ES2337115B2 - Metodo para la deteccion del riesgo de desarrollar vitreorretinopatiaproliferante (vrp). - Google Patents

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Abstract

Método para la detección del riesgo de desarrollar vitreorretinopatía proliferante (VRP).
La presente invención se refiere a un método que permite identificar el riesgo de desarrollar vitreorretinopatía proliferante en aquéllas personas que son sometidas a cirugías oculares. Más concretamente, el método se basa en la detección de una serie de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP: "single nucleotide polymorphisms") o grupos de SNPs (Haplotipos) que predisponen al desarrollo de la enfermedad.

Description

Método para la detección del riesgo de desarrollar vitreorretinopatía proliferante (VRP).
La presente invención se refiere a un método que permite identificar el riesgo de desarrollar vitreorretinopatía proliferante en aquéllas personas que son sometidas a cirugías oculares. Más concretamente, el método se basa en la detección de una serie de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP: "single nucleotide polymorphisms") o grupos de SNPs (Haplotipos) que predisponen al desarrollo de la enfermedad.
Estado de la técnica
La vitreorretinopatía proliferante (VRP) es una respuesta cicatrizal anómala, que constituye la causa más frecuente del fracaso de la cirugía de desprendimiento de retina (DR) y para la que, a pesar de los avances que ha vivido la oftalmología en las últimas décadas, aún siguen sin conocerse sus causas o los factores que predisponen a la misma.
Desde hace más de 20 años se han realizado importantes esfuerzos para conocer factores predictores del riesgo de sufrir esta complicación, en un intento por identificar a los pacientes que se beneficiarían de terapias más específicas o para mejorar la comprensión de los mecanismos intrínsecos que provocan esta complicación.
Hasta el momento, todos los trabajos en esta línea se han desarrollado en base al análisis de las características clínicas de los pacientes con DR con y sin VRP, y los modelos predictivos establecidos en función de éstas variables, aunque explican parcialmente el riesgo de desarrollar esta complicación, son incapaces de aportar un análisis con valores de sensibilidad y especificidad satisfactorios.
En 2006 Sanabria et al realizaron un estudio piloto sobre el componente genético en el desarrollo de la VRP, encontrándose una distribución diferente de los (SNP) estudiados en los codones 10 y 25 del Transforming Growth Factor beta 1 (TGF-beta1) entre los pacientes con y sin VRP, lo que les llevó a concluir que éstos podrían conferir una mayor susceptibilidad a presentar esta complicación (Sanabria Ruiz-Colmenares et al. Acta Ophthalmol Scand. Jun; 84(3):309-13 (2006)). Sin embargo, estos resultados no consiguen demostrar en absoluto existencia de factores genéticos que predispongan al desarrollo de VRP, puesto que el escaso tamaño muestral de ese trabajo no permite utilizar las herramientas estadísticas adecuadas para el análisis de datos genéticos.
La confirmación de la contribución genética de un individuo a presentar una mayor susceptibilidad para el desarrollo de la VRP y, así como, la identificación del perfil genético que confiere ese incremento del riesgo, permitiría la apertura de nuevas posibilidades de tratamiento enfocados hacia el desarrollo de terapias más personalizadas.
Breve descripción de la invención
Los autores de la presente invención han conseguido demostrar, sorprendentemente, la presencia de factores genéticos que predisponen al desarrollo de VRP. El análisis de estos factores genéticos, vendrán a completar los estudios de aquéllos factores clínicos que en la actualidad ya se emplean para determinar el riesgo que un determinado sujeto tiene a padecer VRP tras una intervención ocular.
Tal y como informa el articulo publicado en 2005 de Nature Genetics (Nat. Genet 37:1299-1300), aunque muchos de los 7 millones de SNPs que se conocen tienen unas frecuencias superiores al 5%, en la actualidad no existen herramientas que permitan llevar a cabo el análisis en bloque de todos ellos. Este hecho, que supone la dificultad de hacer un estudio genético completo, unido al desconocimiento acerca de qué genes podrían estar relacionados con la VRP llevó a la necesidad de llevar a cabo la selección de todos aquellos genes que a priori pudiesen, de algún modo, estar relacionados con la complicación.
Para la selección de los marcadores, fue necesaria la formulación de una hipótesis de partida que planteó la posibilidad de que algunos marcadores de genes de citoquinas, factores nucleares y factores de crecimiento involucrados en la inflamación y en procesos fibróticos, así como los intermediarios correspondientes de las vías de señalización, pudieran estar presentes de forma significativa en pacientes que hubiesen desarrollado VRP tras un DR.
Así, se seleccionaron para el análisis 30 genes candidatos involucrados en los diferentes mecanismos implicados en la inflamación y en procesos profibróticos en general, que se detallan a continuación:
El TNF, TNFR2, TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD7, IFNG, IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL8, IL10, NFKB1, NFKBIA, NFKBIB, HGF, CTGF, PDGF, PDGFRA, PI3K, EGF, FGF2, MIF, MMP2, MMP9, MCP1, IGF-11, IGF2, IGF-IR.
