial.
2. El uso in vitro según la reivindicación 1, que adicionalmente utiliza como indicador para el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial la

variante de nucleótido simple rs886424 del cromosoma 6, cuya posición en el

genoma humano (GRCh38/hg38) es la 30814225, en una muestra biológica aislada

de un individuo.
3. El uso in vitre según la reivindicación 1 o 2, que adicionalmente utiliza como indicador para el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial la variante de nucleótido simple rs4947296 del cromosoma 6, cuya posición en el genoma humano (GRCh38/hg38) es la 31090401, en una muestra biológica aislada de un individuo.
4.-Método de obtención de datos útiles para el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial en un individuo afectado por dicha enfermedad, que comprende:

a) detectar la presencia in vitro de la variante de nucleótido simple rs9380217 del cromosoma 6, cuya posición en el genoma humano (GRCh38/hg38) es la 31083776, en una muestra biológica aislada de dicho individuo.
5. El método según la reivindicación 4, donde adicionalmente se detecta la presencia in vitro de cualquiera de los indicadores seleccionados de la lista que comprende:

a) la variante de nucleótido simple rs886424 del cromosoma 6, cuya posición en el genoma humano (GRCh38/hg38) es la 30814225, en una muestra biológica aislada de dicho individuo; y/o

b) la variante de nucleótido simple rs4947296 del cromosoma 6, cuya posición en el genoma humano (GRCh38/hg38) es la 31090401, en una muestra biológica aislada de dicho individuo.
6.-Método pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial unilateral en un individuo afectado por dicha enfermedad, que comprende la detección de la presencia de la variante definida en la reivindicación 4, y que además comprende:

b) clasificar al individuo en el grupo de individuos con progresión hacia

enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial bilateral cuando

presenta el alelo con menor frecuencia en homocigosis para rs9380217 de

forma que dicho individuo presente el genotipo TI para rs9380217.
7.-Método pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial unilateral en un individuo afectado por dicha enfermedad según la reivindicación 6,

que además comprende la detección de la presencia de cualquiera de las va riantes

definidas en la reivindicación SA V/o 56, y donde se clasifica al individuo en el grupo

de individuos con progresión hacia enfermedad que cursa con hipoacusia

neurosensorial bilateral cuando presenta el alelo con menor frecuencia en homocigosis para rs4947296 de forma que dicho individuo presente el genotipo ee para rs4947296 y/o cuando presenta el alelo con menor frecuencia en homocigosis para rs886424 de forma que dicho individuo presente el genotipo TI para rs886424.
8.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere o la enfermedad autoinmune del oído interno.
9.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, donde la muestra aislada es el ADN genómico obtenido de sangre periférica.
10.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, donde el individuo pertenece a una población de ascendencia europea, y más preferiblemente de ascendencia española.
11.-El método según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde la hipoacusia neurosensorial es unilateral.
12.-Método para clasificar un individuo que padece o tiene probabilidad de padecer una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial, preferiblemente la enfermedad de Méniere o la enfermedad autoinmune del oído interno, en uno de dos grupos, en el que el grupo 1 comprende los individuos identificables mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7 como individuos con progresión hacia enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial bilateral, y

en el que el grupo 2 representa el resto de individuos.
13.-Un kit o dispositivo, preferiblemente un microarray de dos canales, un chip de oligonucleótidos de ADN, un GeneChip o un chip de ADN para genotipado, adecuado para llevar a cabo el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, que comprende una superficie sólida, preferiblemente de vidrio, plástico o silicio, al que se la une o diseña al menos un oligonucleótido complementario a la secuencia SEQ ID NO: 1 o a un fragmento de la misma que comprenda la variante de nucleótido simple para rs9380217 y opcionalmente oligonucleótidos

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complementarios a las secuencias SEQ ID NO: 2 V/o SEQ ID NO: 3 o fragmentos de

las mismas que comprendan la variante de nucleótido simple para rs4947296 V/o para rs88642414.
14. El kit según las reivindicación 13, donde dicho kit es un microarray que

5 comprende oligonuleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de las

secuencia nucleotídica descritas en la reivindicación 13.
15. El kit o dispositivo según la reivindicación 13, donde kit es un chip de AON para genotipado.
16.-Uso in vitro de un kit o un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones

lOBa 15, para el pronóstico de una enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial.
17.-El uso de un kit o un dispositivo según la reivindicación anterior, donde la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere

o la enfermedad autoinmune del oído interno.

15 18.-El uso de un kit o un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, donde la enfermedad que cursa con hipoacusia neurosensorial es la enfermedad de Méniere.
19.-El uso de un kit dispositivo según las reivindicaciones 16 a 18, donde la hipoacusia neurosensorial es unilateral.

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