El gen del TNF\alpha está ubicado en el cromosoma 6, dentro de una región en medio del complejo mayor de histocompatibilidad. Los genes ubicados en esta región presentan un alto desequilibrio de ligamiento, de forma tal que los marcadores estudiados en un gen señalan a otros marcadores en otros genes dentro de la región. Se considera además que la mayoría regula la expresión del TNF\alpha. De esta forma, se ha descrito esta región como TNF block (bloque del TNF). El bloque del TNF está compuesto por los siguientes genes: los llamados genes del TNF (TNF\alpha; LTA; LTB), el gen del AIF1, el gen del NCR3, el gen del NFKBIL1, el gen del ATP6P1G, y el gen del BAT1. (Allcock, R. J. N.; Windsor, L.; Gut, I. G.; Kucharzak, R.; Sobre, L.; Lechner, D.; Garnier, J.-G.; Baltic, S.; Christiansen, F. T.; Price, P. High-density SNP genotyping defines 17 distinct haplotypes of the TNF block in the Caucasian population: implications for haplotype tagging. Hum. Mutat. 24: 517-525, 2004). En el presente trabajo se han incluido marcadores ubicados en los genes que componen este bloque y se han denominado indistintamente TNF.
A partir de estos genes, se seleccionaron un total de 230 de SNPs, que se encontraban distribuidos entre los 30 genes candidatos mencionados anteriormente y que se analizaron para un total de 450 muestras. De todos los SNPs analizados únicamente aquéllos localizados en los genes SMAD7, TNF, PIK3CG y TNFR2 presentaron una asociación significativa con la VRP, una vez analizados un total de 88.650 polimorfismos para el total de muestras. Estos resultados demuestran la existencia de factores genéticos que predisponen al desarrollo de VRP y, más concretamente, la asociación de determinados genes con la complicación.
En una segunda fase, y a partir de los modelos estadísticos se identificaron combinaciones de SNPs que permiten evaluar el riesgo de desarrollar una VRP en un paciente nuevo. Se identificaron modelos predictivos de 2,10 y 42 SNP.
\vskip1.000000\baselineskip
Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para la determinación del riesgo de desarrollar VRP (en adelante, método de la invención) que comprende identificar en una muestra la presencia de factores de riesgo o la ausencia de factores de protección de cualquiera de los marcadores seleccionados del siguiente grupo de marcadores genéticos:
i)
Marcadores ubicados en el gen SMAD7,
ii)
Marcadores ubicados en el gen TNF,
iii)
Marcadores ubicados en el gen PIK3CG,
iv)
Marcadores ubicados en el gen TNFR2,
v)
marcadores ligados a cualquiera de los marcadores anteriores, preferentemente con un desequilibrio de ligamiento (r^{2}) mayor o igual 0.70, 0.80 ó 0.90 y más preferentemente ubicados en el mismo gen. Los marcadores ubicados en los mencionados genes son, preferentemente, SNPs que pueden ser seleccionados, sin ninguna limitación, de las bases de datos dbSNP, HapMap, etc.
donde la presencia de al menos uno de los de los marcadores i-v es indicativa de la existencia de un mayor o menor riesgo a desarrollar VRP.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de este aspecto de la invención, los marcadores ubicados en los genes SMAD7, TNF, PIK3CG, TNFR2 pueden ser seleccionados del grupo que comprende, sin ningún tipo de limitación, SNPs, microsatélites, minisatélites, inserciones, deleciones, variaciones del numero de copias, inversiones y traslocaciones, donde dichos marcadores pueden ser analizados mediante técnicas sobradamente conocidas en el estado de la técnica (Nat Rev Genet. 2001 Dec; 2(12):930-42, Forensic Sci. Int. (2005) 154: 181-194, Nature. 2006, 444(7118):444-54, PCR Methods Appl. 3:13-22, 1993, etc).
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la presente invención los marcadores genéticos ubicados en los genes SMAD7, TNF, PIK3CG, TNFR2 son seleccionados respectivamente del grupo que comprende:
i)
rs7226855 (tabla 2),
ii)
rs2229094, rs2256974, rs2857706 (tabla 2) y haplotipos de TNF seleccionados de la tabla 3.
iii)
El haplotipo seleccionado de la tabla 3 (PIK3CG).
iv)
El haplotipo seleccionado de la tabla 3 (TNFR2), ó
v)
Marcadores ligados a cualquiera de los marcadores anteriores, preferentemente con un desequilibrio de ligamiento (r^{2}) entre marcadores de r^{2} mayor o igual 0.70, y más preferentemente SNPs que pueden ser seleccionados, sin ninguna limitación, de las bases de datos dbSNP, HapMap, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención el método comprende las etapas de:
i)
Extracción y purificación de material genético (genómico o mitocondrial) a partir de una muestra,
ii)
Amplificación de al menos uno de los marcadores mencionados anteriormente,
iii)
Identificación de los marcadores mediante técnicas sobradamente conocidas en el estado de la técnica.
iv)
Determinación del riesgo a desarrollar VRP.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos necesarios para llevar a cabo la amplificación de los marcadores genéticos pueden ser desarrollados, sin ningún tipo de limitación, a partir la información disponible en bases de datos tales como EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk) o NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) y programas informáticos tales como Primer 3, Assay Design 3.0, entre otros.
En una realización preferida de la invención el método de la invención puede estar automatizado empleando cualquiera de las técnicas seleccionadas del grupo de sistemas que comprende, sin ningún tipo de limitación: MassArray system de SequenomTM, SNPlex genotipyng system de Applied Biosystems, GenomeLab SNPstream system, entre otros.
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Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método para la determinación del riesgo de desarrollar VRP que comprende los siguientes pasos:
a.
Extraer el material genético de una muestra biológica aislada.
b.
Genotipar al menos un SNP ubicado en al menos uno de los genes seleccionados del grupo que comprende: TNF, TNFR2, TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD7, IFNG, IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL8, IL10, NFKB1, NFKBIA, NFKBIB, HGF, CTGF, PDGF, PDGFRA, PI3K, EGF, FGF2, MIF, MMP2, MMP9, MCP1, IGF-11, IGF2, IGF-IR, preferentemente seleccionados de cualquiera de las tablas 1 y 8.
c.
Seleccionar al menos un SNP del paso 2 a partir de procedimientos basados en la minimización del error de predicción.
d. \hskip0.5cm i)
Introducir los datos de genotipado de los SNPs seleccionados en el paso c) de una muestra problema en un modelo ajustado mediante la aplicación de la técnica Random Forest, ó
ii)
Introducir los datos de genotipado de los SNPs seleccionados en el paso c) de una muestra problema en un modelo ajustado mediante la aplicación de cualquiera de las técnicas Support Vector Machines con kernel lineal ó Support Vector Machines con Kernel radial.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida de este aspecto de la invención, los SNPs genotipados de cada uno de los genes del paso b deben formar un conjunto mínimo de SNPs representativos, localizados en un determinado gen o región capaces de caracterizar a dicho gen/región. La selección de este conjunto implica la eliminación de aquellos SNPs que proporcionan información redundante debido al alto desequilibrio de ligamiento respecto del conjunto de SNPs elegido.
En una realización preferida de este segundo aspecto de la invención en el paso b) se genotipa al menos un SNP o conjunto mínimo de SNPs donde dicho SNPs son TagSNPs y/o están ubicado en exones o regiones promotoras del gen.
En una más realización también preferida de este aspecto de la invención en el paso b) se genotipan al menos dos SNPs que se encuentran en bloques de desequilibrio diferentes, y más preferentemente en genes distintos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización todavía más preferida de este aspecto de la invención en el paso c) la selección del los SNPs del paso 2 (SNPs más informativos) se realiza por cualquiera por cualquiera de los siguientes procedimientos:
a.
un procedimiento basado en la búsqueda exhaustiva del mejor subconjunto de SNPs
b.
un procedimiento basado en la búsqueda secuencial partiendo del subconjunto formado por todos los SNPs del paso 2 y desestimando progresivamente aquellos SNPs cuya eliminación del modelo no proporciona un menor error de predicción (Díaz-Uriarte R. y Álvarez de Andrés S. (2006). BMC Bioinformatics 2006, 7:3 doi:10.1186/1471-2105-7-3)
c.
un procedimiento basado en la búsqueda secuencial partiendo del subconjunto formado por un único SNP y seleccionando progresivamente aquellos SNPs del paso 2 cuya incorporación al modelo proporciona un menor error de predicción.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención los SNPs de los genes TNF, TNFR2, TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD7, IFNG, IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL8, IL10, NFKB1, NFKBIA, NFKBIB, HGF, CTGF, PDGF, PDGFRA, PI3K, EGF, FGF2, MIF, MMP2, MMP9, MCP1, IGF-11, IGF2, IGF-IR son seleccionados de la tabla 8 y, en una realización preferida los genes seleccionados del paso c) son aquellos presentados en cualquiera de las tablas 4, 5 o 6.
Un tercer aspecto de la invención proporciona un Kit (en adelante kit de la invención) para determinar el riesgo de desarrollar VRP que comprende medios capaces de llevar a cabo la reacción de detección de los marcadores genéticos ubicados en los genes SMAD7, TNF, PIK3CG, TNFR2. Dichos medios de detección pueden comprender, sin ningún tipo de limitación, oligonucleótidos, enzimas (polimerasas, enzimas de restricción, etc.), tampones, dNTPs, y cualquier otro reactivo requerido para la puesta a punto del kit.
Breve descripción de las figuras
Figura 1.- Cada punto representa el número de SNPs frente a la estimación de error que se comete al clasificar a los individuos utilizando cada SNP para cada modelo. El error de predicción mejora a medida añadimos SNPs al modelo, hasta alcanzar un punto en el que, mientras más SNPs se utilizan, peor es la predicción.
Figura 2. Cada punto representa el número de SNPs frente a la estimación de error que se comete al clasificar a los individuos utilizando cada SNP para cada modelo. El error de predicción mejora a medida añadimos SNPs al modelo, hasta alcanzar un punto en el que, mientras más SNPs se utilizan, peor es la predicción.
Figura 3. Curvas ROC. Establece la capacidad de predicción del modelo. Cuanto más se aleje de la diagonal (hacia arriba), mejor capacidad de predicción tiene el modelo.
Descripción detallada de la invención
A continuación se presentan una serie de ensayos realizados por los inventores, cuya finalidad es ilustrar y poner de manifiesto la especificidad y efectividad de la invención, no suponiendo en ningún caso una limitación a la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
1.- Selección de genes candidatos
La selección de genes candidatos se realizó en función de la información disponible sobre patologías inflamatorias o profibróticas. Para ello se realizó una extensa busqueda bibliográfica en las bases de datos públicas PubMed y OMIM (www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/), que llevó a la selección de los siguientes 30 genes:
TNF, TNFR2, TGFB1, TGFB2, SMAD3, SMAD7, IFNG, IL1A, IL1B, IL1RN, IL6, IL8, IL10, NFKB1, NFKBIA, NFKBIB, HGF, CTGF, PDGF, PDGFRA, PI3K, EGF, FGF2, MIF, MMP2, MMP9, MCP1, IGF-11, IGF2, IGF-IR
\vskip1.000000\baselineskip
2.- Selección de SNPs
La búsqueda y selección de los polimorfismos se realizó utilizando las bases de datos públicas, como dbSNP o HapMap. Se seleccionaron aquellos polimorfismos que fueran bialélicos, como la mayoría de los SNPs, y aquellas deleciones que no superaran las 6 pares de bases.
Para la selección se tuvieron en cuenta los siguientes criterios:
\sqbullet
\vtcortauna La localización en el gen: se priorizaron los SNPs en regiones promotoras y exónicas que provoquen un cambio no sinónimo en la transcripción del gen.
\sqbullet
\vtcortauna Los bloques de desequilibrio de ligamiento: en función de la información disponible en el proyecto HapMap (www.hapmap.org), se priorizaron los TagSNPs o polimorfismos en diferentes bloques de desequilibrio.
\sqbullet
\vtcortauna La frecuencia alélica: se priorizaron los polimorfismos con una frecuencia del alelo menor superior al 10% en Caucásicos.
\sqbullet
\vtcortauna los SNPs descritos en la literatura en relación a patologías inflamatorias o profibróticas.
En función de los criterios utilizados se preselecionaron 230 polimorfismos, distribuidos entre los 30 genes candidatos, que de algún modo podría estar relacionados con la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
3.- Selección de pacientes, materiales y métodos
Los pacientes, seleccionados a partir de centros de referencia ubicados en 5 comunidades autónomas españolas diferentes, se clasificaron según las características clínicas que presentaban en el momento de su inclusión en el estudio, siendo asignados en los grupos caso o control:
Para el grupo VRP (casos) se incluyeron pacientes con DR primario que tuviesen una o más de las siguientes características:
\bullet
\vtcortauna Pliegues fijos en uno o más cuadrantes causados por membranas epirretinianas.
\bullet
\vtcortauna Cuadros de VRP anterior según la modificación propuesta por Machemer y col sobre la establecida por el Retina Society Committee en 1983 (2).
\bullet
\vtcortauna Áreas de acortamiento retiniano que precisen retinotomías de descarga y/o retinectomías para poder reaplicar la retina durante la vitrectomía por pars plana (VPP).
Para el grupo DR (controles) se incluyeron pacientes con DR primario que tras 3 meses de seguimiento no hubiesen desarrollado una VRP.
Esta clasificación fenotípica de los pacientes fue efectuada por cada investigador de acuerdo a los criterios clínicos mencionados.
\vskip1.000000\baselineskip
4.- Selección del tamaño muestral
Se calculó el tamaño muestral adecuado teniendo en cuenta la incidencia de la VRP en el entorno. Según la fórmula de tamaño muestral para muestras de distinto tamaño, considerando como casos a los pacientes con VRP y controles a los pacientes con DR, se estimó necesario recoger muestras de 150 casos de VRP y 300 DR. Con ese tamaño muestral se tendría una potencia del 90% para detectar diferencias significativas entre los grupos caso y control.
\vskip1.000000\baselineskip
5.- Recolección de muestras y procesado de las muestras
La toma de muestra se realizó a partir de sangre periférica, extrayendo 6 mi de cada uno de los pacientes incluido en el estudio que se conservaron en tubos de plástico con EDTA a 4ºC. Los envíos de las muestras desde los diferentes centros implicados en el estudio se enviaron al Laboratorio de Biología Molecular del IOBA a temperatura ambiente, una vez por semana.
A medida que se recibieron las muestras de sangre periférica, se realizó la extracción de ADN según el protocolo que se detalla en el kit comercial REAL Kit para extracción de DNA de sangre periférica SSS ref: RBM02.
Las muestras de ADN se almacenaron en tubos Eppendorf a -20ºC, identificados con el código de barras correspondiente. La cuantificación del ADN se realizó con la técnica de real time-PCR. En aquellos casos en los que hubo alguna duda sobre la pureza de la muestra se llevó a cabo la verificación mediante espectrofotometría. Para ello se utilizó el espectrofotómetro BioPhotometer, de la casa Eppendorf y se tomó como punto de corte de índice de pureza de la muestra 1,6.
Una vez extraído el ADN de todas las muestras se enviaron al Centro Nacional de Genotipado de Santiago de Compostela, donde se realizó el genotipado de las mismas.
Las muestras de ADN se remitieron al centro de genotipado en placas de 96 pocilios debidamente numeradas y selladas, en concentraciones de 100 ng/ul y con un volumen de 50 ul cada uno.
\vskip1.000000\baselineskip
6.- Genotipado de las muestras
El genotipado de las muestras se llevó a cabo de forma enmascarada y tanto lo casos como los controles se analizaron simultáneamente y bajo las mismas condiciones. Se utilizó para este proceso una plataforma de alto rendimiento (SNPlex genotyping System de Applied Biosystems).
\vskip1.000000\baselineskip
7.- Análisis estadístico de los resultados 7.1. Establecimiento de asociaciones significativas
Se estimaron las frecuencias alélicas y genotípicas, y se verificó el equilibrio de Hardy-Weinberg tanto en la muestra global como en los controles.
Se establecieron las asociaciones nominales de los diferentes SNPs con los grupos control y enfermedad utilizando los modelos de chi-cuadrado y el Test exacto de Fisher y se ajustaron modelos de regresión logística para elegir el mejor modelo de herencia para cada SNP. Como cada individuo posee 2 alelos y el riesgo puede depender de cada uno de los ellos, se definieron 5 modelos de herencia: co-dominante, en donde cada alelo aporta un riesgo independiente; dominante, en donde una copia del alelo en cuestión es suficiente para modificar el riesgo (homocigoto para ese alelo y heterocigoto tienen el mismo riesgo); recesivo, son necesarias 2 copias del alelo para modificar el riesgo; sobre-dominante, es decir, ser heterocigoto es un riesgo, y aditivo, en donde cada copia del alelo involucrado modifica el riesgo, de manera que ser homocigoto para ese alelo implica el doble de riesgo.
Se identificaron los posibles haplotipos consistentes con los datos observados en la muestra, considerando conjuntos formados por todos los SNPs estudiados por gen y subconjuntos de alelos consecutivos de tamaño 2 hasta tantos marcadores estudiados en cada gen menos 1. Se estimaron las frecuencias haplotípicas en la muestra total y en cada grupo por separado utilizando el algoritmo EM. Se utilizó un estadístico score para contrastar la asociación entre los haplotipos y el estado caso/control de la muestra. Para este análisis también se ajustaron modelos de herencia: en este caso aditivo, recesivo y dominante.
Estos resultados se corrigieron utilizando el método corrección para comparaciones múltiples en dos pasos propuesto por Rosemberg (Rosenberg P.S. et al. (2006) Che A., Chen B.E. Statist Med, 25: 3134-49), en el que en un primer paso cada asociación de un gen con la enfermedad se resume utilizando un único p-valor que combina los análisis de SNPs simples y de bloques haplotípicos y en una segunda etapa estos p-valores por gen, se ajustan controlando la tasa de falsos descubrimientos (False Discovery Rate, FDR) utilizando el q-valor (Storey J.D. et al (2003). Annals of Statistics, 31: 2013-35).
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Resultados
En la toma de muestras se recogieron finalmente un total de 450 muestras, 312 del grupo control y 138 del grupo casos, entre los diferentes centros incluidos en el estudio. Una vez reunidas todas las muestras y hecha la extracción y cuantificación del DNA genómico, se realizó el genotipado de las mismas. Todas las muestras pudieron ser analizadas.
De los SNPs seleccionados para su estudio, 6 no pudieron ser estudiados por problemas en el diseño de los oligonucleótidos y 27 no pudieron ser estudiados por fallos en el procedimiento de genotipado. Se estudiaron pues 197 SNPs por muestra, lo que supuso un total de 88.650 polimorfismos.
Para todos los polimorfismos se verificó que cumplían con el equilibrio de Hardy-Weinberg tanto en la muestra global como en el grupo control y casos, excepto el rs4916944 del PDGFA, por lo que éste también fue eliminado del análisis. Además, también se estimaron las frecuencias genotípicas para cada polimorfismo.
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Asociaciones significativas \bullet Asociaciones simples
Se analizaron las asociaciones de cada SNP por separado con el estado caso- control y de acuerdo al modelo de herencia que mejor explica la distribución de genotipos que existen en la muestra. Se encontraron un total de 22 asociaciones significativas distribuidas en 15 genes diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Asociaciones múltiples
Todos los bloques haplotípicos analizados verificaron el desequilibrio, es decir, los alelos no se comportaron con independencia entre si. Del análisis global de los haplotipos completos de cada gen consistentes con la muestra (formados por todos los alelos estudiados en cada gen) se observó que existía una asociación significativa con el estado caso/control para los 4 de los 30 genes estudiados.
Además se analizó qué ocurre con los haplotipos formados por subconjuntos de alelos consecutivos de tamaño 2 hasta tantos marcadores como se hubiesen estudiado por gen menos 1. Así, se encontraron también asociaciones significativas de haplotipos consistentes con la muestra en 11 genes.
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Corrección para comparaciones múltiples
Fijando el nivel de FDR (False Discovery Rate) (Benjamini, et al. (1995). Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Múltiple Testing. J Roy Stat. Soc. (Ser B) 57: p.289-300), es decir, la proporción de falsos positivos esperados entre los contrastes que resultaron significativos, en 5%, se encontraron 4 genes significativamente asociados con el estado caso/control: el PIK3CG (p-valor: 0,009; q-valor: 0,03), el SMAD7 (p-valor: 0,004; q-valor:0,0250), el TNF (p-valor: 0,005; q-valor: 0,0250), y el TNFR2 (p-valor: 0,019; q-valor: 0,0475).
Este paso de corrección de los resultados obtenidos previamente es imprescindible para establecer la asociación significativa de un gen o un marcador genético con una determinada enfermedad, ya que de no aplicarse las asociaciones obtenidas a priori podrían ser erróneas. En el presente estudio la aplicación de esta corrección supuso el descarte de más del 70% de los genes candidatos iniciales.
1
Tabla de genes que resultan significativos con el estado caso/control tras la corrección FDR para comparaciones múltiples.
En las tablas 2 a 3 se muestran las asociaciones simples y múltiples de genes de la tabla 1 que resultaron estar significativamente asociados con la enfermedad.
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7.2. Modelos predictivos
En esta segunda fase y a partir de los modelos estadísticos, se identificaron combinaciones de SNPs que permiten evaluar el riesgo de desarrollar una VRP en un paciente nuevo. Se identificaron modelos predictivos de 2, 10 y 42 SNP.
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Determinación de los SNPs predictivos
Se mide la correlación del SNP con la presencia o no de VRP usando lo que se conoce como "ganancia de información" (IG, Information Gain) ((Cover T.M., Thomas J.A. (1991). Elements of information theory. New York: John Wiley): técnica de aprendizaje automatizado (machine learning) que consiste en conseguir reducir la entropía como consecuencia de realizar una división en los datos. La entropía, que denotamos por H, es una medida del grado de incertidumbre que existe sobre un conjunto de datos.
En nuestro contexto, dado un SNP concreto consideramos dos variables, X = {AA,aa,Aa} que representa el genotipo observado e Y = {0,1} que representa el estado caso/control. Los pasos para determinar si este SNP es o no informativo son los siguientes:
1) Calcular la entropía de la variable Y como 2 donde p_{k} es la probabilidad de pertenecer a cada uno de los grupos, k=0 para los controles y k=1 para los casos. Esta probabilidad se estima como la proporción de individuos de la muestra que pertenecen al grupo concreto.
2) Calcular la entropía de la variable Y condicionada a cada uno de los valores de X como
200 donde x_{i} \epsilon {AA, aa, Aa} y H(Y/X = x_{i}) es la entropía de la variable Y entre los pacientes cuyo genotipo observado es x_{i}
3) Calcular la IG como IG(Y/X) = H(Y)-H(Y/X), de forma que un valor de IG pequeño significaría que el SNP no es informativo.
4) Determinar la significación estadística de IG utilizando un test de permutaciones (Welch W.J., 1990. Construction of permutation test. J Am Statist Assoc, 85: 693-8). La hipótesis que se contrasta es que el SNP no es buen predictor del estado caso/control. El p-valor para cada uno de los SNP se determina permutando aleatoriamente el estado caso/control observado y calculando en cada caso el valor de IG en esa permutación. El p-valor será la proporción de permutaciones para las que el valor de IG es mayor o igual que el valor original. Se contrasta el valor informativo de cada SNP con 10.000 permutaciones. Puesto que el número de contrastes es alto, utilizamos el nivel de significación basado en el método False-Discovery rate (Benjamini Y., Hochberg Y. 1995).
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Modelos predictivos aplicados
El objetivo es ajustar modelos que clasifiquen bien a nuevos individuos una vez conocido su perfil genotípico, es decir que minimicen el error de predicción. Debido a las dimensiones de los datos, se hace necesario elegir entre todas las variables (SNPs) disponibles, conjuntos que predigan el estado de un individuo de la manera más precisa posible.
Se han utilizado técnicas de aprendizaje automatizado (Machine Learning Techniques). Este tipo de técnicas tratan de construir de forma semi-automática modelos estadísticos predictivos. Hay muchos tipos de modelos, pero es imposible, a priori, determinar que clase de modelo es más apropiado para un conjunto de datos dado. Por ese motivo, se prueban diferentes tipos de modelos y posteriormente se validan, para finalmente seleccionar el modelo más fiable en cuanto a su capacidad predictiva.
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A) Modelos basados el clasificador de Naïve Bayes
El modelo de Naïve Bayes utiliza las frecuencias de los diferentes valores de cada SNP en pacientes cuyo estado caso/control es conocido para predecir el estado de nuevos pacientes, cuyo perfil genotípico es conocido pero no su estado. Es el modelo más simple, pero asume que las distintas variables predictoras (SNPs) son independientes entre sí dado el estado caso/control. A pesar de que esta hipótesis es típicamente falsa, en la práctica funciona bien.
Con el método Naïve Bayes simplemente se tabulan el número de veces que un SNP particular ocurre como homocigoto o heterocigoto en una población (caso o control). Esta tabulación proporciona directamente una probabilidad condicionada de la forma. Para clasificar a un nuevo paciente, se utilizó la regla de Bayes.
La clase con la mayor probabilidad es la que se elige para el paciente no clasificado.
Para seleccionar los SNPs más relevantes, teniendo en cuenta que el objetivo es conseguir la máxima exactitud en la discriminación, se ha utilizado un método de eliminación recursiva (backward). Se parte del modelo estimado a partir de todos los SNPs y se calcula su exactitud a través del error de cross-validación. En el segundo paso se clasifican los datos utilizando N-1 SNPs, donde N es el número total de SNPs, N veces, quitando cada vez un SNP. Se comprueba si al eliminar cada uno de los SNPs aumenta la exactitud y en caso afirmativo, se descarta dicho SNP. Se repite el proceso hasta que el hecho de eliminar un SNP conlleve una pérdida de exactitud significativa.
Para calcular el error de cross-validación, utilizamos la técnica de validación cruzada del tipo n-fold (n-fold cross validation). Esta técnica es un proceso iterativo, de forma que en cada paso se dividen los datos en n-1 muestras de entrenamiento (training set) y 1 muestra de contraste (test set). Con las muestras de entrenamiento se ajusta el mejor modelo posible y con la muestra de contraste se comprueba la validez de dicho modelo. El proceso continúa hasta que todos los grupos se han utilizado como muestra de contraste. El error de cross-validación, será la media de los errores cometidos con cada una de las muestras de contraste. En este caso se ha utilizado n=20.
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B) Modelos basados en SVM (Support Vector Machine)
La técnica de SVM tiene como objetivo obtener un hiperplano óptimo capaz de separar lo mejor posible dos clases. El caso más sencillo es en el que un hiperplano (líneas de más de 2 dimensiones) es capaz de separar correctamente todos los puntos, pero esto no ocurre siempre. Es posible aplicar funciones kernel cuya misión es transformar el espacio de partida en otro espacio, donde sea posible resolver el problema. Por ejemplo, supongamos que tenemos sólo 2 variables (SNPs) y que los datos no pueden ser correctamente separados en los dos grupos, caso/control, por una línea recta (kernel lineal). SVM creará un modelo apropiado, modificando el espacio de partida. Así por ejemplo, un kernel cuadrático podría convertir puntos 2-dimensionales en puntos 3-dimensionales: {SNP1, SNP2}->{SNP1 x SNP1, SNP1 x SNP2, SNP2 x SNP2}, en donde el problema pueda ser resuelto a través de hiperplanos. El SVM podría llevar a cabo la partición de los puntos en este nuevo espacio a través de hiperplanos. Claramente la elección del kernel es muy importante en este tipo de modelos, los más relevantes son el lineal, el radial y el polinómico. Un tutorial sobre esta técnica puede encontrarse en (Burges C.J.C. (1998). A Tutorial on Support Vector Machines for Pattern Recognition. Data Mining and Knowledge Discovery, 2:121-67).
Como en el caso del modelo Naïve Bayes, para seleccionar los SNPs más relevantes se ha utilizado un método de eliminación recursiva (backward) basado en minimizar el error de cross-validación, calculado a partir de validación cruzada de tipo n-fold, con n=20.
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C) Modelos basados en árboles de decisión
Los modelos estadísticos basados en árboles de decisión trabajan de forma recursiva creando particiones de un conjunto de datos dado para conseguir la mejor clasificación de los individuos en relación a una variable respuesta, en nuestro caso el estado caso/control.
Hay varios algoritmos para construir modelos predictivos basados en árboles de decisión. En el desarrollo de la invención se utilizó el método conocido como CART (Classification and Regression Tress) (Breiman L.F., et al (1984). Classification and regression trees. Chapman & Hall, New York). In Machine Learning, 45, 5-32 (2001)), un método de árbol binario, que se construye según el siguiente proceso: en primer lugar se encuentra la variable predictora que mejor divide los datos en los 2 grupos (caso/control). Los datos se separan en estos dos grupos y el proceso se aplica separadamente a cada uno de ellos. El proceso continúa hasta que se alcance un criterio de parada relacionado, habitualmente, bien con un mínimo número de datos en cada subgrupo, bien con un máximo número de variables predictoras que puedan intervenir en el modelo o bien con ambos parámetros a la vez. En cada paso se añade un nuevo "nodo" al árbol, que en este contexto se corresponde con un SNP.
En este tipo de modelos es muy frecuente el problema de sobreajuste (overfitting) que surge al utilizar demasiadas variables predictoras en relación a la cantidad de datos disponibles y se traduce en modelos poco generalizables. Para asegurar que el árbol de decisión ajustado no está sobreajustado, se utiliza lo que se conoce como la "poda" (pruning) del árbol que consiste en eliminar subárboles que podrían ser erróneos. Hay muchas técnicas de poda, aquí se ha utilizado la regla "1 desviación estándar" (1 Standard Error rule) que se basa en el error de cross-validación. Según esta regla el árbol con mejores propiedades de generalización es el modelo más simple con un error de cross-validación menor que menor error de cross-validación + 1 error estándar.
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D) Modelos basados en Random Forest
Básicamente, los Random Forest (Breiman, L. Random Forests. In Machine Learning, 45, 5-32 (2001)) son modelos consistentes en una colección de árboles de decisión, de forma que cada árbol se construye a partir de una serie de variables seleccionadas aleatoriamente. Una vez construido el modelo para clasificar a un nuevo individuo, cada uno de los árboles emite un "voto", asignándose a la clase que tenga un mayor número de votos.
Un resultado de este tipo de modelo son varias medidas de la importancia de cada una de las variables implicadas. La más importante está basada en el decrecimiento del error de precisión cuando los valores de una variable en un nodo de un árbol se permutan aleatoriamente. Esta es la medida que se utiliza en el procedimiento de selección de los SNPs más predictivos.
Para seleccionar SNPs se utiliza el proceso iterativo propuesto por Díaz-Uriarte y Álvarez de Ándres (Díaz-Uriarte R. y Álvarez de Andrés S. (2006). BMC Bioinformatics 2006, 7:3 doi:10.1186/1471-2105-7-3). En cada iteración, se construye un nuevo modelo después de descartar aquellas variables con menor medida de importancia en la iteración anterior. La diferencia con otros métodos que existen de eliminación progresiva de variables radica en que no se recalculan las medidas de importancia en cada paso del algoritmo, mejorando así el posible problema de sobreajuste. Se elige el modelo más simple (con menor número de variables) con una tasa de error menor que la mínima tasa de error + 1 error estándar (1 Estándar Error rule).
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E) Validación de los modelos
Para validar el modelo se utiliza la técnica de validación cruzada del tipo n-fold (n-fold cross validation). Es un proceso iterativo, de forma que en cada paso se dividen los datos en n-1 muestras de entrenamiento (training set) y 1 muestra de contraste (test set). Con las muestras de entrenamiento se ajusta el mejor modelo posible y con la muestra de contraste se comprueba la validez del modelo. El proceso continúa hasta que todos los grupos se han utilizado como muestra de contraste.
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Utilizando esta técnica se obtendrá un valor predicho por el modelo para cada una de las observaciones, lo que permite utilizar las siguientes herramientas de evaluación:
Sensibilidad. Proporción de casos que son clasificados como tal por el modelo predictivo, por tanto da una idea de la utilidad del modelo para identificar a los casos. Es una característica intrínseca de la prueba no viéndose afectada por la prevalencia de la enfermedad.
Especificidad. Proporción de controles que son clasificados como tal por el modelo predictivo, por tanto da una idea de la utilidad del modelo para identificar a los controles. Al igual que la sensibilidad es una característica intrínseca de la prueba no viéndose afectada por la prevalencia de la enfermedad.
Proporción de falsos positivos. Proporción de pacientes controles clasificados por el modelo como casos.
Proporción de falsos negativos. Proporción de pacientes casos clasificados por el modelo como controles.
Exactitud. Proporción de pacientes clasificados correctamente por el modelo.
Índice J de Youden o seguridad diagnóstica. Se calcula como Sensibilidad + Especificidad -1. Cuanto más se aproxima a 1, mayor es la calidad del resultado predicho por el modelo.
Odds ratio diagnóstica. Indica cuántas veces es más frecuente que el modelo clasifique bien a un paciente. Es la misma interpretación que cualquier otra odds-ratio, si es >1 la relación que existe entre lo que predice el modelo y lo realmente observado es positiva, es decir, es más probable acertar; si es <1 es más probable no acertar con la clasificación y si es 1 indica que no hay relación entre lo que predice el modelo y lo realmente observado.
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Resultado de la aplicación de los modelos predictivos
En función de los valores obtenidos para cada modelo, se seleccionaron los siguientes modelos que se ajustaron con los SNPs de la tabla 1:
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1.- Modelos basados en SVM (Support Vector Machine)
En este tipo de modelos no pueden existir valores pérdida en las variables predictoras (SNP). Hay dos opciones: (1) imputar los valores pérdida, completando los genotipos que faltan en función del resto de genotipos observados en el mismo paciente, y (2) sólo considerar los pacientes para los que hay los datos completos. En este último caso se seleccionaron 166 pacientes, de los cuales 114 (68.7%) eran controles y 52 (31.3%) casos.
Se ajustaron modelos utilizando los kernel lineal, radial y polinómico de grado 2 y 3 (cuadrático y cúbico). A continuación se presentan únicamente aquéllos modelos para los que se obtuvieron resultados satisfactorios.
kernel lineal (Muestra sin tener en cuenta los casos con valores perdidos)
Se seleccionaron, utilizando el método de eliminación backward, 42 SNPs (tabla 4) con un error de predicción estimado del 16.1%. Fig. 1. La presencia de estos 42 SNPs es indicativa de un mayor riesgo a desarrollar VRP.
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TABLA 4 
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3 
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kernel radial (Muestra imputando los valores perdidos).
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Se seleccionaron, utilizando el método de eliminación backward, 10 SNPs (tabla 5) con un error de predicción estimado del 22,4% (Fig. 2). La presencia de estos 21 SNPs es indicativa de un menor riesgo de desarrollar VRP.
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TABLA 5 
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4 
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2.- Modelo basado en Random Forest (Muestra sin tener en cuenta los casos con valores perdidos)
En este tipo de modelos no pueden existir pérdidas en las variables predictoras (SNP). Hay dos opciones: (1) imputar los valores pérdidas, completando los genotipos que faltan en función del resto de genotipos observados en el mismo paciente, y (2) sólo considerar los pacientes para los que tenemos los datos completos. En este último caso se seleccionaron 166 pacientes, de los cuales 114 (68.7%) son controles y 52 (31.3%) casos, resultado que la presencia los SNPs presentados en la tabla 2 es indicativa de un mayor riesgo a desarrollar VRP, según se presenta en la tabla de riesgo siguiente.
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TABLA 6 
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5 
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6 
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Validación de los modelos
Las medidas de la capacidad predictiva de cada uno de los modelos los modelos seleccionados se muestra en la siguiente tabla (tabla 7). Comentar brevemente los resultados obtenidos.
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TABLA 7 
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8 
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Para los modelos basados en SVM y en Random Forest se imputan los valores pérdidas. El clasificador de Naïve Bayes y los árboles de decisión, permiten trabajar con este tipo de valores. Fig. 10 (Curvas ROC).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18

Claims (3)

1. Método para la obtención de datos útiles para la determinación del riesgo de desarrollar Vitreo Retinopatía Proliferante (VRP) que comprende identificar en una muestra biológica aislada las variantes polimórficas del gen SMAD 7 asociadas al SNP rs7226855.
2. Método para la obtención de datos útiles para la determinación del riesgo de desarrollar Vitreo Retinopatía Proliferante (VRP) que comprende el método de obtención de datos según la reivindicación 1, donde la variante polimórfica del gen SMAD 7 identificada es el SNP rs7226855.
3. Método para pronosticar el riesgo de desarrollar Vitreo Retinopatía Proliferante (VRP) que comprende llevar a cabo el método para la obtención de datos según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la presencia de variantes polimórficas del gen SMAD 7 asociadas al SNP rs7226855, o la presencia del SNP rs7226855 se identifica como un factor de riesgo a desarrollar VRP.
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